Practica No. 5

MANUAL DE LABORATORIOMICROOBIOLOGIA INDUSTRIAL

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAFACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

MANUAL DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

BOGOTA, ENERO 2012

PRÁCTICA No. 1


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ELABORACIÓN DE JEREZ

1. INTRODUCCIÓN

El VINO es un líquido que se obtiene por fermentación espontánea del jugo de uva fresca, es espontánea porque en la misma uva se encuentra la levadura responsable de este proceso Saccharomyces cerevisiae. El mosto o jugo de uva es un líquido que contiene de 70 a 80% de agua; el 20% restante está constituido por glucosa, tartrato, ácido de potasio, taninos, sustancias colorantes, sustancias minerales, etc. La fermentación alcohólica corresponde a la reacción química efectuada por las levaduras, en que el azúcar presente en la uva es transformado en alcohol (etanol), liberándose dióxido de carbono y energía en forma de calor. El vino es una bebida moderadamente alcohólica. Cuando las levaduras han transformado todo el azúcar en alcohol, la fermentación se termina.

C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 6 O + 2 CO 2

Durante la fermentación alcohólica los azúcares del mosto son transformados por las levaduras

(Saccharomyces cerevisiae) en etanol y CO2, obteniéndose el vino.

Dentro de los vinos propiamente dichos, elaborados de uvas se distinguen cinco clases: vinos aperitivos, vinos rojos (tintos), blancos, de postre y espumosos. Los contenidos de alcohol de las cinco clases de vinos, son distintos, los vinos espumosos y los vinos de mesa tintos y blancos tienen del 10 al 14% de alcohol, los vinos aperitivos y de postre contienen alrededor del 20% de alcohol.

Determinados términos especiales se utilizan para describir vinos: Vinos Ordinarios, son los que no contienen dióxido de carbono e incluyen los de mesa, aperitivo y postre. Vinos espumosos: son los que se hicieron espumosos durante una fermentación secundaria en la botella o en la cuba o bien se carbonataron. Vinos secos, son los que no contienen azúcar o si la hay, su concentración es tan pequeña que no resulta fácil apreciarla por la captación gustativa.

2. OBJETIVO

Elaborar un jerez a pequeña escala, que permita observar los cambios ocurridos durante la elaboración de este producto.

3. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

3.1 Cepas Saccharomyces cerevisiae (250 mL en caldo Saboreaud)

3.2 Medios de cultivo (por grupo de trabajo) Agar Agar (20 mL) (filtración y clarificacion) Agua peptonada (3 tubos taparrosca 16 x 150, con 4,5 mL c/u) diluciones


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3.3 Reactivos (por grupo de trabajo) Colorantes de Gram Meta Bisulfito de sodio al 10% (10 mL)

3.4 Materiales (por grupo de trabajo) 2 libras de Uvas pasas Botella de vino para el envasado final (1) Cámara de NeuBauer (1) Colador (1) Embudo de vidrio estéril (1) Láminas Laminilla Papel filtro de celulosa (3) Pipeta de 1 mL (1) Pipeta de 10 mL (1) Pipeta de 5 mL (2) Pipeta pasteur (1) Tubos Falcon 50 mL (10)

3.5 Equipos Centrífuga Microscopio

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Estrujado de las uvas, inicio de la fermentación

Seleccione las uvas pasas de acuerdo a su estado de sanidad

Lleve las uvas al recipiente de vidrio llenando aproximadamente 3/4 partes del recipiente y adicione agua hasta aproximadamente ¼ parte

Haga un coloración de Gram y un recuento en cámara del inóculo de Saccharomyces cerevisiae y adicione a las uvas, de manera que por cada mL de jerez haya una concentración de 108 células ( 2 %)

Adicione 5 mL de metabisulfito de sodio al 10% para evitar la contaminación, mezcle y deje incubando durante 4 días. No cierre herméticamente el recipiente.

4.2 Evaluación del crecimiento de la levadura

Pasados estos días, realice coloración de Gram, con el fin de determinar la presencia de la levadura, la cual debe estar en gemación, si no encuentra una alta población de levadura, adicione Saccharomyces cerevisiae, en una proporción del 3% del volumen final contenido en el recipiente.

