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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS
II M O D U L A C I O N A D R E N E R G I C A
D E L A T E N S I O N P R O D U C I D A P O R K+
Y D E L O S C A N A L E S D E Ca 2+ E N L A S
FIBRAS M U S C U L A R E S L E N T A S D E L P O L L O
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOREN CIENCIAS
CON LA ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA
P R E S E N T A
M en C. XOCHITL ANGÉLICA
R O S I O T R U J I L L O T R U J I L L O
DIRECTOR DE TESIS: Dr. MIGUEL HUERTA VIERA
COLIMA, COLMA, FEBRERO DE 1997.
1
ÍNDICE
PARTE 1
1. INTRODUCCION........................................... 5
1.1. TIPOS DE FIBRAS QUE COMPONEN A LOS MÚSCULOS
ESQUELETICOS...........................................5
1.2. ESTRUCTURA DE LAS FIBRAS MUSCULARES.......................7
1.3. RESPUESTA MECÁNICA ANTE SOLUCIONES CON ALTO
CONTENIDO DE POTASIO,................................ 8
1.4. ACOPLE ENTRE LA EXCITACIÓN y LA CONTRACCIÓN......... 10
1.5. TIPOS DE HIOSINA EN LAS FIBRAS MUSCULARES
ESQUELETICAS.................................................12
1.6. EFECTO DE LA ADRENALINA SOBRE LA CONTRACCIÓN
MUSCULAR ............................................14
1.7. EL SISTEMA NERVIOSO AUTÓNOMO......................15
1.8. RECEPTORES ADRENÉRGICOS.................................20
1.9. PAPEL DEL AMP'c SOBRE LA CONTRACCIÓN MUSCULAR.......... 27
PROLOGO .................................................4
1.10. ANTECEDENTES INMEDIATOS...........................................................28
1.11. MÉTODO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............ 32
1.12. RESULTADOS..................................... 37
1.12.1. RESPUESTA MECÁNICA DE LAS FIBRAS MUSCULARES
LENTAS A DISTINTAS CONCENTRACIONES
DE K+ EXTERNO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
1.12.2. MODULACION ADRENERGICA DE LA TENSION
INDUCIDA POR K+. . . . . . . . . . . . . .............. . . . . . . . . 42
1.12.3. BLOQUEO DE LA MODULACION ADRENERGICA
DE LA TENSION . . . . . . . ....................... 46
1.12.4. MODULACION DE LA TENSION POR ISOPROTERENOL . . . . . . 48
1.12.5. MODULACION DE LA TENSION POR AMPc................ 51
1.12.6. MODULACION ADRENERGICA DE LA TENSION
PRODUCIDA POR CAFEINA . . ............................. 53
PARTE II
II. INTRODUCCION ......................................... 57
11.1. PROPIEDADES ELECTRICAS DE LA MEMBRANA DE
LAS FIBRAS LENTAS DEL MUSCULO ALD DEL POLLO........57
11.2. CANALES DE Ca2+ .................................... 58
11.2.1. TIPOS DE CANALES DE Ca2+.........................62
11.3. ESTRUCTURA DEL CANAL DE Ca 2+ .......................66
11.4. PROTEINAS G Y LOS CANALES DE CALCIO................70
11.5. ANTECEDENTES INMEDIATOS............................74
3
11.6. MÉTODO ............................................. 76
11.6.1. HICROELECTRODOS.................................. 81
11.6.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL........................... 82
11.6.3. ANÁLISIS ......................................... 84
11.7. RESULTADOS.........................................85
11.7.1. POTENCIALES DE BARIO EN LAS FIBRAS LENTAS........ 85
11.7.2 CORRIENTE ENTRANTE DE BARIO EN
11.7.3 CURVA CORRIENTE-VOLTAJE EN LAS FIBRAS LENTAS........92
11.7.4 EFECTO DEL Co2+ SOBRE LA CORRIENTE DE
BARIO...............................................94
11.7.5 EFECTO DE LA NIFEDIPINA SOBRE LA CORRIENTE DE
BARIO. . . . . . . . . . . . . . . . . ..... . . . . ...........96
11.7.6 EFECTO DE LA ADRENALINA SOBRE LA IBa EN LAS FIBRAS
LENTAS . . . . . . . . . ......................................... 98
11.7.7 MODULACION DE LA IBa POR ISOPROTEREMOL.......... 101
11.7.8 EFECTO DEL PROPRANOLOL SOBRE LA MODULACIÓN
ADRENERGICA DE LA IBa...... ....... ............. 103
III. DISCUSION GENERAL.................................. 106
IV. CONCLUSIONES........................................ 117
V. REFERENCIAS.......................................... 119
LASFIBRAS LENTAS...............................89
P R Ó L O G O
L a contracción muscular es un proceso mecánico que
depende del incremento en los niveles intracelulares de Ca2+.
Un hecho interesante es que este fenómeno es modulado por
hormonas como la noradrenalina, adrenalina, etc. (Williams y
Barnes, 1989; Huerta, Muñiz, Trujillo y Lomelí 1991; Cairns y
Dulhunty, 1993; García y Escamilla-Sánchez, 1994).
Por lo tanto, resultó relevante examinar en esta tesis
si la tensión inducida por K+ está sujeta a modulación
adrenérgica en las fibras lentas del músculo ALD del pollo e
investigar si esta modulación se relaciona con los canales de
Ca2+ de manera semejante a lo que ocurre en otras
preparaciones (González-Serratos, 1981; Arreola, Calvo,
García y Sánchez, 1987; Somasundaram y Tregear, 1993; Huerta,
Trujillo y Vásquez. 1997).
La tesis se presenta en dos partes: la primera, está
relacionada con la tensión producida por k+ y la segunda, se
relaciona con los canales de calcio. Al final de estas dos
partes se hace una discusión general con sus respectivas
conclusiones.
5P A R T E I
I.- INTRODUCCIÓN
1.1. TIPOS DE FIBRAS DE LOS MUSCULOS ESQUELETICOS
Las fibras de los músculos esqueléticos pueden o no
responder con una sacudida cuando son estimulados
eléctricamente. Las fibras que responden con una sacudida, se
han dividido en:
1) fibras de sacudida rápida y,
2) fibras de sacudida lenta.
En cambio, hay fibras musculares esqueléticas que no
responden con una sacudida, esto es porque carecen del
mecanismo generador del potencial de acción (es decir, no
poseen canales de sodio activables por voltaje) como las
fibras tónicas de los anfibios (Gilly, 1975; Huerta, 1984). y
las encontradas en los músculos extraoculares de los
mamíferos (Kuffler y Vaughan-Williams, 1953; Burke y
Ginsborg, 1956). Las fibras rápidas se contraen y se relajan
rápidamente y su función está asociada a los movimientos
rápidos, por ejemplo aquellos donde intervienen las
extremidades. En contraste, las fibras lentas que se contraen
y relajan lentamente, son útiles en el mantenimiento del tono
postural. Estos diferentes tipos de fibras se hallan
entremezcladas, sin embargo es posible encontrar músculos que
6
contienen exclusivamente fibras rápidas, Por ejemplo: el
pectoralis major y el posterior latissimus dorsi (PLD) de las
aves así como el sartorio de los anfibios. Entre los músculos
constituidos exclusivamente por fibras lentas se encuentra el
anterior latissimus dorsi (ALD) de las aves (Ginsborg, 1960;
Page , 1969; Hess, 1970; Ogata, 1988) (fig. 1).
Figura 1. Diagrama que muestra el músculo latissimus dorsi del pollo. Este músculo se compone de dospartes, una anterior (ALD) y otra posterior (PLD), localizadas a nivel de la línea mediadorsal (Modificado de Ginsborq, 1960).
7
Las fibras que componen estos dos tipos de músculos, ALD
y PLD presentan además diferencias estructurales, las cuales
a continuación se describen.
1.2. ESTRUCTURA DE L A S FIBRAS MUSCULARES
La unidad funcional del músculo es la sarcómera y una
fibra muscular posee muchas de ellas que se repiten
sucesivamente a lo largo de la fibra y se acoplan una a otra
por medio de una línea Z.
Cada sarcómera posee dos tipos de filamentos: 1) gruesos
y 2) delgados y en ella se definen las bandas 1, A y la zona
H. La banda 1 6 isotrópica a la luz, contiene a los
filamentos delgados y es compartida simétricamente por dos
sarcómeras adyacentes. La zona H contiene a los filamentos
gruesos y en la banda A o anisotrópica, ambos están
interdigitados. A la mitad de la zona H se encuentra la línea
M que divide a la sarcómera en dos partes simétricas.
Las fibras del músculo PLD se disponen de manera regular
y poseen un sistema de túbulos T y retículo sarcoplásmico
extensamente desarrollado. Estas fibras son inervadas por
terminales motoras gruesas que finalizan en forma de placa y
generalmente son monoinervadas. En contraste, las fibras
lentas del ALD se disponen irregularmente y su sistema
sarcotubular está menos desarrollado que el de las fibras
rápidas son inervadas por terminales motoras delgadas que se
ramifican y dan origen a finas varicosidades con aspecto de
racimo de uvas. Estas fibras son multiinervadas (Kuffler y
Vaughan-Williams, 1953a,b; Ginsborg, 1960; Hess 1961; Page y
Slater, 1965;Page ,1969; Salmons y Vrbová, 1969: Hess,
1970; Ogata, 1988).
1.3. RESPUESTA MECÁNICA ANTE SOLUCIONES CON ALTO CONTENIDO DE
POTASIO
Otra diferencia entre las fibras rápidas y las fibras
lentas, es la respuesta mecánica ante soluciones con alto
contenido de K+. Cuando las fibras rápidas del PLD son
puestas en soluciones despolarizantes con un alto contenido
de K+, estas fibras responden con un desarrollo de tensión
transitorio, esta contractura relaja espontáneamente a pesar
de estar presente el fluido de contractura (fig. 2B). En
contraste, las fibras lentas del ALD responden a estas mismas
soluciones con u n a contractura sostenida, la cual se
caracteriza por un desarrollo de tensión rápida que decae
hacia una segunda fase sostenida, la cual se mantiene todo el
tiempo que está presente la solución despolarizante de K+
(fig. 2A). Esta fase sostenida es dependiente del Ca2+
9
extracelular (Page, 1969; Huerta y Stefani, 1981; Krippeit-
Drews y Schmid, 1992).
Con respecto al acople excitación-contracción, también
existen diferencias entre estos dos tipos de fibras
musculares, sobretodo, en lo que respecta a la participación
del Ca2+ en la activación contráctil (Brum, Ríos y Stefani,
1988), es decir, el desarrollo de tensión de las fibras
musculares lentas depende en mucho del Ca2+ que entra al
mioplasma del exterior celular (Huerta, Muñiz y Stefani,
1986).
160 h
Figura 2. Respuesta de las fibras musculares esqueléticas del pollo al ser bañadas por soluciones conalto contenido de K+ En A, la contractura de las fibras lentas del ALD. En B, la contracturade las fibras rápidas del PLD (Tomado de Huerta, 1981).
1 0
1.4. ACOPLE ENTRE LA EXCITACION Y LA CONTRACCION
Durante el proceso de excitación, la membrana de una
fibra muscular es despolarizada por un potencial de acción
(fig. 3-B-l) en los músculos de sacudida o por potenciales
sinápticos en las fibras tónicas. El acoplamiento entre la
excitación y la contracción ocurre cuando la despolarización
de la membrana es conducida al interior de la fibra muscular
a través de los túbulos-T (fig. 3-B-2), la cual se propaga
hacia las cisternas terminales del retículo sarcoplásmico
(RS) mediante una señal química (trifosfato de inositol, IP3)
(Lea, Griffits, Tregear y Ashley, 1986) ó por un movimiento
asimétrico de cargas (Schneider y Chandler, 1973; Chandler,
Rakowsky y Schneider, 1976; Ríos y Brum, 1987; Lamb y Walsh,
1987). En este sentido, los túbulos-T de las fibras
musculares esqueléticas contienen una alta concentración de
canales de Ca2+ sensibles a dihidropiridinas (DHP) (Nicola-
Siri, Sánchez y Stefani, 1980), los cuales conducen el
desplazamiento de carga intramembranal (fig. 3-B-3) y al
encontrarse yuxtapuestos con los receptores a rianodina (los
canales de Ca2+ del RS) (Block, Imagawa, Campbell y
Franzini-Armgstron, 1988) causan la apertura de estos canales
y la consecuente liberación de los iones Ca2+ almacenados en
el interior del RS (fig. 3-B-4). Así, la concentración de
Ca2+ en el mioplasma se incrementa de valores aproximados de
10-7 a 10D5 M (fig. 3-B-5). El Ca2+ que se libera del RS
1 1
promueve la apertura de más canales de Ca2+ del RS haciendo
que aumente más la concentración de Ca2+ en la célula (calcio
libera calcio) (Endo; 1977; Lamb y Stephenson, 1990; Gyorke y
Palade, 1992). Parte de este Ca2+ en el mioplasma se une a la
troponina de los filamentos de actina y se produce un cambio
conformacional en la molécula, descubriéndose los "sitios
activosl" a los cuales se van a unir las cabezas de miosina
para formar los llamados puentes cruzados. Esta interacción
de la miosina con los filamentos de actina y la hidrólisis de
ATP producen el deslizamiento de los filamentos delgados con
respecto a los gruesos, produciéndose el mecanismo de la
contracción muscular (fig. 3-B-6).
Finalmente, la concentración de Ca2+ en el mioplasma se
reduce por la captación activa de Ca2+ efectuada por el RS;
la tropomiosina inhibe la unión de los puentes cruzados, y el
músculo nuevamente se relaja.
Por otra parte, hay una interesante correlación entre la
estructura del sistema sarcotubular y la función muscular.
Los músculos que se contraen y se relajan rápidamente poseen
un RS muy desarrollado y un extenso sistema de túbulos T.
