JOURNAL READING

Angiotensin-Converting Enzyme 2 Overexpression in the

Subfornical Organ Prevents the Angiotensin II–Mediated Pressor and

Drinking Responses and Is Associated With Angiotensin II Type 1

Receptor Downregulation

BLOK KARDIOVASKULER 1

Kelompok 3:

Ratih Oktaviana (2111210001) Pratiknyo Dipo L. (2111210026)

Rery Tiara Amalia D (2111210002) Putri Agustin (2111210030)

Amalia Alfi K. D (2111210003) Erina Yustira (2111210031)

Olivia Cindy (2111210019) Hidayatulloh Arief (2111210032)

Hilda Nur Ainia (2111210020) Santi Purnama Sari (2111210069)

M. Taufiqurrahman S. (2111210021) Eka Sukma Budi R. (2111210070)

Karolina Afriyani K. (2111210025) Alfien Aripasha (2111210071)

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS ISLAM MALANG

2013

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala pujian agung kami sembahkah kepada Allah SWT

yang telah memberikan pertolongan, petunjuk dan kekuatan materil maupun moril

sehingga kami dapat menyelesaikan makalah telaah jurnal ini dengan hasil

sedemikian rupa.

Jurnal yang berjudul “Angiotensin-Converting Enzyme 2

Overexpression in the Subfornical Organ Prevents the Angiotensin II–

Mediated Pressor and Drinking Responses and Is Associated With

Angiotensin II Type 1 Receptor Downregulation ini dibuat dengan menelaah

dari sebuah jurnal.

Kami berharap jurnal ini dapat digunakan sebagaimana mestinya sehingga

dapat menambah wawasan dan bermanfaat bagi pembaca maupun penulis sendiri.

PENYUSUN

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sistem renin-angiotensin (RAS) memiliki efek pada sistem kardiovaskular

dan homeostasis cairan. Pada Awalnya efek ini diduga merupakan hasil utama

dari produksi sistemik angiotensin (Ang) II. Rangsangan reseptor Ang II tipe 1

(AT1) yang ada dalam ginjal dan pembuluh darah untuk membuat vasokonstriksi

pembuluh darah serta reabsorpsi air dan garam. Ginjal dan hati adalah organ

endokrin utama untuk menghasilkan renin dan sintesis angiotensinogen, tetapi

akhir-akhir ini pendapat tentang RAS telah ditentang karena renin dan

angiotensinogen telah terdeteksi di jaringan ekstrarenal dan ekstrahepatik.

RAS lokal terdapat di beberapa jaringan, misalnya di jaringan jantung,

adiposa, pembuluh darah, dan sumsum tulang, dengan efek sama pada RAS-

endokrin tetapi juga tergantung pada sistem individual. Salah satunya, RAS otak,

dianggap penting dalam regulasi kardiovaskular dan penting dalam patogenesis

hipertensi dan gagal jantung. Tetapi RAS otak masih kurang dipahami karena

kesulitan penelitian dalam membedah RAS otak pada tingkat selular, regional

pada seluruh tingkat organisme.

Tahun 2000, ACE-family menemukan sesuatu yang baru yang di

identifikasi dan diberi nama Ang-converting enzyme (ACE) 2. Jenis

carboxypeptidase ini pertama kali di sekuens dan di klon dari manusia dengan

gagal jantung bagian ventrikel dan limfoma yaitu cDNA-library. Studi ini

melaporkan adanya ekspresi ACE2 di mRNA dalam hati dan ginjal, tetapi tidak

terdeteksi dalam otak. Selain itu, aktivitas ACE2 mRNA juga terdapat pada

medula oblongata dan otak mencit. Telah diketahui adanya protein ACE2 dan

mRNA dalam otak mencit, termasuk daerah yang terlibat dalam regulasi pusat

fungsi kardiovaskular. Dilaporkan bahwa ACE2 dapat menurunkan Ang II ke

vasodilator peptide Ang-(1-7) dengan afinitas 400 kali lipat lebih besar daripada

Ang I. Meskipun pusat Ang-(1-7) meningkatkan sensitivitas refleks baroreseptor

dan tanggapan pressor atau depressor tergantung pada daerah yang ditargetkan.

