Uji Pirogenitas

7/26/2019 Uji Pirogenitas

1/52

Uji sterilitas

danUji Pirogenitas

Ismi Rahmawati, M.Si, Apt


2/52

UJI STERILITAS


3/52


4/52

Pendahuluan

Salah satu persyaratan produk-produk untuk injeksi yaituharus bebas dari kontaminasi mikroorganisme.

Tujuan utama pembuatan sediaan steril adalah mutlak

tidak adanya kontaminasi mikroba. Tidak seperti syarat

banyak sediaan yang lain, syarat sterilitas adalah nilaiyang mutlak.

Mikroorganisme kontaminan umumnya dieliminasi

dengan Cara sterilisasi.


5/52

Produk Farmasi Steril Untuk produk parenteral, sediaan obat mata,

termasuk larutan lensa kontak , dan produk-produk

yang diberikan pada luka terbuka atau untuk proses

irigasi rongga tubuh. Uji sterilitas perlu dilakukanmutlak


6/52

Syarat Steril: Sterility Assurane !e"el dengan probabilitas sama

atau lebih baik dari #$-%, artinya dalam satu juta

sediaan steril hanya boleh maksimum # yang tidak

steril.


7/52

Digunakan untuk menetapkan apakah bahan atauproduk farmasi yang harus steril memenuhi syaratberkenaan dengan uji sterilitas seperti yangtertera pada masing-masing monogra bahanatau produk.

Mengingat kemungkinan hasil positif pada suatuproduk dapat disebabkan oleh pengerjaan yangsalah (teknik yang salah) atau kontaminasilingkungan pada waktu pengujian, diberlakukan

pengujian 2 tahap seperti yang tertera padabagian !enafsiran "asil #ji $terilitas

Tujuan :


8/52

Ketentuan Hasil Uji sterilitas

&ika terdapat kontaminasi mikrobadenganmenggunakan prosedur 'armakope indonesia,

maka dinyatakan bah(a bahan tersebut tidak

memenuhi syarat

)an sebaliknya jika tidak terdapat kontaminan

mikroba maka akan dinyatakan memenuhi syarat.

Analisis : berdasarkan tidak adanya pertumbuhan mikrobapada media Fluid Thioglycollate (FTM) dan Soyabean CaseinDigest (SCD)pada *$-*+ bakteri/ dan 0$-0+ 'ungi/

selama 1 dan #2 hari.


9/52

Media uji sterilitas

media yang digunakan harus mampu untukmerangsang pertumbuhan mikroba

Fluid Thioglycollate (FTM) / alternative

thioglycolat medium (ATM)ook untuk

pertumbuhan bakteri anaerob tapi jg dapat

aerob, pada suhu inkubasisuhu *$-*+

Soyabean Casein Digest (SCD)untuk

pertumbuhan bakteri aerobpada suhu *$-*+ bakteri/ dan 0$-0+ 'ungi/ selama 1

dan #2 hari.


10/52

Fluid Thioglycollate Medium %-&ystine '. g

$odium hloride 2. g

De*trose Monohydrate+anhydrous .+.'

ranulated agar '. g

east /*trat (water-soluble) .' g !anreati Digest of asein 0.' g

$odium thioglyoli 1id '. g

r 3hioglyoli 1id '.4 m%

5esa6urin $odium $olution (0 in 0'''),freshlyprepared 0.' m%

!uried 7ater 0'''m%

p" setelah sterilisasi ,0


11/52

Soybean-Casein digest Medium

!anreati Digest f &asein 0.' g !apai Digest of $oybean Meal 4.' g

$odium &hloride .' g

Dibasi !otassium !hosphate 2. g

De*trose Monohydrate+1nhydrous 2.+2.4 g

!uried 7ater 0''' m%


12/52

Prosedur pengujian:

inokulasi langsung ke dalam media uji (Directinoculation of culture medium )sesuai untuk sampel dengan 8olume keil8olume produk tidak lebih dari 0'9 dari

8olume medium$esuai untuk sampel a:ueous solutions, oily

li:uids, ointments and reamsDiret inoulation of the ulture medium

suitable :uantity of the preparation to bee*amined is transferred diretly into theappropriate ulture medium ; inubate for notless than 0< days.