No olvide cerrar muy bien el recipiente y de almacenarlo en un lugar seco.


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4.3 Primer trasiego

A los quince días de llevado a cabo el proceso, filtre con las toallas desechables y vuelva a dejar en proceso fermentativo. Realice un recuento en cámara de Neubauer con el fin de estimar la población de levaduras.

Adicione de 10-15 mL de agar-agar.

4.4 Filtración y clarificación

Haga una coloración de Gram para verificar si la levadura ha finalizado la fermentación.

Después de un mes, filtre a través del papel desechable y papel filtro, con el fin de purificar y darle el brillo característico al vino. Con la ayuda de una probeta, deposite su jerez en varios tubos falcon de 50ml, llenándolos con un volumen igual para todos (45 ml). Entregue los tubos a los monitores, quienes centrifugaran los tubos a 7000 RPM por 5 minutos con el fin de retirar sólidos suspendidos, células muertas y partículas.

Una vez centrifugados, realice una filtración por membrana de 0.45 micras, con el fin de clarificar y dar el brillo característico al jerez. La filtración se realiza con la ayuda de una bomba de succión, vasos para filtración de membrana y filtros de 0.45 micras. (recuerde que solo debe filtrar el jerez por la membrana de 0.45 micras después de haber centrifugado, pues si se realiza antes de centrifugar, los sólidos suspendidos y partículas, obstruirán el filtro, impidiendo un alto rendimiento de este.

Determine las características organolépticas del producto y envase.

5. RESULTADOS

Complete los siguientes datos:

Prueba Inóculo Día 4 Día 15 Día 30 Día 45 Día 60

Coloración de Gram

Recuento en cámara de Neubauer

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


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8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIÓN

9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

1. Describa, cómo es la acción antioxidante del anhidro sulfuroso en los vinos?

2. Defina que es la acidez volátil, y para que se determina?3. Cuáles son los criterios de selección de cepas de levaduras con

capacidad enológica?4. Que efectos se pueden producir en el vino, por un exceso en el aireado?5. Nombre dos enzimas que se pueden emplear en vinos y cuál es su

función?6. Enumere cinco propiedades del anhidro sulfuroso o metabisulfito?


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PRÁCTICA NO. 2 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE Saccharomyces spp

1. INTRODUCCIÓN

La identificación de levaduras, está relacionada fundamentalmente con su caracterización macroscópica y microscópica, donde es importante verificar la presencia de estructuras como las ascosporas. En el caso del género Saccharomyces es necesario determinar las características de asimilación y fermentación de diversos azúcares, así como su capacidad de tolerancia al etanol y su reacción frente a la urea.

Entre los aspectos morfológicos considerados, se encuentran el tamaño y la forma de las células, el modo de reproducción o capacidad de sedimentación. Entre las características fisiológicas, se encuentra el hecho de fermentación de determinado carbohidrato y si puede utilizar o no determinadas fuentes de nitrógeno.

2. OBJETIVO

Realizar el aislamiento de una levadura a partir del vino elaborado en el laboratorio y realizar su identificación mediante pruebas bioquímicas.


3.1 Medios de cultivo (por grupo de trabajo)

Azúcares: Lactosa, Fructosa, Arabinosa, Xilosa, Manitol, Arbutina, Sacarosa, Glucosa, Maltosa. (Un tubo de 13 x 100 con 5 ml de cada azúcar con campana de Durham)

Agar Rosa de Bengala (1 caja) Agar OGY (1 caja) Etanol al 1% en caldo nutritivo (1 tubo)

3.2 Reactivos Colorantes de Gram Azul de lactofenol

3.3 Materiales (por grupo de trabajo) Gradilla Asa redonda

3.4 Equipos Microscopio Incubadora a 35°C Incubadora a 25°C

4. PROCEDIMIENTO


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Tome una asada del sobrenadante del vino y realice aislamiento en agar rosa de bengala y agar OGY, lleve a incubar por 48 horas a 35ºC.

Realice una descripción macroscópica de las colonias, realice una coloración de Gram y una preparación en fresco con azul de lactofenol, observe si hay formación de ascas.

