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231HEMATOLOGÍA • Volumen 19 Nº 3: 231-245, 2015

Inmunotrombosis: implicancias de las trampas extracelulares de neutrófilos en el desarrollo y progresión de la enfermedad tromboembólica

venosa.

Immunothrombosis: implications of neutrophil extracellular traps in the development and progression

of venous thromboembolic disease.

Aranda F, Perés Wingeyer S y de Larrañaga G.

Laboratorio de Hemostasia y Trombosis,Hospital de Infecciosas Francisco Javier Muñiz. Buenos Aires, Argentina.

[email protected]

Fecha de recepción: 19/08/2015Fecha de aprobación: 27/10/2015

ARTÍCULODE REVISIÓN

Palabras clave: inmunotrombosis, trampasextracelularesdeneutrófilos, hemostasia, enfermedad tromboembólica venosa.

Keywords: immunothrombosis, neutrophil extracellular traps, haemostasis, venous thromboembolic disease.

ResumenDurante mucho tiempo se consideró que las pla-quetas estaban involucradas exclusivamente en el sistema hemostático y que los leucocitos sólo par-ticipaban de los mecanismos del sistema inmunoló-gico. Sin embargo, esta visión ha cambiado, recono-ciéndose que existe una profunda interrelación entre ambos sistemas, y que las plaquetas y los leucocitos son efectores centrales que cumplen roles hemostá-ticos e inmunológicos. Las procesos infecciosos constituyen un importante factor de riesgo trombótico. De hecho, se ha acuña-doeltérminoinmunotrombosis,definidocomounarespuesta inmune innata que implica la formación de un trombo en un vaso sanguíneo favoreciendo el confinamientoyladestruccióndemicroorganismospatógenos. En esta respuesta, están involucrados tanto factores inmunológicos como hemostáticos.Hace casi una década se describió que los neutró-filosdesplieganunmecanismoextracelularqueles

permite confinar y destruirmicroorganismos.Estenovedoso mecanismo consiste en la liberación de estructuras en forma de redes, denominadas trampas extracelulares de neutrófilos (NETs), compuestasporADN,histonasyotrasproteínasantimicrobia-nas, en respuesta a la presencia de microorganismos patógenos.Asimismo,lasNETsseformantambiénen respuesta a distintos estímulos inflamatorios,como ocurre en patologías como vasculitis de pe-queños vasos, pre-eclampsia y diferentes tipos de tumores.LasNETspodríanserunnexofundamen-talentreinflamaciónytrombosis,principalmentealestar involucradas en el andamiaje que brinda esta-bilidad a los trombos.DistintoscomponentesdelasNETstienenungranpotencial como biomarcadores trombóticos. Ade-más,elconocimientodelroldelasNETsenlafisio-patología trombótica ofrecería nuevas posibilidades para prevenir la trombosis y mejorar el tratamiento trombolítico.

HEMATOLOGÍAVolumen 19 nº 3: 231-245

Septiembre - Diciembre 2015

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ARTÍCULO DE REVISIÓN

IntroducciónDurantemuchosañoshemosidentificadoalaspla-quetas como células involucradas únicamente en funciones de la hemostasia y a los leucocitos como células exclusivas del sistema inmune. Sin embar-go, hoy la visión es mucho más amplia y tanto las plaquetas como los glóbulos blancos han sido reco-nocidos como efectores centrales que cumplen roles tanto en el sistema hemostático como en el sistema inmunológico. Durante un proceso séptico, las pla-quetasinteraccionanconlosneutrófilos,víatolllikereceptor-4 (TLR-4), activándolos y provocando eldespliegue de diferentes mecanismos de defensa para controlar la infección(1). Estos eventos ocurren principalmente en los sinusoides hepáticos y los ca-pilarespulmonares.Recientemente,sehademostra-do que las plaquetas poseen un rol colaborativo con las células de Kupffer hepáticas en la erradicación de infecciones sistémicas(2). Bacterias como Baci-llus cereus y Staphylococcus aureus meticilino re-sistentes son capturadas rápidamente por las células de Kupffer y activan plaquetas, que se adhieren de manera sostenida a dichas células, y, mediante esta

