PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTADA DE CIENCIAS ...

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAFACULTADA DE CIENCIAS

PROGRAMA DE POSGRADOS EN CIENCIAS BIOLOGICAS

DETERMINACION DE LA VIA DE ACCESO A MEDULA ESPINAL UTILIZADA POR EL VIRUS

DE LA RABIA INOCULADO EN LA ALMOHADILLA PLANTAR DE RATON ADULTO

MYRIAM LUCIA VELANDIA ROMERO

DIRECTORMARLEN MARTINEZ GUTIERREZ M.Sc

CODIRECTORJAIME EDUARDO CASTELLANOS PARRA M.Sc, Ph.D

ASESORJAIRO ALONSO TOVAR FRANCO M.Sc, Ph.D

Bogotá, D.C., Colombia.

“La universidad no se hace responsablepor los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católicay por que las tesis no contengan ataques

personales contra personas algunas,antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar

la verdad y la justicia”

2

Artículo 23 de la Resolución No 13 de julio de 1946




APROBADO

__________________________ ___________________________ Marlén Martínez Gutiérrez M.Sc Jaime E. Castellanos M.Sc Ph.D

Director Co- Director

____________________ ____________________ __________________

3

Alejandro Múnera Orlando Torres H. Orlando Torres Universidad Nacional Instituto Nacional de Salud Universidad Javeriana




APROBADO

__________________________ ___________________________ Marlén Martínez Gutiérrez M.Sc Jaime E. Castellanos M.Sc Ph.D

Director Co- Director

4

Tabla de contenido

2. Resumen 83. Introducción 10

4. Objetivos 114.1 Objetivo General

114.2 Objetivos Específicos 11

5. Marco Conceptual12

5.1 Nervio Ciático, Nervio Tibial, Ganglios Espinales 125.1.1 Nervio Ciático 125.1.2 Nervio Tibial 135.1.3 Ganglios Espinales 145.1.3.1 Clasificación de subpoblaciones neuronales de los ganglios espinales

155.1.3.1.1 Clasificación Morfológica

155.1.3.1.2 Clasificación Fisiológica 155.1.3.1.3 Clasificación Bioquímica

165.1.4 Médula Espinal

175.2 Trazado de tejido nervioso 175.2.1 Fluoro Gold 185.2.2 Los virus como neurotrazadores 185.3 Virus de la Rabia

195.3.1 La rabia: un problema de salud pública 205.3.2 Estructura viral

21 5.3.3 Ciclo viral 225.3.4 Transporte del virus de la rabia 235.3.5 Patogenia de la infección por virus de la rabia 255.3.5.1 Estudios de interacción de virus de la rabia y neuronas sensoriales y motoras 265.3.5.1.1 Modelos de infección por virus de la rabia in vitro 26

5

5.3.5.1.2 Modelos de infección por virus de la rabia in vivo27

6 Metodología30

6.1 Estrategia Experimental30

6.1.1 Determinación de la ubicación neuroanatómica de las neuronas sensoriales y motoras que inervan la almohadilla plantar

316.1.1.1 Cirugía 316.1.1.2 Aplicación del neurotrazador Fluoro Gold (FG) 316.1.1.3 Procesamiento de los tejidos 32

6.1.2 Determinación del tiempo de aparición de antígeno viral para virus de la rabia en neuronas sensoriales y motoras infectadas

326.1.2.1 Infección de los animales 326.1.2.2 Procesamiento de los tejidos 336.1.2.3 Inmunohistoquímica

34

6.1.3 Determinación del porcentaje de neuronas sensoriales infectadas por Virus de la rabia 346.1.4 Determinación del perfil morfométrico de las neuronas sensoriales infectadas por virus de la rabia 35

6.1.5 Análisis estadístico 35

7. Consideraciones éticas 36

8. Resultados 37

8.1 Determinación de la ubicación neuroanatómica de las neuronas sensoriales y motoras que inervan la almohadilla plantar

378.1.1 Región sacra: Vértebra sacra 1 408.1.2 Región lumbar: Vértebras lumbares L6- L1

408.1.3 Región Toráxica: Vértebras Toráxicas T13- T12 44

8.2 Determinación del tiempo de aparición de antígeno viral para virus de la rabia en neuronas sensoriales y motoras infectadas

44

8.3 Determinación del porcentaje de neuronas sensoriales infectadas por

6

virus de la rabia 49

8.4 Determinación del perfil morfométrico de las neuronas sensoriales infectadas por virus de la rabia 55

9. Discusión 639.1 Aspecto Neuro- Anatómico 639.2 Aspecto Neuro- Virológico 659.3 Aspecto Virológico 73

10. Conclusiones 7611. Recomendaciones 7712. Bibliografía 78Anexos

Contenido de figuras

Figura 1: Estructura del Virus de la rabia 21Figura 2: Ciclo Viral 24Figura 3: Resumen metodología 38Figura 4: Sección transversal de columna vertebral y GE

39Figura 5: Cortes transversales de la región Sacro- Lumbar de ratón adulto 42Figura 6: Fotomicrografías de neuronas sensoriales de GE y ME marcadas con FG 43Figura 7: Marcaje para virus de la rabia en neuronas sensoriales y motoras de la región lumbar L2 a 120 h p.i. 46Figura 8: Marcaje para virus de la rabia en neuronas sensoriales y motorasde las regiones L4 y S1 a 120 h p.i.

47Figura 9: Fotomicrografía de ME de la región lumbar 2 a 96h p.i.

48Figura 10: Porcentaje de infección obtenidos a 72h, 96 y 120 h p.i. de cada nivel vertebral (ANOVA)

50

7

Figura 11: Porcentaje de infección obtenido en GE ipsilaterales y contralaterales Comparando todos los niveles vertebrales a 96 y 120h p.i. (ANOVA)

51Figura 12: Porcentaje de infección en ganglios ipsi y contralaterales a 96 y 120h p.i(t- Student) 52Figura 13: Esquema de distribución de antígeno viral para VR en médula espinal (ME) y ganglios espinales GE 54Figura 14: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales de GE presentes en cada nivel vertebral analizado.

55Figura 15: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas en GE ipsi y contralaterales S1, L6 y L5

56Figura 16: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas en GE ipsi y contralaterales L4, L3, L2 y L1 57Figura 17: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas en los GE ipsi y contralaterales S1, L6 y L5 a 96 y 120h

58Figura 18: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas en los GE ipsi y contralaterales L4, L3, L2 y L1 a 96 y 120h 59Figura 19: Histograma de distribución de frecuencias de GE ipsilaterales a 96 y 120h 60Figura 20: Histograma de distribución de frecuencias de GE contralaterales a 96 y 120h 61Figura 21: Modelo de transporte del virus de la rabia 75

Contenido de tablas

Tabla 1: Promedios de los diámetros de las neuronas infectadas a 96 o 120 h p.i. de GE ipsi y contralaterales de cada nivel vertebral. 63

Tabla 2: Promedios de los diámetros de las neuronas infectadas de GE ipsi y contralaterales de cada nivel vertebral a 96 o 120 h p.i.

63

8

A mi familia

A Marlén.

Agradecimientos.

Agradezco infinitamente a

9

La Dra. Marlén Martínez por apoyarme, guiarme y enseñarme,

además de confiar en mí sobre todo y a pesar de mis errores,

temores y terquedad.

Al Dr. Jaime Castellanos, Por abrirme sin temor las puertas

de los laboratorios de Neurociencias del Instituto Nacional de

Salud y del Instituto de Virología de la Universidad El Bosque.

Gracias Jefe!

A José Hilarion, Histo- tecnólogo del laboratorio de patología

del Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses,

por permitirme ingresar y trabajar durante casi un año en su

laboratorio.

A Rosalía, Nadia, Verónica, Efraín, Samanda y demás

compañeros de ahora, de siempre, gracias por todo!

2. RESUMEN

Mediante modelos animales in vitro e in vivo se ha demostrado el marcado

neurotropismo del virus de la rabia (VR), tropismo explicado parcialmente

por la presencia de algunas moléculas de membrana de las células

10

susceptibles. Estas moléculas podrían actuar como posibles receptores para

el virus; Sin embargo algunos eventos neuropatogénicos durante la infección

aún no son conocidos ó no están bien entendidos.

Por ejemplo, no existe una clara evidencia que defina si existe una vía

preferencial de captura y transporte que sea utilizada por el VR para acceder

al SN. Algunos trabajos sobre el tema han demostrado que de acuerdo al

sitio de inoculación y la técnica empleada es posible detectar antígeno viral

en diferentes tiempos, tanto en neuronas motoras de médula espinal (ME)

y/o en núcleos motores del encéfalo, como en neuronas sensoriales de

ganglios espinales (GE) y núcleos sensitivos del encéfalo; por lo tanto estos

resultados controversiales fueron la razón principal para realizar el presente

trabajo: definir si existe una vía preferencial de captura y transporte del VR

hasta SN.

Para abordar esta pregunta, postulamos un modelo animal de infección por

VR en el cual se evaluó por inmunohistoquímica, si existe alguna preferencia

por parte del virus hacia la vía sensorial o la vía motora para ser capturado y

transportado hasta la ME y posteriormente al encéfalo, además utilizando

diferentes tiempos post- infección, se describió la cinética de infección en las

neuronas sensoriales y motoras de la región sacro- lumbar de ratón adulto.

Los resultados obtenidos demostraron que después de inocular VR en la

almohadilla plantar, el virus fue capturado preferencialmente por las

terminaciones sensoriales de la zona de inoculación, involucrando

específicamente una subpoblación neuronal definida morfométricamente.

Esta susceptibilidad diferencial aumentó con el paso del tiempo post-

inoculación (p.i.), mientras que la detección de antígeno viral en neuronas

motoras de ME fue baja y confinada únicamente a las regiones lumbares L2 y

L1. Por otra parte debido a la naturaleza altamente neurotrópica del VR,

confirmamos su aplicación como un excelente neurotrazador.

11

Por lo tanto nuestros resultados, no solo aporta información neuroanatómica

de tipo sensorial y motora de la almohadilla plantar de ratón adulto, se

presenta por primera vez, el paso transináptico del virus hacia el lado

contralateral al sitio de la infección tanto en ME como en GE, lo cual sugiere

la utilización por parte del virus, de vías complejas de conectividad entre

neuronas sensoriales y motoras de ambos lados de la ME y los GE, fenómeno

que aumenta la capacidad de dispersión del VR en el SN.

3. INTRODUCCION

La patogenia del VR en el SN central y periférico, es debida al ingreso y

replicación viral en los somas neuronales. Algunos modelos tanto in vitro

como in vivo, han determinado que el marcado neurotropismo del virus esta

12

determinado por la presencia de algunas moléculas de membrana que

pueden actuar como receptores para el virus. Tanto las neuronas sensoriales

de los GE y las neuronas motoras de ME expresan en su membrana las 3

moléculas receptoras propuestas para el VR (RNAch, NCAM y p75 NTR), sin

embargo actualmente no hay claridad de la participación de cada una de

ellas o su posible interacción en los diferentes procesos infecciosos, además

no se conoce si por sí solas, determinan de algún modo la preferencia de

captura y transporte del VR desde la periferia hasta la ME.

Por lo tanto, presentamos un modelo animal de infección por VR con el cual

se evaluó, por inmunohistoquímica, la participación de las neuronas

sensoriales y motoras de la región sacro- lumbar de ratón adulto, en la

captura y transporte del virus hasta ME y posteriormente a encéfalo, en

diferentes tiempos p.i. Los resultados obtenidos demostraron que existe una

marcada preferencia por parte del virus hacia la vía sensorial y en esto

proceso involucró en particular una subpoblación neuronal definida

morfométricamente. Esta susceptibilidad diferencial se observó aumentada

con el paso del tiempo post- inoculación (p.i.), mientras que la detección de

antígeno viral en neuronas motoras de ME fue baja y confinada a las

regiones lumbares L2 y L1. Por otro lado, confirmamos que el VR debido a

su naturaleza altamente neurotrópica es un excelente neurotrazador lo cual

nos permitió aportar información neuroanatómica del tipo de innervación

presente en la almohadilla plantar de ratón adulto, si no que además

reportamos por primera vez el paso transináptico del VR hacia el lado

contralateral al sitio de la infección tanto en ME como en GE, lo cual

demuestra la versatilidad por parte del virus para utilizar vías complejas de

conectividad entre neuronas sensoriales y motoras de ambos lados de la ME.

4. OBJETIVOS PROPUESTOS

13

4.1 OBJETIVO GENERAL:

Determinar la vía de acceso a médula espinal utilizada por el virus de la

rabia inoculado en la almohadilla plantar de ratón adulto.

4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

4.2.1. Determinar la ubicación neuroanatómica de las neuronas sensoriales y

motoras que participan en la inervación de la almohadilla plantar de ratón

adulto.

4.2.2 Determinar el tiempo de aparición de antígeno viral en neuronas

sensoriales y motoras infectadas con virus de la rabia.

4.2.3. Obtener el porcentaje de neuronas sensoriales infectadas por virus de

la rabia.

4.2.4 Definir el perfil morfométrico de las neuronas sensoriales infectadas

por virus de la rabia.

5. MARCO CONCEPTUAL

14

El VR puede utilizar las vías nerviosas (sensorial o motora) para llegar el SN

luego de ser inoculado en la periferia. Las neuronas involucradas en la

captura y transporte del virus poseen características morfológicas,

fisiológicas y funcionales específicas de acuerdo a la función y tejido blanco

que inervan, por lo tanto, su ubicación en GE y ME y su participación en la

promoción de la infección en el SN fueron el objeto principal de estudio en el

presente trabajo. Para abordar la problemática de la neuro- patogenia por el

VR fue necesario hacer una revisión de los aspectos neuroanatómicos,

neurobiológicos y finalmente virológicos, que presento a continuación.

5.1 NERVIO CIATICO, NERVIO TIBIAL Y GANGLIOS ESPINALES

La almohadilla plantar de las extremidades posteriores (zona de inoculación

de VR utilizada en el presente estudio), de la mayoría de vertebrados esta

constituida por los músculos abductor y flexor del quinto dedo, flexor

plantar corto, interóseos plantares, aductor del primer dedo, músculos

lubrícales de los dedos II- V, tendón del músculo aductor del primer dedo,

flexor corto del primer dedo, abductor del primer dedo. Esta área está

inervada principalmente por el nervio plantar medio y lateral, ramas

principales del nervio tibial que a su vez proviene del nervio ciático (Willians,

2001).

5.1.1 NERVIO CIATICO

El nervio ciático (NC) es el nervio de mayor diámetro y longitud, en todo el

organismo de todos los mamíferos, es continuación de la división superior

del plexo sacro. El nervio sale de la pelvis por el agujero ciático mayor,

debajo del músculo piramidal de la pelvis y desciende por el trocánter mayor

del fémur y la tuberosidad isquiática, a lo largo de la parte posterior del

muslo, hasta un tercio inferior donde se divide en dos grandes ramas

denominadas nervio tibial y peroneo común. En la parte superior de su curso

se sitúa por debajo del glúteo mayor y reposa sobre la superficie posterior

15

del isquion; a continuación cruza el obturador interno y los gemelos y pasa

sobre el cuadrado femoral que lo separa del obturador externo y de la

articulación de la cadera. Por su lado interno acompaña al nervio cutáneo

posterior del muslo y a la arteria glútea inferior. Las ramas de innervación

muscular del nervio ciático se distribuyen al bíceps femoral, al semi-

tendinoso, al semi- membranoso y a la porción isquiática del aductor mayor

(Willians, 2001).

Mediante las técnicas de inmunohistoquímica y de degeneración

anterógrada, se ha descrito la distribución topográfica de las ramas

lumbares 6, 5 y 4 (L6, L5, L4) que aportan al NC de rata, de esta forma se

describió la distribución y el aporte de fibras provenientes de estas tres

ramas lumbares. Sin embargo, los resultados sugieren que estas ramas no

son las únicas que conforman este tronco nervioso en estos animales

(Montoya et al, 2002). Por otro lado, mediante la técnica de trazado

retrógrado con FluoroGold (FG), nuestro grupo describió que el NC de ratón

esta conformado por fibras que provienen tanto de los ganglios L6, L5 y L4

como de regiones más caudales como la sacra 1 y zonas más cefálicas como

lumbares 3, 2 y 1 y torácicas 13 y 12 (Velandia et al, 2002). Estos hallazgos

confirman que este nervio es un plexo complejo que involucra en su origen

espinal varios niveles vertebrales lo cual puede revelar la variedad y

complejidad de información que transporta.

5.1.2 NERVIO TIBIAL

El nervio tibial en los mamíferos superiores (ciático poplíteo interno) es la

mayor rama terminal del NC. Nace de los ramos de las divisiones ventrales

de los nervios IV y V lumbares y II y III sacros en humanos. Desciende a lo

largo de la cara posterior del muslo atravesando la fosa poplítea hasta el

borde distal del poplíteo, donde pasa, junto con la arteria poplítea, por

debajo del arco sóleo. En la parte superior del muslo está cubierto por los

16

músculos flexores de la rodilla y en la parte inferior de la fosa poplítea está

cubierto por los márgenes del gastronemio para luego discurrir en línea

recta hasta el maléolo interno y el tendón del calcáneo. Este nervio se divide

en los nervios plantares interno y externo (Willians, 2001).

5.1.3 GANGLIOS ESPINALES

Los ganglios espinales (GE), sensoriales (GS) o de la raíz dorsal (GRD), están

ubicados cerca de los espacios intervertebrales a cada lado de la médula y a

lo largo de esta. Son agregados celulares los cuales se forman durante el

desarrollo a partir de la migración de células de la cresta neural. Por ser

neuronas seudo- unipolares, su única fibra se divide en dos ramas: una

medial o central y otra lateral o periférica, Las ramas centrales se extienden

hacia la ME haciendo sinapsis con neuronas ubicadas en el asta dorsal; las

ramas periféricas se extienden y se unen con la raíz anterior proveniente de

la médula, formando de este modo el nervio espinal (Dyck, 1993,

Bustamante, 2001). Estos nervios espinales conformados por las ramas

anteriores provenientes de la ME y posteriores provenientes de los GE se

unen fuera de la columna vertebral, generando un nervio periférico que

puede ser sensitivo o mixto (conformado por fibras motoras y sensitivas).

Las fibras de estos nervios inervan finalmente zonas del organismo como

piel, músculo o vísceras.