Siembre cada uno de los azúcares, deje de último el etanol. Lleve a incubar a 25oC por 3 días.

Lea las reacciones bioquímicas como asimilación: si hay crecimiento (por turbidez y sin cambio de pH); y fermentación: si hay presencia de CO2,

turbidez y cambio en el Compare las bioquímicas con la tabla, e identifique el microorganismo.

5. RESULTADOS

5.1 Descripción macroscópica de las colonias de Saccharomyces

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5.2 Descripción microscópica

Coloración de Gram __________________________________________________

Azul de lactofenol ____________________________________________________

5.3 Resultados azúcares

OGYROSA DE BENGALA


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Saccharomyces cerevisiaeGlucosa +Galactosa +Ribosa -Arabinosa -Sacarosa +Maltosa +Celobiosa -Trehalosa +Lactosa -Xilosa -Rafinosa +Ramnosa +

Lactosa

Fructosa

Arbutina

Maltosa

Manitol

Arabinosa

Sacarosa

Glucosa

Xilosa

Alcohol al 1%

Microorganismo Identificado_____________________

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


1. Explique, fundamentado en un artículo, dos técnicas empleada para la

identificación de levaduras y su fundamento.

2. Porque algunos productores de vino no controlan el crecimiento de

levaduras salvajes en el vino?

3. Que desventajas tiene el uso de pruebas bioquímicas como

fermentación de azúcares en la identificación de levaduras?


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4. Que diferencias existen entre usar el agar rosa de bengala y OGY para el

aislamiento de Levaduras

5. Defina que es un auxograma y zimograma y su finalidad??



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PRÁCTICA NO. 3IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CONTAMINANTES DEL JEREZ

1. INTRODUCCIÓN

El análisis de las uvas y los vinos se realiza por diferentes razones, entre las que se destacan: la madurez, reducción del avinagramiento y mejora del proceso.Algunas de las “enfermedades” del vino son causadas por microorganismos nocivos, perjudicando la calidad del vino, entre las que se encuentran: Flor del vino y avinagramiento producidos por producción de ácido acético, amargor generado por un aumento de la acidez, donde el vino adquiere un olor butírico y pútrido, el ahilado o grasa donde existen microorganismos que se rodean de una sustancia mucilaginosa, la dextrosa, que agrupa bacterias, generando un aspecto aceitoso al vino.

Algunos de los análisis que se deben realizar a un vino son:

Característica EspecificacionesMicrobiológicos Determinación de levaduras salvajes

BotrytisBacterias acéticas Bacterias ácido lácticas

2. OBJETIVOS

Realizar el análisis microbiológico al vino realizado en el laboratorio.


3.1 Medios de cultivo (1 caja por grupo de trabajo)

Medio para el aislamiento de Zygosaccharomyces

A 600 ml de agua, adicionar100 g de glucosa10 g de triptona10 g de extracto de levadura25 g de agarCompletar a 1L con agua, esterilizarUna vez autoclavado, enfriar el medio y añadir 10 ml de ácido acético glacial.

Medio Tenner-Vetsch modificado (Aislamiento de bacterias ácido lácticas)

Diluir 335 ml de zumo de tomate hasta 1.500 con agua destilada y filtrar.A 1 litro de la solución anterior, añadir.20 g de agar


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20 g de triptona5 g de peptona5 g de extracto de levadura3 g de glucosa2 g de lactosa1 g de extracto de hígado1ml de tween 80 al 5%Calentar en un baño de agua hirviendo hasta que se disuelva, ajustar el pH a 5,5; esterilizar en autoclave.

Medio de carbonato cálcico-etanol (Aislamiento de bacterias del ácido acético)

En un volumen adecuado de agua disolver20 g de CaCO3

5 g de extracto de levadura20 de agar0.02 de verde de bromocresolDisolver manteniendo la solución en una baño de agua hirviendo. Autoclavar.