Aquellos que se contraen y relajan lentamente tienen un RS
menos desarrollado, por lo tanto el desarrollo de tensión
depende importantemente del Ca2+ que entra al mioplasma de la
1 2
solución extracelular (Huerta y Stefani, 1981; 1986).
Aunque el mecanismo de la excitación-contracción todavía
es muy discutido, recientemente se menciona que también las
proteínas-G de la membrana pueden estar involucradas
(Somasundaram, Tregear y Trentham, 1991).
X.5. TIPOS DE MIOSINA EN LAS FIBRAS MUSCULARE S ESQUELETICAS
Se ha reportado que la miosina que compone a los
filamentos gruesos de las fibras de sacudida lenta es
distinta de aquella que compone a los filamentos gruesos de
las fibras de sacudida rápida. Estas diferencias han sido
obtenidas mediante pruebas bioquímicas, metabólicas e
histoquímicas y todas ellas relacionadas con la ATPasa de las
cabezas de miosina.
Figura 3. Diagrama que muestra el acoplamiento entre la excitación y la contracción muscular. En A,una sección de una fibra muscular en reposo y en B, en contracción. Note en B, el incrementoen la concentración intracelular de Ca2+ y la interacción de los puentes cruzados (Tonado de Eckert, Randa11 y Augustine, 1990).
1 4
La miosina, la cual consta de una porción alargada (S2)
y dos cabezas globulares (SI), con actividad de ATPasa. Es en
estas cabezas donde se han diferenciado al menos tres formas,
las llamadas isoformas rápidas e isoformas lentas en
relación a su variada motilidad en geles de poliacrilamida
( Page , Miller, DiMario, Hager, Moser y Stockdale, 1992).
La expresión temprana de estos dos tipos de miosina durante
la miogénesis permite distinguir el orígen de las fibras
musculares rápidas y lentas en las aves y su diversidad en el
desarrollo al inicio es independiente de la inervación pero
después ocurre una modulación de la expresión diferencial
influenciada por las terminales nerviosas que las contactan y
por las secreciones hormonales. La isoforma lenta se expresa
en el ALD del pollo.
1.6. EFECTO DE LA ADRENALINA SOBRE LA CONNTRACCIÓN MUSCULAR
Por otro lado, sobre la modulación de la tensión, en
particular por adrenalina sobre el músculo esquelético, se
conoce que ésta incrementa la sacudida y el tétanos en las
fibras musculares rápidas de la rana y de mamífero (Bowman y
Zaimis, 1989). Sin embargo, en mamífero, en las fibras
lentas, la información es controversia1 ya que Bowman y Anden
1 5
(1981) reportan disminución de la tensión de la sacudida y
del grado de fusión de los subtétanos, mientras que Cairns y
Dulhunty (1993) reportan un incremento en la tensión. Con
respecto a las fibras tónicas de la rana, en 1991 nosotros
describimos que la adrenalina incrementa la tensión de las
contracturas por k+(Huerta y col. 1991). Estos hallazgos
posteriormente fueron confirmados por García y Escamilla-
Sánchez en 1994.
1.7. EL S I S T E M A NERVIOSO AUTÓN O M O
A continuación describiré algunas características del
sistema nervioso autónomo y la médula adrenal asociada, la
cual fisiológicamente es la productora de adrenalina.
El sistema nervioso autónomo (SNA) está formado por los
sistemas: simpático ó adrenérgico y parasimpático 0
colinérgico, ambos caracterizados por el neurotransmisor que
liberan sus terminales nerviosas sobre sus células efectoras.
El sistema simpático libera noradrenalina principalmente y el
sistema colinérgico acetilcolina. En general, estos sistemas
regulan las actividades de estructuras que no están bajo el
control voluntario,por ejemplo, la respiración, la
digestión, la temperatura corporal, el metabolismo, la
sudoración y la secreción de ciertas glándulas, entre ellas
16
las adrenales (fig. 5).
En los mamíferos simpatectomizados se ha observado que
pueden llevar una vida normal en condiciones de laboratorio.
Sin embargo, en condiciones de estrés la carencia de las
funciones simpaticoadrenales impide las reacciones
instintivas al miedo y al peligro y fallan los mecanismos
homeostáticos del organismo.
La glándula adrenal posee una malla densa de placas
terminales de axones eferentes de neuronas ganglionares
espinales y del nervio esplácnico, el cual inerva un gran
número de células cromafines medulares y bastan unos pocos
impulsos para que exista una descarga masiva de catecolaminas
hacia la circulación sanguínea (Lesouhaiter y col., 1996).
Normalmente, las circunstancias de estrés y excitación
incrementan la secreción de adrenalina por las células
cromafines de la medula adrenal (fig. 6) causando una
redistribución del flujo sanguíneo hacia los músculos,
desencadenando una respuesta que depende del tipo de músculo
activado.
17
Figura 5. Diagrama que ilustra el SNA y los sistemas que éste regula. La glándula adrenal escontactada por la inervación esplácnica. Tomado de Lefkowitz, Hoffman y Taylor, 1996).
1 8
La médula adrenal consta de dos poblaciones celulares
que contienen catecolaminas: una con adrenalina (= 80% del
total) y otra con noradrenalina (= 20% del total) (fig. 6).
Las células que contienen adrenalina poseen la enzima
feniletanolamina N-metil transferasa, cuya síntesis es
inducida por cortisol de las células corticales que le
rodean. En estas células, la noradrenalina sintetizada deja
los gránulos y es metilada en el citoplasma de las células
medulares a adrenalina (fig, 7), donde es retenida y
almacenada en gránulos cromafines hasta su liberación
(Vanfuler, 1972).
Figura 6. Muestra la glándula adrenal, los te jidos gue la conforman y sus distintos productos desecreción. (Tomada de Kaplan, 1996) .
19
HO ADRENALINA
Figura 7. Biosíntesis de la adrenalina y las enzimas implicadas, en minúsculas.
2 0
Para ejercer su efecto, las catecolaminas circulantes
requieren interactuar con receptores en la membrana de las
células efectoras (Sutherland, 1982). A continuación se hace
una descripción de los receptores adrenérgicos.
1.8. RECEPTORES ADRENERGICOS
Del tipo de receptor con el que interactúen las
catecolaminas circulantes, entre ellas la adrenalina, depende
la respuesta de la célula efectora. Se han reportado dos
tipos de receptores a noradrenalina y adrenalina, llamados
alfa (a) y beta (B). La interacción de catecolaminas con
receptores a facilita la transmisión neuromuscular (Bowman y
Nott, 1969) y la interacción con receptores 8, modula una
gran cantidad de procesos fisiológicos, entre ellos, la
contracción muscular (Bowman y Nott, 1974; Bowman y Anden,
1981).
Los receptores α y β son subdivididos de acuerdo a su
localización en la membrana de las células efectoras en α1
b1α2 y β2 y β3 (fig- 8A). Este último clonado. Los subtipos
α1 y β1 se localizan en la proximidad de las terminales
nerviosas de órganos efectores y los subtipos α2 y β2 se
localizan en regiones postsinápticas alejadas de los sitios
21
de liberación de la noradrenalina; ubicación estratégica
relacionada con la activación por catecolaminas circulantes.
Estos dos tipos de receptores corresponden a una familia
de receptores constituidos por una secuencia de 418 residuos
aminoacidicos y con siete dominios transmembranales. Cada
dominio forma una hélice-a! de suficiente longitud para
atravezar la membrana y sus sitios de unión a catecolaminas
están orientados externamente al igual que su terminal amino.
En cuanto al receptor B-adrenérgico, su terminal
carboxilo está orientada hacia el lado interno de la
membrana (fig. 8B) y entre los diferentes subtipos A existe
una secuencia similar en un 60% de sus aminoácidos. También
este receptor posee sitios de fosforilación a nivel de las
protruciones intracelulares, los cuales permiten la
desensibilización del receptor por desfosforilación cuando
este ha sido sujeto a una constante acción del agonista. Este
es un mecanismo de regulación de la actividad del receptor.
Adicionalmente, se ha mostrado, mediante mutagénesis que en
el receptor β sus aminoácidos que interactuan directamente
cada grupo funcional de la molécula agonista (Hoffman yLefkowitz, 1996).
EXTRACEL
Figura 8. En A, los subtipos de receptores β-adrenérqicos. En B, el receptor β2 yY sus dominios transmembranales. El símbolo vindica un sitio para N-glicosilación y WWW indica un sitiopara tio-acilación (Tomado de Hoffman y Lefkowitz, 1996).
22
23
Para caracterizar los efectos de una catecolamina
particular, existen drogas que actúan como agonistas
específicos para cada tipo de receptor y su acción emula el
efecto producido por la catecolamina en estudio. Se han
reportado como agonistas B-adrenérgicos al isoproterenol y la
dobutamida y de acción agonista α, la fenilefrina, metoxamina
y la mitfentermina (Hoffman y Lefkowitz, 1996).
Por otra parte, se conoce que, los receptores b están
acoplados a otra enzima membranal, la adenilato ciclasa. De
tal manera que la activación del receptor (primer mensajero)
activa a un segundo grupo de mensajeros (segundos mensajeros)
que amplifican cada vez más la señal. En este sentido, el
receptor activado, activa a un grupo de proteínas membranales
llamadas proteínas G (Ga) (Gilman, 1987) (véase parte II
sobre estas proteínas), las cuales median en la célula
efectora la producción de AMP cíclico (AMPc) al unirse a la
enzima adenilato ciclasa (fig. 9A) la cual cataliza la
transformación de 3'5' -AMPc a partir del complejo Mg2+/ATP
(Sutherland, 1982).Este permanece hacia múltiples sitios
en la célula y actúa como segundo mensajero que regularmente
ejerce su acción sobre proteínas cinasas AMPc-dependientes.
Estas proteínas fosforilan ó desfosforilan específicamente
2 4
residuos de serina/treonina (Rohrkasten, Meyer, Nastainez,
Sieber y Hofmann, 1988) de otras proteínas celulares
(receptores, canales iónicos e incluso proteínas contráctiles
(Reuter, 1987; Hille, 1994).
Todas estas acciones de amplificación de la señal
desencadenadas por la interacción de la adrenalina con su
receptor conducen a sumar las respuestas de los sistemas
efectores, las cuales finalmente permiten que el individuo
reaccione con acciones de lucha ó huida. La interrogante es:
¿Como son evocadas todas estas respuestas por la adrenalina?
Una explicación a éste mecanismo es la activación de sistemas
de segundos mensajeros efectuada por la adrenalina (Tsien,
1977; Sutherland, 1982; Reuter, 1987) mediante reacciones
bioquímicas en .. cascada en el citoplasma de la célula
efectora, también conocida como transducción de la señal
(Taussig y Gilman, 1995). En la ausencia de este tipo de
eventos amplificadores de la señal como el anteriormente
descrito, en la célula los niveles de AMPc son muy bajos y
solamente son incrementados por un breve periodo de tiempo
por la adenilato ciclasa activada por la proteína Ga-GTP
(Gilman, 1987). y por el receptor activado por un ligando
(Sutherland, 1982). Una sola molécula de adrenalina (presente
a concentraciones tan bajas como 10-10 M) puede causar la
2 5
activación de docenas de subunidades α de las proteínas G y
cada una de ellas en turno, podría activar a muchas enzimas
adenilato ciclasa, las cuales a la vez sintetizan cientos de
moléculas de AMPc y cada una de estas en turno activan a
cinasas dependientes de AMPc que fosforilan cientos de
residuos proteicos en las células efectoras.
Cada uno de estos sistemas de señales activadas por el
receptor son "apagadas" por mecanismos regulatorios
específicos, como pueden ser por desfosforilación del
receptor, desensibilización del receptor por el agonista,
inactivación de la proteína G por GTPasas, que transforman su
estado activo ((r-GTP a α-GDP y se vuelve a asociar al
complejo βτ en la membrana (fig. 9B) a los pocos segundos de
haber sido activada (Taussig y Gilman, 1995) y finalmente, la
acción del AMPc es inhibida por la acción de las enzimas
fosfodiesterasas del AMPc (PDE) las cuales transforman el 3,5
AMPc activo a 5-AMP inactivo, terminando con la amplificación
de la señal desencadenada por la interacción agonista-
receptor.
2 6
CRGS)(GAP)
Figura 9. Muestra los mecanismos de amplificación de la señal. En A, la activación del receptor poruna hormona estimulante (Hs) ó inhibitoria (Hi) activa a la proteína G. Gs activa a la enzimaadenilato ciclasa (C) que transforma el ATP a AMPc. El AMPc es disminuido por la acción delas fosfodiesterasas (PDE). En B, el receptor activado y la proteína G, disociada en a-GTP y βτ se unen a otro sistera de efectores y su acción termina por la actividad de las GTPasas(GAP). La proteína G es inactivada y se asocia en su complejo cl α-GDP y βτ (Tomado de Iyengar, 1997).
2 7
1.9. PAPEL DEL AMPc SOBRE LA CONTRACCIÓN MUSCULAR
Se ha mencionado que la acción efectuada por agonistas
B-adrenérgicos en el músculo esquelético puede ocurrir a
través de la vía del AMPc (Oota y Nagai, 1977; Fellenius,
Hedberg, Holmberg y Waldeck, 1980; Williams y Barnes, 1989;
Cairns y Dulhunty, 1993; Huerta y col., 1997). Se ha mostrado
primeramente por Oota y Nagai (1977) y más tarde por Varagic
y Kantara (1974), Cairs y Dulhunty (1993) que la acción de
un análogo del AMPc (dibutiril AMPc) ó el utilizado por
Huerta y col (1997) I 8 Bromo-AMPc, ambos mimetizan los
efectos del agonista A-adrenérgico sobre la contracción del
músculo esquelético.