La población neuronal presente en los GE fue descrita mediante la utilización

de diversas técnicas histológicas, con las cuales se logró demostrar que

estas neuronas son exclusivamente de tipo sensitivo, además se observó que

existen entre ellas diferencias en tamaño, función y bioquímica. De este

modo se logró clasificar las neuronas en poblaciones y subpoblaciones

neuronales, esta clasificación se complementa a través de la identificación

de moléculas marcadoras expresadas de forma diferencial entre las

neuronas de tamaño pequeño (asociados a nocicepción), neuronas

17

intermedias y grandes (asociadas a mecanorecepción y propiocepción)

(Martínez et al, 2000). Otros elementos celulares presentes en los GE son los

fibroblastos y células glíales (células de Schwann y/o Células satélites). Los

fibroblastos recubren el ganglio formando una cápsula de tejido conectivo y

rodean a las células de la glía que encierran a cada neurona participando en

funciones de soporte y barrera fisiológica para las neuronas (Bustamante,

2001).

5.1.3.1 CLASIFICACION DE SUBPOBLACIONES NEURONALES DE LOS GE.

Las neuronas del GE son diferentes morfológica, bioquímica y

funcionalmente, por lo tanto es posible diferenciarlas en poblaciones y

subpoblaciones neuronales, estas diferencias al parecer son determinadas

durante el desarrollo del GE (Martínez et al, 2000).

5.1.3.1.1 CLASIFICACIÓN MORFOLÓGICA

El tamaño de las células neuronales permite dividirlas en dos grandes

grupos: neuronas tipo A las cuales se observan grandes y claras, y tipo B las

cuales son pequeñas y oscuras. La densidad de su citoplasma esta dado

principalmente por la sustancia de Nissl (agregados de retículo

endoplásmico rugoso), por lo tanto, las neuronas tipo A (claras) poseen la

sustancia de Nissl distribuida heterogéneamente en el citoplasma, mientras

que las neuronas tipo B (oscuras) lo presentan compacto (Rambourg et al,

1983). En algunas especies se ha podido determinar la presencia de

subpoblaciones definidas por tamaños en neuronas grandes A, intermedias

B y pequeñas C, sin embargo esta clasificación varia según la edad, la

especie y las condiciones de obtención de las neuronas (in vitro ó in vivo).

Aunque es difícil determinar cual de los tipos neuronales son predominantes

en los GE, la evidencia demuestra que las células de tamaño intermedio y

grande son quienes ocupan buena parte del ganglio in vivo (Sommer et al,

1985).

18

5.1.3.1.2 CLASIFICACIÓN FISIOLÓGICA

Esta clasificación refiere principalmente a la función que cumplen las

neuronas, es decir, al tipo de información que reciben y transportan al SNC.

El tipo de información puede ser nociceptiva, mecanoreceptiva o

propioceptiva y de acuerdo a esto los tamaños y la velocidad de transmisión

de las fibras varía, por lo tanto hay una relación importante entre la función,

el tamaño de la neurona y el grosor de su fibra axónica. Por ejemplo las

fibras delgadas tipo III y IV, asociadas a neuronas pequeñas amielínicas,

transmiten principalmente información nociceptiva. La información mecánica

se transporta principalmente por fibras tipo II y IV, mientras que la

información propioceptiva es transmitida por fibras tipo I y II; estas

modalidades sensoriales se relacionan con neuronas de tamaños

intermedios y grandes (Harper y Lawson, 1985, Cameron et al, 1986).

5.1.3.1.3 CLASIFICACIÓN BIOQUÍMICA

La presencia de neuropéptidos, enzimas y algunos carbohidratos, ya sea

sobre el tejido neural o las neuronas en cultivo, ha permitido clasificar y

describir algunas de las subpoblaciones neuronales centrales o periféricas.

Algunos neuropéptidos pueden ser neurotransmisores, además, pueden

actuar como mediadores de inflamación, estimulando algunas células del

sistema inmune entre otros (Sommer et al, 1985).

Los neuropéptidos Sustancia P (SP, por sus siglas en inglés) y el péptido

relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP, por sus siglas en inglés), se

distribuyen principalmente en la población de neuronas pequeñas presentes

en los GE y se asocian al transporte de información sensorial nociceptiva

(Snider, 1998). Por otro lado el neuropéptido Y (NPY, por sus siglas en

inglés) y el péptido intestinal vasoactivo (VIP, por sus siglas en inglés) se

encuentran en neuronas de tamaño intermedio y grande del GE, asociadas al

transporte de información propioceptiva o mecanoreceptiva. Además, el

19

perfil de expresión de estos neuropéptidos esta asociado a la acción de los

diferentes factores de crecimiento que son expresados en el tejido blanco y

durante el desarrollo del GE determinan el fenotipo neuronal (Lawson et al,

1993)

5.1.4 MEDULA ESPINAL

La ME es la parte del SNC localizada en el interior del canal vertebral, se

extiende desde la base del cráneo hasta la cuarta o quinta vértebra lumbar,

es de de forma cilíndrica y su diámetro varia en algunas zonas. En ratón se

divide en 7 segmentos cervicales, 13 dorsales o toráxicas, 6 lumbares y 5

sacros. Los cuerpos celulares de las neuronas se ubican a lo largo de la ME

en la zona central de la misma, conocida como sustancia gris. Rodeando

esta zona se encuentra la sustancia blanca conformada por los paquetes de

las fibras que se proyectan desde los somas de la sustancia gris o

descienden desde las neuronas del encéfalo. La sustancia gris medular

contiene las neuronas de tipo sensitivo, las motoneuronas anteriores y las

interneuronas. Las neuronas ubicadas en el asta dorsal conforman varios

núcleos y en general estas células son contactadas por las fibras que

provienen del GE. Las motoneuronas del asta ventral son neuronas grandes

que emiten sus fibras a través de la raíz ventral hasta las fibras musculares

esqueléticas, estas neuronas se clasifican en motoneuronas alfa y gamma.

Las primeras inervan las grandes fibras musculares esqueléticas, inervan

hasta 3 fibras musculares por lo tanto, se conocen como unidad motora. Las

motoneuronas gamma inervan fibras musculares de tamaño pequeño

denominadas fibras intra- fusales. Las interneuronas están presentes en

todas las áreas de la sustancia gris medular tanto en las astas dorsales como

en el asta ventral, estas células son de tamaño pequeño fácilmente

excitables, que pueden excitar a otras interneuronas o a las motoneuronas,

20

generando circuitos integrados en la médula (Guyton, 1989; Bustamante,

2001).

A pesar de que actualmente se cuenta con una vasta lista de estudios sobre

estructura y función del SN, la determinación de conexiones y proyecciones

de neuronas del sistema nervioso central (SNC) y/o del sistema nervioso

periférico (SNP) es un campo poco explorado, debido a la complejidad de las

mismas y las dificultades técnicas que se presentan. Actualmente para

definir topográficamente la ubicación de algunos tractos nerviosos, se ha

desarrollado la técnica de neurotrazado en la cual se utilizan moléculas

orgánicas ó inorgánicas y algunos virus neurotrópicos.

5.2. TRAZADO DEL TEJIDO NERVIOSO

Las técnicas de trazado neuronal se han desarrollado para identificar,

determinar y describir topográficamente vías neuroanatómicas de interés

particular o general, cuando el procedimiento convencional de disección de

los tejidos no es suficiente. Dentro del variado grupo de trazadores existen

algunas moléculas complejas que emiten fluorescencia lo cual ofrece

ventajas tanto en el procesamiento como en la observación de la muestra

pues no se requiere realizar procedimientos adicionales a la misma. Aunque

existen otras técnicas de descripción neuroanatómica, entre las cuales se

hallan la técnica de degeneración anterógrada y/o retrógrada, hoy en día es

muy frecuente usar trazadores fluorescentes para la identificación de rutas

de primer orden en el SNC y SNP de ratas y otros mamíferos y que además

puede ser aplicado a tejidos embrionarios y adultos vitales, fijados y/o

postmortem (Vercelli et al, 2000, Wouterlood et al, 2002).

5.2.1 FLUORO GOLD

Dentro del grupo de trazadores fluorescentes de común aplicación, se

encuentra el Fluorogold (FG, hydroxystilbamitide methanesulfato ) (Schmued,

1994). El FG se aplica y se incorpora en segmentos nerviosos normales y/o

21

lesionados, se acumula y transporta en vesículas usando el transporte

axonal retrógrado. Una vez en el soma, la acumulación de vesículas

fluorescentes da una apariencia granular en el citoplasma de las células

marcadas (Vercelli et al, 2000, Kobbert et al, 2000). Es usado comúnmente

in vivo para definición de destinos de inervación durante el desarrollo, (“fate

mapping”) y en transplantes de células previamente marcadas para

determinar el desplazamiento o el comportamiento de estas (Hernit- Grand y

MacKilis, 1996, Onifet et al, 1993).

5.2.2 LOS VIRUS COMO NEUROTRAZADORES

Algunos virus selectivamente infectan células neuronales, por lo tanto son

utilizados como neurotrazadores, (Vercelli et al, 2000). Comúnmente son

utilizados el Virus de Pseudorabia (PrV) (Card, 1998), el Virus del Herpes

Simplex (HSV-1, HSV-2) (Norgren et al, 1998) y el Virus de la rabia (VR)

(Tang et al, 1999, Kelly y Strick, 2000). Estos virus son excelentes

herramientas de neurotrazado, sin embargo su manejo debe ser cuidadoso

puesto que su infección puede causar la muerte (como en el caso de la

infección por el VR). El marcado tropismo de estos virus hacia el SN, es la

característica principal con la cual se logran definir rutas específicas de

conectividad en diferentes áreas del SN o entre la periferia y el SN. Los virus

de PrV, HSV y VR pasan de una neurona a otra únicamente a través de las

conexiones sinápticas, por lo cual solo infectan neuronas conectadas entre

sí, de este modo se identifican conexiones neuronales específicas de primer,

segundo y tercer y en muchos casos cuarto orden quienes conforman un

tracto determinado en el SN (Kelly y Strick, 2000). El neurotropismo es un

fenómeno que sugiere la existencia de moléculas de membrana en las

neuronas, que favorecen la unión, ingreso y posteriormente el transporte del

virus desde la periferia (sitio de inoculación) hacia los somas de las neuronas

involucradas, facilitando el acceso del virus a la ME o al encéfalo.

22

Algunas consideraciones técnicas como la especie animal, el sitio de

inoculación, la cantidad de virus inoculado, la cepa viral utilizada y el tiempo

de infección, deben ser tenidas en cuenta a la hora de utilizar los virus

neurotrópicos como trazadores. Por último es importante resaltar que esta

técnica de trazado se pueden combinar con técnicas inmunoquímicas para

detectar en los mismos tejidos, antígeno viral y marcadores específicos

celulares, con lo cual se amplia y mejora la información neuroanatómica,

bioquímica y fisiológica obtenida (Loewy, 1998, Vercelli et al, 2000).

El VR es un virus altamente neurotrópico, no lítico, que se mueve de manera

tiempo dependiente a través del SN del animal infectado. Este virus ha sido

ampliamente utilizado como trazador en el sistema oculomotor,

motoneuronas del músculo hipogloso y bulbo- esponjoso (Ugolini, 1995,

Tang, et al, 1999, Kelly y Strick, 2000, Granty et al 2002).

5.3 VIRUS DE LA RABIA

Los virus RNA de hebra sencilla no segmentada y de sentido negativo son

agrupados dentro del orden de los Mononegavirales. Este orden esta

conformado por 4 familias de virus, entre ellas se encuentra la familia

Rhabdoviridae a la cual pertenece el género Lyssavirus cuyo representante es

el virus de la rabia. Estos virus poseen una morfología similar a una bala, es

decir con un extremo aplanado y el otro redondeado; sus dimensiones son

de aproximadamente 200 nm por 75 nm, con una nucleocápside de tipo

helicoidal. Estos virus infectan principalmente y preferencialmente a las

neuronas del SNC y SNP de mamíferos, ocasionando generalmente una

encefalitis mortal (Rose et al, 2001).

5.3.1 LA RABIA UN PROBLEMA EN SALUD PÚBLICA

A pesar de todo lo que actualmente se conoce respecto a la infección por el

VR y aunque hace más de un siglo existe la vacuna antirrábica y el

23

tratamiento post- exposición temprano es efectivo, una vez que aparecen los

signos neurológicos no existe ningún tipo de tratamiento posible y la muerte

del individuo es inminente. Aunque en los últimos años el número de casos

ha disminuido, la gravedad de la situación radica en la persistencia de casos

humanos detectados tardíamente. La OMS estima que ocurren por lo menos

50000 muertes humanas cada año debidas a accidentes rábicos, la mayoría

de ellas en países subdesarrollados de África, América Latina y

principalmente Asia (Ministerio de Salud, 2000). Según el informe de la

Oficina de Epidemiología del Ministerio de Salud de Colombia, el

comportamiento de la rabia en los últimos años afecta la población rural y/o

urbana de algunas ciudades de nuestro país. El último caso reportado

sucedió en junio del 2004, donde un brote de rabia silvestre transmitida por

murciélagos hematófagos afectó la población indígena Embera ubicada en la

zona norte del Bajo Baudó, cobrando la vida de 13 niños (Acosta, 2000, Páez

et al, 2003, Escobar, 2004). Por esta razón la circulación del virus y la

enfermedad causada por este, debe ser considerada aún como un problema

de salud pública en nuestro país.

La enfermedad por infección rábica sigue siendo un rompecabezas, pues su

patogenia no esta totalmente comprendida y no hay explicación suficiente

sobre su letalidad, por lo tanto, se hace necesario plantear modelos

experimentales in vivo, que ayuden a los investigadores del país y del

mundo a comprender los eventos tempranos de la patogenia viral, a

descubrir las rutas de preferencia del virus para ingresar al SN y plantear

futuras terapias farmacológicas o la construcción racional de vacunas que

inhiban la infección, evitando de este modo la muerte del individuo.

5.3.2 ESTRUCTURA VIRAL

El RNA del virus esta conformado por 5 genes monocistrónicos que codifican

para las 5 proteínas estructurales. Alrededor del RNA se ubica el complejo

riboproteico denominado nucleocápside (NC) que involucra la nucleoproteína

24

(N), la fosfoproteína (P) y la polimerasa viral (L). La proteína M actúa como

puente entre la nucleocápside y la membrana, además se asocia con el

dominio citoplasmático de la glicoproteína (G). Se sabe que la proteína G del

virus participa activamente en la unión del virus a las células hospederas y

estimula la respuesta inmune del huésped (Wunner et al, 1988; Rose et al,

2001; Rupprechts et al, 2002, Faber et al, 2004).

El genoma del VR posee una secuencia líder ubicada en el extremo 3´ y una

región no codificante en el extremo 5´. Los aproximadamente 12,000

nucleótidos codifican para las proteínas estructurales, N, P, L, M y G. El RNA

del virus esta asociado a la proteína N actuando posiblemente como

estabilizador del mismo, permitiendo la transcripción y replicación de la

hebra. A este complejo riboproteico se denomina ribonucleoproteína (RNP),

a su vez y sobre este complejo interactúa la proteína L y la fosfoproteína P.

Figura 1: Representación esquemática del genoma, proteínas y VR ensamblado.

La membrana del virus es proveniente de la célula de la cual fue liberado y

es sobre esta que se proyecta hacia afuera la glicoproteína (G) conformada

por trímeros. Entre la ribonucleoproteína y la membrana se encuentra la

N P M G L3´

5´

Estructura de las Proteínas

Virales

Virus ensamblado

25

RNA Viral

proteína M la cual participa en estabilizar la RNP dentro del virus además de

intervenir en el proceso de replicación viral (Finke et al, 2003).

Las proteínas P y N son proteínas que pueden ser fosforiladas,

principalmente por quinasas celulares. Wu y Cols, 2002 demostraron que la

fosforilación de la proteína N en la posición 389 es necesaria e indispensable

para la transcripción, replicación y encapsidación de los nuevos virus. La

polimerasa viral al parecer puede adenilar, metilar y fosforilar nucleótidos,

sin embargo, su principal función es la de permitir el inicio de la hebra

complementaria de RNA durante la replicación viral (Wunner et al, 1988, Wu

et al, 2002).

5.3.3 CICLO VIRAL

El ciclo viral para los rabdovirus, se inicia con la unión del virus a moléculas

de la superficie celular que pueden actuar como moléculas receptoras

(Haywood, 1994). Una vez el virus se une a estas moléculas, se inicia el

proceso de adsorción viral, normalmente este proceso sucede bajo las

mismas condiciones celulares de la endocitosis. Para el caso particular del

VR la proteína G es la responsable de la unión y posterior ingreso del virus al

citoplasma celular (Faber et al, 2004). Las moléculas celulares que han sido

postuladas como los posibles receptores para el VR son; el Receptor

Nicotínico de Acetilcolina (RNACh) (Lentz et al, 1982), la Molécula de

Adhesión Celular Neural (NCAM, por sus siglas en ingles) (Thoulouze et al,

1998), y el Receptor de Baja Afinidad para las Neurotrofinas (p75 NTR, 75 kDa.

“Neurotrophin Receptor) (Tuffereau et al, 1998). Aunque otras moléculas

como los gangliosidos (Superti et al, 1986), glicosaminoglicanos y

fosfolípidos han sido reportadas como moléculas receptoras o captadoras

del VR no esta definida su participación en la adsorción y penetración del VR

(Castellanos, 2002). El endosoma formado, junto con el virus unido

posiblemente a su receptor, sufre varios procesos fisiológicos y bioquímicos

que permiten la fusión de la membrana viral con la membrana celular,

26

permitiendo el desnudamiento del virus, es decir la liberación del genoma

viral dentro del citoplasma celular, y es allí donde se inicia la transcripción

del RNA y la posterior replicación del mismo para la generación de las

nuevas hebras de sentido negativo de la futura progenie viral (Figura 2).

Debido al sentido negativo de la hebra del RNA, la enzima RNA polimerasa

dependiente de RNA genera una hebra complementaria de sentido positivo

(5´ - 3´ ) de tal forma que se obtiene mRNA de cada uno de los 5 genes

virales, cada una con su secuencia de inicio y de terminación. Estos

mensajero son procesados por ribosomas libres citoplasmáticos y si es

necesario pueden ser llevadas hasta el aparato de Golgi donde sufren

modificaciones post- traduccionales, luego de esto pueden ser exportadas al

citoplásma ó hacia la membrana celular (Tordo, 1996). El ensamblaje de los

nuevos virus se realiza muy cerca de la membrana celular, esto implica la

presencia de G insertada en la membrana y la ubicación de las demás

proteínas listas, para el acople y formación de una nueva partícula viral, la

cual será liberada por gemación (Wagner 1990, Rose et al, 2001).