Peran ACE2 di pusat kardiovaskular masih belum jelas karena kurangnya alat

khusus untuk menyelidiki fungsinya.

Hipotesis menyatakan bahwa ACE2 memiliki peran utama dalam regulasi

pusat sistem saraf otonom dengan peningkatan Ang-(1-7) dan efek buffering

dalam meningkatkan Ang II pada penyakit kardiovaskular. Untuk menguji

hipotesis dan selektifitas dalam memanipulasi ekspresi ACE2 dalam jaringan atau

sel-sel tertentu, dikembangkan kode adenovirus untuk ACE2 manusia. Data

menunjukkan bahwa enhanced green fluorescent protein (eGFP) sebagai gen yang

dilaporkan. Selain itu, Ad-hACE2-EGFP sangat tinggi dalam menginduksi ACE2

mRNA, protein, dan aktivitas di neuron. Lebih penting lagi pada infeksi

intracerebroventricular (ICV) Ad-hACE2 mengakibatkan aktivitas ACE2 yang

meningkat pada subfornical organ (SFO) mencit, yang dikaitkan dengan

penurunan ekspresi reseptor AT1 dan menyebabkan penurunan yang signifikan

dalam Ang II yang dimediasi tekanan dan respon haus. Konsekuensinya, Hasilnya

menetapkan peran ACE2 dalam pengaturan pusat fungsi kardiovaskular,

menawarkan satu target baru untuk pengobatan hipertensi dan penyakit

kardiovaskular.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Materials and Methods

1. Adenovirus Generation

Virus Ad-hACE2-EGFP dikembangkan di Universitas Iowa Gene Transfer

Vector Core. Secara singkat, ACE2 pcDNA3.1 vektor dicerna dengan XbaI dan

PmeI dengan memisahkan fragmen 2418-bp hACE2. Fragmen ini kemudian

dikloning ke dalam pacAd5 CMV IRES EGFP pA shuttle (Gambar IA). Hasilnya

kemudian digunakan untuk menghasilkan adenovirus hACE2 EGFP.

2. Cell Culture and Adenovirus Infection

Sel neuro-2A (neuroblastoma mencit, American Type Culture Collection,

Manassas, Va) ditumbuhkan dalam 6 wadah dengan kepadatan 2 x 105 sel.

Setelah 24 jam, sel-sel diinkubasi dalam FBS medium rendah (2%) dengan Ad-

hACE2-EGFP virus atau Ad-eGFP control virus (100 Mois) selama 6 jam,

kemudian dikembalikan dalam 10% FBS medium. Pada hari ketiga setelah

infeksi, sel diperiksa menggunakan mikroskop fluoresensi (Olympus, IX81),

kemudian media dan sel dikumpulkan dan diuji seperti yang dijelaskan di bawah

ini.

3. In Vivo Adenovirus ICV Injection

Mencit jantan C57BL/6J, umur 8 sampai 10 minggu (Charles River

Laboratories, Wilmington, Mass), dibius dan disuntik Ad-hACE2-EGFP atau Ad-

EGFP (2 x 106 plaque-forming units [pfu], 200 nL) menggunakan pressure

injector (PicospritzerII). Mencit dieutanasia 7 hari setelah infeksi. Otak: (1)

dibelah koronal di cryostat, kemudian diproses dalam GFP fluoresensi visualisasi

dan hACE2 atau AT1 imunohistokimia, atau (2) dibekukan pada 80 ° C sebelum

SFO dibedah dan digunakan untuk tes berikutnya. Semua prosedur telah disetujui

oleh Institutional Use and Care Committee at Louisiana State Health Sciences

Center, New Orleans.

4. AT1 Receptor Binding

Densitas AT1 reseptor ditentukan oleh membran plasma preparations dari

mencit SFOs (n 20 per grup) dan sel neuro-2A setelah infeksi dengan Ad-

hACE2-EGFP atau Ad-EGFP. Membran suspensi (100 g per reaksi) diinkubasi

dengan 100 pmol / L Ang II (Perkin Elmer, specific activity: 2200 Ci/mmol)

selama 2 jam pada suhu kamar. Nonspesifik binding ditentukan dengan 5 mol / L

nonradioaktif Ang II.