En otros estudios, usando inhibidores de la
fosfodiesterasa del AMPc como la cafeína Bowman y Nott (1974)
ó la forskolina (Prostran y Varagic, 1986) apoyaron
adicionalmente el papel del AMPc sobre la potenciación de la
fuerza de contracción inducida por simpatomiméticos sobre las
fibras de sacudida rápida.
28
1.10. ANTECEDENTES INMEDIATOS
Es sabido que el υg de adrenalina inyectado a un animal
de tamaño promedio, corresponde a la máxima concentración
sanguínea de adrenalina liberada por la medula suprarrenal en
caso de estrés extremo (Folkow, 1955). La dosis intravenosa
mínima que afecta al músculo lento de mamífero es de
aproximadamente 0.06-O-5 ug/Kg de peso, correspondientes al
rango fisiológico de adrenalina circulante (Bowman y Zaimis,
1958).
Por otra parte, es conocido que la adrenalina modula la
contracción del músculo esquelético (Bowman y Nott, 1974;
Bowman y Anden, 1981). Esta modulación depende del tipo de
fibra muscular sobre la que actúa (Tomita, 1975; Bowman y
Zaimis, 1989; Huerta y col., 1991; Cairns y Dulhunty, 1993;
Escamilla-Sánchez, 1994). En las fibras rápidas de mamíferos,
la tensión al pico de la sacudida es incrementada en
aproximadamente 10 a 20%. El grado de fusión del tétanos es
incrementado. En contraste, la tensión al pico de la sacudida
lenta es disminuido en un 10 a 25%, mientras que la amplitud
de los tétanos incompletos también es disminuido en un 60%
(Tomita, 1975; Bowman y Zaimis, 1989). Sin embargo, bajo
ciertas condiciones, la tensión es incrementada en los
músculos de sacudida lenta (Cairns y Dulhunty, 1993).
2 9
Williams, Caron y Daniel. (1984), reportaron una mayor
densidad de receptores A-adrenérgicos (β2) y una mayor
actividad de la adenilato ciclasa en las fibras de sacudida
lenta que en las fibras rápidas. La modulación de la tensión
en estos músculos ocurre vía AMPc (Oota y Nagai, 1977) ó
directamente vía proteinas-G (Yatani, Imoto, Codina,
Hamilton, Brown y Birnbaumer, 1988). Los hallazgos de Cairns
y Dulhunty (1993), confirman la activación predominante de
receptores A2 por adrenalina y terbutalina.
Oota y Nagai (1977); Huerta y col. (1991) y Cairns y
Dulhunty (1993) han mostrado que para que la adrenalina
ejerza un efecto observable sobre el músculo, requiere al
menos de 3 a 5 minutos ó de 10 a 20 minutos para observar su
mayor acción. Además, es posible encontrar diferencias en
el curso temporal del efecto sobre músculo completo y sobre
fascículos 0 fibras aisladas (Brum, Gonzalez, Ferreira,
Maggi y Santi, 1990).
Los receptores β-adrenérgicos han sido identificados en
músculo esquelético embrionario de pollo tanto in vivo como
in vitro y la ocupación de estos receptores por agonistas β+
adrenérgicos incrementa la actividad de la adenilato ciclasa
así como los niveles intracelulares de AMPc (Schmid, Renaud y
Ladzundski, 1988).
3 0
Como podemos ver, la información en la literatura sobre
la modulación adrenérgica de la tensión en las fibras de
sacudida lenta es controversial, ya que en los mamíferos por
un lado se reporta una disminución de la tensión (Bowman y
Anden, 1981) y por el otro un incremento (Cairns y Dulhunty,
1993). Asimismo, en los anfibios, se ha mostrado que la
tensión de sacudida de fibras rápidas aisladas y de músculos
completos aumenta en la presencia de adrenalina (Oota y
Nagai, 1977; Gonzales-Serratos y col., 1981; Arreola y col.,
1987).
En las fibras tónicas de la rana hemos reportado (Huerta
y col., 1991) que adrenalina incrementa la tensión producida
por k+ en fascículos de pocas fibras. Estos resultados fueron
posteriormente confirmados por García y Escamilla-Sánchez en
1994). De esta manera, los resultados anteriormente descritos
en fibras lentas y la gran escasez de literatura sobre la
modulación adrenérgica del músculo lento nos motivó
plantearnos la siguientes preguntas: ¿ Está sujeta a
modulación adrenergica la tensión inducida por k+ en las
fibras musculares lentas del pollo? ¿Se relaciona esta
modulación con los canales de Ca2+
Para tratar de resolver nuestras preguntas nos
propusimos los siguientes objetivos particulares:
3 1
1) Estudiar si la tensión inducida por K+ está sujeta a
modulación adrenérgica.
2) Demostrar la presencia de canales de Ca2+
3) Investigar si estos canales de Ca2+ están sujetos también
a una modulación adrenérgica.
Para llevar a cabo nuestros objetivos, utilizamos dos
métodos de registro experimental:
1) registro mecánico y,
2) registro eléctrico.
En esta primera parte describo lo relacionado con el
registro mecánico.
3 2
1.11. M É T 0 D 0
Para realizar los experimentos de registro mecánico
utilizamos fascículos del músculo ALD de aproximadamente 500
υm de diámetro extraídos de pollos de engorda de cruza
Cross, de hasta 3 semanas de edad. Estos fascículos eran
colocados en una cámara de registro de lucita transparente,
sujetos del tendón dista1 al fondo de la cámara y del
extremo proximal (con parte del hueso húmero) a la palanca de
un transductor mecanoeléctrico (Cambridge Technology, Inc.
400). El transductor era conectado directamente a un
registrador rectilíneo (Gould 220). y a un amplificador
(Cyberamp 380). La conección de este a una tarjeta A/D (TL-l
DMA) y una computadora (AT386) nos permitieron adquirir
(software AXOTAPE de Axon Instruments) y almacenar los datos
experimentales para ser analizados posteriormente (véase
dispositivo experimental, fig.10).
Previo al registro de la tensión isométrica, los
fascículos de fibras lentas eran estirados en aprox. 1.3
veces su longitud de reposo y se dejaban equilibrar con flujo
constante de la solución normal por un periodo de 15 minutos,
hasta mantener una tensión basal estable. La tensión
(contractura) fue inducida por soluciones con alto contenido
de k+ (ver soluciones). Las soluciones y sustancias de prueba
3 3
eran pasadas directamente a la cámara experimental y a través
de una jeringa sin émbolo conectada a una llave de tres vías
instalada en la base de la cámara. Una vez que pasaban a la
cámara de registro, estas eran retiradas por medio de un
sistema de succión. Los fascículos se dejaban reposar por un
periodo de l0-15 minutos entre cada contractura.
Los experimentos fueron realizados a temperatura
ambiente (20-22°C). Cuando se utilizaron sustancias sensibles
a la luz (como la nifedipina y el 8 Br-AMPc, los experimentos
fueron realizados en la obscuridad).
La composición de las soluciones utilizadas en esta
etapa experimental es enlistada en la Tabla 1.
3 4
1
1.
Figura 10, Diagrama del dispositivo experimental empleado para el ristro isométrico de la tensiónA, es la C mara experimental que contiene al músculo ALD; B es el transductor de tensión; C, es el registrador en papel. D, eH lainterfase (TL-1DMA), E, es el amplificador Cyberamp; t, es una computadora y G, es el sistema se succión.
3 5
Tabla1
Solución normal (Ginsborg, 1960) [mM]
NaCl 167.0
KCl 5.0
CaCl2 5 . 0
MgCl2 2 . 0
Glucosa 2 g/l
pH 7.4
*Cuando se preparaban soluciones con alto k+ el ión Na+ se
sustituía equimolarmente por k+. Se utilizó el Imidazol-Cl-
para ajustar el pH.
Para reducir la posible modificación del potencial de
superficie cuando utilizamos una solución carente de calcio,
5 mM-CaClfueron reemplazados en (mM) por 1.38 NiC12, 1.38
CoCl. o 10.3 mM-MgCl2 (Hille, Woodhull y Shapiro, 1975). Las
soluciones con estos iones fueron preparadas adicionando el
volúmen apropiado a partir de soluciones madre (0.1 M). El
intercambio de las soluciones fué realizado de la manera
descrita previamente por Huerta, Muñiz y Stefani (1986). La
solución carente de Ca2+ fué adicionada al fascículo en
3 6
estudio 5 minutos previos a realizar la prueba experimental.
A todas las soluciones de prueba se les adicionaron 50 υm de
d-tubocurarina, para evitar efectos directos de la adrenalina
sobre la transmisión neuromuscular.
Utilizamos ampolletas de adrenalina (Pisa Lab.) cuya
dilución era de l:lOOO, a partir de la cual se tomaba el
volúmen necesario para ajustar la concentración de prueba.
Tomando en consideración los estudios previos (Huerta y col.,
1991), usamos un periodo de incubación de la adrenalina de 15
minutos anterior al experimento. También utilizamos
isoproterenol, DL-propranonol, cafeína y 8-Br AMPc (Sigma
Chemicals), de los cuales se hacían soluciones madre a partir
de las cuales se tomaba el volúmen requerido para realizar
las diluciones apropiadas.
Para el análisis de los registros de la tensión
utilizamos las subrutinas del AXOTAPE ó las mediciones
directas de los trazos en Papel mediante una regla
milimétrica calibrada. Las medidas son reportados como media
f error estándar. Las diferencias de tensión con respecto a
las condiciones control y de prueba fueron determinadas por
un análisis de diferencias de medias, usando la prueba
estadística “t de Student" para las pruebas de significancia,
con un nivel de p ≤ 0.05.
3 7
1.12. RESULTADOS
A continuación se describen los resultados sobre la
modulación adrenérgica de la tensión en las fibras lentas del
músculo ALD del pollo.
1.12.1. RESPUESTA MÉCANICA DE LAS FIBRAS MUSCULARES LENTAS A
DISTINTAS CONCENTRACIONES DE K+ EXTERNO
Las fibras lentas del pollo al ser expuestas a
soluciones con alto contenido de K+, responden con una
contractura que es dependiente de la concentración
extracelular de k+ (Ginsborg, 1960; Page, 1969; Huerta y
Stefani, 1981).
Previo a estudiar la modulación de la tensión por
adrenalina, analizamos la respuesta de las fibras lentas del
ALD a distintas concentraciones de k+. En la figura ll se
muestran los registros de tensión a distintas concentraciones
de k+.En A se observa que el umbral del fenómeno mecánico se
alcanza cuando la concentración de K+ es de 20 mM y a partir
de esta concentración la tensión se va incrementando de
amplitud y comienza a adquirirse la forma típica de la
contracturas por K+ característica de las fibras lentas. En
3 8
ocasiones, con 60 mM ya se pueden distinguir las dos fases de
la contractura: la rapida y la sostenida donde la tensión se
estabiliza (D). Estas dos fases siempre se presentan cuando
las concentraciones son ³ 80 mM-K+. La mayor amplitud de
tensión se obtuvo con 80 mM-K+. A medida que se incrementa
[K+]e la tensión aumenta. Concluimos pues, que la forma y la
magnitud de la contractura dependen de la concentración de K+
externo utilizada. La forma de la contractura de K+ es
cualitativamente similar a la registrada en las fibras
tónicas de anfibio (Huerta y Stefani, 1986) y tanto esta como
la velocidad de subida y la amplitud de la contractura son
dependientes de la concentración de K+, tal como ha sido
descrito en estudios previos (Ginsborg, 1960; Page, 1969;
Huerta y Stefani, 1981).
En la figura 12, se muestra la curva de activación de la
tensión versus el logaritmo de la concentración de K+
utilizada.
39
Figura ll. Ilustra la tensión producida por distintas concentraciones extracelulares de k+. Note quela forma y la amplitud de la contractura dependen de la [K+]e. El número sobre el pulsode Kt indica la concentración del ión en mM.
Figura 12. Curva de activación para la tensión inducida por soluciones de alto Kt en las fibrasmusculares lentas del pollo. En las abcisas el logaritmo de la concentración extracelular de
k+ y en las ordenadas la tensión máxima en miligramos. Los puntos corresponden a los valoresmedios de la tensión máxina. La línea continua representa el ajuste a ojo.
4 1
Por otra parte, es importante señalar que las fibras
musculares lentas del pollo no presentan inactivación de la
contractura, es decir, una vez alcanzada la meseta ó fase
sostenida de la tensión, ésta se prolonga todo el tiempo en
que está presente el fluido de contractura.
4 2
1-12.2. MODULACION ADRENERGICA DE LA TENSIÓN INDUCIDA POR K+
Resultados previos en las fibras tónicas de la rana
(Huerta y col., 1991), muestran que la adrenalina modula la
tensión de las contracturas por K+ y que esta modulación es
mayor cuando la concentración de adrenalina es de 10 υ M En
este sentido, realizamos una curva concentración-respuesta de
la adrenalina sobre la tensión inducida por K+ en las fibras
lentas de pollo. Utilizamos la tensión producida por una
concentración de K+ de 60 mM, la cual sabemos que produce una
contractura submaximal. En la figura 13 se muestra una curva
concentración-respuesta de la adrenalina a distintas
concentraciones, aplicada sobre la contractura producida por
60 mM-K+. Puede notarse que desde pequeñas concentraciones,
la adrenalina produce una disminución de la tensión control.
A concentraciones de 0.25 υM (2.5X10-7 M), la adrenalina
disminuye la tensió control (1.53±1.3%; n=3). A
concentraciones de adrenalina 25 υM (5X10-7 M) la disminución
de la tensión es mayor y de manera concentración-dependiente.
El mayor efecto se obtiene con 10 υM (1X10-5 M) (16.36±3.3%;
n=8), sin embargo a mayores concentraciones que 10 υ M la
adrenalina no produce un mayor efecto.