Agar WL adicionado de actidiona (Aislamiento de levaduras salvajes)

3.2 Reactivos Colorantes de Gram Azul de lactofenol Azul de metileno

3.3 Materiales (por grupo de trabajo) Asa redonda Láminas Laminillas Cámara de Neubauer 6 tubos taparrosca de 16 x 150 con 4,5 mL de agua peptonada al 0.1% 2 pipetas de 1 mL Capilares

3.4 Equipos Microscopio Incubadora a 25ºC Incubadora a 30ºC

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Aislamiento de Zygosaccharomyces

A partir del vino realizar aislamiento, llevar a incubar a 25oC durante 6 días, revisar la formación de ascas con forma de masa, para ello realizar coloración con azul de lactofenol.


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Interpretación:La presencia de ascas es indicador de la presencia de este microorganismo.

4.2 Aislamiento de levaduras salvajes

Tomar una asada del vino y realizar el aislamiento en el agar WL, incubar a 25oC durante 3 días.

Interpretación:Levaduras que fermenten son consideradas como contaminantes.

4.3 Aislamiento de bacterias ácido lácticas.

Tomar una asada del vino y sembrar por aislamiento, incubar a 30oC por 72 horas.

Interpretación:La aparición de colonias blancas, es indicativo de la presencia de bacterias ácido-lácticas.

4.4 Aislamiento de bacterias del ácido acético.

Realizar el aislamiento a partir del vino, incubar a 30oC por 72 h.

Interpretación:Las colonias presentan un aclaramiento alrededor por la neutralización del CaCO3

4.5 Recuento de levaduras, viabilidad y porcentaje de gemación.

Realizar recuento de levaduras del vino para ello haga diluciones de la muestra. Tome el último tubo y adicione azul de metileno. Monte la cámara y haga el recuento de levadura en el cuadrante central.

Haga los siguientes recuentos: Recuento total: Tome todas las levaduras y cuéntelas Rto de viabilidad: sobre el recuento anterior determine aquellas que se vean

azules como células muertas, cuéntelas y saque el porcentaje. Porcentaje de gemación: Sobre las células viables, cuente las levaduras que

se encuentren en gemación y determine el porcentaje de gemación. Haga los cálculos para expresar los resultados por mililitros.

5. RESULTADOS

5.1 Dibuje los resultados obtenidos en los diferentes aislamientos.


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5.2 Recuentos

Rto totalRto de viabilidad% de gemación

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


1. Explique el termino de levaduras “Killer” y cual es su mecanismo frente a

otras levaduras?

2. Realice una lista de 5 contaminantes, bacterias, hongos y levaduras y su

efecto en el vino?

3. Enumere tres medios de cultivo y su fundamento, empleados en el control

de calidad de contaminantes del vino, empleados en a industria?

4. Porque la sulfitación además de emplearse, como inhibidor de flora

acompañante en el proceso de elaboración de jerez, es empleada, también

como criterio de selección de cepas etanólicas?

5. Cuales son los principales contaminantes al inicio de la fermentación del

vino?

6. En que proceso de elaboración del vino, cree usted, basado en artículos, son

los puntos de mayor contaminación y alteración del proceso.



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PRÁCTICA NO. 4ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO DEL JEREZ

1. INTRODUCCIÓN

A lo largo de la historia de la elaboración del vino, las técnicas analíticas se han hecho cada vez más importantes, el análisis de las uvas y los vinos se realiza por diferentes razones, entre las que se destacan: la madurez, reducción del avinagramiento y mejora del proceso.Los factores físico-químicos del vino también afectan el rendimiento y las funciones vitales de la levadura, a si como su respiración, fermentación y reproducción, factores que dependen de la composición química del mosto y del etanol formado; de la cantidad de azúcares depende la velocidad de fermentación, la presencia de alcohol (etanol) producido disminuye el crecimiento de la levadura y la acidez del vino puede reducir la eficiencia de fermentación de azúcares en la misma. Por esta razón es de vital importancia realizar los análisis pertinentes al producto final.