5.3.4 TRANSPORTE DEL VIRUS DE LA RABIA

Se ha demostrado que el VR ingresa al interior celular a través de la unión de

la glicoproteína G viral con las posibles moléculas receptoras presentes en la

membrana de las células, lo cual permite el ingreso del virus por endocitosis

y la subsiguiente liberación del RNA viral en el citoplasma celular.

Sin embargo para la generación de progenie viral, fenómeno que sucede en

el citoplasma neuronal, el virus debe ser transportado desde el sitio de

inoculación hasta los somas ubicados, en algunos casos en zonas bastante

lejanas al área, por tanto el virus utiliza los sistemas de transporte

intracelular neuronal.

27

Figura 2: Esquema del ciclo viral para el VR. Se describen los numerosos eventos que suceden en el citoplasma de la célula, desde la adsorción (1) del virus hasta la gemación (13) de la progenie viral.

El VR utiliza el transporte retrógrado rápido mediante la asociación de

elementos propios con elementos del cito- esqueleto y proteínas motoras

tales como la dineina. En este aspecto se ha demostrado que la cadena ligera

de la dineina (LC8) interactúa directamente con la fosfoproteína P del virus.

La zona de interacción de la proteína P corresponde a los residuos 138- 172

y en particular en la posición 162 de esta región donde existe una serina,

por lo tanto, la fosforilación de P en este residuo puede regular la asociación

28

y activación del complejo motor de la dineina. Estos hallazgos sugieren la

utilización por parte del VR de los sistemas de transporte y movilidad de las

neuronas para desplazarse desde las terminaciones sinápticas hasta los

somas y viceversa, procesos que permiten aumentar la dispersión y

efectividad de la infección (Sodeik, 2000, Ploubidou y Way, 2001).

5.3.5. PATOGENIA DE LA INFECCION POR VIRUS DE LA RABIA

La encefalitis, causada por el VR en todos los casos reportados, es mortal. La

marcada preferencia del VR por las células neuronales (neurotropismo) ha

sido objeto de varios estudios. En los últimos años los estudios sobre la

patogenia de la infección por VR han estado enfocados principalmente a la

búsqueda de las moléculas que expliquen el marcado neurotropismo, y su

participación en la promoción de la infección (Schweighardt y Atwood, 2001;

Castellanos y Hurtado, 2001). La adquisición de la enfermedad es debida a la

mordedura de un animal rabioso, sin embargo la eficiencia de la transmisión

depende de la profundidad de la mordedura, de la cantidad de virus

presente en la saliva y la cercanía al SNC. La evidencia experimental ha

demostrado que la interacción de la glicoproteina del virus con algunas

moléculas de membrana es uno de los factores determinantes para la

adsorción y penetración viral. (Tuffereau et al, 2001, Sakai et al, 2004, Roche

y Gaudin, 2004),

In vivo las moléculas NCAM y RNACh han sido ubicadas en los botones

sinápticos de terminaciones sensoriales y motoras presentes en piel o

músculo. Por tanto estas moléculas pueden promocionar el ingreso del virus

a las fibras nerviosas sensoriales o motoras. Sin embargo, existen estudios

que han demostrado que el virus puede o no sufrir un periodo de replicación

en las células musculares, antes de ser capturado por las terminales

nerviosas (Tsiang, 1988; Lewis et al, 2000). Una vez el virus es capturado y

endocitado en los botones sinápticos, viaja rápidamente mediante el

29

transporte axonal retrógrado hasta los somas de neuronas motoras o

sensoriales ubicados en el asta ventral de la ME o en los GE respectivamente,

aquí el virus puede replicarse y ser nuevamente transportado

retrógradamente hasta el encéfalo (Coulon et al, 1989, 1998), y desde allí a

tejidos no neuronales como glándulas salivales, músculo estriado y cardiaco,

glándulas suprarenales (Jogui et al, 2002)

5.3.5.1. ESTUDIOS DE INTERACCIÓN ENTRE VIRUS DE LA RABIA Y

NEURONAS SENSORIALES Y/O MOTORAS

Como se dijo anteriormente en experimentos in vivo, el virus puede unirse a

posibles receptores presentes en la membrana plasmática de terminaciones

motoras o sensoriales existentes en el sitio de inoculación, para luego ser

transportado hasta los somas de estas neuronas ubicadas en el asta ventral

de la ME o en los GE. Sin embargo y aunque se ha encontrado antígeno viral

en ambos tipos de células, los investigadores no han logrado establecer si

existe una vía de preferencia para el acceso del virus desde la periferia hasta

el SNC.

5.3.5.1.1 MODELOS DE INFECCIÓN POR VIRUS DE LA RABIA IN VITRO

Utilizando cultivos primarios de GE de diferentes especies animales y en

diferentes estadíos de desarrollo, se ha demostrado la capacidad de captura,

transporte y replicación del VR en estas células, lo que sugiere que estas

neuronas poseen una alta susceptibilidad a la infección, quizás mediante las

mismas moléculas receptoras y demás mecanismos utilizados por las

neuronas motoras (Tsiang et al, 1983, 1989, 1991, Coulon et al, 1989).

A partir del modelo de cultivo de GE desarrollado previamente (Castellanos y

Hurtado, 1999) Martínez y cols mediante técnicas inmunocitoquímicas y

morfométricas evaluando la susceptibilidad diferencial a la infección por VR

en las subpoblaciones neuronales presentes en los cultivos de GE de ratón

30

adulto. Los resultados obtenidos demostraron que a pesar de la

heterogeneidad de la población celular del cultivo, preferencialmente fueron

infectadas por VR las neuronas de diámetros intermedio y grande. Estos

resultados fueron confirmados mediante la caracterización bioquímica con

neuropéptidos, donde se observó que las células infectadas fueron positivas

NPY o VIP; estos neuropéptidos son marcadores de subpoblaciones

neuronales grandes. En este estudio también se determinó la presencia y

participación de las posibles moléculas receptoras para el VR (NCAM, RNACh

y p75 NTR) en las células infectadas, donde se observó que las neuronas

infectadas expresan en su membrana el receptor p75 NTR o la subunidad alfa

4 del RNACh. Estos resultados sugieren que la susceptibilidad diferencial del

VR por la población de neuronas grandes presentes en el cultivo puede ser

debida al tipo de información que transportan, situación definida

principalmente por el tejido blanco al que inervan y a la presencia de las

moléculas p75 NTR y la subunidad alfa 4 del RNAch, las cuales pueden estar

incrementando el tropismo, acelerando la captura y el transporte del VR

desde la periferia hasta el SN (Martínez et al, 2002, 2003, 2005).

5.3.5.1.2 MODELOS DE INFECCIÓN POR VIRUS DE LA RABIA IN VIVO

Desde los primeros trabajos de investigación en la patogenia y patología

rábica, se ha descrito que posterior a una inoculación periférica, el virus es

capturado y transportado por los nervios sensitivos y motores hasta el SNC

(Baer et al, 1968; Baer y Cleary, 1972; Dean et al, 1963; Murphy et al, 1973).

El virus inoculado, puede entrar directamente al SN o sufrir un período de

amplificación en el músculo esquelético (Baer et al, 1968; Charlton y Casey,

1979; Shankar et al, 1991). Estos eventos se suceden una vez el virus se une

a la posible molécula receptora presente en la membrana de la célula

neuronal o muscular, la cual por endocitosis permite el ingreso del virus al

citoplasma de las células, de tal manera que el proceso de adsorción del

virus se inicia muy temprano después de la inoculación (Lewis et al, 2000).

31

Una vez el virus ingresa a las neuronas es transportado retrógradamente

hasta los cuerpos de las neuronas ubicadas en ME, de allí posteriormente es

transportado retrógradamente y liberado al cerebro, donde se disemina

produciendo la encefalitis que generalmente es mortal. Posteriormente el

virus puede colonizar tejido no neuronal como glándulas salivares y córnea

entre otros (Tsiang et al, 1983, Jogui et al, 2002).

Existe una amplia evidencia experimental que demuestra que el VR al ser

inoculado en zonas musculares inervadas principalmente por terminaciones

motoras, es capturado y transportado rápidamente al SNC detectando

antígeno viral en áreas motoras de la corteza cerebral y además en el

hipocampo, tálamo, sustancia nigra, tectum de cerebro medio y en la capa

de células de Purkinje del cerebelo. La infección en estas áreas varía de

acuerdo al tiempo post- inoculación, sitio, cantidad y cepa de virus

inoculado. Luego el virus replicado en estas zonas, es transportado de modo

centrífugo hacia tejidos no neuronales, completando la dispersión viral

(Coulon et al, 1989, Jackson, 1991,2002a, 2002b, 2003, Tang et al, 1999,

Guigoni y Coulon, 2002),

Por otro lado, cuando se realizan inoculaciones del VR en el músculo

masetero de ratón, este es capturado y transportado por las neuronas

sensoriales que inervan este músculo, detectando antígeno y RNA virus-

específico en neuronas del trigémino, neuronas de tipo sensorial similares a

las presentes en los GE, en las cuales el transporte del virus es bastante

rápido (Jackson, 1991, 2002a, 2002b, 2003; Shankar et al, 1991). Cuando se

realizan inoculaciones de VR vía intranasal, la aparición del antígeno viral en

el trigémino es más tardía (unos 6- 8 días) (Jenson et al, 1969; Coulon et al,

1989; Astic et al, 1993). Después de inocular por vía intramuscular con virus

“calle”, se detecta material viral en perimisio y endomisio del músculo

esquelético, seguido de la detección en las fibras musculares.

32

Posteriormente, entre las 18 y 24 horas, se encuentra material

inmunoreactivo en GE y luego se incrementa el número de neuronas

sensoriales infectadas (Baer et al, 1968; Charlton y Casey, 1979; Watson et

al, 1981). De esta forma se ha evidenciado mediante modelos in vivo la

participación de las terminaciones y neuronas sensoriales en la captura e

ingreso del virus al SNC.

Dean y cols (1963) desarrollaron un experimento para evaluar y dilucidar

cual de las vías (sensorial o motora) captura con mayor eficiencia el virus. En

este estudio los autores seccionaron la raíz ventral y la raíz dorsal de los GE

lumbares de diferentes ratones adultos. Posteriormente a estos mismos

animales se les inoculó VR en la almohadilla plantar y se evaluó a diferentes

tiempos p,i. Los resultados demostraron que independiente de la lesión en la

raíz ventral (vía motora) o la raíz dorsal (vía sensorial) los animales murieron

por encefalitis rábica, lo cual demuestra que ambos tipos de neuronas son

susceptibles a la infección y pueden promover la infección hasta SNC. Los

resultados enunciados anteriormente han sido obtenidos e interpretados de

acuerdo a los diferentes modelos y técnicas experimentales utilizadas. En

este último aspecto, la mayoría de estos trabajos evalúan por separado la

infección en secciones de ME y ganglios lumbares, previa extracción de los

tejidos de la columna vertebral (cavidad medular y agujeros intervertebrales,

respectivamente) (Tsiang et al, 1983, 1988; Coulon et al, 1989; Guigoni y

Coulon, 2002), desafortunadamente esto ocasiona la desconexión total de

los ganglios a la médula y viceversa. Esta desconexión no permite evaluar de

modo real la interconexión que existe entre las neuronas sensoriales y

motoras y el paso del virus de un sistema al otro. Por otro lado por

disposiciones anatómicas, la sustancia gris de la ME termina a la altura de

las vértebras lumbares 1 o 2 del ratón, así que las regiones medulares que

conectan con los GE más caudales se hallan muy distantes al agujero

intervertebral donde se alojan estos ganglios. Por esta razón los GE de las

regiones lumbar y sacra poseen largas raíces dorsales que los conectan con

33

el asta dorsal correspondiente, por lo tanto, las zonas medulares vecinas a

los ganglios ubicados en la zona sacro- lumbar no corresponden a la misma

zona vertebral. Este análisis no ha sido tomado en cuenta en la mayoría de

estudios, por lo tanto, lo descrito hasta el momento en la infección in vivo

de GE y ME por virus de la rabia, presenta estos errores de interpretación

neuroanatómicos que alteran la correcta interpretación de los resultados. Por

ejemplo Tang y cols, (1999); Coulon y cols, (1989) reportan infección

primaria en motoneuronas, a los tres días p.i. y de modo tardío (4 o 5 días)

reportan infección en las neuronas sensoriales de los GE, como consecuencia

del transporte centrífugo del virus, sugiriendo de esta forma la infección

secundaria de estas neuronas (Coulon et al, 1989; Tang et al, 1999).

Por este motivo se debe buscar un modelo experimental que permita

describir por un lado la cinética y la preferencia (si la hay), entre las vías

sensorial y motora a la infección por VR y el tipo de subpoblaciones

neuronales involucradas en la infección. Por otro lado evaluar al mismo

tiempo y en un mismo nivel vertebral la ME y los GE, lo cual permitirá

confirmar la interacción neuroanatómica directa y el paso transináptico del

VR entre ellos, así se podrá demostrar la importancia que poseen las

neuronas sensoriales en los proceso de dispersión y patogenia de la

enfermedad, puesto que definitivamente estas neuronas son una de las

puertas de entrada del virus al SNC.

6. METODOLOGIA

6.1. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Los materiales y métodos están descritos de acuerdo a los requerimientos

experimentales, utilizados en cada uno de los objetivos específicos

planteados. Con esta metodología se buscó definir inicialmente mediante la

utilización de la molécula neuro- trazadora FG, el área vertebral específica

donde se ubicaron las neuronas sensoriales y motoras que conforman el NC

34

y sus principales ramas, entre las cuales se cuentan las fibras involucradas

en la inervación de la almohadilla plantar. Una vez identificada el área

vertebral donde se alojó el mayor número de neuronas sensoriales y motoras

que conforman el NC, se tomaron ratones ICR los cuales fueron inoculados

con VR en la almohadilla plantar y sacrificados a diferentes tiempos post-

inoculación. De estos animales se obtuvieron secciones transversales de la

columna vertebral las cuales fueron procesados por inmunohistoquímica, así

se determinó el sitio y el tiempo de aparición de antígeno viral en neuronas

sensoriales y motoras en los diferentes niveles vertebrales analizados. A

continuación sobre estas mismas secciones se cuantificó el número de

neuronas infectadas en los diferentes tiempos y niveles analizados, con

estos datos se realizó un análisis por ANOVA y DMS con el cual se comparó

el porcentaje de infección obtenido en los GE a 72, 96, y 120h p.i, en cada

nivel vertebral . Por último y sobre estos mismos tejidos se definió el perfil

morfométrico de las neuronas infectadas y no infectadas procesadas por

inmunohistoquímica, los datos obtenidos fueron analizados mediante la

prueba no paramétrica de Kolmogorov- Smirnov y t- Student con el cual se

comparó la distribución por diámetros de las neuronas de cada GE de los

niveles vertebrales analizados a 96 y 120h p.i.

6.1.1. Determinación de la ubicación neuroanatómica de las neuronas

sensoriales y neuronas motoras que inervan la almohadilla

plantar

6.1.1.1 Abordaje quirúrgico: Para la ubicación especifica de las neuronas

sensoriales y motoras que conforman el NC y sus ramas principales, se

utilizaron dos (2) ratones machos jóvenes de 30- 35 g de la cepa ICR (Institut

Cancer Research). Los animales fueron anestesiados previa aplicación de

atropina (0,02 mg/kg) con una mezcla de ketamina (15 mg/kg) y xilazina

(90 mg/kg). Después que los animales perdieron el reflejo patelar, se realizó

una incisión entre la cresta ilíaca y la parte distal del fémur de ambas

35

extremidades, los músculos fueron cuidadosamente apartados en el borde

caudal del músculo gluteus maximus , donde se localizó el nervio ciático.

Sobre este nervio se realizaron los procedimientos descritos más adelante,

una vez terminada la aplicación del trazador se suturaron los músculos con

sutura re- absorbible y la piel con sutura 5,0. Los animales antes, durante y

al finalizar los procedimientos fueron mantenidos en condiciones de bioterio

por el tiempo definido con agua y comida ad libitum.

6.1.1.2 Aplicación del Neurotrazador FluoroGold (FG): Para la

identificación de las neuronas sensoriales de los GE y de las neuronas

motoras de ME, se utilizó la implantación de una cámara de silicona la cual

contenía en su interior el trazador retrógrado FG, para esto se seccionó por

completo el nervio ciático, el cabo proximal se introdujo en una cámara de

silicona de 7mm de longitud, con uno de sus extremos sellados, luego se

colocaron 10 µl de solución de FluoroGold al 5% en NaCl 0,15M. El cabo

proximal se dejó en contacto con la solución y se fijo a la cámara con dos

puntos de sutura 9- 0. Para evitar la salida de la solución y la impregnación

de los tejidos vecinos, se colocó silicona de uso odontológico en la zona de

unión de la cámara y el nervio.

6.1.1.3 Procesamiento de los Tejidos

El tiempo de exposición al trazador fue de 6 días. Luego de este tiempo los

ratones fueron nuevamente anestesiados y se perfundieron a través de la

arteria aorta, con buffer fosfato salino (PBS, pH 7,4) seguido por un fijador

(paraformaldehído 4% en PBS). Posteriormente se realizó la disección de la

totalidad de la columna vertebral, se retiró el exceso de músculo y se post-

fijaron las columnas en la misma solución fijadora durante 48 horas. Las

columnas con el tejido nervioso dentro y restos de tejido muscular

alrededor, fueron descalcificadas en una solución de ácido fórmico al 10%

más paraformaldehído al 4% en agua, durante 15 días (de acuerdo a lo

36

reportado previamente por Velandia et al, 2002), Los tejidos fueron

criopreservados en una solución de sacarosa al 20% y se almacenaron a 4ºC

hasta el día de corte. Los segmentos ubicados por debajo de la cintura

pélvica fueron desechados, las vértebras del resto de la columna fueron

enumeradas en dirección rostral con el fin de determinar los sitios exactos

de aparición del marcaje.

