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UNIVERSIDAD

UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE MEDICINA

IDENTIFICACIÓN DE GENES RESPONSABLES DE

RESISTENCIA A CARBAPENÉMICOS EN CEPAS

NOSOCOMIALES DE Pseudomonas aeruginosa

AISLADAS EN ALGUNOS HOSPITALES DE MÉXICO

Tesis para obtener el grado de

Maestro en Ciencia Médicas:

Fabián Rojas Larios.

Asesores:

D en C. Oscar A. Newton Sánchez.

Facultad de Medicina

Universidad de Colima

M en C. Gerardo Martínez Aguilar.

Unidad Biomédicas del Instituto Mexicano del Seguro Social, Durango,

Durango.

Colima, Col. febrero de 2009

ÍNDICE

Página

Resumen 1

Sumario 2

Introducción 3

Antecedentes 6

Infecciones nosocomiales 6

Pseudomonas aeruginosa 8

Antibióticos β-lactámicos 10

β-lactamasas 11

Metalo- β-lactamasas (MBLs) 13

Identificación del fenotipo a metalo-β-lactamasas 18

Justificación 21

Pregunta de investigación 22

Objetivo general 22

Objetivos específicos 22

Material y Métodos 23

Periodo de estudio 23

Tipo de estudio 23

Universo de estudio 23

Tamaño de la muestra 23

Criterios de selección 24

Variables 25

Identificación de Pseudomonas aeruginosa 25

Prueba de susceptibilidad a carbapenémicos 26

Identificación fenotipo a metalo-β-lactamasas 26

Extracción del DNA bacteriano 27

Identificación del os genes MBLs a través de la

reacción de la cadena de polimerasa (PCR)

27

Análisis estadístico 30

Aspectos éticos 30

Resultados 31

Discusión 39

Conclusiones 44

Perspectivas 44

Glosario 45

Anexos 47

Anexo 1: Tinción de gram 48

Anexo 2: Pruebas bioquímicas 49

Anexo 3: Susceptibilidad a diversos antibióticos 52

Anexo 4: Determinación de fenotípica de metalo-β-

lactamasas

53

Anexo 5: Extracción de DNA 55

Anexo 6: Identificación de genes MBLs 57

Bibliografía 59

Agradecimientos 67

ÌNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Identificación fenotípica de MBLs 20

Figura 2. Plan de trabajo 29

Figura 3. Cepas de P. aeruginosa aislada por servicio hospitalario 31

Figura 4. Interpretación fenotípica de metalo-β-lactamasas a través de la

técnica de doble disco

32

Figura 5. interpretación feotípica de metalo-β-lactamasas a través de la

técnica de E-test

33

Figura 6. Identificación de gen IMP-1 e IMP-2 en muestras procedentes de

los hospitales de Colima, Guadalajara y Durango.

34

Figura 7. Identificación de gen VIM-1 y VIM-2 en muestras procedentes de

los hospitales de Colima, Guadalajara y Durango

34

Figura 8. Comparación de la frecuencia de cepas multiresistentes entre los

diferentes hospitales participantes

38

Figura 9. P. aeruginosa con presencia de MBLs por medio de técnica de

triple disco

53

Figura 10. Estructura de la tira E-test 53

Figura 11. Método de interpretación de E-test 54

Figura 12. Componentes del kit Ultra Clean para extracción de DNA en

bacterias

55

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1. Comparación de los diferentes métodos para la identificación

fenotípica de MBLs

19

Tabla 2. Indicadores para la identificación de MBLs en cepas de

Pseudomonas aeruginosa

28

Tabla 3. Patrones de sensibilidad a diversos antibiótico en cepas de

Pseudomonas aeruginosa en los hospitales de Colima, Durango y

Guadalajara

32

Tabla 4. Distribución de los genes de MBLs respecto a la ciudad de

procedencia de cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos

35

Tabla 5. Patrones de sensibilidad a diversos antibióticos en cepas de P.

aeruginosa del HRU en Colima

35


aeruginosa de Hospital General de Durango

36


aerugionsa de CMO en Guadalajara

36

Tabla 8. Comparación de los antibióticos entre cada uno de los hospitales

participantes

37

DEDICATORIA

A las personas que durante estos dos años se han ido,

los que están presentes

y por los que aún tienen que llegar.

A mis asesores:

Gracias Dr. Newton, Dr. Martínez, Dr. Tinoco y Dr. Villaseñor por su confianza, apoyo

incondicional y enseñarme a dar lo máximo en esta profesión. Todo mi respeto y

admiración.

Esperanza y Fabiola:

Gracias familia por estar ahí, por su amor, compresión, consejo, darme el aliento en

seguir. Y enseñarme a que los retos en la vida se logran a base de honestidad, fe,

esperanza y dedicación.

Amigos:

Por permitirme trabajar y aprender con ustedes, por todos lo buenos y malos momentos

que vivimos dentro y fuera del laboratorio y por estar ahí cuando los necesite. Para

aquellos nuevos amigos que hice durante esta aventura llamada maestría gracias por

todo y una disculpa para aquellas personas que descuide o deje abandonados por seguir

este sueño, pero que siempre las llevo en el pensamiento.

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología:

Agradezco la beca brindada durante este periodo de formación

1

RESUMEN

Antecedentes: El desarrollo de resistencia y la aparición de cepas de P. aeruginosa

portadoras de metallo-β-lacatamasas (MBLs) son un problema de salud pública.

Objetivo: Identificar los genes responsables de la resistencia a carbapenémicos en

cepas nosocomiales de P. aeruginosa aisladas en algunos hospitales de México.

Metodología: estudio descriptivo multicéntrico transversal, realizado con cepas de P.

aeruginosa procedentes de hospitales de Colima, Durango y Guadalajara del 2007 a

2008. La identificación se las cepas se realizó con técnicas convencionales de

microbiología; el perfil de susceptibilidad a antibióticos se realizó por Kiby-Bauer de

acuerdo a las recomendaciones del CLSI (Clincal Laboratory Standars Institute). El

fenotipo de resistencia a MBLs se determinó por E-test y doble disco de Hodge y se

confirmó mediante la identificación de los genes IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-

1 por reacción en cadena de la polimerasa (PRC). Se utilizaron cepas de P. aeruginosa

productoras de VIM, IMP y ATCC 27853 como control de calidad.

Resultados: Se obtuvieron 253 cepas, 14 se excluyeron, analizándose un total de 239.

El 37% fueron de Guadalajara, 33% de Durango y 30% de Colima. Setenta cepas (29%)

fueron resistentes a carbapenémicos, y en 40 de ellas se encontraron genes MBLs; 25

cepas tuvieron un solo gen (IMP-1, VIM-1, VIM-2), 13 cepas dos genes (VIM-1+IMP-

2, VIM-1+VIM-2, IMP-1+VIM-2, IMP-1+VIM-1) y 2 cepas tres genes (IMP-1+VIM-

1+VIM-2).

Conclusiones: La prevalencia de resistencia a carbapenémicos y la presencia de genes

de MBLs en P. aeruginosas es semejante a la de países europeos y superior a la

reportada en el continente americano. La presencia de cepas con más de un gen de

resistencia es un hallazgo relevante.

Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa, infección nosocomial, carbapenémico,

metalo-β-lactamasas, antibiótico, mecanismos de resistencia, multiresistencia.

2

SUMMARY

Background: The development of antibiotic resistance and emergence of metallo-β-

lactamase (MBLs) carrying strains of P. aeruginosa are a public health problem.

Objective: Identify the genes responsible for carbapenem resistance in nosocomial

strains of P. aeruginosa isolated in some Mexican hospitals.

Methods: A multicenter, descriptive, cross-sectional study performed with strains of P.

aeruginosa obtained in hospitals in Colima, Durango and Guadalajara from 2007 to

2008. Conventional microbiology techniques were employed for strain identification.

In accordance with the CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), the Kirby-Bauer

technique was used to obtain the antibiotic susceptibility pattern. The MBLs resistant

phenotype was determined by E-test and Hodge double disk test. Results were

confirmed by positive identification of IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 and SPM-1 genes

with PCR testing. VIM and IMP producing P. aeruginosa strains as well as ATCC

27853 were used for quality control.

Results: In total, 253 strains were obtained, of which 14 strains were excluded for a

final total of 249 strains. Thirty seven (37%) percent were obtained in Guadalajara,

33% in Durango and 30% in Colima. Seventy strains (29%) were resistant to

carbapenems and MBLs genes were found in 40 strains, of which 25 strains had only

one gene (IMP-1, VIM-1, VIM-2), 13 strains had two genes (VIM-1 +IMP-2, VIM-

1+VIM-2, IMP-1+VIM-2, IMP-1+VIM-1) and 2 strains had three genes (IMP-1+VIM-

1+VIM-2).

Conclusions: The prevalence of carbapenem resistance and the presence of MBLs

genes in P. aeruginosa are similar to those found in European countries and higher than

that reported on the American continent. The presence of strains containing more than

one resistant gene is a relevant finding.

Key words: Pseudomonas aeruginosa, nosocomial infection, carbapenems, metallo-β-

lactamase, antibiotic, resistance mechanisms, multidrug resistance.

3

INTRODUCCIÓN

En el grupo heterogéneo de bacterias gram negativas y de mayor importancia médica se

encuentra la familia de Enterobacteriaceae, en donde algunos géneros de esta familia

son patógenos intestinales importantes (Shigella sp, Salmonella sp, Yersinia sp) y varios

son únicamente colonizadores normales del sistema gastrointestinal del ser humano

(Escherichia sp, Enterobacter sp, Klebsiella sp). La localización extraintestinal de las

Enterobacteriaceae generalmente provoca una amplia gama de procesos infecciosos,

particularmente en el sistema genitourinario. Los individuos con alteración de sus

barreras anatómicas normales con frecuencia son afectados por estas bacterias,

ocasionando infecciones tales como: neumonía, septicemia, meningitis o infecciones de

piel y tejidos blandos. Los pacientes hospitalizados, son particularmente susceptibles a

la colonización y en algunos casos infección por Enterobacteriaceae, de modo que estos

microorganismos se encuentran considerados entre las principales causas de infección

intrahospitalaria. (Eisentein, 2000)

Las Enterobacteriaceae constituyen aproximadamente 80% de los aislamientos de

bacterias gram negativas en el laboratorio de microbiología clínica y alrededor del 50%

de los aislamientos de importancia clínica, la mayoría de ellos de origen

intrahospitalario. (Eisentein, 2000)

A finales de 1989, la Organización Panamericana de la Salud conjuntamente con la

Sociedad de Epidemiología Hospitalaria de Estados Unidos de América (EUA), realizó

una conferencia regional sobre prevención y control de infecciones nosocomiales (IN).

Los objetivos de dicha conferencia fueron implementar normas e instrumentos

homogéneos, para la prevención y control de IN. El objetivo fundamental por el cual se

instituyó el control de las IN fue garantizar la calidad de la atención médica.(NOM-EM-002-

SSA2-2003; NOM-026-SSA2-1998)

De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana de Emergencia NOM-EM-002-SSA2-2003 se

define a la IN como la multiplicación de un organismo parasitario dentro del cuerpo y

que puede presentar o no sintomatología; y el cual fue adquirido durante la

4

hospitalización del paciente. Tomando en cuenta el periodo de incubación que pueden

aparecer de 48 a 72 horas de su ingreso.(NOM-EM-002-SSA2-2003) Aunque se debe tomar en

cuenta que cada hospital debe de tener su programa de prevención y control de IN el

cual está regido por la NOM-026-SSA2-1998, en donde se promueve la vigilancia

epidemiológica para la detección oportuna de las IN a través de sistemas de trabajo

multidisciplinario y que permita el manejo ágil y eficiente de la información necesaria

para la prevención y el control de las IN.( NOM-026-SSA2-1998)

Las IN son un problema grave de salud pública, con frecuencias que varían entre 2-18%

dependiendo del tipo de hospital. Repercuten en forma importante en la morbilidad y

mortalidad e incrementan los días de estancia hospitalaria, el número de estudios de

laboratorio, de gabinete y otros procedimientos con el consecuente incremento de los

costos. En EUA se reporta que cada año mueren 62,000 pacientes por IN.(Velazco, 2001)

Estudios multicéntricos sobre infecciones hospitalarias indican que las enterobacterias

como Klebsiella sp, E. coli, Enterobacter sp y Pseudomonas sp son las más frecuentes

entre las bacterias gram negativas, y Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis así como otros Staphylococcus coagulasa negativo predominan entre los

gram positivos.(Domínguez, 2005)

En el 2002 en EUA, The Centers for Disease Control and Prevention (Los Centros de

Control y Prevención de Infecciones) (CDC) estimó que el 5% de los pacientes

hospitalizados padecerían un infección nosocomial con un costo anual de 4.5 billones de

dólares para el país. (Haag, 2002)