Los análisis que se deben realizar a un vino incluyen:

Característica EspecificacionesSólidos solubles “Azúcar”, extracto, glucosa y fructosaAcidez Total, volátil, pH, ácidos individualesAlcoholes Etanol, metanol, aceites, fusel y glicerolCompuestos carbonilo Acetaldehído, diacetiloEsteres Acetato de etilo, antranilato de metiloCompuestos nitrogenados

Amoníaco, aminoácidos, aminas, proteínas

Compuestos fenólicos Totales, fracciones fenólicas incluyendo antocianinas

Adiciones químicas Acido sórbico y benzoico

2. OBJETIVOS

Realizar el análisis físico-químico al vino realizado en el laboratorio.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 Reactivos (por grupo de trabajo) Reactivo de yodo: disolver 1 g de yodo y 20 g de Yoduro de potasio en un

Litro de agua desionizada. (1 mL) Etanol al 95% (2 mL) Pastillas clinitest (1)

3.2 Materiales (por grupo de trabajo)


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Gradilla (1) Tubo de 13 x 100 (1) Tubo de 16 x 150 (2) Pipeta de 1 ml (3) Pipeta de 5 ml (1) Pipeta de 10 mL (1)

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Polisacáridos/pectinas

Tomar 1 ml del vino y añadir 2 ml de etanol o HCL al 1%, mezclar y dejar en reposo durante 15 minutos.Interpretación: La formación de gel después de varios minutos indica la presencia de pectina.

4.2 Prueba de almidón: (Para sidra)Añadir 1 ml de reactivo de yodo a 10 ml de zumo.

Interpretación: el color azul oscuro o violeta indica la presencia de almidón.

4.3 Azúcares reductores: estimación visual rápidaEsta prueba es útil al finalizar la fermentación. Tomar 2 ml del vino filtrado y colocarlo en un tubo adicionar la pastilla de Clinitest, comparar por color con la escala. Esta prueba sirve como criterio de finalización de la fermentación.

4.4 Prueba del alcoholímetro

Introducir el alcoholímetro limpio y seco, dentro del jerez y soltar con un suave movimiento giratorio, dejar flotar libremente. Una vez que el alcoholímetro ha cesado en su movimiento vertical efectuar la lectura por debajo del menisco y horizontalmente a la superficie del destilado. NOTA: El destilado debe estar a 20ºC para que no exista error en la lectura. El alcoholímetro debe tomarse siempre por la extremidad superior del vástago y jamás por el flotador, se debe lavar con alcohol puro y luego con éter, para extraer las materias grasas que pueden haberse adherido, y luego se seca con papel filtro.

4.5 Determinación de la acidez total del Jerez.

El vino es en realidad una disolución ácida diluida. Sin los ácidos tendría un sabor muy insípido y su estabilidad sería mínima, llegando incluso a ser atacado por muchos microorganismos que producirían fermentaciones no deseables. Incluso el color sería muy pobre.

En la bodega se debe conocer en todo momento la acidez del vino a fin de determinar la cantidad adecuada de dióxido de azufre que se ha de añadir.

La acidez total se define como la suma de los ácidos en estado libre que existen en el vino y que sean valorables, cuando se realiza la neutralización hasta pH=7,0, por adición de una disolución alcalina. Generalmente es del


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orden de 5 g/l expresada en ácido tartárico, o 3,25 g/l expresada en ácido sulfúrico.

Los ácidos que se valoran son de naturaleza orgánica, siendo los principales:

Ácido tartárico. Ácido málico. Ácido láctico. Ácido cítrico. Ácido succínico.

La determinación de la acidez total se realiza en la práctica en base a una valoración ácido-base, utilizando como reactivo valorante una base fuerte como es el hidróxido sódico (NaOH), y tomando como punto de equivalencia pH= 7,0. Para detectar dicho punto utilizaremos el indicador "azul de bromotimol", cuyo intervalo de viraje se encuentra comprendido entre los valores de pH (6,0-7,5) y la variación es de color amarillo a azul-verdoso.

4.5.1Material utilizado: - Bureta graduada y soporte. - Matraz erlenmeyer de 200 ml. Reactivos: - Disolución de NaOH 0,1 N - Azul de bromotimol.

4.5.2 Técnica:

-En un erlenmeyes de 200 ml. se introducen 10 ml. de vino blanco exactamente medidos y se diluyen con 50 ml de agua destilada libre de anhídrido carbónico.