5. Western Blot

Media kultur sel (10 L), lisat sel (10g), dan membran SFO yang dimurnikan

(5g) dikumpulkan secara terpisah dan diproses menggunakan acuan standar

Western blot terhadap hACE2 atau AT1 antibody. Spesifik Band dideteksi dengan

chemiluminescence sesuai dengan petunjuk dari pabrik (ECL, Perkin Elmer,

Boston, Mass) dan dikuantitatif dengan densitometri Laser (FujiFilm,

ImageReader versi 1.2).

6. ACE2 Activity

Sel dan media kultur dikumpulkan 3 hari setelah infeksi, dan SFOs mencit

dikumpulkan 7 hari setelah Ad-hACE2-EGFP atau Ad-EGFP. Aktivitas ACE2

diukur dalam cell lysate, cell culture medium dan SFO lysate, sebagaimana yang

dijelaskan. Data (arbitrary fluorescence units [AFU]) disajikan sebagai jumlah

substrat FPSVI yang dikonversi ke produk per menit dan dinormalisasi untuk total

protein atau volume of medium.

7. Immunohistochemistry

Tujuh hari setelah diinfeksi dengan Ad-hACE2-EGFP atau Ad-EGFP, otak

yang diperfusi, ditunggu semalaman, dan sebagaimana yang dijelaskna. Bagian

Otak dan kultur sel diproses sebagai hACE2 atau AT1 receptor detection (1:50

pengenceran selama 48 jam). Imunostaining dideteksi menggunakan fluoresensi

(Olympus, IX81) dan bidang terang (Nikon Eclipse E600) pada mikroskop.

8. Physiological Recordings

Mencit jantan C57BL/6J (n 25) dibius dan diinstrumentasi dengan Canula ICV

dan radiotelemetry probe, sebagai described. Mencit sadar kemudian disuntikkan

ICV dengan Ad-hACE2-EGFP atau Ad-EGFP (2 106 PFU, 200 nL). Setelah 7

hari, tekanan darah (BP) dicatat pada awal dan injeksi berikutnya dari Ang II (200

ng, 200 nL), carbachol (100 ng, 200 nL), atau Ang-(1-7) receptor blocker D-

Ala7-Ang-(1-7) (200 fmol, 200 nL) sebelum ICV Ang II. Asupan air dipantau

dengan mencatat waktu yang dihabiskan selama 15 menit. Dari rekaman awal,

spontaneous baroreceptor reflex sensitivity (SBRS) dihitung dengan

menggunakan metode urutan sebagaimana yang dijelaskan.

9. Statistical Analysis

Data dinyatakan sebagai SEM. Data dianalisis dengan Student tes atau

ANOVA (setelah uji Bartlett homogenitas varians), diikuti oleh Newman Keuls

correction untuk beberapa bagian. Perbandingan statistik dilakukan dengan

menggunakan Prism4 (GraphPad Software, San Diego, Calif). Perbedaan

dianggap signifikan secara statistik pada P 0,05.

EKSPRESI hACE2 DI SEL-SEL NEURON

HASIL

ACE2 Expression and Ang II–Mediated Pressor and Drinking Responses

Untuk menilai kemampuan ACE2 melawan efek dari Ang II di SFO, mencit yang sadar dan bebas bergerak yang sebelumnya terinfeksi Ad-hACE2-EGFP (7 hari) disuntik ICV dengan Ang II (200 ng dalam 200 nL), dan dampaknya dicatat pada BP dan masuknya air. Dasar acuannya adalah Mean Arterial pressure(MAP) dan Heart Rate 7 hari setelah terinfeksi, tidak ada perbedaan secara signifikan antara Ad-EGFP (MAP: 111±3 mm Hg; heartrate: 605±9 bpm) and Ad-hACE2-eGFP (MAP: 113±3 mm Hg; heart rate: 617±26 bpm; P>0.05) groups.

Gambar 3 : ACE2 berlebih yang menurunkan tekanan Ang II dalam merespon ACE2 pada tikus yang sadar

.