13/52

Metode langsung umumnya digunakan untuk &airan

$alep dan minyak

=at padat

>apas murni ?enang bedah, perban, pembalut, dan sejenisnya

serta jarum,

1lkes dan alat suntik steril


14/52

Prinsipnya :

?ahan yang akan diuji disiapkan

masukkandalam media yang sesuai.

?ahan uji @ media dalam suatu erlenmeyersteril diinkubasi dalam inkubator minimal

0< hari dengan pengamatan pada setiap harimulai hari ke 4 hingga hari terakhirpengamatan. Dapat juga diberi jarak waktutertentu

#ntuk perlakuan awal sampel, preparasi dapatberbeda beda

#mumnya sampel berbentuk larutan. &airandigunakan untuk mendispersi atau membilas.


15/52

Perlakuan sampel awal

&airan Dapat dipindahkan langsung dengan pipet steril

atau jarum suntik dalam 8olum tertentu dalamtabung atau wadah steril

$alep !ilih 2' wadah yang tiap wadah mewakili

sampel, di bagi jadi 2 klpk A 0' wadah 0'' mg tiap wadah ke labu berisi 0'' ml

pembawa


16/52

teknik penyaringan membran.

!enyaringan membran berguna untuk airan dan serbuk yang dapat larut yang

bersifat bakteriostatik atau fungistatik, untukmemisahkan mikroba kontaminan daripenghambat pertumbuhan.

untuk bahan seperti minyak, salep+krim yangdapat melarut ke dalam larutan pengener bukanbakteriostatik atau bukan fungistatik.

3eknik penyaringan membran dapat juga

digunakan untuk uji sterilitas permukaan ataulumen kritis alat-alat kesehatan (BC C, 0EE).


17/52

Biltrasi Membran

Digunakan membran lterdengan ukuran pori tidak lebih besar dari ',


18/52

Tabel Jumlah Untuk Bahan CairCsi 7adah

(ml)

olume

minimum

(ml)

ol. minimum untuk media Humlah

7adah

!ermedia

#ntuk

inokulasi

langsung

#ntuk

membran

I 0

I 0'

0' - '

' - I0''

'-I0''

(C.)

0'' J ''

K ''

$emua

0

0'

$emua

$emua

$emua

0

0


19/52

Uji pirogen


20/52

Matinya mikroorganisme dalam produk 'armasi,belum menjamin tiadanya e'ek-e'ek merugikan akibat

kontaminan mikroorganisme.

3arena apabila komponen-komponen penyusun

mikroorganisme yang sudah mati tersebut dalam

jumlah yang ukup, mereka akan dapat menimbulkan

e'ek-e'ek yang tidak dikehendaki.

Salah satu komponen penyusun dinding sel bakteri,khususnya dari golongan gram negati' yang sering

menimbulkan e'ek merugikan adalah

!ipopolisakarida, yang dikenal sebagai endotoksin.

Pendahuluan


21/52

/ndotoksin adalah toksin yang dihasilkan olehbakteri gram negatif

!irogen adalah senyawa yang menyebabkankenaikan suhu tubuh akibat penggunaan

produk farmasi yang diberikan searaintra8ena

$emua endotoksin bersifat pirogen, tetapitidak semua senyawa pirogen itu merupakan

endotoksin


22/52

/ndotoksin dihasilkan oleh bakteri gramnegatif patogen ataupun nonpatogen selamamasa pertumbuhannya atau pada saat sellisis.

/ndotoksin bersifat tahan panas, merupakanantigenlemah, dan tidakdapat di ubahmenjadi toksoid.

/ndotoksin bakteri terdiri dari %ipopolisakarida

(%!$), umumnya terikatpadaprotein danfosfolipid. %!$ ini menyusun membran luarbakteri ram negatif. &ontoh %!$ dari Salmonella terdiri dari bagian

Lipid A yang hidrofob yang terikat pada suatu


23/52

Meskipunseluruh bakteri gram negatif memiliki%!$padadinding selnya, %!$ tidak bersifat toksikhingga dilepaskan dari membran luar dinding sel.