-Se añaden unas gotas del indicador "azul de bromotimol", con lo que la muestra adquiere un color amarillo-verdoso (en caso de muestras con gran intensidad de color es muy probable que no se distingua por confundirse con el color del vino).

-Con la bureta ya enrasada de disolución de NaOH 0,1 N se empieza la valoración añadiendo gota a gota el reactivo valorante al matraz que contiene la muestra, tratando de agitar para conseguir una mezcla lo más intima entre el reactivo valorante y el vino. Seguiremos repitiendo el proceso hasta que el color de la muestra vire a verde-azulado, punto en el cual consideramos que se ha alcanzado el punto de equivalencia. En este momento se leerán el volumen gastado de NaOH.


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Cálculos:

Notas:

Se pueden usar otros indicadores que tengan un intervalo de viraje próximo a pH=7,0, tales como el "rojo cresol" (pk=7,7). No obstante, el mejor seguimiento de la valoración se puede hacer utilizando un pH-metro de precisión tomando medidas del valor del pH en cada momento con el fin de representar la curva de valoración.

En el vino, también existen otros ácidos tales como el ácido sulfuroso, -añadido en la vendimia y el ácido carbónico originado en la fermentación-. Mientras que el primero no influye apreciablemente en los resultados, el segundo sí, llegando incluso a aumentarlos significativamente. Para evitar esta interferencia, se suele agitar el vino a temperatura ambiente, sometiéndole a vacío parcial hasta que cese el desprendimiento de anhídrico carbónico. También se puede hervir el vino durante un minuto para conseguir el mismo resultado.

5. RESULTADOS

5.1 Prueba de pectina __________________5.2 Prueba de almidón __________________5.3 Azúcares reductores _________________5.4 Contenido de alcohol _________________

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


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1. Investigue que otros análisis a los vistos en clase se evalúan en la producción de vinos, y busque la norma AOAC, que explique el fundamento de la técnica.

2. Que son los aceites fusell que se pueden producir durante la fermentación y que efectos causan en el vino?

3. Haga un diagrama de todo el proceso de elaboración de la champaña indicando, tipos de uva, microorganismo, proceso de fermentación, clarificación, gasificación, embotellado y almacenamiento

4. Cómo se determina la presencia de lactatos en el vinos y que efectos producen.

5. Busque los parámetros fisico-quimicos que rigen para Colombia la calidad de los vinos.



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PRÁCTICA No. 5PODER LEUDANTE DE LA LEVADURA PANARIA

1. INTRODUCCIÓN

Para la producción de pan se utilizan cepas de Saccharomyces cerevisiae; esta levadura utiliza glucosa como fuente de carbono generando dióxido de carbono, el cual causa el esponjamiento de la masa y la textura del producto final. Esta levadura debe tener unas características especiales para que se pueda utilizar en la producción del pan: alta velocidad de crecimiento, buen rendimiento sobre el medio utilizado, buen poder de fermentación para obtener una masa esponjosa y con buena contextura, tolerancia a inhibidores microbianos como el ácido propiónico, entre otras.

2. OBJETIVO

Establecer el efecto de la levadura sobre la masa panaria.

3. MATERIALES

3.1 Cepas Suspensión de levadura (Saccharomyces cerevisiae): 10g de levadura + 120

ml de agua 28ºC en un erlermeyer. (preparar 500 mL de suspensión para todo el curso).

3.2 Materiales (por grupo de trabajo) Sacarosa (10 g) Harina de trigo (100 g) Vasos de precipitado de 250 mL o frascos de compota (4) Probetas de 250 mL (4) Pipeta de 10 mL (2) Espátula Varilla agitadora

3.3 Equipos Balanza Incubadora a 30ºC

4. PROCEDIMIENTO

Numerar los vasos de precipitado (1-4)

Añadir a cada uno 25 g de harina de trigo

Añadir 3 gramos de sacarosa a los vasos # 1, 2 y 3

Al vaso #1: Añadir 22.5 ml de agua

Al vaso #2: Añadir 15 ml de agua


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Pasar la suspensión de la levadura con la pipeta a los vasos de precipitado: Vaso #1: 7.5 ml Vaso #2: 15 ml Vaso #3: 30 ml Vaso #4: 30 ml