En los últimos 20 años, a nivel mundial, P. aeruginosa ha sido una de las bacterias que

con mayor frecuencia causan IN, además desde 1995 la resistencia a carbapenémicos se

ha ido incrementando paulatinamente desde 3% hasta el 38% en diversos lugares tales

como Japón. (Lee, 2002; Kimura, 2005), Colombia (Crespo, 2004; Pagani, 2005) y Corea.(Kim, 2005)

La información sobre la epidemiología de las IN causadas por P. aeruginosa en

hospitales mexicanos es limitada. Se han reportado episodios de infecciones causadas

por este germen en hospitales de tercer nivel con tasas que van desde 4.1 hasta 22.6

episodios por 1000 egresos hospitalarios, en donde los sitios de aislamiento más

5

frecuentes fueron: vías urinarias, cordón umbilical, heridas quirúrgicas, bacteriemias,

venopunción, pulmón, conjuntivas y peritoneo. Las áreas hospitalarias con las tasas más

altas de IN son las unidades de terapia intensiva. (Sifuentes, 1998; Tinoco, 1997)

Entre las infecciones de vías urinarias, Escherichia coli y Candida spp. constituyeron

un 50% del total de microorganismos aislados. De los restantes, Enterococo, Klebsiella

pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa representaron 24.6%. Dentro de las infecciones

de herida quirúrgica, los gérmenes aislados con mayor frecuencia fueron E. coli

(26.1%), Staphylococcus aureus (13.3%), estafilococo coagulasa negativo (11.1%), P.

aeruginosa (9.1%) y Enterobacter cloacae (8.7%) y en las neumonías nosocomiales, P.

aeruginosa fue el patógeno predominante con 35.1% de los aislamientos.(Ponce de León 1999)

,

En nuestro país, se han documentado aislamientos de P. aeruginosa con altos

porcentajes de resistencia a cefalosporinas de tercera generación 65%(Domínguez, 2005) a

carbapenémicos 12%, a aminoglucósidos 21% y a quinolonas 11%. (Pacheco, 2006)

La identificación y clasificación de patógenos nosocomiales a través de la tipificación

molecular es una herramienta importante para los estudios epidemiológicos. (D`Gata, 2006)

La identificación de la huella digital genómica por medio de electroforesis de campos

pulsados, permite identificar las clonas circulantes en los hospitales y seleccionar tipos

representativos de las mismas para corroborar la presencia de los genes productores de

metalo-β-lactamas.

6

ANTECEDENTES

Infecciones nosocomiales

El objetivo primordial de un programa de control de IN es reducir su frecuencia, así

como la morbilidad y la mortalidad asociadas, por medio de la vigilancia continua, el

mejoramiento de las condiciones de atención de los pacientes y la preparación del

personal en materia de prevención y control de infecciones.

Se estima que del total de 35 millones de pacientes que se hospitalizan en EUA, al

menos 2.5 millones desarrollarán una infección nosocomial, es decir, habrá 5.7

infecciones por cada 100 admisiones. En ese país se informan incidencias de

infecciones nosocomiales de 3 al 5%. En América Latina, a pesar de los esfuerzos de los

países por enfrentar este problema, únicamente 5% de los hospitales informan tener

comités con programas regulares de control de infecciones nosocomiales.(Ponce de León,

1999)

La mayoría de los hospitales en la provincia mexicana no cuentan con un programa de

vigilancia y control de IN, por lo tanto la información epidemiológica existente

proviene en su mayoría de instituciones de tercer nivel, cuyas características son muy

diferentes a la mayoría de los hospitales mexicanos, tanto en el tipo de pacientes que se

atienden como en la disponibilidad de recursos. En consecuencia, en hospitales

generales esta información sólo se conoce parcialmente, a través de informes aislados

de programas de vigilancia de algunas instituciones, o bien de brotes de IN. (Tinoco, 1997;

Martínez, 2001)

Los hospitales que han implementado un sistema de vigilancia y control de IN han

logrado reducir sus tasas de incidencia; así como la detección oportuna de brotes, la

identificación de aquellas bacterias que con mayor frecuencia se aíslan en las

infecciones nosocomiales y finalmente la individualización de las áreas de

hospitalización que presentan mayor incidencia. Tal es el caso del Instituto Nacional de

Ciencias Medicas y Nutrición “Salvador Zubirán”, que entre 1982 y 1984 reportó tasas

7

de IN de 19.5 por cada 100 egresos; del 1991 a 1996 Ponce de León y cols. reportaron

8.6% de infecciones nosocomiales por año, traduciéndose en una reducción de la tasa de

IN a un 11.5 por cada 100 egresos. Las áreas de mayor incidencia fueron: terapia

intensiva con una tasa promedio de 26.9 infecciones por 100 egresos, superando hasta

tres veces la tasa promedio de los sectores de hospitalización que fueron de 9.47 a 7.5

infecciones por 100 egresos. Los agentes causales de IN más comunes en vías urinarias

fueron E. coli y Candida sp con el 50%, K. pneumoniae y P. aeruginosa con el 24.6%,

en neumonías por P. aeruginosa se documentó en el 35.1% de los casos. (Ponce de León, 1999)

En el caso de un hospital de segundo nivel como el Hospital General de Durango, desde

1994 Tinoco y cols. implementaron un sistema de vigilancia y control de infecciones

nosocomiales reportándose una tasa de incidencia de 9 por cada 100 egresos,

encontrando las tasas más altas en las unidades de terapia intensiva pediátrica, de

adultos y neonatal, con tasas intermedias en medicina interna y unidad de cuidados

coronarios.(Tinoco, 1997) Para el 2005 la tasa de incidencia de IN se redujo al 2%,

observándose las tasas más altas en las terapias intensivas.

La neumonía y la bacteriemia nosocomial son dos de las IN más frecuentes, la

ventilación mecánica y el uso de catéteres intravenosos, son los principales factores de

riesgo para la adquisición de estas infecciones. La etiología de las neumonías asociadas

a ventilación mecánica en México es poco conocida, en parte por la dificultad para

establecer su diagnóstico, así como por la falta de protocolos específicos de vigilancia

epidemiológica. Las bacterias gram negativas han sido los principales agentes

involucrados, tanto Klebsiella pnemoniae como Pseudomonas sp que se han

identificado como colonizantes en pacientes sometidos a ventilación mecánica en

unidades de cuidados intensivos y en brotes de neumonía nosocomial.(Ponce de León, 1999)

Un buen laboratorio de microbiología que disponga de procedimientos estándar y de

control de calidad incrementa la documentación microbiológica de los episodios de

infecciones nosocomiales y favorece el uso racional de antibióticos. Por ello, la elección

del tratamiento empírico debe basarse en el conocimiento de la microbiología y del

patrón de susceptibilidad propio de cada unidad hospitalaria.(Martínez, 2001)

8

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa es un bacilo móvil, flagelado, aerobio, gram negativo

perteneciente a la familia Pseudomonadaceae. Tiene forma de bastón con un tamaño de

1.5-3 μm. Produce pigmentos fluorescentes difusibles que incluyen pioverdina y un

pigmento fenazínico soluble denominado piocianina; el último, producido por más del

50% de los aislamientos clínicos, aparece azul o verde a pH neutro o alcalino y es el

origen de nombre aeruginosa. Algunas cepas producen también pigmento rojo oscuro o

negro, produce un olor dulzón semejante a jugo de uva o de maíz y es nutricionalmente

versátil. No requiere factores de crecimiento orgánicos y puede utilizar más de 30

compuestos orgánicos para su desarrollo. Es un aerobio obligado, excepto en presencia

de nitrato. (Sanford, 2000; Geo, 2005)

La P. aeruginosa crece bien de 37 a 42° C, su crecimiento a 42° C ayuda a diferenciar a

otras especies de Pseudomonas del grupo fluorescente. No fermenta los carbohidratos,

pero muchas cepas oxidan glucosa. La identificación se basa en la morfología colonial,

prueba de oxidasa y presencia de pigmentos característicos. La diferenciación entre P.

aeruginosa y otras Pseudomonas con base en su actividad bioquímica requiere pruebas

con diversos sustratos.(Geo, 2005)

Pseudomonas aeruginosa produce dos hemolisinas, una es una proteína termolábil

denominada fosfolipasa C y la otra un ramnolípido termoestable. Estas dos sustancias

parecen actuar en forma sinérgica para degradar los lípidos y la lectina. Al igual que las

proteasas, las hemolisinas pueden contribuir a la invasión tisular mediante sus efectos

citotóxicos sobre los tejidos del huésped. Además la fosfolipasa C ejerce un efecto

patológico importante en infecciones del aparato respiratorio inferior por Pseudomonas

mediante la degradación enzimática del componente fosfatidilcolina del surfactante

pulmonar, que conduce a atelectasia. Más aun, los derivados de la fosfatidilcolina

inducen la producción de más fosfolipasa C, reforzando así el efecto de la enzima. La

fosfolipasa C también puede contribuir a la inflamación asociada con la infección por P.

aeruginosa al aumentar la síntesis y liberación de ácido araquidónico. El ramnolípido

puede ejercer un efecto patogénico adicional en las infecciones agudas y crónicas del

tracto respiratorio inferior por Pseudomonas al inhibir el transporte mucociliar y las

funciones ciliares del epitelio respiratorio. En resumen estos factores de virulencia

9

pueden contribuir en la patogenicidad de la P. aeruginosa, incluyendo la formación y

expresión de adesina, endotoxinas y exotoxinas hidrolíticas, que causan destrucción de

los tejidos.

P. aeruginosa se presenta a veces como parte de la flora microbiana normal de los seres

humanos. La prevalencia de colonización en personas sanas fuera de los hospitales o

luego del ingreso a ellos es relativamente baja y se da en sitios húmedos como periné,

axilas y oídos. Las tasas representativas de colonización específica por sitios son piel 0-

2%, mucosa nasal 0-3%, heces 2.6-24%. Por el contrario, la hospitalización puede

conducir a tasas muy altas de colonización, en particular en la piel de pacientes con

quemadura grave, en el aparato respiratorio inferior de pacientes sometidos a

ventilación mecánica, en el aparato gastrointestinal de pacientes que reciben

quimioterapia para enfermedades neoplásicas o prácticamente en cualquier sitio en

personas tratadas con antibióticos de amplio espectro. En cada caso las tasas de

colonización pueden exceder el 50% y la colonización a menudo precede una infección

invasora. (Sanford, 2000)

La P. aeruginosa produce infección en heridas y quemaduras, formando pus color azul

verdoso. Cuando se introduce al sistema nervioso central causa meningitis, cuando la

vía de entrada son catéteres, instrumentos o soluciones irritantes ocasiona infección del

aparto urinario. La infección del aparto respiratorio, en especial por ventiladores

mecánicos contaminados, producen neumonía necrosante. La infección del ojo, puede

conducir a una destrucción rápida de ese órgano, sobre todo cuando se presenta después

de procedimientos o lesiones quirúrgicas. En recién nacidos o personas

inmunocomprometidas, P. aeruginosa puede invadir el torrente sanguíneo y causar

septicemia. En la mayor parte de las infecciones por P. aeruginosa los síntomas y

signos son inespecíficos y se relacionan con el órgano afectado. (Geo, 2005)

P. aeruginosa es uno de los patógenos nosocomiales más frecuente, causante de

infecciones severas, particularmente en pacientes con cáncer, quemaduras y fibrosis

quística. Su tratamiento es complicado debido a que esta bacteria tiene la capacidad de

adaptación, mutación y adquisición de genes de resistencia. Los cuales le confieren

resistencia hacia los β-lactámicos anti-pseudomonas; siendo de mayor trascendencia

clínica los que presentan resistencia hacia los carbapenémicos. En el 2002 en América

10

Latina se reportó un 18% de resistencia a carbapenémicos en cepas de Pseudomonas sp

y Acinetibacter sp; estimándose que el 2% de las P. aeruginosa son productoras de

metalo- β-lactamasas (MBLs).(Crespo, 2004)

Debido a que la P. aeruginosa es uno de lo principales patógenos hospitalarios, se

puede estimar su prevalencia a partir de los datos de vigilancia anual recolectados por el

Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones Nosocomiales (NNIS) del CDC. Según

estos datos, la incidencia de infecciones por P. aeruginosa en EUA declinó de 4.8/1000

egresos hospitalarios en 1985 a 3.4/1000 en 1991, con un tasa global de infecciones

durante ese periodo de 4 por 1000 egresos, ocupando el cuarto lugar de los patógenos

más frecuentes y constituyó el 10% de todas las infecciones hospitalarias. En 1991, en

USA fue la principal causa de neumonía hospitalaria, la tercera causa de infecciones

hospitalarias en vías urinarias, el quinto en infecciones en heridas quirúrgicas y la

octava en torrente sanguíneo. También es el patógeno asociado con mayor frecuencia

con infecciones en la unidad de cuidados intensivos. Las tasas de mortalidad atribuidas

a infecciones por P. aeruginosa es de aproximadamente el 34%.(Crespo, 2004)

Antibióticos β -lactámicos

Los antibióticos β-lactámicos ejercen su acción por interferencia con la formación de

peptidoglucano, mecanismo compartido por los agentes glucopeptídicos, como la

vancomicina. Los diferentes miembros del gran grupo de los antibióticos β-lactámicos

poseen afinidades distintas para las diversas proteínas fijadoras de penicilina. El

aztreonam no interactúa con las proteínas fijadoras de penicilina de las bacterias gram

positivas, por lo que es el único miembro de este grupo que es ineficaz contra estos

microorganismos. (Peterson, 2005; Wood, 1996)

La actividad bactericida puede requerir la interacción de un antibiótico β-lactámico con

más de una proteína fijadora de penicilina. La saturación de estas proteínas fijadoras no

es esencial y no tiene efecto sobre la sensibilidad microbiana. El efecto de las enzimas

autolíticas también puede ser importante para la actividad bactericida de los antibióticos

β-lactámicos. La otra clase importante de antibióticos que interfiere en forma activa con

la síntesis de la pared celular bacteriana es el grupo glucopeptídico, representado por la

vancomicina y la teicoplanina. (Koneman, 2001; Peterson, 2005; Wood, 1996)

11

A pesar de la gran variedad de mecanismos de resistencia para los antibióticos β-

lactámicos, los más importantes son las β-lactamasas, estas son enzimas capaces de

hidrolizar los anillos β-lactámicos de la penicilina, cefalosporinas y el resto de los

antibióticos inhibiendo su actividad. Hay docenas de β-lactamasas, sin embargo cada

una tiene especificidad por determinado sustrato β-lactámico. El desarrollo de nuevos β-

lactámicos ha surgido en respuesta a la producción de β-lactamasas por las bacterias.