AbstractIt was long thought that platelets were exclusively involved in the haemostatic system and that leukocyteswereonlypartoftheimmuneresponse.However, this paradigm has been shifted, and it has been recognized that there is a cross-talkbetween these two systems, with both platelets and leukocytesaskeyeffectorsthathaveimmunologicaland haemostatic roles.Theinfectiousprocessesareamajorriskfactorforthrombosis. In fact, the term immunothrombosis has been coined, defined as an innate immuneresponse that involves the formation of a thrombus in a blood vessel and promotes the confinementand destruction of pathogenic microorganisms. In this response, both immunological and haemostatic factors are involved.Almost a decade ago, it was described that neutrophils display an extracellular mechanism that allows

them toconfineanddestroymicroorganisms.Thisnovelmechanisminvolves the releaseofnetwork-shaped structures, termed neutrophil extracellular traps(NETs),composedofDNA,histonesandotherproteins with antimicrobial activity, in response to the presence of pathogenic microorganisms. Furthermore,NETsarealsoformedinresponse todifferent inflammatory stimuli, as in pathologieslike small vessel vasculitis, pre-eclampsia anddifferent types of tumors. NETs could be a keylinkbetweeninflammationandthrombosis,mainlybeing involved in the scaffolding that gives stability to the thrombus.Different elements that are part of the NETsstructure have a great potential as thrombotic biomarkers. In addition, elucidating the role ofNETs in the thrombotic pathophysiology mightoffer new possibilities for preventing thrombosis and improving thrombolytic therapy.

acción coordinada, logran encerrar a las bacterias y eliminarlas. Este novedoso mecanismo representa un sistema de vigilancia mediante el cual las pla-quetas interaccionan con leucocitos e intervienen activamente en la respuesta inmune. En la presente revisión, abordaremos el tema de los neutrófilosysuconexiónconeldesarrolloylapro-gresión de la trombosis venosa.

Enfermedad tromboembólica venosaLaenfermedadtromboembólicavenosa(ETV),queincluyetantoalatrombosisvenosaprofunda(TVP)como a su complicación asociada, el tromboembo-lismopulmonar(TEP),eslapatologíacardiovascu-lar más común después del infarto de miocardio y el accidente cerebrovascular isquémico(3). La ETV es una patología multifactorial y, epide-miológicamente, está asociada a distintos factores de riesgo. A su vez, cada factor de riesgo puede estar asociado a uno o más mecanismos de acción involucrados en la formación del trombo. Entre los factoresderiesgoasociadosaETVmásimportan-tesseencuentrandiversaspatologías inflamatorias


TRAMPAS EXTRACELULARES DE NEUTRÓFILOS EN INMUNOTROMBOSIS

tales como infecciones, enfermedades autoinmunes, obesidad y cáncer, inmovilizaciones prolongadas, embarazos y tratamientos con quimioterapia, entre otros(4-6).

Fisiopatología de la ETVLos trombos venosos son estructuras que consisten de sucesivas capas de fibrina, plaquetas, glóbulosrojos y leucocitos. Las plaquetas cumplirían un rol mecánico sosteniendo la formación del trombo y es por esto que la trombosis venosa depende fuer-temente de su adhesión, activación y agregación(7). De todasmaneras, la estabilidad final del tromborequieredelestablecimientodeunfirmeandamiajeestructural provisto por polímeros de gran tamaño, entreloscualesseencuentranlafibrinayelfactordevonWillebrand(FvW)(8-9).La formación de un trombo venoso puede desenca-denarseapartirdealteracionesenelflujosanguíneo,la activación o fallas en el funcionamiento normal del endotelio vascular o por un estado de hipercoa-gulabilidad de la sangre(4). Sin embargo, a diferen-cia de lo que ocurre con la trombosis arterial, que generalmente es el resultado de la erosión o ruptura de una placa aterosclerótica, los mecanismos del de-sarrollo de la trombosis venosa en vasos sanguíneos intactos aún no son comprendidos completamente. El desarrollo de los trombos venosos suele comen-zar en los senos de las válvulas venosas donde, de-bidoacomplejosmecanismospropiosdelosfluidosque se dan particularmente en la cavidad de dichas válvulas, el patrón de flujo sanguíneo se vuelveanormal y provoca alteraciones en el funcionamien-to endotelial(10).Elestancamientodelflujo sanguí-neo(estasis)enlaseccióndelosvasossanguíneostendría similares efectos. La estasis de la sangre provoca una baja en la tensión de oxígeno que trae aparejada la activación local del endotelio(11). Al ac-tivarse, las células endoteliales liberan FvW desde loscuerposdeWeibel-Palade,yelFvWactúacomomediador en el reclutamiento de plaquetas. A su vez, tanto el endotelio activado como las plaquetas re-clutadas y activadas aumentan la expresión de gli-coproteínaP-selectinaensusmembranas,lacualesresponsabledelreclutamientoinicialdeneutrófilosy otras células de la inmunidad innata que también están involucradas en el desarrollo y la propagación del trombo(12-13).Porúltimo,elotrofactorquetieneun rolpreponderante en lapatogénesisde laETV