Mezclar con una varilla de vidrio

Numerar las probetas (1-4)

Añadir la masa a las probetas correspondientes y colocarlas a 30ºC

Esquema del procedimiento:

1

1 2 3 425g de harina 25g de harina 25g de harina 25g de harina3g de sacarosa 3g de sacarosa 3g de sacarosa 3g de sacarosa22.5mL de agua 15mL de agua 7.5mL agua 30mL de suspensión7,5mL suspensión 15mL de suspensión 22.5 mL suspención

Leer y anotar la altura de la masa en cada probeta en intervalos de 15 minutos durante 1:30 horas

5. RESULTADOS

5.1 Completar el siguiente cuadro:

Tiempo (min) Probeta 1 Probeta 2 Probeta 3 Probeta 40

153045607590

5.2 Dibuje los resultados altura vs tiempo


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5.3 Discuta los resultados obtenidos, de acuerdo a su criterio cual de los 4 ensayos es el mejor, que razones lo llevan a concluir.

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


1. De que depende la elasticidad que debe tener la masa panaria?

2. De que dependen los grados de esponjamiento obtenidos en la masa

panaria?

3. Cual es la proteína presente en la harina de trigo importante en el proceso de fermentación del pan, y que función cumple?

4. Que aditivos se pueden adicionar a la harina de trigo para mejorar la actividad de la levadura

5. Cuales son los productos metabólicos en la fermentación de la levadura en la elaboración del pan que otorga los olores típicos del pan en el momento de horneado

6. Qué es la masa madre y en qué casos se emplea?

7. Qué tipos de bacterias pueden actuar también en la fermentación de la

harina?

8. Porqué es tan importante la retención de humedad en la masa panaria y

qué relación tiene con la levadura

9. Cómo se comporta la levadura en harinas como la de maíz y centeno?



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PRÁCTICA NO. 6ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO DE LA LECHE CRUDA

1. INTRODUCCIÓN

Los sistemas de control de calidad y gestión de riesgos han pasado de la comprobación del producto final a la certificación del proceso, con la introducción, por ejemplo, de evaluaciones por análisis de peligros en puntos críticos de control (HACCP). La FAO y otras instituciones han elaborado directrices y realizado programas de capacitación en materia de normas y especificaciones para la leche y los lácteos; sobre normas sanitarias y fitosanitarias, y sobre los obstáculos técnicos al comercio, en el ámbito del comercio internacional. Estas directrices y programas de capacitación se han adaptado para el sector de los pequeños productores de lácteos.

Dentro de los parámetros que se deben seguir para determinar la buena calidad físico-química de la leche se encuentran: ausencia de sustancias tales como adulterantes, preservativos, sustancias tóxicas y residuos de drogas o medicamentos, tiempo de reducción del azul de metileno, y ausencia de calostro, sangre u otros elementos extraños en suspensión.

2. OBJETIVO

Realizar el análisis fisicoquímico de una leche cruda.


3.1 Reactivos (por grupo de trabajo)

3.1.1 Prueba de alcohol Alcohol etílico 68% (2 mL)

3.1.2 Tiempo de reducción del azul de metileno (2 mL de solución de trabajo) Azul de metileno

Solución madre: colocar en un frasco estéril de color ámbar 2000 mL de agua destilada recientemente hervida por 10 minutos. Agregar 1.1 g de cloruro de azul de metileno, agitar hasta completa disolución, enfriar y conservar la solución colorante en un sitio oscuro y en refrigeración. Preparar la solución semanalmente. (Monitores: Se recomienda preparar máximo 100 ml de la solución madre)

Solución de trabajo: en un frasco que contenga 90 mL de agua destilada estéril, agregar 10 mL de la solución madre. Preparar esta solución diariamente.