Las cefalosporinas de primera generación son susceptibles a la hidrólisis por diversas β-

lactamasas que frecuentemente se encuentran en bacilos gram negativos, incluyendo las

cefalosporinasas cromosomales de Pseudomonas sp, Enterobacter sp y otros géneros.

También se encuentran presentes β-lactamasas de enterobacterias mediadas por

plásmidos, las cuales también hidrolizan otras penicilinas y a diferencia de las

cefalosporinasas cromosomales, usualmente son inactivadas por inhibidores de β-

lactamasa tales como el ácido clavulánico.(Wood, 1996)

β -lactamasas

Las ß -lactamasas son enzimas con capacidad de hidrolizar el enlace amida del anillo β-

lactámico el cual confiere resistencia a la bacteria y esta es capaz de inactivar a diversos

antibióticos (cefalosporinas, monobactam, carbapenémicos, etcétera). Estas enzimas se

encuentran codificadas en plásmidos lo que les otorga la capacidad de diseminación

entre distintas cepas lo que ha provocado que se hayan difundido a nivel mundial en

pocos años.

Ambler clasificó las β-lactamasas acorde a su estructura molecular en cuatro tipos (A a

la D). La clase A, C y D son las más comunes; la clase B se diferencian por la

producción de metalo-β-lactamasas. Los genes que codifican dicha resistencia son

localizados en el cromosoma bacteriano, los cuales son acarreados por transposones o

están presentes en algunos integrones. Los genes pueden ser identificados en todas las

Enterobacterias, pero en cepas con resistencia a β-lactámicos como E. Coli, Klebsiella

sp y Proteus sp adquieren mayor importancia identificar β-lactamasas de clase A, C y

D, y en Acinetobacter sp y Pseudomonas sp las β-lactamasas de clase B.(Jacoby, 2005)

No se tiene un consenso sobre la definición práctica de las β-lactamasas de espectro

extendido (BLEES); pero comúnmente se manejan los BLEES como las β-lactamasas

12

que confieren resistencia bacteriana hacia las penicilinas, cefalosporinas de primera,

segunda y tercera generación y aztreonam (pero no a carbapenémicos o cefamicinas);

debido a que hidrolizan el antibiótico, este mecanismo puede llegar ha ser inhibido con

el ácido clavulánico. (Jacoby 2005; Koneman, 2001; Peterson, 2005; Piorel, 2001; Shibata, 2003; Walsh, 2005)

Dentro de la clase A, se han identificado β-lactamasas de los tipos TEM, (temoneira) de

los cuales se conocen hasta 130 tipos y SHV (sulfhydryl) donde existen 50 tipos de

enzimas. Los países donde se han identificado cepas de P. aeruginosa con genes de

resistencia son: Francia, Turquía, Italia, Corea, Brasil y Colombia. (Crespo, 2004; Jacoby, 2005;

Peterson, 2005; Wood, 1996)

En la clase C de β-lactamasas, la enzima AmpC, mediada por plásmidos, induce la

resistencia a β-lactámicos y es codificada por genes cromosomales en muchos bacilos

gram negativos. Se han encontrado más de 20 diferentes tipos de β-lactamasas AmpC

en plásmidos, provocando resistencia a cefamicinas, así como a oximino- β-lactámicos,

son resistentes a la inhibición por ácido clavulánico; pero son sensibles a

carbapenémicos, cefalosporinas de cuarta generación y fluoroquinolonas. (Jacoby, 2005;

Thomoson, 2000)

Las β-lactamasas de clase D son poco comunes, se caracteriza por hidrolizar las

oxacilinas y benzilpenicilinas, las cuales se encuentran principalmente en cepas de

Pseudomonas aeruginosa. Los tipos OXA (hidrólisis de oxacilina) se caracterizan por

conferir franca resistencia a cefotaxima y en ocasiones a ceftazidima y aztreonam. Estas

han sido encontradas en cepas de P. aeruginosa de Francia y Turquía, y son

relativamente resistentes a la inhibición por ácido clavulánico. (Crespo, 2004; Jacoby, 2005;

Peterson, 2005)

Las carbapenemasas o metalo-β-lactamasas (MBLs) pertenecen a la clase B y son un

grupo diverso de enzimas representadas por aquellas que hidrolizan imipenem (IMP), de

las cuales se conocen 17 tipos, y fueron identificadas a principios de los años noventas

en Japón en Pseudomonas sp y Acinetobacter sp. La información sobre la circulación de

cepas productoras de MBLs en el mundo aun es limitada, pero en algunos países

europeos, Canadá y Brasil se han reportado de manera creciente este tipo de cepas. Una

segunda familia de MBLs es la enzima imipenemasa veronasa (VIM) debido a que fue

13

en Verona, Italia donde se describió en 1999 identificándose 10 tipos teniendo una

mayor distribución a nivel mundial comparado con MBLs que hidrolizan IMP presente

en varios países de Europa, Sur de América y el este de EUA. Las de más reciente

identificación son la SPM (MBL Sau Pablo) y GIM (imipenemasa Alemania).(Jacoby, 2005;

Suárez, 2006; Walsh, 2005)

Metalo- β-lactamasas (MBLs)

Las metalo-β-lactamasas son capaces de hidrolizar los carbapenémicos. Los reportes de

resistencia varían, pero en consenso general aparecen con mayor frecuencia la

resistencia a β-lactámicos y quinolonas en la familia de Enterobacteriaceae,

Acinectobacter sp, Serratia sp y Pseudomonas sp. (Fritshe, 2005; Walsh, 2005)

Durante los años noventa la adquisición de MBLs provocó la emergencia de resistencia

entre patógenos gram negativos incluyendo Pseudomonas aeruginosa en Japón e Italia.

Estas enzimas, poseen amplias características que les permiten resistir la acción de

inhibidores de β-lactamasas convencionales, permitiendo que estas bacterias sean

resistentes a las β-lactámicos (incluyendo carbapenémicos), reduciendo el repertorio de

agentes antimicrobianos para su tratamiento. Además, los genes MBLs pueden

incorporarse en integrones que determinan diferentes mecanismos por lo que cepas

productoras de MBLs exhiben fenotipos multiresistentes incluyendo a agentes no β-

lactámicos. (Riccio, 2005; Thomson, 2000)

Los carbapenémicos principalmente el imipenem y meropenem son agentes utilizados

para el tratamiento de infecciones por P. aeruginosa multiresistente. La resistencia de

estos antibióticos puede ser de bajo nivel (concentración mínima inhibitoria (CMI)-32

mg/L) determinada por la pérdida de la porina OprD combinada en represión

cromosomal del gen ampC o por sobreexpresión del mecanismo de expulsión activa del

antibiótico, que conduce a una resistencia de alto nivel (CMI-32 mg/L), este último

mecanismo es todavía poco común en P. aeruginosa. (Kim, 2005)

La serina de las carbapenemasas son derivadas de las enzimas de clase A o clase D y

son usualmente mediadas por resistencia a carbapenémicos en Enterobacteriaeae o

Acinetobacter sp. Las enzimas identificadas en Enterobacteriaeae incluyen NmcA,

14

Sme1-3, IMI-1, KPC1-3 y GES-3. A pesar de la avidez de estas enzimas hacia los

carbapenémicos, no siempre confieren altos niveles de resistencia y no todas son

inhibidas por ácido clavulánico. La clase A y D de carbapenemasas son codificadas por

genes que son producidas por la bacteria o codificadas por su cromosoma (algunas

veces asociada a su integrón) o acarreadas por plásmidos. (Walsh, 2005)

Las MBLs fueron formalmente categorizadas por la serina en β-lactamasas en 1980 en

Japón; y en 1989 Bush las clasificó en grupos separados, acorde a sus propiedades

funcionales para quedar referenciada en el sistema general de β-lactamasas. Este

esquema fue inicialmente basado en el perfil de substrato (en particular hidrólisis de

imipenem), con sensibilidad al ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y la falta de

inhibición por los inhibidores de serian β-lactamasa. Este esquema fue actualizado en

1995 y posteriormente modificado en 1997 para acomodarlo en los tres grupos de

enzimas que ha sido clasificado. Solo dos tipos transferibles de MBLs han sido

estudiados, en Bacteroides fragilis CcrA y IMP-1 en P. aeruginosa. El grupo 3a posee

enzimas con actividad de amplio espectro; el grupo 3b posee enzimas con preferencia

hacia los carbapenémicos; el grupo 3c hidroliza pobremente a los carbapenémicos

comparado con otros sustratos de β-lactámicos. Sin embargo, estas enzimas poseen

marcas características que son inhibidas por EDTA, así como agentes quelantes de

cationes divalentes.( Fiett, 2006; Thomsom, 2000; Walsh, 2005)

A nivel molecular, los MBLs son un grupo heterogéneo de proteínas que pueden ser

clasificadas con base en su estructura virtual. Se ha hecho una subclasificación de

enzimas B basadas en la secuencia o por sus características estructurales. El árbol

filogenético indica la relación de unas enzimas con otras a través de la secuencias de

nucleótidos. Las relacionadas con la clase B1 son enzimas que poseen una unión de zinc

coordinada por tres histidinas y una cisteina acomodadas por transferencia en los MBLs

como: IMP, VIM, GIM y SPM-1 pero tienen una actividad marginal de β-lactamasas

AmpC. La clase B2 incluye una asparagina por histidina en la primera posición del

puente de zinc característico, hisitidina-X–histidina-X-ácido aspártico (NXHXD) y

deriva de enzimas SHF-1 en Aeromonas sp y Serratia fonticola. MBLs L1 es exclusiva

de la clase B3, ya que es única entre las β-lactamasas que son funcionalmente

representadas como un tetrámero. (Piorel, 2001; Walsh, 2005)

http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido

15

La adquisición de la codificación cromosomal de las MBLs tiene diversos argumentos,

los cuales siguen siendo cuestionados. Se creé que el periodo de tiempo en que las

bacterias han sido expuestas a β-lactámicos y por ello la bacteria adquiere esta

información en sus genes para expresar resistencia al antibiótico. Otro argumento es que

estas enzimas realizan una función celular normal como respuesta al ambiente pero que

aun no ha sido evaluada. (Walsh, 2005)

La diseminación de cepas que poseen genes de MBLs es condicionada por el consumo

de cefalosporinas de espectro extendido y carbapenémicos. Los genes estructurales de

tipo IMP, VIM y GIM-1 que se localizan en integrones clase 1, los genes IMP también

se han encontrado en integrones clase 3. Los integrones son capaces de obtener una vía

de entrada al casete cromosómico y alcanzar un sitio específico de recombinación en el

DNA, y por lo tanto se expresarán en el integrón mismo y en el casete cromosómico.