A partir de los diferentes segmentos vertebrales se realizaron cortes

seriados de 16 m de espesor en crióstato (Tissue- tek II, Modelo No, 4551),μ

los cuales fueron recogidos en láminas pretratadas con poli- L- lisina (100

µg/ml) y se realizó un montaje húmedo con glicerol tamponado pH 9,0, Los

cortes a analizar contenían ME y los respectivos GE, los cuales fueron

observados usando un microscopio Nikon dotado de un sistema de

epifluorescencia utilizando el filtro de excitación adecuado (480 nm). De

esta manera se determinaron los GE y neuronas motoras que aportan fibras

al nervio ciático de los niveles vertebrales ubicados.

6.1.2. Determinación del tiempo de aparición de antígeno viral para

virus de la rabia en neuronas sensoriales y motoras infectadas.

6.1.2.1 Infección de animales: Se tomaron dos (2) ratones adultos jóvenes

machos de la cepa ICR por cada tiempo analizado; estos animales fueron

infectados con 50 µl de inóculo viral (106.7 dosis letales) en el cojinete

plantar de la pata posterior derecha, con la cepa de virus CVS (Challenge

Virus Standard) mantenido y pasajeado en cerebros de ratones adultos (CVS-

CR). El título de este virus fue determinado por inoculación intracerebral de

diluciones seriadas en ratones de 14- 16 gr. Los animales antes y durante los

tiempos post- inoculación fueron mantenidos en condiciones de bioterio con

ciclos de luz/oscuridad de 12 horas, comida y agua ad libitum .

6.1.2.2 Procesamiento de los tejidos: Para determinar la cinética (tiempo y

ubicación) de detección de antígeno viral se evaluaron dos (2) animales

37

correspondientes a los tiempos de 24, 48, 72, 96 y 120 horas p.i., los

cuales fueron anestesiados con una mezcla de Ketamina 15mg/Kg peso y

Xilaxina 90mg/Kg peso. Una vez que en los animales se observó la ausencia

del reflejo podal, se procedió mediante la apertura de la cavidad toráxica a la

canalización de la arteria aorta para la iniciación del proceso de perfusión,

de esta manera se dio inicio a la circulación de la solución salina de fosfatos

(PBS, pH 7,4) seguida por un fijador (paraformaldehído 4% en PBS). La

columna vertebral fue disecada, se retiró el exceso de músculo y se dejaron

las columnas en post- fijación en la misma solución fijadora durante 48

horas. Las columnas con el tejido nervioso dentro y restos de tejido

muscular alrededor, fueron descalcificados en una solución de ácido fórmico

al 10% más paraformaldehído al 4% en agua, durante 15 días. Los tejidos

fueron criopreservados en una solución de sacarosa al 20% y almacenados a

4 ºC hasta el día en que fueron cortados. Los cortes fueron de 12 µm de

espesor obtenidos en crióstato (Tissue- Tek II, Modelo No, 4551),

procesando las regiones vertebrales determinadas en el numeral 6.1.1, estos

cortes fueron recogidos en láminas pretratadas con poli- L- lisina (200

µg/ml) distribuidos de la siguiente forma: el primer corte obtenido, fue

recogido en la primera lámina, el segundo en la segunda y así sucesivamente

hasta montar 5 cortes por lámina en 16 láminas por nivel vertebral

seccionado, de esta forma se obtuvo en cada lámina diferentes niveles de ME

y de los GE, lo cual nos permitió detectar antígeno viral en diferentes zonas

de los GE. Las láminas con los cortes fueron almacenadas a

- 20ºC hasta ser procesados por inmunohistoquímica.

6.1.2.3 Inmunohistoquímica

De un total de 112 láminas por ratón, se escogieron 8 láminas con la

distribución de cada corte descrita anteriormente, estos cortes fueron

hidratados con PBS pH 7,2 por 10 minutos, luego se permeabilizaron por 30

38

minutos con Tritón X- 100 al 0,1% en PBS, posteriormente se bloqueó la

peroxidasa endógena con una solución de metanol al 50% y peróxido de

hidrógeno (H2O2) al 0,5% por una hora. Los sitios inespecíficos se bloquearon

con suero de recién nacido (SRN) al 10%, El antígeno viral se detectó con un

anticuerpo policlonal anti- nucleocapside (BIORAD Cat Nº 72114C) dilución

1:200 en SRN al 5%, toda la noche en cámara húmeda a 4Cº. El anticuerpo

secundario anti- conejo biotinilado (Vector Lab BA-1000) se utilizó en una

dilución 1:200 luego se adiciono el complejo de avidina- peroxidasa

biotinilada (KIT ABC Vector Lab PK 4000), los tiempos de incubación para

cada incubación fueron de 45 minutos cada uno a temperatura ambiente. La

interacción de antígeno- anticuerpo primario, secundario y complejo, se

reveló con diaminobenzidina al 0,1% en tris- HCl 0,1M pH 7,2 y H2O2 al 0,02%

en agua destilada con una proporción 1:1, posteriormente se realizó una

contracoloración con Hemalum de Mayer 1:1 en agua por 45 segundos. Los

cortes se dejaron secar al aire y se realizó el montaje acuoso con gelatina de

Káiser.

6.1.3 Determinación del porcentaje de neuronas sensoriales infectadas

por virus de la rabia.

De las láminas procesadas por inmunohistoquímica obtenidas en el

procedimiento descrito en el numeral 6.1.2.3, se tomaron 4 láminas al azar

por cada nivel y tiempo analizados. Cada lámina contenía 5 cortes completos

incluyendo ME y GE. Las neuronas sensoriales que presentaron el núcleo y

nucleolos de cada uno de los GE de los niveles vertebrales fueron contadas.

Las proporciones de infección (sometidas a transformación angular) fueron

comparadas entre cada tiempo y entre niveles vertebrales con un test de

ANOVA- DMS.

6.1.4. Determinación del perfil morfométrico de las neuronas

sensoriales infectadas por virus de la rabia.

39

De los cortes procesados en el numeral 6.1.2.3, se tomaron dos láminas por

animal en cada tiempo y nivel analizados, la distancia entre cortes fue de

100 a 110 m, estos cortes fueron procesados a través de un sistema deμ

captura y análisis de imagen. Este sistema consistió en capturar las

imágenes de los GE mediante el programa Studio DC10plus (PINNACLE

SYSTEMS®) utilizando una cámara Philips LTC 0435 conectada a un

microscopio tri - ocular a un aumento de 400X, posteriormente las imágenes

fueron transferidas y digitalizadas a través del sistema ImagePC

(www.scioncorp.com ), marcando el contorno de los somas de las neuronas

con núcleo presentes en cada sección tanto para neuronas infectadas y no

infectadas, de esta manera se obtuvieron los siguientes datos: área ( mμ 2)

perímetro ( m) y el diámetro utilizando la formula D= Perímetro/μ .π Los

datos fueron almacenados en EXCEL y analizados posteriormente utilizando

el programa estadístico SIMSTAT. En la figura 3 se resumen los

procedimientos descritos en los numerales 6.2, 6.3 y 6.4.

6.1.5 Análisis estadístico

Para el análisis estadístico del presente estudio se emplearon tres pruebas

diferentes: análisis de ANOVA, t- Student y un test de dos muestras de

Kolmogorov- Smirnov. Mediante un test de ANOVA de una sola vía y un

análisis de diferencias mínimas significativas (DMS) se compararon: los

porcentajes de infección (procesados previamente por transformación

angular) obtenidos en cada uno de los GE ipsi y contralaterales analizados a

72, 96 y 120h p.i. y los porcentajes de infección de todos los GE ipsilaterales

o contralaterales en los tres tiempos analizados, usando un valor de p<0.05.

Con el análisis t–Student se comparó el porcentaje de infección entre

ganglios ipsi y contralaterales de cada uno de los niveles a 96 y 120 horas

post- infección con un valor de p<0.05. Además, con esta prueba se

comparó los diámetros de neuronas sensoriales infectadas a 96 y 120 H p.i.,

en GE ipsi y contralaterales.

40

http://www.scioncorp.com/

Por otra parte, la prueba no paramétrica de Kolmogorov- Smirnov permitió

comparar la distribución por diámetro de las neuronas infectadas frente a las

totales de cada ganglio ipsi y contralateral a 96 y 120h p.i., de toda la región

Sacro- Lumbar analizada con un valor de p<0.05.

7. CONSIDERACIONES ETICAS

Todos los procedimientos que se realizaron, fueron aprobados por los

comités de Ética de las entidades participantes: Universidad El Bosque e

Instituto Nacional de Salud de Bogotá.

Adicionalmente toda la metodología se llevó a cabo teniendo en cuenta lo

enmarcado en la declaración universal de los derechos de los animales

proclamada por la liga internacional de los derechos del animal Ginebra,

Suiza (Ley 84 de 1989). Por los principios éticos de la experimentación

animal enunciados por la ICLAS, (International Council for Laboratory Animal

Science) incluida en la resolución No 008430 de 1993 del Ministerio de

Salud, la cual establece las normas científicas, técnicas y administrativas

para la investigación en salud (Principios éticos de la Experimentación

animal 1997). Además se incluyen las consideraciones contempladas en los

artículos 87 al 94 del título V del decreto 1665 de 02/08/2002 de la guía

para la presentación de investigaciones y trabajos de grado, de la División de

Investigaciones de la Universidad El Bosque.

8. RESULTADOSA continuación se presentarán los resultados obtenidos en el desarrollo de

cada uno de los objetivos específicos, por lo tanto, se describirá inicialmente

la ubicación y descripción neuro- anatómica de las neuronas sensoriales y

motoras que conforman el NC y las fibras que inervan la almohadilla plantar.

Estos resultados nos permitieron definir la zona vertebral específica en

donde se alojan el mayor numero de neuronas sensoriales y motoras del NC.

Posteriormente, por inmunohistoquímica se detectó antígeno viral en la zona

41

vertebral determinada anteriormente pero en los animales infectados por VR

a diferentes tiempos. Luego sobre estos mismos tejidos se determinó la

ubicación y se cuantifico y definió el perfil morfométrico de las neuronas

sensoriales infectadas.

8.1. Determinación de la ubicación neuroanatómica de las neuronas

sensoriales y motoras que participan en la innervación de la

almohadilla plantar de ratón adulto.

Para la ubicación e identificación de las neuronas sensoriales y motoras que

conforman el nervio ciático (NC) e inervan la almohadilla plantar, se realizó

la implantación de una cámara de silicona conectada al muñón proximal del

NC transectado, lo que garantizó que la totalidad del nervio estuviera en

contacto con la solución del trazador retrógrado FluoroGold (FG). Para definir

en cuales GE y regiones medulares se alojaron las neuronas sensoriales y

motoras marcadas, fue necesario procesar el tejido óseo de la columna

vertebral por una la técnica histológica de descalcificación. De esta manera

se lograron obtener secciones transversales seriadas de los diferentes

niveles vertebrales, en cada corte se observó el cuerpo vertebral y las

apófisis transversas ubicadas a lado y lado de la apófisis espinal.

42

Figura 3: Resumen de la metodología utilizada en los tejidos de animales infectados con VR. A. Extracción de la región Sacro- Lumbar y descalcificación de la misma, B. Obtención de cortes a partir de un segmento vertebral particular, C. Montaje de los cortes en 16 láminas pretratadas, D. Procesamiento de por inmunohistoquímica para detectar antígeno viral, E. Sobre estos mismos cortes se realizó el conteo (números) bajo microscopio, de neuronas sensoriales infectadas y no infectadas y la observación de las neuronas motoras presentes en la ME, F. Por último, se digitalizaron las imágenes utilizando un sistema de video acoplado a un microscopio y conectados a un computador, donde a través del programa Scion- Image se definió el contorno de las neuronas presentes en los cortes.

3

4

21

L3

L4

L5

L6

S1

A

B

C DE

F

43

En cada corte se observó en el centro de cada vértebra el canal medular y

dentro de éste, se observó la ME y los GE, externamente y rodeando cada

vértebra se observó tejido conjuntivo y muscular (Figura 4A). De esta manera

se analizaron en un mismo corte las neuronas motoras de la ME y las

neuronas sensoriales de los GE ipsilaterales (derechos) y contralaterales

(izquierdos) correspondientes a un mismo nivel vertebral. En el presente

estudio los niveles vertebrales objeto de análisis correspondieron a la

vértebra sacra 1 (S1), la totalidad de la región lumbar, que en ratón

corresponde a 6 vértebras, numeradas desde la región más caudal (L6) hasta

la más rostral (L1) y por último las vértebras toráxicas T13 y T12.

Figura 4: Sección transversal de columna vertebral y GE contrastado con Giemsa. A se muestra un corte transversal de columna, se observa el cuerpo de la vértebra (CV) y las apófisis transversas (T) y espinal (E). En el centro se distingue la médula (ME) y los ganglios espinales (GE) uno de ellos en recuadro. B Detalle de un GE, se observa las neuronas sensoriales con una coloración azul (flecha) y en el centro un haz de fibras axónicas con una coloración moradas (cabeza de flecha). Se describen las divisiones por zonas del GE, las zonas Dorso- medial y Ventro- Medial son las más cercanas a la médula, mientras que las zonas Dorso y Ventro Lateral son las más alejadas a ella Barra 200 m. μ

ME

GE

E

T

CV

A BDorso- Lateral Dorso- Medial

Ventro- Lateral Ventro- Medial

Méd

ula Esp

inal

44

A continuación se describen las características morfológicas de los tejidos

anexos y nervioso (ME y GE) contrastados con Giemsa, realizadas bajo

microscopio de luz en cada una de las vértebras de la región Sacro- Lumbar

analizada, además se describen los resultados obtenidos en estas zonas

pero procesada para detectar el FG bajo microscopia de epifluorescencia. El

marcaje obtenido con FG en tejido nervioso fue observado como un

precipitado específico de aspecto granular de color amarillo, generado por la

acumulación de vesículas de FG dentro del citoplasma de las neuronas

específicamente marcadas (Figura 6). En los GE se referirán las zonas donde

se encontró marcaje específico con FG como zonas dorso- medial y ventro-

medial a las regiones del ganglio mas cercanas a la médula y las zonas dorso

y ventro- lateral para las regiones más alejadas de la ME (Figura 4B).

8.1.1. Región Sacra: Vértebra sacra S1

Morfológicamente la vértebra sacra 1 (S1) posee modificaciones evidentes en

las apófisis laterales las cuales se observan agrandadas (en forma de alas de

mariposa). Por otra parte el espacio del canal medular es estrecho y aloja

paquetes de fibras denominadas cola de caballo junto con la presencia de un

relicto de sustancia gris y epéndimo denominada filum terminale . Los GE

fueron observados a ambos lados de la cola de caballo, estos presentaron

forma triangular, de tamaño pequeño, alojados tanto en el canal medular

como en el agujero intervertebral. Las poblaciones de neuronas presentes en

estos GE, se hallaron distribuidas homogéneamente en el interior de cada

ganglio. Por otro lado, se observó un paquete de fibras axónicas que

atraviesan la parte media de estos, estas fibras corresponden a las

proyecciones centrales o periféricas provenientes del mismo (Figura 5G).

Al realizar la evaluación por fluorescencia, se observó precipitado de FG, en

algunas neuronas sensoriales presentes en estos GE, estas células se

encontraron ubicadas en las zonas dorso y ventro medial y ventro- lateral del

ganglio (Figura 6A).

45

8.1.2. Región Lumbar: Vértebras lumbares L6- L1

Esta región vertebral posee 6 vértebras que fueron divididas en tres

regiones, la región más caudal fue conformada por las vértebras lumbares 6

y 5, estas vértebras poseen cuerpos vertebrales robustos. La región media y

rostral fue definida por las vértebras lumbares 4 y 3 y las vértebras 2 y 1

respectivamente, estas últimas cuatro vértebras poseen cuerpos vertebrales

más pequeños, las apófisis transversas y espinales son medianas y de forma

normal. Las poblaciones de neuronas sensoriales presentes, se observaron

distribuidas homogéneamente dentro de cada GE. La morfología de la ME en

esta región varió considerablemente, estos cambios fueron evidentes a

medida que la médula ascendió rostralmente por el canal medular. Las

diferencias fueron dadas principalmente por un aumento en el diámetro del

canal medular lo que evidencia un aumento en el área de la sustancia gris y

blanca. Para la vértebra lumbar mas caudal (L6) de la región, el segmento de

ME comparte las características morfológicas descritas para la vértebra sacra

1. Los segmentos medulares del resto de la región lumbar (desde L5 hasta

L1), presentaron características tales como un aumento progresivo del área

que ocupa la sustancia gris, de tal forma que en estas vértebras fue posible

distinguir claramente las astas o cuernos ventrales en donde se alojan las

neuronas motoras, y las astas dorsales donde se ubican las neuronas

medulares que corresponden a las aferencias centrales de la que conectan

con la rama medial proveniente de las diferentes neuronas sensoriales de los

GE. Al igual que en ME los GE de esta región presentaron variaciones en

tamaño a medida que se ascendió rostralmente, todos los GE se observaron

ubicados dentro del canal medular y en varios casos no coincidían con el

agujero intervertebral. Las neuronas sensoriales de cada uno de los GE

lumbares presentaron poblaciones neuronales de tamaños diferentes,

distribuidas homogéneamente dentro de todos los ganglios. (Figura 5 A- F)

Por fluorescencia, para los GE de toda la región lumbar, se detectaron

numerosas neuronas marcadas, lo cual sugiere que es en esta zona donde se

46

ubican la mayoría de neuronas sensoriales que componen el nervio ciático

(Figuras 6 B, C, D). En ME se observaron neuronas marcadas con FG

únicamente en los segmentos medulares de las vértebras L2 y L1 ubicadas

tanto en el asta dorsal como en el asta ventral (Figuras 6 F).

8.1.3 Región Toráxica: Vértebras toráxica T13 y T12 Esta zona vertebral presentó una morfología en ME y GE muy similar a la

descrita anteriormente para las vértebras lumbares L2 y L1. La sustancia gris

ocupó gran parte de la médula acompañada por la característica distribución

de la sustancia blanca conformada por paquetes de fibras axónicas de las

vías medulares ascendentes y descendentes. Los GE fueron de gran tamaño

ubicados en el canal medular, conformados por una población de neuronas

de diferentes tamaños distribuidas homogéneamente en los ganglios.

Por fluorescencia se observó FG depositado, sólo en algunos somas

neuronales ubicadas en la zona ventro- medial y dorso- lateral de los

ganglios (Figura 6 E).

8.2. Determinación de la ubicación y tiempo de aparición de antígeno

viral en neuronas sensoriales y motoras infectadas con virus de la

rabia.