Gambar 3A menggambarkan respon tekanan typikal yang diinduksi oleh

ICV Ang II pada mencit yang sadar yang sebelumnya terinfeksi Ad-EGFP

menunjukkan peningkatan yang pesat dalam BP yang berkembang dalam menit

setelah injeksi ICV dan perlahan-lahan kembali ke awal. Pretreatment eGFP tidak

mempengaruhi efek dan durasi respon tekanan pada ICV Ang II. Bagaimanapun,

mencit yang diinfeksi dengan Ad-hACE2-eGFP menghambat penurunan pada

ang-II yang signifikan yang dimediasi dengan respon tekanan dengan menurunkan

pada kedua amplitude (ΔMAP:Ad-hACE2-eGFP 8±2 versus Ad-eGFP 18±2

mmHg ; P<0,01) dan durasi efek (Ad-hACE2-eGFP 9±2 versus Ad-eGFP 16±2

minutes; P<0,05) (Gambar 3B and 3C). penurunan respon tekanan ang II tidak

dicegah dengan pretreatment D-Ala-Ang-(1-7) (ΔMAP: Ad-hACE2-eGFP 5±3

versus Ad-eGFP 14±2 mm Hg), menunjukkan bahwa ekspresi hACE2 di SFO

menghambat respon Ang II–induced pressor dengan menurunkan kadar AngII

dari pada melibatkan Ang-(1-7) –mediated mechanism. Disamping itu, tidak

mempengaruhi Ad-hACE2-eGFP pada respon yang dimediasi tekanan oleh

muscarinic agonist carbachol (100 ng ICV in 200 nL) )(ΔMAP: Ad-hACE2-eGFP

14±3 versus Ad-eGFP 18±7 mm Hg; P>0.05), selektivitas hACE2 untuk peptida

angiotensin. Akhirnya, penurunan respon tekanan Ang II-mediate yang diamati

pada kelompok Ad-hACE2-EGFP berkorelasi dengan peningkatan aktivitas enzim

dalam mencit (Gambar 3D).

Untuk mengkonfirmasi kemampuan SFO-ditargetkan pada ekspresi

hACE2 dalam mencegah efek lokal Ang II-mediated , kami menilai ketika respon

haus Ang II–mediated diikuti pretreatment adenovirus.

Regulasi Reseptor AT1 receptor yang diekspresikan oleh ACE2 in vitro

Ad-hACE2-eGFP menumpulkan perilaku dalam minum air yang dihasilkan dari

pusat kerja Ang II (Ad-hACE2-eGFP: 5±3 versus Ad-eGFP: 41±6seconds;

P<0.001) (Figure 4A). untuk menilai apakah gangguan Ang II tingkat lokal oleh

hACE2 pada SFO mampu memodifikasi mekanisme fisiologis jauh, kami

menganalisis sensitivitas barorefleks pada tikus setelah infeksi virus. Tidak ada

perubahan signifikan yang diamati dalam SBRS 7 hari setelah infeksi (sampai

urutan: Ad-hACE2-eGFP 2.0±0.5 versus Ad-eGFP 2.2±0.4; turun urutan: Ad-

hACE2-eGFP 1.5±0.2 versus Ad-eGFP 1.6±0.2 ms/mm Hg; P>0.05; Gambar

4B) ), menunjukkan bahwa gangguan sinyal Ang II di SFO tidak dapat mengubah

mekanisme baroreflex berasal di batang otak.

ACE2 berlebih menurunkan Ang II dalam intak minuman, tapi tidak pada SBRS tikus yang sadar

ACE2 and AT1 Receptor Expression

Untuk mendapatkan mekanisme ACE2 yang mencegah Ang II–mediated

pressor and respon haus, kita melihat pengaruh overekspresi ACE2 pada regulasi

reseptor AT1. Pilihan ini dimotivasi oleh ketidakmampuan D-Ala7-Ang-(1-7)

untuk memblokir Ad-hACE2-EGFP yang dimediasi efek dan penelitian

sebelumnya menunjukkan bahwa Ang-(1-7) memiliki efek hipotensi, tapi tidak

pada hewan yang normotensif.