es la hipercoagulabilidad de la sangre. Ésta depen-de fundamentalmente de las concentraciones indi-viduales y el funcionamiento tanto de las proteínas pro-coagulantes como de las anti-coagulantes, y de la concentración y la naturaleza de las micropar-tículas (MPs) que contienen factor tisular (FT), lamolécula encargada de iniciar la vía extrínseca de coagulación y que es considerada como la principal involucrada en el desencadenamiento de la coagu-laciónenETV(14-15). Una compleja interacción entre estos distintos factores lleva a la activación tanto de la vía intrínseca como extrínseca de la coagulación y, en consecuencia, a la formación defibrina y alconsiguiente establecimiento de un trombo intravas-cular(5,15-16).Básicamente, la evolución del trombo procede ge-neralmente a través de tres etapas(17). En una prime-ra fase, el trombo se encuentra desorganizado. Si se formabajocondicionesdeflujocontinuodesangre,se van alternando capas de plaquetas y glóbulos ro-jos en forma de láminas, mientras que si se forma en condiciones estáticas adopta un aspecto más unifor-me. Luego de unos días, el trombo comienza a or-ganizarse y, en esta etapa, son reclutadas las células inflamatoriasqueseinfiltranenlosbordesdedichotrombo. Luego de semanas, se puede observar la etapa del trombo organizado, en la cual este trombo poseeunaaparienciafibrosaordenadayconescasainfiltracióninflamatoria.Muchosfactoresafectanlagradualización de este proceso e, incluso, un trombo a menudo puede mostrar varias etapas de desarrollo al mismo tiempo.

ETV asociada a procesos inflamatorios. El rol de los neutrófilos.Talcomohemosmencionado, laspatologías infla-matorias son un factor de riesgo importante para eldesarrollodeETV.Laformacióndelostrombospuedeserfuertementeintensificadaporlainflama-ción y el daño endotelial(18).Unarespuestainflama-toria aguda, debido a una infección o a un trauma, puede resultar en la activación sistémica de la coa-gulación mediante diferentes mecanismos, en los cuales las células del endotelio vascular cumplen un rol central promoviendo el reclutamiento de pla-quetas,neutrófilosyotrosleucocitos,yparticipan-do directamente en la iniciación, la regulación de la formaciónyenlaposteriorremocióndefibrina(19-20). Uno de los principales componentes celulares invo-



lucradosenlosprocesosinflamatoriossonlosneu-trófilos.Losneutrófilossonlosmiembrosmásabun-dantes de la población de leucocitos, comprenden entre50y70%delamismaenindividuossanos,y constituyen la primera línea de defensa frente a la invasión de microorganismos patógenos, ya que son los primeros leucocitos reclutados a los sitios de infección(21-22). Amulic y colaboradores han descripto su tarea de una manera muy elegante: en el torrente sanguíneo, los neutrófilos actúan comomonitores de la posi-ble presencia de señales de peligro para el hospe-dador, patrullando de manera continua los vasos sanguíneos, buscando atentamente indicios de una incipienterespuestainflamatoriay,encasodedetec-tarla, desarrollando rápidamente un proceso bien or-questado que les permita localizar, atacar y destruir la potencial amenaza(23). Este proceso en el cual los neutrófilos integran elcomplejo bombardeo de estímulos y los traducen en acciones concretas, se denomina activación de los neutrófilos.

Trampas extracelulares de neutrófilos Hasta hace algunos años, se consideraba que los neutrófilosempleabandosmecanismosparaconte-ner y eliminar los microorganismos invasores: la fa-gocitosis y la degranulación(24). Esta última implica la liberación de un arsenal de enzimas, péptidos an-timicrobianos y otras moléculas hacia el espacio ex-tracelular, entre las que se encuentran proteasas que degradan factores de virulencia y toxinas, lisozima que degrada la pared celular bacteriana, péptidos que aumentan la permeabilidad de las membranas de diversos microorganismos y catelicidinas y defensi-nas que pueden matar bacterias en forma directa(25). Sin embargo, recientemente han surgido evidencias indiscutibles en las cuales se demuestra que los neu-trófilos pueden eliminar patógenos mediante otromecanismo de manera extracelular(26). Este nove-doso mecanismo consiste en la liberación por parte delosneutrófilosactivadosdeestructurasenformaderedes,denominadasNETs(delinglésneutrophilextracellulartraps),compuestasporADN,histonasy otras proteínas con actividad antimicrobiana(26-28). .