!ada saat bakteri gram negatif mati, disintegrasidinding selnya mengakibatkan pelepasan toksin

%!$. !elepasan endotoksin dalam sistem peredaran

darah dapat menyebabkan syok akibat penurunantekanan darah dan kegagalan fungsi banyak organ

/fek /ndotoksin ?agi 3ubuh Demam, akti8asi sistem sitokin, rusaknya sel-sel

endotelial, permeabilitas pembuluh darah berubahsehingga menyebabkan turunnya tekanan darah


24/52

/ndotoksin diperkirakan merupakan substansipirogenik yang sangat aktif. !irogenikmerupakan substansi yang mampumenyebabkan demam sampai pada kematian

dan sering menemari sediaan farmasi. #ji pirogenitas dimaksudkan untuk membatasi

resiko reaksi demam yang dapat diterima olehpasien apabila diinjeksi dengan suatu sediaan

farmasi. $ampai saat ini, substansi pirogenik yang

diketahui paling aktif dan paling seringmenemari sediaan farmasi adalah endoktoksin

Tu!uan


25/52

$ejak diketahui bahwa endotoksin ternyata mampumenggumpalkan sel darah %imulus, kemudiandikembangkan suatu pengujian untuk mendeteksi adanyaendotoksin dengan menggunakan reagensia yang dibuatdari sel darah Limulus.

!engujian ini kemudian dikenal sebagai metode Limulus

Amebocyt Lysate (%1%). Metode %1% merupakan pengujianin 8itro maka mulailah perusahaan-perusahaan melihatkemungkinan untuk menggantikan uji pirogenitas kelinidengan metode %1%.

3he %imulus ameboyte lysate (%1%) test adalah uji in8itro untuk deteksi dan analisis kuantitatif endotoksinbakteri. N Metode analisis %1% yang dilakukan menakupteknik gel-lot dan turbidimetri kinetik dankromogenik(kolorimetri).


26/52

#ji kelini telah lama digunakan untukmembantu industri farmasi menguji pirogenitassediaannya.

!engujian ini pada prinsipnya merupakan injeksiintra8ena ke tubuh kelini di bawah kondisitertentu dan selanjutnya dipantau dan diatattemperatur 4 kelini dalam jangka waktutertentu.

Hewanpercobaan digunakan kelini yangselama seminggu sebelum pengujian tidak

menunjukkan penurunan bobot badan.

"#$ %$&'*$TAS M*"*A+A* +,$*C$


27/52


28/52

3elini tidak dapat digunakan uji pirogenitas jika:

4 hari sebelumnya telah digunakan untuk

pengujian pirogenitas dan memberikan hasil

negatif

4 minggu sebelumnya telah digunakan untuk

pengujian pirogenitas, sediaan uji tidak

memenuhi syarat

3elah digunakan kapan saja untuk pengujian

pirogenitas dan respon rata-rata kelompok

kelini melebihi 0,2&


29/52

Alat termometer denganketelitian ',0 & dan alat suntik

Bahanuji 6at uji dilarutkan atau

dienerkan dengan larutannatrium klorida steril bebaspirogen atau bila larutan uji

sesuai dapat langsung digunakan


30/52

Cara/Prosedur pengujian

0 jam sebelum pengujianmasukkan kelini ke dalam kotakkelini sedemikian rupa sehingga

kelini tertahan dengan letakleher yang longgar, badannyabebas hingga kelini dapat duduk

dengan bebas


31/52

"!i -endahuluan

0 sampai 4 hari sebelum pengujian,suntikan intra8ena 0' ml per kg bobotbadan dengan larutan natrium klorida sterilbebas pirogen dalam ruangan yang tenang

!erbedaan suhu ruangan terhadap suhupemeliharaan tidak boleh lebih dari 4.$elama 0 malam hingga pengujian selesaikelini tidak diberi makan dan selamawaktu pengujian tidak diberi minum.

&atat suhu badan kelini dengan inter8altidak lebih dari 4' menit dimulai E' menitsebelum penyuntikan hingga 4 jam sesudahpenyuntikan dengan larutan natrium kloridasteril bebas pirogen. >elini yang


32/52

lakukan pengujian menggunakan sekelompok hewanperobaan terdiri dari 4 ekor kelini. "angatkansediaan uji hingga lebih kurang 4L,, suntikkanperlahan-lahan ke dalam 8ena auriularis tiap kelini.