A partir de los resultados obtenidos en el numeral 8.1, y al análisis

cualitativo realizado en los diferentes niveles vertebrales se observó que el

mayor número de neuronas sensoriales y motoras que conforman el NC se

alojaron entre las vértebras sacra 1 y en las lumbares desde L6 hasta L1.

Por tanto en los animales que fueron analizados 24, 48, 72, 96 y 120 horas

p.i., se empleó el protocolo de fijación de los tejidos y de obtención de

cortes transversales descritos anteriormente.

47

Figura 5: Cortes transversales de la región Sacro- Lumbar de ratón adulto, contrastados con Giemsa. De la A a la F Región lumbar (L1 a L6 respectivamente). G vértebra Sacra 1. Se observan las diferencias morfológicas de forma y tamaño de la ME (cabeza de flechas) en los diferentes niveles vertebrales, el tamaño y ubicación de los ganglios espinales GE (flechas) y la estructura de las apófisis espinal (AE) y transversas (AT) y del cuerpo vertebral (CV) Barra 200 m μ

B

C

D

A

CV

AP E

F

G

CV

CV

CV

CV

CV

CV

AT

AT

AE

AE

AE

AT

AT

AT

48

*

TM

C D

E F

Figura 6: Fotomicrografías de neuronas sensoriales de GE y ME marcadas con FG inyectado en una cámara de silicona implantada en el muñón proximal del nervio ciático. Se observan neuronas sensoriales marcadas (flechas) de los ganglios espinales de las regiones: A S1, B. L5, C. L3, E. T12 . D. Detalle de neuronas sensoriales marcadas y no marcadas (cabeza de flecha), nótese el aspecto granular del precipitado de FG. F. Detalle de marcaje del asta dorsal de ME de la región lumbar 1. Barras de 50 m.μ

BA

49

Se procesaron 40 cortes por nivel y por tiempo mediante la técnica de

inmunoperoxidasa indirecta, la detección de antígeno viral en neuronas

sensoriales y neuronas motoras, permitió observar inclusiones

citoplasmáticas inmunoreactivas (IR) para VR, en ninguno de los casos

analizados se observaron fibras axónicas IR presentes en GE o en ME (Figura

7A- B). Solamente a partir de las 72h p.i., se detectó antígeno viral en

algunas neuronas sensoriales de los GE ipsilaterales de la región lumbar L5 y

L4. Por otro lado a 96 y 120h p.i., se observó un mayor número de

neuronas IR para antígeno viral en los GE de toda la región Sacro- Lumbar. La

IR para VR en los GE ipsilaterales fue observado en las zonas dorso- medial,

dorso- lateral y ventro- lateral sin embargo la mayor inmunoreactividad se

obtuvó en las neuronas sensoriales ubicadas en la zona ventro- medial

(Figura 7 C- D). Al evaluar la presencia de antígeno viral en ME, esté sólo se

detectó en los cortes provenientes de L4 hasta L1 a 96 y 120h p.i. En las

regiones L4 y L3 se observó IR en algunas neuronas motoras del asta ventral

y del asta dorsal ipsilateral. Por otra parte, en las regiones L2 y L1 fue

evidente un aumento en la IR de las astas dorsales y del número de

neuronas motoras marcadas (Figura 8 A- F).

Sorprendentemente, se detectó antígeno viral en las neuronas sensoriales

ubicadas en los GE contralaterales (izquierdos), con un patrón de

distribución de las neuronas infectadas similar al observado en los GE

ipsilaterales, lo que podemos definir como una infección espejo “mirror-

like” . De igual modo se observó IR en las astas dorsales y ventrales

contralaterales de la ME de las regiones vertebrales L2 y L1. En estas zonas,

se observó un patrón de marcaje específico y particular distribuido

principalmente en las neuronas del asta dorsal ipsilateral y en neuronas

comisurales ubicadas en la lámina VIII del asta ventral contralateral. Por otro

lado la IR fue menos evidente en neuronas motoras ipsi y contralaterales y

en las neuronas del asta dorsal contralateral. Estos resultados sugieren que

el transporte del virus desde el GE hasta la ME involucra neuronas ubicadas

50

en el asta dorsal ipsilateral y sus conexiones con las interneuronas

comisurales que favorecen el transporte del virus hacia el lado contralateral

(Figura 9).

51

C

BA C

D FE

Figura 7: A Marcaje obtenido en motoneuronas de ME de la región L2 B. Neuronas sensoriales infectadas (flecha) y no infectadas (cabeza de flecha), observe la presencia de vesículas citoplasmáticas altamente inmunoreactivas. C- D- E: Cortes de ME (D) y GE ipsilaterales (E) y contralaterales (C) de la región L2 a 120h p.i. Observe la presencia en ME de antígeno viral en astas ventrales y dorsales ipsi (flechas) y contralaterales. En GE se observa un gran número de neuronas infectadas tanto en el ganglio ipsi como en el contralateral (flechas). Barras 100 mμ

Figura 8: Cortes de ME (B,E) y GE ipsilaterales (C,F) y contralaterales (A,D) de la región L2 a 120h p.i.de las regiones L4 (A,B,C) y sacra 1 (D,E,F). Observe las diferencias morfológicas que presenta la ME en los diferentes niveles vertebrales, además de las diferencias observadas en el patrón de infección. Contrario a lo observado para los GE donde se obtuvo en todos los niveles un gran número de neuronas infectadas tanto en el ganglio ipsi como en el contralateral (flechas), Barras 100 mμ

D E

A

52

Figura 9: Fotomicrografía de ME de la región lumbar 2 a 96h p.i. Se observan las diferencias de inmunoreactividad entre el asta dorsal ipsilateral (línea continua) respecto al marcaje contralateral (línea punteada), observe el marcaje específico en la lámina VIII (línea roja) de la ME contralateral y sólo algunas motoneuronas de asta ventral ipsi y contralateral positivas para VR (flechas).Barra 200 mμ

Por tanto es posible concluir que el VR, al ser inoculado en la almohadilla

plantar, utiliza preferencialmente la vía sensorial para alcanzar la ME, siendo

detectado sólo a partir de las 72h p.i.; sin embargo el número de neuronas

infectadas aumenta en el transcurso del tiempo post- inoculación y el virus

es dispersado a través de la ME utilizando vías complejas de conectividad

entre los GE y ME, entre ambos lados de la médula y logra infectar las

neuronas sensoriales del GE contralateral, además es importante resaltar que

la ubicación de las neuronas sensoriales de estos GE es similar a la obtenida

en los GE ipsilaterales.

53

8.3 Porcentaje de neuronas sensoriales de la región sacro- lumbar

infectadas por virus de la rabia.

Se tomaron 4 láminas por cada animal, evaluados a 72, 96 y 120h p.i. y de

cada uno de los niveles vertebrales procesados previamente por

inmunohistoquímica (numeral 6.2.3). Sobre estos se realizó un conteo de

aproximadamente 17.000 neuronas totales entre infectadas y no infectadas

de los 7 niveles vertebrales estudiados, tanto de ganglios ipsi como

contralaterales, este procedimiento se realizó bajo microscopio a una

magnificación de 400X.

De este modo se logró detectar claramente antígeno viral sólo a partir de las

72h p.i., en los GE de los niveles vertebrales lumbares L5 y L4, con un

porcentaje de infección menor al 1%. A 96 y 120h p.i., se observó un

aumento significativo obtenido a través del análisis estadístico (ANOVA y

DMS p<0.05), en el porcentaje de neuronas IR para VR, en todos los GE

ipsilaterales de la región sacro- lumbar analizada. (Figura 10), excepto para

las regiones L4 y L3 donde el porcentaje de infección se mantuvo invariable

entre 96 y 120h p.i. En los GE contralaterales de la región sacro- lumbar, se

observaron dos fenómenos: a las 96h p.i., se evidenció un menor porcentaje

de infección respecto al porcentaje obtenido en los GE ipsilaterales

correspondientes, contrario a lo sucedido a 120h p.i., donde el porcentaje de

infección fue similar entre ganglios ipsi y contralaterales (Figura 11).

Por otro lado, al comparar los porcentajes de infección de todos los GE

contralaterales a 96 y 120h p.i., se observó un aumento estadísticamente

significativo (t- Student p<0.05) (Figura 12).

Figura 10: Porcentaje de infección obtenidos a 72h (barra verde), 96h (barra amarilla) y 120h (barra naranja) en GE ipsilaterales (A) y contralaterales (B). Los porcentajes de infección fueron estadisticamente diferentes en todos los niveles al compararlos en los diferentes tiempos p.i.

0

10

20

30

40

50

S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1

Niveles Vertebrales

Por

cent

aje

de In

fecc

ión

(%) 72 H 96 H 120 H

0

10

20

30

40

50

S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1

Niveles Vertebrales

Po

rcen

taje

de

Infe

cció

n (%

) 72 H 96 H 120 H

A

B

55

0

10

20

30

40

50

IPSILATERALES CONTRALATERALES

Ganglios Espinales

Po

rcen

taje

de

Infe

cció

n (%

) S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1

0

10

20

30

40

50

IPSILATERALES CONTRALATERALES

Ganglios Espinales

Po

rcen

taje

de

Infe

cció

n (%

) S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1B

56

Figura 11: Porcentaje de infección obtenido en GE ipsilaterales y contralaterales a 96h p.i. (A) y 120h p.i. (B). Los valores de p obtenidos con el análisis ANOVA y DMS, se muestran en el anexo # 2

0

10

20

30

40

50

S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1

Niveles Vertebrales

Po

rcen

taje

de

Infe

cció

n (%

) IPSILATERAL CONTRALATERAL

0

10

20

30

40

50

S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1

Nivel Vertebral

Po

rcen

taje

ded

Infe

cció

n (

%) IPSILATERAL CONTRALATERAL

Figura 12: Porcentaje de infección a 96h (A) y 120h (B) p.i, en ganglios ipsilaterales (barra oscura) y ganglios contralaterales (barra clara). Se obtuvieron diferencias estadísticamente

A

B

**

*

**

*

*

*

**

57

significativas (*), con un valor de p<0.05 de acuerdo a lo obtenido con la prueba t- Student aplicada a todos los GE ipsi y contralaterales.

58

Estos resultados demuestran un aumento significativo en el porcentaje de

neuronas infectadas a 120h p.i., respecto a los otros tiempos analizados,

este incremento es visible tanto en GE ipsilaterales como contralaterales

contrario a lo obtenido en ME donde independiente del tiempo p.i., sólo se

detectó antígeno viral en la región lumbar L2 y L1 y principalmente

distribuido en las astas dorsales ipsilaterales.

En la Figura 13 se resumen los patrones de distribución de IR para VR en los

7 niveles vertebrales analizados, además se demuestran las diferencias

morfológicas en el tamaño de la ME y los GE, se observa también la

distribución de las neuronas IR para VR ubicadas en el asta dorsal y ventral

de la ME y en los GE ipsi y contralaterales de los 7 niveles vertebrales

analizados (Desde Sacro 1 hasta Lumbar 1).

59

).

Figura 13: Esquema de distribución de antígeno viral (flechas) para VR en médula espinal (ME) y ganglios espinales GE a 120h p.i., en los diferentes niveles vertebrales de ratón adulto analizados, cola de caballo (CC).

L1

L2

L3

L4

L5

L6

S1

GE

ME

CC

GE

GE

GE

GE

GE

GE

ME

ME ME

ME

CC

60

8.4 Descripción del perfil morfométrico de las neuronas sensoriales

infectadas por virus de la rabia.

Una vez obtenidos los porcentajes de infección de las neuronas sensoriales

en los diferentes GE ipsi y contralaterales de toda la región Sacro- Lumbar, se

tomaron únicamente cortes de animales procesados a 96 y 120 h p.i., sobre

los cuales se realizó un análisis morfométrico de neuronas infectadas y no

infectadas presentes en todos los GE. De este modo se caracterizó

morfométricamente la subpoblación de neuronas sensoriales infectadas por

VR. Se analizó un promedio de 600 neuronas sensoriales (infectadas y no

infectadas) por ganglio de 12 cortes por cada uno de los niveles vertebrales.

Estos resultados demostraron que la población de neuronas sensoriales de

GE in vivo de ratón adulto puede dividirse en tres subpoblaciones neuronales

definidas por sus diámetros. La población de neuronas grandes ≥35 mμ

presente con un 46%, seguida por la población de 25 a 35 m con un 52%μ

definida como neuronas intermedias y finalmente con un porcentaje de 2%

se ubica la población de neuronales pequeñas menores a 20 m de diámetro.μ

0

20

40

60

80

100

S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1Niveles Vertebrales

Po

rce

nta

je N

eu

ron

al (

%)

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Figura 14: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales de GE presentes en cada nivel vertebral analizado. Se observa una distribución descendente de las poblaciones intermedias y ascendente grandes presentes en los GE de los diferentes niveles vertebrales.

61

Los resultados obtenidos en este análisis demostraron que la población de

neuronas que fueron preferencialmente infectadas por VR en ambos GE

independiente del tiempo de infección, fueron las neuronas grandes cuyos

diámetros son mayores o iguales a 35 m (Figuras 15 y 16).μ

BS1A

62

.

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

rcen

taje

Neu

ron

al IPSI CONTRA

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

rcen

taje

Neu

ron

al IPSI CONTRA

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

rcen

taje

Neu

ron

al IPSI CONTRA

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

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taje

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al IPSI CONTRA

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

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100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

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taje

Neu

ron

al IPSI CONTRA

L5

L6

Figura 15: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas presentes en los ganglios ipsilaterales (barra oscura) y contralaterales (barra clara) de los niveles S1, L6 y L5 a 96 h (A) y 120h (B). Nótese que predomina la infección en la población de neuronas de diámetro ≥ a 35 m μ

63

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

rcen

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Neu

ron

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0

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40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

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taje

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ron

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0

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40

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80

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20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

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taje

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al IPSI CONTRA

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20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

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Po

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Neu

ron

al IPSI CONTRA

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20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

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Neu

ron

al IPSI CONTRA

0

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80

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20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

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al IPSI CONTRA

0

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40

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80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

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taje

Neu

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al IPSI CONTRA

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño NeuronalP

orce

ntaj

e N

euro

nal IPSI CONTRA

L1

L2

L3

L4

BA

L5

Figura 16: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas presentes en los ganglios ipsilaterales (barra oscura) y contralaterales (barra clara) de los niveles L4, L3, L2 y L1, a 96 h (A) y 120h (B). Nótese que predomina la infección en la población de neuronas de diámetro ≥ a 35 m, el corchete demuestra las diferencias estadísticamenteμ significativas, obtenidas en el test de Kolmogorov- Smirnov p<0.05

64

Por otro lado al evaluar la distribución de las frecuencias de neuronas

infectadas en los GE ipsi y contra de los 7 niveles vertebrales, demostró que

la susceptibilidad a la infección por VR presentada por las neuronas grandes

(mayores o iguales a 35 m) se mantuvo independientemente del tiempo p.i.,μ

(Figura 17 y 18).

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

rcen

taje

Neu

ron

al

96 H 120 H

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μTamaño Neuronal

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rcen

taje

Neu

ron

al

96 H 120 H

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

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taje

Neu

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al

96 H 120 H

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

rcen

taje

Neu

ron

al

96 H 120 H

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

rcen

taje

Neu

ron

al

96 H 120 H

0

20

40

60

80

100

20m≤ μ 21-35mμ 35m≥μ

Tamaño Neuronal

Porcen

taje Neu

rona

l

96 H 120 H

Figura 17: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas presentes en los ganglios ipsilaterales (A) y contralaterales (B) a 96 h (barra clara) y 120h (barra oscura) de los niveles S1, L6 y L5, Nótese que predomina la infección en la población de neuronas de diámetro ≥ a 35

m, el corchete demuestra las diferencias estadísticamente significativas, obtenidas en el test deμ Kolmogorov- Smirnov p<0.05.

L5

L6

BS1A

65

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

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rcen

taje

Neu

ron

al 96 H 120 H

0

20

40

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80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

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al 96 H 120 H

0

20

40

60

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20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

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taje

Neu

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al 96 H 120 H

0

20

40

60

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100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

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taje

Neu

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al 96 H 120 H

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño NeuronalP

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je N

euro

nal 96 H 120 H

0

20

40

60

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100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

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taje

Neu

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al 96 H 120 H

0

20

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20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

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Neu

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al

96 H 120 H

0

20

40

60

80

100

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Tamaño Neuronal

Po

rcen

taje

Neu

ron

al 96 H 120 H

Figura 18: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas presentes en los ganglios ipsilaterales (A) y contralaterales (B) a 96 h (barra clara) y 120h (barra oscura) de los niveles L4, L3, L2 y L1, Nótese que predomina la infección en la población de neuronas de diámetro ≥ a 35 m, el corchete demuestra las diferencias estadísticamente significativas, obtenidas en el test deμ Kolmogorov- Smirnov p<0.05

L2

L3

BA

L4

L1

66

En las figuras 19 y 20 se muestra la comparación de la distribución de

frecuencias de las neuronas infectadas a 96 y 120h p.i., en los ganglios

ipsilaterales (figura 19) y contralaterales (figura 20). En este análisis se

observó la preferencia estadísticamente significativa (test de Kolmogorov-

Smirnov p<0.05 ) del VR hacia las neuronas sensoriales grandes ≥35 m,μ

independiente del nivel vertebral, tiempo p.i. y lateralidad de los GE.

0

20

40

60

80

100

S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1

Nivel Vertebral

Po

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taje

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20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

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100

S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1

Nivel Vertebral

Po

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taje

Neu

ron

al

20 m≤ μ 21-35 mμ 35 m≥ μ

Figura 19: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas presente en los ganglios ipsilaterales, a 96h (A) y 120h (B). Nótese que predomina la infección en la población de neuronas de diámetro ≥ a 35 mμ

A

B

67

Figura 20: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas presentes en los ganglios contralaterales a 96h (A) y 120h (B). Nótese que predomina la infección en la población de neuronas de diámetro ≥ a 35 mμ

A

B

0

20

40

60

80

100

S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1

Nivel Vertebral

≤ 20 mμ 21- 35 mμ ≥35 mμ

Po

rcentaje N

euro

nal

0

20

40

60

80

100

S1 L6 L5 L4 L3 L2 L1

Nivel Vertebral

Porcentaje Neuronal

≤ 20 μm 21- 35 μm ≥ 35 μm

68

Los resultados obtenidos mediante el análisis morfométrico y el test de

Kolmogorov- Smirnov, se demostró de forma contundente, la susceptibilidad

diferencial de la población de neuronas grandes (≥35 m) hacia la infecciónμ

por VR, esta tendencia se mantuvó invariable en los tiempos post- infección

evaluados, niveles vertebrales y entre GE ipsi y contralaterales (Figuras 15 a

la 20)

Al evaluar a 96 y 120H p.i. los promedios de los diámetros de las neuronas

sensoriales infectadas de los GE ipsilaterares comparados contra sus

respectivos contralaterales, solo los niveles L6, L5, L4 y L2 a 96H y L4 a

120H p.i., presentaron diferencias estadísticamente significativas. Por otro

lado, cuando se compararon los diámetros de los GE ipsilaterales de cada

uno de los niveles vertebrales durante el transcurso de la infección (96H y

120H p.i), se observó que a 120H p.i., sólo los GE ipsilaterales de L5 y L1 y

los contralaterales de L6, presentaron diferencias estadísticamente

significativas, los datos se presentan en las tablas 1 y 2.