Figura 1. Mecanismos de defensa mediados por neutrófilos. Esquema representativo de los distintos mecanismos empleados por los neutrófilos para la contención y/o eliminación de los agentes patógenos. Adaptado de Shock 2014, Camicia G., Pozner R. y de Larrañaga G.

EstasNETstienenlacapacidaddepegar,desarmary matar patógenos de manera extracelular, y se cree que lo harían al exponerlos a altas concentraciones locales de antimicrobianos(26,28-30).LasNETstienenla capacidad de atrapar todo tipo de microorganis-mos, incluyendo bacterias Gram positivas, Gram

negativas, hongos y protozoos(27,29,31-35). Ademásdesufunciónmicrobicida,lasNETscum-pliríanunrolvitalalconfinaralospatógenosenelsitio de infección, actuando como una barrera física que previene su diseminación(36). Estructuralmente, lasNETssonfibras,semejantesaunateladearaña



(Figura 2),queestánconstituidasporADNconin-crustaciones de péptidos y enzimas antimicrobianas

comoelastasa,catepsinaG,mieloperoxidasa,histo-nas,proteinasa3,gelatinasa,LL-37,lactoferrina,ycalprotectina(30).

Figura 2. Neutrófilos y trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). Imagen de microscopia electrónica cedida por Volker Brinkmann y Arturo Zychlinsky. Max Planck Institute for Infection Biology, Alemania.

Hasta el momento no se ha esclarecido totalmente si cada patógeno activa selectivamente alguno de estos mecanismosdedefensa,ocómodecideelneutrófilocuáldeellosdebeemplear.Noobstante,teniendoencuenta que, in vitro, la fagocitosis y la degranulación son procesos rápidos, mientras que la formación de NETsesunprocesomáslento,sehasugeridoquela secuencia temporal de estos mecanismos sería: fagocitosis,degranulacióny,finalmente,formacióndeNETs(30).Recientemente se presentaron eviden-ciasquepermiten afirmarque losneutrófilos libe-ranselectivamenteNETsenrespuestaapatógenosde gran tamaño, cuando los mismos son demasiado grandes para ser fagocitados(37). Esta capacidad, ade-más, es crítica para evitar el daño tisular excesivo

durante la respuesta a la infección. Asimismo, se ha demostradoquelasNETsnosonliberadasexclusi-vamente en respuesta a microorganismos, sino que también pueden ser formadas frente a una infección viraleinclusoensituacionesdeinflamaciónestérilcomo, por ejemplo, en vasculitis de pequeños vasos, pre-eclampsia y diferentes tipos de tumores(38-43).LaNETosiseselprocesoporelcuallosneutrófiloscambian su morfología adquiriendo una forma apla-nada, emiten numerosas protrusiones de membrana y liberan fibras deADN decoradas con proteínashacia el medio extracelular(31). Este proceso involu-cra la decondensación de la cromatina, el reordena-miento de la arquitectura nuclear y granular, segui-do de la mezcla de la cromatina con el contenido



antimicrobiano de los gránulos en el citoplasma y, finalmente,laliberaciónhaciaelespacioextracelu-lar de proteínas granulares y otros péptidos antimi-

crobianos anclados a la cromatina, tras la ruptura de la membrana celular(31,44-48)(Figura 3).Sibienestemecanismode“NETosissuicida”esel

Figura 3. Formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). Esquema representativo del modelo de for-mación de NETs por NETosis. La activación del neutrófilo por contacto con microorganismos patógenos o diferentes estímulos inflamatorios conduce a la desintegración de la membrana nuclear y de las membranas granulares, decon-densación de la cromatina, y mezcla del contenido nuclear con proteínas granulares y citoplasmáticas. Posteriormen-te, el neutrófilo se contrae y expulsa la NET. Este proceso es relativamente lento y demanda entre 2 a 3 horas para completarse. Adaptado de J Mol Med 2009, von Köckritz-Blickwede y Nizet.