Los integrones consisten en tres regiones: 5`, 3` y una región variable. La región

5`consiste en un gen integrasa (intl), un sitio de recombinación adyacente (attI), y un

promotor, que facilita la expresión que produce en la región del casete cromosómico. La

región 3` en la mayoría de las ocasiones conserva su estructura parcial, pero en

ocasiones es eliminada por el gen qac (qacEA1) el cual confiere resistencia a los

antisépticos y sulfonamidas.(Walsh, 2005)

Cuando los casetes acarrean genes de resistencia a los aminoglucósidos y β-lactámicos,

estos pueden moverse con libertad de un integrón a otro pero no pueden moverse de un

organismo a otro y requiere de ayuda de otros elementos genéticos como los plásmidos

o transposones. La mayoría de los genes MBLs se encuentran usualmente en plásmidos

de 120 a 180 kb. (Kimura, 2005; Walsh, 2005)

Existen cuatro grupos de MBLs mediados por plásmidos (IMP, VIM, SPM y GIM) que

han sido descritos a nivel mundial, y sus determinantes genéticos asociados con

integrones. En 1991 en Japón se describió el gen IMP-1 en cepas de Serratia

marcescens y P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, y de este se ha partido para la

identificación de nuevos MBLs como VIM-1 en Italia, VIM-2 en Francia, SPM-1 en

Brasil y GIM-1 en Alemania. (Fiett, 2006; Kim, 2005; Riccio, 2005)

16

Cuando se identificó en Japón el primer gen de resistencia a carbapenémicos se

consideró como un problema de salud solo para ese país; pero en 1997 se presentan los

primeros reportes de la presencia del gen IMP en cepas de P. aeruginosa de Italia y

Portugal. Aunque en estudios retrospectivos en cepas colectadas en 1994 en Hong Kong

y en 1995 en Canadá determinaron que la resistencia fue debida a IMP-7 en cepas de P.

aeruginosa y a IMP-4 en cepas de Acinetobacter sp.(Chu, 2001) En Corea existen dos

estudios que reportan cepas resistentes a carabapenémicos debido a la producción de

MBLs (Lee, 2002). En uno de los estudios se encontraron genes IMP en el 35% de las cepas

resistentes a carbapenémicos o ceftazidima (Kim, 2005). Mientras que en otro estudio

realizado en 2000-2001 en hospitales coreanos se presentó el 60% de cepas productoras

de MBLs. (Walsh, 2005)

El segundo grupo más frecuente de MBLs es la familia VIM; presentando resistencia a

los β-lactámicos, monobactámicos y carbapenémicos. Al igual que los genes blaIMP, el

gen blaVIM-1 se integra en el casete cromosómico en una clase de integrón; esta fue

identificada en cepas de P. aeruginosa en tres hospitales de Italia. En 1996 se identificó

en Francia el gen blaVIM-2 en una cepa de P. aeruginosa que en comparación a VIM-1

esta es susceptible a aztreonam; aunque han aumentado los reportes de su presciencia en

otros países como: Japón, Corea, Portugal, España, Polonia, Chile, Venezuela,

Argentina y EUA. En los últimos años se han identificado otros tipos de gen VIM como

VIM-3, VIM-4, VIM-5 y VIM-6 los cuales difieren en la cantidad de aminoácidos, su

susceptibilidad hacia algunos antibióticos debido a que presentan fenotipos de

resistencia diferente entre cada tipo de VIM y la presencia en cierta cepas de K.

pneumoniae, P. aeruginosa y P. putida. (Fiett, 2006; Jacoby, 2005; Laupland, 2005; Peterson, 2003; Piorel,

2001; Riccio, 2005; Suárez, 2006;Walsh, 2005)

En 1997 en Sao Paulo, Brasil se identificó un nuevo gen denominado SPM-1 en cepas

de P. aeruginosa; en su secuenciación se identificó una diferencia no mayor de 24

aminoácidos en comparación con los genes IMP y VIM; otra característica es que está

inmediatamente asociado a regiones comunes y no con integrones o transposones. Una

característica en común con el resto de los genes es que no hidroliza el ácido

clavulánico o aztreonam. En Alemania se identificó el gen GIM-1, presentando una

diferencia en su estructura genética del 31 al 41% con respecto a los genes IMP y VIM;

a su vez este gen es dependiente de zinc (HXHXD). (Riccio, 2005; Walsh, 2005)

17

El incremento de la resistencia a carbapenémicos por cualquier mecanismo ha ido en

aumento de acuerdo con el Programa Internacional de Vigilancia de la Resistencia

SENTRY; en el caso de Japón del 19.3% reportado en 1998, incrementó al 38% para el

2002; y en cepas brasileñas de P. aeruginosa se reportó de 44.8%. (Fritshe, 2005)

De acuerdo con los resultados del SENTRY en el 2002, América Latina presentó una

prevalencia del 18% en cepas de P. aeruginosa y Acinectobacter sp. resistentes a

carbapenémicos, se estimó que el 2% de los aislamientos de P. aeruginosa productoras

de MBL eran procedentes de hospitales. Al menos cinco tipos de MBLs como: IMP-1,

IMP-7, IMP-16, VIM-2, VIM-8 y SPM-1 se han detectado en hospitales de países

como: Chile, Venezuela, Colombia y Brasil. (Laupland, 2005; Lee, 2002; Pagani, 2005; Villegas, 2006)

Mientras que en EUA Cofksky y cols, identificaron que el 25% de las cepas aisladas de

P. aeruginosa fueron resistentes a carbapenémicos y asociados a una tasa de mortalidad

del 20%. (Haag, 2002)

En el caso de Colombia, Cerpo y cols reportaron en un estudio de seguimiento de 1997

al 2003 una prevalencia del 38% de cepas resistentes a carbapenémicos. Identificaron

seis tipos de fenotipos: 1) resistente a imipenem o meropenem, ceftazidima,

aminoglucósidos y quinolonas, pero susceptible a aztreonam y piperacilina; 2) similar a

fenotipo uno pero resistente a aztreonam y piperacilina, 3) resistente solamente a

imipenem, 4) susceptible solamente a piperacilina, 5) resistente a imipenem o

meropenem pero susceptible a cualquier otro antibiótico y 6) solo sensible a cefepime. (Crespo, 2004)

En el 2004, Lagatolla y cols. en hospitales de Italia reportaron una frecuencia del 20%

en cepas P. aeruginosa con genes de MBLs aunque en general y el 70% de ellas

presentaron los genes VIM-1 y VIM-2. (Lagatolla, 2004), En el 2005, Laupland y cols

reportaron en hospitales de Canadá una tasa de incidencia anual de 10.5 casos por cada

100,000 infecciones nosocomiales por P. aeruginosa, de los cuales el 43% (98/228)

presentaron resistencia a carbapenémicos, y de esas cepas aisladas el 39% fueron

identificadas como productoras de MBLs tipo VIM y el 2% productoras de MBLs tipo

IMP. (Laupland 2005) En el 2006, Villegas y cols en Colombia reportaron un promedio de

13.5% de cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, siendo de ellos el 26%

aisladas en la unidad de terapia intensiva. (Villegas, 2006)

18

Los factores de riesgo que contribuyen a la colonización e infección con cepas

productoras de MBLs difieren un poco en relación al resto de las infecciones

nosocomiales; uno de los principales factores de riesgo es la estancia hospitalaria

prolongada u hospitalización en terapia intensiva, enfermedades graves como diabetes,

cáncer, VIH, insuficiencia renal, cirugías (transplante o traumatismos), el uso de

catéteres, sondas urinarias, apoyo ventilatorio, hemodiálisis, cirugías abdominales de

emergencia, sondas de gastrostomías o yeyunostomías, y la administración de β-

lactámicos o de otros antibióticos. (Murphy, 2003; Pagani, 2005; Piorel, 2001)

La aparición de P. aeruginosa productora de MBLs representa un riesgo

epidemiológico por dos razones principales: 1) MBLs confieren resistencia no sólo a

carbapenémicos sino a todos los β-lactámicos y con frecuencia se asocian con

resistencia a aminoglucósidos; y 2) los genes que codifican enzimas para MBLs son

acarreadas comúnmente en elementos móviles (genes incluidos en casetes de

integrones) que pueden propagarse horizontalmente entre diferentes amplicones y cepas. (Kim, 2005)

La importancia clínica de identificar los genes productores de MBLs es debido a la

transferencia de estos genes a otras bacterias como: P. aeruginosa, Acinetobacter sp y

Enterococcus sp. y con ello conferir la resistencia a todos los β-lactámicos,

aminoglucósidos y fluoroquinolonas; ofreciendo como única opción terapéutica

polimixinas. (Walsh, 2005)

Identificación de MBLs

Desde la creación de los carbapenémicos en los años ochentas, no se visualizó que en un

periodo de diez años las bacterias, especialmente las enterobacterias no fermentadoras,

adquirieran la capacidad de producir una resistencia hacia este grupo de antibióticos.

Con la creciente prevalencia a nivel mundial de P. aeruginosa y Acinetobater sp

productoras de MBLs, al conferir resistencia a los carbapenémicos coadyuvaron a que

esto se extendiera hacia las cefalosporinas. Se ha buscado una explicación a esta

transferencia de resistencia cruzada a través de técnicas de biología molecular para

identificar lo genes o plásmidos que confieren estas mutaciones en las cepas de P.

19

aeruginosa y hasta el momento se han atribuido a dos mecanismos: alteraciones a nivel

de las porinas y a través de bombas de flujo.

Para la confirmación de los genes causantes de MBLs se requiere de técnicas

moleculares específicas, las cuales no todos los laboratorios de microbiología cuentan

con el equipo necesario para realizar estos estudios por lo que la utilización de técnicas

de identificación fenotípica para las cepas sospechosas de producción de MBLs son una

opción que se pude tener al alcance y que a su vez son sugeridas a realizar por la CLSI

(Clincal Laboratory Standar Institute); pero no sugieren una técnica específica y de ahí

que se han descrito diferentes tipos de procedimientos como: la utilización de discos de

EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) con imipenem, E-test, sinergismo de discos de

EDTA con imipenem o ceftazidima (técnica de Hodge) y discos con MPA (ácido 2-

mercaptopropionico) con imipenem o ceftazidima (Tabla 1 y Figura 1). (Lee, 2001; Marchiaro

2005; Walsh, 2002)

Tabla 1. Comparación de algunos métodos para la identificación fenotípica de

MBLs (Marchiaro, 2005)

EDTA +

imipenem

E-test Técnica de

Hodge

Sensibilidad 100% 92% 67%

Especificidad 100% 100% 70%

Valor predictivo positivo 100% 100% 32%

Valor predictivo negativo 100% 98% 91% EDTA= Ácido etilendiaminotetraacético

A pesar de los procedimientos fenotípicos existentes para la identificación de MBLs, se

ha intentado unificar criterios para determinar el tipo de gen productor de MBLs (IMP,

VIM, GIM, SPM) en cepas de P. aeruginosa y Acinetobacter sp, a través de la técnica

de Hodge y la prueba de E-test, pero esto no ha sido posible debido a que cada autor ha

propuesto diferentes puntos de cohorte entre las concentraciones de EDTA haciendo

cuestionar la sensibilidad y especificidad de la prueba; una ventaja con lo que cuenta la

E-test con respecto al resto de las pruebas fenotípicas es medir las concentraciones

mínimas inhibitorias la cual reduce el margen de error, motivo por lo cual es el más

utilizado hasta el momento. (Aktas, 2008; Cornaglia, 2007; Picao, 2008)

20

A)

B)

C)

Figura 1. Identificación fenotípica de MBLs: A) Técnica de Hodge

(sinergismo de EDTA + imipenem o ceftazidima), B) E-test y C)

Técnica de EDTA + imipenem.

21

JUSTIFICACIÓN

La resistencia bacteriana es un problema serio, con repercusiones en la morbilidad y

mortalidad de pacientes hospitalizados en general y en particular de los que adquieren

infecciones nosocomiales, condicionando altos costos para su tratamiento y control.

Debido a su patogenicidad y a la resistencia que presenta hacia los antibióticos, la P.

aeruginosa es una de las bacterias que condiciona más problemas a nivel

intrahospitalario. En nuestro país son pocos los hospitales que tiene programas de

vigilancia y control de infecciones nosocomiales validados por lo que no se dispone de

información confiable sobre la epidemiología de las IN por P. aeruginosa.

El uso indiscriminado de antibióticos β-lactámicos ha sido un factor que a nivel mundial

ha incrementado la resistencia de P. aeruginosa, especialmente hacia los

carbapenémicos, con repercusión importante a nivel hospitalario donde se observan

fallas terapéuticas de los esquemas de antimicrobianos utilizados tradicionalmente.

Además, las bacterias que tengan en su casete cromosómico alguno de los genes

productores de MBLs, tendrá la oportunidad de transferirlo a través de plásmidos a

aquellas cepas de P. aeruginosa que no lo contengan e inclusive a otro tipo de bacterias

como Acinectobacter sp y Serratia sp y finalmente propagarse en todos los niveles

hospitalarios y de la región. Este problema se reflejará con aumento en la morbilidad y

mortalidad, así como elevación de costos para el manejo de IN causadas por P.

aeruginosa productoras de MBLs.