!enafsiran hasil suhu awal tiap kelini adalah suhu

rata-rata 2 pembaaan suhu dengan inter8al 4' menitdan dilakukan


33/52

3elini dinyatakan memenuhi syarat jika perbedaan suhua(al antara kelini yang satu dengan yang lain tidak lebihdari #4. 3elini dinyatakan tidak memenuhi syarat jika

perbedaan suhu a(al lebih besar dari $,04suhu a(al lebihkeil dari *5,$4dan tidak lebih besar dari *6,54

Sediaan uji dinyatakan memenuhi syarat jika jumlah respontidak melebihi kolom 0 dan dinyatakan tidak memenuhisyarat jika jumlah respon melebihi kolom * untuk tiapkelompok.

&ika jumlah respon terletak antara kolom 0 dan kolom *,pengujian diulangi. &ika pengujian keempat jumlah responmelebihi %,%$4sediaan uji dinyatakan tidak memenuhi syarat

$nter-retasi hasil u!i


34/52

&umlah3elini

Sediaan ujimemenuhi syarat

jika jumlahrespon tidakmelebihi

Sediaan uji tidakmemenuhi

syarat jikajumlah responmelebihi

* #,0$ 0,1$

% 0,5$ 2,*$

6 2,+$ %,$

#0 %,%$ %,%$


35/52

7alaupun terdapat 8ariasi prosedurpelaksanaan pada berbagaiBarmakope,

tetapi pada prinsipnya adalah samayaitu menatat kenaikan suhubadan kelini sebagai respon

terhadap substansi pirogenik dalamsediaan yang disuntikkan ke tubuhkelini.


36/52

telah lama dikenal dan digunakan untuk menguji berbagai

sediaan dan terbukti memberikan hasil memuaskan.

$ensiti8itas kelini dan manusia terhadap substansi

pirogenik relatip sama. >enaikan suhu kelini akibat

substansi-pirogenik, sampai batas tertentu masih dapat

diterima oleh manusia sehingga kenaikan suhu kelini

tersebut dapat distandardisasi terhadap substansi

pirogenik yang dapat diterima manusia.

?angham menyebutkan, uji kelini menggambarkan

seluruh respon farmakologis terhadap pirogen dan rele8an

dengan respon pada manusia.

dibandingkan dengan uji %1% yaitu mampu mendeteksi

semua pirogen termasuk endoktoksin.

3euntungan pengujian


37/52

!ada saat ini endoktoksin diketahuimerupakan pirogen yang paling, kuat, namunkehadiran pirogen lain dalam suatu sediaanperlu diperhitungkan

karena manusia tidak hanya respon terhadapendoktoksin saja tetapi juga pirogen yang lain.

!engujian kelini menawarkan jasa untukmaksud tersebut dan sampai saat ini belum

dapat digantikan dengan pengujian lain.

> l h ji k li i dib di k d ji %1%


38/52

>elemahan uji kelini dibandingkan dengan uji %1%antara lain

memerlukan pemeliharaan dan perawatan hewan dan

laboratorium yang lebih intensif. "ewan harus dipeliharadalam ruangan dengan temperatur tidak jauh berbedadengan tempat perobaan. !emeliharaan hewan harusdilakukan dengan sebaik mungkin untuk menghindariinfeksi penyakit yang dapat mengganggu perobaan

atau mengaaukan interpretasi hasil. ?erat badan keliniharus dijaga jangan sampai mengalami penurunan yangberarti dalam 0 minggu menjelang digunakan.

$ensiti8itas dipengaruhi oleh musim, kegaduhan,

kegelisahan, makanan dan lain sebagainya. >egelisahanakan dapat menyebabkan kenaikan suhu relatip tinggi,sehingga mengaaukan interpretasi hasil.

ariabilitas biologis. 5espon setiap kelini terhadapsubstansi yang sama belum tentu sama, sehingga

terdapat 8ariasi kenaikan suhu pada tiap kelini.


39/52

ara dengan !A!