4 3
En la presencia de 1 υ M la tensión máxima de la
contractura por K+ disminuye en aprox. un 7% con respecto al
control, en contraste, con 10 υM de adrenalina, se aprecia
una mayor disminución de la tensión, hasta en un 20%. En la
figura 14, se ilustra una respuesta representativa cuando
utilizamos una concentración de adrenalina de 10 υ M Si la
tensión total es definida como el área bajo la contractura
por K+, la adrenalina 10 υM disminuye la tensión en un 33.57%
con respecto al control. Cuando la solución conteniendo
adrenalina fué lavada de la solución normal, la tensión de la
contractura recuperó la amplitud control.
P
Figura 13. Curva concentración respuesta a la adrenalina. En las abcisas la concentración molar deadrenalina y en las ordenadas la disminución de la tensión en porcentaje del valor de control.Los puntos representan valores medio ± el error estándar de la media para una serie de al
menos 5 experimentos para cadq punto. Estos resultados fueron signoficativos para 1, 2 y 10υm (p< 0.05).El mayor efecto de la adrnalina está localizado en 10 υM (1x10-5M).
45
Figura 14. Modulación de la tensión por adrenalina 10 υM En A, la contractura control. En B, sepuede apreciar el efecto de 10 υM de adrenalina (ADR) y en C, la contractura control.
4 6
I-12.3, BLOQUEO DE LA HODULACION ADRENERGICA DE LA TENSION
Es conocido que el propranolol es un bloqueador B-
adrenérgico (Hoffman y Lefkowitz, 1996). Con el objeto de
determinar si este efecto de la adrenalina es mediado por
receptores β , estudiamos el efecto del propranolol ( 5 υ M )
sobre la tensión en esta fibras lentas. La figura 15 muestra
el efecto de haber incubado previamente el fascículo con
propranolol (5υM) y adrenalina (10 υM). De esta serie
experimental, un registro representativo muestra que en estas
circunstancias, la contractura prácticamente permanece sin
cambio con respecto al control (compare B contra A y C). Esto
sugiere que al estar presente el propranolol, este compite
por la interacción con los receptores, antagonizando la
acción de la adrenalina.
47
Figura 15. Muestra el efecto de la adrenalina y propranolol sobre la tensión producida por k+ En A,la contractura control: en B, la contractura cuando adicionaros 5 υM de propranolol y 10 pHde adrenalina (ADR), en C, la contractura final.
4 8
1.12.4. MODULACIÓN DE LA TENSION POR ISOPROTERENOL
Es conocido que el isoproterenol a bajas concentraciones
actúa predominantemente sobre los receptores β (Tashiro,
1973; Hoffman y Lefkowitz, 1996). Con el fín de reforzar lo
expuesto anteriormente, si el efecto de la adrenalina es
mediado por receptores B, el isoproterenol causaría un efecto
similar al de la adrenalina.
Cuando el isoproterenol (1υM) es incubado previamente
durante 15 minutos, este causa una disminución de la tensión
producida por K+. La amplitud de la tensión se reducen en
aprox. un 10% con respecto al control. Este efecto se aprecia
mejor, cuando se utilizan 10 υM de isoproterenol. En la
figura 16 se muestran los resultados obtenidos con esta
concentración. La tensión máxima se reduce en aprox. 20% con
respecto al control y la tensión total en aprox. un 34 %
(compare B en relación a A). Cuando se lava al fascículo con
la solución normal, la tensión tiende a igualar aquella del
control (C).
Un hecho interesante, fué que al aplicar isoproterenol
(10 υ M directamente durante la meseta de la contractura
(fig- 17), en todos los casos, se observó una relajación de
la tensión y si este se dejaba por un tiempo mayor, el
fascículo relajaba totalmente a pesar de estar presente la
solución despolarizante de K+.
49
Fiqura 16. Muestra el efecto del isoproterenol (10 υ M sobre la tensión producida por k+ . En A, lacontractura control: en B, la contractura cuando el fascículo fu preincubado con 10 £M deisoproterenol (ISO) y en C, el control final, posterior al lavado.
50
Figura 17. Muestra el efecto de la adición de Isoproterenol (ISO) 10 υM sobre la neseta de tensión.
511.12.5. MODULACION DE LA TENSION POR AMPc
Con el fin de investigar la posible mediación de la
acción de la adrenalina vía un segundo mensajero, como es el
AMPc (Oota y Nagai, 1977; Fellenius y col., 1980; Williams y
Barnes, 1989; Cairns y Dulhunty, 1993; Huerta y col., 1997),
exploramos incubando (5 min) el fascículo con un análogo
permeable del AMPc como es el 8-Br AMPc, el cual, similar a
otros analogos, difunde más fácilmente a través de la
membrana y es menos susceptibles que el AMPc a la hidrólisis
intracelular (Drummond, Hemmings y Warneboldt, 1974). En la
figura 18 se muestra un registro representativo en el cual la
aplicación de 0.1 mM de 8-Br AMPc, causó una disminución de
la tensión en aprox. un 20% con respecto al control (compare
B contra A) y la tensión de la contractura recuperó la
tensión control después del lavado con la solución normal
(CI l
Estos resultados nos sugieren que la adrenalina y el
isoproterenol disminuyen la tensión inducida por K+ en las
fibras lentas del pollo y que este efecto es bloqueado por un
bloqueante B-adrenérgico como es el isoproterenol y que el
probable mecanismo de acción es a través del AMPc.
52
C
Figura 18. Muestra el efecto del 8 Br AMPc (0.1 mM sobre las contracturas por k+ . En A, lacontractura control; en B, la contractura cuando el fasc!culo fu preincubado con 8 Br-AWc;en C, la contractura final después del lavado.
5 3
Se ha descrito en estudios previos realizados en fibras
rápidas y lentas de anfibios que la adrenalina modula la
tensión modulando canales de Ca2+ (González-Serratos, 1981;
Arreola y col., 1987; Huerta, Trujillo y Vásquez, 1997).
Además se ha postulado que la adrenalina puede actuar sobre
la liberación de calcio del RS (Gonzalez-Serratos, 1981;
Huerta y col., 1991). Se investigo la
participación de la liberacion de calcio del RS,
Estos resultados se describen en el siguiente apartado.
1.12.6. MODULACION ADRBNERGICA DE LA TEiNSION PRODUCIDA
POR CAFEINA
En las fibras rápidas, la cafeína a concentraciones
relativamente altas, induce el desarrollo de una contractura
transitoria (Lüttgau y Oetliker, 1968). Este efecto es
considerado ser debido principalmente a un incremento en la
liberación de Ca2+ del RS (Axelsson y Thesleff, 1958; Caputo,
1966; Lüttgau y Oetliker, 1968; Endo, 1975; Endo, Kakuta y
Kitazawa, 1981; Kovacs y Szücs, 1983; Delay, Ribalet y
Vergara, 1986; Klein, Simon y Schneider, 1990). En las
fibras musculares lentas del pollo y de la rata, también se
5 4
genera una contractura con concentraciones relativamente
altas de cafeína (Huerta y Stefani, 1981; Connet, Ugol t
Hammack y Hays, 1983; Fryer y Neering, 1989). La cafeína al
igual que las soluciones de alto K+ produce un desarrollo de
tensión dependiente de la concentración (Huerta y Stefani,
1981; Muñiz, Huerta, Dueñas, Trujillo y Elizalde, 1992) y en
el caso de las fibras musculares lentas del pollo, las
contracturas mantenidas inducidas por cafeína fueron
dependientes del calcio extracelular (Huerta y Stefani,
1981).
También se conoce que la cafeina es una droga que inhibe
a la fosfodiesterasa del AMPc (Butcher y Sutherland, 1962;
Bowman y Nott, 1974), impidiendo su transformación a AMP
inactivo y su uso, apoya el papel del AMPc en la disminución
de la tensión producida por la adrenalina en las fibras
musculares lentas. Cuando adicionamos adrenalina (10 PM) a la
solución de cafeína (8 mM), se produce una disminución de la
tensión control similar a aquella observada durante los
registros de la tensión producida por K+ (27.1511.59 % (n=3)
fig. 19).
5 5
Figura 19. Modulación adrenérgica de la tensión producida por cafeína. En A, la contracturacontrol inducida por 8 mM de cafeína (CAF); en B, la contractura por cafeína cuandopreincubamos el fascículo con 10 uM de adrenalina (ADR) ; en C, la contractura finalposterior al lavado con la solución normal.
5 6
La Tabla 2 resume los resultados anteriormente
descritos.
TABLA 2
DROGAS DISMINUCIÓN DE LA TENCIÓN(8 del control)
ADRENALINA 7.29±2.79
(1 υM) ( n=8 )
ADRENALINA 16.36±3.39
( n=8 )
ISOPROTERENOL 9.17±1.76
(1 µM) ( n=4 )
ISOPROTERENOL 24.19±3.23
(10 µM) ( n=3 )
ADRENALINA+PROPRANOLOL 4.03±1.38
(l0µM) (5µM) ( n=4 )
8-Br AMPc 24.22±2.92
(100 µM) ( n=3 )
CAFEINA+ADRENALINA 27.15±1.59
(8µM) (10 µM) ( n=3 )
(10 υM)
5 7
PARTE I
II- INTRODUCCION
Puesto que el objetivo de esta segunda parte está
relacionada con los canales de calcio y su modulación por
adrenalina, empezaré describiendo algunas propiedades
eléctricas de la membrana de las fibras musculares lentas del
músculo ALD del pollo.
11.1. PROPIEDADES ELÉCTRICAS DE LA MEMBRANA DE LAS FIBRAS
LENTAS DEL MÚSCULO ALD DEL POLLO
Ginsborg en 1960 y más tarde Cullen, Harris, Marshall y
Ward (1975), mostraron que las fibras multiinervadas del
músculo ALD del pollo tenían la capacidad de generar
potenciales de acción propagados, en contraste con lo
descrito por Kuffler y Vaughan-Williams (1953) y por Burke y
Ginsborg (1956) para las fibras tónicas de la rana, las
cuales no producen potenciales de acción consecutivos a la
estimulación eléctrica.
El potencial de la membrana de las fibras lentas del
músculo ALD del pollo también fué estudiado por Cullen y col.
(1975), quienes reportaron valores del potencial de membrana
en reposo de -62±1 mV. Este valor encontrado en las fibras
5 8
lentas del pollo es semejante al reportado por Kiessling
(1960) para las fibras tónicas de la rana con valores de
-63 ± 8.3 mV. Sin embargo, los valores encontrados por Cullen
y por Kiessling son bajos en comparación a aquellos obtenidos
por Stefani y Steinbach (1969) para las fibras tónicas de la
rana, de -80 mV.
En las fibras musculares rápidas del pollo, Kano,
Wakuta y Satoh (1989), describieron la presencia de canales
de Ca2+. A continuación se describen algunas características
biofísicas y farmacológicas de los canales de Ca2+.
11.2. CANALES DE Ca2+
En la primera parte de esta tesis hemos mencionado que
la fibra muscular requiere de un incremento en los niveles
intracelulares de Ca2+ para contraerse. El Ca2+ que activa la
contracción muscular proviene primordialmente del retículo
sarcoplasmico y/ò de la solución externa vía los canales de
Ca2+ voltaje-dependientes que son activados por una
despolarización de la membrana.
El estudio de los canales de Ca2+ en el músculo
esquelético presenta mayores dificultades que el estudio de
los canales de Na+ o K+ (Huerta, 1984; Huerta y Stefani,
5 9
1986). En las distintas preparaciones donde han sido
reportadas corrientes acarreadas por Ca2+, estas corrientes
muestran diferencias en sus propiedades fundamentales (como
dependencia del voltaje y en su cinética). Estas diferencias
en la actualidad han sido identificadas mediante métodos
biofísicos y farmacológicos por una diferencia del tipo del
canal de Ca2+ a través del cual están pasando. Es decir, que
puede existir más de un tipo de canales de Ca2+, incluso hay
casos en que dos corrientes de Ca2+ presentan diferentes
propiedades encontradas en la misma membrana (e.g. en huevo
de estrella de mar) (véase Hagiwara y Byerly, 1981). Es
posible, por consiguiente, que muchas de las controversias
que existen alrededor de las corrientes de Ca2+ sean debidas
al hecho de que provienen de diferentes membranas.
Fatt y Katz (1953) mostraron que las fibras musculares
de crustáceos podían generar un potencial de acción en
respuesta a la estimulación eléctrica en soluciones carentes
de Na+ en el músculo rápido de la rana. Bianchi y Shanes
(1959) mostraron que el influjo de Ca2+ aumentaba 30 veces
cuando el músculo era estimulado. En esta misma preparación
en solución carente de Cl- y con TEA, se puso de manifiesto
una corriente entrante de Ca2+ (Standfield, 1977; Sánchez y
Stefani, 1978).
60
En los músculos esqueléticos rápidos de embrión de pollo
(digitorum flexore) fué registrado un potencial de acción con
una meseta insensible a TTX y que era en cambio, bloqueada
por Mn2+ (Kano y Shimada, 1973; Kano, 1975). Esta meseta
desaparece con el desarrollo, lo que sugiere que los canales
de Ca2+ son modulados por las influencias neurales.
En músculo esquelético de rata, también se registro un
potencial cuyo componente de Ca2+ también desaparece con el
desarrollo (Cognard, Lazdunski y Romey, 1986; Gonoi y
Hasegawa, 1988).
En soluciones carentes de Na+ y Cl- y con Ba2+ como el
ión permeante en miotubos cultivados del músculo pectoralis
(músculo rápido) del pollo Kano y col., 1989, reportaron
potenciales de Ba2+ cuya morfología era modificada durante el
desarrollo. Estas diferencias fueron posteriormente asociadas
a dos tipos de canales de calcio, uno de bajo umbral y otro
de alto umbral (ver mas adelante).