Secara In vitro, overekspresi ACE2 pada sel neuro 2A dihasilkan

penurunan 70 % (0.30±0.03) ekspresi protein AT1 dibandingkan dengan Ad-

eGFP(1.00±0.08; P<0.001) (Gambar 5A). Demikian pula, ikatan reseptor AT1

(Figure 5B) diturunkan secara drastic Ad-hACE2-eGFP versus selAdeGFP-

diperlakukan(7.5±2.8 versus 21.7±3.6 fmol/mg ofproteins; P<0.05). observasi ini

di konfirmasi lebih lanjut oleh AT1 immunofluorescence (Figure 5C and 5D),

yang menunjukkan bahwa secara in vitro, ACE2 downregulates mengekspresikan

receptor AT1.

Kemudian interaksi ACE2-AT1 secara in vivo. Mencit (n = 50) di injeksi

dengan Ad-hACE2-eGFP atau Ad-eGFP dan setelah 7 hari SFOs dikumpulkan

dan diproses untuk ikatan reseptor AT1, Western blot, and immunohistochemistry.

Pada observasi in vitro, ikatan reseptor AT1 terjadi penurunan signifikan di SFO

pada Ad-hACE2-eGFP–treated mencit yang dibandingkan dengan Ad-

eGFP(10.0±8.0 versus 36.9±10.7 fmol/mg proteins; P<0.05) (Gambar 6A). serupa

di tingkat reseptor AT1 diamati di SFO ekstrak membran plasma dari Ad-hACE2-

EGFP- treated mencit (Gambar 6B). Akhirnya, reseptor AT1 immunostaining

(Gambar 6C) diturunkan secara signifikan di inti SFO di ikuti overekspresi ACE2.

Kesimpulannya kami menunjukkan bahwa

Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahwa ACE2 diberikannya

efek modulatory sebagiannya melalui downregulation reseptor ekspresi AT1,

sehingga mencegah Ang II u2013 penyelamat % dimediasi respon pressor dan

minum. Diberikan efek modulatory melalui sebagian downregulasi ekspresi

reseptor AT1. Mencegah Ang II–mediated pressor and respon haus.

Diskusi

Pada perkembangan beberapa penyakit Kardiovaskuler ditemukan

aktivitas berlebih dari RAS, begitu juga dengan RAS yang di temukan pada otak.

Namun ada keterbatasan dalam mempelajari RAS di otak karena mekanisme yang

spesifik. ada data penting seperti peran forebrain dan regio brainstem yang

mengaktivasi jalur Angiotensin sehingga terjadi peningkatan tonus saraf simpatis.

Terdapat kesulitan dalam memahami bagaimana jalur interaksinya namun baru-

baru ini ditemukan peningkatan RAS di perifer dan di central sistem saraf. study

ini, mengembangkan new viral vector expressing hACE2 dan mencari tahu peran

ACE2 sebagai buffer yang memediasi penekanan angiotensin II dan respon haus

yang berasal dari SFO. Yang merupakan enzim yang berperan dalam pengaturan

fungsi jantung dan volume homeostasis.

Untuk mengatasi keterbatasan dalam mempelajari RAS otak, parailmuwan

telah menggunakan target overekspresi ras gen dari hewan transgenik, gen

delivery, atau kombinasi dari keduanya. Metode klasik yang digunakan untuk

terapi gen otak menggunakan adenoassociated Virus, lentivirus atau adenovirus.

Tidak seperti Lentivirus, target utama saraf pada otak, vektor adenovirus tidak

memiliki tropism jaringan, sehingga memungkinkan tansduksi dari glia dan

neuron. Kami menunjukan bahwa ekspresi primer ACE2 terutama pada Neuron,

dilaporkan mengekpresikan astrocytic secara in vitro. Selain itu transgen adenoviral

tidak dapat digabungkan dalam genom, sehingga mencegah mutagenesis random

insersional. Meskipun kami tidak dapat menilai reaksi inflamasi dari injeksi virus,

namun sebelum percobaan dilakukan kami menggunakan jenis vektor dan titer

otak yang mirip, ditambah kurangnya perilaku abnormal pada mencit yang

terinfeksi. Pada akhirnya, secara cepat ( 3 hari) dan efisiensi ekspresi hACE2 pada

ad-hACE2-EGFP dapat memanipulasi ekspresi dan aktivitas ACE2 pada aktivitas

in vitro dan in vivo.

Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk menilai efek dari ACE2

yang berlebih pada Angiotensin II melalui respon fisiologis. Data kami

memberikan bukti bahwa overekspresi ACE2 pada pusat forebrain yang dimediasi

dengan Angiotensin II sebagian berespon terhadap downregulasi AT1 ekspresi

reseptor. Pengaturan ICV pada respon Angiotensin II menekan kuat dan berespon

bradikardi sebelum masuknya air. Semuanya merupakan respon dari stimulasi

pada reseptor AT1 di SFO dan nuclei terminal lamina.

ACE2 menurunkan ekspresi reseptor di SFO

Data kami menunjukan bahwa overekspresi ACE2 pada forebrain dan

SFO dihambat oleh tekanan dan respon haus yang merupakan hasil dari

pengaturan ICV pada Angiotensin II. hasil ini didapat dari (1) penurunan pada

Angiotensin II disebabkan karena adanya korelasi yang dimediasi ACE2- pada

Angiotensin II ke angiotensin (1-7), hal ini mengarah pada stimulasi reseptor AT1

yang lebih kecil (2) penurunan kadar Angiotensin II dikaitkan dengan peningkatan

kadar Angiotensin (1-7), terutama pada aktivasi dari Angiotensin (1-7) reseptor.

Walaupun dalam penelitian “Ferreira et al” ditemukan sedikit penurunan asupan

air pada hewan transgenik (mencit) dimana terdapat plasma Angiotensin pada

tingkat tinggi. Angiotensin bertujuan untuk mengubah komponen bardikinin yang

berasal dari baroreflex, peran angiotensin dalam pengurangan Angiotensin II BP

tidak ditemukan dalam eksperimen. pada kenyataanya sifat vasoaktif angiotensin

in vivo yang dilaporkan dalam keadaan patologis, seperti hipertensi, atau miokard

infark dan peptida memiliki efek minimal yang normotensif dalam hewan.

Demikian juga dengan kegagalan untuk mengembalikan angiotensin II yang

memediasi proses pressor dan respon haus setelah pretreatment dengan reseptor

Angiotensin blocker. Selain itu , ada fakta lain saat pengamatan yaitu tidak terjadi

perubahan pada kurva baroreflex yang menunjukan penurunan Angiotensin II

yang memediasi pressor dan respon haus yang merupakan hasil dari stimulasi

jalur Angiotensin II.pengamatan ini dilakukan secara konsisten dengan melihat

kemampuan ACE2 dalam menghidrolisis Angiotensin II efisiensi katalik yang

tinggi ((kcat/Km_1.9_106 mol/L _ sec_1). Kesimpulan yang terbaru ditemukan

diman Lentivirus mengikat ACE2 yang menuju ke Rostral ventrolateral medula

pada tikus yang hipertensi spontan, menghasilkan penurunan sementara pada BP

dan denyut jantung 4 minggu setelah infeksi. Hal ini terjadi karena suntikan

Angiotensin di rostral medula ventro-lateral yang dilakukan sebelumnya telah

membuktikan adanya peningkatan BP, data ini menunjukan bahwa penurunan BP

tidak dimediasi oleh Angiotensin dan mungkin hasil dari penurunan jalur sinyal

Angiotensin II.

Meskipun sensitivitas baroreflex berubah mengikuti hACE2 secara

berlebih di SFO, mungkin ini menunjukkan bahwa modulasi dari RAS terbatas

pada daerah terinfeksi virus, data kami menunjukkan bahwa hACE2 juga

merupakan target untuk sheddases, sehingga melepaskan enzim dalam lingkungan

sel.

Dalam kasus otak, kita tidak bisa mengesampingkan kemungkinan bahwa

disekresikan ACE2 dari interstitial ke cerebrospinal cairan, yang memungkinkan

enzim tersebut memodulasi kadar Ang II dan pusat sinyal jalur seluruh otak. SFO

berperan sebagai kunci dalam regulasi pusat BP dan volume

homeostasis.Memang, kurangnya blood brain barrier menjadikan SFO sensitif

terhadap beredar peptida, seperti angiotensins, yang dapat mencapai otak dan

merangsang lokal reseptor untuk mengerahkan efek sentral melalui perifer.

