PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS … · 2018-12-05 · pontificia universidad...
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS BIODEGRADACIÓN ANAERÓBICA DE TOXAFENO EN SUELOS CONTAMINADOS DEL MUNICIPIO DE EL COPEY ANGELICA MARÍA ROJAS MORA DIRECTOR: ZIV ARBELI, Ph.D Bogotá, D.C, Colombia Enero de 2016
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
BIODEGRADACIÓN ANAERÓBICA DE TOXAFENO EN SUELOS
CONTAMINADOS DEL MUNICIPIO DE EL COPEY
ANGELICA MARÍA ROJAS MORA
DIRECTOR: ZIV ARBELI, Ph.D
Bogotá, D.C, Colombia Enero de 2016
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
BIODEGRADACIÓN ANAERÓBICA DE TOXAFENO EN SUELOS
CONTAMINADOS DEL MUNICIPIO DE EL COPEY
ANGELICA MARÍA ROJAS MORA
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título de
MAGÍSTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Bogotá, D.C, Colombia Bogotá, D.C., Enero de 2016
BIODEGRADACIÓN ANAERÓBICA DE TOXAFENO EN SUELOS
CONTAMINADOS DEL MUNICIPIO DE EL COPEY
ANGELICA MARÍA ROJAS MORA
APROBADO
Alba Alicia Tres Palacios, Msc; Ph.D Directora de Posgrado
Facultad de Ciencias Básicas
Concepción Puerta B, Ph.D Decana Académica
Facultad de Ciencias Básicas
NOTA DE ADVERTENCIA
"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia".
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1946.
“Hay una fuerza motriz más poderosa que el vapor, la electricidad y la energía atómica: la voluntad”
Albert Einstein
AGRADECIMIENTOS
A Dios y a la Virgen Milagrosa, por darme la tenacidad, espíritu, inteligencia,
constancia y templanza para lograr llevar a cabo esta maestría y este trabajo.
A mis papas, Aura Stella Mora y José Héctor Rojas, por brindarme su apoyo
incondicional, en cada paso del camino; por sus concejos, valores y
enseñanzas
A mi Director, el Doctor Ziv Arbeli, por compartir conmigo fracasos y logros
durante esta investigación; por su paciencia, exigencia, conocimientos y apoyo.
A mi Familia, por su apoyo incondicional, por sus oraciones y por su paciencia
A mi Novio, Julián Ruiz, por incentivarme a alcanzar el éxito cada día, por
compartir mis tristezas, mis alegrías, mis incertidumbres y por apoyarme con
mis sueños.
Al Doctor Fabio Roldan, por sus enseñanzas, y sus aportes críticos y analíticos
durante este trabajo
Al Ingeniero Alejandro Reyes, por su amistad, por el apoyo, la colaboración y la
disposición con la que me ofreció valiosas enseñanzas en cromatografía.
A Hernán Avellaneda, por su amistad sincera, su dulzura y su ayuda
incondicional durante todo este proceso.
A la Unidad de Saneamiento y biotecnología Ambiental, USBA, por proveerme
el mejor espacio y ambiente de trabajo durante todos estos años, y por
hacerme sentir como en casa.
1
TABLA DE CONTENIDO
Pag
LISTA DE TABLAS ………………………………………………………… 5
LISTA DE FIGURAS ……………………………………………………..... 6
LISTA DE ANEXOS ………………………………………………………….. 8
RESUMEN …………………………………………………………………….. 10
ABSTRACT …………………………………………………………………… 11
1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………….. 12
2. MARCO TEÓRICO ……………………………………………………….. 17
2.1. COMPUESTOS HALOGENADOS ……………………………………. 17
2.1.1 Compuestos orgánicos halogenados ………………………………. 17
2.1.2 Compuestos orgánicos persistentes (COPs) ……………………… 17
2.2. TOXAFENO ……………………………………………………………... 19
2.2.1 Propiedades físicas y químicas …………………………………….. 22
2.2.2 Nomenclatura ………………………………………………………… 22
2.2.3 Métodos analíticos ……………………………………………………. 24
2.2.4 Impacto ambiental ……………………………………………………. 24
2.2.5 Métodos para la biorremediación de toxafeno …………………….. 24
2.2.5.1 Harina de Sangre ………………………………………………….. 24
2.2.5.2 DARAMED …………………………………………………………. 24
2.2.5.3 Otras tecnologías de biorremediación ………………………….. 27
2.3. BIODEGRADACIÓN DE COMPUESTOS HALOGENADOS ……... 28
2.3.1 Procesos de Deshalogenación reductiva …………………………. 28
2
2.3.2 Biodegradación de COPs ……………………………………………. 30
2.3.2.1 Hexaclorociclohexano (HCH) …………………………………….. 31
2.3.2.1.1 Biodegradación de hexaclorociclohexano (HCH) …………… 31
2.3.2.2 Bifenilos policlorados (PCBs) …………………………………….. 32
2.3.2.2.1 Biodegradación de PCB ………………………………............. 33
2.3.2.2.2 Decloración de PCBs por priming………………………… 34
2.4. BIODEGRADACIÓN ANAERÓBICA DE TOXAFENO ……………… 35
3. OBJETIVOS ………………………………………………………………... 38
3.1 Objetivo general ………………………………………………………… 38
3.2 Objetivos específicos …………………………………………………… 38
4. METODOLOGÍA …………………………………………………………… 39
4.1 REACTIVOS …………………………………………………………….. 39
4.2 ORIGEN DE LAS MUESTRAS DE SUELO …………………………. 39
4.2.1 Caracterización de los suelos ……………………………………….. 41
4.3 ESTANDARIZACIÓN DE LA METODOLOGÍA DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE TOXAFENO ……………………………………….. 41
4.3.1 Estandarización del método cromatográfico para GC-ECD …….. 41
4.3.2 Estandarización del método cromatográfico para GC-FID ……... 43
4.4 ESTANDARIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN DE TOXAFENO ……. 44
4.4.1 Ensayos de extracción de toxafeno a partir de suelos …………... 45
4.4.1.1 Extracción de toxafeno a partir de muestras ambientales ……. 45
4.4.2 Extracción de toxafeno a partir de lodos ………………………….. 45
4.5 BIODEGRADACIÓN DE TOXAFENO EN MICROCOSMOS ………. 47
4.5.1 Medición del pH ……………………………………………………….. 48
4.5.2 Extracción de toxafeno a partir de microcosmos …………………. 49
4.5.3 Análisis por GC-ECD ………………………………………………... 49
3
4.5.3.1 Cuantificación de la concentración de Toxafeno …………….... 49
4.5.3.2 Evaluación de la transformación de toxafeno …………………. 50
4.6 ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS DE ENRIQUECIMIENTO ANAERÓBICOS ………………………………………………………………. 51
4.6.1 Extracción de toxafeno a partir de cultivos enriquecidos ………... 54
4.6.2 Análisis por GC-ECD ………………………………………………... 54
4.6.3 Análisis por GC-FID …………………………………………………. 54
4.6.4 Extracción de ADN a partir de cultivos de enriquecimiento …….. 55
4.6.4.1 Análisis de resultados por electroforesis ……………………….. 56
4.6.5 Evaluación de la presencia de bacterias halorespiradoras ……… 56
5. RESULTADOS …………………………………………………………….. 60
5.1 CARACTERIZACIÓN DE LOS SUELOS ……………………………... 60
5.2 ESTANDARIZACIÓN DE LA METODOLOGÍA DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE TOXAFENO ……………………………………….. 61
5.2.1 Estandarización del método cromatográfico para GC-ECD ……... 61
5.2.2 Estandarización del método cromatográfico para GC-FID ……… 61
5.3 ESTANDARIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN DE TOXAFENO …….. 61
5.3.1Ensayos de extracción de toxafeno a partir de suelos ……………. 61
5.3.1.1 Extracción de toxafeno a partir de muestras ambientales ……. 63
5.3.2 Extracción de toxafeno a partir de lodos ………………………….. 64
5.4 BIODEGRADACIÓN DE TOXAFENO EN MICROCOSMOS ………. 66
5.4.1 Comportamiento del pH …………………………………………....... 66
5.4.2 Cuantificación de la concentración de Toxafeno ………………….. 68
5.4.3 Evaluación de la transformación de Toxafeno …………………….. 70
5.5 ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS DE ENRIQUECIMIENTO ANAERÓBICOS ………………………………………………………………. 77
4
5.5.1 Análisis de la transformación de la primera fase de cultivo por GC-ECD ……………………………………………………………………….. 77
5.5.2 Análisis de la degradación de Toxafeno en la segunda fase de enriquecimiento por GC-FID ………………………………………………… 81
5.5.3 Evaluación de la presencia de bacterias halorespiradoras ……... 83
5.5.3.1 Condiciones específicas de PCR ………………………………... 84
5.5.3.2 Condiciones relajadas de amplificación de PCR ………………. 85
5.5.3.3 Condiciones de PCR en gradiente ………………………………. 86
6. DISCUSIÓN ………………………………………………………………… 88
7. CONCLUSIONES ………………………………………………………..... 94
8. RECOMENDACIONES ………………………………………………….... 95
9. BIBLIOGRAFÍA ……………………………………………………………. 96
ANEXOS ………………………………………………………………………. 112
5
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Nombres sistemáticos de los componentes presentes en el toxafeno y sus códigos y nomenclaturas alternativas, presentes en la literatura ………………………………………………………………………….
23
Tabla 2. Programas de temperatura evaluados para la estandarización del método cromatográfico de toxafeno por GC-ECD ………………………
42
Tabla 3. Programas de temperatura evaluados para la estandarización del método cromatográfico de toxafeno por GC-FID ………………………
43
Tabla 4. Descripción de las metodologías de extracción evaluadas para suelos ……………………………………………………………………………
45
Tabla 5.Descripción de los tratamientos evaluados en microcosmos ….. 48
Tabla 6. Descripción de los tratamientos en cultivos de enriquecimiento.. 52
Tabla 7. Primers utilizados en la búsqueda de grupos de bacterias halorespiradoras en cultivos de enriquecimiento …………………………… 56
Tabla 8.Condiciones específicas de PCR según autores, para cada set de primers, incorporando algunas modificaciones en el protocolo ………. 58
Tabla 9. Caracterización físico-química del suelo…………………………. 60
Tabla 10. Porcentajes de recuperación para el ensayo de extracción…… 62
Tabla 11. Ensayo de extracción a partir de muestras ambientales………. 64
Tabla 12. Resultados del ensayo de extracción a partir de lodos………... 65
Tabla 13. Porcentajes de recuperación y RSD para los 7 eventos de muestreo a través del tiempo …………………………………………………
69
Tabla 14. Porcentajes de recuperación del tetracloro-m-xileno, para el ensayo a partir de lodos ……………………………………………………… 77
Tabla 15. Porcentajes de recuperación para el PCB Nº 209 ……………. 82
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Lista de contaminantes orgánicos persistentes junto con su estructura química y años de adiciones en el convenio de Estocolmo…….
18
Figura 2. Esqueletos carbonados que componen la mezcla técnica de toxafeno……………………………………………………………………………
22
Figura 3. Esquema de los puntos de muestreo en el predio de las antiguas bodegas de CENALGODON…………………………………………. 40
Figura 4. Integración de toxafeno y moléculas surrogadas por área total … 50
Figura 5.Integración de 11 picos seleccionados y moléculas surrogadas a lo largo de la huella del toxafeno ………………………………………………. 51
Figura 6. Protocolo de extracción de toxafeno a partir de suelos …………. 63
Figura 7. Protocolo de extracción de toxafeno a partir de lodos …………… 66
Figura 8. Medición de valores de pH en 4 periodos de tiempo, para 6 tratamientos de microcosmos ………………………………………………….. 67
Figura 9. Concentración del toxafeno en tratamientos de microcosmos durante 210 días…………………………………………………………………. 68
Figura 10. Comparación del perfil cromatográfico de los tratamientos estéril, atenuación natural y lodos con a los 210 días por GC-ECD ……… 71
Figura 11. Comparación del perfil cromatográfico de los tratamientos estéril, atenuación natural y ZVI con lodos y cal a los 210 días por GC-ECD ……………………………………………………………………………… 71
Figura 12. Comparación del perfil cromatográfico de los tratamientos estéril, atenuación natural y ZVI con lodos a los 210 días por GC-ECD…… 72
Figura 13. Transformación de toxafeno en microcosmos…………………… 74
Figura 14. Comportamiento de las áreas relativas de los picos desde el día 60 hasta el día 270 …………………………………………………………. 75
7
Figura 15. Comparación del perfil cromatográfico de los tratamientos lodos con melaza, ZVI con lodos y ZVI con lodos y cal a los 210 días por GC-ECD…………………………………………………………………………..
76
Figura 16. Transformación de toxafeno durante la primera fase del cultivo de enriquecimiento ……………………………………………………………… 78
Figura 17. Transformación de toxafeno durante la primera fase del cultivo de enriquecimiento………………………………………………………………. 80
Figura 18. Comparación del perfil cromatográfico de la primera fase de enriquecimiento con dibromocilohexano a los 0 días, 30 días y 50 días por GC-ECD………………………………………………………………………….
81
Figura 19.Concentración del toxafeno en la segunda fase de enriquecimiento durante 131 días………………………………………………
82
Figura 20 Amplificación del 16s RNAr (primers 27F y 1492R)……………… 83
Figura 21 Amplificación del 16s RNAr de las secuencias target para el Filum Cloroflexi en lodos del rio Bogotá, bajo una amplificación de PCR especifica (temperatura de anillamiento 60ºC)……………………………….
84
Figura 22 Amplificaciones inespecíficas de PCR relajada………………….. 85
Figura 23 Amplificación de Cloroflexi en lodos del rio Bogotá, utilizando un gradiente de PCR ……………………………………………………………….
86
Figura 24 Amplificación del genero Desulfuromonas en lodos del rio Bogotá, utilizando un gradiente de PCR ……………………………………..
87
8
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1.Evidencias fotográficas de lo encontrado en el primer evento de muestreo …………………………………………………………………… 112
Anexo 2. Vista satelital de la ubicación del predio contaminado en las antiguas bodegas de CENALGODON……………………………………… 112
Anexo 3. Punto de muestreo PM 2.1, evidencia de una mancha de coloración oscura y olor característicos del toxafeno, en cercanías al punto de monitoreo 2 (PM 2) ………………………………………………… 113
Anexo 4. Curva de calibración de Toxafeno por GC-ECD ……………….. 113
Anexo 5. Curva de calibración del m-xileno por GC-ECD ……………….. 113
Anexo 6. Curva de calibración del PCB Nº29 por GC-ECD ……………… 114
Anexo 7. Curva de calibración de Toxafeno por GC-FID ………………… 114
Anexo 8. Curva de calibración de m-xileno por GC-FID …………………. 114
Anexo 9. Curva de calibración de PCB Nº29 por GC-FID ……………….. 115
Anexo 10. Solución SL9 de elementos traza ……………………………… 115
Anexo 11. Solución de vitaminas …………………………………………… 115
Anexo 12. Solución de selenito y tungstate ……………………………….. 116
Anexo 13. Reporte de métodos utilizados en el análisis de suelos por
parte del laboratorio IGAC …………………………………………………… 116
Anexo 14. Métodos evaluados para la identificación de Toxafeno utilizando diferentes programas de temperatura con GC-ECD ………….. 117
Anexo 15.Métodos evaluados para la identificación de Toxafeno utilizando diferentes programas de temperatura con GC-FID 119
Anexo 16. Comparación del perfil cromatográfico de los tratamientos estéril y atenuación natural a los 210 días por GC-ECD…………………. 121
Anexo 17. Transformación de toxafeno en microcosmos con detalle de 6 de los picos más cambiantes a lo largo del tiempo. 122
Anexo 18. Evaluación de 11 picos por cada tratamiento en microcosmos a través del tiempo ……………………………………………………………. 123
9
Anexo 19. Transformación de toxafeno durante la primera fase del cultivo de enriquecimiento ……………………………………………………. 124
Anexo 20 .Amplificación del 16s RNAr para las muestras de ADN de cada uno de los 4 tratamientos de la segunda fase del cultivo de enriquecimiento, utilizando dos diluciones de trabajo …………………… 125
10
RESUMEN
El toxafeno es un contaminante orgánico persistente, compuesto por una
mezcla de miles de congéneres policlorados. En Colombia, fue el plaguicida
más utilizado en los campos de algodón en el departamento del Cesar. Este
estudio evaluar la biodegradación anaeróbica de Toxafeno en suelos
contaminados del municipio de El copey
Utilizando una muestra compuesta de suelo, se evaluaron 7 tratamientos en
microcosmos anaeróbicos durante 270 días, para determinar el efecto de los
biosólidos, la melaza, el material vegetal, el hierro cero Valente (ZVI) y la cal,
sobre la degradación de toxafeno. También, se realizó un enriquecimiento del
suelo contaminado, evaluando el efecto priming de 3 moléculas halorgánicas, y
la participación de 7 grupos de bacterias halorespiradoras.
Con un análisis del área relativa de 11 picos, utilizando GC-ECD, se pudo
evidenciar cambios en el patrón de toxafeno, para los microcosmos y los
cultivos enriquecidos. Los tratamientos que presentaron mayor transformación
en microcosmos, fueron los que tuvieron adición de melaza, bisólidos y ZVI.
Los cultivos enriquecidos, presentaron mayor potencial de transformación en
un periodo de tiempo más corto (30dias), con respecto a los microcosmos
(hasta los 120 días). No se logró identificar microorganismos halorespiradores
en la segunda fase del cultivo, probablemente dada a la alta concentración de
toxafeno que se presentó en los suelos. La molécula trans-1,2-
dibromociclohexano, presentó un mayor cambio en los picos iniciales y finales
de la huella, lo que sugiere un efecto potenciador (o priming) sobre los
procesos de deshalogenación reductiva en cultivos enriquecidos para este
plaguicida.
11
ABSTRACT
Toxaphene is a persistent organic pollutant, which consists of a mixture of
thousands of polychlorinated congeners. In Colombia, toxaphene was the most
widely used pesticide in cotton fields located on Cesar department. This study
evaluated the anaerobic biodegradation of toxaphene contaminated soil in El
Copey, Cesar.
Seven treatments were evaluated using a sample of soil in anaerobic
microcosm for 270 days, to determine the effect of biosolids, molasses,
vegetable material, zero valent iron (ZVI) and lime, on the degradation of
toxaphene. It was also made an enrichment culture of toxaphene contaminated
soil, evaluating the effect of 3 priming molecules, and the participation of 7
groups of halorespiring bacteria.
An analysis of relative area of 11 peaks of toxaphene, using GC-ECD, was
used to give evidence of changes in the toxaphene fingerprint for microcosm
and enriched cultures. The microcosm treatments with an addition of molasses,
biosolids and ZVI had higher transformation in the first peaks of the retention
time than other treatments. On the other hand, enriched cultures showed a
higher potential of toxaphene transformation in a shorter time period (30days),
with respect to the microcosms (up to 120 days). However, it was not possible
to identify halorespiring microorganisms in the second stage of the enriched
cultures, probably because of a high initial concentration of toxaphene showed
on the soils. The molecule Trans-1, 2-dibromocyclohexane demostrated a major
change in the initial and final footprint peaks, which suggest an enhancer (or
priming) effect on reductive dehalogenation processes enriched for this
pesticide.
12
1. INTRODUCCIÓN, ALCANCE Y DEFINICIÓN DEL
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
Introducción
El toxafeno, también conocido como canfecloro, fue uno de los plaguicidas
organoclorados más utilizados alrededor del mundo durante la época de 1950 y
mediados de 1980, principalmente en cultivos de algodón, soja y maíz (1). Es
una mezcla policlorada compleja de bornanos, canfenos, dihidrocanfenos y
bornadienos con un contenido de cloro entre el 67-69% (2), que componen
aproximadamente 1000 compuestos (4,5), aunque el número teórico de las
combinaciones posibles únicamente para los bornanos policlorados asciende a
32.768 (de los cuales, 512 son quirales) (3).
Debido a su alta persistencia en el ambiente, toxicidad, transporte a largas
distancias y comportamiento bioacumulativo, el toxafeno, fue clasificado como
un contaminante orgánico persistente (COP) según el convenio de Estocolmo y
restringido en 1982 por la EPA (Agencia de protección ambiental U.S.A) (1,6).
Actualmente ocupa el puesto 32 en la lista de prioridad de sustancias
peligrosas de la ATSDR (Agency For Toxic Substances & Disease Registry)
(7), y debido su extenso uso alrededor del mundo (aun después de su
prohibición), se ha determinado que varios de los congéneres del toxafeno son
ubicuos en el ambiente, encontrándose en el agua, el aire, y en el suelo, así
como en la biota, incluidos organismos acuáticos del ártico y humanos (3, 8-
13).