más ampliamente aceptado, también se ha demos-tradoquelasNETspuedenserliberadassininducirla propia muerte celular, mediante un mecanismo que ha sido denominado “NETosis vital”, conser-vando las funciones vitales y el arsenal de armas convencionales de defensa del neutrófilo(49-50). Porejemplo, mediante microscopía electrónica se pudo demostrar que Staphylococcus aureus induce una rá-pidaliberacióndeNETsatravésdelageneracióndepequeñas evaginaciones esféricas surgidas a partir de la membrana nuclear que son exportadas median-te vesículas, preservando de esta forma la integridad de la membrana plasmática(50-51). Sin embargo, pese a que el conjunto de instruccio-nesdelosneutrófilosessimpleyefectivoes,asu

vez, potencialmente perjudicial. La función primor-dialdelosneutrófilosesexterminaralosmicrobiospatógenos sin dañar al hospedador pero, ante la duda, la prioridad es cumplir con el primer objeti-vo, más allá de los daños colaterales que se puedan producir(23). El arsenal de armas antimicrobianas de lasquedisponenlosneutrófilos,entrelascualeses-tánincluidaslasNETsysusdistintoscomponentes,puede ser tan peligroso para las células del hospe-dador como lo son para los microbios invasores, ya que permiten atrapar y matar microorganismos pero lo hacen bajo el riesgo de provocar daño, tanto en el endotelio, si las despliegan a nivel vascular, como en los tejidos hacia los cuales extravasan(1,52-55).



NETs y TrombosisLas infecciones, tal como lo hemos descripto pre-viamente, constituyen un importante factor de ries-go trombótico. De hecho, Engelman y Massberg acuñaron el término inmunotrombosis,definiéndo-lo como una respuesta inmune innata que implica la formación de un trombo a nivel de los vasos san-guíneos y favorece el confinamiento, el reconoci-miento y la destrucción de los microorganismos pa-tógenos(56). Considerando que la activación endote-lial es uno de los principales inductores del proceso trombótico,quelasNETstambiénseformanenlavasculatura y no sólo a nivel tisular, que muchas de las enzimas y péptidos antimicrobianos que forman partedelasNETspuedenprovocareldañoylacon-secuente activación del endotelio, que la estabilidad de los trombos requiere de un andamiaje provisto porgrandespolímeroscomolafibrinayelFvWyque se observó formación y persistencia deNETsenpatologías inflamatoriasno infecciosas, resulta-ríalógicopensarquelasNETspodríanserunnexofundamental entre la inflamación y la trombosis. Así, bajo esta hipótesis, Fuchs y colaboradores de-mostraron por primera vez en el año 2010, mediante ensayoselegantesybienorganizados,quelasNETsaportarían no sólo un andamiaje estructural sino también estímulos que permiten la activación, el pe-gado y la agregación de plaquetas, la adhesión de glóbulos rojos y de proteínas plasmáticas relevan-tes en la estabilidad del trombo, tales como FvW, fibronectina y fibrinógeno(57). Estas moléculas se pegaríanalasNETsprobablementedebidoasuafi-nidadporlashistonasoelADN(58-60). La activación plaquetaria mediada por las NETs podría debersea la acción de las histonas o de proteasas que for-man parte de estas estructuras. Se vio que, in vitro, lashistonaspurificadasestimulanelinflujodecal-cio hacia las plaquetas promoviendo su activación y su agregación(61-62). Además, las enzimas elastasa ycatepsinaG,queseencuentranenzimáticamenteactivasdentrode laestructurade lasNETs, tienenla capacidad de potenciar la agregación plaquetaria activando receptores de las plaquetas a través de su proteólisis(63-64). Fuchs y colaboradores fueron pioneros en mos-trar evidencias claras de que marcadores propios deNETs,comoADNextracelular,histona(H)3ycomplejosADN/H2A/H2B,estabanpresentestantoen plasma como en el interior de los trombos en un