En este estudio se determinará la presencia de genes IMP-1, IMP2, VIM-1, VIM-2 y

SMP-1 en cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, así como el patrón de

susceptibilidad a otros antibióticos. La información generada será de gran utilidad para

realizar una descripción de los genes y así fundamentar y realizar propuestas para la

implementación de medidas de control a mediano y largo plazo.

22

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Cuál es la frecuencia de los genes IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-1 en cepas

nosocomiales de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos aisladas en

algunos hospitales de México?

OBJETIVO GENERAL

Identificar la presencia de los genes IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-1 de

resistencia a carbapenémicos en cepas nosocomiales de P. aeruginosa aisladas en

algunos hospitales de México.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Determinar el perfil de susceptibilidad a carbapenémicos, cefalosporinas,

quinolonas, inhibidores de β-lactamasas y monobactam a través de la técnica de

Kirby Bauer de las cepas de P. aeruginosa aisladas en hospitales de Colima,

Durango y Guadalajara.

- Identificar el fenotipo de metalo-β-lactamasas a través de la técnica de doble disco y

la prueba de E-test de las cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos

aisladas en hospitales de Colima, Durango y Guadalajara.

- Describir la frecuencia de los genes IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-1 en la

cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos aisladas en los hospitales

participantes.

23

MATERIAL Y MÉTODOS

Periodo de estudio: El estudio se realizó de febrero de 2007 a diciembre de 2008; se

estudiaron las cepas de P. aeruginosa obtenidas de hospitales de Colima, Durango y

Guadalajara.

Tipo de estudio: multicéntrico, transversal, descriptivo.

Universo de trabajo: Cepas aisladas de pacientes que presentaron infecciones

nosocomiales en los siguientes hospitales: Hospital Regional Universitario (HRU) y

Hospital General de Zona No. 1 del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), en la

ciudad de Colima; Hospital General de Durango (HGD) y Hospital General de Zona

No. 1 del IMSS de la ciudad de Durango y Centro Médico de Occidente del IMSS de la

ciudad de Guadalajara (CMO). El muestro fue no probabilístico de casos consecutivos

no repetidos.

Tamaño de la muestra: fue calculado con la fórmula de una proporción.(Velazco, 2003;

Fernández, 1996)

Donde:

• Zα 2 = 1.962 (ya que la seguridad es del 95%)

• p = proporción esperada

• q = 1 – p

• d = precisión

N= (1.96)2*[(0.37*0.72)]

(0.03)2

N= (3.84)*(0.23)

0.0009

24

Se usaron los estimados de frecuencia esperada con la fuente de información disponible,

la cual indica que la prevalencia en cepas de P. aeruginosa nosocomiales resistentes a

carbapenémicos es alrededor de 37.5% (Crespo, 2004), con una precisión absoluta del 3%.

Resultando un tamaño de muestra de:

n = 995

Se reajustó el tamaño de la muestra utilizando la fórmula de una proporción en

poblaciones finitas menores a 5,000 casos. Tomando en consideración los datos

proporcionados por los Servicios de Epidemiología de los hospitales participantes,

referente al número de infecciones nosocomiales identificadas en el 2006; Colima:

IMSS con 73 casos y HRU con 284 casos; Durango: IMSS con 56 casos y HGD con

394; y Guadalajara: CMO con 129 casos. Dando una media de 187 infecciones

nosocomiales. (Fernández, 1996)

N= n

1 + (n/población)

N= 995

1 + (995/187)

Resultando un tamaño de muestra de:

N= 158 cepas de P. aeruginosa

Criterios de Selección:

Inclusión:

Cepas aisladas de pacientes que presenten infección nosocomial.

No inclusión:

25

Cepas aisladas de pacientes con reingreso menor a 2 semanas

Eliminación

Muerte de la cepa por el transporte inadecuado de la muestra.

Contaminación de las placas de agar por otros gérmenes.

Variables:

Variable Naturaleza Escala de

Medición

Indicador Interrelación

Genes

responsables de

resistencia

Cualitativa Nominal

politómica

IMP1, IMP2,

VIM1, VIM2,

SPM1

Dependiente

Desarrollo de estudio: (Figura 2)

Se recuperaron las cepas aisladas de muestras de sondas urinarias, puntas de catéter,

aspirados bronquiales, hemocultivos y secreciones, las cuales fueron proporcionadas por

el Laboratorio de Microbiología de los hospitales participantes y se enviaron en placas

de agar MacConkey selladas con parafilm y en hielera cerrada con refrigerantes (4-8°C)

al laboratorio de Ecología de la Facultad de Medicina, de la Universidad de Colima, en

forma personal las correspondientes a la ciudad de Colima y por mensajería de 24 horas

del resto de la unidades sedes (Guadalajara y Durango). Todas las cepas fueron

resembradas en placas de agar MacConkey e incubadas a 36 ºC por 24 horas en el

Laboratorio de Ecología de la Facultad de Medicina.

Identificación de P. aeruginosa:

Las características de las colonias en placas MacConkey son: producen pigmento rojo

oscuro o negro, con olor dulce semejante a jugo de uva o de maíz. Como control de

26

calidad para todas las pruebas se utilizó la cepa de P. aeruginosa ATCC 27853

(American Type Culture Collection).

Inicialmente se les realizó a todas las cepa una tinción de gram (Anexo 1), para verificar

que fueran bacilos gram negativos, posteriormente se seleccionaron una colonia

perfectamente aislada de la caja de petri con la cual se inocularon los tubos que

contienen las pruebas bioquímicas (Agar triple azúcar, Citratro de Simmons y

Oxidación-Fermentación de Hugo y Leifson) las cuales se revelaron en 24 horas (Anexo

2).

Prueba de susceptibilidad:

La identificación se realizó mediante la técnica de Kirby Bauer para susceptibilidad en

disco, de acuerdo a lo dispuesto por la CLSI de los EUA y los lineamientos

recomendados por la American Society for Microbiology. Por crecimiento durante 24

horas a 35° C en agar Mueller-Hinton conteniendo cloruro de sodio al 4%. Se utilizaron

como cepa control para P. aeruginosa ATCC 27853. Se emplearon los siguientes

antibióticos: amikacina (30 μg), aztreonam (30 μg), ampicilina con sulbactam (10/10

μg), cefepime (30 μg), cefotaxima (30 μg), ceftazidima (30 μg), ceftriaxona (30 μg),

ciprofloxacina (5 μg), gentamicina(10 μg), imipenem (10 μg), y meropenem (10 μg),

piperacilina con tazobactam (100/10 μg), trimetoprin con sulfametoxazol (1.25/ 23.75

μg) y ticarcilina con ácido clavulánico (75/10 μg). (CLSI, 2006; Weldhagen, 2003) (Anexo 3)

Identificación del fenotipo a metalo-β-lactamasas:

Posteriormente de verificada la resistencia a carbapenémicos en las cepas de P.

aeruginosa, se empleó la técnica de doble y triple disco en placa para la identificación

del fenotipo MBLs; donde se utilizaron discos de EDTA, ceftazidima, imipenem y

meropenem. (Anexo 4). De acuerdo con Kimura y cols se esperó que el 1.9% de las

cepas resistentes a carbapenémicos muestren el fenotipo a metalo-β-lactamasas. Se

realizó al mismo tiempo la prueba de E-test la cual muestra sensibilidad y especificidad

superiores a la técnica de Hodge. (Kimura, 2005; Walsh, 2002) Se utilizó como cepas control

ATCC 27858 (control negativo), la cepa de P. aeruginosa productora de VIM-2 y la

cepa de P. aeruginosa productora de IMP-4677 (controles positivos).

27

Extracción de DNA:

Para la extracción de DNA de las bacterias se realizó mediante las especificaciones del

Kit UltraCleanTM Microbial DNA (MO Bio Laboratories, Inc. Solana Beach, CA).

Donde se obtuvieron aproximadamente 200 ng/μl de DNA. El DNA se conservó en

congelación a -20° C hasta su procesamiento; esta temperatura de conservación lo

mantiene estable por aproximadamente 12 meses. (Anexo 5)

Identificación de los genes de MBLs a través de la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR):

Para la determinación de los genes para MBLs (IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-

1) se realizó una mezcla de PCR total de 20μl, con las siguientes concentraciones:

Buffer 2 μl, Mg 1 μl, dNTPs 0.5 μl, DNA 0.5 μl, iniciador R 0.7 μl, iniciador F 0.7 μl

(Tabla 2), Taq a 0.1 μl y H2O 14.4 μl. Las condiciones del termociclador fueron las

siguientes: 94° C por 3 minutos, seguido de 38 ciclos a 94° C por 30 segundos,

alineamientos de 50° C por 40 segundos y extensión de 72° C por 40 segundos, para

terminar con 5 minutos de incubación

La realización de la electroforesis fue con gel de agarosa al 1% y TBE al 1% con un

voltaje de 85 por una hora y media; cada pozo del gel fue cargado con una mezcla de

jugo azul y el marcador syber green (2μl) y mezclado con 10 μl de la muestra a

procesar. Cada corrida cuenta con un control positivo para IMP y VIM, a excepción de

SPM. Se reveló el gel en lámpara UV. (Anexo 6)

28

Tabla 2. Iniciadores para la identificación de MBLs en cepas de P. aeruginosa. (Shibata, 2003)

Gene Secuencia del Primer (5´- 3´) Pb

blaIMP-1 F1 (5`-ACC GCA GCA GAG TCT TTG CC-3`)

R1 (5´-ACA ACC AGT TTT GCC TTA CC-3´)

587

blaIMP-2 F2 (5´-GTT TTA TGT GTA TGC TTC C-3´)

R2 (5`-AGC CTG TTC CCA TGT AC-3´)

678

blaVIM-1 F3 (5´-AGT GGT GAG TAT CCG ACA G-3´)

R3 (5´-ATG AAA GTG CGT GGA GAC-3´)

261

blaVIM-2 F4 (5`-ATG TTC AAA CTT TTG AGT AAG-3´)

R4 (5´-CTA CTC AAC GAC TGA GCG-3´)

801

blaSPM-1 F5( 5`GCG TTT TGT TTG TTG CTC-3´)

R5(5`TTG GGG QATG TGA GAC TAC-3`)

786

Obtención de cepas

Siembra e identificación

Morfología

Pruebas bioquímicas Agar triple azúcar Citrato Oxidación-Fermentación (Hugh Y Leifson) Oxidasa

Suceptibilidad a antibióticos por Kirby-Bauer

Identificación de fenotipos de MBLs

Extracción de DNA

Identificación por PCR los genes de MBLs

Tinción de gram

29

Figura 2. Plan de trabajo

30

ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

La información se concentró en una base de datos de Excel y el análisis estadístico se

realizó con el programa SPSS 13.0. Las variables de estudio se colectaron en forma

numérica, se realizó estadística descriptiva (proporción de resistencia a carbapenémicos

y presencia de gen IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-1), por lo que se determinó la

frecuencia de cepas resistentes y su genotipo, los cuales se expresaron en porcentajes y

presentados en tablas. Se utilizó la prueba de ji cuadrada para determinar la asociación

entre las variables nominales. Se determino la frecuencia de cepas multiresistentes (> 3

antibióticos) por lugar de origen y se realizó ANOVA para determinar la diferencia

entre los diferentes hospitales y las cepas multiresistentes, acorde al teorema de

tendencia central se justifica el uso de la prueba t de una vía para ubicar

geográficamente la diferencia estadística de las cepas multiresistentes entre los

hospitales participantes.

ASPECTOS ÉTICOS.

Debido a que se utilizaron cepas aisladas de los pacientes con infección nosocomial y a

quienes se les realizó cultivos como parte de los procedimientos clínicos habituales, no

se realizó solicitud de autorización a los pacientes. Durante todo el estudio la

información se manejó de forma confidencial. El proyecto fue aprobado por la

Comisión Nacional de Investigación Científica IMSS con Registro 007-785-043 y en la

Secretaría de Salud autorización HRU 2007-2-SR-EP-INFECT-06.

31

RESULTADOS

Se incluyeron 239/253 cepas de P. aeruginosa, eliminándose 14 por contaminación; las

239 cepas incluidas tuvieron la siguiente distribución de los diferentes centros: 73 cepas

(30%) precedentes del Hospital Regional Universitario, 78 cepas (33%) del Hospital

General de Durango y 88 cepas (37%) del Centro Medico de Occidente de Guadalajara;

no se aislaron cepas nosocomiales en el IMSS Colima y Durango durante el periodo de

estudio.

La distribución respecto a la procedencia de las cepas por servicio hospitalario fue: 41%

(98/239) de Pediatría, 23% (54/239) de Cirugía, 22% (53/239) de Medicina Interna, 6%

(14/239) de Terapia Intensiva, 4% (10/239) de Cuidados Intensivos Neonatales, 3%

(8/239) de Urgencias y 1% (2/239) de Ginecología y obstetricia (Figura 3).