Estos resultados sugieren que en el transcurso de la infección, el virus

inicialmente infecta las neuronas sensoriales de diámetros ≥35 m de los GEμ

ipsilaterales y debido a las conexiones especificas que relacionan las

neuronas sensoriales de un GE al otro, el virus es transportado gradualmente

a estas últimas de diámetro similar y ubicadas en áreas semejantes del GE

contralateral (infección en espejo).

69

Tabla #1: Promedios de los diámetros de las neuronas infectadas a 96 o 120 h p.i. de GE ipsi y contralaterales de cada nivel vertebral. Se observan diferencias estadísticamente significativas en los niveles L6, L5, L4 y L2 a 96 H p.i. y L4 a 120 H con un valor de p<0.05 de acuerdo al análisis de t- Student .

Los números en rojo muestran que tanto en el análisis de t- Student como de Kolmogorov-Smirnov, los valores de p fueron estadísticamente significativos.

Tabla #2: Promedios de los diámetros de las neuronas de GE ipsi y contralaterales a 96 y 120 H p.i., de cada nivel vertebral. Se observan diferencias estadísticamente significativas en los niveles L5 y L1 en los GE ipsilaterales y en L6 en los GE contralaterales con un valor de p<0.05 de acuerdo al análisis de t- Student.

CONTR

35.08

36.63

35.59

36.57

32.73

31

31.65

0,21736.73L1

0,04638.65L2

0,32036.50L3

0,04241.73L4

0,04836.62L5

0,00635.15L6

0,70435.15S1

IPSI

Valor Promedio 96H

CONTR

40.41

37.94

35.42

36.07

36.96

31.61

33.60

0,95540.63L10,32538.56L2

0,49635.82L30,03237.13L40,93137.06L50,19132.47L6

0,60634.13S1IPSI

Valor de Promedio 120

120 H

40.63

38.56

35.82

37.13

37.06

32.47

34.13

0,00136.73L1

0,91938.65L2

0,77336.50L3

0,45841.73L4

0,01336.62L5

0,17035.15L6

0,29035.15S1

96 H

Valor de Promedio IPSI

120 H

40.41

37.94

35.42

36.07

36.96

31.61

33.60

0,23435.08L1

0,08436.63L2

0,13935.59L3

0,06336.57L4

0,77132.73L5

0,00531L6

0,41231.65S196 H

Valor Promedio CONTR

70

Los números en rojo muestran que tanto en el análisis de t- Student como de Kolmogorov-Smirnov, los valores de p fueron estadísticamente significativos.

9. DISCUSIÓN

El presente estudio tuvo como objeto definir, mediante un modelo de

infección por VR in vivo,, la cinética de infección en neuronas sensoriales y

motoras a través de diferentes tiempos post- inoculación. Esto permitió

establecer la preferencia de captura y transporte del virus desde la periferia

hacia la ME por una vía nerviosa.

Para este fin fue necesario emplear técnicas diferentes que nos permitieron

definir una región vertebral específica en la cual se alojó la mayor parte de

neuronas sensoriales de los GE y motoras de la ME, que componen el NC.

Estas neuronas fueron evaluadas al mismo tiempo y en un mismo corte

mediante la aplicación del neurotrazador FG y la obtención de cortes de

columna vertebral. Por otro lado en animales infectados por VR se detectó

antígeno viral después de ser inoculado en la almohadilla plantar a

diferentes tiempos p.i., de este modo se logró identificar específicamente las

neuronas sensoriales y motoras, involucradas en el transporte del VR desde

la periferia hasta la ME. Por tanto, se analizaron aspectos neuroanatómicos,

neurovirológicos y virológicos que permitirán discutir y comprender los

resultados descritos anteriormente.

9.1 Aspectos Neuro- Anatómicos

El NC posee fibras de tipo sensorial y motor que inervan en su totalidad la

parte dorsal de la extremidad inferior. En ratón, no se conoce en su totalidad

el origen espinal de estas fibras, sin embargo, se han extrapolado los

resultados obtenidos previamente en rata. Para este último, algunos estudios

han demostrado mediante el uso de diferentes técnicas, que el NC de ratas

posee fibras de tipo sensorial que provienen de los ganglios lumbares L6, L5

71

y L4 y las fibras motoras provienen de los niveles medulares

correspondientes (Gelderb y Chopins, 1977; Popesko et al 1998; Williams,

2001). Montoya y cols evaluaron, mediante la técnica de degeneración

retrógrada de las raíces espinales de los ganglios L6, L5 y L4, el aporte que

cada una de ellas hace al NC. Además de describir la distribución topográfica

de cada una de las raíces espinales dentro del nervio, los autores sugieren la

posibilidad de que existan aportes de fibras sensoriales que provengan de

GE ubicados en zonas más caudales o rostrales a las ya descritas (Montoya

et al, 2002). Por otro lado Pugdellivol- Sánchez y cols, (1998) mediante la

aplicación de moléculas neurotrazadoras evaluaron el número aproximado

de neuronas motoras y sensoriales que conforman el NC de ratas y sugieren

que las neuronas ubicadas en estos niveles vertebrales (L6, L5, L4) son

insuficientes comparado con la cantidad de fibras cuantificadas en cortes

transversales del nervio (Pugdellivol- Sánchez et al, 1998; 2002).

Esta información demuestra, en primer lugar que el NC es un tronco

nervioso al cual estan aportando varios GE ubicados en niveles diferentes a

los reportados. En segundo lugar, aunque las ratas y los ratones poseen

altos grados de homología neuroanatómica, no es posible comparar y

extrapolar entre estas dos especies los datos obtenidos experimentalmente

para ratas. Por esta razón nuestro primer objetivo específico consistió en

realizar un seguimiento detallado de la ubicación neuro- anatómica

específica de la mayor cantidad de neuronas sensoriales y motoras que

conforman el NC en ratón. Mediante la implantación de una cámara de

silicona que contenía la solución del neurotrazador FG se garantizó que

todas las fibras del nervio estuvieran en contacto con la solución, sin

embargo, para definir el sitio exacto de aparición del marcaje fue necesario

obtener cortes completos de cada vértebra mediante la descalcificación del

tejido óseo. Esto permitió evaluar en una misma sección la ME y los GE

pertenecientes a una zona y región vertebral determinada, sin afectar

72

considerablemente la morfología de los tejidos y la forma y el contenido

citoplasmático de las neuronas, este procedimiento fue previamente

estandarizado por nuestro grupo (Velandia et al, 2002). De este modo se

observó bajo epifluorescencia el marcaje característico de FG en las

neuronas distribuidas entre los GE de la vértebra sacra 1, la región lumbar

completa (L6 a L1) y las vértebras toráxicas T13 y T12. Las neuronas

positivas para FG fueron ubicadas normalmente en zonas determinadas

dentro de cada GE lo que demuestra una posible distribución somatotrópica

de estas neuronas. Esta distribución y ubicación específica dentro de los

ganglios fue reportada para el GE L4 de rata por Peyronnard et al, (1986) y

Pugdellivol- Sanchez et al, (1998). En estos trabajos se sugiere que durante

el desarrollo del GE, la ubicación de cada neurona esta relacionada con el

tipo de tejido inervado, lo cual determina en parte la modalidad sensorial de

las neuronas (Guan et al, 2003). Nuestros resultados nos permiten sugerir

dos aspectos neuro- anatómicos de las neuronas sensoriales que conforman

el NC de ratón. En primer lugar se describió que estas neuronas se ubican

mayoritariamente entre la región lumbar, sin embargo las vértebras sacra 1 y

toráxicas 13 y 12 hacen aportes minoritarios. En segundo lugar se observó

que estas neuronas se alojan principalmente en las zonas ventro- medial,

dorso- lateral y medial de los GE, ubicaciones similares a las descritas

anteriormente para ratas, lo cual demuestra la distribución somatotrópica de

las neuronas sensoriales del NC en los GE de ratón.

9.2 Aspecto Neuro- Virológico

La preferencia del VR hacia las neuronas sensoriales presentada en este

estudio es de particular interés y se soporta por los resultados obtenidos

durante la cinética de detección de antígeno viral por inmunohistoquímica

en los diferentes tiempos p.i, y niveles vertebrales evaluados. Esta cinética

determinó que sólo a partir de las 72h p.i. algunas neuronas sensoriales de

los GE ipsilaterales de las vértebras L5 y L4 fueron IR para VR, mientras que

73

para la ME de la región Sacro- Lumbar analizada no fue detectado antígeno

viral. Sin embargo a 96 y 120h p.i., la IR fue detectada en todos los GE

ipsilaterales de los 7 niveles analizados y únicamente en la ME

correspondiente a las vértebras L2 y L1. Estos resultados contradicen lo

reportado por varios autores quienes mediante modelos de infección in vivo,

aseguran que el VR ingresa al SN principalmente por la vía motora (Coulon et

al, 1989; Jackson 1991; Tang et al, 1999, Guigoni y Coulon, 2002; Mazarakis

et al, 2002)

Las diferencias obtenidas entre nuestro estudio y lo reportado por los

diferentes autores pueden ser debidas por algunos de los siguientes

aspectos: el modelo animal utilizado, la cepa viral, el sitio de inoculación y

las técnicas de evaluación utilizadas. En primer lugar el modelo animal

comúnmente utilizado para estos estudios es el ratón (Coulon et al, 1989;

Jackson 1991); sin embargo se han utilizado otros modelos animales como

ratas adultas o post natales de un día de nacidas (Tang et al, 1999 Guigoni y

Coulon, 2002, Mazarakis et al, 2002), y zorrillos adultos (Charlton y Casey,

1979); entre otros. Este aspecto constituye un factor importante al evaluar

la neuropatogénia de la enfermedad debido a que cada especie puede

presentar de manera específica, diferencias en tiempo y síntomas durante el

desarrollo de la enfermedad. Por otro lado la edad de los animales determina

de modo específico la susceptibilidad y el carácter letal de la enfermedad,

este hecho fue demostrado por Morimoto y cols (1998), quienes en un

modelo de infección por VR en ratones adultos y postnatales, demuestran

estas diferencias entre los dos grupos, siendo más susceptibles los animales

más jóvenes.

Del mismo modo que el modelo animal, la cepa viral utilizada también

puede incidir directamente en determinar los tiempos de infección y el

carácter letal de la enfermedad. En nuestro estudio se empleó una cepa fija

obtenida a través de pasajes sucesivos en cerebro de ratón adulto, lo que

incrementa el neurotropismo y la capacidad de evasión del sistema inmune,

74

lo cual conlleva a un aumento en el carácter letal del virus (Lafon M, 2004),

contrario a lo reportado por Coulon et al, 1989; Jackson 1991; Tang et al,

1999, Guigoni y Coulon, 2002, Mazarakis et al, 2002, Lafon M, 2004,

quienes utilizando cepas virales obtenidas a partir de cultivos de células

fibroblastoides, obtienen tiempos de infección y características

neuropatológicas diferentes a las nuestras. Estas cepas pierden parcialmente

el tropismo y pueden estimular más rápidamente la respuesta inmune del

individuo, lo que conduce a una disminución en la letalidad del virus, siendo

detectados los síntomas de la enfermedad en tiempos posteriores a los

presentados por los animales infectados con la cepa viral más neuro- tropica

(Castellanos et al, 2002, Morimoto et al 1998, Lafon M, 2004).

El sitio de inoculación del virus determina parcialmente el tropismo y de

acuerdo a su cercanía con el SN determina la velocidad de ingreso y

colonización del virus al SNC. Comúnmente es utilizado como sitio de

inoculación el músculo masetero (Shankar et al,1991; Prosniak et al, 2001),

aunque también es reportada la aplicación de virus en los músculos gracilis

o sartorio (Charlton y Casey, 1979) y bulbo- esponjoso (Tang et al, 1999) o

en la cámara anterior del ojo (Kucera et al, 1985), en el sistema oculomotor

(Ugollini et al, 1995), en las fosas olfatorias (Lafay et al, 1991) o mediante

inoculaciones directas por estereotaxia en el SNC (Mazarakis et al 2002). Los

resultados obtenidos por los diferentes autores muestran que de acuerdo a

la zona de inoculación, el tiempo de detección de antígeno viral o de RNA

total varían considerablemente en las áreas del SN afectadas.

Estos aspectos en conjunto determinan algunas de las características de

neuro- invasión del VR y sugieren según los estudios, que una vez el virus es

inoculado en un área determinada, es capturado principalmente por las

terminaciones motoras presentes en el sitio de inoculación y transportado

hasta sus somas ubicados en la ME (Faber et al, 2004). Sin embargo un

75

último aspecto que normalmente no es tenido en cuenta, es la manera de

evaluar la relación neuronanatómica entre la zona medular y los GE

analizados en los modelos in situ.

La neuroanatomía de la ME y los GE, poseen aspectos particulares. En el

análisis neuroanatómico realizado inicialmente, demostramos que la

morfología de la ME varía de modo sustancial en las últimas vértebras de la

columna, esta variación radica principalmente en el agotamiento de la

sustancia gris en las vértebras sacras y lumbares caudales, esto implica que

las aferencias sensoriales y eferencias motoras correspondientes a los GE

ubicados en estas vértebras deben alojarse en niveles medulares más

rostrales. Esta descripción es un parámetro importante para definir la

participación y preferencia del VR por la vía sensorial o motora para

colonizar la ME y posteriormente el encéfalo.

La evidencia experimental existente en los modelos de infección in situ ,

reporta antígeno viral o RNA en áreas de la médula anatómicamente no

relacionadas totalmente con el sitio de inoculación, pasando por alto los

aspectos neuroanatómicos descritos anteriormente. Los resultados

obtenidos demuestran cinéticas diferentes y una clara preferencia de captura

y transporte del virus principalmente por las neuronas motoras, por lo cual

siempre es sugerido que el VR una vez inoculado es capturado y

transportado por las terminaciones de estas motoneuronas. De este modo se

facilita el ingreso del virus a ME y su dispersión a otras zonas del tejido

incluyendo encéfalo (Prosniak et al, 2001). Sin embargo y aunque existe

evidencia experimental que demuestra que las neuronas sensoriales de los

GE también participan en la captura y transporte del virus desde la periferia

hasta la ME, se ha desestimado la participación de las neuronas sensoriales

durante la infección por VR por lo que sugiere que estas neuronas no

participan de modo directo en la promoción de la infección y colonización

del SNC (Charlton y Casey, 1979, Lafon 2005).

76

Por el contrario, mediante la inoculación de VR en la almohadilla plantar y

mediante el procesamiento de los tejidos utilizado en este estudio,

presentamos un modelo de evaluación para la detección de VR en SN. Por

un lado utilizamos la almohadilla plantar como zona de inoculación, esta

área comúnmente es tomada como desafió para la evaluación de la

capacidad patógena del virus, además esta zona puede simular las áreas

periféricas que comúnmente son afectadas en los accidentes rábicos en

animales y humanos. Por otro lado el manejo simultaneo de la ME y GE de

las vértebras de la región Sacro- Lumbar (S1 hasta L1), logró de modo claro

ubicar, describir, cuantificar y definir en los diferentes tiempos p.i., las

poblaciones de neuronas de los GE y de ME infectadas por VR inoculado en

la almohadilla plantar. Nuestros resultados apuntan hacia definir una escasa

participación de las neuronas motoras de la ME, puesto que estas sólo

fueron detectadas en los mayores tiempos p.i., y restringidas a la región

vertebral L2 y L1, contrario a lo observado para GE en los cuales se encontró

IR a partir de las 72h p.i. con un incremento evidente en el transcurso del

tiempo. Con estos argumentos podemos concluir que el VR inoculado en la

almohadilla plantar coloniza la ME principalmente por la vía sensorial, lo que

demuestra que estas neuronas poseen características bioquímicas favorables

para la captura, transporte y replicación del virus in vivo, evidencia que había

sido previamente demostrada en modelos de infección in vitro reportado por

Tsiang y cols, (1983; 1989); Castellanos, (2002), Martínez, (2003); Martínez

y cols, (2005), quienes utilizando neuronas sensoriales demostraron que

estas neuronas son un buen sustrato celular para la transcripción y

replicación viral, características que son mantenidas in vivo (Utiníco et al,

2002).

Por otra parte al realizar la evaluación del porcentaje de neuronas infectadas

en los GE de cada uno de los tiempos p.i., se observó un incremento

77

significativo a las 120h p.i., respecto al obtenido a las 96 y 72h para los

ganglios S1, L6, L5, L2 y L1. Sin embargo, se presentó un fenómeno

particular en los GE L4 y L3, en los cuales no se observó un aumento

significativo en el porcentaje de neuronas infectadas entre tiempos,

sugiriendo que existen varios procesos: un transporte retrógrado y

anterógrado constante del virus a través de las fibras axónicas de estos

ganglios y es posible pensar que la cantidad de virus capturado y replicado

en estas neuronas permanece invariable en el transcurso del tiempo, lo cual

explicaría la escasa modificación en el porcentaje de neuronas infectadas a

96 y 120h p.i.

Los resultados obtenidos durante la cinética de infección, pueden sugerir

varios fenómenos: en primer lugar es posible que el virus haya tenido un

periodo inicial de replicación en el tejido muscular de la zona de

inoculación, lo cual explicaría la ausencia de antígeno viral las primeras 72h,

por otro lado es posible que la técnica empleada no sea lo suficientemente

sensible para detectar pequeñas cantidades de antígeno viral presente en los

primeros tiempos post- infección en los diferentes niveles vertebrales

analizados, esta situación cambió en los tiempos post- infección de 96h y

120h en los cuales se detectó en todos los GE y en ME de la región L2 y L1.