SFO tidak hanya sensitif terhadap peptida sistemik, tetapi juga

merupakan situs penting untuk sintesis dari Angiotensin II yang juga terlibat

dalam regenerasi kardiovaskular dan respon haus.Selain itu, SFO juga menerima

proyeksi dari beberapa daerah otak, termasuk paraventricular dan supraoptik inti,

inti traktus solitarius, dan ventrolateral sumsum tulang belakang. Overekspresi

ACE2 di SFO bisa berpotensi mengakibatkan perubahan pada beberapa jaringan

saraf. Misalnya,hasil ACE2 yang berlebih di SFO, aktivasi neuron bisa berkurang

di PVN, sehingga berpengaruh dalam respon haus.

Namun, kurangnya ekspresi hACE2 berpengaruh langsung dalam pengaturan

pengeluaran PVN. Menariknya, kami mengamati bahwa pencegahan Ang II-

dimediasi pressor dan reseptor haus oleh ACE2 yang berlebih,dapat dikaitkan

dengan downregulation AT1 ekspresi reseptor di SFO. Data ini menunjukkan

bahwa tidak hanya ACE2 yang berlebih saja yang dapat mengurangi jumlah Ang

II, tetapi juga lebih merusak reseptor Ang II dengan cara membatasi jumlah AT1

reseptor.

Walaupun begitu penurunan ekspresi reseptor AT1 pada membran sel

yang dihasilkan dari internalisasi atau regulasi gen tetap menjadi penentu. Ini bisa

dimediasi oleh Angiotensin (1-7), seperti yang disarankan sebelumnya, meskipun

percobaan kami tampaknya tidak sesuai dengan pembentukan micromoles dari

Angiotensin (1-7) yang diperlukan untuk menghasilkan respon ini. Atau, dapat

dilakukan stimulasi lebih lama untuk pengeluaran Angiotensin (1-7) bisa

menyebabkan downregulation yang berakibat penghambatan AT1 reseptor pada

gen ACE2 dan ekspresi protein, menurut pengkajian terbaru.

Namun, menilai peran ACE2 pada komponen RAS lainnya telah terbatas

pada tanggal, dan kurangnya alat yang tersedia untuk memodulasi ekspresi ACE2.

Ad-hACE2-EGFP meupakan penentu pertama kalinya yang menunjukkan bahwa

ACE2 mampu mengatur komponen lain dari RAS.

Singkatnya, hasil ini menunjukkan overekspresi dari ACE2 di SFO memainkan

peran penting dalam regulasi BP dan homeostasis volume oleh modulasi kedua

jumlah Ang II dan AT1 reseptor yang tersedia, untuk menstimulasi jalur sinyal

downstream. Selain itu, kami berspekulasi bahwa pembentukan ACE2 dimediasi

Ang-(1-7)hanya relevan dalam kondisi patofisiologi. Akhirnya, penelitian ini

memberikan bukti dalam prinsip peran terapi gen ACE2 dan, lebih umum

memvalidasi ACE2 sebagai target baru untuk pengobatan kondisi yang

melibatkan RAS disfungsional, seperti hipertensi dan penyakit kardiovaskular

lainnya.

Online Figure Legend

Online Figure 1. Ekspresi Ad-hACE2-eGFP pada sel neuro-2A.

Human ACE2 cDNA (A1) yang di masukan ke kumparan vektor (A2)

pacAd5 CMV IreS eGFP pA alur dari eGFP gen reporter. Konsep akhir ini (A3),

ekspresi hACE2 dan eGFP memenuhi sebagai non-fusion proteins berada di

bawah kontrol dari CMV promoter, yang kemudian digunakan untuk

menghasilkan hACE2-eGFP adenovirus. Neuro-2A (neuroblastoma tikus, ATCC)