Los residuos ambientales de toxafeno presentan un patrón común bajo
condiciones reducidas en sedimentos, suelos y lodos, usualmente dominados
por hexaclorobornanos y heptaclorobornanos, aparentemente resultando de
procesos de biotransformación (14-20). Hasta el día de hoy, se conocen solo
dos microorganismos capaces de degradar el toxafeno bajo condiciones
anaeróbicas: Dehalospirillum multivorans, un microorganismo estrictamente
anaeróbico, que genera muchos de los mismos congéneres residuales, que se
13
observan en medios reducidos de diferentes entornos vía deshalogenación
reductiva (DR)(14); y Enterobacter sp. D1 un microorganismo anaerobio
facultativo, gram negativo que tiene la capacidad de crecer y desarrollarse con
suplementos de toxafeno en rangos de 3-96mg/l (19).
En la actualidad, se presentan dos alternativas de biorremediación de suelos
contaminados con toxafeno que han sido probadas a escala piloto o a full
escala: 1. DARAMEND, una tecnología en la que se utilizan ciclos aeróbicos-
anaeróbicos con adición de hierro cero Valente (ZVI), nutrientes (determinados
según el tipo de suelo a tratar) y agua para producir condiciones reducidas; y
2. Un tratamiento anaeróbico con harina de sangre y fosfatos (21). Ambos
procedimientos, buscan bioestimular las comunidades bacterianas presentes
para degradar el toxafeno. Sin embargo, refiriéndonos a los procesos y a los
microorganismos implicados en la biodegradación del toxafeno, aún hay mucho
conocimiento por consolidar (22).
En general, del toxafeno se puede decir, que aún se desconoce la composición
exacta de la mezcla y del número creciente de congéneres que la componen;
su comportamiento ambiental, sus mecanismos de degradación, los
microorganismos implicados, su análisis y cuantificación, su nomenclatura y su
grado de toxicidad, son aun interrogantes y vacíos que generan una brecha
significativa en el conocimiento científico y en los mecanismos de mitigación de
riesgo.
Problemática en Colombia
Desde 1953, el cultivo de algodón en Colombia, fue uno de los más complejos,
debido al mal manejo que ciertos agricultores dieron a las siembras, lo que
facilitaba la recirculación de plagas en las cosechas siguientes; razón por la
cual, este cultivo se constituyó como el principal consumidor de plaguicidas
tipo COP en la década de los ochenta (23), principalmente en el departamento
del Cesar, en los municipios del Copey (corregimiento de Caracolito), y en
Codazzi (24). A principios de la década de los noventa, debido al fenómeno
continuo de proliferación de plagas, y a la aparición del gusano bellotero, se
14
presentó una crisis en el sector algodonero; disminuyendo el área sembrada y
dejando excedentes de plaguicidas sin utilidad, que se almacenaron mediante
prácticas no adecuadas (23,24).
La sobredosificación de plaguicidas de tipo COP, los entierros de pesticidas
obsoletos y la inadecuada disposición de los mismos, sumada a la persistencia
y poca movilidad características de estas sustancias, han generado la
existencia de sitios contaminados en el país (23); los cuales constituyen un
riesgo latente para la comunidad cercana a estas zonas y para el medio
ambiente en general (24). Un estudio sobre la consolidación del inventario de
plaguicidas COP, realizado por el Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo
Territorial de la República de Colombia, determino, que en el departamento del
Cesar existen alrededor de 10 sitios posiblemente contaminados, 4 de los
cuales se encuentran ubicados en Copey (lugar en donde se centra este
estudio) (23).
Del historial del predio en Copey, se conoce que en 1996, 807 tambores de
Metil Paratión y 153 de Toxafeno, fueron trasladados y almacenados
inadecuadamente en las bodegas de la Central Algodonera en liquidación
CENALGODON, sin ningún tipo de advertencia a la población aledaña (25).
Desde el año 2000, gracias a la resolución 2971 impartida por el Ministerio de
Salud de la Republica de Colombia, con respecto a la prohibición del uso y
compra de todas las formas comerciales del toxafeno (26); el ministerio de
Medio ambiente, inicio los tramites de manipulación, embalaje y trasporte de
los residuos ubicados en el predio, para su posterior incineración en el exterior,
hecho que fue llevado a cabo, solo hasta el año 2004, luego de la evaluación
de otras opciones de tratamiento en el país (26).
Finalmente, un estudio realizado en el 2010 por el Ministerio de Ambiente,
Vivienda y Desarrollo Territorial, en colaboración con la Universidad Nacional
de Colombia, informo que el suelo superficial de este predio se encontraba
contaminado con toxafeno en un área aproximada de 4.913,8 m2, y que de
este, 2170 m2 tenían concentraciones elevadas de toxafeno (cerca de 120-
4.700 mg*Kg-1) (27). Este hecho es inquietante, debido a que la salud de las
15
personas y de la biota en general, puede estar viéndose afectadas; además, la
vaporización, bioacumulación y arrastre a las corrientes de agua constituye un
potencial problema de contaminación.
Justamente, en el año 2010, se publicó un estudio de incidencia y tendencia de
seis canceres en poblaciones posiblemente expuestas ambientalmente a
plaguicidas en desuso en el departamento del Cesar; los resultados
informaron, que en los municipios de Agustin Codazzi y el Copey se obtuvieron
las tasas superiores de incidencia para los canceres de hígado en ambos
sexos y de vejiga en las mujeres. Estos resultados llevaron a concluir que
posiblemente existe una asociación estadística y geoespacial entre la
incidencia de algunos canceres y la exposición ambiental a plaguicidas de tipo
COP en desuso, en el departamento del Cesar, incluido el toxafeno (28).
De acuerdo a estas problemáticas, se hizo necesario buscar alternativas, para
mitigar el riesgo a la población aledaña, y así mismo, generar restricciones en
el pastoreo de animales o ingreso sin la debida autorización (Anexo 1). Por
este motivo, nace el proyecto “Biorremediación de suelos contaminados con
toxafeno: del laboratorio al campo”, financiado por COLCIENCIAS, y ejecutado
por la Pontificia Universidad Javeriana (Bogotá) y la Universidad del
Magdalena, en acompañamiento con CORPOCESAR, en donde los hallazgos
de este trabajo, hacen parte importante de los resultados de sus objetivos.
Definición del problema de investigación
Uno de los factores que más influye en el desarrollo de nuevo conocimiento
científico en la degradación del toxafeno, es el análisis y la cuantificación del
contaminante debido a la complejidad de las mezclas comerciales, y al déficit
de estándares para su cuantificación por cromatografía. En la actualidad, no se
conoce con exactitud el número de moléculas que componen el toxafeno (1-5,
22,29,30,31); y por ende, los análisis de degradación se ven limitados al
estudio de unos cuantos congéneres (16,17,18,20,22). Todo esto dificulta el
conocimiento de todos los productos de degradación y de su toxicidad, así
16
como las propiedades de absorción importantes para conocer el destino y
movilidad ambiental del contaminante (22, 32, 33, 34).
Debido los escasos estudios que existen hasta el momento con respecto al
panorama de biodegradación del toxafeno, tanto en nuestro país, como a nivel
mundial; este trabajo, busco proporcionar nuevo y valioso conocimiento a nivel
científico, con respecto al análisis holístico de la mezcla de congéneres del
toxafeno en microcosmos y cultivos enriquecidos; por medio del estudio de
degradación y trasformación, utilizando variantes en el modelo de integración
del cromatograma por GC-ECD y GC-FID.
El uso de diferentes tratamientos de microcosmos, se fundamentó en la adición
de componentes que han demostrado ser eficientes en la degradación
anaeróbica de otros COP, al bioaumentar y bioestimular los microorganismos
presentes en el suelo. Mientras que, los análisis en cultivos de enriquecimiento,
surgen a raíz del escaso conocimiento que se tiene a cerca de la participación
de microorganismos en los procesos de decloración del toxafeno y de posibles
moléculas halorgánicas que pudieran acelerar los procesos de
deshalogenación reductiva, como se ha observado para PCBs (35-38) y
dioxinas (39).
Este trabajo es pionero en la utilización de 3 moléculas halorgánicas
alternativas al contaminante, para incrementar los procesos de
deshalogenación reductiva; y en la búsqueda, de grupos de bacterias
halorespiradoras en cultivos enriquecidos con toxafeno, como se ha
evidenciado para otros COP (40-46).
17
2. MARCO TEÓRICO
2.1. COMPUESTOS HALOGENADOS
2.1.1 Compuestos orgánicos halogenados
Los compuestos orgánicos halogenados constituyen un grupo amplio de
sustancias que se encuentran naturalmente, debido a procesos geotérmicos o
producto de organismos vivos (47); pero también, pueden ser derivados de la
síntesis de productos de actividades antropogénicas (48). Para comprender el
ciclo global de estos compuestos, es necesario considerar su producción,
biodegradación, asimilación, integración (ej. adsorción o acoplamiento a la
materia orgánica) y también su persistencia en el ambiente (47,48).
En muchos aspectos, la química de estos compuestos se debe a las
propiedades fisicoquímicas del sustituyente halogenado: con el incremento del
peso molecular del halógeno, las energías del enlace carbono-halógeno
decrecen marcadamente (ej. F>Cl>Br>I); el tamaño físico y la forma del
sustituyente halogenado también puede afectar su reactividad y
biodegradación, ya que su condición estérica puede dificultar la absorción en
las células y el ataque enzimático (48,49). El grupo halógeno de un compuesto
orgánico generalmente reduce su solubilidad en agua y por el contrario
aumenta su solubilidad en moléculas lipídicas, en consecuencia se reduce su
biodegradación ya que disminuye su biodisponibilidad y aumenta su capacidad
de bioacumularse (47-50).
2.1.2 COMPUESTOS ORGÁNICOS PERSISTENTES (COPs)
De los contaminantes liberados al ambiente por las actividades humanas, los
COPs son clasificados como sustancias peligrosas, ya que tienen propiedades
tóxicas, son resistentes a la degradación, se bioacumulan y son transportados
por el aire, el agua y las especies migratorias a través de las fronteras
internacionales; depositándolos lejos de los lugares de su inicial liberación, y
acumulándose en ecosistemas terrestres y acuáticos (50,51). La lista del
Convenio de Estocolmo (Figura 1) incluye por una parte sustancias que están
18
ya prohibidas o estrictamente reguladas en Europa desde hace tiempo (como
diferentes plaguicidas y productos químicos industriales), que causan
problemas en otras áreas del mundo en las que no se han producido emisiones
directas (ej. aldrina, dieldrina, DDT, endrina, heptacloro, clordano, mirex, y
Toxafeno) (50,52).
Figura 1. Lista de contaminantes orgánicos persistentes junto con su estructura química y años de adiciones en el convenio de Estocolmo. Imagen editada por autora.
Fuente: Zeng E, 2015 (52)
19
Los COPs son persistentes en el ambiente, pues tienen una larga vida media
(de años o décadas) en los sedimentos, los suelos, el aire y los organismos;
normalmente son hidrofóbicos por lo cual son poco biodisponibles ya que
evitan las fases acuosas y se adhieren fuertemente a los sólidos y la materia
orgánica (53-56). Debido a esta propiedad, se almacenan en los tejidos grasos
o lipídicos de los organismos, y se biomagnifican a lo largo de las cadenas
tróficas (49, 54, 56).
En lo que respecta a la salud, los seres humanos están expuestos a los COPs
por la inhalación y contacto cutáneo, o a través de los alimentos, siendo los
más importantes los que son ricos en grasa (carne, pescado, lácteos, etc.) (49,
53-56). Pese a que cada sustancia conlleva a diferentes problemáticas en la
salud, se sabe que los COPs pueden producir cáncer, deficiencias
reproductivas, o inducción de disfunciones en el sistema endocrino o
neurológico (49,54).
Los graves riesgos para el medio ambiente y la salud humana, generados por
estos productos químicos, afectan especialmente a los países en desarrollo,
donde los sistemas y la tecnología necesaria para eliminarlos pueden ser muy
deficientes o incluso inexistentes. La problemática Colombiana no es ajena a
este hecho, y se concentra en el uso y manejo inadecuado de algunos
plaguicidas en el campo agrícola (24,51,56); la carencia de normas de manejo
y disposición, la reducción de las aéreas sembradas y la resistencia de las
plagas a lo largo de los años, han generado abandono o entierros no
controlados de algunos plaguicidas que por ley o ineficiencia ya son obsoletos.
Debido a este hecho, en Colombia existen varios lugares contaminados con
COPs (algunos posiblemente no identificados), que generan un riesgo a la
población y a los ecosistemas (24).
2.2. TOXAFENO
El toxafeno es una mezcla compleja que consiste principalmente en bornanos,
canfenos, dihidrocanfenos y bornadienos policlorados; la mayoría de estos
contienen de 5 a 12 sustituyentes cloros por molécula (2, 8), el número teórico
20
de las combinaciones posibles, solo para los bornanos policlorados asciende a
32.768 (16.128 pares de enantiomeros y 512 con estructuras quirales) (3). La
totalidad de congéneres que contiene el toxafeno es aun aproximada, y ha
pasado de 174 (57), 180-190 (58), 246 (59), 670 (60) hasta 1.000 en los últimos
años (4,5).
Fue introducido como plaguicida en 1945 por Hercules Co. con el nombre
comercial de Hercules 3965, pero solo hasta 1948 fue comercialmente activo
(2,8). Durante los años 60s y mediados de los 80s, fue uno de los plaguicidas
más utilizados en la agricultura alrededor del mundo gracias a su amplio
espectro de actividad biosida (1,2,8).
Fue aplicado en cultivos de tabaco, granos, vegetales, hortalizas, frutas,
nueces, césped, plantas ornamentales, así como en ganado y en peces (1,2,8);
sin embargo cerca del 85% de su uso mundial se dio en los cultivos de algodón
contra las plagas: Agrotis ipsilon (gusano tierrero), Spodoptera sp. (gusano
cogollero y tierrero), Feltia sp. (gusano tierrero), Sacadodes pyralis (gusano
rosado colombiano), Pectinophora gossipyella (gusano alambre), Heliothis
virescens (gusano bellotero), Anthonomusgrandis (picudo del algodonero), y
Trichoplusia (gusano medidor) (10,22,23).
Su naturaleza volátil y de persistencia lipólitica, contribuyo a la dispersión a
través del agua y los ambientes marinos; por ello, trazas de toxafeno fueron
encontradas en áreas remotas como el ártico, donde este pesticida jamás fue
usado (61). En adición, la bioacumulación en la biota, a lo largo de las cadenas
tróficas, hizo que el toxafeno también fuera detectado en humanos (61-66)
Fue restringido en 1982 por la EPA (Agencia de protección ambiental U.S) y
clasificado en el 2004 como un COP según el convenio de Estocolmo (6);
actualmente ocupa el puesto 32 en la lista de prioridad de sustancias
peligrosas de la ATSDR (Agency For Toxic Substances & Disease Registry)
(7).
21
Se estima que la producción global de toxafeno fue de 450.000 ton, de los
cuales se usaron 1.33 millones de toneladas entre 1950 y 1993 (67). El mayor
uso, se documentó en USA con un valor aproximado mayor de 100.000 ton,
mientras que más de 10.000 ton fueron registradas para su uso en la Unión
Soviética, Germania, Brasil, Colombia, Egipto y otros países (68).
A pesar de su importancia como insecticida y su ubicua distribución en muchos
lugares del mundo, la información sobre el toxafeno y su comportamiento en el
ambiente, es escasa. Esto podría estar relacionado, con la dificultad del
análisis de la mezcla de congéneres, que hoy en día se ve limitada por 23
estándares específicos individuales (69,70,71), con los cuales se ha podido
tener una “visión general del toxafeno” relacionado con el transporte, destino,
degradación y efectos tóxicos en el ambiente (1-6, 22). No obstante, aún se
desconoce la composición exacta de la mezcla y del número creciente de
congéneres que la componen; su comportamiento ambiental, sus mecanismos
de degradación, los microorganismos implicados, su análisis y cuantificación,
su nomenclatura y su grado de toxicidad, son aun interrogantes y vacíos que
generan una brecha significativa en el conocimiento científico y en los
mecanismos de mitigación de riesgo.
2.2.1 Propiedades físicas y químicas
El proceso de producción del toxafeno consiste en la extracción cruda del α–
pineno a partir del tronco del pino, usando metilisobutilquetona, calor y presión.
La isomerización del α–pineno produce canfeno, bornileno, y α-terpineol. El
canfeno es subsecuentemente clorado bajo luz ultravioleta, y durante este
proceso, se generan diferentes estructuras, a las que se les conoce como
congéneres del toxafeno técnico (Figura 2) (2,3,8)
22
Figura 2. Esqueletos carbonados que componen la mezcla técnica de toxafeno. (A) Bornano; (B) Borneno; (C) Bornadieno (D) Canfeno y (E) Dihidrocanfeno.
Fuente: (de Geus et al., 1999)
Los productos técnicos del toxafeno tienen un contenido de cloro de 67-69%,
posee una masa molecular media de 414g/mol, una gravedad específica de
1,63g/ml y solubilidad en agua entre el rango de 0,4 y 3mg/l, por lo cual es más
fácilmente soluble en solventes orgánicos, como hidrocarburos aromáticos y
alifáticos (2,8).
2.2.2 Nomenclatura
Para describir los diferentes compuestos que se encuentran presentes en las
mezclas técnicas del Toxafeno, se han determinado varias nomenclaturas
como base, debido a que los nombres sistemáticos (regidos por las normas
IUPAC) generan algunos inconvenientes: entre ellos, se encuentran los
extensos nombres para los bornanos clorados, y la baja uniformidad que se
tiene especialmente en las posiciones C8 y C9 del esqueleto.
23
Tabla 1. Nombres sistemáticos de los componentes presentes en el toxafeno y sus códigos y nomenclaturas alternativas, presentes en la literatura
Fuente:(de Geus et al., 1999)
Como se observa en la Tabla 1, el número total de los congéneres teóricos
calculados por la fórmula de Vetter en 1993 (3) para 5 clases de compuestos,
es extensiva. Se presentan 61 componentes del toxafeno técnico que han sido
identificados; estos componentes clorados, consisten en 48 bornanos, 6
bornenos, 1 bornadieno, 5 canfenos, y 1 dihidrocanfeno. Sin embargo, y como
se puede observar, el numero los congéneres puede ser fácilmente
confundidos al utilizar nombres sistemáticos, especialmente porque muchos de
ellos son enantiómeros.
24
Por este motivo varios autores han propuesto el uso de nombres más simples y
menos sistemáticos, algunos como la numeración Parlar, se fundamentan en el
orden de elución de los diferentes congéneres, por cromatografía de gases (5,
31,72), y otros en nomenclaturas binarias (73,74,75)
2.2.3 Métodos analíticos
Uno de los factores que más influye en el desarrollo de nuevo conocimiento
científico en la degradación del toxafeno, es precisamente el análisis y
cuantificación del contaminante. El reto, radica en la complejidad de las
mezclas comerciales, el déficit de estándares para su cuantificación, y a su
comportamiento en muestras ambientales, que puede diferir significativamente
del toxafeno técnico comercial, ya que esta molécula sufre un cambio lento,
donde el producto original se rompe (o se degrada) perdiendo cloros, (a estas
sustancias se les denomina “productos degradados del toxafeno”), pudiendo
volatilizarse, bioacumularse o transportarse a largas distancias (3,8,22,34,61).
Hasta ahora, los métodos analíticos más utilizados para la cuantificación de
muestras ambientales son: la cromatografía de gases (GC) acoplada al
detector de captura de electrones (ECD), o al detector de masas (MS), junto
con algunas variables en dos dimensiones que se han estudiado en los últimos
años (29,30). Ambas técnicas poseen ventajas y problemas inherentes, como
la sobreestimación de la concentración debido a interferentes halogenados a la
falta de información de la composición de los congéneres de toxafeno en la
muestra (29, 30, 31).
2.2.4 Impacto ambiental
Pese a que el toxafeno fue descontinuado hace dos décadas, aun se siguen
reportando residuos en las columnas de agua, los sedimentos y en matrices
biológicas de varios ecosistemas del mundo (76-79). Se ha demostrado un
efecto adverso en varios organismos invertebrados del suelo, siendo el más
susceptible Folsomia candida (33); y del agua, como peces, focas o ballenas
25
(79,80). El toxafeno, puede ser degradado en matrices biológicas y sedimentos
debido a actividades metabólicas de microorganismos o por degradación
abiótica. El transporte y degradación en los suelos puede ser muy lento, ya que
el toxafeno posee una vida media entre 100 días y 14 años, dependiendo del
tipo de suelo, el clima y los microorganismos que allí se encuentren (16, 22).
Consecuentemente, algunos congéneres altamente persistentes, pueden ser
encontrados en sedimentos, suelos y organismos; dominados por
Hexaclorobornanos como el HxSed y Heptaclorobornanos como el HpSed (9,
10,14,16,17,18,20).
En ambientes acuáticos, dos congéneres, un octaclorobornano reportado como
B8-1413 o p26; y un nonaclorobornano reportado como B9-1679 o p50, han
sido reportados frecuentemente con una distribución particular (34, 78, 80).