40/52

pendahuluan %isat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda

(%imulus polyphemus). 0EO !enggunaan %1% untuk deteksi endotoksin

berawal dari pengamatan ?ang bahwa infeksi bakterigram negatif pada %imulus polyphemus menyebabkan

koagulasi intra8askular yang parah. 0EO


41/52

#ji %1% merupakan pengujian untukmemperkirakan konsentrasi endotoksinbakteri yang mungkin ada dalam ontohbahan.

!engujian ini pada prinsipnya merupakankoagulasi protein yang ada dalam reagensia%1% oleh endotoksin.

!engujian tersebut ialah dinyatakan positif

apabila terjadi pembentukan gel dandinyatakan negatip bila tidak terjadipembentukan gel. !embentukan gel akanterjadi apabila kandungan endotoksin dalam

ontoh sediaan lebih besar daripada

MT'D %*"#$A* ,A,


42/52

%1% telah digunakan seara resmi di #$! PPCuntuk membatasi kandungan endotoksinbakteri suatu sediaan, terutama sediaanradiofarmasi.

!eranan %1% untuk membatasi kandunganendotoksin bakteri makin lama makin luasdigunakan terutama untuk sediaan parenteraldan peralatan medis.

>ruger (0EL4) melaporkan kemungkinanpemakaian metode %1% untuk pengujianberbagai bahan yang berkaitan dengan

farmasi, antara lain


43/52

Prinsip LAL Test #ji %1% memanfaatkan dasar responimun dari kepiting

landam kuda terhadap in8asi bakteri gram negatif. ?ahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting

landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktordan ion-ion yang berinteraksi menyebabkan koagulasi.

/ndotoksin ram negatif mengkatalisis akti8asi proen6imdalam lisat amubosit %imulus. Dimana >eepatan awalakti8asi ditentukan oleh konsentrasi endotoksin.$elanjutnya en6im yang diakti8asi (en6im koagulase)menghidrolisis ikatan spesik dalam suatu protein

penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisatamubosit %imulus menghasilkan koagulin $ekaliterhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengansendirinya dan membentuk suatu gumpalan+bekuanseperti gel.


44/52

!emeriksaan bahan baku untuk parenteral.

!emeriksaan air proses untuk parenteral

!emeriksaan elemen lter untuk eliminasipirogen.

Menentukan penyebab terjadinya pirogen positip. #ntuk 8alidasi sterilisasi dry-heat!

!engujian produk jadi.

5adiofarmasi.

%arutan untuk hemodialisis dan air untukmengenerkan larutan hemodialisis (pengujiantidak diperlukan seara resmi).

Cnjeksi dengan dosis tunggal lebih besar dari 0

ml.


45/52

>euntungan menggunakan %1% dibandingkan dengankelini

penanganannya lebih praktis. $ebagai pengujian in8itro, tidak ada kesalahan+kegagalan akibat 8ariasibiologis.

waktu yang dipergunakan untuk melakukanpengujian lebih singkat, baik pada waktupelaksanaan maupun waktu persiapannya.

5uangan yang digunakan relatip lebih keil danpersonil yang dibutuhkan relatip sedikit.

$elain itu %1% mendeteksi endotoksin lebih sensitifdibandingkan kelini. $ensiti8itas %1% menapai ','0-- ','< ng+ml atau lebih keil.

Hika dibandingkan dengan uji kelini %1% mempunyai


46/52

Hika dibandingkan dengan uji kelini, %1% mempunyaibeberapa kelemahan antara lain

%1% hanya mendeteksi endotoksin dan tidak mampumendeteksi pirogen eksogen yang lain seperti 8irus,fungi, bakteri dan lain-lain.

$elain itu %1% tidak dapat digunakan untuk memeriksabeberapa sediaan seara langsung, seperti

$ediaan yang tidak dapat dinetralkan menjadi p" O-,

misalnya potasium kanrenoate. $ediaan yang mengandung 6at-6at penghambat

pembentukan gel misalnya konsentrasi &a2 tinggi,tetrasiklin, streptomisin, polimisin, kloramfenikol,

penisilin semisintetik, sitrat, fosfat dan lain-lain. #ntuk melakukan pemeriksaan bahan-bahan tersebut

dengan %1%, memerlukan beberapapretreatment yangberfungsi menghilangkan gangguan-gangguan yang ada.!erlakuan tersebut antara lain dengan pengeneran atau

ltrasi.