modelodeTVPenbabuinos,locualfueconfirmadoposteriormente en un modelo murino(57,65). Además, demostraron que la H3 no sólo estaba presente en forma abundante en los trombos sino que también se encontraba citrulinada. La citrulinación es una modificaciónpost-traduccional(conversióndeargi-ninaencitrulina,unaminoácidonoconvencional)mediada por la enzima peptidilarginina deiminasa 4(PAD4),unaenzimaaltamenteexpresadaengra-nulocitos(66-67).Al ocurrir estamodificación, se re-duce la carga positiva de las histonas permitiendo la decondensación de la cromatina, la cual es fun-damentalparalaformacióndelasNETs(46)(Figura 3).De hecho, los neutrófilos de ratones knockoutparaelgendePAD4sonincapacesdeformarNETs,mientras que la sobreexpresión de esta enzima es estímulo suficiente para la decondensación y for-macióndeNETsaúnencélulasquenormalmenteno las producen(48,68).Por lotanto, ladeteccióndela presencia de H3 citrulinada en trombos en mo-delosmurinosdeTVP indicaríaqueprovienendeneutrófilosque formaronNETs.Posteriormentesevio que la incapacidad de formarNETs por partederatonesdeficientesenelgendePAD4resultóserprotectoraenelmismomodelodeTVP(69). Allí se observó que, pese a que las plaquetas y los leucoci-tos se acumulaban a lo largo del endotelio activado, se formaba una cantidad mucho menor de trombos, loscualesteníanneutrófilospresentesensuinteriorpero la estabilidad de estos trombos no se sostenía en el tiempo. Tantopreviacomoparalelamentealestablecimien-todelaconexiónentrelasNETsylosprocesosquellevan a la formación de un trombo, también fue evaluada la capacidad de afectar de manera indivi-dual los mecanismos de coagulación por parte de los ácidos nucleicos y de algunos componentes nu-cleares. Las moléculas polianiónicas, incluyendo al ADN,alARNylospolifosfatos,sonactivadorasdela coagulación, promoviendo la activación de pro-teasas de la vía intrínseca, tal como los factores XII y XI (70-71). Las histonas, por su parte, también po-seen efectos protrombóticos. La H4 provoca la au-toactivación de la protrombina, independientemente de la cascada de coagulación, y también estimula la exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática de los glóbulos rojos, lo que acelera la formacióndefibrina(72-73). A su vez, las histonas in-crementan la generación de trombina a través de un



mecanismo que depende de las plaquetas, contribu-yendo a la activación y la agregación plaquetaria y, adicionalmente, poseen la capacidad de inhibir me-canismos anticoagulantes al impedir la activación de la proteína C mediada por trombomodulina(62,74-75). Incluso Xu y colaboradores demostraron, utilizando un modelo murino de sepsis, que la infusión de his-tonas promueve la formación de microtrombos en pulmón(61). Por su parte, también se demostró quelaenzimaelastasadeneutrófilosposeepropiedadespro-coagulantes, al inactivar proteolíticamente al inhibidor del factor tisular e intensificar la accióndel factor X activado. Más aún, distintos trabajos mostraron que las plaquetas activadas son capaces de estimular la liberacióndeNETs, resultandoasíen una especie de círculo vicioso de formación de NETsyactivacióndeplaquetas,evidenciandoaúnmás la compleja interacción que existe entre los dis-tintos actores involucrados en el proceso trombóti-co(1,12,76).La tendencia a desarrollar trombosis es un rasgo característico asociado a pacientes que presentan diferentes tipos de tumores y el estado de hipercoa-gulabilidad en el que se encuentran puede deberse a múltiples factores, que van desde las propias propie-dades procoagulantes de las células tumorales has-ta los efectos de cirugías, del uso de catéteres y de los agentes quimioterapéuticos(77).Porsuparte,losneutrófiloscumplenunpapelcentralenlabiologíatumoralyconstituyenunagranproporcióndelinfil-tradoinflamatorio,tantoentumoreshumanoscomoen modelos murinos de cáncer(78-79). Sus propiedades pro o anti-tumorales son un continuo tema de deba-te pero, en estudios recientes, ha sido demostrado queel fenotipode losneutrófilosdifieresegún lasdistintas etapas de progresión tumoral, volviéndose más protumoral a medida que el tumor lleva más tiempo de desarrollo(80). Aumentos en el recuento de neutrófilos periféricos y/o intratumorales han sidoasociados a peores prognosis y desenlace en dife-rentes tipos de cáncer, mucho de ellos asociados a un elevado riesgo de trombosis venosa(81-82). En un modelo murino de carcinoma mamario, se observó trombosis pulmonar en una etapa tardía de progresión tumoral, coincidente con recuento de neutrófilos y niveles plasmáticos deADN ex-tremadamente altos y, simultáneamente al desarro-llo de trombosis, se registró hipercitrulinación de H3 en plasma(83). Incluso, en otro modelo murino