Esta dispersión en la cual involucró un mayor número de neuronas sugiere

que existió propagación viral no solo en tejido nervioso sino también en el

tejido muscular del área de inoculación (Murphy et al, 1973, Shankar et al,

1991, Tang et al, 1999) excepto para el área inervada principalmente por L4

y L3. Otro aspecto que puede estar implicado, es la eficiente replicación del

virus en las neuronas sensoriales de los ganglios inicialmente infectados, lo

cual permitió transportar nuevas partículas virales entre las neuronas del

asta dorsal ipsilateral de las regiones medulares L2 y L1 y desde allí

dispersar el virus a zonas más caudales y más rostrales a estas, tanto en ME

como de GE.

78

Por último y como queda demostrado en el presente trabajo el virus recurre

a complejas vías de conectividad y comunicación entre el lado derecho de la

médula (ipsilateral) y el lado izquierdo de esta (contralateral), lo que

permitió una mayor dispersión del virus y la infección en los GE

contralaterales. Este aspecto requiere de un doble análisis, uno desde el

punto de vista neuroanatómico y otro virológico.

Neuro- anatómicamente la infección de las neuronas sensoriales

contralaterales a 96 y 120h p.i., involucra necesariamente interneuronas de

diferente naturaleza funcional y bioquímica que comunican ambos lados de

la ME. Dentro de este grupo de neuronas se incluye posiblemente la

población de neuronas comisurales ubicadas en la lámina VIII del asta

ventral de la ME. Estas interneuronas participan de forma activa en los

procesos que implican movimientos coordinados entre ambos lados del

cuerpo, como por ejemplo caminar o nadar (Koltzenburg et al, 1999), La

evidencia de la ubicación y función de estas interneuronas coincide con

nuestros resultados, puesto que las interneuronas contralaterales se alojan

entre los niveles medulares L2 y L1, zonas en las que encontramos

exclusivamente marcaje ipsi y contralateral y en particular en la lamina VIII

de la ME (Figura 9). Sin embargo, aunque los mapas de interacción entre

motoneuronas ipsilaterales y la respectiva activación de interneuronas

comisurales excitatorias y/o inhibitorias contralaterales y la respuesta de

motoneuronas contralaterales es ampliamente conocida (Eide et al 1996;

1999; Helms y Jonson, 2003), no existen reportes que describan la

interacción, asociación y comunicación entre estas y las neuronas

sensoriales de los ganglios ipsi y contralaterales. Esta interacción queda

demostrada al detectar neuronas sensoriales infectadas ubicadas en sitios

específicos dentro de los GE contralaterales similares a las observadas en los

GE ipsiliaterales. Por tanto en el presente estudio no solo estamos

corroborando la capacidad anteriormente descrita, del VR como

79

neurotrazador (Loewi A, 1998, Ugollini 1995, Tang et al, 1999, Kelly y Strick,

2000), sino que además estamos sugiriendo por un lado, la capacidad del

virus para utilizar vías complejas de conectividad entre neuronas de ambos

lados de la ME y ambos GE, con lo cual el virus aumenta su capacidad de

dispersión y alteración de las funciones locales de los tejidos y órganos

durante la infección, incluso antes de colonizar completamente el encéfalo;

por otro lado sugerimos la existencia de una vía de conexión e interacción

entre las neuronas sensoriales de los GE con las neuronas comisurales de ME

tanto ipsi como contralaterales .

Otro aspecto importante con el cual se confirma la participación de las

neuronas sensoriales en la infección por VR en SN es la marcada

susceptibilidad diferencial de estas neuronas. Los resultados obtenidos

sugieren de modo contundente, que al realizar la inoculación del VR en la

almohadilla plantar, el virus fue capturado y transportado principalmente por

la población de neuronas sensoriales grandes ( 35 m), presentes en los GE.≥ μ

Este fenómeno fue anteriormente descrito en un modelo de cultivos

primarios de neuronas sensoriales de GE de ratón adulto (Martínez y

Castellanos, 2005). En este modelo se describe que las poblaciones de

neuronas pequeñas e intermedias fueron las células que mayoritariamente

se encontraron en el cultivo, mientras que las células de tamaños grandes

(≥25 m) fueron la población minoritaria, sin embargo al evaluar elμ

porcentaje de infección para VR, se observó que el virus infectó

preferencialmente la población de neuronas grandes con un 42.6%, frente a

un 31 y 26.4% de infección de las poblaciones de neuronas pequeñas e

intermedias presentes en el cultivo. Por otro lado cuando se evaluó la

presencia de alguna de las moléculas receptoras para el virus (RNACh,

NCAM, p75 NTR) en las células infectadas, se encontró que las poblaciones

positivas para el virus también lo fueron para la subunidad 4 delα receptor

RNACh ó para el receptor p75 NTR, esta población de neuronas correspondió a

80

las neuronas de mayor tamaño (castellanos et al, 2000; Martínez M, 2003;

Martínez y Castellanos, 2005; Castellanos J, 2002).

Con el anterior estudio se concluyó que las neuronas sensoriales de tamaños

grandes en cultivo presentaron una marcada susceptibilidad a la infección

por VR, susceptibilidad asociada principalmente a la presencia de dos de las

moléculas receptoras postuladas para el VR el RNACh y p75 NTR.

En el presente trabajo se determinó que la población de neuronas grandes

( 35 m) fue la población predominante en los GE de la región sacro-≥ μ

lumbar, resultados que coinciden con lo reportado por Sommer y cols,

(1985) para ratones y por Rambourg y cols, (1983) en ratas. Además se

demostró que son estas neuronas las que preferencialmente se infectan con

VR, esta preferencia aumentó en el transcurso de la infección entre las 96 y

120H p.i, en los GE ipsilaterales de algunos niveles (L5 y L1), lo cual

demuestra que a 120H p.i., se involucran áreas musculares o articulares

inervadas por terminaciones de neuronas grandes, por otro lado, los

resultados observados en los GE contralaterales, demuestran el transporte

gradual del virus desde las neuronas sensoriales ipsilaterales hasta las

neuronas sensoriales ubicadas en zonas especificas en el GE contralateral,

este transporte viral, utiliza la compleja vía de conexiones que posiblemente

puede existir entre GE ipsi y contralaterales a través de las interneuronas

comisurales.

Lo anterior sugiere que los modelos de infección para VR in vitro e in vivo

mantienen las características de susceptibilidad a la infección al detectar

principalmente antígeno viral en una población determinada

morfométricamente. La población de neuronas sensoriales grandes de GE se

relacionan por participar en la captación y transporte de información de tipo

propioceptivo y/o mecanoreceptivo (Scott S, 1992), por tanto podemos

sugerir que la zona de inoculación escogida, posee gran cantidad de

81

terminaciones sensoriales de este tipo y que debido a su función y al tipo de

tejido inervado, expresan en su membrana mayoritariamente receptores de

acetilcolina RNACh y su subunidad α4 (presente únicamente en el neuronas

y el receptor p75 NTR (Castellanos y Hurtado, 2001; Lafon M, 2005). Este

aspecto puede determinar gran parte de la susceptibilidad de esta

subpoblación a la infección. Por otra parte es posible que estas neuronas

posean características bioquímicas únicas en su maquinaria celular, que

permitan al virus transcribirse y replicarse eficientemente, sin embargo se

necesitan nuevos estudios que permitan valorar esta hipótesis.

Con los resultados obtenidos, proponemos un modelo de transporte y

conectividad descrita por el VR inoculado en la almohadilla plantar de ratón

adulto. El modelo se resume en la figura 21, en el cual planteamos lo

siguiente: El virus inoculado en la almohadilla plantar de ratón adulto, puede

sufrir procesos de replicación en músculo ó puede ser capturado

directamente por las terminaciones propioceptivas o mecanoreceptivas

(neuronas grandes) presentes en la zona de inoculación. Una vez en el

interior de los axones. viaja por transporte axonal retrogrado hasta el soma

de las neuronas sensoriales ubicados en los GE de la región sacro- lumbar,

en estas últimas puede replicarse o puede pasar directamente a las células

del asta dorsal de la médula, en estas células el virus se replica y puede

infectar interneuronas ipsilaterales, que pueden infectar a su vez neuronas

motoras del asta ventral derecha, o infectar neuronas comisurales que

permiten dispersar el virus desde el lado derecho de la infección hacia el

lado izquierdo, y desde allí viaja de modo anterógrado a las neuronas

sensoriales contralaterales. Además de este sistema de dispersión local, el

virus puede ser transportado directamente por las neuronas del asta dorsal

ipsi y contralateral a través del tracto cortico- espinal y por el tracto espino-

talámico a zonas mas rostrales y mas caudales a las involucradas

inicialmente.

82

9.3 Aspecto virológico

Desde el punto de vista virológico, es sabido que las neuronas tanto in vitro

como in vivo, son un excelente sustrato celular para la transcripción y

replicación viral, de hecho, buena parte de esto procesos son realizados

parcial o totalmente por la maquinaria sintética de las células (Wu et al,

2002), además se conoce suficientemente que existen marcadas diferencias

bioquímicas y funcionales entre las neuronas, por tanto el virus una vez

ingresa al organismo, interactúa con algunas moléculas de la membrana de

las células susceptibles a la infección que facilitan su ingreso. Es posible que

cada célula neuronal involucrada en los diferentes pasos que permiten el

viaje del virus desde la periferia hasta ME y encéfalo, sean de naturaleza y

función diferentes una de otra y ofrezcan al virus moléculas receptoras

distintas, por tanto el virus debe adaptarse a cada ambiente celular ofrecido

en el transcurso de su viaje (Lafon M, 2005). En nuestro estudio se observó

antígeno viral en diferentes tipos de neuronas de ME, esto indica que estas

neuronas fueron en mayor o menor grado, sustratos celulares favorables que

permitieron en el transcurso del tiempo, la generación de nueva progenie

viral y su dispersión, entre niveles vertebrales y localmente entre los lados

ipsi y contralaterales de cada región vertebral. Estas neuronas se

encontrarían ubicadas en la región medular de las vértebras L2 y L1 y

permitirían el paso transináptico del virus a las neuronas correspondientes

del asta dorsal contralateral y de allí el virus seria transportado de modo

retrógrado y posiblemente anterógrado, entre los diferentes tipos de

neuronas de ME. En este aspecto no existe evidencia ni con el virus de la

rabia, ni con otros virus neurotrópicos, por lo tanto este trabajo es el primer

reporte presentado y de acuerdo a su originalidad, se requieren nuevos

estudios que permitan evaluar la capacidad replicativa del virus en algunas

de las neuronas de médula y los mecanismos utilizados por el virus para ser

transportado dentro de esta.

83

34

5

6

6’

8

7

1

2

84

Figura 21: El VR es capturado y transportado retrógradamente hasta los somas de las neuronas sensoriales de los GE 1, desde donde es transportado anterógradamente hasta el asta dorsal ipsilateral 2 y luego puede ser de nuevo llevado hasta los somas de los GE 3. En ME el VR puede infectar motoneuronas ipsilaterales 4’ o interneuronas 5 las cuales pueden a su vez transportar el virus hacia neuronas del asta dorsal ipsilateral 6 y desde estas a motoneuronas contralaterales 6’. En el asta dorsal contralateral el virus puede viajar hacia las neuronas sensoriales de los ganglios contralaterales y viceversa 7 y 8.

10. Conclusiones

1. El nervio ciático es un plexo nervioso conformado por fibras

axónicas de GE alojados entre las vértebras S1 hasta la toráxica T12,

aunque el mayor número de neuronas sensoriales que conforman

este nervio se ubican en los GE S1 y la totalidad de la región lumbar,

mientras que las neuronas motoras se ubican principalmente en la

región lumbar L2 hasta T 12.

2. El VR inoculado en la almohadilla plantar requiere posiblemente de

72H p.i., para ser capturado y transportado principalmente por

terminaciones sensoriales de neuronas grandes de tipo propioceptivo

y mecanoreceptivo ubicadas en la zona. Una vez en el soma de estas

neuronas ubicadas en los GE de la región sacro- lumbar, el VR se

replica y transporta retrógrada y anterógradamente, de tal forma que

infecta nuevas neuronas con características bioquímicas y funcionales

diferentes, tanto en ME como en los GE. De esta manera el virus

incrementa su capacidad de dispersión en el tejido nervioso.

3. El marcado neurotropismo del VR sugiere una gran versatilidad de

este para infectar neuronas de diferente naturaleza, con la cual

aumenta sus posibilidades de dispersión en el tejido nervioso,

además pone en evidencia la existencia de vías complejas de

85

conectividad entre ME y GE ipsi y contralaterales, esta compleja

propagación viral en los diferentes niveles vertebrales, nos permite

interpretar de forma diferente algunos de los procesos

neuropatogénicos de la infección por VR.

4. Las neuronas sensoriales de tipo propioceptivo y/o mecanoreceptivo

de los GE favorecen y promocionan, la captura y el transporte del VR

desde la almohadilla plantar hasta la ME. Estas neuronas son más

susceptibles a la infección que las neuronas motoras y mantienen

estas características de susceptibilidad tanto en el modelo de

infección in vitro como in vivo.

11. PERSPECTIVAS

1. Evaluar mediante técnicas de biología molecular el RNA viral

genómico y mensajero en ME y GE de los diferentes niveles y tiempos

post- infección aquí evaluados.

2. Evaluar el efecto de algunos fármacos antivirales propuestos por

nuestro grupo (Neurotrofinas, Heparina, agonistas y antagonistas del

RNAch) en el modelo de infección in vivo aquí propuesto.

3. Determinar en el modelo de infección propuesto los diferentes

eventos de la neuropatogénia tales como respuesta inmune frente a

la infección, daño funcional neuronal y transporte viral, que se

suceden durante la infección por el VR en tejido neuronal.

86

4. Evaluar mediante microscopia electrónica y confocal el paso

transináptico del VR desde las neuronas sensoriales hacia las

neuronas de la ME y entre estas.

5. Caracterizar las rutas de conectividad entre ME y GE ipsi y

contralaterales.

6. Mediante el sistema in vitro obtener y purificar las neuronas de

diámetros mayores o iguales a 35 m para caracterizarμ

bioquímicamente los diferentes elementos que confieren a esta

subpoblación específica la susceptibilidad diferencial al VR.

12. Bibliografía

1. Acosta J. 2000. Situación actual de la rabia en Colombia. Inf Quinc Epidem Nac 5: 89-90.

2. Astic L. Saucier D. Coulon P. Lafay F. Flamand A. 1993. The CVS strain of rabies virus as transneuronal tracer in the olfatory system of mice. Brain Res. 619:146- 56.

3. Baer G. Cleary W. 1972. A model in mice for the pathogenesis and treatment of rabies. J Infect Dis. 125: 520- 527

4. Baer G. Shantahaveerappa T. Bourne G. 1968. The pathogenesis of fixed rabies virus in rats. Bull WHO. 33: 783- 790

5. Bustamante J. 2001. Neuroanatomía Funcional y Clínica. Colombia Celsius pg 916. Cameron A. Leah J. Snow P. 1986. The electrophysiological and morphological

characteristics of feline dorsal root ganglion cells. Brain Res. 362:1- 6. 7. Card J. 1998. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in

transneuronal studies of neural circuitry. Neuronsci. Biobehav Rev. 22: 685- 948. Castaneda- Castellanos D. Castellanos J. Hurtado H. 2002. Differential use of the

nicotinic receptor by rabies virus based upon substrate origin. J Neurovirol. 8:150- 4.9. Castellanos J. 2002. Modificación en la adsorción del virus de la rabia en cultivos de

ganglio sensorial tratados con neurotrofinas. Tesis de doctorado en ciencias químicas. Universidad Nacional de Colombia.

10. Castellanos J. Hurtado H. 1999. Viral infection studied in adult sensory neurons. In L. Haynes (Ed.). The Neuron in Tissue Culture. Chichester: Jonh Wiley & Sons Ltd.; P.289-93.

87

11. Castellanos J. Hurtado H. 2001. Receptores para virus de la rabia. Biomedica. 21: 389-401.

12. Charlton K. Casey G. 1979. Experimental rabies in skunks. Laboratory Investigation. 41: 36- 44

13. Coulon P. Dervin C. Kucera P. Lafay F. Prehaud C. Flamand A. 1989. Invasion of the periheral nervous systems of adult mice by the CVS strain of rabies virus and its avirulent derivate. J. Virol. 63: 3550- 54.

14. Coulon P. Ternaux J. Flamand A. Tuffereau C. 1998. An avirulent mutant of rabies virus is unable to infect motoneurons in vivo and in vitro. J. Virol. 72:273- 78.

15. Dean D. Evans W. McClure R. 1963. Pathogenesis of rabies. Bull WHO. 29: 803- 80916. Dyck P. 1993. Peripheral Neuropathy. W.B. Sauders Company vol 1 pg 23017. Eide A, Glover J, Kjaerulff Kiehn O. 1999. Characterization of commissural interneurons

in the lumbar region of the neonatal rat spinal cord. J Comp Neurol. 403;332- 4518. Eide A, Glover J. 1996. Development of an identified spinal commissural interneurons

population in an amniote: neurons of the avian hofmann nuclei. J Neurosci. 16;5749-61

19. Escobar E. 2004. La rabia transmitida por vampiros. Biomedica.24:231- 3620. Faber M, Pulmanausahakui R, Nagao K, Prosniak M, Rice A, Koprowski H, Schell M,

Dietzschold B. 2004. Identification of viral genomic elements responsible for rabies virus neuroinvasiveness. PNAS. 101; 16328- 32.

21. Finke S. Muller- Waldeck R. Conzelmann K. 2003. Rabies virus matrix protein regulates the balance of virus transcription and replication. J Gen Virol. 84: 1613- 21

22. Gelders J, Chopin S. 1977. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. Anat Rec 88: 45- 47

23. Grantyn A. Brandi A. Dubayle D. Graf W. Ugolini G. Hadjidimitrakis K. Moschovakis E. 2002. Density gradients of trans- synaptically labeled collicular neurons after injections of rabies virus in the lateral rectus muscle of the rhesus monkey. J. Comp. Neurol. 451: 346- 61

24. Guan W, Puthenveedu M, Condic M. 2003. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation J. Neurosci. 23:1781–1791

25. Guigoni C. Coulon P. 2002. Rabies virus is not cytolytic for rat spinal motoneurons in vitro. J. Neurovirol. 8; 306- 17

26. Guyton A. 1989. Anatomía y fisiología del sistema nervioso. Bogotá, Editorial Medica Panamericana, pg 233- 7

27. Harper A. Lawson S. 1985. Conduction Velocity is related to morphological cell type in rat dorsal root ganglion neurons. J. Physiol. 359:31- 46.