Más del 70-80% de estos congéneres, han sido aislados de mamíferos marinos
(17, 18, 34, 61, 65, 66, 78, 80), sin embargo, solo representan el 1,2% del
toxafeno técnico comercial, y no se encuentran continuamente en sedimentos
(únicamente en lugares con un alto historial de contaminación) (34, 78).
Cuando los animales son expuestos a esta variedad de productos de
degradación del toxafeno, algunos de estos congéneres, como el Hx-Sed y Hp-
Sed, son fácilmente metabolizados y excretados, vía decloración,
dehidrodecloración, y oxidación, principalmente a través de la mezcla del
sistema oxidasa y otras enzimas hepáticas microsomales (8,54, 63, 64). No
obstante, un limitado número de congéneres (p26, p50, p40, p41, p62) son
poco metabolizados, y no pueden ser fácilmente excretados, por lo cual,
tienden a acumularse mayoritariamente en los tejidos grasos de los organismos
(incluyendo humanos); esto induce acciones neurotóxicas, defectos
reproductivos, desarrollo de tumores y cáncer en varios animales (1,2,8, 22,60,
63,64,78)
26
2.2.5 Métodos para la biorremediación de toxafeno
2.2.5.1 Harina de Sangre
Esta tecnología usa sangre seca y pulverizada de animales, como fuente de
nutrientes, y fosfatos como buffer, para controlar el pH del material
contaminado (en algunas aplicaciones también es requerida la adición de
almidón). Los suelos contaminados son mezclados con los aditivos y saturados
con agua para minimizar la transferencia de oxígeno a la mezcla, y mantener
las condiciones anaeróbicas, requeridas. Se hace necesario poner el lodo en
una celda linear y cubrirla con un plástico, de esta manera se incuba por varios
meses, mientras se evalúa periódicamente la concentración del contaminante.
Este proceso ha sido utilizado en suelos y sedimentos contaminados con
toxafeno. Uno de los ejemplos citados, relaciona el tratamiento de 8.000 yardas
en Laveen, Arizona, que contenían aproximadamente 110 mg/kg de toxafeno;
el procedimiento fue realizado en un periodo de 180 días a full escala,
obteniendo concentraciones finales de toxafeno entre 5-20 mg/Kg, con un
porcentaje de reducción del 66-82% (21).
2.2.5.2 DARAMED
Es una tecnología innovadora de biorremediación de suelos y sedimentos, que
utiliza ciclos de anoxia y aireación, para degradar diferentes plaguicidas
organoclorados, como el toxafeno, DDT, DDE, Lindano, Dieldrin y clordano.
DARAMED usa aditamentos de fuentes de carbono orgánicas (dependiendo
del tamaño de la partícula de suelo), hierro cero Valente (ZVI) y agua, para
estimular la actividad biológica y la reducción de oxígeno en la matriz, lo que
promueve la decloración de estos compuestos. El ZVI puede actuar como un
donador de electrones, al reducir el agua y producir hidrogeno; o puede
presentarse deshalogenación reductiva del contaminante, acoplada a la
corrosión del hierro (21,81).
Los ciclos consisten en una fase anaeróbica (que típicamente puede durar 1 o
2 semanas), seguida de una fase aeróbica, donde el suelo debe ser labrado
27
con un equipo especial, para incrementar la difusión de oxígeno, durante
aproximadamente dos semanas. Esta tecnología ha sido usada, en diferentes
sitios como USA, Canadá, Europa, y Brasil, obteniendo buenos porcentajes de
remoción. En Montgomery, Alabama, se trataron 4.500 ton de suelo
contaminado con un promedio de 189 mg/Kg de toxafeno, y en un periodo de
173 días se logró una reducción de la concentración en promedio a 10mg/kg,
con un porcentaje de remoción del 89% (21, 81).
Existen otros reportes a full escala y a escala piloto, donde los porcentajes de
remoción incrementan a 93,2% y 95% para el toxafeno; sin embargo,
DARAMED posee ciertas limitaciones, como lo son, la elevada concentración
de plaguicidas, altos niveles de metales pesados en el suelo, o pH < a 2,
debido a que pueden interferir con los procesos de biodegradación (21, 81).
2.2.5.3 Otras tecnologías de biorremediación
Para la biorremediación de toxafeno, se han propuesto otras tecnologías, que
aunque no han sido probadas a full escala, se cree que pueden ser efectivas.
Una de ellas es Gene expression Factor, que utiliza un factor proteico que
restaura, las proteínas de las bacterias nativas del suelo, que pudieron ser
dañadas o removidas, por la contaminación. Este factor no es peligroso, y debe
ser añadido con otros aditamentos como cal, materia orgánica (estiércol, o
carbón) y fertilizantes; Gene expression debe ser adicionado una vez en días
cálidos, y/o dos veces en días fríos, por un periodo de dos meses. Esta
tecnología fue probada con toxafeno en Morgan Hill, California, donde se
trataron 14.200 yardas de suelo contaminado con 6,2mg/kg y después de la
aplicación, se obtuvo una concentración final de 0,130 mg/kg con una
reducción de 97,9%.
Otra tecnología promisoria, se denomina In Situ Thermal Desorption (ISTD), es
un tratamiento térmico, que utiliza la conductividad térmica para transferirla al
ambiente. ISTD puede calentar el suelo o los sedimentos a temperaturas de
hasta 1.000 ºF, para tratar moléculas con altos puntos de ebullición, algunos de
28
ellos incluyen contaminantes semivolátiles como los bifenilos policlorados
(PCBs), los hidrocarburos poliaromáticos (PAHs), y otros pesticidas y
herbicidas. Esta técnica ha logrado un 99,9% de porcentajes de remoción a full
escala, pero aún no ha sido utilizada para el tratamiento de sitios contaminados
con toxafeno, sin embargo, se perfila como una buena alternativa. (21)
2.3. BIODEGRADACIÓN DE COMPUESTOS HALOGENADOS
Los compuestos halogenados, son fuertemente electronegativos, lo que hace,
que al estar unidos al átomo de carbono, se obtenga una deficiencia de
electrones, que aumenta proporcionalmente al incrementar el número de
halógenos, favoreciendo los procesos reductivos (como es el caso de
plaguicidas altamente clorados como el toxafeno); mientras que los procesos
oxidativos, se favorecen, cuando las moléculas presentan una menor cantidad
de halógenos unidos a la molécula (42,82,83).
Durante la biodegradación de compuestos orgánicos halogenados, priman los
procesos de deshalogenación, donde el microorganismo elimina o sustituye el
halógeno, generando sustancias algunas veces menos toxicas, o en ocasiones
más toxicas que el componente inicial. Dentro de los mecanismos de
deshalogenación, que se pueden dar tanto en condiciones aerobias como
anaerobias, pueden existir varias vías de deshalogenación: como la oxidativa,
la hidrolítica, la sustitución intermolecular, la dihidroeliminación y la
deshalogenación reductiva (42,82,83)
2.3.1 Procesos de Deshalogenación reductiva
Muchos de los procesos de decloración en el ambiente son catalizados por
bacterias anaeróbicas que pueden metabolizar los componentes
haloaromáticos o haloalifáticos. La deshalogenación reductiva (DR) implica la
eliminación de los sustituyentes halógenos como iones y su correspondiente
sustitución por un hidrogeno en forma de electrones y protones este puede
darse en tres casos diferentes (41,82,83):
29
o DR acoplada a cometabolismo:Muchos microorganismos metanogénicos,
acetogénicos, sulfato reductores y bacterias reductoras de hierro realizan
una deshalogenación co-metabólica que no genera ningún beneficio para el
organismo, y por lo cual las tasas de degradación son mucho menores,
que otros tipos de DR (40,42, 83).
o DR ligada al metabolismo de carbono: Las reacciones de DR no son
restringidas a bacterias estrictamente anaeróbicas; las bacterias purpuras
del azufre como Rhodospirillum rubrum, R. photometricum y
Rhodopseudomonas palustris crecen fototróficamente con ácidos
halocarboxílicos, en usencia de oxígeno. La remoción reductiva del
sustituyente halógeno es seguida por la asimilación del correspondiente
acido carboxílico (40,83).
o DR como proceso respiratorio (Halorespiración): Existen bacterias que
usan la energía generada en el proceso de deshalogenación para la
síntesis de ATP acoplándolo a un proceso respiratorio anaeróbico, al que
se le conoce como halorespiración (40,42,83). Se ha demostrado que esta
reacción es exergónica para la mayoría de los compuestos halogenados
por lo que pueden ser termodinámicamente favorables para algunos
microorganismos como aceptores de electrones bajo condiciones de
anoxia; la energía libre de Gibbs (ΔGº) generada en el proceso de
decloración puede estar dentro del rango de -130 a -180kJ mol-1. El
potencial redox generado, es comparable al proceso de denitrificación y
más alto que el generado en el proceso de sulfato reducción (40, 41, 83).
Las enzimas clave implicadas en el proceso de halorespiración son las
dehalogenasas reductivas (RDs), una clase de enzimas capaces de
eliminar cloruros de las moléculas. La mayoría delas RDs caracterizadas
hasta el momento, están estrechamente ligadas con la membrana
citoplasmática, reforzando su rol en el transporte de protones acoplados a
la fosforilación y producción de ATP (40-43, 83)
30
Para los procesos de deshalogenación reductiva, se han caracterizado hasta el
momento, varios microorganismos pertenecientes a diferentes filums; algunas
bacterias como Desulfitobacterium (44), Sulfurospirillum, Desulfomonas,
Desulfovibrio y Tricholobacter han demostrado ser metabólicamente versátiles
con respecto al espectro de donadores y aceptores de electrones que
necesitan para la producción de biomasa (40,41), mientras que,
Dehalococcoides (84,85), Dehalobacter spp (45,46,86), Dehalobium
chlorocoercia DF-1 (87, 88 89) y Dehalogenimonas Lykanthroporepellens (90)
son bacterias fuertemente especializadas, y estrictamente dependientes del
proceso de halorespiración para su crecimiento, y en la mayoría de los casos,
necesitan hidrogeno como donador de electrones.
Los halorespiradores deben competir continuamente con los microorganismos
hidrogenotrópicos, acetogénicos, metanogénicos y reductores de sulfato,
cuando el H2 es el principal donador de electrones (40, 41). Dado que bajo este
proceso, el contaminante sirve como aceptor final de electrones, se debe limitar
la disponibilidad de otros aceptores de electrones (sulfato, hierro, nitrato, entre
otros) que puedan incrementar la biomasa de los competidores e incrementar,
los donadores de electrones alternativos (hidrogeno, acetato, formato) (40, 41,
43,83, 84).
2.3.2 Biodegradación de COPs
En esta parte, no se pretende hacer una revisión extensa de todos los COPs,
sino que, dada la escasa información acerca de la biodegradación del toxafeno,
se pretende hacer énfasis en dos tipos de moléculas, para señalar algunos
mecanismos de degradación, que podría compartir el toxafeno: 1. El
hexaclorociclohexano (HCH), un plaguicida clorado de estructura cíclica que
puede existir en 8 formas químicas denominadas esteroisomeros y 2. Los
Bifenilos policlorados (PCBs) que se componen de dos anillos fenilos con 1 a
10 átomos de cloro, existiendo aproximadamente 209 congéneres, de acuerdo
a la cantidad y posición de los cloros.
31
2.3.2.1 Hexaclorociclohexano (HCH)
El Hexaclorociclohexano (HCH), conocido anteriormente como hexacloruro de
benceno (BHC), es una sustancia química sintética que existe en ocho formas
químicas llamadas esteroisómeros. Los diferentes isómeros se nombran de
acuerdo a la posición de los átomos de hidrógeno en la estructura de la
sustancia química (α-, β-, ϒ- yδ) (91, 92). Una de las formas más estudiadas, ya
que constituye 9-18% de los isómeros de HCH, es la forma gamma-HCH (o γ-
HCH), más conocida como Lindano (32). Esta sustancia se utilizó como
insecticida en frutas, verduras, y en la protección de cultivos forestales, así
como para la prevención de las enfermedades transmitidas por vectores
durante muchas décadas (como control de sarna en animales o piojos en
humanos) (92,32).
Se sabe que el HCH puede permanecer en el aire durante amplios períodos de
tiempo y transportarse a largas distancias en función de las condiciones
ambientales (90-93). En los seres humanos, la inhalación de ciertas cantidades
toxicas de HCH, puede resultar en trastornos de la sangre, mareos, dolores de
cabeza, y los posibles cambios en los niveles de hormonas sexuales (92). En
los animales, se ha evidenciado que todos los isómeros pueden producir
efectos hepáticos y renales, y daños en el sistema reproductor (90,92,32).
2.3.2.1.1 Biodegradación de hexaclorociclohexano (HCH)
La degradación microbiana de HCH en suelos y en sedimentos, ha sido
estudiada tanto en condiciones anaeróbicas como aeróbicas ya que la
mineralización completa, es llevada a cabo solo en sistemas oxidativos (94,95).
Existen algunos isómeros como el β-HCH, que debido a la posición ecuatorial
de los cloros, su transformación es más limitada y por esto se encuentra de
manera más persistente en el ambiente (96).
En 2005 Quintero et al. Evaluó la degradación anaeróbica de los isómeros α, γ,
β y σ-HCH en medio liquido con lodos, y encontró, que los isómeros α- y γ-
HCH desaparecían entre 20 y 40 días, mientras que, los isómeros más
recalcitrantes (β y σ-HCH) solo eran degradados al cabo de 120 días. En este
32
estudio se observó la producción de metabolitos intermedios como el
pentaclociclohexano (PCCH), tetraclorociclohexano (TCCH), tri-, di- y
monoclorobenceno (96).
Bajo condiciones aeróbicas, el isómero β-HCH presenta limitada
transformación (97,98); pero, bajo condiciones anaeróbicas, se ha observado
que este proceso puede ocurrir por decloración, hasta obtener benceno o
clorobenceno bajo condiciones metanogénicas (99,100). La decloración de este
isómero, se lleva a cabo por dicloroeliminación (removiendo dos átomos de
cloro y generando un doble enlace) (94,96,99) por cometabolismo en cultivos
puros de Clostridium spp, y Citrobacter freundii (101), o cultivos mixtos
originados de suelos o sedimentos contaminados (79,96,99,100).
Existen bacterias sulfato reductoras: Desulfovibriogigas, Desulfovibrio
africanus, y Desulfococcus multivorans, que pueden realizar dehalogenación
del lindano con acumulación de productos finales como el clorobenceno y el
benceno (102); así como, microorganismos halorespiradores como
Dehalobacter sp. que también pueden participar de los procesos de
deshalogenación reductiva de isómeros recalcitrantes como lo es el β-HCH,
aunque, únicamente bajo la participación de Sedimentibacter sp, un
microorganismo que no es conocido por participar en procesos de decloración
(46). Se ha concluido que al obtener consorcios degradadores de HCH, y
aportar ciclos de fases aeróbicas y anaeróbicas, existen mayores posibilidades
de realizar un efectiva degradación del contaminante (94,95).
2.3.2.2 Bifenilos policlorados (PCBs)
Los Bifenilos policlorados (PCBs) son productos artificiales conocidos como
hidrocarburos clorados, que se componen de dos anillos fenilos con 1 a 10
átomos de cloro, y existen en aproximadamente 209 congéneres, de acuerdo a
la cantidad y posición de los cloros (51, 52). Los PCB fueron fabricados desde
1929 en diferentes mezclas, diferidas entre sí, por su cantidad de sustituyentes
clorados (Aroclor 1221, 1242 y 1260); fueron utilizados en cientos de
33
aplicaciones industriales y comerciales, incluyendo, el uso en pinturas,
plásticos y productos de caucho, así como en equipos de transferencia de calor
eléctrica y equipos hidráulicos (como transformadores y condensadores); hasta
su prohibición en 1979, debido a su alta persistencia ambiental y toxicidad
(103, 104).
Su alta estabilidad química, superhidrofobicidad y toxicidad que depende en
cierta medida, de la cantidad de cloros que contenga los congéneres; han
hecho que los PCBs, sean uno de los COPs más persistentes alrededor del
mundo, ya se encuentra distribuido en el ambiente, incluso en lugares remotos
como la Antártica y el norte de Greenland (103-106).
En cuanto a los riesgos a la salud humana, existen estudios que sugieren que
la alta exposición a los PCBs puede producir irritación de la nariz y los
pulmones, acné, malestar gastrointestinal, alteraciones de la sangre, en el
hígado, depresión y fatiga. Mientras que en los animales, puede producirse
episodios de anemia, cáncer de hígado, aumento en la tasa de muertes
prematuras y alteraciones en el sistema inmunitario, la tiroides y los órganos
reproductivos. (104, 105, 107)
2.3.2.2.1 Biodegradación de PCB
Los procesos de decloración reductiva de PCBs se han demostrado como
procesos naturales en muchos ambientes acuáticos (108-109), lo que provee
una descontaminación parcial de los ambientes, que al ser acoplados a
procesos de degradación aeróbica, se puede lograr una completa destrucción
de este tipo de contaminantes (103, 110, 111).
Se han descrito varias rutas de degradación tanto en el ambiente como bajo
condiciones de laboratorio; típicamente, el proceso de decloración se da
cuando el cloro se encuentra en posición meta y/o para, generando
sustituciones orto, que aunque no son muy comunes, también se han estudiado
(110-113). Existen varios microorganismos que son responsables de los
diferentes procesos de decloración de PCB, sin embargo, su crecimiento y
34
establecimiento en diferentes cultivos enriquecidos, depende de ciertos
factores ambientales, como lo son: la disponibilidad de aceptores y donadores
de electrones, que pueden determinar, a su vez, la ruta y el grado de
decloración (51,111,112,113). En 2007 Bedard D et al. reportó que
Dehalococcoides sp cepa CBDB1, puede utilizar los PCBS en mezclas
comerciales como aceptor final de electrones (38,114). Entre los
microorganismos que se han citado como degradadores de PCBs, se
encuentran varios halorespiradores como: Dehalobium chlorocoercia DF-1,
muy estrechamente relacionada con el género Dehalococcoides,
encontrándose dentro del mismo Filum Cloroflexi (84,88,89).
2.3.2.2.2 Decloración de PCBs por priming
Es una estrategia promisoria que busca incrementar la decloración de PCBs
por comunidades microbianas halorespiradoras. La estrategia supone, que
dichos compuestos “priming” generan una ventaja a los microorganismos que
poseen enzimas o cofactores que tienen especificidad sobre compuestos
halogenados, al brindar una molécula que sea más fácilmente asimilable, para
estas bacterias (35-38,114,115).
Un estudio encontró, que los mecanismos de deshalogenación de ciertos
congéneres de PCB, pueden ser activados por “priming”, al utilizar diferentes
moléculas como benzoatos halogenados (35) o bifenilos bromados (como el
2,6-bromobifenil), que presento la mayor efectividad en los procesos de
deshalogenación reductiva (36, 37, 38). La habilidad de varias sustancias
cíclicas mono- o di- halogenadas, incluyendo halobenzoatos para potencializar
la decloración del PCB ha sido estudiada, junto con varios bromo-análogos,
encontrando una acción positiva de priming, sobre las comunidades
enriquecidas en base a su habilidad para dehalogenar estas moléculas, y
consecuentemente algunos congéneres de PCBs (36,37,114,115).
Para lograr el efecto “prime” esperado, se hace necesaria la evaluación de
diferentes moléculas en cultivos enriquecidos, que no presenten interferencias
con el contaminante, ni sean más recalcitrantes o toxicas que este; y
35
adicionalmente, que sean degradadas completamente (35,38,39,115). Este tipo
de tratamiento, también han sido usado para otros COPs como las dioxinas,
logrando un efecto positivo en los mecanismos de deshalogenación reductiva
de este plaguicida (39), sin embargo, hasta el momento, no se conocen
reportes de su uso para el toxafeno.
2.4. BIODEGRADACIÓN DE TOXAFENO
Como regla general para los dos contaminantes descritos anteriormente (HCH
y PCBs), los congéneres con mayor número de cloros (que son altamente
estables e hidrofóbicos), se perfilan como buenos sustratos para procesos de
degradación anaeróbica, vía halorespiración (donde la molécula actúa como un
aceptor de electrones), u otros procesos de deshalogenación reductiva (como
cometabolismo). Mientras que, los congéneres con menos cantidad de cloros
son más susceptibles a ser metabolizados por vías aeróbicas.
Para el toxafeno, parece funcionar de igual manera esta regla, aunque la vía
aeróbica (116) o la utilización de ciclos (como en la tecnología DARAMED)
(117), no ha sido descrita con exactitud en la literatura. Los estudios de Lacayo
y colaboradores en 2004 evaluaron la degradación de toxafeno utilizando dos
tipos de reactores (uno anaeróbico y uno aeróbico) que operaban en
secuencia; después de 6 semanas el 87% del toxafeno técnico fue degradado,
y a la semana 39 se degrado en un 98%. Sin embargo, la mayoría de la
conversión, fue llevada a cabo en el reactor anaeróbico, en donde la
concentración de congéneres con más sustituyentes cloro, decreció a mayor
velocidad bajo estas condiciones (117).