En general, los canales de Ca2+, se abren con la
despolarización de la membrana y muestran algún grado de
inactivación durante la despolarización sostenida. Tienen al
menos, moderada selectividad a los iones y son bloqueados por
varios agentes hidrofóbicos y cuaternarios que actúan
6 1
internamente en la membrana. Se ha confirmado que los
ionesdivalentes permeantes compiten con el Ca2+ por la
entrada al canal y que los iones divalentes como son el Ni+,
Ca2+ o Co2+ bloquean competitivamente los flujos de Ca2+
(Hagiwara, 1983; Bean, 1989; Hess, 1990; Tsien, Hess y
McCleskey, 1987).
También algunos compuestos orgánicos son potentes
bloqueadores de los canales de Ca2+ como el verapamil y el
D600 (Kohlardt, Bauer, Krause y Fleckenstein, 1972). Hace
algunos años se demostró ser la nifedipina mas efectiva que
el D600 como bloqueador de la ICa (Almers y Palade, 1981;
Glossman, Ferry y Rombusch, 1984).
Por otro lado, en músculo de percebe y en neuronas de
caracol, la ICa parece depender de la concentración
intracelular de Ca2+ ionizado y tiende a bloquearse por el
incremento de Ca2+ intracelular, ya que una concentración
intracelular de este ión de 5X10-6 M reduce importantemente
la ICa. Esta hipótesis sugiere que el decaimiento de la ICa
es debida a la acumulación de Ca2+ intracelular, evidencias
que también han sido reportadas ocurren en otras
preparaciones (neuronas de Aplysia, paramecio y en músculo
esquelético de insecto) (Standen y Standfield, 1982).
6 2
11.2.1. TIPOS DE CANALES DE Ca2+
De acuerdo a criterios electrofisiológicos Y
farmacológicos, a la fecha y particularmente en neuronas, se
han definido al menos seis tipos de canales de Ca2+ voltaje-
dependientes: T, L, N, P, Q y R (Modulator, Alomone labs. 5
1996-97). De estos tipos de canales solamente dos han sido
reportados principalmente en el músculo esquelético: los
canales tipo T y L (González-Serratos, 1981; Stefani y
Chiarandini, 1982; Cognard, Ladzunski y Romey, 1986; Arreola
y col., 1987; Tsien y col., 1987; Bean, 1989; Kano y col.,
1989; Caterall, 1992; Hullin, Biel, Flockerzi y Hoffmann,
1993).
En la figura 20 se muestra un cladograma que esquematiza
el origen de los distintos canales de Ca2+ y su localización
en los distintos tejidos. Al parecer, los distintos canales
de Ca2+ fueron originados por un ancestro común que modificó
su expresión hacia un tipo de canales sensibles a DHP
(nifedipina y nitrendipina) y otro no sensibles a DHP; de los
cuales, el gen que codifica para canales de calcio tipo L
(CaCh1) solamente ha sido encontrado en músculo esquelético,
lo que le confiere características regulatorias muy
particulares a este canal, con respecto al encontrado en otro
tipo de tejidos (Hullin y col., 1993).
63
Los canales tipo T son canales de Ca2+ de bajo umbral
que se abren con pequeñas despolarizaciones (con un bajo
umbral), se inactivan rápidamente y son resistentes a
dihidropiridinas (como la nifedipina y nitrendipina) y a la
estimulación R-adrenérgica (González-Serratos, 1981; Arreola
y col., 1987).
En contraste, los canales de Ca2+ tipo L se activan con
un alto umbral, se inactivan lentamente, son bloqueados por
dihidropiridinas, como la nifedipina (Glossman y col., 1984;
Bean, 1989; Caterall, 1992; Hullin y col., 1993) y también
por antagonistasde los canales de Ca2+ como el verapamil 0 el
diltiazem (Hoffmann, Flockerzi, Nastainczyc, Ruth y
Schneider, 1990). Este tipo de canales son expresados en
células neuronales, endócrinas y en músculo cardiaco, liso y
esquelético (Hullin y col., 1993). Además se ha reportado que
este tipo de canales L son modulados por hormonas y
neurotransmisores (Hille, 1983; Arreola y col., 1987; Tsien y
col., 1987; Bean, 1989; Caterall, 1992) y en general, por
mecanismos que activen la producción de AMPc en un mecanismo
d e fosforilación dependiente de AMPc (Mundiña-Weienmann,
Chang, Gutiérrez y Hosey, 1991) como sucede con la adrenalina
y el isoproterenol.
Por otro lado, los canales tipo L, N, P y Q requieren de
despolarizaciones mayores para su apertura. Los canales N,
6 4
son insensibles a dihidropiridinas pero son bloqueados por la
conotoxina y los canales P y Q son sensibles a la agatoxina.
La corriente iónica acarreada a través de los canales R,
recientemente identificada en neuronas es insensible a las
toxinas, pero es sensible al Ni2+.
65
Figura 20. El origen de los distintos canales de Ca2+ es a partir de un ancestro común. CaCh es elgen que codifica para cada tipo de canal de Ca2+ y en particular el gen CaCh1, solo ha sidoencontrado en músculo esquelético (Tomado de Hullin y col., 1993).
6 6
Los canales tipo T, han sido reportados recientemente en
músculo embrionario y fetal. En el músculo rápido de pollo,
estos canales están relacionados con la actividad espontánea
de contracción que tienen los mioblastos y los miotubos en
cultivo (Kano y col., 1989). Estos canales tipo T desaparecen
después de un tiempo (3-6 días de cultivo), predominando la
actividad a través de canales tipo L. A los canales tipo T se
les ha asociado con el inicio de la actividad espontanea de
las células musculares, la cual al ser de bajo umbral,
activa (en las células en desarrollo) la expresión de canales
de Ca2+ tipo L (Cognard, Ladzunski y Romey, 1986; Caterall,
1988; Bean, 1989; Kano y col., 1989). El mecanismo que regula
la expresión de estos dos tipos de canales de Ca2+ y la
significancia fisiológica de su aparición temprana durante el
desarrollo no ha sido totalmente aclarada.
11.3. ESTRUCTURA DEL CANAL DE Ca2+
Los canales tipo L del músculo esquelético están
compuestos de cinco diferentes subunidades: a1 (llamada
también αlS), α2, β, π y ∞ (fig. 21) (Caterall, 1988; 1992;
Tanabe, Beam, Adams, Niidome y Noma, 1990; Hullin y col.,
1993) 1990). La subunidad α1 (de 212-273 KD) es el
componente formador del poro del canal, mientras que las
otras cadenas pueden cambiar su propiedad en los diferentes
tipos celulares donde ha sido reportado este tipo de canal de
6 7
calcio (Caterall, 1988; 1992; Lamb, 1991; Hullin y col.,
1993). Esta subunidad es el receptor a dihidropiridinas y a
fenilalquilaminas (Tanabe y col., 1990).
Todas las subunidades α 1 hasta ahora reportadas,
revelan estructura similar, consistiendo de cuatro
repeticiones homologas (1, II, III y IV), con sus terminales
amino y carboxilo orientadas hacia el lado interno de la
membrana (fig. 21A). Todas ellas forman una estructura muy
similar a aquella de los canales de k± y Na+ voltaje-
dependientes. En el dominio S4 se localiza el sensor al
voltaje del canal (Lamb, 1991; Caterall, 1992). La estructura
molecular de este dominio al parecer, se ha conservado en
todo el reino animal (ver revisión de Keynes, 1994).
La subunidad al está unida al complejo a2 (de 143 KD) y
a una subunidad δ (de 27KD) por enlaces disulfuro. Las
subunidades β (54 KD) y δ son mas pesadas que α 2 e
interactúan directamente con α 1 En la subunidad α1 y β se
localizan los sitios que son sustratos de fosforilación por
proteinas AMPc-dependientes (fig. 21B). La subunidad αl
contiene el sitio receptor a antagonistas orgánicos del canal
de Ca2+ (DHP, verapamil, diltiazem) y se considera ser el
componente funcional principal del canal de Ca2+ (Lamb,
1991). La fosforilación de la subunidad al representa el
6 8
mecanismo de regulación del canal por agonistas β -
adrenérgicos (Levitan, 1985; Caterall, 1988; TAnabe y col.,
1990).
La conductancia del canal en concentraciones normales de
Ca2+ (1-5 mM) no es clara, la corriente es muy pequeña y solo
ha sido posible explorarla con concentraciones de Ca2+
mayores o utilizando iones mas permeantes a través del canal,
como es el Ba2+ (véase más adelante).
69
Figura 21. Muestra la estructura molecular propuesta para el canal de Ca2+ de músculo esquelético. EnA, los cuatro dominios homólogos transaembranales de la subunidad al (1, II, III y IV) y lasy las distintas subunidades gue que lo conforman: α,β,δ y 6 (Be Hullin y y col., 1993). En B,un modelo hipotético, del canal de calcio, basado en datos bioquímicos. Ψ son sitios deglicosilación;(.PJ sitios de fosforilación y SS, uniones disulfuro del canal (Be Caterall,1988).
7 0
11.4. PROTEÍNAS G Y LOS CANALES DE CALCIO
Su función es regular muchas otras proteínas, las
proteínas de unión a núcleotidos de guanina (proteínas-G) son
además fosfatasas, que dividen al trifosfato de guanosina
(GTPasas) para formar difosfato de guanosina (GDP). Debido a
esta actividad, estas proteínas oscilan entre los estados de
transición de unión a GTP y GDP y así regulan diversos
procesos, tales como la síntesis de proteínas, el ensamble
del citoesqueleto, transporte vesicular, transducción de
señales y acción directa sobre los canales iónicos (Dolphin,
Wootton, Scoot y Trentham, 1988). La superfamilia comprende
tanto proteinas-G monoméricas como multiméricas y en todas
ellas la liberación de la unión a GDP y su unión a GTP es un
proceso altamente regulado. Las proteínas G heterotriméricas,
consisten de tres subunidades: alfa (α), beta (β) (6) y gama (α),
asociadas en un solo complejo Gαβρ(aGque en su estado de
reposo, la proteína-G permanece en la membrana como
heterotrimero Gαβδ (GaBa) unido a GDP a través de su subunidad Ga.
La estimulación de la actividad de la proteína-G hace que se
disocie el complejo Ga del GβδGBr y se una el primero al GTP.
Estos complejos disociados pueden unirse a otra proteína y
estimular (Gas) ó inhibir (Gai) su actividad fisiológica
(Cockroft y Stutchfield, 1988; Tassig y Gilman, 1995) (fig.
22A). Cuando un receptor (R) es activado por una hormona (H),
la transducción de la señal emitida por el receptor ocupado
71
por la hormona activa a una proteína G que se disocia al
unirse al GTP en dos moléculas transmisoras de la señal (GTP-
y GTP-bd Posteriormente, estas subunidades regulan
diversos sistemas efectores: adenilato ciclasas (AC's)
productoras de segundos mensajeros como el AMPc, fosfolipasas
C (C's) productoras de IP3, fosfosdiesterasas (PDE), canales
iónicos (principalmente de Ca2+ y una gran variedad de
canales de K+) y otras funciones no definidas (Dolphin y
col., 1988) (fig. 22B).
La terminación de la señal para ambas subunidades ocurre
por una hidrólisis del GTP por las GTPasas activadas por las
proteínas reguladoras de las proteínas-G llamadas GAP
(Iyengar, 1997).
a
Figura 22. Componentes del sistema de transducción de señales a través de un sistema deproteínas G. En A se muestra como la interacción de una hormona (estimulante, s, óinhibitoria, i) unidas a su respectivo receptor, pueden desencadenar la vía de segundosmensajeros a través de una proteína G que activa a una enzima membranal, la adenilato ciclasa(C) . En B, los distintos sistemas que regula una proteína G activada por la interacción de lahormona con el receptor. PDE, es la enzima fosfodiesterasa; AC, la adenilato ciclasa.
73
Se ha mostrado que la subunidad GTP,δS, análogo no
hidrolizable del GTP, activa proteínas-G al unirse a Gα
manteniéndola en un estado activado que puede causar la
contracción en fibras musculares desnudas (Di Virgilio,
Salviati, Pozzan Y Volpe, 1986). Este hallazgo ha sido
cuestionado, sin embargo existen evidencias de que las
proteínas-G pueden estar ligadas a la actividad de los
canales de Ca2+, ya que la entrada de Ca2+ en túbulos-T
sellados fué la causa de la contracción en las preparaciones
de fibras desnudas (Di Virgilio y col., 1986; Somasundaram y
col., 1991). Se ha mostrado ademas, en fibra cortada y en
fibra intacta, que la GTP,S incrementa la sensibilidad al
voltaje del receptor a DHP, tanto en términos de movimiento
de carga como en la apertura de canales de Ca2+ (García,
Aldeco y Stefani, 1990).
En cuanto a las proteinas-G endógenas del músculo
esquelético Scherer, Toro, Entman y Birnbaumer (1987) Y
Villas, Robert, Carrier, Beeler, Rout, Toutant y Dupont
(1989) encontraron que afecta mayormente al receptor a DHP un
componente llamado Gαo, de 40 KDa que es sensible a la toxina
pertussis localizado particularmente en los túbulos-T
(Toutant, Barhanin, Bockaert y Rout, 1988; Villaz y col.,
1989). En el músculo esquelético lento se ha descrito que
existe una mayor concentración de Gαo que en el músculo
rápido en el cual se encuentra una mayor proporción de G αs
74
(Toutant y col.,1990; Somasundaram y Treager, 1993).
11.5. ANTECEDENTES INMEDIATOS
Se ha reportado en las fibras rápidas que la adrenalina
incrementa la tensión modulando canales de Ca2+ (González-
Serratos, 1981; Arreola y col., 1987), por lo que respecta a
las fibras tónicas de la rana, el incremento de la tensión
por adrenalina está asociada también a una modulación
adrenérgica de los canales de Ca2+ un incremento en la IBa
(Huerta y col., 1991; Huerta y col., 1997).