28. Haywood A. 1994. Virus receptors: binding. Adhesion strengthening and changes in viral structure. J. Virol. 68: 1- 5

29. Helms A, Johnson J. 2003. Specifications of dorsal spinal cord interneurons. Curr Opin Neurol. 13;42- 49

30. Hemachudha t. Laothmatas J. Rupprecht C. 2002. Human rabies: a disease of complex neuropathogenic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1: 101-109

31. Hernit- Grand C. MacKlis J. 1996. Embryonic neuron transplanted to regions of targeted photolytic cell death in adult mouse somatosensory cortex re- forms specific callosal projections. Exp Neurol. 139:131- 42.

32. Jackson A. 2003. Rabies Virus infection: An update. J. Neurovirol. 9:253- 5833. Jackson A. 1991. Biological basis of rabies virus neurovirulence in mice: comparative

pathogenesis study using the immunoperoxidase technique. J. Virol. 65: 537- 540. 34. Jackson A. 2002a. Update on rabies. Curr Opin Neurol. 15:327- 3135. Jackson A. 2002b. Rabies Pathogenesis J. Neurobiol.8:267- 9

88

36. Jenson B. Rabin E. Bentinck D. Melnick J. 1969. Rabies virus neuronitis. J. Virol. 3: 265-269.

37. Jogui S, Radotra D, Banerjee A. 2002. Rabies viral antigen in extracranial organs a postmortem study. Neurophat Apped Neurol 28:334- 38

38. Kelly R. Strick P. 2000. Rabies as a transneuronal trace of circuits in the central nervous system. J. Neurosci Methods. 103: 63- 71

39. Kobbert C. Apps R. Lanciego J. Mey J. Thanos S. 2000. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol 62: 327- 51.

40. Koltzenburg M, Wall P, McMahon S. 1999. Does the right side know what the left is doing? TINS. 22;122- 27

41. Kucera P, Dolivo M, Coulon P, Flamand A. 1985. Pathway of early propagation of virulen and avirulen rabies strain from the eye to the brain. J. Virol 55:158- 62

42. Lafay F, Caoulon P, Astic L, Saucer D, Riche D, Holley A, Flamand A. 1991. Spread of the CVS strain of rabies virus and of the avirulent mutant AvO1 along the olfatory pathways of the mouse after intranasal inoculation. Virol 183:320- 30

43. Lafon M. 2004.Subversive neuroinvasive strategy of rabies virus. Arch Virol. 18:149-59.

44. Lafon M. 2005. Rabies virus receptors. J NeuroVirol. 11;82- 745. Lawson N. Perry M, Prabhakar E. McCarthy W. 1993 Primary sensory neurons:

neurofilament, neuropeptides, and conduction velocity. Brain Res Bull 30: 239- 43.46. Lenzt T. Burrage T. Smith A. Crick J. Tignor G. 1982. Is the acetylcholine receptor a

rabies virus receptor? Science; 215:182- 184. 47. Lewis. P. Fu. Y. Lentz. T. 2000. Rabies virus entry at the neuromuscular junction in

nerve- muscle co- cultures. Muscle & Nerve. 23: 720- 73048. Loewy A. 1998. Viruses as transneuronal tracers for defining neural circuits. Neurosci.

Biobehav. Rew. 22: 679- 8449. Martínez M. 2003. Caracterizacion Inmunohistoquímica de subpoblaciones neuronales

que se infectan preferencialmente con el virus de la rabia en cultivos primarios de ganglio de la raíz dorsal. Tesis de maestría en Microbiología. Universidad Nacional de Colombia.

50. Martínez M. Castellanos J. 2005. Morphological and biochemical characterization of sensory neurons infected with rabies virus in vitro (sometido).

51. Martínez M. Quiroga N. Castellanos J. Hurtado H. 2000. Subpoblaciones neuronales presentes en el ganglio de la raíz dorsal. Biomédica 20: 248- 260.

52. Martínez M. Velandia M. Quiroga N. Castellanos J. 2002. Differential susceptibility in sensory cultured neurons to rabies virus infection. J Neurovirol. 8 (S1):109.

53. Mattos C. Mattos C. Rupprecht C. 2001. Rhabdoviruses Cap 39 pags 1245- 1277 en: Knipe DM. Howley PM. Willians L (eds). Fields Virology 4 edits. Philadelphia PA. USA

54. Mazarakis N, Azzouz M, Rohll J, EllardF, Wilkes F, Olsen A, Carter E, Barber R, Baban D, Kingsman S, Kingsman A, O”Malley K, Mitrophanous K. 2001. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vector enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum Mol. Gens. 10:2109- 21

55. Ministerio de Salud. 2000. El control de la rabia: Una prioridad de salud pública nacional. Inf Quinc Epidem Nac. 5: 33- 34

56. Ministerio de Salud. Resolución 008430 de 4 de octubre de 1993. Colombia. 13 pt.57. Montoya J. Ariza J. Sutachán J. Hurtado H. 2002. Relationship between functional

deficiencies and the contribution of myelin nerve fibers derived from L4- L5 and L6 spino- lumbar branches in adult rat sciatic nerve. Exp Neurol 173:266- 74

58. Morimoto K, Hooper D, Craig J, Carbaugh H. 1998. Rabies Quasiespecies: implications for pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 95: 3152- 56

59. Murphy F. Bauer S. Harrison A. Winn W. 1973. Comparative pathogenesis of rabies and rabies- like viruses: infection and transit from inoculation site to the central nervous system. Lab Invest. 28: 361- 368

89

60. Norgren Jr R. Lehman M. 1998. Herpes simplex as a transneuronal tracer. Neuronsci. Biobehav Rev. 22: 695- 708

61. Onifet S. White L. Whittemore S. Holets V. 1993. In vitro labeling strategies for identifying primary neural tissue and a neuronal cell line after transplantation in the central nervous system cell. Transplant 2:131- 49.

62. Páez A. Nuñez C. García C. Bóshell J. 2003. Molecular epidemiology of rabies epizootics in Colombia: evidence for human and dog rabies associated with bats. J. Gen Virol. 84:795- 802.

63. Peyronard J, Charron L, Lavoie J, Messier J. 1986. Motor, Sympathetic and sensory innervation of rat skeletal muscles. Brain Res. 373:288- 302

64. Ploubidou A. Way M. Viral transport and the cytoesqueleton. Curr Opin. Cell Biol. 2001; 13:97- 105

65. Popesko P, Rajtová V, Horak J. 1998. A colour atlas of the anatomy of small laboratory animals. Wolfe Publishing Ltd.

66. Principios éticos de la experimentación animal. International Council for Laboratory Animal Science. 1997. En: Biomédica. 17 (4): 325.

67. Prosniak M, Hooper D. C, Dietzschold B, Koprowski H. 2001. Effect of rabies virus infection on gene expression in mouse brain PNAS. 98: 2758–63

68. Puigdellívol- Sánchez A, Prats- Galino A, Ruano- Gil D, Molander C. 1998. Sciatic and femoral nerve sensory neurons occupy different regions of the dorsal root ganglion in the adult rat. Neurosci Lett. 251; 169- 72

69. Puigdellívol- Sánchez A, Valero- Cabré A, Prats- Galino A, Navarro X., Molander C. 2002. on the use of fast blue, fluorogold and diamidino yellow for retrograde tracing after peripheral nerve injury: uptake, fading, dye interactions, and toxicity. J Neurosci Methds. 115; 115- 27

70. Rambourg A. Clermont Y. Beaudet A. 1983. Ultraestructural feactures of six types of neurons in rat dorsal root ganglia. J. Neurocytol. 12:47- 66.

71. Roche S, Gaudin Y. 2004. Evidence that Rabies Virus Forms Different Kinds of Fusion Machines with Different pH Thresholds for Fusion. J. Virol 78: 8746- 52.

72. Rose J. Whitt M. 2001. Rhabdoviridae: the viruses and their replication Cap 38 pgs 1221- 1244 en: Knipe DM. Howley PM. Willians L (eds). Fields Virology 4 edits. Philadelphia PA. USA

73. Rupprecht C. Hanlon C. Hemachudha T. 2002. Rabies re- examined. The lancet infectious diseases 2:327- 343

74. Saad C. Rodríguez G. Revelo D. 2000. Parálisis flácida por rabia en una niña de 6 años. Inf Quinc Epidem Nac. 5: 81- 86

75. Schmued L. 1994. Anterograde and retrograde neuroanatomical tract tracing with fluorescent compounds. Neurosci Protocols. 50:1- 15

76. Schweighardt B. Atwood W. 2001. Virus receptors in the human central nervous system. J. Neurovirol. 7: 187- 195.

77. Scott S. 1992. Sensory Neurons. Diversity, Development, and plasticity. Oxford University Press.

78. Sakai M, Kankanamge P, Shoji J, Kawata S, Tochikura T, Kawai A. 2004. Studies on the conditions required for structural and functional maturation of rabies virus glycoprotein (G) in G cDNA- transfected cells. Microbiol. Immunol. 48:853- 64

79. Shankar V. Dietzschold B. Koprowski H. 1991. Direct entry of rabies virus into the central nervous system without prior local replication. J. Virol. 65:2736- 8.

80. Sodeik B. 2000. Mechanims of viral transport in the cytoplasm. Trends in microbiology. 8: 465- 72.

81. Sommer E. Kazimeierczak J. Droz B. 1986. Neuronal subpopulations in the dorsal root ganglion of the mouse as characterisd by combinations of ultrastructural and cytochemical features. Brain Res. 346:31026.

90

82. Superti F. Hauttecoeur B. Morelec M. Goldono P. Bizzini B. Tsiang H. 1986. Involvement of gangliosides in rabies virus infection. J Gen Virol. 67: 47- 56

83. Tang Y. Rampin O. Guiliano F. Ugolini G. 1999. Spinal and brain circuits to motoneurons of the bulbospongiosus muscle: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus. J. Comp. Neurol. 414:167- 92.

84. Thoulouze M. Lafage M. Schachner M. Hartmann U. Cremer H. Lafon M. 1998. The neural cell adhesion molecule is a receptor for rabies virus. J Virol. 72: 7181- 7190.

85. Tordo N. 1996. Characteristics and molecular biology of the rabies virus Cap 3 pgs 28-51 en: Meslin F. Kaplan M. Koprowski H Laboratory techniques in rabies 4 edit WHO Geneva.

86. Tsiang H. 1988. Rabies virus infection of myotubes and neurons as elements of the neuromuscular junction. Rev Infect Dis. 10:S733- 38

87. Tsiang H. Ceccaldi PE. Lycke E. 1991. Rabies virus infection and transport in human sensory dorsal root ganglia neurons. J Gen Virol. 72:1191- 4.

88. Tsiang H. Koulakoff A. Bizzini B. Berwald- Netter Y. 1983. Neurotropism of rabies virus an in vitro study. J Neuropathol Exp Neurol. 42: 439- 452.

89. Tsiang H. Lycke E. Ceccaldi P. Ermine A. Hirardot X. 1989. The anterograde transport of rabies virus in rat sensory dorsal root ganglia neurons. J Gen Virol. 70: 2075- 85.

90. Tuffereau C,Desmezieres E, Benejean J, Jallet C, Falmand A, Tordo N, Perrin P, 2001.Interaction of lyssaviruses with the low affinity nerve- groth factor receptor p75NTR. J Gen Virol. 82:2861- 67.

91. Tuffereau C. Benejean J. Blondel D. Kieffer B. Flamand A. 1998. Low- affinity nerve growth factor receptor (p75NTR) can serve as a receptor for rabies virus. EMBO J. 17:7250- 59

92. Ugolini G. 1995. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: transfer from hypoglossal motoneurons to connected second- order and higher order central nervous system cell groups. J. Comp. Neurol. 356: 457- 80

93. Utinico L, Rodríguez H, Velandia M, Martínez M, Castellanos J. inmunolocalización de marcadores bioquímicos y receptores virales en ganglio espinal in situ. XXXVII Congreso de la Asociación Colombiana de Ciencias Biológicas, Pasto 1- 4 de 2002, Pg 48

94. Velandia M. Montoya J. Martínez M. Perdomo S. Castellanos J. 2002. Comparación de tres técnicas de trazado retrogrado para la identificación del origen espinal del nervio ciático en ratón. Biomédica 22: 529- 34.

95. Vercelli A. Repici M. Garbossa D. Grimaldi A. 2000. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. BrainRes Bull 51: 11- 28.

96. Wagner R.1990 Rhabdoviridae and their replication. Cap 31 pgs 867- 879 en: Knipe DM. Howley PM. Willians L (eds). Fields Virology 2 edits. New York. USA

97. Watson H. Tignor G. Smith A. 1981. Entry of rabies virus into the peripheral nerves of mice. J. Gen. Virology. 56.371:382.

98. Willians P. Anatomía de Gray. 2001. Pag. 967. Elsevier Espala SA.99. Wouterlood F. Vinkenoog M. Van der Oever M. 2002. Tracing tools to resolve neuronal

circuits. Network Comput. Neural Syst. 13:327- 42100. Wu X. Gong X. Foley D Schnell J. Fu F. 2002. Both viral transcription and replication

are reduced when the rabies virus nucleoprotein is not phosphorylated. J. Virol. 76: 4153- 61

101. Wunner W. Larson J. Dietzschold B. Smith C. 1988. The molecular biology of rabies virus. Rev Infect Dis. 10: s771- s784.

91

Anexos

Anexo # 1:

Porcentaje de neuronas sensoriales infectadas en GE ipsilaterales y contralaterales de la región sacro- lumbar analizadas a 72, 96 y 120 horas post- inoculación. p <0.05 de acuerdo a la prueba de t- Student.

IPSILATERALES 72H 96H 120H p

S1 PROMEDIO 0,00 9,95 22,11 0.004

DESV EST. 0,00 11,92 7,90

EEM 0,00 4,21 2,79

L6 PROMEDIO 0,00 14,12 28,68 0.005

DESV EST. 0,00 3,38 4,95

EEM 0,00 1,20 1,75

L5 PROMEDIO 0,49 8,73 28,63 0.000

DESV EST. 0,34 1,81 5,97

EEM 0,12 0,64 2,11

L4 PROMEDIO 0,40 31,80 36,31 0.001

DESV EST. 0,67 4,04 15,87

EEM 0,24 1,43 5,61

L3 PROMEDIO 0,00 28,90 31,60 0.029

92

DESV EST. 0,00 9,26 6,53

EEM 0,00 3,27 2,31

L2 PROMEDIO 0,00 15,04 18,59 0.031

DESV EST. 0,00 12,40 5,61

EEM 0,00 4,38 1,98

L1 PROMEDIO 0,00 7,52 18,33 0.000

DESV EST. 0,00 2,60 7,91

EEM 0,00 0,92 2,80 CONTRALATERALES 72H 96H 120H p

S1 PROMEDIO 0.00 9,62 20,34 0.006

DESV EST. 0.00 6,34 9,44

EEM 0.00 2,24 3,34

L6 PROMEDIO 0.00 9,27 25,49 0.004

DESV EST. 0.00 2,78 4,24

EEM 0.00 0,98 1,50

L5 PROMEDIO 0.00 4,20 22,08 0.039

DESV EST. 0.00 2,82 2,92

EEM 0.00 1,00 1,03

L4 PROMEDIO 0.00 17,58 27,91 0.000

DESV EST. 0.00 13,85 1,65

EEM 0.00 4,90 0,58

L3 PROMEDIO 0.00 12,25 29,24 0.000

DESV EST. 0.00 9,58 6,80

EEM 0.00 3,62 2,40

L2 PROMEDIO 0.00 6,73 15,66 0.002

DESV EST. 0.00 6,53 5,72

EEM 0.00 2,31 2,02

L1 PROMEDIO 0.00 5,28 18,33 0.003

DESV EST. 0.00 2,31 3,52

EEM 0.00 0,82 1,24

93

Anexo # 2:

Valor de p de acuerdo al ANOVA y DMS obtenido al comparar los porcentajes de infección de neuronas sensoriales infectadas en GE ipsilaterales y contralaterales de la región sacro- lumbar analizadas a 96 y 120 horas post- inoculación p <0.05 de acuerdo a la prueba de t- Student.

GE Valor de pContralaterales 96H 120H

S1 vrs L3 0,0077 0,0055S1 vrs L4 0,0064 0,0118L6 vrs L2 0,0039 0,0019L6 vrs L3 0,3922 0,2386L6 vrs L4 0,3453 0,4071L6 vrs S1 0,0446 0,0627L5 vrs L1 0,0166 0,0066L5 vrs L2 0,0041 0,0208L5 vrs L3 0,3809 0,0296L5 vrs L4 0,3350 0,0606L5 vrs L6 0,9829 0,2580L5 vrs S1 0,0465 0,4171L3 vrs L4 0,9269 0,7134L2 vrs L3 0,0007 0,0002L2 vrs L4 0,0005 0,0003L2 vrs S1 0,2441 0,1009L1 vrs L2 0,8573 0,4160L1 vrs L3 0,0038 0,0001L1 vrs L4 0,0033 0,0002L1 vrs L6 0,0160 0,0008L1 vrs S1 0,3963 0,0288

GE Valor de pIpsilaterales 96H 120H

S1 vrs L3 0,0214 0,1792S1 vrs L4 0,0024 0,1276L6 vrs L2 0,9535 0,2072L6 vrs L3 0,0062 0,0771L6 vrs L4 0,0004 0,0471L6 vrs S1 0,8880 0,6459L5 vrs L1 0,6710 0,8113L5 vrs L2 0,1427 0,6116L5 vrs L3 0,0003 0,0041L5 vrs L4 0.0000 0,0017L5 vrs L6 0,1576 0,0946L5 vrs S1 0,1733 0,0473L3 vrs L4 0,1994 0,9354L2 vrs L3 0,0070 0,0078L2 vrs L4 0,0005 0,0034L2 vrs S1 0,9291 0,1032L1 vrs L2 0,0665 0,7790L1 vrs L3 0,0001 0,0047L1 vrs L4 0.0000 0,0019L1 vrs L6 0,0741 0,1296L1 vrs S1 0,0927 0,0631

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