Existen escasos estudios que han demostrado procesos de transformación
oxidativa de toxafeno, de los cuales, la mayoría refieren a procesos muy lentos
e incompletos de degradación (118-124), especialmente de algunos
congéneres muy recalcitrantes como B8-1413 (p26) y B9-1025 (p50) (121,122).
Existen dos estudios con microorganismos aislados, que han demostrado ser
capaces de degradar toxafeno en condiciones aeróbicas: Pseudomonas putida,
36
aislada de camfor como única fuente de carbono (123), y Bjerkandera sp.cepa
BOL13, un hongo de pudrición blanca (124).
Sin embargo, se ha demostrado, que la degradación de toxafeno, es llevada a
cabo principalmente, bajo condiciones de anaerobiosis, vía deshalogenación
reductiva, o dehidrocloración, dando lugar a congéneres menos clorados y más
insaturados (8,9,13-20,125-128). No obstante, varios componentes del
toxafeno son diferencialmente transformados en el ambiente: algunos
congéneres son más persistentes, y otros son degradados rápidamente; esto
implica que la degradación está estrechamente relacionada con el número, y la
posición de los sustituyentes clorados (1,8,14,16,126).
La ruta más descrita de transformación bajo condiciones de anoxia, en
sedimentos y suelos, es la sustitución de Cl por H (14,15,16), los residuos en
estos medios están usualmente dominados por los congéneres 2-exo,3-endo,6-
exo,8,9,10-hexaclorobornano (B6-923) y 2-endo,3-exo,5-endo,6-exo,8,9,10-
heptaclorobornano (B7-1001) (14,16,18,126-127).
En 1996 Fingerling y colaboradores estudiaron la degradación de toxafeno en
suelo bajo condiciones anaeróbicas, de 6 bornanos policlorados, todos los
bornanos fueron transformados individualmente por deshalogenación reductiva,
pero este proceso, dependió estrechamente del estado de cloración
(nonaclorobornano> octaclorobornano > heptaclorobornano). A su vez, se
demostró que ninguno de estos 6 componentes, fue degradado en suelos
autoclavados, lo que sugiere que la degradación, es principalmente mediada
por microorganismos (16).
De la misma manera, Buser et al estudiaron la degradación de toxafeno técnico
bajo condiciones anaeróbicas en lodos de una planta de tratamiento de aguas,
y encontraron que los clorobornanos, los clorocanfenos y compuestos
relacionados, tuvieron una rápida degradación por DR en orden de
decacloro>nonacloro>octacloro>heptacloro. En los lodos esterilizados, se
evidencio degradación más lenta que en los lodos anaeróbicos; y se demostró,
que en estos últimos, los congéneres más tóxicos, denominados Toxican A y B,
37
también fueron degradados, mientras los más persistentes p26 y p50, fueron
degradados, pero más lentamente (15).
Entre los microorganismos que se han citado en la literatura como
degradadores potenciales de toxafeno en condiciones anaeróbicas se
encuentran: Enterobacter sp. Cepa D1un microorganismo anaerobio facultativo,
gram negativo que tiene la capacidad de crecer y desarrollarse con
suplementos de toxafeno en rangos de 3-96mg/l; metabolizando rápidamente
octaclorocanfenos, nonaclorobornanos, y decaclorobornanos, mientras que los
hexaclorocamfenos y heptaclorobornanos fueron más lentamente degradados y
subsecuentemente acumulados a lo largo del experimento (19), sin embargo,
en este estudio no se precisa bajo que mecanismo, este microorganismo
metaboliza el toxafeno.
Finalmente Dehalospirillum multivorans, fue citado como degradador de
toxafeno en dos estudios de Ruppe y colaboradores en 2003. Este
microorganismo gram negativo y estrictamente anaerobio, muestro una rápida
eliminación de octa- y decacloros de los componentes técnicos del toxafeno
durante los primeros 16 días de tratamiento, evidenciando acumulación
principalmente del compuesto HxSed(14). En el segundo estudio, se incubo
este microorganismo con dos metabolitos detectados en los sedimentos del
lago Ontario (Canadá): 2-exo,3-enco,6exo,8,9,10-hexaclorobornano (B6-923) y
2-endo,3-exo,5-endo,6-exo,8,9,10-heptaclorobornano (B7-1001). Se evidencio
que después de 14 días, la biotransformación del B7-1001, resulto en dos
penta- y seis hexa-clorobornanos; mientras que el B6-923 resulto en el 70% de
transformación con tres petaclorobornanos, uno de los cuales también fue
identificado como producto de transformación del B7-1001 (20).
De los mecanismos de degradación de este contaminante y los
microorganismos que participan en esta, queda mucho por estudiar y descubrir;
y así como otros COPs se ha evidenciado que los procesos de degradación,
dependen en gran medida de la biodisponibilidad del contaminante (13), la
fuente de carbono, los donadores de electrones y la formación de metabolitos
(9,51,43).
38
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la biodegradación anaeróbica de Toxafeno en suelos contaminados del
municipio de El copey
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Evaluar diferentes tratamientos anaeróbicos de biorremediación en
suelos contaminados con toxafeno.
• Estudiar la transformación de toxafeno en cultivos de enriquecimiento
anaeróbicos.
• Evaluar el efecto de moléculas haloorgánicas alternativas sobre la
transformación de toxafeno en condiciones anaeróbicas.
• Determinar la presencia de grupos de bacterias halorespiradoras en
cultivos enriquecidos de suelos contaminados con toxafeno.
39
4. METODOLOGÍA
4.1 REACTIVOS
Para los análisis cromatográficos, se utilizó un estándar analítico de toxafeno
técnico (mezcla de congéneres) marca Dr. Ehrenstorfer. El PCB Nº 209
(2,2,3,3,4,4,5,5,6,6-decaclorobifenil) y Tetracloro-m-xileno (2,4,5,6-tetracloro-m-
xileno) fueron usados como moléculas surrogadas (marca Dr. Ehrenstorfer,
grado estándar analítico).
Para la extracción de toxafeno, se utilizó el Isoooctano (2, 2,4-trimetilpentano,
grado cromatografía) marca J.T Baker; el Sulfato de sodio anhidro granular
(Na2SO4) marca J.T Baker y los filtros de Nylon (25 mm; 0.22 μm) de marca
Agilent.
El 3,3´, 5,5´-tetrabromo-bisfenol A (al 97%), trans-1,2-dibromociclohexano (al
99%) y el 3,3´, 5,5´-tetrabromo-1,1´-bifenil, marca Sigma-Aldrich (grado
analítico); se utilizaron como moléculas bromadas en los cultivos de
enriquecimiento.
4.2 ORIGEN DE LAS MUESTRAS DE SUELO
Las muestras de suelo, se tomaron en las antiguas bodegas de
CENALGODÓN, ubicadas en el corregimiento de Caracolicito, Municipio de El
Copey, al Noroccidente del Departamento del Cesar, en la margen derecha de
la vía El Copey-Fundación por la antigua carretera nacional (coordenadas N
10º 11 W 073º 58, ubicación satelital anexo 2).
Para este estudio, se realizaron dos eventos de muestreo sistemático en el
predio: el primero en el año 2012, donde se recolectaron alrededor de 4
muestras con barreno de giro a 20cm, y 2 muestras con barreno de golpe
(aproximadamente a 0.5m de profundidad) utilizando núcleos de PVC (diámetro
de 5 cm, longitud 15 cm); en 3 puntos diferentes, denominados PM1, PM2 y
40
PM3(figura 3), en cercanía a3 pozos de monitoreo de agua subterránea que se
realizaron en un estudio anterior, para evaluar la migración vertical del
contaminante (27). Cerca al pozo de monitoreo 2, se evidencio una zona de
coloración oscura que expedía un olor fuerte, característico del plaguicida; a
este punto se le denomino PM2.1 (anexo 3); y de allí, se tomaron 4 muestras
superficiales. Las muestras recolectadas en esta ocasión, fueron utilizadas en
todos los ensayos que se realizaron para la extracción de toxafeno y
establecimiento de las condiciones de análisis por cromatografía de gases.
Figura 3. Esquema de los puntos de muestreo en el predio de las antiguas bodegas de CENALGODON
Para el segundo muestreo, realizado en Diciembre de 2013, ese tomaron
muestras de un sitio en cercanía al pozo de monitoreo 2 (recuadro rojo, figura
3). En el lugar, aproximadamente un mes antes del muestreo, se había
realizado una excavación donde se removió el suelo de relleno y se expuso el
suelo original (suelo superficial contaminado); el área expuesta tenía
aproximadamente 6 x 3 metros. Se recolectaron 20 muestras de manera
41
sistemática con barreno de giro, las cuales fueron mezcladas para formar una
muestra compuesta del suelo. Esta muestra fue pasada por un tamiz de 2 mm
y fue utilizada para realizar los análisis de suelo, y los ensayos en
microcosmos. Adicionalmente se tomaron 5 muestras puntuales con núcleos de
PVC y barreno de golpe, para ser utilizadas en el establecimiento de los
cultivos de enriquecimiento anaeróbicos.
4.2.1 Caracterización de los suelos
Para determinar la composición química del suelo, se enviaron dos muestras
compuestas de suelo, tomado en el segundo muestreo, para ser analizadas en
el laboratorio del Instituto Geográfico Agustín Codazzi (IGAC). La humedad y la
capacidad de campo, fueron calculadas, para determinar la cantidad de agua
que debía añadirse a los microcosmos para tener un 100% de capacidad de
campo en los ensayos; estos análisis se determinaron con ensayos de
saturación del suelo realizados por Prieto, en el 2014 (116) en la Unidad de
Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) de la Pontificia Universidad
Javeriana.
4.3 ESTANDARIZACIÓN DE LA METODOLOGÍA DE DETECCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DE TOXAFENO
El toxafeno fue cuantificado por cromatografía de gases (GC-2014, Shimadzu)
acoplado al detector de captura de electrones (ECD) y al detector de ionización
de llama (FID). De manera general, para los dos detectores, se utilizó una
columna DB-XLB (30m x 0.25mm diámetro interno, 0.25 μm de espesor de
pelicula, Agilent Technologies), gas de arrastre helio (1ml/min), y nitrógeno
como gas make up.
4.3.1 Estandarización del método cromatográfico para GC-ECD
Para la estandarización del método cromatógrafico utilizando ECD, se
evaluaron 8 programas de temperatura, descritos en la tabla 2. El volumen de
42
inyección fue 0.2 μl a 220ºC, en modo de Split 1/10, y la temperatura del
detector fue 320 ºC.
Tabla 2. Programas de temperatura evaluados para la estandarización del
método cromatográfico de toxafeno por GC-ECD
Método Programa de temperatura Duración
1 100ºC (2min); 15ºC/min – 160ºC (0min); 5ºC/min
– 300 ºC (6min) 40min
2 170ºC (0); 15ºC/min – 200ºC (0min); 3ºC/min –
300 ºC (6min) 42 min
3 170ºC (2min); 15ºC/min – 200ºC (0min); 2ºC/min
– 300 ºC (6min) 43 min
4 170ºC (2min); 15ºC/min – 220ºC (0min); 2ºC/min
– 300ºC (0min) 61min
5 80ºC (1min); 4ºC/min – 200ºC (0min); 3ºC/min –
230 (0min); 15ºC/min – 250ºC (5min) 48 min
6 100ºC (2min); 5ºC/min – 300ºC (6min) 36 min
7 200ºC (2min); 5ºC/min – 300ºC (6min) 28 min
8 170ºC (2min); 15ºC/min – 200ºC (0min); 2ºC/min
– 250 (5min); 300ºC (0min) 61 min
9 180ºC (2min); 2ºC/min – 300ºC (2min) 64 min
10 220ºC (50min) 62 min
Después de realizar la selección del método cromatográfico, se realizaron
ensayos con muestras ambientales, para la selección de un Split más
adecuado, ya que se presentaban altas concentraciones de toxafeno en las
muestras ambientales, lo que implicaba una elevada señal en el detector y
posibles fuentes de contaminación para la celda. Se evaluaron 5 split diferentes
(1:50; 1:100; 1:150; 1:200 y 1:300) y se seleccionó el Split 1:100, para todos los
análisis con este detector.
La curva de calibración de toxafeno, se utilizó para la cuantificación de la
concentración a través del tiempo, tomando 7 puntos: 20, 50, 100, 200, 300 y
400 mg*L-1, con un coeficiente de determinación (r2) mayor al 0.99 (Anexo 4),
bajo las condiciones de temperatura seleccionadas (descripción en el inciso
4.5.3). También se realizaron curvas para los surrogates Tetracloro-m-xileno
43
(2,4,5,6-tetracloro-m-xileno) y PCB No. 209 (2,2,3,3,4,4,5,5,6,6-
decaclorobifenil), para 7 concentraciones diferentes: 0,125; 0,5; 1,25; 2,5; 5;
7,5 y 10 mg*L-1 (Anexo 5 y 6 respectivamente). Las curvas fueron realizadas
por 3 operarios, utilizando patrones diferentes y realizando inyecciones por
triplicado de cada concentración según los lineamientos de las normas EPA
8081B y 8000C.
4.3.2 Estandarización del método cromatográfico para GC-FID
Utilizando los mismos parámetros anteriormente nombrados, refiriendo al uso
de la columna DB-XLB, al gas de arrastre (He) y make up (N), se evaluaron 6
programas de temperatura, descritos en la tabla 3. El volumen de inyección fue
1 μl a 220ºC, en modo de Split 1:2, y la temperatura del detector fue 310 ºC.
Tabla 3. Programas de temperatura evaluados para la estandarización del
método cromatográfico de toxafeno por GC-FID
Método Programa de temperatura Duración
1 200ºC (2min); 5ºC/min – 300ºC (6min) 28 min
2 170ºC (2min); 7ºC/min – 210ºC (0min); 4ºC/min
– 250ºC (0min); 2ºC/min – 280 ºC (7min) 39.71 min
3 170ºC (2min); 8ºC/min – 210ºC (0min); 5ºC/min
– 250ºC (0min); 3ºC/min – 280 ºC (5min) 30 min
4 80ºC (1min); 4ºC/min – 200ºC (0min); 3ºC/min –
230ºC (0min); 15ºC/min – 280ºC (5min) 45 min
5 200ºC (2min); 10ºC/min – 250ºC (0min); 3ºC/min
– 300 (6min) 29.67 min
6 170ºC (2min); 12ºC/min – 200ºC (0min); 3ºC/min
– 300ºC (4min) 41.8 min
La curva de calibración de toxafeno fue realizada utilizando 10 puntos, bajo las
condiciones de temperatura seleccionadas (descripción en el inciso 4.6.4): 200,
400, 600, 1.000, 1.200, 1.400, 1.800, 2.200 y 3.000 mg*L-1(anexo 7), realizando
3 inyecciones por concentración, y usando una ventana de integración entre
10,85 +/- 0,048 hasta 30,57 +/- 0,09. De la misma manera, se realizaron curvas
para los surrogates Tetracloro-m-xileno (2,4,5,6-tetracloro-m-xileno) y PCB No.
44
209 (2,2,3,3,4,4,5,5,6,6-decaclorobifenil), para 7 concentraciones: 1, 2, 3, 5, 10,
15 y 20 mg*L-1 (Anexo 8 y 9 respectivamente).
4.4 ESTANDARIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN DE TOXAFENO
Para la estandarización de las metodologías de extracción, se usó como base
la normativa EPA 3550B (con algunas modificaciones), siendo necesarios
varios ensayos de extracción utilizando suelos sin contaminantes dopados con
toxafeno. Estos suelos se obtuvieron, del jardín del edificio 54 de la facultad de
ciencias en la Pontificia Universidad Javeriana.
De acuerdo a la normativa de extracción (EPA 3550B), se presentaban dos
solventes sugeridos: Hexano y cloruro de metileno; no obstante, y debido la
restricción de sustancias de la Universidad, el Hexano, no pudo ser utilizado
como solvente para este estudio. Por otro lado, el cloruro de metileno, también
fue descartado ya que por su contenido de cloro, la señal que se obtenía con el
detector ECD, era demasiado alta, y esto podría contaminar la celda (según
observaciones del proveedor).Por este motivo, se seleccionó el isooctano, que
de acuerdo a la norma EPA 8081B, también es sugerido para la detección de
pesticidas organoclorados por cromatografía de gases.
4.4.1 Ensayos de extracción de toxafeno a partir de suelos
Para determinar la metodología de extracción a partir de suelos, se estudiaron
dos técnicas diferentes, que se exponen en detalle en la tabla 4. Para cada
ensayo, se utilizaron dos muestras de suelo sin contaminante de diferente
procedencia: Suelo 1, obtenido del jardín del primer piso del edificio 54 de la
Pontifica Universidad Javeriana; y Suelo 2, obtenido de un predio boscoso de
pastoreo de ganado en el Valle del cauca (este suelo fue obtenido del proyecto
silvopastoriles, realizado en la Unidad de Biotecnología y Saneamiento
Ambiental)
45
Tabla 4. Descripción de las metodologías de extracción evaluadas para suelos
Denominación Descripción de la metodología
Método largo
5 g Suelo dopado + 5 gNa2SO4 + 10ml isooctano
Vortex por 1 min
Shaker por 24 h para extraer el toxafeno
Vortex por 1 min
Dejar decantar y tomar el extracto
Método Corto
5 g Suelo dopado + 5 gNa2SO4 + 10ml isooctano
Vortex por 1 min para homogenizar
Baño de ultrasonido por 18h para extraer el toxafeno
Vortex por 1 min
Dejar decantar y tomar la muestra
A cada muestra que contenía 5g de suelo dopado (con 50 mg*L-1 de toxafeno),
se adicionaron 10 mg*L-1 de Tetracloro-m-xileno y PCB Nº 209, dejando
evaporar el solvente (isooctano) durante 20min. A continuación se adicionaron
5 g de sulfato sódico anhídrido y 10 ml de isooctano. Culminado el proceso de
extracción se realizó un primer paso de filtrado, utilizando lana de vidrio, y a
continuación, se utilizó un filtro de Nylon de 0.2µm como segundo y último
paso; las muestras se almacenaron a -4 ºC hasta su análisis por GC/ECD.
4.4.1.1 Extracción de toxafeno a partir de muestras ambientales
Para determinar la reproducibilidad del método de extracción seleccionado, se
utilizó suelo contaminado del segundo muestreo. Se manejaron 9 réplicas de
suelo estéril, junto con 9 réplicas de suelo sin tratamiento; y se sometieron al
proceso de extracción. A continuación, se realizó la inyección en el equipo de
cromatografía con detector de captura de electrones, y se realizó la respectiva
integración para determinar la concentración de toxafeno y la variabilidad entre
las muestras; se calcularon los porcentajes de recuperación de los surrogates
(% Recovery), para determinar si el método cumplía con lo estipulado por la
norma EPA 8081B para mezclas multicomponente como el toxafeno.
4.4.2 Extracción de toxafeno a partir de lodos
Para generar el lodo dopado, se buscó simular las mismas condiciones de
extracción que se presentarían en los cultivos de enriquecimiento, para ello: se
46
tomó 1g de suelo no contaminado, y se dopo con toxafeno, a una
concentración final de 80 mg*kg-1; a continuación, se adicionaron 4.5ml de
medio cultivo txA (ver descripción en el inciso 4.6) y se dejó en contacto con el
suelo durante 3 días.
Para la extracción, se utilizó baño de ultrasonido con shaker, y se quiso
determinar, si se debía hacer separación de la fase acuosa y la fase sólida de
la unidad experimental; para ello se realizó un ensayo de extracción con suelos
dopados con toxafeno, que consistió en evaluar los porcentajes de
recuperación que se presentaban al procesar toda la unidad experimental bajo
esta metodología de extracción, y compararla con la extracción que se
realizaba al medio acuoso y a la fase sólida, por separado.
Para realizar la extracción, se adicionaron los surrogates Tetracloro-m-xileno y
PCB Nº209 a una concentración final de 5 mg*kg-1 en la unidad experimental, y
se realizó vortex por 1min dejando en contacto por 20min. Para el
procesamiento de cada una de las fases, se esperó a evidenciar decantación, y
se apartó el suelo húmedo del medio de cultivo, a continuación se adiciono 5ml
de isooctano a cada fase. Para el caso del procesamiento de la unidad
experimental completa, se adicionaron 10ml de solvente.
La metodología de extracción utilizada fue la siguiente: baño de ultrasonido por
2 h, seguido por 20 h en Shaker, y finalizando con 2 h de baño de ultrasonido.
La limpieza de las muestras se realizó, trasfiriendo 5ml del solvente a un frasco
de vidrio limpio que contenía 2g de sulfato de sodio anhidro, con el fin de
eliminar cualquier rastro de agua de la muestra; finalmente se realizó la
limpieza usando filtro de Nylon de 0.2µm.