Cuando se utilizan bloqueadores de los canales de Ca2+,
la tensión producida por las fibras lentas es menor respecto
que en soluciones normales. Esto nos sugiere, en principio,
que la participación del Ca2+ que entra a la célula,
probablemente vía canales de Ca2+ es importante para la
generación de la tensión y que en vista de que la adrenalina
disminuye la tensión podría la adrenalina modular estos
canales de Ca2+. De esta manera, resultó interesante
investigar la presencia de canales de Ca2+ en la membrana de
las fibras de sacudida lenta del pollo y estudiar si estos
canales de calcio están sujetos también a una modulación
adrenérgica como sucede en otro tipo de músculos.
75
Para investigar la presencia de los canales de Ca2+ en
la membrana de las fibras musculares lentas del pollo,
efectuamos la serie de experimentos que a continuación se
describen.
7 611.6. M E T 0 D 0
A fín de detectar la presencia de una conductancia al
Ca2+ fué necesario bloquear aquellas conductancias que se le
opondrían, ya que éstas la enmascararían. En la membrana de
las fibras musculares lentas del pollo, la conductancia que
predomina es la de K+ y Na+ (Ginsborg, 1960; Huerta y
Stefani, 1981), por lo tanto, fué necesario utilizar en la
solución de registro (tabla 4) un bloqueante de los canales
de IZ+ como es el tetraetilamonio (TEA) (Standfield, 1970) y
carente de Na+. Ademas de sustituir los aniones permeantes
(Cl-) por otros no permeantes como el acetato. Fue necesario
utilizar un catión divalente que permeara más fácilmente a
través de los canales de Ca2+ como el Ba2+. Seleccionamos el
Ba2+ por dos razones fundamentalmente:
1) se conoce que el Ba2+ sustituye bien al Ca2+ como
acarreador de corriente a través de los canales de
calcio (Fatt y Ginsborg, 1958; Hagiwara y Naka, 1964) y,
2) además también se conoce que bloquea la corriente de K+
dependiente del voltaje (Sperelakis, Schneider y
Harris, 1967; Bean, 1989; Kano y col., 1989; 1992).
Los experimentos fueron realizados en músculo ALD
completo, aislado en solución normal (referida en Tabla 1) y
77
posteriormente se cambiaba esta solución por la solución
modificada de Kano y col. (1989) (véase Tabla 3) en la cual
era equilibrado el músculo por un periodo de 15 minutos,
cambiando inmediatamente la solución y procediendo al
registro. A fín de evitar artefactos mecánicos durante
despolarizaciones prolongadas, el músculo fué sobreestirado.
De esta manera, la solución de registro tenía la composición
en mM que se describe en la siguiente tabla.
Tabla 3
Solución de registro IBa (modificada de Kano y col,, 1989)
Ba (acetato)2
TEA (acetato)
Mg (acetato)2
Glucosa
pH
(mM)
50.0
53.0
10.0
2 g/l
7.4
* Se utilizó el Trismaleato para ajustar el pH.
78
Cuando usamos concentraciones de Ba2+ de 10 y 20 mM fué
necesario agregar también 3,4-DAP (5 mM) para bloquear aún
más la conductancia al K+ (Sánchez y Stefani, 1983).
Los bloqueantes de los canales de Ca2+ (Co2+, Cd2+,
Nifedipina), así como el isoproterenol y el propranolol,
fueron adicionados directamente a la solución de registro a
partir de soluciones madre.
A fín de obtener registros del potencial de membrana
(Vm tanto para las respuestas sub-umbral como para las
respuestas regenerativas (potencial de acción), se aplicaban
a las fibras musculares pulsos rectangulares de corriente
constante (10) de duración y amplitud controladas (véase
dispositivo experimental fig. 23A). Entre pulsos consecutivos
se mantenian a las fibras a un potencial (Vh) de -80 mV. El
potencial de reposo efectivo se mantenía Vm en valor (Vh)
ligeramente hiperpolarizado; esto con el fín de remover la
posible inactivación de las conductancias por la
despolarización debida a la inserción de los mícroeléctrodos.
El método de fijación de voltaje utilizado en este
estudio fué el denominado "fijación de voltaje con tres
microelectrodos intracelulares cerca del extremo de la fibra
muscular" (fig. 23B) (Adrian, Chandler y Hodgkin, 1970).
79
I
Figura 23. Dispositivo experimental para el registro eléctrico. En A, para el registro del potencial yen B, para el registro de la corriente iónica, A, es un amplificador operacional; B, un tansductor I-V: C, es la cámara experimental; D, los amplificadores seguidores de voltaje; E, el amplificadordiferencial; F, la interfase TL-l A/D, D/A; G, la computadora.
80
De manera breve, la técnica de fijación de voltaje con
tres microelectrodes intracelulares utilizada para el
registro de la IBa, consiste en que dos microelectrodos
llenados con KCl 3M se insertan a una distancia de x=1 y x=21
del extremo de la fibra, con la finalidad de registrar los
potenciales de la membrana V1 Y V2). Un tercer
microelectrodo, llenado con citrato de potasio 2M es colocado
a una distancia x=21+1? y es usado para aplicar corriente de
retroalimentación (10). El potencial de la membrana fué
controlado en x=1 (V1) y mantenido a -80 mV y a partir de
éste se aplicaron pulsos de duración y amplitud variable. El
baño fué mantenido a tierra virtual mediante un alambre de
AgCl no-polarizable (véase dispositivo experimental).
De acuerdo a la teoría del modelo de fijación de voltaje
con tres microelectrodos, se puede demostrar que la corriente
transmembranal por unidad de área superficial de la fibra (Im
A/cm2) en el punto VI resulta proporcional a la señal V2-VI,
dado por la relación:
1, =312Ri,
donde a es el radio de la fibra, V2-V1 es la diferencia entre
las señales registradas en V2 y en V1, 1 es la distancia
entre V1 y el extremo (igual a la distancia entre V1 y V2) y
a(V2-Vl)
81
Ri es la resistencia específica de la membrana, que para las
fibras lentas se considera de 250 Ω.cm (Stefani y Steinbach,
1969; Gilli y Hui, 1980; Huerta y Stefani, 1986). El radio de
la fibra y la distancia entre los microelectrodos fueron
medidos mediante un ocular calibrado.
II.6.1. MICROELECTRODOS
Los microelectrodos fueron fabricados con capilares de
vidrio con filamento interno, los cuales poseían un díametro
externo de 1.2 mm y 0.68 mm de diametro interno. Se
fabricaron dos tipos de microelectrodos: de registro de
potencial (V) y 2) de inyección de corriente (1). Estos eran
llenados por medio de una jeringa con aguja plástica. Los
microelectrodos para el registro de potencial eran llenados
con una solución de KCl (3M) y los de corriente con una
solución de citrato de K+ (2M). La resistencia fué de 17-20
MΩ para los microelectrodos de voltaje y para los
microelectrodos de corriente de aproximadamente de l0-12 mΩ.
82
11.6.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Las fibras musculares lentas poseen una resistencia de
entrada muy alta (>2.5 MΩ) (Stefani y Steinbach, 1969; Feede,
1969; Gilly y Hui, 1980) de tal manera que la inserción de
mícroelectrodos resulta en una gran conductancia de fuga y
una reducción de los valores del potencial de reposo. Además
de que a despolarizaciones grandes, se alcanza el umbral para
la contracción y la fibra se despolariza más (Gilly y Hui,
1980). Una manera de reducir estos artefactos mecánicos y
posibilitar el registro de las corrientes iónicas en la
membrana a potenciales más positivos que el umbral para la
contracción es utilizar soluciones hipertónicas o bien
sobreestirar el músculo antes de la inserción de los
microeelectrodos. De esta manera, para el registro
experimental el músculo ALD fué sobreestirado y colocado en
la solución de registro (tabla 4). A las fibras musculares
lentas se les insertaron dos microelectrodos (para el
registro del potencial) y tres microeléctrodos (para el
registro de la IBa). Se aplicaron pulsos despolarizantes de
intensidad variable a estas fibras musculares a partir de un
potencial de mantenimiento de -80 mV. La duración de los
pulsos aplicados fué de 300 ms para el potencial y de 1
segundo para el registro de la IBa
83
La estimulación y registro fué facilitada por el
software (pClamp 5.1, subrutina clampex, Axon Instruments) y
mediante la conección del transductor I-V de un amplificador
a una tarjeta (TL-l) y a una computadora (AT486) se
posibilitó la digitalización y almacenamiento de las señales
para su posterior análisis. Durante la adquisición de los
registros, en el protocolo de estimulación se adicionaron
previo al pulso de prueba, una serie de 4 prepulsos
hiperpolarizantes (protocolo p/4 del clampex) para la resta
de componentes lineales. Todas las señales fueron adquiridas
a 10 KHz y amplificadas por un sistema de amplificadores
seguidores de voltaje y amplificadores diferenciales
acoplados al sistema AD/DA y a la computadora (fiq, 23B). Las
señales registradas fueron visualizadas simultaneamente en la
pantalla de un osciloscopio (TEKTRONIX) y en la pantalla del
monitor de la computadora.
8 4
11.6.3. ANÁLISIS
El análisis de los registros fué realizado con las
subrutinas CLAMPFIT y CLAMPAN del pClamp (ver. 6.0).
Previamente a la medida de los trazos, la corriente de
membrana registrada fué corregida para los componentes
lineales. Posteriormente, la corriente fué filtrada mediante
los procedimientos análogos del software de análisis
(Clampfit de pClamp 6.0). Las gráficas fueron realizadas con
el software SIGMAPLOT y SIGMA (Jandel Scientific) e impresos
en una impresora láser IIP ó Deskjet 400 (Hewlett Packard).
Las medidas aquí reportadas son expresadas como la media ± el
error estándar: cuando se realizaron pruebas de
significancia, se utilizó la "t de Student" con un nivel de p
<0.05
8 511.7. RESULTADOS
II.7.1. POTENCIALES DE Ba2+ EN LAS FIBRAS LENTAS
Fatt y Ginsborg (1958) reportaron que las fibras
musculares de crustáceo, generaban potenciales debidos al
influjo de Ca2+ y que estos potenciales eran generados
también cuando el Ca2+ era sustituido por Ba2+ o Sr2+ en la
solución extracelular. Por otra parte, Huerta y Stefani
(1986), describieron potenciales y corrientes de Ca2+ en las
fibras tónicas de la rana. En células embrionarias del
músculo esquelético rápido del pollo se han reportado
potenciales de Ba2+, lo que indica la presencia de canales de
Ca2+ (Kano y col., 1989). En este sentido, nosotros también
investigamos si las fibras musculares lentas del pollo poseen
canales de Ca2+ dependientes del voltaje.
Mediante la técnica de fijación de corriente nosotros
registramos la respuesta de la membrana de las fibras
musculares lentas evocadas por pulsos despolarizantes de 300
ms de duración y de amplitud variable, partiendo de un
potencial de mantenimiento de -80 mV. En la figura 24 se
muestra un registro típico de los potenciales registrados
cuando el músculo fué bañado por solución que contenía 50 mM
de Ba2+ (ver tabla 3). Estos potenciales presentaban una
morfología semejante al potencial de bario descrito
86
previamente en las fibras rápidas de pollo (Kano y col.,
1989). Los potenciales presentan un umbral cercano a -60 mV.
Esta respuesta de Ba2+ fué consistentemente obtenida en 5
fibras lentas y consistía de una despolarización adicional
durante el curso de los pulsos electrotónicos (fig. 24A). Así
pues, las fibras lentas del músculo ALD al igual que las
fibras rápidas del pollo, son capaces de responder con
potenciales pequeños y lentos. Considerando que este
potencial en las fibras musculares lentas es originado por un
incremento en la conductancia iónica de la membrana, el ión
involucrado deberá tener un potencial de equilibrio positivo.
Dicho ión seguramente es el Ba2+, ya que es el único catión
en la solución con estas características. Por lo tanto, los
subsiguientes experimentos fueron hechos con el propósito de
mostrar la participación de los canales de Ca2+ en la génesis
de esta respuesta. Para tal fín se analizó el efecto del Co2+
y Cd2+ que se sabe, son bloqueantes de la conductancia al
Ca2+ en otras preparaciones (Sánchez y Stefani, 1978;
Hagiwara y Bierly, 1981). En este sentido, los potenciales
anteriormente descritos eran bloqueados al añadir Co2+ (5 mM)
a la solución. En esas condiciones solamente fué registrada
la respuesta electrotónica de la membrana (fig- 24B). También
la respuesta en tres fibras lentas fué bloqueada por Cd2+ (2
mM) (datos no mostrados). Cuando se utilizaba 3 mM de Co2+ el
potencial de Ba2+ se bloqueaba parcialmente, Este efecto fué
8 7
reversible, observándose en 4 fibras lentas del músculo ALD.
Estos resultados sugieren que el ión bario participa en la
génesis de estos potenciales en las fibras lentas del músculo
ALD del pollo.
88
Figura 24. Muestra un registro típico de los potenciales de Ba2+ de las fibras lentas de pollo y subloqueo por Co2+. En A, los potenciales obtenidos por despolarización de la membrana enuna fibra del músculo ALD bañado por una solución de bario (50 mM En B, la adición de Co2+
(5 mM a la solución de registro bloquea el potencial lento y evidencia solo la respuestaelectrotónica de la membrana. El potencial de mantenimiento en ambos casos fué de -80 mV.
89
II-5.2. CORRIENTE ENTRANTE LENTA DE BARIO EN LAS FIBRAS
LENTAS
Nosotros estudiamos las corrientes iónicas que subyacen
a los potenciales anteriormente descritos en las membranas de
estas fibras musculares lentas del pollo, utilizando para
ello el método de fijación de voltaje con tres
microelectrodos en el extremo de la fibra.