de cáncer pancreático y trombosis, se observó que, enelinteriordelostrombos,habíaMPsprocoagu-lantes derivadas de células tumorales adheridas a lasNETs(84). Asimismo, los niveles plasmáticos de ADN se encuentran frecuentemente elevados enpacientes con cáncer, siendo estos niveles mayores en etapas avanzadas de la progresión tumoral, de la misma manera que se ha visto que hay incrementos enlosnivelesdeADNplasmáticoynuclesosomasasociados al tratamiento con quimioterapia(85-87). Es-tos resultados, obtenidos en trombosis venosas aso-ciadas a distintos tipos de tumores, indicarían que loscomponentesde lasNETsestaríanfuertementeinvolucrados en el desarrollo y el mantenimiento de la estructura del trombo. Endefinitiva,lapresenciadeNETsenlostrombosvenosos es indudable pero, de todas maneras, el rol que cumplen dentro su estructura y la importan-ciaquetienenensufisiopatologíaaúnnohansidocompletamente esclarecidos(88). Un estudio reciente evaluó la composición de tromboembolismos ve-nosos humanos y los resultados revelaron que se produceacumulacióndeNETsdurante laetapadeorganizacióndeltromboyqueestasNETsestaríaníntimamente asociadas con plaquetas unidas a FvW, respaldandolaideadequelasNETsparticipanac-tivamente en la maduración de los trombos y son parte de la estructura que les brinda estabilidad(89). (Figura 4).

NETs y trombolisis.Posible impacto a nivel diagnóstico.Parapoderrestaurarelflujosanguíneo,esindispen-sable que el trombo sea degradado y solubilizado. LafibrinayelFvW,losprincipalescomponentesdelandamiaje estructural del trombo, son fragmentados proteolíticamente por acción de las proteasas plas-minayADAMTS-13, respectivamente.LasNETs,siendo un tercer componente de esta estructura, tam-bién deben ser desarmadas durante la trombolisis. Dehecho,sehademostradoqueelADNseunealosproductosdedegradacióndelafibrinamanteniendofirmementeunidaatodalareddefibrina,porloquees indispensable su remoción(90-91). La cromatina que formaparte de lasNETs se en-cuentra en un estado de alta decondensación, vol-viéndoseasímuyaccesibleparalasADNasashuma-nas,enzimasquedegradanADN.MedianteensayosinvitrosedemostróquelaaccióndelasADNasas



plasmáticas es fundamental para la completa de-gradación de los coágulos sanguíneos siendo estos resultados respaldados posteriormente por estudios

que analizaron las cinéticas de la degradación de los tres componentes estructurales de los trombos(26,28,57,92-93).

Figura 4. Trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) en el proceso trombótico.Las celulas endoteliales activadas poseen una expresión aumentada de ciertas proteínas, tales como p-selectina y factor de Von Willebrand (FvW). La p-selectina permite el anclaje de los neutrófilos al endotelio activado y el FvW facilita la adhesión de las plaquetas activadas mediante su interacción con la glicoproteína Ib. Los neutrófilos, en respuesta a diversos estímulos inflamatorios, liberan NETs. Las NETs proveen un andamiaje estructural al trombo en formación facilitando una mayor adhesión de plaquetas activadas, glóbulos rojos y de proteínas involucradas en la estabilidad del trombo, como el mismo FvW y la fibrina, debido a su afinidad por las histonas o el ADN. A su vez, las NETs estimulan la activación plaquetaria, promoviendo una mayor adhesión y agregación de plaquetas, pro-bablemente mediante la acción de las histonas y de proteasas, como la elastasa, componente fundamental de estas estructuras.

EnunmodelodeTVPenbabuinos,sevioquelosniveles plasmáticos deADN aumentaban con unacinética similar a los del dímero D, producto de degradación de la fibrina(57, 93). En pacientes con TVP,nosóloseencontróque losnivelesdeADNen plasma eran mayores respecto de controles sanos ydepacientessintomáticosquenoteníanTVP,sinoquedichosnivelesdeADNcorrelacionabanpositi-vamente con los niveles de FvW y negativamente

con los niveles deADAMTS-13 (92). Por lo tanto,esprobablequelosnivelesdeADNencirculaciónpuedan reflejar la degradación deNETs dentro deun trombo. Asimismo, los niveles de nucleosomas en circulación y de ciertos marcadores de activación deneutrófilostambiénseencuentranaumentadosenpacientesconTVPrespectodepacientessintomáti-cosperosinconfirmación(92-94). En consecuencia, tanto los distintos productos de



degradacióndelasNETsasícomolosmarcadoresde activación de neutrófilos podrían considerarsecomo potenciales biomarcadores para ser utilizados eneldiagnósticodeTVP,considerandoqueactual-mente el ultrasonido es el mejor método diagnóstico peronosiempreesconfiable(88,95).