47
4.5 BIODEGRADACIÓN DE TOXAFENO EN MICROCOSMOS
Los ensayos de degradación se realizaron en frascos de vidrio de 20ml con
tapa y agrafe para favorecer la atmosfera anaeróbica. Se tomaron cinco
gramos de suelo (en peso húmedo) para cada unidad experimental y se
adicionaron 841μl de agua con el fin de disminuir la trasmisión de oxígeno,
llegando a un 100% de saturación, según la capacidad de campo (cantidad
determinada por ensayos previos de humedad y capacidad de campo del
suelo, inciso 4.4.1).
Se evaluaron 5 tratamientos y dos controles, que se exponen en detalle en la
tabla 5 y se distribuyeron para 7 eventos de muestreo en un periodo de 270
días (utilizando muestreo por sacrificio). Todos los tratamientos fueron
evaluados bajo una atmosfera modificada con nitrógeno, se utilizó un bombeo
continuo de gas estéril por 1 min para cada unidad experimental, y se selló el
frasco de vidrio, con tapón de caucho y agrafe. A continuación, se incubaron
los frascos en oscuridad a 30ºC.
La base de cada uno de los tratamientos seleccionados, se fundamentó en la
adición de diferentes materias que pudieran bioestimular la comunidad del
suelo, como la melaza, los nutrientes (fosforo y nitrógeno) y el material vegetal;
este último tratamiento, fue evaluado en la degradación aeróbica de toxafeno
(116). El Hierro cero Valente, fue adicionado debido a su capacidad reductora y
su potencial para degradar diferentes contaminantes; por ello es usado en
estrategias de biorremediación a Full escala como DARAMED (21). Finalmente,
los biosólidos fueron añadidos para bioaumentar y bioestimular la comunidad
del suelo, y con ello obtener mayor degradación de toxafeno, así como ha sido
demostrado en otros estudios (15,117),
48
Tabla 5.Descripción de los tratamientos evaluados en microcosmos
Designación Tratamiento Descripción
AT.NA Atenuación Natural SueloA
EST Control abiótico Suelo estérilB
MV Material Vegetal
Suelo + hojas de Eucalyptuscinerea
(2,5%) + hojas de Cupressuslusitánica
(2,5%)A
MEL Melaza Suelo + N y PC + Melaza (1%)D
LOD.MEL Biosólidos + melaza Suelo + Stock de N y PC + Melaza (1%)D+
Biosólidos (5%)E
ZVI.CAL
Hierro cero valente +
Melaza + biosólidos +
cal
Suelo + N y PC + Melaza (1%)D +
Biosólidos (5%)E + Hierro cero valente
(1%) + Cal (0,1%)
ZVI.LOD Hierro cero valente +
Melaza + biosólidos
Suelo + N y PC + Melaza (1%)D +
Biosólidos (5%)E + Hierro cero valente
(1%)
A. Se adicionaron 841 µl de agua destilada estéril a razón de mantener el 100% de
saturación y favorecer la disminución de oxígeno en los suelos.
B. La esterilización de los controles abióticos se realizó por 15 min a 15 psi (120 ºC) y se
repitió 3 veces, en 3 días consecutivos.
C. El stock de nutrientes de N y P contenía (g/l): 1084 NH4Cl; 0.115 K2HPO4 y 0.039
KH2PO4, fue adicionado únicamente a los tratamientos que contenían melaza a una
concentración final teórica (mg*Kg-1 de suelo) de 182.32 NH4Cl; 19.37 K2HPO4; y 6.49
KH2PO4.
D. La melaza, se distribuyó a lo largo del experimento hasta lograr una concentración final
del 1% (0.01gr melaza por adición) durante 5 momentos de tiempo (0, 40, 80, 120 y
160 días).
E. Los biosólidos utilizados, son los productos de digestión anaeróbica de los sólidos
sedimentados en el tratamiento primario de aguas residuales, y fueron obtenidos de la
planta El Salitre, Bogotá, Colombia.
4.5.1 Medición del pH
Se realizaron 4 mediciones de pH a lo largo del experimento (0, 20 ,120 y 200
días), por duplicado para cada tratamiento. A una unidad de microcosmos que
contenía 5 g de suelo, se agregaron 10 ml de agua destilada y a continuación,
se agitó a 200 rpm (30 °C) por 24 horas. Se dejó precipitar el suelo por 10 min
y se determinó el pH (Schott Instruments, Lab 850)
49
4.5.2 Extracción de toxafeno a partir de microcosmos
En cada evento de muestreo, se tomó la totalidad de la unidad experimental (3
réplicas por cada tratamiento). Se adicionaron 625 μL del stock de Tetracloro-
m-xileno (400 mg*L-1, disuelto en Isooctano) para una concentración final de 50
mg*L-1 como molécula surrogada, y se dejó en contacto con la muestra 20
minutos para permitir la evaporación del solvente.
Luego, se añadió 5g de sulfato de sodio anhidro granular, se agito
vigorosamente para mezclar, y se adicionaron 10 ml de isooctano. Se volvió a
agitar los frascos vigorosamente, y se sellaron con un agrafe y tapón de caucho
para ser colocados en baño de ultrasonido, durante 18h. Finalmente se
tomaron 2ml de solvente con una jeringa y se pasó a través de un filtro de
Nylon(Agilent, 25 mm; 0.22 μm). El PCB No. 209 se utilizó como estándar
interno y fue añadido al realizar la dilución de las muestras (1/20 o 1/10 según
correspondiera) a una concentración final de 2.5 mg*L-1.
4.5.3 Análisis por GC-ECD
4.5.3.1 Cuantificación de la concentración de Toxafeno
Debido a que el toxafeno es una mezcla multi-componente, la cuantificación se
realizó por la integración del área total de la mezcla multicomponente, iniciando
en el tiempo de retención 4,6 +/- 0,4 min hasta 21,68 +/- 0.17 min, como se
observa en la figura4. El cálculo de los porcentajes de recuperación de los
surrogates, se realizó integrando los picos valle-valle.
50
Figura 4. Integración de toxafeno y moléculas surrogadas por área total
4.5.3.2 Evaluación de la transformación de toxafeno
La evaluación de la transformación del toxafeno se realizó integrando 11 picos
a lo largo de toda la huella multicomponente. Cada área del pico fue dividida
por el área total de la huella y multiplicada por 100, determinando el porcentaje
del área de cada pico o área relativa; con esto, se quiso evidenciar cambios en
el patrón de la huella, para cada tratamiento de microcosmos a lo largo del
tiempo. Los picos seleccionados se determinaron para los siguientes tiempos
de retención en el cromatograma: 7,14; 8,24; 9,52; 10,74; 11,47; 13,50; 13,71;
16,63; 18,06; 18,52 y 20,33 min como se observa en la figura 5.
51
Figura 5. Integración de 11 picos seleccionados y moléculas surrogadas a lo largo de la huella del toxafeno
4.6 ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS DE ENRIQUECIMIENTO ANAERÓBICOS
El enriquecimiento con suelos contaminados (obtenidos de los núcleos de PVC,
del segundo muestreo), se realizó, utilizando 2 botellas de vidrio ámbar de 120
ml con 10 g de suelo contaminado y 45 ml de medio TxA (ver en detalle más
abajo), a los cuales se les denomino, cultivos madre; y 15 frascos de vidrio de
20 ml, con un 1 g de suelo y 4.5 ml de medio TxA, a los que se les denomino,
cultivos de monitoreo. Se evaluaron 4 tratamientos (tabla 6), en 3 eventos de
muestreo, por sacrificio; evaluando 3 moléculas halorgánicas.
52
Tabla 6. Descripción de los tratamientos en cultivos de enriquecimiento
Denominación Descripción
E- TBBPA Suelo contaminado + medio TxA + 3,3´,5,5´-
tetrabromo-bisfenol-A
E- TBB Suelo contaminado + medio TxA + 3,3´,5,5´-
tetrabromo-1,1´-bifenil
E- DBCH Suelo contaminado + medio TxA + Trans-1,2-
dibromociclohexano
E-Tox Suelo contaminado + medio TxA
Para establecer los cultivos de enriquecimiento, se utilizó un medio de cultivo
propuesto por Adrian y colaboradores en 1998 (130), con algunas
modificaciones; para este estudio se denominó TxA. La característica principal
de la selección de este medio, es que no presentaba otros aceptores de
electrones, con excepción del bicarbonato de sodio y el plaguicida. El medio
TxA contenía (en gramos por litro de agua destilada): 0,2K2HPO4; 1 NaCl; 0,27
NH4Cl; 0,41 MgCl2 * 6H2O; 0,52 KCl; 0,15 CaCl2 * 2H2O; 1 extracto de
levadura; 0,5 Cisteina-HCl; mas 1ml de solución SL9 de elementos de traza
(anexo 10) y 1 ml de Rezasurina (al 0.1 %).
Inicialmente, se prepararon 400ml de medio de cultivo ajustando el pH a 6,8
utilizando NaOH 1N; se marcó el nivel, y se adicionaron 40ml más de agua. A
continuación se llevó a ebullición, hasta recuperar el volumen inicial y
evidenciar el cambio de viraje de la rezasurina. Finalizado el proceso de
autoclave, el medio se enfrió bajo un flujo de nitrógeno gaseoso estéril, y luego
se adicionó: NaHCO3 (a una concentración final de 2.5 g*L -1), 0.4ml de
solución stock de vitaminas, propuesta por Arbeli y Ronen, 2003 (131)con
algunas modificaciones (anexo 11), 0,4ml de solución de selenito y tungstate
(anexo 12), y 20ml de un stock de donadores de electrones a 10mM, que
contenía una mezcla de piruvato, formato y lactato.
Para adicionar las moléculas halorgánicas, y evaluar su efecto priming en los
cultivos enriquecidos, se tomó una fracción suelo (1 gr para los cultivos madre,
y 0.2 gr para los cultivos de monitoreo), y se dispuso en los frascos de vidrio. A
53
los cultivos madre, fueron adicionados 250 μL del stock de cada molécula
halorgánica, mientras que a los cultivos de monitoreo, se adicionaron 25 μL
para concentración final de: 0.35mM para el tratamiento con 3,3´,5,5´-
tetrabromo-bisfenol-A; 0.175mM para el tratamiento con 3,3´,5,5´-tetrabromo-
1,1´-bifenil; y 0.35mM para el tratamiento con Trans-1,2-dibromociclohexano.
A continuación se dejó evaporar el solvente por 20min, se adiciono el
excedente de suelo para cada cultivo y se adiciono el medio TxA bajo flujo de
nitrógeno constante durante 1min; finalmente, los frascos se sellaron con tapón
de caucho y agrafe, y se llevaron a incubación a 30ºC en oscuridad. Las
moléculas halorgánicas fueron disueltas en isooctano, o para el caso del
3,3´,5,5´-tetrabromo-bisfenol-A fue disuelto en una mezcla de isooctano:
acetona (1:0,5).
La segunda fase de enriquecimiento se realizó, transcurridos 362 días a partir
del establecimiento de los cultivos iniciales. De igual manera, se realizaron dos
cultivos madre de 50 ml y 15 cultivos de monitoreo de 5 ml cada uno. Para
realizar el pase, se tomaron 5 g de suelo contaminado (a partir de la muestra
compuesta del segundo evento de muestreo), para los cultivos madre y 1 g
para los cultivos de monitoreo.
El suelo dispuesto en los frascos de vidrio, fue esterilizado por 15 min a 15 psi
(120 ºC), repitiendo el proceso 4 veces, en 4 días consecutivos. Finalizado el
proceso, se doparon los suelos con las moléculas halorgánicas manteniendo la
misma relación que se había establecido al inicio del enriquecimiento; y se dejó
evaporar el solvente durante 5 h. A continuación se adicionó el medio de
cultivo TxA (30 ml para los cultivos madre y 3 ml para los cultivos de
monitoreo),bajo flujo de nitrógeno constante durante 1min; y se sellaron los
frascos con tapón de caucho y agrafe. Se tomaron 15 ml de inoculo con jeringa
estéril (a partir de los cultivos madres iniciales), y se transfirieron a cada uno de
los dos nuevos cultivos madre, que contenían 30ml de medio; de la misma
manera se tomaron 1,5 ml de inoculo y se transfirieron a cada uno de los
54
nuevos cultivos de monitoreo. Finalmente se llevaron a incubación a 30ºC en
oscuridad.
4.6.1 Extracción de toxafeno a partir de cultivos enriquecidos
Para la extracción se adicionaron 78µl de la molécula surrogada Tetracloro-m-
xileno, a partir de un stock de 400 mg*L-1 para una concentración final de 3,2
mg*Kg-1, en cada una de las unidades experimentales. Se dejó evaporar el
solvente por 20min en cabina y posteriormente se adicionaron 10ml de
isooctano a cada una de las muestras, se homogenizaron en vortex y se dejó
en baño de ultrasonido por 2h, luego se continuó con shaker por 20h
disponiendo los frascos de forma horizontal, finalizando, nuevamente con baño
de ultrasonido por 2h.
A continuación, se tomó cuidadosamente la fase superior del sobrenadante, y
se limpió de cualquier residuo de agua, con 2g de Sulfato de sodio anhídrido;
luego se utilizó un filtro de Nylon de 0.2µ, y la muestra resultante, se diluyo
según correspondió, para cada evento de muestreo, adicionando el estándar
interno PCB Nº209 a una concentración final de 2.5mg*L-1para los análisis por
GC-ECD y 17 mg*L-1 para los análisis por GC-FID.
4.6.2 Análisis por GC-ECD
Los análisis de 3 eventos de muestreo de la primera fase de enriquecimiento
(0,30, y 50 días), fueron realizados por cromatografía de gases acoplada al
detector de captura de electrones, bajo los parámetros mencionados en el
numeral 4.3. Se analizó la transformación del contaminante, integrando 11
picos a lo largo de toda la huella multicomponente (ver numeral 4.5.3.2).
4.6.3 Análisis por GC-FID
El análisis de la segunda fase de enriquecimiento, fue realizado por
cromatografía de gases con detector de ionización de llama GC-FID (GC-2014,
Shimadzu). El volumen de inyección fue 1 μl a 220ºC, en modo de Split 1:2. El
programa de temperatura fue el siguiente: iniciando en 170ºC (2min);
incrementando 7ºC/min hasta 210ºC (0min); 4ºC/min hasta 250ºC (0min); y
55
2ºC/min hasta 280 ºC manteniendo por 7min. La determinación de la
concentración de toxafeno se realizó por una integración de la huella
multicomponente como se expuso en el inciso 4.5.3.1; pero usando una
ventana de integración entre 10,85 +/- 0,048 hasta 30,57 +/- 0,09.
4.6.4 Extracción de ADN a partir de cultivos de enriquecimiento
La extracción de ADN se realizó, utilizando el kit PowerMax® Soil (MoBIO) a
partir de los cultivos madre de la segunda fase de enriquecimiento,
transcurridos 131 días desde el pase. Inicialmente, se tomó uno de los cultivos
madre de cada tratamiento, y su contenido fue centrifugado en tubos falcon de
15ml a 10.000rpm durante 15min, a continuación, se descartó el sobrenadante,
y se volvió a centrifugar a 10.000rpm por 10min. Nuevamente se descartó el
líquido, se pesaron 10g de muestra en los tubos “PowerMax bead solution
tube”; y se prosiguió con el protocolo de extracción sugerido por el fabricante.
Únicamente se modificó el proceso de lisis con la solución S1, disponiendo los
tubos a calentamiento por 10mina 65ºC (132), seguido por vortex de forma
horizontal por 5 min, continuando con calentamiento a la misma temperatura
por 15 min y finalizando con vortex durante 1 min.
Debido a la baja concentración de ADN obtenida para todos los tratamientos,
se hizo necesario concentrar. A una muestra de 5ml de ADN obtenida a partir
de 10 g se suelo con el kit de extracción, se adicionó 0,2ml de NaCl a 5 M, y
se homogenizó, invirtiendo 3-5 veces; a continuación se adicionaron 10,4ml de
etanol absoluto frio, y se volvió a invertir suavemente de 3-5 veces. Luego, se
centrifugo a 4.150rpm por 30mina temperatura ambiente, se descartó el
sobrenadante, y se adicionaron 6ml de etanol al 70%. Se centrifugo a
3.000rpm por 10min, se descartó el sobrenadante y se dejó secar a
temperatura ambiente durante 30min. Finalmente se resuspendió en 50µl de
buffer de elución estéril (Solución C6 del kit PowerMax® Soil).
56
4.6.4.1 Análisis de resultados por electroforesis
La integridad del ADN fue evaluada mediante electroforesis en un gel de
agarosa al 1% (p/v), teñido con 2μl de SYBR®Safe (Invitrogen); en cámara de
electroforesis por 1 hora a 120 voltios usando buffer TAE 0,5X (EDTA, Tris-HCl,
Acetato). El gel se analizó en un transiluminador bajo luz ultravioleta
(GelDoc™XR+System; Biorad) usando el Hipper Ladder I (Bioline) como
marcador de peso molecular.
4.6.5 Evaluación de la presencia de bacterias halorespiradoras
Se realizó la búsqueda de 7 grupos de bacterias halorespiradoras en los
cultivos de la segunda fase de enriquecimiento, utilizando primers específicos
para el 16s RNAr del gen target de cada organismo como se muestra en la
tabla 7.
Tabla 7. Primers utilizados en la búsqueda de grupos de bacterias
halorespiradoras en cultivos de enriquecimiento
Género Denominación Secuencia sentido 5`-3` Referencia
Dehalococcoides DHC1 (F) y
DHC1377 (R)
GATGAACGCTAGCGGCG
GGTTGGCACATCGACTTCAA
Hendrickson
et al. 2002
(133)
o-17/DF1- type
Chloroflexi
14(F) y
Dehal1265(R)
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
GCTATTCCTACCTGCTGTACC
Watts J.E et
al. 2005
(134)
Cloroflexi Chl348 (F) y
Dehal1884(R)
GAGGCAGCAGCAAGGAA
GGCGGGACACTTAAAGCF
Fagrtvold S
et al 2002
(135)
Desulfitobacterium Dd1 (F) y Dd2(R) AATACCGNATAAGCTTATCCC
TAGCGATTCCGACTTCATGTTC
Fantroussi S
et al.1997
(136)
Desulforomonas BB1(F) y BB1(R) AACCTTCGGGTCCTACTGTC
GCCGAACTGACCCCTATGTT
Loffler F et
al. 2000
(137)
Dehalobacter Deb 179(F) y
Deb 1007(R)
TGTATTGTCCGAGAGGCA
ACTCCCATATCTCTACGG
Schlotelburg
et al. 2002
(138)
Sulfurospirillum
(Dehalospirillum)
JPD121(F) y
JPD557(R)
CCCCATACTCCAACTTATC
TTCTAGGTGACCAGTTTCG
Pietari 2002
(139)
Se trabajó con 2 diluciones para todos los tratamientos con cada set de
primers: 1:20 y 1:50 para los tratamientos: E-TBPPA, E- DBCH y E-Tox; y 1:10
57
y 1:20 para las muestras del tratamiento E-TBB.La amplificación del 16s RNAr
se usó como control del procedimiento de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR),conjunto a cada evaluación realizada para el 16s RNAr de
los grupos de bacterias halorespiradoras. Adicionalmente, se usó ADN de una
cepa pura (no halorespiradora) como control negativo, y ADN de lodos del rio
Bogotá como DNA control. La muestra se obtuvo en Julio de 2015, para un
trabajo de pregrado enmarcado dentro del proyecto “Biorremediación de suelos
contaminados con toxafeno: del laboratorio al campo”; en el tramo del rio que
atraviesa la localidad de Fontibón (puente vial calle 17 con Cra 4 vía Funza-
Bogotá), mediante el uso de una draga que fue arrojada hasta el fondo del rio.
La amplificación del 16s RNAr, se realizó con volumen final de 15 µL, que
incluía: 0.5 mM de los primers universales 27F (5’-
AGAGTTTGATCMTGGTCAG-3’) y 1492R (5’-
TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’), 0.75 U de Taq polimerasa (BIOLASE™
DNA Polymerase; BIOLINE), 0.2 mM de dNTPs, buffer (1X), 3 mM de MgCl2, y
2μl de ADN molde. La PCR se realizó en un termociclador (MyCyclerTM,
BioRad) bajo el siguiente programa: denaturación inicial por 3min a 95°C,
seguida por 30 ciclos que consistieron en una denaturación a 94°C por 1min,
un anillamiento a 55°C por 1min y extensión a 72°C por 2min, finalizando con
una elongación a 72°C por 5min. Los resultados se verificaron con una
electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v), como se describió anteriormente
en el numeral 4.6.4.1.
Para todos los análisis del 16s RNAr de las secuencias target de los grupos de
bacterias halorespiradoras, con los 3 diferentes programas de PCR evaluados,
la reacción se realizó con volumen final de 15 µL, que incluía: 0.5 mM de los
primers evaluados (en la tabla 7), 0.75 U de Taq polimerasa (BIOLASE™ DNA
Polymerase; BIOLINE), 0.2 mM de dNTPs, buffer (1X), 3 mM de MgCl2, y 2μlde
ADN molde. Las PCR se realizaron en un termociclador (MyCyclerTM, BioRad)
bajo los siguientes programas:
58
1. Utilizando las condiciones específicas: se utilizaron las condiciones
específicas de PCR, de acuerdo a lo citado por los autores (tabla 8), con
algunas modificaciones, para cada set de primers.