El potencial de la membrana de las fibras musculares
lentas fué fijado a -80 mV. Se aplicaron pulsos de voltaje
despolarizantes de 1 segundo de duración y de amplitud
variable. El músculo ALD estaba bañado por la solución de
registro (ver soluciones, tabla 3). En estas condiciones
experimentales, al aplicar pulsos despolarizantes se encontró
la presencia de una corriente entrante lenta y mantenida en
aproximadamente 30 fibras musculares exploradas. Esta
corriente se activó a potenciales entre -65 y -60 mV y se
incrementaba a medida que se incrementaba la despolarización
de la membrana. Cuando usamos concentraciones de bario en la
solución de 10 o 20 mM y con pulsos comando de valores
positivos, se observó que el decaimiento de la corriente
entrante fué seguida por una corriente saliente de K+ (fig.
25) I la cual no fué observada cuando se usaron 50 mM Ba2+ en
la solución de registro (fig. 26). Esta corriente saliente de
K+ sugiere que a esas concentraciones de Ba2+ los canales de
90
K+ no fueron totalmente bloqueados.
1
Figura 25. Muestra que con pulsos positivos la corriente entrante de Ba2+ seguida por una corrientesaliente de k+ La concentración de bario en la solución era de 10 mM El potencial demantenimiento fué de -80 mV y a la derecha de cada trazo, se muestra el potencial al cual fuéllevada la membrana por el pulso comando.
91
En la figura 26 se muestran tres trazos característicos
de la corriente entrante (Ba2+ 50 mM). Los valores de la
derecha de cada trazo corresponden al potencial al que fué
llevada la membrana durante el pulso. La corriente no mostró
inactivación con pulsos de un segundo de duración.
Figura 26. Muestra la corriente entrante de Ba2+ La concentración de Ba2+ en la solución era de 50mM. El potencial de mantenimiento fué de -80 mV. A la derecha de cada trazo, se muestra elpotencial al cual fué llevada la membrana por el pulso comando.
9 2II.7.3. CURVA CORRIENTE-VOLTAJE EN LAS FIBRAS LENTAS
En la figura 27, se muestra la relación corriente-
voltaje (I-V) obtenida de los registros promedio de 6 fibras
lentas, con dos concentraciones distintas de Ba2+ (20 y 50
mM) . En círculos y cuadrados llenos (0, m) se representa la
amplitud máxima de la corriente de bario a distintos
potenciales de la membrana, (a) cuando el músculo era bañado
por una solución conteniendo 20 mM de Ba2+. En cuadrados
llenos (m) cuando se usó una solución con 50 mM de Ba2+. Las
barras en cada símbolo representan el error estándar. Estas
curvas muestran que para ambos casos, la corriente se activa
con un umbral cercano a -60 mV y se incrementa en amplitud
con la despolarización de la membrana, hasta alcanzar un
valor máximo a potenciales cercanos a 0 mV (entre -10 y -6
mV). Una mayor despolarización de la membrana produce una
disminución en la amplitud de estas corrientes.
El potencial de inversión extrapolado para estas
corrientes de bario es de aproximadamente +60 mV. Este valor
extrapolado del potencial de inversión nos sugiere que la
corriente de potasio (IK) no fué completamente bloqueada por
el TEA, ni por el bario 20 mM.
Los resultados anteriormente descritos confirman la
presencia de canales de ca2+ en estas fibras lentas. Esta
corriente de Ba2+ registrada a través de canales de calcio
9 3
depende del voltaje; y, su amplitud depende de la
concentración extracelular de bario. Es decir, es de menor
amplitud cuando la concentración extracelular de Ba2+ es de
20 mM y se incrementa cuando la concentración de Ba2+ es
mayor.
IBa a dos concentraciones extracelulares de Ba2+. (l) a 20 mM y (l) a50 mM. El umbral para la IBa en ambas concentraciones del ión es cercano a -60 mV y zsuamplitud depende de la concentración del ión. El máxiamo valor de la IBa se localiza entre -10y -6 mV, a partir del cual la mayor despolarización conduce a una disminución de la IBa a unpotencial de inversión extrapolado a aprox. +60 mV.
IBa (υa/cm2)
II.7.4. EFECTO DEL Co2+ SOBRE LA CORRIENTE DE BARIO94
En la solución de registro para la corriente, el ión
Ba2+ es el único catión que puede llevar la corriente
entrante a través de canales de los canales de Ca2+. Por
ello, se estudio en 4 fibras lentas del pollo el efecto de
los bloqueantes de los canales de calcio, como es el Co2+,
que es un bloqueador competitivo de los canales de Ca2+
(Hagiwara y Takahashi, 1967; Hagiwara, Fukuda y Eaton, 1974).
En la figura 28 en el registro A, se muestra la
corriente entrante lenta a distintos potenciales (registro
control). En la misma figura pero en el registro B, se
observa el efecto de haber añadido Co2+ (5 mM) a la solución.
En esta figura (28B) se puede apreciar claramente que la IBa
es bloqueada por el Co2+. Este bloqueo es dependiente de la
concentración de Co2+, ya que al usar una concentración de 3
mM de Co2+ (Kano y col., 1989) en la solución de registro, la
IBa no fue totalmente bloqueada. Estos resultados confirman
que la corriente entrante en las fibras lentas es llevada
por Ba2+ a través del canal de Ca2+
95
Figura 28. de la IBa por Co2+ (5 mM). En A, la IBa control obtenida a partir de un potencialde mantenimiento de -80 mV. En cuanto se adicionó Co 2+ (5mM) a la solución de registro, la
es bloqueada.
9 6
II.7.5. EFECTO DE LA NIFEDIPINA SOBRE LA CORRIENTE DE BARIO
A fín de obtener información adicional sobre el tipo de
canal de Ca2+ por el cual está fluyendo la IBa, examinamos el
efecto de una dihidropiridina que es selectiva en bloquear
especificamente canales de calcio tipo L (Glossman y col.,
1984; Bean, 1989; Caterall, 1992; Hullin y col., 1993). Por
esta razón, se utilizó la nifedipina (5 PM) y en estas
circunstancias, la corriente de Ba2+ fué bloqueada por la
nifedipina. En la figura 29 se muestra un registro
representativo de los resultados obtenidos en estas
circunstancias experimentales. En la fig- 29A, se muestra un
trazo de IBa control, cuando el potencial de la membrana fué
llevado a -12 mV a partir de un potencial de mantenimiento de
-80 mV. En la fig. 29B, se ilustra la IBa después de
adicionar 5 υM de nifedipina a la solución de registro, donde
se puede observar que la corriente de bario es bloqueada.
Estos resultados son consistentes con la interpretación de
que la corriente entrante de Ba2+ es acarreada a través del
canal de Ca2+ tipo L, ya que la nifedipina bloquea
alostéricamente al canal de calcio al quedar atrapada en el
poro del canal al momento de abrirse este, impidiendo el
flujo de iones (Glossman y col., 1984).
9 7
Figura 29. Bloqueo de la IBa por nifedipina 5 υM En A, la corriente de bario control. A la derecha
del trazo se .muestra el potencial al cual fué llevada la membrana por el pulso comando. En B,después de adicionar nifedipina a la solución de reqistro, se puede observar que la IBa esbloqueada por la nifedipina.
98
II.7.6. EFECTO DE LA ADRENALINA SOBRE LA IBa EN LAS FIBRAS
LENTAS
Una vez que se demostró la presencia de los canales de
Ca2+ en la membrana de las fibras lentas del músculo ALD,
nuestra siguiente fase experimental fué investigar si estos
canales de calcio estaba sujetos a modulación adrenérgica.
Para realizar esta etapa experimental, se registró la
IBa en solución con 50 mM de bario y a potenciales de
membrana llevados a un valor cercano al valor máximo de la
corriente. En la fig- 30A se registró la corriente control.
Posteriormente se adicionó adrenalina (10 υM a la solución
de baño. En 4 fibras exploradas, observamos que la adrenalina
producía una disminución en la amplitud de la IBa en
aproximadamente 50 % (fig- 30B).
El efecto de la adrenalina sobre IBa se aprecia mejor en
la curva corriente-voltaje (fig. 31). En círculos llenos (e),
la IBa control y en cuadrados llenos (m) la IBa en solución
conteniendo adrenalina (10 uM) Las barras representan el
error estándar. En esta gráfica se puede observar que el
umbral no se modifica y el efecto de la adrenalina depende
del voltaje, alcanzando un efecto máximo en aproximadamente
-12 mV (52 ± 2 % n=4).
99
Figura 30. Modulación de la IBa por adrenalina. En A, la IBa control. En B, la IBa cuando se aplicòadrenalina (10 υM) a la solución de registro, se puede observar que la amplitud de la IBa esdisminuída. El potencial de la membrana fué fijado en -80 mV y se llevó la membrana a -12mV, para ambos casos.
100
Figura 31. Nuestra la curva I-V para la IBa(50 mM) y el efecto de la adrenalina sobre la IBa. Encírculos llenos (e), la IBa control y en cuadrados llenos (l) la IBa cuando se agregóadrenalina (10 uM) a la solución de baño, la amplitud de la IBa es disminuida en más del 50%con respecto al control.
101
II.7.7. MODULACION DE LA IBa POR ISOPROTERENOL
A fín de conocer si la modulación de la IBa por
adrenalina, también está relacionada con los receptores β-
adrenérgicos, se estudió el efecto de un agonista como es el
isoproterenol, que como ya se mencionó actúa preferentemente
sobre este tipo de receptores. En esta serie experimental,
cuando se usó el isoproterenol (10 υM), observamos un efecto
similar al producido por la adrenalina. La figura 32 muestra
un ejemplo representativo de esta serie experimental, en la
cual en la figura 32A, se muestra la corriente de bario
control cuando el potencial de la membrana fué llevado a -12
mV a partir de un potencial de mantenimiento de -80 mV.
Cuando aplicamos isoproterenol (10 uM) a la solución de
registro, la amplitud de la corriente de bario es disminuída
por el agonista β-adrenérgico en aproximadamente 50% de su
amplitud control (fig. 32B).
102
Figura 32. Disminución de la IBa por isoproterenol (10 pH). En A, la IBa control y en B, elefecto de aplicar isoproterenol a la solución. A la derecha de cada trazo el potencial alcual fué llevada la membrana por el pulso comando.
103
II.7.8. EFECTO DEL PROPRANOLOL SOBRE LA MODULACION
ADRENERGÍCA DE LA IBa
Los resultados anteriormente descritos, nos indican que
la IBa está siendo modulada por la adrenalina al interactuar
con receptores B-adrenérgicos. Esto fué adicionalmente
confirmado cuando se usó adrenalina (10 υM) más el
antagonista β-adrenérgico propranolol (5 υM). En la figura
33 se ilustran dos trazos superpuestos de la corriente de
bario registrada a un mismo valor de potencial. A la derecha
se indica el valor del potencial. En círculos vacíos (o) la
IBa control cuando el potencial al que fué llevada la
membrana. En círculos llenos (l) cuando se adicionaron
adrenalina (10 υM) y propranolol (5 υ M ) a la solución de
baño. En estos registros superpuestos no se observa cambio en
el trazo de corriente.
Figura 33. Efecto del propranolol (5 υM) antagoniza la acción de la adrenalina (10 pH). En círculosvacíos (0) la IBa control y en círculos llenos (o) superpuesta la IBa en presencia deadrenalina 10 υM y propranolol 5 υM.
104
Estos efectos del propranolol se aprecian mejor en la
curva corriente-voltaje de la figura 34. En esta curva se
muestra en círculos llenos (8) la corriente control y en
cuadrados llenos (m) la IBa cuando se agregó a la solución
del baño adrenalina (1OυM) y propranolol (5υM). Como se puede
notar, la adrenalina en presencia de propranolol no produce
una disminución de la IBa y no se modifica apreciablemente el
umbral. Las barras reflejan el error estándar de 4 fibras
lentas del pollo.
105
Figura 34. Curva I-V que muestra la acción del propranolol y adrenalina sobre la IBa. (l) la corrientecontrol y (m) con adrenalina ( lOυM) y propranolol (5υM). Note que no existe ladisminución de la IBa previamente observada con adrenalina.
106
III- DISCUSIÓN GENERAL
Los resultados experimentales de la parte 1 de la
presente tesis muestran que la adrenalina produce una
sminución de la tensión generada por K+ en las fibras
ntas del músculo ALD del pollo. Al parecer, este efecto es
través de los receptores beta-adrenérgicos (A), puesto que
agonista especifico B-adrenergico como es el isoproterenol
causa un efecto similar. Esta acción de la adrenalina sobre
a tensión es bloqueada por un antagonista A-adrenérqico como
s el propranolol (Hoffman y Lefkowitz, 1996), confirmando
Si que la acción es por medio de los receptores β−
tdrenérgicos.
Por otro lado, los efectos que produce la activación de
-os receptores A-adrenérgicos son mediados por la activación
le la enzima adenilato ciclasa, la cual, en otras
preparaciones biológicas causa un incremento en el nivel
intracelular de AMPc (Rasmussen y Tenenhouse, 1968;
Sutherland, 1982; Oota y Naqai, 1977; Tsien, 1977;
Fellenius, Hedberg, Holmberg y Waldeck, 1980; Sutherland,
1982; Williams y Barnes, 1989; Cairns y Dulhunty, 1993 ;
Huerta, Trujillo y Vásquez, 1997). En las fibras lentas del
músculo ALD del pollo nosotros encontramos que cuando se
aplica un análogo permeable del AMPc (el 8-Bromo AMPc), éste
causa una disminución de la tensión de las contracturas Por
107
K+, semejante a la producida por adrenalina. Estos resultados
sugieren que esta acción de la adrenalina es mediada a través
del AMPc intracelular
Basados en el conocimiento que existe de la acción de la
adrenalina, a nivel intracelular, sobre el músculo
esquelético, podemos considerar diversos mecanismos para
publicar el efecto de la adrenalina sobre las fibras lentas
. músculo ALD del pollo. Estos mecanismos incluyen: 1)
calificaciones en la fosforilación de la miosina; 2) cambios
los procesos que regulan la liberación y recaptura del
cio del retículo sarcoplásmico y, 3) alteraciones del
'lujo de calcio a través de los canales de calcio del
colema. A continuación discutiremos estos mecanismos.