yang terinfeksi oleh Ad-hACE2-eGFP (10-100 MOI) atau sebuah kontrol dari

virus Ad-eGFP (100 MOI) pada densitas 2x105 sel/well. Gambar Brightfield dan

GFP fluorescence (B) yang di ambil 72 jam setelah infeksi (20x). Ekspresi GFP

yang takarannya tergantung pada peningkatan berdasarkan infeksi virus Ad-

hACE2-eGFP. Media kultur sel (C) yang bernoda bintik dengan anti hACE2

ectodomain atau N-terminal antibodi. Munculnya protein hACE2 di proses

dengan tepat dan di lepaskan menuju media sel kultur. “P” mengindikasikan

sebuah kontrol positif (sel lysate utuh 72 jam setelah infeksi Ad-hACE2-eGFP

100 MOI) pada noda bintik anti-hACE2 N-terminal antibodi.

Online Figure 2. Ketergantungan waktu ekspresi Ad-hACE2-eGFP pada

SFO

Bagian SFO yang dikumpulkan dan diproses pada eGFP fluorescence 3, 7,

14 dan 28 hari setelah infeksi virus. Hasil dari ICV Ad-hACE2-eGFP

menginduksi suatu peningkatan yang signifikan pada eGFP fluorescence pada 3

dan 7 hari. Meskipun adanya persistant dari beberapa sel yang masih mengandung

eGFP pada dinding lateral ventrikel (data tidak diperlihatkan), fluorescence telah

hilang pada 14 dan 28 hari setelah infeksi Ad-hACE2-eGFP. Aktifitas ACE2

(grafik) pada hypothalamus berdasarkan infeksi Ad-eGFP (GFP) atau Ad-hACE2-

eGFP (ACE2), secara potitf di korelasikan dengan eGFP flourescence pada SFO.

Statistik yang signifikan : P<0.001 vs. Ad-eGFP.

Online Figure 3. Ekspresi eGFP dan hACE2 diantara neurons dan glial cells.

Tujuh hari setelah infeksi, Bagian SFO telah mengumpulkan dan

memproses immunohistochemistry hACE2. Gambar dengan magnifikasi tinggi

telah diambil pada eGFP (hijau) dan immunoflourescence hACE2 (merah) dan

menunjukkan bahwa eGFP dan hACE2 merupakan ko-lokalisasi pada sel yang

sama. Human ACE2 (B dan D) telah terdeteksi pada neuron (B) serta sel glia (D),

meskipun ekspresi hACE2 lebih lemah daripada glia (D).

Catatan Fisiologi

Tikus percobaan yang telah di anestesi dan di bedah guna memasukan ICV

canula dan pemasangan radiotelemetry untuk mencatat tekanan darah yang

kronis. Tikus kemudian di injeksi dengan Ad-hACE2-eGFP atau Ad-

eGFP, lalu di kembalikan ke kandang. Pada 7 hari setelah infeksi, tekanan

darah secara berlanjut di catat selama 30menit pada tikus yang sadar dan

dapat bergerak secara bebas terlebih dahulu di berikan injeksi ICV random

: Ang-II , Carbachol , Ang-(1-7) reseptor blocker , D-Ala-Ang.

Didahulukan Ang-II kemudian dimonitoring lagi dengan tambahan waktu

30menit.

Intake air dimonitoring pada beberapa kasus dengan mencatat waktu

menghabiskan minuman pada waktu 15menit berdasarkan pemberian Ang-

II. Dari catatan awal, Spontaneous Baroreseptor Reflex Sensitivity (SBRS)

dihitung menggunakan metode sekuens yang telah di jelaskan sebelumnya.

BAB III

PENUTUP

Overekspresi ACE2 pada forebrain dan SFO dihambat oleh tekanan dan respon

haus yang merupakan hasil dari pengaturan ICV pada Angiotensin II. Hasil ini

didapat dari :

1. Penurunan pada Angiotensin II disebabkan karena adanya korelasi yang

dimediasi ACE2- pada Angiotensin II ke angiotensin (1-7), hal ini

mengarah pada stimulasi reseptor AT1 yang lebih kecil

2. Penurunan kadar Angiotensin II dikaitkan dengan peningkatan kadar

Angiotensin (1-7), terutama pada aktivasi dari Angiotensin (1-7) reseptor

Sehingga ekspresi ACE2 juga bisa dijadikan obat hipertensi dan penyakit gagal ginjal karena dapat membuat vasodilatasi pembuluh darah. Hal ini berarti ekspresi ACE2 memiliki efek yang sama seperti ACE inhibitor.