Tabla 8.Condiciones específicas de PCR según autores, para cada set de
primers, incorporando algunas modificaciones en el protocolo
Grupo Set de Primers Condiciones de PCR
Dehalococcoides DHC1 (F) y
DHC1377 (R)
Denaturación 95ºC (2 min) - 40 Ciclos
[Denaturación 94ºC (1 min); Anillamiento
55ºC (1 min); Extención 72ºC (1 min) ]
Enlongación 72ºC (10 min)*
o-17/DF1- type
Chloroflexi
14(F) y
Dehal1265(R)
Denaturación 94ºC (1 min) - 30 Ciclos
[Denaturación 94ºC (30 seg); Anillamiento
62ºC (30 seg); Extención 72ºC (30 seg) ]
Enlongación 72ºC (5 min)
Cloroflexi Chl348 (F) y
Dehal1884(R)
Denaturación 95ºC (1 min) - 30 Ciclos
[Denaturación 95ºC (45 seg); Anillamiento
60ºC (45 seg); Extención 72ºC (45 seg) ]
Enlongación 72ºC (30 min)
Desulfitobacterium Dd1 (F) y Dd2(R)
Denaturación 95ºC (4 min)* - 30 Ciclos
[Denaturación 92ºC (1 min); Anillamiento
55ºC (1 min); Extención 72ºC (1 min) ]
Enlongación 72ºC (10 min)
Desulforomonas BB1(F) y BB1(R)
Denaturacion 94ºC (3 min) - 30 Ciclos
[Denaturación 94ºC (45 seg); Anillamiento
58ºC (30 seg); Extención 72ºC (1.5 min) ]
Enlongación 72ºC (7 min)
Dehalobacter Deb 179(F) y
Deb 1007(R)
Denaturación 98ºC (3 min) - 28 Ciclos
[Denaturación 93ºC (1 min); Anillamiento
53ºC (1 min); Extención 72ºC (2 min) ]
Enlongación 72ºC (10 min)*
Sulfurospirillum
(Dehalospirillum)
JPD121(F) y
JPD557(R)
Denaturación 94ºC (3 min) - 29 Ciclos
[Denaturación 94ºC (45 seg); Anillamiento
54ºC (30 seg); Extención 72ºC (1.3 min) ]
Enlongación 72ºC (9 min)
(*) Modificación al protocolo
59
2. Condiciones relajadas de amplificación: Para cada set de primers, se
utilizó una denaturación inicial por 2min a 95°C, seguida por 35 ciclos que
consistieron en una denaturación a 94°C por 50 segundos, un anillamiento a
53°C por 1min y extensión a 72°C por 2min, finalizando con una elongación
a 72°C por 10min
3. Condiciones en gradiente: Únicamente evaluada para aquellos primers
que dieran amplificaciones positivas o inespecíficas en cualquiera de las dos
condiciones anteriores. Utilizando una denaturación inicial por 2min a 95°C,
seguida por 35 ciclos que consistieron en una denaturación a 94°C por 50
segundos, un anillamiento en gradiente, evaluando 4 temperaturas,
determinando una mínima de 53ºC y una max de acuerdo a la temperatura
anillamiento referida por los autores para cada set de primers; durante 1min
y extensión a 72°C por 2min, finalizando con una elongación a 72°C por
10min.
Los resultados fueron evaluados mediante electroforesis en un gel de agarosa
al 1% (p/v), teñido con 5μl de SYBR®Safe (Invitrogen); en cámara de
electroforesis con capacidad para 80 muestras (por 2 horas a 125 voltios)
usando buffer TAE 0,5X (EDTA, Tris-HCl, Acetato). El gel se analizó en un
transiluminador bajo luz ultravioleta (GelDoc™XR+System; Biorad) usando el
Hipper Ladder I (Bioline) como marcador de peso molecular.
60
5. RESULTADOS
5.1 CARACTERIZACIÓN DE LOS SUELOS
Según los resultados de análisis realizados por el Instituto Geográfico Agustín
Codazzi (IGAC), presentados en la tabla 9 (métodos utilizados se reportan en
el anexo 13); el suelo se clasifico como franco-arcillo-arenoso, presentando
características fuertemente acidas, y uno de los elementos más abundantes fue
el hierro.
Tabla 9. Caracterización físico-química del suelo
PARAMETRO
pH 5,6
Concentración de Carbono (C.O) 1,30%
Concentración de Nitrógeno Total N 0,09%
Capacidad de Campo* 25.38%
Contenido de humedad* 6,83%
Salinidad CE (dS/m) 0,34
Granulometría del suelo
Arena 47,80%
Limo 27,80%
Arcilla 24,40%
Complejo de cambio (cmol(+)/Kg)
ClC 9,2
Ca 5,1
Mg 0,79
K 0,39
Na 0,06
N-NH4 mg/Kg 32,4
N-NO3 mg/Kg 12,6
Fosforo(disponible) mg/Kg 444
Elementos menores (mg/kg)
Mn 40,2
Fe 90,6
Zn 4,4
Cu 4,4
B 0,16
(*) Ensayos realizados en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental
61
5.2 ESTANDARIZACIÓN DE LA METODOLOGÍA DE DETECCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DE TOXAFENO
5.2.1 Estandarización del método cromatográfico para GC-ECD
El método cromatógrafico escogido para llevar a cabo los análisis por ECD, fue
el método 7, con una duración total de 28min, ya que en el menor tiempo de
corrida, se podía observar el patrón completo de la huella del toxafeno, con
respecto a los demás métodos evaluados (anexo 14). El programa de
temperatura fue el siguiente: 200ºC (2 min), incrementando 5 °C/min hasta 300
°C, mantenido a 6 min, con un split 1:100 (para mayor detalle del método,
remitirse al inciso 4.3.1)
5.2.2 Estandarización del método cromatográfico para GC-FID
Después del análisis de las 6 rampas de temperatura por GC-FID, se determinó
que el mejor método de corrida con este detector, fue el método 2, con una
duración total de 39,71 min .Aunque fueron evaluados otros métodos con
menor duración, se presentaban problemas con el incremento de la línea base,
posiblemente debido al incremento en la temperatura (anexo 15). El programa
fue el siguiente: iniciando en 170ºC (2min); incrementando 7ºC/min hasta
210ºC (0min); 4ºC/min hasta 250ºC (0min); y 2ºC/min hasta 280 ºC
manteniendo por 7min 100 (para mayor detalle del método, remitirse al inciso
4.3.2)
5.3 ESTANDARIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN DE TOXAFENO
5.3.1 Ensayos de extracción de toxafeno a partir de suelos
Se realizaron ensayos utilizando suelos dopados con Toxafeno y moléculas
surrogadas, para determinar los porcentajes de recuperación de cada uno, al
someterlos a dos metodologías de extracción: método corto, y método largo
(ver descripción en la tabla 4, inciso 4.4.1). Estos ensayos fueron realizados
por dos operarios diferentes, con tres replicas por tratamiento cada uno.
En la tabla 10, se observan los resultados obtenidos para este ensayo, en
donde se concluyó, que al procesar las muestras durante 18h en baño de
62
ultrasonido (ensayo denominado método corto), se obtuvo en promedio un
94,84% de recuperación para el toxafeno (independientemente del suelo y del
operario), con respecto a un 88,68% de recuperación en promedio, para el
método largo.
Tabla 10. Porcentajes de recuperación para el ensayo de extracción
Operario Suelo metodología
utilizada
Tetracloro-m-
Xileno Toxafeno PCB Nº 209
%CV %Rec. %CV %Rec. %CV %Rec.
1 Suelo 1 Método
corto
1,3 75,1 1,8 93,6 2,0 140,6
1 Suelo 1 5,5 79,5 4,4 97,4 57,5 148,2
2 Suelo 2 2,4 80,5 1,0 93,5 2,1 139,1
1 Suelo 2 Método
Largo
5,2 78,9 6,8 87,9 5,5 137,7
2 Suelo 1 1,2 74,4 2,7 85,3 1,5 135,8
2 Suelo 2 20,0 80,7 25,6 92,8 17,3 140,0
Método corto: 18 h en baño de ultrasonido; método largo: 24 h en shaker; %CV: Coeficiente
de variación; %Rec: Porcentaje de recuperación
El protocolo de extracción quedo establecido como se muestra en la figura 6; la
preparación de las muestras, se mantuvo de la misma manera, tal y como se
describe en el protocolo de extracción de la EPA 3550, usando baño de
ultrasonido. En el procedimiento final de limpieza, se decidió omitir el paso con
lana de vidrio, ya que se observó que el solvente no extraía partículas de suelo.
63
Figura 6.Protocolo de extracción de toxafeno a partir de suelos
5.3.1.1 Extracción de toxafeno a partir de muestras ambientales
Utilizando la metodología de extracción seleccionada (baño de ultrasonido por
18h), se procedió a verificar la reproducibilidad del método, al realizar
extracción de 18 muestras ambientales del suelo del segundo muestreo (9 de
ellas, estériles).
Los resultados presentados en la tabla 11, muestran que la metodología de
extracción seleccionada, es reproducible en muestras ambientales, ya que se
evidencia que la desviación relativa estándar (CV) 14,26% para las réplicas
estériles y 15,78% para los suelos no esterilizados, permanece tal como se
sugiere en la norma EPA 8081B (<20%). Los porcentajes de recuperación de
Muestra de Suelo (5 g)
•En frasco de vidrio libre de interferentes
Adición de moleculas surrogadas
•Evaporacion de solvente por 20 min
Adición de Sulfato de Sodio anhidro (5 g)
•Homogenización completa en el suelo
Adición de Isooctano (10 ml)
•Sellar con tapa de caucho y agrafe
Baño de ultrasonido 18 h
Limpieza de la muestra
•Tomar 1-2ml de solvente con jeringa
•Pasar por un filtro de Nylon
64
este ensayo, estuvieron entre el 74,81 y 87,01% para el Tetracloro-m-xileno; y
entre 63,59 y 68,75% para el PCBNº209.
Tabla 11. Ensayo de extracción a partir de muestras ambientales
Muestra Unidades de
Área
Concentració
n de toxafeno Promedio
Desviación
estándar %CV
Suelo Estéril
11.534.192,6 7.882,7
10.254,6 1.462,6 14,3
12.267.459,0 8.431,4
14.475.023,0 10.083,3
14.703.245,4 10.254,1
16.434.512,5 11.549,6
17.794.168,2 12.567,0
15.981.759,7 11.210,8
14.174.754,3 9.858,6
14.970.469,2 10.454,0
Suelo
13.493.308,8 9.348,7
10.326,5 1.629,0 15,8
17.958.712,3 12.690,1
11.942.988,4 8.188,6
14.123.876,4 9.820,5
11.800.907,8 8.082,3
15.982.605,1 11.211,4
16.107.436,9 11.304,8
17.141.602,7 12.078,7
14.648.585,9 10.213,2 %CV: Desviación estándar relativa (coeficiente de variación)
En este ensayo, no se determinó la recuperación de toxafeno, debido a que se
desconocía la concentración del plaguicida en las muestras ambientales. Sin
embargo, gracias a esta extracción, se pudo evidenciar que existe una elevada
contaminación en el suelo, encontrándose en promedio 10.291mg*Kg-1 de
toxafeno.
5.3.2 Extracción de toxafeno a partir de lodos
En el ensayo de extracción de lodos, se buscó conocer, si era necesario hacer
una separación de la fase acuosa y sólida de la muestra, para poder tener
buenos porcentajes de recuperación en la metodología de extracción
seleccionada; los resultados del promedio de las réplicas para cada muestra
(n=5) se muestran en la tabla 12.
65
Tabla 12. Resultados del ensayo de extracción a partir de lodos
Muestra Toxafeno Tetracloro-m-xileno PCB Nº209
% Rec. %CV %Rec. %CV %Rec. %CV
Lodo 72,7 6,5 92,8 7,4 71,5 9,6
Fase Aquosa 2,3 88,0 2,6 39,8 -3,4 100,6
Fase sólida 37,6 54,4 35,3 33,1 41,3 49,0
Unificación de fases 59,0 72,8 54,5 69,1 47,8 79,2
Unificación de fases: Unión 1:1 de los extractos de la fase acuosa y la fase sólida en el vial
de cromatografía %CV: Coeficiente de variación; %Rec: Porcentaje de recuperación
Se evidencio, muy baja concentración de toxafeno en la fase liquida que fue
separada del suelo húmedo después de aplicar la metodología de extracción;
esto puede deberse a la baja polaridad que presenta el plaguicida, y a su
conocida persistencia en el suelo. Se esperó obtener mejores resultados al
realizar la extracción del suelo húmedo que fue separado del medio de cultivo,
debido a que no existían posibles interferentes con el método (como el agua
disponible en el medio de cultivo); sin embargo, el porcentaje de recuperación
fue bajo, tanto para las moléculas surrogadas, como para el toxafeno,
comparado con el procesamiento de la unidad experimental completa del lodo
(tabla 12).
Al unificar las fases (extracto de la fase liquida + extracto de la fase solida), se
esperaron porcentajes de recuperación similares al lodo. Sin embargo, pese a
que existe mejor recuperación, en comparación a las fases por separado,
también se observa alta variabilidad en la extracción, ya que los %CV del
toxafeno, Tetracloro-m-xileno y PCB Nº 209, son superiores al 20%.
Este ensayo fue concluyente, para determinar el método final de extracción de
toxafeno a partir de lodos, el cual se presenta en detalle en la figura 7. Para
llevar a cabo un correcto procedimiento de extracción, es indispensable realizar
el sellamiento de los frascos de vidrio, utilizando tapas de caucho con un
envolvimiento de papel aluminio; esto, con el fin de evitar la degradación del
material de caucho con el solvente.
66
Figura 7. Protocolo de extracción de toxafeno a partir de lodos
5.4 BIODEGRADACIÓN DE TOXAFENO EN MICROCOSMOS
5.4.1 Comportamiento del pH
En la figura 8se observan las variaciones del pH a través del tiempo para los
diferentes tratamientos en microcosmos. Es evidente el carácter acido de los
suelos, que empieza a incrementar algunas unidades en la escala después de
20 días del transcurso del experimento, aunque esta variación puede deberse a
que al inicio de las mediciones (día 0), el modo de agitación de las unidades
experimentales, se realizó de manera vertical, mientras que en las siguientes
Muestra de lodo (5 ml)
•En frasco de vidrio libre de interferentes
Adición de moleculas surrogadas
•Vortex para homogenizar por 1 min
•Evaporacion de solvente por 20 min
Adición de Isooctano (10 ml)
•Sellar con tapa de caucho, recubierta con aluminio y agrafe
Metodologia de extracción
•Baño de ultrasonido 2 h
•Shaker horizontalmente 20 h
•Baño de ultrasonido 2 h
Limpieza cde la muestra
•Tomar 1-2ml de solvente con jeringa
•Trasferir a frasco de vidrio limpio, con 2 gr sulfato de Sodio anhidro
•Pasar por un filtro de Nylon de 0.2µm
67
mediciones, se realizó de forma horizontal; esto pudo adjudicar la diferencia en
la medición de todos los tratamientos a los 0 días con respecto a los demás
tiempos de análisis.
Figura 8. Medición de valores de pH en 4 periodos de tiempo, para 6
tratamientos de microcosmos
Las diferencias de pH entre tratamientos y a lo largo del tiempo, se adjudican
precisamente, a los aditivos que fueron añadidos a cada unidad experimental.
El tratamiento que presento los menores valores de pH fue al que se le
adicionaron hojas de eucalipto y Ciprés (M.V); mientras que el tratamiento de
Atenuación natural (AT.NA) mantuvo relativamente constante los valores de pH
a partir del día 20.Los tratamientos que contenían melaza, nutrientes y
biosólidos (MEL, y LOD.MEL) presentaron un descenso a partir del día 20,
probablemente debido a la fermentación de los azucares por parte de los
microorganismos. Finalmente los tratamientos que contenían hierro cero
Valente (ZVI.CAL y ZVI.LOD) fueron los únicos que lograron incrementar y
mantener los valores de pH alrededor de 7; la adición de Cal, incremento solo
4,0
4,3
4,6
4,9
5,2
5,5
5,8
6,1
6,4
6,7
7,0
7,3
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
pH
Tiempo (dias)
AT.NA
MV
MEL
LOD.MEL
ZVI.CAL
ZVI.LOD
68
en 0,2 unidades el valor de pH hacia el día 20, y no difirió mucho del
tratamiento homónimo que no contenía Cal.
5.4.2 Cuantificación de la concentración de Toxafeno
La medición de la concentración de toxafeno (figura 9) presento altas
variaciones entre las réplicas de cada tratamiento, en la mayoría de los
tiempos; esto puede deberse a la distribución del contaminante en los suelos, a
deficiencias durante el proceso de extracción, o a contaminación de la celda del
detector. El tratamiento EST presento la menor concentración (4.777 mg*L-1) a
los cero días, hecho que no se atribuye a degradación abiótica durante el
proceso de esterilización, ya que según los ensayos de extracción de muestras
ambientales, la variación entre la concentración de las réplicas de suelo y las
réplicas esterilizadas, solo equivalen a una diferencia de 100mg*Kg-1 (referirse
al inciso 5.3.1.1); adicionalmente, la concentración del control abiótico (EST),
después de los cero días, es muy similar con los demás tratamientos.
Figura 9. Concentración del toxafeno en tratamientos de microcosmos durante 210 días.
0
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
7.000
8.000
9.000
10.000
11.000
12.000
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
mg
To
xa
fen
o /
Kg
su
elo
Tiempo (dias)
AT.NA
EST
MV
MEL
LOD.MEL
ZVI.CAL
ZVI.LOD
69
Los tratamientos de atenuación natural (AT.NA)y material vegetal (M.V),
presentaron los valores más altos de toxafeno a los cero días (11.637 y 10.459
mg*Kg-1respectivamente); mientras que los demás tratamientos, exceptuando
el EST, se agruparon en concentraciones de 6.310 y 5.800 mg*L-1enel mismo
tiempo.
La oscilación de las concentraciones en entre el tiempo 0 y el tiempo 2 (0, 20 y
40 días respectivamente), se adjudican a deficiencias en el proceso de
extracción, determinado por los elevados valores en los coeficientes de
variación para las moléculas surrogadas (tabla 13): 90,48%, para el tetracloro-
m-xileno y 164,64% para el PCB Nº 209 a los cero días. Según la norma
EPA8000C los porcentajes de recuperación (%Rec.) deben mantenerse entre
70-130%, y los coeficientes de variación (%CV) deben permanecer <20%. Si se
observan los valores reportados en la tabla 13, se puede determinar, que
únicamente a partir del tiempo 4 (60 días) los valores de ambas moléculas
surrogadas, empiezan a estabilizarse de manera favorable, según los
parámetros de la norma.
Tabla 13. Porcentajes de recuperación y RSD para los 7 eventos de muestreo a través del tiempo
Tetrachloro-m-xilenoA PCB Nº 209B
Tiempo
(días) (%) Rec. (%) CV (%) Rec. (%) CV
0 113,5 90,5 28,6 164,6
20 54,5 23,9 37,6 73,9
40 87,2 9,0 23,1 50,4
60 66,4 4,2 98,6 4,9
120 74,8 8,7 111,9 4,0
210 71,6 2,6 89,4 5,7
(A) El surrogate tetracloro-m-xileno, fue usado para evaluar el proceso de
extracción(B)El PCB fue usado como estándar interno con el que se midió la
reproducibilidad del equipo %Rec: Porcentaje de recuperación; %CV: Coeficiente de
variación
70
En resultados de degradación (figura 9), se observó, que la mayoría de
tratamientos se agrupan y fluctúan de manera muy similar a lo largo del tiempo,
lo cual, no permite evidenciar diferencias entre los tratamientos. Se cree que
uno de los factores que interfirió en la cuantificación de la huella
multicomponente del toxafeno, especialmente en el tiempo cero, pudo ser la
contaminación de la celda del detector de captura de electrones. Como se
evidencio anteriormente, las muestras ambientales presentaban altos valores
de toxafeno y esto pudo incidir en la contaminación de la celda; por ende, y
debido a que no se realizó limpieza térmica del detector, antes de correr las
muestras iniciales, se puede presentar una sobreestimación de los valores de
concentración inicial de toxafeno.
5.4.3 Evaluación de la transformación de Toxafeno
Se superpusieron y se compararon los perfiles cromatográficos de cada uno de
los tratamientos evaluados en microcosmos, para corroborar la existencia de
cambios en el patrón de la huella del toxafeno. Se evidencio que existían
variaciones en el patrón de algunos tratamientos, con respecto a los
tratamientos de control abiótico y atenuación natural. Al comparar estos dos
controles entre sí, no se evidenciaron cambios muy significativos en el patrón,
con excepción de un pequeño incremento en algunos picos durante los
primeros tiempos de retención (desde 7 hasta 12,5 min) en el tratamiento de
atenuación natural con respecto al estéril (anexo 16).