47/52

Prinsip LAL Test #ji %1% memanfaatkan dasar responimun dari kepiting

landam kuda terhadap in8asi bakteri gram negatif. ?ahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting

landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktordan ion-ion yang berinteraksi menyebabkan koagulasi.

/ndotoksin ram negatif mengkatalisis akti8asi proen6imdalam lisat amubosit %imulus. Dimana >eepatan awalakti8asi ditentukan oleh konsentrasi endotoksin.$elanjutnya en6im yang diakti8asi (en6im koagulase)menghidrolisis ikatan spesik dalam suatu protein

penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisatamubosit %imulus menghasilkan koagulin $ekaliterhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengansendirinya dan membentuk suatu gumpalan+bekuanseperti gel.


48/52

"The gel-lot end point test7 Uji penggumpalan gelatin/

") 5eagensia %1% diampur dengan sampel larutan uji dalam

tabung gelas masing-masing dengan 8olume sama yaitu0,' ml.

2) $etelah diampur, tabung gelas tersebut diinkubasi padatemperatur 4Q& R 2Q& selama O' menit R 0 menit.

) !embaaan pengujian larutan yaitu tabung gelas dariinkubator diambil dengan hati-hati, kemudian membaliknya0L'Q, sehingga permukaan atas tabung berada di bagianbawah.

#) "asil pembaaan adalah

!ositif ( @ ) jika terbentuk gelatin pada yang tetap, berartiontoh larutan uji tersebut mengandung sedikitnya samadengan sensiti8itas 5eagensia yang digunakan.

Segatif (T) jika tidak terbentukUgelatin padat yang tetap,berarti bahwa ontoh larutan uji tersebut tidakmengandung endotoksin atau lebih sedikit daripadasensiti8itas reagensia yang digunakan.


49/52

Dalam metode ini, ara inkubasi adalah sama seperti metode yang

telah disebutkan di atas. >alau dalam metode C tersebut e8aluasihasil diamati dari terbentuknya gelatin, sebaliknya dalam metodeini diegah jangan sampai terbentuk gelatin. &ara menghindariterbentuknya gel yaitu dengan mengenerkan reagen %1% ataudengan menambah 8olume larutan uji sebelum pengujian mulai

dilakukan. Dalam metode ini yang diharapkan adalahterbentuknya kekeruhan, yaitu sebagai akibat presipitasi VproteinoagulogenV.

Dasar dari metode ini yaitu peningkatan jumlah endotoksin akanmenyebabkan hertambahnya kekeruhan dan bertambahnya

kekeruhan ini sebanding dengan bertambahnya endotoksin. Silaioptical density dibaa dengan menggunakan spektrofotometer."asil yang didapat akan memberikan konsentrasi endotoksinseara kuantitatif, yaitu dengan mengekstrapolasikan dalam kur8astandar, dan kur8a standar diperoleh dengan membuat serikonsentrasi endotoksin.

The turbidometric test (u!i kekeruhan)

i i ( !i


50/52

Metode ini didasarkan atas terbentuknya warna,sedangkan aranya hampir sama denganmetode kedua.

Samun dalam metode ini presipitasi protein

dengan menggunakan centri fuge! >onsentrasi endotoksin dalam suatu ontohjuga diperoleh dengan mengekstrapolasikandalam kur8a standar dan pembaaan juga

menggunakan spektrofotometer.

The colorimetric test (u!i

arna)


51/52

Metode ini berbeda dengan metode-metode yangterdahulu.

Metode yang disebutkan sebelumnya tergantungsepenuhnya pada reagensia %1%, terutamakandungan Vprotein oagulogenV di dalamnya yang

berfungsi membentuk gelatin protein. $edangkanmetode ini, fungsi untuk membentuk gel protein yaitudari suatu substrat kromogenik sintetis untukmenggantikan Vprotein oagulogenV.

$ubstrat kromogenik sintetis ini mengandungrangkaian asam amino yang sama seperti koagulogenreagensia. !embaaan hasil juga seperti pada 2metode sebelumnya, yaitu dengan menggunakanspektrofotometer.

The chromogenic subsrate test


52/52

Terima

kasih

Uji Pirogenitas

Documents

Transcript of Uji Pirogenitas