Figura 3. Cepas de P. aeruginosa aislada por servicio hospitalario.

3% 4% 6%

41%

22% 23%

1%0%5%

10%15%20%25%30%35%40%45%

Urg UCIN UTI Ped MI Cx GYO

Los perfiles de susceptibilidad a los antibióticos en forma global se muestran en la tabla

3, en donde los antibióticos que presentaron mayor resistencia fueron ampicilina con

sulbactam (99%), trimetoprin con sulfametoxazol (98%), cefotaxima (45%) y

ceftriaxona (48%).

32

Tabla 3. Patrones de sensibilidad a diversos antibiótico en cepas de Pseudomonas aeruginosa

en los hospitales de Colima, Durango y Guadalajara (n=253)

Resistente Intermedio Sensible

Amikacina 28% 2% 70%

Ampi/Sulbactam 99% 0% 1%

Aztreoam 10% 22% 68%

Cefepime 19% 3% 78%

Cefotaxima 45% 42% 13%

Ceftazidima 28% 5% 67%

Ceftriaxona 48% 32% 20%

Ciprofloxacina 22% 4% 74%

Gentamicina 23% 2% 75%

Imipenem 24% 2% 74%

Meropenem 20% 3% 77%

Piperacilina/Tazobactam 8% 0% 92%

TMP/SMX 99% 0% 1%

Ticarcilina c/ac Clav 33% 0% 67%

De las 239 cepas incluidas, y agrupando a las resistentes (62/237) junto con resistencia

intermedia (8/239), el 29% (70/239) se identificaron con fenotipo resistente a

carbapenémicos, con una distribución geográfica como sigue: Guadalajara 53% (37/70),

Colima 26% (18/70) y Durango 21% (15/62). Al realizar la identificación fenotípica de

metalo-β-lactamasas de estas cepas a través de la técnica modificada de Hodge (doble

disco), el 41% (29/70) se identificó como productoras de MBLs; mientras que por

prueba E-test se identificó al 47% (33/70) con el mismo fenotipo (Figura 4 y 5).

Figura 4. Interpretación fenotípica de metalo-β-lactamasas a través de la técnica de doble disco

33

Figura 5. Interpretación fenotípica de metalo- β-lactamasas a través de E-test

En la identificación de los diferentes genes de resistencia estudiados de estas 70

cepas de P. aeruginosa con patrón de resistencia a carbapenémicos, el 57% (40/70)

presentó al menos un gen productor de MBLs, con la siguiente distribución (Figuras 6 y

7):

• Cepas positivas a un solo gen: 25/40 (62.5%)

o IMP-1: 12 cepas

o VIM-1: 9 cepas

o VIM-2: 4 cepas

• Cepas positivas a dos genes diferentes: 13/40 (32.5%)

o VIM-2 + IMP-1: 8 cepas

o VIM-1 + VIM-2: 3 cepas

o VIM-1 + IMP-2: 1 cepa

o IMP-1 + VIM-1: 1 cepa

• Cepas positivas a tres genes diferentes: 2/40 (5%)

o IMP-1 + VIM-1 + VIM-2: 2 cepas

34

igura 6. Identificación de gen IMP-1 e IMP-2 en muestras procedentes de los hospitales de Colima,

igura 7. Identificación de gen VIM-1y VIM-2 en muestras procedentes de los hospitales de Colima,

uadalajara y Durango.

cepas positivas para el gen SPM-1. Llama la atención que la

ayoría de las cepas con más de un gen positivo a producción de MBLs proceden de un

800 pb 700 pb 600 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 100 pb

IMP-1

IMP-2

F

Guadalajara y Durango.

800 pb 700 pb 600 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb

VIM-1

VIM-2

F

G

No se identificaron

m

tercer nivel de atención (Guadalajara), como se muestra en la tabla 4.

35

Tabla 4. Distribución de los genes productores de MBLs respecto a la ciudad de

procedencia de cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos (n=40)

Gene identificado Guadalajara Colima Durango

VIM-1 6 - 3

VIM-2 4 - -

IMP-1 3 9 -

VIM-1 + IMP-2 1 - -

VIM-1 + VIM-2 3 - -

IMP-1 + VIM-2 7 1 -

IMP-1 + VIM-1 1 - -

IMP-1 + VIM-1 + VIM-2 2 - -

Los patrones de susceptibilidad a los diferentes grupos de antibióticos en cada uno de

los hospitales participantes mostraron una similitud en la prevalencia de resistencia

hacia algunos de ellos como aminoglucósidos, cefalosporinas de tercera generación e

inhibidores de β- lactamasas; aunque se observó diferencias en la prevalencia individual

entre cada antibiótico principalmente en amikacina, cefotaxima, ceftriaxona, cefepime,

imipenem, meropenem y ticarcilina con ácido clavulánico (Tabla 5 a 7). Siendo las

cepas con mayor resistencia las del Centro Médico de Occidente de Guadalajara.

Tabla 5. Patrones de sensibilidad a diversos antibióticos en cepas de

P. aeruginosa del HRU en Colima (n=73)





Cefepime 15% 2% 84%






Imipenem 18% 3% 79%

36



TMP/SMX 96% 0% 4%


Tabal 6. Patrones de sensibilidad a diversos antibióticos en cepas de

P. aeruginosa de Hospital General de Durango (n=78)




Aztreoam 1% 22% 77%

Cefepime 1% 5% 93%






Imipenem 19% 0% 81%

Meropenem 4% 1% 95%


TMP/SMX 100% 0% 0%


Tabla 7. Patrones de sensibilidad a diversos antibióticos en cepas

de P. aerugionsa de CMO en Guadalajara (n=88)





Cefepime 38% 2% 60%






37

Imipenem 34% 2% 64%



TMP/SMX 100% 0% 0%


Las sensibilidades intermedias in vitro se interpretaron como resistentes, debido a que

en las decisiones clínico-terapéuticas son considerados resistentes; por lo que las

proporciones de resistencia a cefalosporinas de tercera generación fue 83%, a

aminoglucósidos 30% y carbapenémicos 25%. Se realizaron comparaciones con ji

cuadrada entre el tipo de hospital y los perfiles de susceptibilidad para cada uno de los

antibióticos utilizados (Tabla 8).

La comparación entre un hospital de segundo nivel (Hospital Regional Universitario de

Colima) versus de tercer nivel (Centro Médico de Occidente de Guadalajara) mostraron

una diferencia estadística significativa en la resistencia con los siguientes antibióticos:

amikacina (p=0.000), cefepime (p=0.001), ceftazidima (p=0.002), meropenem

(p=0.001), trimetopin con sulfametoxazol (p=0,0366) y ticarcilina con ácido clavulánico

(p=0.02); en el caso de la comparación del Hospital General de Durango versus el

Hospital Regional Universitario de Colima (ambos de segundo nivel de atención)

presentaron diferencia estadística significativa en la resistencia con amikacina

(p=0.010) y meropenem (p=0.008). Las comparaciones del Centro Médico de Occidente

contra el Hospital General de Durango revelaron una diferencia estadística significativa

en la resistencia con aztreonam (p=0.014), cefepime (p=0.000), ceftazidima (p=0.000),

gentamicina (p=0.028), meropenem (p=0.014) y ticarcilina con ácido clavulánico

(p=0.007).

Tabla 8. Comparación de los antibióticos entre cada uno de los hospitales participantes

Colima vs Guadalajara Durango vs Colima Guadalajara vs Durango

ji cuadrada valor de p ji cuadrada valor de p ji cuadrada Valor de p

Amikacina 18.3752 0.000 6.647 0.010 3.336 0.068

Amp Sulbactam 2.441 0.204* 0.411 0.475* 1,135 0.470*

Aztreonam 2.009 0.156 0.965 0.326 5.991 0.014

Cefepime 10.510 0.001 3.796 0.051 25.164 0.000

Cefotaxima 5.364 0.021 2.290 0.130 0.610 0.435

38

Ceftazidima 9.935 0.002 0.174 0.677 13.127 0.000

Ceftriaxona 3.174 0.075 0.644 0.422 0.945 0.331

Ciprofloxacina 1.204 0.273 0.288 0.592 0.315 0.575

Gentamicina 1.827 0.176 0.659 0.417 4.851 0.028

Imipenem 4.828 0.028 0.041 0.839 5.98 0.014

Meropenem 10.514 0.001 7.089 0.008 31.682 0.000

Piperacilina con

tazobactam

0.018 0.893 1.111 0.292 1.489 0.222

Trimetropin con

slufametoxazol

3.685 0.055* 3.27 0,111* NR NR

Ticarcilina con ac

clavulánico

4.921 0.027 0.182 0.670 7.246 0.007

NR = Sin registro

* = Realización de prueba exacta de Ficher

Se identificaron el 79% (189/239) de las cepas aisladas como cepas multiresistentes (> 3

antibióticos); considerando la diferencia estadísticamente significativa obtenidas por ji

cuadrada, se realizó el análisis de varianza de un factor para comparar la frecuencia de

resistencia entre los hospitales participantes y el lugar de procedencia, donde se revela

que Colima tuvo valores estadísticamente significativos (p=0.009) y menor frecuencia

(43/189) de cepas multiresistentes; ya que la probabilidad del evento (67%) es mayor

del 50% de acuerdo al teorema de limite central, por lo que se justifica la utilización de

estadística paramétrica y a través de la prueba t para dos muestras con varianzas iguales

(t = -1,79) revelaron que las tasas de multiresistencia son estadísticamente significativas

(p< 0.03) por la zona geográfica entre Colima versus Durango y Guadalajara (Figura 8).

Figura 8. Comparación de la frecuecnia de cepas multiresistentes entre los difrentes hospitales participantes

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

COLIMA DURANGO GUADALAJARA

Frec

ueci

a

* *

ANOVA * Prueba F = 4.70 p=0.009

*

39

DISCUSIÓN

Desde la introducción de las cefalosporinas de tercera generación en el tratamiento de

enfermedades infecciosas, la prevalencia de resistencia en cepas de Pseudomonas

aeruginosa y del resto de las Enterobacterias se ha incrementando constantemente. (Castanheira 2008) El mecanismo de resistencia mediado por B lactamasas de espectro

extendido puede ser secundario a la presencia de plásmidos o de cromosomas que posen

genes que producen cantidades importantes de estas enzimas tales como

cefalosporinasas que condicionan resistencia a cefalosporinas y carbapenémicos. Los

genes involucrados en estos mecanismos de resistencia pueden ser trasferidos

fácilmente y aunado al incremento de resistencia a otros tipos de antibióticos

condicionan que los esquemas empíricos convencionales resulten inapropiados para el

tratamiento inicial de pacientes en los que las Pseudomonas tienen un papel importante.

Los genes que codifican para la producción de β-lactamaas pueden estar localizados en

el cromosoma bacteriano, plásmidos o tranposones y su expresión puede ser de tipo

constitutivo o inducible por lo que es necesario realizar la identificación de los mismos. (Courvalin, 2001; McGowan, 2006)

La prevalencia de cada gen de MBLs es variable, debido a la gran diversidad de

subtipos que existen y que se describen actualmente, pero no debemos olvidar que la

mayoría son derivados de los primarios IMP-1, IMP-2, VIM-1 y VIM-2.(Sasha, 2008) La

prevalencia en la producción de MBLs en cepas de P. aeurginosa es muy variable entre

los diferentes tipos de hospital y países; se reporta prevalencias que van del 2% al 39%

en países como Japón (Sasaki, 2004), India (Gupta, 2006; Navaneeth, 2002), Polonia (Fiett, 2006), Italia (Logatolla, 2004) y Canada (Laupland, 2005). En nuestro estudio la frecuencia de genes de MBLs

(57%) es muy similar a la cifra estimada para el 2002 del programa SENTRY en países

latinoamericanos (56%). (Frietche, 2005).