Posible impacto terapéuticoAdemás de la potencial aplicación como biomarca-dores, a nivel diagnóstico, que podrían tener algu-nos de los distintos elementos que forman parte de lasNETs,conocerenprofundidadelroldelasNETsen la fisiopatología trombótica y los mecanismospor los cuales se generan en la vasculatura, ofrece-ría nuevas posibilidades para prevenir la trombosis y mejorar el tratamiento trombolítico. El agente an-titrombótico ideal es aquél que es capaz de prevenir la formación patológica de trombos teniendo el me-nor impacto posible sobre la hemostasia, por lo que los neutrófilos resultarían ser blancos terapéuticosideales(88). Una alternativa que está siendo fuertemente estu-diada es la terapia dirigida contra la P-selectina. La inhibición de P-selectina resultó ser protectora enmodelosanimalesdeTVP,reduciendosignificativa-menteelreclutamientodeneutrófilos,lageneracióndeNETsylaactividadprocoagulantedelapropiaP-selectina(12,93,96). De hecho, en un estudio reciente seobservóquela inhibicióndeP-selectinamostrómejores efectos terapéuticos y profilácticos que laenoxaparina y que un inhibidor de FvW, en un mo-delodeTVPenbabuinos(97).El uso de tratamientos específicos dirigidos haciacomponentesestructuralesdelasNETs,comoAD-Nasas, anticuerpos anti-histonas o heparina no anticoagulante, son estrategias atractivas para la prevención de la trombosis y del posible daño or-gánico si lasNETs se convierten en un problemadebidos sus efectos deletéreos colaterales(61,88,98). En algunosestudiosconmodelosanimalesdeTVP,laadministracióndeADNasaImostróefectosprotec-tores; sin embargo, en un estudio reciente, se obser-vóqueeltratamientoconADNasaprovocaunama-yor generación de trombina que, probablemente, se deba a la liberación masiva de algunos componentes delasNETsquepuedenresultarperjudicialesparael hospedador provocando daño endotelial(12,65,99). A su vez, teniendo en cuenta el rol de las redes en la contención de las infecciones, una terapia con AD-

NasaparadisminuirlasNETspodríagenerarcomoefectocolateralunaerradicación ineficientede losmicroorganismos patógenos(100). La heparina, además de ser un agente anticoagulan-te, desmantela las redesdeADNdeNETsy evitalas interacciones entre histonas y plaquetas, por lo tanto es probable que su uso resulte en una dismi-nucióndelatrombosismediadaporlasNETs(98). La actividaddeADNasa I es exacerbada, invitro, enpresencia de serino-proteasas, y esto puede ser imi-tado por la heparina, ya que desplaza a las histonas de la cromatina permitiendo una mejor accesibilidad paralaenzimaADNasaI(88). Es por ello que la com-binacióndeADNasaIconheparinapodríareduciraún más el riesgo de eventos trombóticos y prevenir significativamenteeldañocausadoporlashistonas.Sin embargo, el uso de heparina podría, al mismo tiempo, aumentar el riesgo de hemorragia. Debido a esto, un trabajo muy reciente se focalizó en ob-tenerunaheparinaquepresentelosefectosbenefi-ciosossobreelcontroldelasNETsperoreduciendoel riesgo de sangrado. De esta manera, Wildhagen y colaboradores, mediante un elegante abordaje experimental, lograronpurificarunafracciónde laheparina sin función anticoagulante que, in vitro, puede prevenir la citotoxicidad mediada por histo-nasyreducirlamortalidaddelainflamaciónestérily sepsis en modelos de ratón, sin aumentar el riesgo de sangrado(98). Sin embargo, como hemos mencio-nado,estasestrategiasbasadasendesmantelarNETsya formadas podrían tener efectos colaterales no de-seados.Porestemotivo,unaestrategiaqueaúnnoha sido explorada en profundidad pero que se viene proponiendo extensamente como alternativa es li-mitar laformacióndeNETsutilizandoinhibidoresdePAD-4(88,90).

Perspectivas a futuro. Aún quedan muchos interrogantes por responder y se deben realizar muchas investigaciones para po-der hacerlo. Seguramente, a lo largo de los próximos años, veremos crecer los conocimientos acerca de losmecanismosdelaformacióndeNETsysuim-plicanciaenlafisiopatologíadelatrombosis.Deloque seguro ya no quedan dudas es que los glóbulos blancos han dejado de pertenecer solamente al cam-po de la inmunología para ser un elemento funda-mentaldeladefinicióndeINMUNOTROMBOSIS.



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