La disminución de la tension por adrenalina,
isoproterenol y 8 Br-AMPc en las fibras del músculo ALD del
.lo no puede ser explicada por una acción sobre la unión
iromuscular puesto que las preparaciones fueron curarizadas
) υ M de d-tubocurarina). Trabajos previos han mostrado que
acción de la adrenalina depende del tipo de músculo sobre
que actúa ya sea rápido o lento. La disminución de la
sión en las fibras lentas del músculo ALD es similar a la
minución que causa la adrenalina sobre la sacudida en el
culo completo soleo de mamífero (Bowman y Zaimis, 1958;
108
Bowman, Goldberg y Raper, 1962; Tomita, 1975; Holmberg y
Waldeck, 1979; Bowman y Anden, 1981).
Bowman y Anden (1981), sugieren que la acción de las
catecolaminas (adrenalina y noradrenalina) producen una
disminución de la tensión al disminuir la afinidad de los
miofilamentos por el Ca2+ y que este efecto posiblemente sea
mediado por el AMPc. Sin embargo, Fabiato y Fabiato (1978)
han reportado que la sensibilidad de las miofibrillas para el
calcio no cambia por acción de la adrenalina y el AMPc.
Actualmente en las fibras musculares lisas ha resultado ser
relevante este mecanismo (Stull, Blumenthal y Cooke, 1980).
Cairns y Dulhunty (1993) reportaron un incremento en la
tensión en fibras lentas únicas aisladas del músculo soleo de
mamifero, en contraste a lo encontrado cuando se utilizó
músculo completo por Bowman y Anden (1981). Sin embargo,
estos investigadores describieron que la adrenalina a
concentraciones inferiores a 10 υM, tenían doble efecto
sobre la tensión, es decir, primeramente la deprimían y
posteriormente la incrementaban, sugiriendo una probable
activación de distintos mecanismos que promueven la depresión
de la tensión con concentraciones intracelulares bajas de
AMPC. Las diferencias en el curso temporal del efecto de la
adrenalina en músculo completo y en fibras musculares únicas
puede ser debido al tiempo requerido por la hormona para
109
difundir dentro de todas las fibras musculares y alcanzar
todas las fibras individuales (compare los trabajos de Bowman
y Anden (1981) y de Cairns y Dulhunty (1993).
Por otra parte, en las fibras musculares rápidas de la
rana, se ha demostrado que la tensión de la sacudida aumenta
en la presencia de adrenalina (en fibras musculares únicas)
(Oota y Nagai, 1977; Gonzales-Serratos y col., 1981; Arreola
Y col, 1987). De acuerdo a Oota y Nagai (1977), la
instalación del efecto inotrópico positivo de la adrenalina
toma de 3 a 5 minutos para que aparezca el efecto y de 10 a
20 minutos para alcanzar un efecto completo.
En las fibras musculares lentas de la rana, la acción de
la adrenalina causa un incremento en la tensión de la
contractura por K+ (Huerta y col., 1991) y estas
observaciones fueron confirmadas por García y Escamilla-
Sánchez (1994).
Por lo que respecta a la posibilidad de que la
liberación ó recaptura del calcio del RS, se modifica por
acción de la adrenalina, Schwartz, Entman, Kanike, Lane,
VanWinkle y Bornet (1976) han mostrado que la proteína
reguladora del mecanismo de transporte de calcio al interior
del RS es fosforilada y este mecanismo de transporte es
110
estimulado por el AMPc. La fosforilación de esta proteína
reguladora puede incrementar la máxima recaptura de calcio
con la consecuencia en una elevada concentración de calcio
del RS (Fabiato y Fabiato, 1978; González-Serratos y col.,
1981). Sin embargo, en fibras musculares rápidas de la rana
Oota y Nagai (1977) y González-Serratos y col. (1981) han
reportado que la tensión desarrollada por las contracturas
por cafeína se incrementa por efecto de la adrenalina.
Martirosi y Beeler (1983) han mostrado que solamente la
proteína reguladora del mecanismo de transporte de calcio de
los músculos lentos es fosforilada. Estos investigadores
argumentan que el incremento en la recaptura de calcio por el
RS trae como consecuencia una'disminución de la tensión de la
sacudida y un incremento en la velocidad de relajación en las
fibras lentas de mamifero. En este sentido, nuestros
resultados experimentales al utilizar contracturas por
cafeína se observó que la adrenalina disminuye estas
contracturas, lo que estaría de acuerdo con estos autores y
podría explicar el hecho que si se aplica isoproterenol
durante la contractura por K+ la relajación se incrementa
hasta el punto de relajar espontáneamente las fibras lentas
del pollo.
Por último, en fibras musculares rápidas, la modulación
adrenérgica de la tensión está asociada a un mayor influjo de
111
calcio a través de los canales de calcio (Arreola y col.,
1981), así como en las fibras lentas de la rana (Huerta,
Trujillo y Vásquez, 1997). Por lo tanto, nosotros examinamos
la posibilidad que la modulación adrenérgica de la tensión en
fibras lentas del músculo ALD del pollo se deba a una
alteración de influjo de calcio a través de los canales de
calcio. Sin embargo, al no estar descritos los canales de
calcio en la membrana de las fibras lentas del músculo ALD
del pollo, primeramente tuvimos que realizar los experimentos
que mostraran evidencias de la presencia de estos canales de
calcio, para posteriormente estudiar si estos canales de
calcio estaban sujetos a modulación adrenérgica.
Nuestros resultados experimentales descritos en la parte
II de esta tesis muestran la presencia de canales de calcio
dependientes del voltaje en la membrana de las fibras
musculares lentas del pollo.
Se registraron potenciales de Ba2+ en la membrana de
estas fibras del músculo ALD del pollo, los cuales son
bloqueados por el Co2+, que se sabe es un bloqueante de los
canales de Ca2+. Esto sugiere que el sarcolema de estas
fibras musculares lentas del pollo posee canales de Ca2+. Se
realizaron una serie de experimentos con la técnica de
fijación de voltaje para estudiar la corriente iónica
112
subyacente a estos potenciales. Se registraron las corrientes
entrantes de Ba2+ que son también bloqueadas por el
bloqueador de los canales de Ca2+, como el Co2+. Estas
corrientes entrantes de Ba2+ son bloqueadas por nifedipina,
lo que nos sugiere que estas corrientes de Ba2+ son
acarreadas a través de canales de Ca2+ tipo L. Estos canales
comparten características similares a aquellas reportados
para las fibras tónicas de anfibio (Huerta y Stefani, 1986),
ya que son corrientes pequeñas y mantenidas en las cuales no
se aprecia inactivación durante pulsos de un segundo de
duración. Estas características también las poseen las
corrientes de bario registradas en las fibras rápidas de
pollo por Kan0 y col. (1989). Es conocido, en otras
preparaciones, que la inactivación de los canales de calcio
tipo L es lenta y depende del voltaje y del calcio
intracelular. La inactivación es más rápida cuando el Ca2+ es
el acarreador de corriente y mucho más lenta cuando en lugar
de Ca2+ es el ion Ba2+. Cuando el acarreador es el Ba2+
virtualmente no hay inactivación de la IBa con pulsos de más
de un segundo (Wollin, Kwan, Boose, Flockerzi, Hoffmann y
Kass, 1993).
Las curvas I-V para la IBa mostraron un umbral de
activación entre -65 y -60 mV, el cual es similar al
reportado por Huerta y Stefani (1986) para las fibras tónicas
de la rana y por Kano y col. (1989) para las fibras rápidas
del pollo. La máxima amplitud de la corriente fué obtenida a
potenciales entre -10 y 0 mV y cuando se utilizaron
concentraciones de Ba2+ entre 10 y 20 mM el decaimiento de la
corriente entrante era seguida por una corriente saliente de
K+, ya que a esas concentraciones de Ba2+ los canales de K+
no fueron totalmente bloqueados. Sin embargo, cuando
utilizamos 50 mM de Ba 2+ la corriente fué mantenida y de
mayor amplitud que aquella obtenida con menores
concentraciones de Ba2+ la solución (10 y 20 mM). Así
pues, la IBa es dependiente de la concentración del ión. La
IBa mostró un potencial de inversión extrapolado a aprox. +60
mV.
Los resultados experimentales también muestran que la
adrenalina y más específicamente el agonista-β isoproterenol
causan una disminución de la amplitud de la corriente
entrante de bario en las fibras lentas del músculo ALD de
pollo. El bloqueante β-adrenérgico, propranolol, bloqueó el
efecto de la adrenalina sobre la corriente de Ba2+.
Nuestros resultados sugieren que el efecto de la
adrenalina sobre la tensión puede ser debido, al menos en
parte a una disminución del influjo de Ca2+ a la fibra
muscular evidenciado como una disminución en la amplitud de
114
la corriente de bario a través de los canales de Ca2+ en las
fibras musculares lentas del pollo.
En contraste, el incremento en la tensión por adrenalina
en fibras de sacudida rápida de anfibio está relacionada con
un incremento del influjo- de Ca2+ a través estos canales de
Ca2+ (Arreola y col., 1987). La acción de los agonistas β−
adrenérgicos promueve la fosforilación de canales de Ca2+,
conduciendo a un incremento en su probabilidad de apertura
(Hille, 1992). El incremento en la tensión por adrenalina en
las fibras musculares lentas de rana, al parecer también está
relacionado con un incremento en el influjo de calcio (Huerta
y col., 1997).
Por lo que respecta al músculo ALD del pollo, una
posible explicación a este mecanismo de acción de la
adrenalina, es que al interactuar en la membrana de las
fibras musculares lentas del pollo, esta active otros
intermediarios en el mecanismo de transducción como son las
proteínas asociadas a nucleótidos de guanina (Gilman, 1987),
las cuales a la vez activen la vía del AMPc o bien que estas
proteínas inhiban la fosforilación directamente de los
canales de calcio produciendo una disminución en la entrada
de calcio (evidenciada como una disminución de la IBa).
115
Ademas, se ha reportado que las catecolaminas disminuyen
la concentración intracelular de calcio en el reposo de las
fibras musculares de sacudida lenta (Ballani y Grafe, 1988).
Las señales mediadas por las proteínas G activadas por
el receptor y otros sistemas de segundos mensajeros que
median la activación o inhibición de canales iónicos han sido
previamente reportadas (Holz, Rane y Dunlap, 1986; Scott y
Dolphin, 1986). En 1988, Dolphin y colaboradores, encontraron
que los análogos del GTP reducían la amplitud y hacían más
lenta la cinética de las corrientes de calcio tipo L en
neuronas sensoriales de varias especies incluyendo pollo y
rata, lo cual han asociado a las proteínas-G sensibles a la
toxina pertussis.
Por otro lado, Somasundaram y Tregear en 1993,
encontraron que el agonista b-adrenérgico, isoproterenol
(l0 υM), causaba en miobolas de músculo esquelético de rata
una disminución de hasta un 50% en la corriente de Ca2+ tipo
L. Esta disminución la asocian a una proteína G, ya que
también el sustrato no hidrolizable de la proteína G (GTPδS)
inhibió la corriente de Ca2+.
Al parecer, la subunidad GTPδS análoga tiene efectos
duales, ya que en el músculo esquelético lento, se ha
116
encontrado que la proteína G (Go) localizada particularmente
en los túbulos-T y que es sensible a la toxina pertussis,
produce una acción inhibitoria sobre los canales de calcio
(Toutant y col., 1990) y posiblemente esto explique la
disminución de la corriente de calcio por GTPδS.
Aunque nosotros no tenemos evidencias de la acción de
las proteínas G sobre la modulación adrenérgica de la tensión
y de los canales de calcio en las fibras musculares lentas
del pollo, una posibilidad sería ésta, la mediada a través de
un tipo particular de proteína G, que medie las acciones de
la adrenalina y el isoproterenol sobre la disminución de la
tensión y de la IBa en estas fibras musculares lentas.
Sin embargo, estudiar esta posibilidad nos permite
continuar con una línea de investigación que aclare más la
acción de la adrenalina sobre la modulación de la tensión y
de los canales de calcio en las fibras lentas del músculo ALD
del pollo.
1 1 7
I V . C O N C L U S I O N E S
Los presentes resultados experimentales sugieren las
siguientes conclusiones:
1. Que la tensión producida por K+ en las fibras musculares
lentas del pollo es disminuida por la adrenalina y por
el isoproterenol. Este efecto es bloqueado por un
bloqueante β como es el propranolol y el problable
mecanismo es a través del AMPc.
2. Las contracturas por cafeína son disminuidas por la
adrenalina, lo que sugiere que pudiera estar
incrementada la recaptura de calcio por el RS, lo que
podría contribuir, al menos en parte, a explicar la
disminución de la tensión.
3. Se demostró la presencia de canales de Ca2+ dependientes
del voltaje en estas fibras lentas del pollo, los cuales
presentan algunas similitudes con los canales de Ca2+
encontrados en las fibras rápidas del pollo (Kano et
al., 1989) y en las fibras tónicas de la rana (Huerta y
Stefani, 1986).
118
4. Que estos canales de Ca2+ también están sujetos a
modulación adrenérgica, ya que la adrenalina y el
isoproterenol disminuyen la amplitud de la IBa. Este
efecto es bloqueado también por el propranolol.
5. Por último, se sugiere que al menos en parte, la
disminución de la tensión por adrenalina, pudiera estar
relacionada con los canales de Ca2+a2+ en estas fibras
lentas del pollo. Nosotros desconocemos el mecanismo por
el cual la adrenalina y el isoproterenol disminuyen la
amplitud de la corriente de Ba2+.
119
V - R E F E R E N C I A S
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