La prevalencia de gen IMP-1 en Japón del año 2000 a la fecha ha sido de 1 al 4.4% en

las cepas de P. aeruginosa, mientras que en Corea el VIM-2 tiene una frecuencia del

95%. En el sur de Europa ha predominado el VIM-1 (especialmente en Italia) con un

6.5 %; Alemania en el 2002 reportó la prevalencia de IMP-1 del 43% seguido de IMP-6

e IMP-4, mientras que VIM-1, VIM-4 y VIM-5 se han encontrado en un 29% de las

40

cepas (Castanheira, 2004) En América del Norte (EUA y Canadá) los reportes existentes

muestran la presencia de diferentes subtipos de IMP (IMP-7, IMP-18) y VIM (VIM-7,

VIM-2); aunque en cepas de Chicago y Texas el VIM-2 ha permanecido como el más

frecuente desde el 2001. Mientras que en América del Sur la identificación de VIM-2 ha

sido del 31% y de IMP-1 de 8.3%. (Villegas, 2006)

En estudios que han caracterizado los mecanismos moleculares de resistencia mediados

por los genes MBLs (principalmente IMP y VIM), han determinado que estos se

encuentran insertados en los integrones de clase I, transposones o plásmidos, elementos

que pueden ser transferidos a otras especies de gram negativos. (Waldehagen, 2004) Los

elementos genéticos movibles que contienen los integrones son fuente importante para

diseminarse los genes bla. Los integrones no son movibles pero su localización con

elementos genéticos movibles (plásmidos, transposones) permiten ese movimiento. Los

genes de β-lactamasas son localizados en integrones y frecuentemente son acompañados

por genes que codifican resistencia a diversos antibióticos. En el caso de MBLs son

localizados en los integrones tipo 1 y 3 y tienen capacidad de que se inserten plásmidos

o transposones al cromosoma bacteriano. (Pournaras, 2002; Sasha, 2008) Aunque recientemente se

ha descrito otro mecanismo de adquisición de dichos genes que es por regiones

comunes, esto ha sido asociado con otras elementos movibles denominados regiones

SXT y cuando se asocian dos regiones comunes se les ha denominado elementos IS

(ISCR). (Toleman, 2006; Toleman, 2002)

Los genes IMP-1 y VIM-1 se localizan en el cromosoma bacteriano; mientras que IMP-

2, VIM-2 y SPM-1 se encuentran en plásmidos. (Sacha 2008) Con este hecho se puede

suponer que las cepas que presentaron más de un gen tienen mayor afinidad en el sitio

de integración del casete integrándolo como propio y además permitiendo el acceso a

más plásmidos o transposones conteniendo genes de resistencia y que estos a su vez

puedan transferirse a otro tipo de bacteria creando clonas altamente virulentas y

resistentes. (Livermore, 2006) Osman, Fiett y Cheng identificaron cepas con más de un gen

de MBLs. El análisis molecular de estas cepas mostró la presencia de genes de tipo

VIM y en 45% de ellas además se encontró el gen IMP-1 en un integrón. (Cheng, 2008; Fiett,

2006; Osman, 2007)

41

Dentro de los patrones de resistencia a diversos antibióticos se encontró que los grupos

que presentaron mayor resistencia fueron las cefalosporinas de tercera generación,

carbapenémicos y aminoglucósidos. Comparando los datos con los reportados por la

NNIS (National Nosocomial Infections Survillance) de EUA las tasas de resistencia

hacia las cefalosporinas de tercera generación, carbapenémicos y quinolonas fue mayor

en este estudio.(McGowan, 2006) Este fenómeno que antes era especifico en las unidades de

cuidados intensivos se ha diseminado ha otras áreas de hospitalización creando datos

alarmantes en la morbi-mortalidad de cada hospital; un caso particular fue reportado en

Nueva York donde el 56% de las cepas nosocomiales fueron resistentes a

ciprofloxacina.(Bratu, 2005) Para Latinoamérica el incremento de resistencia hacia los

carbapenémicos ha sido mayor que en EUA. Andrade y cols reportaron que la

prevalencia en resistencia hacia meropenem se ha incrementado de un 17% en 1997 a

un 36% en el 2001, así como hacia los β-lactámicos, aminoglucósidos y

quinolonas.(Andrade, 2003) Específicamente, P. aruginosa tiene facilidad para desarrollar

resistencia hacia los antibióticos β-lactámicos, debido a la expresión de β-lactamasas

AmpC codificadas cromosomalmente las cuales contribuyen de manera intrínseca al

rápido desarrollo de resistencia hacia β-lactámicos, contribuyendo a la adquisición o

mutación para la expresión de bombas de flujo hacia cefalosporinas, quinolonas,

aminoglucósidos y carbapenémicos; aunque la mayoría de la resistencia hacia los

carbapenémicos causadas por MBLs es por pérdida de porinas. Este párrafo no se

entiende, porque la expresión de AmpC contribuye a la adquisición o mutación para la

expresión de bombas de flujo, creo que es un problema de traducción (Hancock, 2000; Hawkey,

2004; Livermore, 2006)

El reporte de SETNRY en el periodo de 2001 a 2004 reveló que en América Latina y

Europa es mayor la resistencia a los antibióticos que en EUA y Asia del Pacífico. Las

cifras de resistencia a los antibióticos de manera global hacia cefalosporinas,

carbapenémicos y aminoglucosidos son similares a las cifras que reportaron para

Europa, solo en el caso de la piperacilina con tazobactam se encontró por debajo de lo

reportado y con ciprofloxacina la prevalencia reportada por EUA fue similar a la

obtenida en el estudio. (Gales, 2006)

Los reportes de SENTRY sobre las prevalencias de resistencia a diversos antibióticos en

América Latina son similares a lo encontrado en el estudio en el hospital de tercer nivel

42

de atención, pero en el caso de los hospitales de segundo nivel las cifras de resistencia

son similares a las reportadas por EUA y Asia.

Con los resultados obtenidos observamos que la frecuencia de resistencia a

carbapenémicos (25%) está dentro de lo reportado; pero es superior a la resistencia

reportada en hospitales de EUA, e inferior a la países como Canadá, Italia, Japón,

Polonia y Corea (Fiett, 2006; Lagatolla, 2004;Leupland, 2005; Kim, 2005; Kimura, 2005) .

Dentro de los reportes a nivel nacional la prevalencia de resistencia a cefalosporinas y

carbapenémicos está dentro de los reportado en la literatura; como en el caso de

Pacheco y cols en 2006 en un hospital de tercer nivel reportaron la resistencia de 35% a

imipenem y 12% a meropenem y Castillo y cols en 2006 en el Hospital la Raza con una

resistencia de ≈45% a ceftazidima, cefepima, aztreonam e imipenem. (Castillo, 2006)

El estudio TRUST (Tracking Resitance in the United States Today), ha reportado que la

multirresistencia (> 3 antibióticos)en cepas de P. areuginosa se ha incrementado en los

últimos años desde un 7.2% reportado en 2001 a 9.9% en 2003; este aumento fue en un

promedio del 22% hacia cuatro antibióticos específicamente (ceftazidima, imipenem,

gentamicina y ciprofloxacina o levofloxacina). (Landmann, 2005) En comparación con el

estudio encontramos similitudes en la multiresistencia hacia ceflosporinas,

aminoglucósidos, quinolonas y carbapenémicos. Las diferencias en las frecuencia de la

multiresistencias es debidas ha la zona geográfica, tipos de paciente y probablemente a

los esquemas terapéuticos que se utilizan en cada una de las instituciones.

El inicio de tratamientos empíricos inadecuados y el no realizar modificaciones en los

mismos son factores predisponentes en el aumento de la morbimortalidad en los

hospitales, así mismo estos son focos de diseminación de la cepa en los diferentes sitios

de hospitalización por los cuales ingresa el paciente y potenciando la limitación

terapéutica. El uso de piperacilina con tazobactam, cefepime, imipenem o meropenem

se han tomado como opciones terapéuticas empíricas en la unidades de cuidados

intensivos en EUA y por consecuencia han sido factor en el incremento de la resistencia

por P. aeruginosa (Bath, 2007; Rossolini, 2005). Bath y cols concluyeron que en las infecciones

en las cuales inician esquemas antimicrobianos empíricos con base en piperacilina con

tazobactam y/o cefepime del 21% al 26% de las P. aeruginosa son resistentes a estos

43

antibióticos y en un 18% de los casos era innecesario acorde al germen aislado. (Bhat, 2007)

Gupta en el 2008 sugiere que aquellas cepas de P. aeruginosa multiresistentes se les

inicie un esquema con dos antibióticos de diferente familia cefalosporina + quinilona o

cefaloporina + aminoglucósido o monobatam + polimixina B; ya que si la cepa fuese

productora de MBLs no permitirá que se diseminara más su resistencia a cepas

susceptibles a carbapenémicos.(Gupta, 2008)

El conocimiento de la epidemiología y de los perfiles de susceptibilidad a antibióticos

propios de cada unidad hospitalaria es de gran utilidad ya que proporciona herramientas

sólidas a los médicos responsables de la toma de decisiones en el manejo de pacientes

con infecciones graves. Así mismo el conocimiento de los mecanismos moleculares de

resistencia proporciona elementos sólidos para que los comités de prevención y control

de infecciones nosocomiales y de uso de antimicrobianos puedan establecer medidas de

control y prevención de diseminación de cepas resistentes y multiresistentes.

44

CONCLUSIONES

La prevalencia de cepas de Pseudomonas aeruginosa productoras de MBLs se

encuentra dentro de los parámetros esperados y descritos en la literatura internacional.

Se demostraron cepas de Pseudomonas aeruginosa con detección de más de un gen a

MBLs.

Existe diferencia significativa en los patrones de resistencia hacia carbapenémicos,

aminoglucósidos e inhibidores de β-lactamasas entre los hospitales de segundo y tercer

nivel de atención.

Los datos obtenidos en este estudio sobre la identificación de estos genes permiten dar

un panorama de este fenómeno en nuestro país.

PRESPECTIVAS

En las cepas que se les identificó más de un gen es conveniente realizar la identificación

del plásmido, integrón o secuenciación de los fragmentos de gen integrados para definir

su mecanismo de origen.

En aquellas cepas que resultaron negativas a producción de MBLs pero resistentes a

carbapenémicos explorar aquellos genes que están confiriendo esa resistencia como es

el caso de las carbapenemasas de clase A (KPC, IMI/NCM, SME y GES) y clase D

(OXA)

45

GLOSARIO

Amplicón: regiones de DNA que tienen potencial para ser amplificadas.

Clona: es un conjunto de individuos genéticamente idénticos que descienden de un

mismo individuo por mecanismos de reproducción asexual.

B-lactamasa: Enzima que cataliza la hidrólisis del anillo betalactámico de algunas

penicilinas y cefalosporinas, con formación de ácido penicilínico y pérdida de eficacia

del antibiótico

Hemolisinas: Cualquiera de las numerosas sustancias que lisan o disuelven los

hematíes. Las hemolisinas están producidas por cepas de muchas clases de bacterias,

incluidos algunos estafilococos y estreptococos. También están presentes en venenos y

en ciertos vegetales.

Integrón: se encuentra en los plásmidos, comosomas y transposones del sistema de

captura de genes. Piezas de DNA llamadas casetes cromosómicos que puedens se

incorporados, expresados y dieminados.

Peptidoglucano: El peptidoglucano o mureína es un heteropolímero formado por una

secuencia alternante de N-acetil-glucosamina y el ácido N-acetilmurámico unidos

mediante enlaces ß-1,4. La cadena es recta y no ramificada. Constituyendo la estructura

básica de la pared celular de las bacterias.

Piocianina: Pigmento azul o verde azulado que puede ser extraído de Pseudomonas

aeruginosa con cloroformo.

Pioverdina: Pigmento amarillo producido por algunas cepas de Pseudomonas

aeruginosa.

Plásmido: cualquier tipo de inclusión intracelular que se considera tiene una función

genética, especialmente una molécula de ADN procedente del cromosoma bacteriano

http://es.wikipedia.org/wiki/Pol%C3%ADmero

http://es.wikipedia.org/wiki/Pared_celular

http://es.wikipedia.org/wiki/Bacterias

46

que determina rasgos no fundamentales para la viabilidad del organismo, aunque de

algún modo cambia la capacidad del organismo para adaptarse.

Porina: son proteínas que se encuentran en la membrana celular y actúan como poros

que permiten el paso de moléculas.

47

ANEXOS

48

ANEXO 1

Tinción de Gram: El procedimiento para la tinción de Gram distingue 2 grupos de

células. Las que retienen el colorante primario son llamadas “Gram positivo” y las que

pierden el color primario y toman otro colorante de contraste, llamadas “Gram

negativas”. El mecanismo se basa en las características fisicoquímicas de las estructuras

de la pared celular de los microorganismos.

- Procedimiento:

1. Preparar y fijar un frotis de la muestras por analizar pasándola

suavemente en la flama del mechero.

2. Cubrir con colorante de violeta de genciana. Esperar 1 minuto.

3. Escurrir el colorante de violeta de genciana sin enjuagar y cubrir

con solución Gram yodo. Esperar 1 minuto.

4. Lavar con solución de alcohol acetona hasta decoloración.

5. Sacudir para evaporar el resto de alcohol acetona.

6. Cubrir el frotis con colorante de safranina. Esperar 1 minuto.

7. Lavar repetidas veces con agua corriente hasta que no haya

restos del colorante.

8. Secar al aire y observar al microscopio de luz.

49

ANEXO 2

Pruebas bioquímicas: se inoculara una colonia en los siguientes medios:

1. Tubos inclinados con agar hierro triple azúcar (TSI) e incubadas de 18 a 24 h en

incubadora a 37º C.