Al comparar estos dos controles con los demás tratamientos, se evidenciaron
diferencias en los microcosmos que contenían biosólidos con melaza (
LOD.MEL) (figura 10); y los tratamientos ZVI.LOD y ZVI.CAL, que contenían
biosólidos, melaza y ZVI, con y sin cal (figura 11 y figura 12, respectivamente).
71
Figura 10. Comparación del perfil cromatográfico de los tratamientos estéril (en
negro) , atenuación natural (en rosa) y lodos con melaza (en azul) a los 210 días por
GC-ECD. (A.) Visualización del perfil completo de la huella (B.) detalle de los picos
durante los primeros tiempos de retención (C.) detalle de los picos en la zona media
de la huella (D.) detalle de los picos finalizando la corrida.
Figura 11. Comparación del perfil cromatográfico de los tratamientos estéril (en
negro) , atenuación natural (en rosa) y ZVI con lodos y cal (en azul) a los 210 días por
GC-ECD. (A.) Visualización del perfil completo de la huella (B.) detalle de los picos
durante los primeros tiempos de retención, detallando picos que no están presentes en
los otros dos tratamientos (C.) detalle de los picos en la zona media de la huella (D.)
detalle de los picos finalizando la corrida.
72
Como se observa, existían diferencias entre los tratamientos, con respecto a
los controles. Adicionalmente, se observó que en los tratamientos que
contenían ZVI, hubo un incremento mayor en los picos de los primeros tiempos
de retención, e incluso, es perceptible la aparición de un pico en el tiempo de
retención 7,14 min (figuras 11B. y 12B); y una disminución en los picos de los
últimos tiempos de retención (figuras 11D y 12D). Estos cambios no pudieron
ser percibidos con la integración completa de la huella del toxafeno y por esto,
se decidió evaluar la transformación del plaguicida mediante variaciones en el
área relativa de 11 de los picos contenidos dentro del área de integración
seleccionada, para todos los tratamientos, a partir de los 60 días.
Figura 12. Comparación del perfil cromatográfico de los tratamientos estéril (en
negro) , atenuación natural (en rosa) y ZVI con lodos (en azul) a los 210 días por GC-
ECD. (A.) Visualización del perfil completo de la huella (B.) detalle de los picos durante
los primeros tiempos de retención, detallando picos que no están presentes en los
otros dos tratamientos (C.) detalle de los picos en la zona media de la huella (D.)
detalle de los picos finalizando la corrida.
73
Al evaluar las áreas, fue posible evidenciar, la trasformación del toxafeno a lo
largo del tiempo. En algunos de los tratamientos, se pudo observar, que 6 de
estos picos (especialmente los picos con menores tiempos de retención: 7,14;
8,3; 9,5; 11,5; 13,5 y 13,7), son los que más fluctúan a lo largo del estudio, lo
que corrobora lo observado en la comparación de los cromatogramas (anexo
17).
En la figura 13, se muestran los 4 tiempos de evaluación en los tratamientos de
microcosmos (60, 120,210 y 270 días respectivamente), señalando los tiempos
de retención de los picos que presentaron un mayor incremento y una mayor
disminución a lo largo del estudio. Se pone en evidencia, la aparición de un
pico, con el menor tiempo de retención (7,14 min), que únicamente empieza a
ser perceptible a partir de los 120 días para los tratamientos que contenían
biosólidos y luego de 270 días, para el tratamiento que solo contenía melaza y
nutrientes (MEL).
Adicionalmente, al hacer la comparación de las áreas de los picos por
tratamiento se pudo observar, que algunos de los picos con tiempos de
retención más altos, como lo es el 18,5 min, disminuyeron gradualmente en los
tratamientos de que contenían hierro cero Valente (Figura 14, anexo 18).
Aunque los demás tratamientos presentaron transformación a través del tiempo
(anexo 18), es evidente que los controles de atenuación natural (AT.NA) y
control abiótico (EST), no presentan un cambio significativo en el patrón de los
picos a lo largo de la huella, ni tampoco se evidencia el pico con menor tiempo
de retención, como si se evidencio en los tratamientos que contenían melazas
(figura 14).
74
Figura 13. Transformación de toxafeno en microcosmos. (A.) Tratamientos a los 60,
(B.) Tratamientos a los 120 días, (C.) Tratamientos a los 210 días y (D.) Tratamientos a los 270 días. Las flechas indican los picos que más presentan variación a lo largo del
tiempo
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áte
a R
ela
tiva
(%
) A. AT.NAESTMVMELLOD.MELZVI.LODZVI.CAL
-
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áre
a R
ela
tiva (
%) B.
-
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áre
a R
ela
tiva
(%
) C.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áre
a R
ela
tiva
(%
)
Tiempo de retención (min)
D.
75
Figura 14. Comportamiento de las áreas relativas de los picos desde el día 60 hasta el
día 270 para cada tratamiento. (AT.NA) Tratamiento atenuación natural; (EST)
Tratamiento de control Abiótico; (MEL)Tratamiento con adición de Melaza y nutrientes
(LOD.MEL) Tratamiento con Biosólidos y adición de melaza y nutrientes, (ZVI.LOD)
Tratamiento con hierro cero Valente, biosólidos, melaza y nutrientes y (ZVI.CAL)
Tratamiento con hierro cero Valente, biosólidos, melaza, nutrientes y Cal
Como resultado de este análisis, se observó que los tratamientos que
generaron un mayor cambio en la huella del toxafeno en los tratamientos de
microcosmos, a través del tiempo fueron: ZVI.CAL (Hierro cero Valente +
biosólidos + melaza + cal), ZVI.LOD (Hierro cero Valente+ biosólidos+ melaza)
76
y LOD.MEL (biosólidos + melaza) ya que es evidente el cambio en el patrón de
los picos con menores tiempos de retención, con respecto los demás
tratamientos (figura 14).
Al sobreponer los cromatogramas, de los tres tratamientos que contenían
biosólidos y fueron bioestimulados con melaza y nutrientes, se evidencio que el
tratamiento con ZVI.CAL, presentaba un incremento mayor a los 210 días que
su tratamiento homónimo (ZVI.LOD) y que el tratamiento que contenía
biosólidos y melaza (LOD.MEL) (figura 15), lo que también se puedo corroborar
con el incremento gradual y constante de las áreas relativas de los picos: 8,3;
11,5; 13,5 y 13,7 min a través del tiempo (figura 14, figura 15B).
Adicionalmente, se percibe que en los últimos tiempos de retención, existe una
disminución gradual, o muy similar a la de los otros dos tratamientos (figura
15D).
Figura 15. Comparación del perfil cromatográfico de los tratamientos lodos con melaza (en negro) , ZVI con lodos (en rosa) y ZVI con lodos y cal (en azul) a los 210 días por GC-ECD. (A.) Visualización del perfil completo de la huella (B.) detalle de los picos durante los primeros tiempos de retención, detallando el incremento de algunos picos (C.) detalle de los picos en la zona media de la huella (D.) detalle de los picos finalizando la corrida.
77
5.5 ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS DE ENRIQUECIMIENTO ANAERÓBICOS 5.5.1 Análisis de la transformación de la primera fase de cultivo por GC-
ECD
Para la evaluación de la transformación del toxafeno en cultivos de
enriquecimiento, se evaluaron tres tiempos en la primera fase de
enriquecimiento (0, 30,50 días), usando cromatografía de gases, acoplada al
detector de captura de electrones con un modelo de integración por área
relativa de 11 picos representativos (detalle en el inciso 4.5.3.2). Los
porcentajes de recuperación, del PCB Nº 209 (molécula usada como estándar
interno, para determinar la reproducibilidad del equipo), se evaluaron
únicamente en el T3 (50 días) para todos los tratamientos. Los porcentajes de
recuperación, estuvieron dentro del rango de 92,23-97,78%, mientras que el
CV estuvo entre 2,51-8,73%. Con respecto al tretacloro-m-xileno (que fue
usado para la evaluación de la extracción) los resultados de recuperación
estuvieron entre 90,70-97,79%, mientras que los coeficientes de variación
(%CV) presentaron un rango de 2,02-7%, ajustándose a lo esperado, con
respecto a la normativa EPA8000C (tabla 14)
Tabla 14. Porcentajes de recuperación del tetracloro-m-xileno, para el ensayo a
partir de lodos
2,4,5,6-Tetracloro-m-xileno
Tiempo (días) (%)Recuperación CV%
0 97,79 7,00
30 90,70 6,12
50 93,53 2,02
Al realizar el análisis de transformación, se observó que existían altas
variaciones en los picos evaluados, para la mayoría de los tratamientos, incluso
desde los 30 días. La figura 16, muestra el cambio en el patrón de los 11 picos
para cada evento de muestreo, y el análisis de los 6 picos mayormente
cambiantes.
78
Figura 16. Transformación de toxafeno durante la primera fase del cultivo de
enriquecimiento. (A.) Tratamientos a los 0 días, (B.) Tratamientos a los 30 días, y (C.) Tratamientos a los 50 días. Las flechas indican los picos que más presentan variación
a lo largo del tiempo
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áre
a R
ela
tiva
(%
)
A. E- DBCH
E-TBB
E-TBBPA
E-Tox
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áre
a R
ela
tiva
(%
)
B.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áre
a R
ela
tiva
(%
)
Tiempo de retención (min)
C.
79
En esta ocasión, fueron elegidos 4 picos en los tiempos de retención menores
(7,1; 8,3; 9,5; y 10,7), y 2 en los tiempos de retención mayores (18,5 y 20,3),
esto con el fin de mostrar más detalladamente, el cambio observado para
algunos de los tratamientos, en donde a través del tiempo, existe una
disminución paralela de los picos en los tiempos de retención mayores y un
incremento en los picos con tiempo de retención menores. Al realizar la
comparación del patrón de picos para cada tratamiento a través del tiempo, se
observa un cambio evidente en todas las unidades experimentales (figura 17).
Al realizar una comparación entre los diferentes tratamientos a través del
tiempo (figura 17) se observó que el que contenía, 3,3´,5,5´-tetrabromo-
bisfenol-A (E-TBBPA) tuvo un comportamiento similar con respecto al
tratamiento que no contenía ninguna molécula priming (E-Tox). En la figura
17C y 17B, se observa que el tratamiento E-TBBPA y E-TOX respectivamente,
obtuvieron una disminución en dos de los picos con tiempos de retención
mayores (18,5 y 20,3 min) y un consecuente incremento en los picos de
retención iniciales (9,5; 10,7; 13,7 y 18,1) a los 30dias, sin embargo luego de
50 días, solo se evidenció una pequeña disminución en los picos 18,5 y 20,3,
mientras que el área relativa de los picos iniciales, se mantuvo relativamente
constante.
En la figura 16 y 17 se puede observar que en los tratamientos que contenían
Trans-1,2-dibromociclohexano (E-DBCH) y 3,3´,5,5´-tetrabromo-1,1´-bifenil (E-
TBB), hubo una mayor transformación del toxafeno a los 50 días, con respecto
al tiempo cero y a los otros dos tratamientos. También se evidenció la aparición
de un pico a los 7,1 minutos, solo después de 50 días de enriquecimiento,
únicamente para estos dos los tratamientos. El tratamiento con Trans-1,2-
dibromociclohexano (E-DBCH), obtuvo una mayor disminución en dos de los
picos de los tiempos de retención más altos (16,6; 18,5 y 20,3); y un
consecuente incremento en los picos de los primeros tiempos de retención a lo
largo del tiempo (Figura 16, y Figura 17A) a los 50 días.
80
Figura 17. Transformación de toxafeno durante la primera fase del cultivo de enriquecimiento. (A.) Tratamiento con Trans-1,2-dibromociclohexano; (B.) Tratamiento
con 3´,5,5´-tetrabromo-1,1´-bifenil; (C.) Tratamiento con 3,3´,5,5´-tetrabromo-bisfenol-A; y (D) Tratamiento sin adición de molécula priming
0,0
1,0
2,0
3,0
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áre
a R
ela
tiva
(%
) A. E-Ciclohex 03050
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áre
a R
ela
tiva
(%
) B. E-Bifenil
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áre
a R
ela
tiva
(%
) C. E-TBBPA
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
7,1 8,3 9,5 10,7 11,5 13,5 13,7 16,6 18,1 18,5 20,3
Áre
a R
elat
iva
(%)
Tiempo de retención (min)
D. E-Tox
81
A diferencia de los demás tratamientos, se pudo evidenciar una disminución
gradual la del área del pico del Trans-1,2-dibromociclohexano a través del
tiempo, lo cual supone la degradación de la molécula, como se observa en la
figura 18A, esto sustentó, que este tratamiento presentara los mayores
cambios en la huella del toxafeno.
Figura 18. Comparación del perfil cromatográfico de la primera fase de enriquecimiento con dibromocilohexano a los 0 días (en negro) , 30 días (en rosa) y 50 días (en azul) por GC-ECD. (A.) Visualización de la disminución de área del dibromociclohexano a lo largo del tiempo (B.) detalle de los picos en los primeros tiempos de retención, detallando el incremento y aparición de algunos picos (C.) detalle de los picos en la zona media de la huella (D.) detalle de los picos finalizando la corrida, detallando la disminución de picos.
5.5.2 Análisis de la degradación de Toxafeno en la segunda fase de
enriquecimiento por GC-FID
Los porcentajes de recuperación para el PCB Nº209 (que fue usado para
evaluar la reproducibilidad del equipo) se muestran en la tabla 15; pese a que
se evidenció baja variabilidad (%CV) y buenos porcentajes de recuperación
para este surrogate, no fue posible determinar el tetracloro-m-xileno con el cual
82
se evaluaba el proceso de extracción, debido a que, usando este detector, se
presentó un pico interferente en el mismo tiempo de retención que este
surrogate, en la mayoría de los tratamientos.
Tabla 15. Porcentajes de recuperación para el PCB Nº 209
PCB Nº 209
Tiempo (días) % Rec. %CV
0 100,8 3,5
28 102,4 2,7
55 98,2 5,4
60 96,6 2,4
131 96,6 2,4
Tal como se observa en la figura 19 se evidenció una baja disminución en la
concentración de toxafeno, para todos los tratamientos. Sin embargo, al
realizar un análisis de varianza por una vía, no existieron diferencias
significativas para determinar que existía degradación en ninguno de los
tratamientos (p=0.08). Los análisis por este detector, no permitieron ver
transformación de la huella para el segundo pase de los cultivos enriquecidos,
al superponer los cromatogramas de los tratamientos, en ninguno de los
tiempos, como se realizó inicialmente con el ECD.
Figura 19. Concentración del toxafeno en la segunda fase de enriquecimiento durante 131 días.
0400800
1.2001.6002.0002.4002.8003.2003.6004.0004.4004.8005.2005.600
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135
mg d
e T
oxa
fen
o/ K
g d
e s
ue
lo
Tiempo en dias
E-TBBPA
E-Bifenil
E-Ciclohex
E-Tox
83
5.5.3 Evaluación de la presencia de bacterias halorespiradoras
La amplificación del 16s RNAr se realizó como control positivo del
procedimiento de PCR, para verificar la funcionalidad de todos los reactivos de
la reacción y la estabilidad de las diferentes diluciones trabajadas para los
análisis de amplificación de bacterias halorespiradoras. La figura 20, muestra
los resultados de la electroforesis al realizar la amplificación con los primers
27F y 1492R, en las diferentes diluciones trabajadas por cada tratamiento.
Con esta PCR, se pudo escoger las diluciones de trabajo para cada muestra de
ADN; para los tratamientos de E-DBCH, E-TBBPA y E-Tox, se seleccionaron
las diluciones de trabajo 1:20 y 1:50, ya que como se observa en la figura 20,
no hubo amplificación utilizando una menor dilución. Para la muestra de ADN a
partir del cultivo E-TBB, se utilizaron menores diluciones: 1:10 y 1:20
respectivamente.
Figura 20. Amplificación del 16s RNAr (primers 27F y 1492R). (HL) marcador de peso HyperLadder I (1Kb);(1) DNA cultivo de enriquecimiento E-TTBPA con dilución 1/5; (2)
DNA cultivo de enriquecimiento E-TTBPA con dilución 1/20; (3) DNA cultivo de enriquecimiento E-TTBPA con dilución 1/50; (4) DNA cultivo de enriquecimiento E-
Bifenil con dilución 1/5; (5) DNA cultivo de enriquecimiento E-Bifenil con dilución 1/10; (6) DNA cultivo de enriquecimiento E-TBB con dilución 1/20; (7) DNA cultivo de
enriquecimiento E-DBCH con dilución 1/5; (8) DNA cultivo de enriquecimiento E-DBCH con dilución 1/20; (9) DNA cultivo de enriquecimiento E-DBCH con dilución 1/50; (10)
DNA cultivo de enriquecimiento E-Tox con dilución 1/5; (11) DNA cultivo de enriquecimiento E-Tox con dilución 1/20; (12) DNA cultivo de enriquecimiento E-Tox
con dilución 1/50; (13) Blanco de PCR; (14) Control positivo
84
Para los análisis paralelos realizados con cada uno de los sets de primers de
bacterias halorespiradoras, se corrió una PCR control, utilizando las dos
diluciones por cada muestra de ADN de cada tratamiento, junto con el ADN de
los lodos, más un control positivo de amplificación (ADN a partir de cepa pura)
y se obtuvieron buenos resultados (anexo 20) durante lo corrido del análisis.
5.5.3.1 Condiciones específicas de PCR
Bajo las condiciones específicas de PCR para cada uno de los 7 set de primers
evaluados, no se obtuvieron amplificaciones para ninguno de los tratamientos
de la segunda fase de cultivo de enriquecimiento, sin embargo, se evidenciaron
amplificaciones positivas para el ADN de lodos con los primers para Chl348 (F)
y Dehal1884(R) específicos para el Filum Cloroflexi (figura 21)yBB1(F) y
BB1(R) específicos para Desulfuromonas.
Figura 21. Amplificación del 16s RNAr de las secuencias target para el Filum Cloroflexi en lodos del rio Bogotá, bajo una amplificación de PCR especifica
(temperatura de anillamiento 60ºC).(HL) marcador de peso HyperLadder I (1Kb); (1) amplificación positiva de Cloroflexi en muestra de lodos con dilución 1/5; (2)
amplificación positiva de Cloroflexi en muestra de lodos con dilución 1/50; (3) blanco de reacción de PCR; (4) DNA cultivos enriquecidos con TBBPA (primera fase de
enriquecimiento); (5) blanco reacción de PCR; (6) Control positivo con amplificación del 16s RNAr (27F y 1492R); (7) amplificación del 16s RNAr de lodos con dilución 1/5;
(8) amplificación del 16s RNAr de lodos con dilución 1/50
85
5.5.3.2 Condiciones relajadas de amplificación de PCR
Al utilizar esta metodología de PCR, se observaron varias amplificaciones
inespecíficas para los primers de Dehalococcoides, Desulfitobacterium y
Dehalobacter (figura 22).Nuevamente, se evidenciaron amplificaciones
positivas para los géneros Cloroflexi y Desulfuromonas a partir de DNA de
lodos y algunas inespecificidades con las muestras de E-DBCH y E-TBB.
Figura 22.Amplificaciones inespecíficas de PCR relajada. (A.) Inespecificidad de los primers de Dehalococcoides en muestras ADN de los tratamientos E-TBBPA dilución
1/50 y E-DBCH dilución 1/20 y 1/50 con un peso esperado de 1377pb; (B.) Inespecificidad de los primers de Dehalobacter en muestras ADN de los tratamientos
E-TBB dilución 1/10 y 1/20 con un peso esperado de 830pb (C.) Inespecificidad de los primers de Desulfitobacterium en muestras ADN de los tratamientos E-TBBPA dilución
1/50 y E-DBCH dilución 1/20 y 1/50 con un peso esperado de 614pb
86
5.5.3.3 Condiciones de PCR en gradiente
Se realizó esta evaluación únicamente para los primers que presentaron
amplificaciones inespecíficas en el ensayo anterior; se evaluaron 5 primers,
utilizando 4 variaciones en la temperatura de anillamiento, iniciando en 53ºC y
terminando con la específica de cada set de primers. Bajo estas condiciones se
evaluaron los cebadores para: Dehalococcoides, Desulfitobacterium,
Dehalobacter, Cloroflexi y Desulfuromonas.
No se presentaron amplificaciones para ninguno de los tratamientos
enriquecidos, pero nuevamente se evidencio amplificaciones positivas en todas
las temperaturas evaluadas para Cloroflexi(figura 23) y Desulfuromonas (figura
24) a partir del DNA de lodos.