Las reacciones sobre TSI en tubos inclinados pueden ser: 1) superficie inclinada

alcalina/profunda alcalina (ausencia de fermentación de carbohidratos), 2) superficie

inclinada alcalina/profundidad ácida (fermentación de glucosa; ausencia de

fermentación de lactosa), 3) superficie inclinada alcalina/profundidad ácida

(fermentación de glucosa; ausencia de fermentación de lactosa, producción de H2S y 4)

superficie inclinada ácida/profundidad ácida (fermentación de glucosa y

lactosa).(MacFaddin, 2003)

2. Utilización De Citrato: El principio de la prueba de utilización del citrato es

determinar la capacidad de un microorganismo para usar citrato de sodio como

única fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento. (Koneman, 2001)

El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que se

encuentra como uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de

Krebs). Algunas bacterias pueden obtener energía de fuentes distintas a la fermentación

de los carbohidratos, con el citrato como única fuente de carbono. La medición de estas

características es importante para identificar muchos miembros de la familia

Enterobacteriaceae. Cualquier medio usado para detectar la utilización del citrato por

las bacterias a probar debe carecer de proteínas y carbohidratos como fuente de

carbono.(Koneman, 2001)

La utilización del citrato por la bacteria en prueba se detecta en el medio de citrato por

la producción de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, que es un

anión, como única fuente de carbono, y fosfato de amonio como única fuente de

50

nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoníaco NH3 lo que lleva a la

alcalinización del medio por conversión del HN3 a hidróxido de amono (NH4OH). El

indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6.0 y azul por

encima de pH 7.6. (Koneman, 2001)

La prueba positiva está representada por la producción de un color azul oscuro que

indica que el microorganismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en

el medio, con formación de productos alcalinos. También puede leerse la prueba como

positiva sin que haya color azul si hay desarrollo visible en la estría de inoculación. Esto

es válido para que el desarrollo sea visible el microorganismo debió haber ingresado en

la fase logarítmica de crecimiento, lo que sólo es posible si ha asimilado carbono y

nitrógeno. Una interpretación positiva, basada en la lectura del trazo es incubando el

tubo durante 24 hrs más, momento en el que desarrolla el color azul.(Koneman, 2001)

3. Prueba De Oxidación-Fermentación (Hugh Y Leifson): Los microorganismos

sacarolíticos degradan la glucosa, ya sea por la vía fermentativa u oxidativa. Los

productos finales de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que

pueden ser detectados por las pruebas convencionales de fermentación. Sin

embargo, los ácidos formados en la degradación oxidativa de la glucosa son en

extremo débiles y para detectarlos es necesario el medio más sensible de oxidación-

fermentación de Hugo y Leifson (medio OF). (Koneman, 2001)

La baja relación proteína/carbohidratos reduce la formación de aminas alcalinas que

pueden neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles que pueden formarse a

partir del metabolismo oxidativo. Las cantidades relativamente elevadas de

carbohidratos sirven para aumentar la cantidad de ácido que puede formarse. La

consistencia semisólida del agar permite que los ácidos que se forman en su superficie

se difundan a través del medio; esto facilita la visualización del cambio de pH del

indicador. En este medio también puede observarse la motilidad. (Koneman, 2001)

51

La producción de ácidos se detecta en el medio por la partición de un color amarillo. En

el caso de microorganismos oxidativos, la producción de color se puede notar en primer

lugar cerca de la superficie de medio. Los patrones de reacción son los siguientes:

Tubo abierto Tubo cubierto Metabolismo

Ácido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo

Ácido ( amarillo) Ácido (amarillo) Fermentativo

Alcalino (verde) Alcalino (verde) No sacrolítico

52

ANEXO 3

Susceptibilidad a diversos antibióticos:

- Procedimiento:

- Una muestra de la cepa menor a 24 horas de su siembra será suspendida en

un tubo de vidrio estéril de 100 x 75 conteniendo 3 ml de solución salina

estéril y la turbidez se ajustó a una densidad correspondiente a 0.5

McFarland, la cual fue agitada en Vortex.

- Dentro de los 15 minutos posteriores al ajuste de turbidez a 0.5 McFarland

de la suspensión del inóculo, se introducirá un hisopo de algodón estéril en

la suspensión ajustada. El hisopo será girado y presionado en la pared

interior del tubo para quitar el exceso de líquido.

- Con el hisopo se estriará por agotamiento sobre la superficie seca del agar

Müller Hinton. Al final se pasa el hisopo alrededor de la orilla de la placa

con agar.

- La placa inoculada se dejarán en reposo durante 3-5 minutos pero no más de

15 para que seque la superficie del agar antes de agregar y colocar los discos

de antibióticos.

- Se colocaron las placas invertidas a una temperatura de 35° C por 18 horas.

- Transcurrido el tiempo de incubación, cada placa fue revisada desde su área

frontal, la zona de inhibición debían ser uniformemente circular y un

crecimiento confluente. Si hay colonias independientes, el inóculo fue pobre

y la prueba debe ser repetida. La zona de inhibición (en mm) se medirá con

un vernier con una adecuada iluminación y sin la tapadera de la caja petri. El

tamaño de las zonas de inhibición en mm serán interpretados de acuerdo a

los criterios del CLSI de E.U.A.

53

ANEXO 4

Determinación del fenotipo a metalo-B-lactamasas (MBL)

Prueba de doble disco: Se ajustará con espectrofotometría de la suspensión bacteriana

a λ625nm D.O. 0.08-0.1. Posteriormente se impregnarán los discos de papel filtro con

10μl de solución de EDTA 0.5M pH 8.0 y colocar a 1 cm de distancia de borde a borde

de los discos de imipenem, meropenem y ceftazidima, una deformación de halo,

aumento debido a al EDTA indica producción de MBLs positiva. (Walsh, 2005) (Figura 2)

Figura 9. P. aeruginosa con presencia de MBLs por medio de técnica de triple disco.

Prueba de E-test: la prueba consiste en colocar una cintilla (5 x 60mm) calibrada con

la escalas de lectura en μg/ml par determinar en cada extremo su gradiente de

concentración. Contiene concentraciones de imipenem de 4 a 256 μg/ml y de imipenem

+ EDTA con concetaciones de 1 a 64 μg/ml (Figura 10)

Figura 10. Estuctura de tira E-test

54

Procedimiento:

- Una muestra de la cepa menor a 24 horas de su siembra será suspendida en

un tubo de vidrio estéril de 100 x 75 conteniendo 3 ml de solución salina

estéril y la turbidez se ajustó a una densidad correspondiente a 0.5

McFarland, la cual fue agitada en Vortex.

- Dentro de los 15 minutos posteriores al ajuste de turbidez a 0.5 McFarland

de la suspensión del inóculo, se introducirá un hisopo de algodón estéril en

la suspensión ajustada. El hisopo será girado y presionado en la pared

interior del tubo para quitar el exceso de líquido.

- Con el hisopo se estriará por agotamiento sobre la superficie seca del agar

Müller Hinton. Al final se pasa el hisopo alrededor de la orilla de la placa

con agar.

- La placa inoculada se dejarán en reposo durante 3-5 minutos pero no más de

15 para que seque la superficie del agar y colocar la tira E-test.

- Se colocaron las placas invertidas a una temperatura de 35° C por 18 horas.

- Transcurrido el tiempo de incubación, cada placa fue revisada desde su área

frontal y comparar las zonas de inhibición acorde al instructivo del

fabricante (AB BIODISK) o en caso contrario medir las comparaciones de

CMI entra cada extremo de la tira (Figura 11).

Figura 11. Métodos de interpretación de E-test

55

ANEXO 5

Extracción de DNA: Para la extracción de DNA de las bacterias se realizará el

siguiente procedimiento: se tomarán dos colonias de un cultivo de 18 a 24 h de

crecimiento, en agar sangre de carnero al 5%, se colocarán en caldo soya tripticasa y se

crecerán en agitación constante a 35° C durante dos horas. Se realizará un lavado de la

bacteria y la extracción se completa con el UltraCleanTM Microbial DNA Kit (MO Bio

Laboratories, Inc. Solana Beach, CA) (Figura 3). Habitualmente la concentración

obtenida con esta técnica es de 200 ng/μl. La concentración de DNA será corroborada

corriendo una muestra del DNA en geles de agarosa con un marcador de peso molecular

como control. El DNA se conservará en congelación a -20° C, manteniéndose estable

por aproximadamente 12 meses.(Mo Bio Laboratories)

Figura 12. Componentes del kit Ultra Clean para extracción de DNA en bacterias.

Procedimiento:

1. De un cultivo de 24 horas de P. aerugina raspe con ayuda de una asa

bacteriológica las colonias del cultivo y suspenda en 1.5 ml de agua destilada en

un tubo de 1.9 ml (de los que se encuentran en el kit); centrifugue a 10,000 RPM

por 30 segundos. Decante el sobrenadante y centirfuge na vez más por 30

segundos; vuelva a decantar el sobrenadante completamente con ayuda de un

pipeta.

2. Resuspenda el sedimento de células en 300 μl de la solución MicroBead y agite

en el vórtex a una velocidad media. Transfiera las células resuspendidas a un

tubo MicroBead.

3. Agregue 50 μl de solución MD1 al tubo MicroBread.

56

4. Asegure los tubos horizontalmente usando un adaptador en el vórtex para

sotener los tubos y agitelos a su máxima velocidad por 10 minutos.

5. Centrifugue los tubos a 10,000 RPM por 30 segundos. Con la precaución de no

exceder las RPM ya que los tubos pueden romperse.

6. Transfiera el sobrenadante un tubo limpio para microcentrífuga (de lo que se

encuentran en el kit).

7. Llegara a obtener de 300 a 350 μl de sobrenadante.

8. Agregue 100 μl de la solución MD2, l sobrenadante. Agite en vórtex por 5

segundos y posteriormente incubelos por 5 minutos a una temperatura de 4º C.

9. Centrifugue los tubos por 1 minuto a 10,000 RPM.

10. Deseche el sedimento, trasfiera el volumen entero de sobrenadante a un tubo

limpio de 1.9 ml (de los que se encuentran en el kit). Esperando un volumen

aproximado de 450 μl.

11. Agregue 900 μl de solución MD3 al sobrenadante y agite en el vórtex por 5

segundos.

12. Agregue 700 μl dentro del foltro y centrifugue a 10,000 RPM por 30 segundos.

Decante todo el filtrado, y agregue al filtro más sobrenadante, vuelva a

centrifugar a 10,000 RPM por 30 segundos. Nota: se requier un total de 2 a 3

filtrados. Decante todo el líquido filtrado.

13. Agregue 300 μl de solución MD4 y centrifugue a 10,000 RPM por 30 segundos.

14. Desecante todo el filtrado

15. Centrifugue por un minuto

16. Retire con cuidado el filtro y póngalo en un tubo nuevo de 1.9 ml (de los que se

encuentran en el kit).

17. Agregue 50 μl de solución MD5 en el centro de la membrana blanca del filtro.

18. Centrifugue por 30 segundos.

19. Descarte el filtro. El DNA en el tubo esta listo para cualquier aplicación. Se

recomienda almacenarlo a -20º C.

57

ANEXO 6

Identificación de genes MLBs:

Mezcla de reacción:

• Utilizar tubos de pared delgada y estériles

Reactivo Volumen (μl) [ n ] Final

Buffer 2

Mg 1

dNTPS 0.5

Taq DNA pol (0.05 U/μl) 0.1

Primer F (10μM) 0.7

Primer R (10μM) 0.7

DNA 0.5

H2O (libre RNAasa) 14.4

Total 20

Muestras analizar

Muestra Notas

58

Programa de PCR en termociclador: 94° C por 3 minutos, seguido de 38 ciclos a 94° C

por 30 segundos, alineamientos de 50° C por 40 segundos y extensión de 72° C por 40

segundos, para terminar con 5 minutos de incubación.

Se analizó por electroforesis en gel de agarosa 1% en TAE (Trisacetato-EDTA) 1x a 85

Volts durante una hora y media y la muestras fueron cargadas con syber safe (2 μl) con

10 μl de la muestra obtenida por PCR. Posteriormente se visualizaron por

transiluminación en lámpara UV.

59

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60

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AGRADECIMIENTOS

Unidad de Investigación Biomédica IMSS Durango

M en C Irma Ramirez

QFB Yvain Salina

Hospital General de Durango

Dr. Juan Carlo Tinoco

Tec Lab Lorena Salcido

Centro de Investigación Biomédica

D en C Alberto Villaseñor

D en C Mayra Quiñones

M en C Martha Carranza

Hospital Regional Universitario

Dra Claudia Torres

QFB Lorena Garcia

QFB Zoila Carrillo

Laboratorio Estatal de Salud Pública

QFB Sergio Medina

Facultad de Medicina

D en C Iván Delgado

M en C Ignacio Ángel

M en C Héctor Galván

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