Figura 23. Amplificación de Cloroflexi en lodos del rio Bogotá, utilizando un gradiente de PCR.(HL) marcador de peso HyperLadder I (1Kb);(1) amplificación de la muestra
de lodos con dilución 1/5 a 55,7ºC;(2) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/5 a 58,1ºC;(3) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/5 a
59,5ºC;(4) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/5 a 60ºC ;(5) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/50 a 55,7ºC;(6) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/50 a 58,1ºC ;(7) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/50 a 59,5ºC;(8) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/50 a 60ºC ;(9) amplificación de la muestra de lodos directa a 55,7ºC;(10) amplificación de la muestra de lodos directa a 58,1ºC; (11) amplificación de la muestra de lodos directa a
59,5ºC;(12) amplificación de la muestra de lodos directa a 60ºC
87
Figura 24.Amplificación del genero Desulfuromonas en lodos del rio Bogotá, utilizando un gradiente de PCR. (HL) marcador de peso HyperLadder I (1Kb);(1) amplificación de la muestra de lodos directa a 55ºC;(2) amplificación de la muestra de lodos directa a
57,2ºC;(3) amplificación de la muestra de lodos a 58,1ºC;(4) amplificación de la muestra de lodos a 58,9ºC ;(5) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/5 a
55,7ºC;(6) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/5 a 57,2ºC ;(7) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/5 a 58,1ºC;(8) amplificación de la muestra de lodos con dilución 1/5 a 58,9ºC ;(9) amplificación de la muestra de lodos
con dilución 1/50 a 55,7ºC;(10) muestra de lodos con dilución 1/50 a 57,2ºC; (11) muestra de lodos con dilución 1/50 a 58,1ºC;(12) muestra de lodos con dilución 1/50 a
58,9ºC
88
6. DISCUSIÓN
Biodegradación de toxafeno en microcosmos
En este trabajo se quiso evidenciar, de una manera holística, el
comportamiento de los diferentes congéneres que componen la mezcla técnica
del toxafeno, ya que en la mayoría de los estudios de degradación anaeróbica
que se han realizado, se analizan particularmente los cambios en los picos de
congéneres específicos y cuantificables a lo largo del estudio (9, 10, 11,14-20).
Sin embargo, usando una integración de la huella multicomponente para
determinar variaciones en el patrón del toxafeno, no fue posible determinar
diferencias entre los tratamientos de microcosmos para cuantificar y determinar
la variación de la concentración a través del tiempo.
Se sabe bien que en el proceso de cuantificación de toxafeno por GC-ECD
puede ofrecer una alta sensibilidad a bajo costo, pero a su vez, pueden existir
algunos problemas inherentes como por ejemplo: ser igualmente selectivo a
otros compuestos halogenados; o ser susceptible a contaminación cuando la
carga del analito es demasiado elevada, lo que puede implicar la posibilidad de
la sobreestimación debido a interferentes (29,30). Por este motivo, y dado a
que la cantidad de toxafeno que existía en los suelos, superaba los 8.000
mg/Kg-1, se trabajó con un Split 1:100, y se realizaron diluciones 1:20 o 1:10
según correspondiera, durante todos los análisis en microcosmos; no obstante,
bajo esta metodología de integración, no se hizo posible obtener un análisis
cuantitativo de la mezcla de toxafeno.
Pese a este hecho, se hizo evidente que al comparar los cromatogramas de los
tratamientos en microcosmos, existían diferencias en las huellas de las
mezclas del toxafeno. Por este motivo, se decidió realizar un análisis por área
relativa de 11 picos distribuidos a lo largo de la huella multicomponente. Se
sabe que el toxafeno es susceptible a fotolisis (140) y a reaccionar con el
ozono y radicales hidroxilo (OH) presentes en la atmosfera (141), sin embargo,
89
con los análisis por área relativa, se pudo evidenciar que no hay degradación
abiótica del contaminante en los suelos del Copey, y que la principal
trasformación que existe del toxafeno, se ve mediada esencialmente por los
microorganismos, lo cual corrobora, las afirmaciones de Fingerling y
colaboradores en 1996 (16) y de otros estudios, que han evidenciado,
comportamientos similares en sus tratamientos, con respecto a sus controles
abióticos (10, 13, 15, 17).
Se observó, que los tratamientos que generaron una mayor transformación del
toxafeno fueron: ZVI.CAL (Hierro cero Valente + biosólidos + melaza + cal),
ZVI.LOD (Hierro cero Valente+ biosólidos+ melaza) y LOD.MEL (biosólidos +
melaza) ya que fue evidente el cambio en el patrón de los picos, en donde
algunos de ellos incrementaron (en los primeros tiempos de retención) y otros
disminuyeron (al final de la corrida). Estos resultados, demuestran que
efectivamente el perfil de la huella multicomponente del toxafeno, presenta
cambios a través del tiempo, especialmente en los picos de los primeros
tiempos de retención de la corrida, posiblemente adjudicados a la acumulación
de algunos congéneres menos clorados. En los estudios de degradación, en
donde se cuantifican congéneres específicos, se ha demostrado este mismo
comportamiento; bajo condiciones anaeróbicas, algunos congéneres tienden a
disminuir (especialmente los más clorados como los octa- y nona-
clorobornanos), mientras que otros, pueden incrementar o mantenerse
constantes, como los hexa- y hepta-clorobornanos (14, 15, 19, 20).
Los tratamientos que presentaron el mayor perfil de trasformación (LOD.MEL,
ZVI.LOD Y ZVI.CAL), tuvieron en común, la adición de biosólidos, nutrientes y
melaza, lo que podría indicar, una acción positiva en las estrategias de
bioaumentación y bioestimulación en los microcosmos anaeróbicos de los
suelos del Copey. El uso de materiales lodosos, como biosólidos, o
sedimentos, junto con la adición de fuentes de carbono, también se han
evaluado en otros estudios de degradación del toxafeno (15, 20,117) y de otros
90
COPs (142,143,144);demostrando ser efectivos en la remoción de los
contaminantes.
Si se comparan, los tratamientos que además de biosolidos y nutrientes,
contenían hierro cero Valente (ZVI), es evidente un incremento notable de los
picos entre el rango del tiempo de retención 7,14-13,71 min y la disminución de
los picos en el tiempo de retención 18,52 y 20,33 min, a partir de los 210 días.
El ZVI (Fe0) se considera de utilidad al ser adicionado en tecnologías de
bioestimulación ya que incentiva los procesos de decloración por reducción, de
algunos contaminantes como PCB (145); y se sabe que puede interferir en
otros procesos como la reducción del nitrógeno atmosférico N2, inmovilización
de numerosos cationes y aniones inorgánicos, reducción de compuestos
aromáticos halogenados, entre otros (146,147).
Se ha demostrado que los donantes de electrones que liberan más lentamente
hidrógeno como el ZVI, son potencialmente más adecuados para apoyar la
decloración, que los donantes de electrones que liberan más rápido hidrógeno,
ya que en estos sistemas la proporción de electrones canalizados a la
metalogénesis, es mucho mayor que en los sistemas con ZVI (145, 146).Por
ello se piensa que al adicionar ZVI y mantener un pH cercano a la neutralidad,
se pueden incrementar los mecanismos de deshalogenación reductiva, como
se evidencio en los tratamientos que contenían ZVI, con respecto a los que no
fue adicionado. Existen otros componentes esenciales para que exista
degradación de los COPs; como lo son, la biodisponibilidad del contaminante
(42,48,49, 54), las condiciones de pH (50,54,95), temperatura, y en general, la
concentración de fuentes de donadores y aceptores de electrones
(40,41,48,49,50,51,103, 142,148).
Los análisis de transformación del toxafeno por área relativa, se hicieron
trascendentales en este estudio, debido a que fue posible percibir variaciones
pequeñas (pero no menos importantes) en la huella multicomponente del
contaminante, a lo largo del tiempo. Se puede concluir que para que exista
91
transformación del toxafeno en los suelos contaminados del copey, se hace
necesario la implementación de estrategias de bioaumentación (como la
adición de Biosólidos anaeróbicos) y bioestimulación (como la adición de
nutrientes y ZVI).
Biodegradación de toxafeno en cultivos enriquecidos y efecto priming
Se observó que existe una transformación del toxafeno en menor tiempo para
los enriquecimientos de la primera fase (30 días), comparativamente con los
tratamientos en microcosmos, en donde se empezó a evidenciar
transformación, solo a partir de los 120 días. Esto sugiere que los
enriquecimientos, pueden presentar un mayor potencial de degradación, que
cualquiera de los tratamientos en microcosmos.
Se esperó, que al realizar un pase luego de 362 días de cultivo, se evidenciara
mayor remoción del contaminante, sin embargo, y aunque no fue posible
determinar la transformación de la huella multicomponente, en la segunda fase
del cultivo, debido al cambio en el uso del detector (GC-FID); no se
evidenciaron diferencias significativas en el cambio de la concentración a
través del tiempo, por lo cual se cree que el enriquecimiento no fue del todo
efectivo. Este hecho, podría deberse a dos factores: 1. La elevada
concentración que presentaban inicialmente los enriquecimientos de los suelos
del Copey, lo que disminuye la biodisponibilidad del contaminante e
incrementa su recalcitrancia; y 2. Al efecto toxico que pueden tener algunos de
los congéneres que se producen en la degradación del toxafeno (9, 13, 14, 15,
16, 18, 20, 117).
En la primera fase del cultivo, los tratamientos que contenían trans-1,2-
dibromociclohexano y 3,3´,5,5´-tetrabromo-1,1´-bifenil, presentaron un perfil de
transformación común al evidenciado en los microcosmos, en donde se
evidencia un mayor incremento en los picos de los primeros tiempos de
retención, y una disminución en los picos de los últimos tiempos de retención,
lo cual se espera al degradar toxafeno, vía deshalogenación reductiva (1,2,8,
13-16)
92
Con los análisis de transformación, se puede evidenciar un efecto priming al
utilizar dibromociclohexano y tetrabromobifenil, durante la degradación
anaeróbica de toxafeno. Existen reportes del uso de bifenilos bromados (36,
37) como moléculas potenciadoras de los procesos de deshalogenación
reductiva con PCBs, no obstante, esta es la primera aproximación que se lleva
a cabo con dibromociclohexano como molécula priming en procesos de
degradación de COPs.
De acuerdo a los diferentes estudios reportados, se espera que la molécula
priming, sea un compuesto que no genere contaminación ni recalcitrancia en el
suelo. Las características evaluadas para seleccionar este tipo de moléculas
potenciadoras, se determinan al evaluar un efecto estimulante en la
degradación del contaminante, y una subsecuente eliminación de esta
molécula a través del tiempo (35,37). Así mismo, se puede evidenciar que es
necesario encontrar una molécula estructuralmente similar, pero menos
compleja (con bajo número de sustituyentes halógenos) que contaminante de
interés (38,39,111)
Se observó que al utilizar dibromociclohexano, se presenta una disminución
gradual en el área del pico de esta molécula hasta los 50-55 días, mientras que
el tretrabromobifenil, solo presento una pequeña disminución a los 30 días,
luego de esto, no se observan mayores cambios en el área del pico de esta
molécula. En lo que respecta a las características de las moléculas priming, el
dibromociclohexano, es estructuralmente más similar al toxafeno, ya que su
esqueleto no es aromático, lo cual podría sugerir que los microorganismos que
sean capaces de reducir el priming bromado (vía deshalogenacion reductiva),
también podrían ser capaces de realizar este tipo de reducción con algunos
congéneres del toxafeno. Este estudio es pionero en el uso de mecanismos
priming en la degradación del toxafeno, y aunque son necesarios más análisis
para determinar la mejor molécula potenciadora para este contaminante, se
puede hacer una aproximación al tipo de moléculas que pueden ser evaluadas.
Aunque observando los procesos de transformación de los diferentes cultivos
de enriquecimiento, se esperó identificar microorganismos halorespiradores en
93
la segunda fase de enriquecimiento, no se obtuvo amplificación para ninguno
de los grupos buscados en este estudio. Es probable que en los suelos de
copey, no exista ninguno de estos microorganismos, y que los procesos de
deshalogenacion reductiva del toxafeno, se estén llevando a cabo por
actividades de cometabolismo.
Sin embargo, al seguir enriqueciendo el cultivo, se esperaría que las
comunidades bacterianas, fueran más especializadas al momento de utilizar el
contaminante y/o la molécula priming como aceptor de electrones, pero como
se mencionó anteriormente, el toxafeno y sus productos de degradación,
pudieron tener un efecto toxico para algunos de los microorganismos que se
encontraron en la primera fase del cultivo. Sería interesante realizar una
aproximación metagenómica, para conocer los microorganismos que participan
en el proceso de deshalogenación reductiva del toxafeno.
Partiendo de que los suelos del copey han estado expuestos desde hace
muchos años a contaminación, y no se evidencia degradación aparente, al
comparar el perfil del toxafeno técnico, y el perfil de los suelos del Copey; se
puede concluir, que existe un efecto toxico del contaminante en los
microorganismos del suelo, y por ello se hace necesario buscar estrategias de
bioaumentación o de enriquecimiento de los microorganismos nativos del
suelo, para que exista biodegradación del toxafeno.
94
7. CONCLUSIONES
o Los análisis de degradación utilizando el tipo de integración por huella, no
son concluyentes para evidenciar cambios en el patrón del toxafeno; por ello
se hace necesario un análisis de transformación, utilizando el área relativa
de varios picos.
o Se evidencio un mayor cambio en el perfil de las áreas de los picos con
tiempo de retenciones menores, para los tratamientos en microcosmos que
contenían melaza, biosólidos y hierro cero Valente
o Se presentó degradación del trans-1,2-dibromociclohexano en los cultivos
enriquecidos, y un incremento en la trasformación del toxafeno hasta los 50
días en la primera fase del cultivo, por lo cual, esta molécula se perfila como
posible priming para incrementar los procesos de reducción del toxafeno.
o La segunda fase del cultivo de enriquecimiento, no presento degradación
importante en la concentración del toxafeno, por lo cual se adjudica, un
efecto toxico de la mezcla que se encuentra presente en el suelo y/o de los
productos de degradación resultantes de la primera fase de cultivo, sobre los
microorganismos del suelo.
o En los cultivos de la segunda fase de enriquecimiento con suelo del Copey,
no se determinó la presencia de bacterias halorespiradoras, sin embargo al
evidenciarse transformación de toxafeno en la primera fase, se cree que
pueden existir microorganismos que intervienen en el proceso de
deshalogenación reductiva.
95
8. RECOMENDACIONES
o Se sugiere evaluar congéneres específicos dentro del patrón de toxafeno,
para determinar su degradación, o su incremento en cualquier tratamiento.
o Se demostró que los tratamientos que contenían ZVI, melaza, y biosólidos
presentaron mayor transformación en microcosmos; por lo cual se sugiere
evaluar y/o optimizar mayores concentraciones de cada uno de los
componentes, utilizando menores concentraciones de toxafeno.
o En este estudio, se cita el primer reporte de utilización de moléculas
halorgánicas alternativas al toxafeno, como potenciadoras de los procesos
de deshalogenación reductiva. Sería importante, estudiar el efecto del
trans-1,2-dibromociclohexano y del 3,3´,5,5´-tetrabromo-1,1´-bifenil en
concentraciones más elevadas, estudiando la degradación de congéneres
específicos, y realizar un pases más continuos, para evitar acumulación de
congéneres recalcitrantes, que pudieran ser tóxicos para los
microorganismos.
o En este trabajo no se logró comprobar la participación de grupos de
bacterias halorespiradoras en la transformación del contaminante; sin
embargo sería interesante conocer los microorganismos que están
implicados en la deshalogenación reductiva del toxafeno mediante análisis
metagenómico de los cultivos enriquecidos.
96
9. BIBLIOGRAFÍA
1. Saleh M. Toxaphene: chemistry, biochemistry, toxicity, y environmental fate.
Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. Springer-Verlag
Vol. 118. New York, US 1991; 1-85
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3. Vetter W. Toxaphene. Theoretical aspects of the distribution of chlorinated
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112
ANEXOS
Anexo 1. Evidencias fotográficas de lo encontrado en el primer evento de
muestreo 3A. Animales de pastoreo en el predio; 3B. Cerca que impide el paso
de personal no autorizado al predio
Anexo 2. Vista satelital de la ubicación del predio contaminado en las antiguas
bodegas de CENALGODON. Tomado de: Google Maps
113
Anexo 3 .Punto de muestreo PM 2.1, evidencia de una mancha de coloración
oscura y olor característicos del toxafeno, en cercanías al punto de monitoreo 2
(PM 2)
Anexo 4 . Curva de calibración de Toxafeno por GC-ECD
Anexo 5 . Curva de calibración del m-xileno por GC-ECD
y = 70337x + 1E+06 R² = 0,9987
0
5.000.000
10.000.000
15.000.000
20.000.000
25.000.000
30.000.000
35.000.000
0 100 200 300 400 500
Unid
ades d
e A
rea
Concentración
y = 38576x + 16808 R² = 0,9988
0
50.000
100.000
150.000
200.000
250.000
300.000
350.000
400.000
450.000
0 2 4 6 8 10 12
Unid
ades d
e A
rea
Concentración
114
Anexo 6. Curva de calibración del PCB Nº29 por GC-ECD
Anexo 7. Curva de calibración de Toxafeno por GC-FID
Anexo 8. Curva de calibración de m-xileno por GC-FID
y = 33640x + 27396 R² = 0,9935
0
50.000
100.000
150.000
200.000
250.000
300.000
350.000
400.000
0 2 4 6 8 10 12
Unid
ades d
e A
rea
Concentración
y = 1040,4x - 27940 R² = 0,9969
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Unid
ades d
e A
rea
Concentración
y = 1581,8x - 373,72 R² = 0,999
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
0 5 10 15 20 25
Unid
ades d
e Á
rea
Concentración
115
Anexo 9 . Curva de calibración de PCB Nº29 por GC-FID
Anexo 10. Solución SL9 de elementos traza
Elementos Trazas SL9 (Tschech y
Pfennig. 1984) 1Litro
Ácido nitroloacetico 12.8 g
FeCl2 – 4H2O 2g
CoCL2 – 6H2O 190mg
MnCl2 – 2H2O 100mg
ZnCl2 70mg
H3BO3 6mg
NiCL2 – 6H2O 24mg
CuCl2 – 2H2O 2mg
Na2MoO4 – 2H2O 36mg
Anexo 11. Solución de vitaminas
Solución de Vitaminas modif
(Arbeli y Ronen.2003) 1Litro
Ácido Fólico 20mg
Piridoxina 100mg
Rivoflabina 50mg
Biotina 20mg
Tiamina 50mg
Ácido Nicótico 50mg
Ácido Pantoteico 50mg
Acido amino P-Benzoico 50mg
Ácido Tiotico 50mg
y = 907,61x - 423,52 R² = 0,999
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
0 5 10 15 20 25
Unid
ades d
e Á
rea
Concentración
116
Anexo 12.Solución de selenito y tungstate
Solución de Selenito tungstate 1Litro
NaOH 0.5g
Na2SeO3 * 5H2O 3mg
Na2WO4 * 2H2O 4mg
Anexo 13.Reporte de métodos utilizados en el análisis de suelos por parte del
laboratorio IGAC
117
Anexo 14.Métodos evaluados para la identificación de Toxafeno utilizando diferentes
programas de temperatura con GC-ECD
METODO RESULTADO TIEMPO
Método 1
40min
Método 2
42 min
Método 3
43 min
Método 4
61min
118
Método 5
48 min
Método 6
36 min
Método 7
28 min
Método 8
61 min
119
Método 9
64 min
Método
10
62 min
Anexo 15.Métodos evaluados para la identificación de Toxafeno utilizando diferentes
programas de temperatura con GC-FID
Método RESULTADO TIEMPO
1
28 min
120
2
39.71 min
3
30 min
4
45 min
5
29.67 min
121
6
41.8 min
Anexo 16.Comparación del perfil cromatográfico de los tratamientos estéril (en
negro) y atenuación natural (en rosa) a los 210 días por GC-ECD. (A.)
Visualización del perfil completo de la huella (B.) detalle de los picos durante
los primeros tiempos de retención (C.) detalle de los picos en la zona media de
la huella (D.) detalle de los picos finalizando la corrida.
122
Anexo 17. Transformación de toxafeno en microcosmos. (A.) Tratamientos a los 60, (B.) Tratamientos a los 120 días, (C.) Tratamientos a los 210 días y (D.) Tratamientos a los 270 días. A1, B1, C1 y D1 detalle de 6 de los picos más cambiantes a lo largo del tiempo.
123
Anexo 18. Evaluación de 11 picos por cada tratamiento en microcosmos a
través del tiempo
124
Anexo 19. Transformación de toxafeno durante la primera fase del cultivo de enriquecimiento. (A.) Tratamientos a los 0 días, (B.) Tratamientos a los 30 días, y (C.) Tratamientos a los 50 días. A1, B1, C1 y D1 detalle de 6 de los picos más cambiantes a lo largo del tiempo.
125
Anexo 20 .Amplificación del 16s RNAr para las muestras de ADN de cada uno
de los 4 tratamientos de la segunda fase del cultivo de enriquecimiento,
utilizando dos diluciones de trabajo