3.1.3 Identificación de harina y almidones Solución de yodo yoduro de potasio (1 mL)


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Yodo: 1 g Yoduro de potasio: 2 g Agua destilada: 300 mL

3.1.4 Identificación de cloruros Solución acuosa de nitrato de plata 1.3415 g/L ( 5 mL) Solución acuosa de cromato de potasio 10% (2 gotas)

3.1.5 Identificación del formaldehído Solución acuosa de cloruro férrico al 1% recién preparado (3 gotas) Acido sulfúrico densidad 1.82-1.8225 g/L (2 mL) Solución diluida de formaldehído: diluir una gota de solución de formaldehído

del 38% en 100 mL de agua. (2 gotas)

3.1.6 Identificación de hipocloritos-cloraminas-dióxido de cloro Solución de yoduro de potasio: disolver 7 g de yoduro de potasio en 100 mL

de agua destilada. Preparar cuando se vaya a usar. (1,5 mL) Acido clorhídrico diluido: a 100 mL de HCL 38.5% agregar 200 mL de agua

destilada. (4 mL) Solución de almidón: hervir un gramo de almidón soluble en 100 mL de agua

destilada. Enfriar antes de usar. (1 mL)

3.2 Materiales (por grupo de trabajo) Frasco gotero Gradilla Malla de asbesto Mechero Trípode Pipeta de 1 mL (1) Pipeta de 1 mL estéril (1) Pipeta de 10 mL estéril (1) Pipeta de 5 mL (5) Pipeta de 2 mL (3) Probeta de 250 mL (1) Termolactodensímetro (1) Tubo de 16 X 150 mL tapa rosca (6) Varilla de vidrio (1) Vaso de precipitado con hielo

3.3 Equipos Baño termostatado (37ºC) Baño termostatado (85ºC)

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Prueba de alcohol

Agitar bien la muestra de leche, tomar 2 mL de leche y colocarlos en el tubo, adicionar 2 mL de alcohol, mezclar.


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Interpretación:Con leche normal la mezcla se desliza a lo largo de las paredes del tubo sin dejar rastros de grumos.Con leche ácida por el contrario, se forman grumos espesos de caseína precipitada.

4.2 Prueba de densidad a 15/15 con termolactodensímetro

Agitar bien la muestra de leche, si la leche presenta separación de la crema, esta se debe calentar por debajo de 38ºC, homogenizar, lleve la leche a una temperatura de 15ºC +/- 5. Agregue la leche a la probeta, evitando la formación de espuma. Introduzca suavemente el termolactodensímetro manteniéndola verticalmente y sosteniéndolo en su descenso hasta un punto cercano a su posición de equilibrio. Provoque un ligero movimiento de rotación. Evite el contacto del termolactodesímetro con las paredes de la probeta. Efectúe la lectura después de un minuto de sumergido el termolactodensímetro.

4.3 técnica de células somáticasTomar 0.01ml de leche, previa agitación de la muestra, colocar una pequeña gota sobre una lámina, dejar secar en superficie horizontal a 40°C, agregar la solución de azul de metileno modificada y dejarla por 5 minutos, lavar escurrir y dejar secar a temperatura ambiente cubrir con la laminilla y observar con el objetivo de inmersión.

Recorrer el extendido contando los campos observados y el número de leucositos encontrados en cada uno de ellos. Esta operación se debe llevar a cabo primero en línea horizontal y luego en línea vertical ( 10 campos horizontales y 10 campos verticales).Descartar los tres primeros campos en los extremos para evitar irregularidades de los bordes del frotis.

Los leucocitos se observan como elementos celulares con citoplasma y núcleo estando este último más teñido que el citoplasma.

Los leucocitos destruidos en que se distingue más del 50% de la célula deben contar y también cuando solo aparece el núcleo.

La expresión de resultados se hacecon la siguiente fórmula

Número de leucocitos contadosNúmero de leucocitos/ml=_____________________________ * factor del microscopio Número de campos contados

4.4 Adulterantes


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4.4.1 Identificación de harina y almidones

Colocar en un tubo de ensayo 5 mL de muestra, hervir, enfriar en el agua con hielo y adicionar 1 mL de la solución de yodo.

Interpretación:Positivo: color azul, indica presencia de almidón y harinaNegativo: color amarillento

4.4.2 Identificación de cloruros

Colocar en tubo de ensayo 5 mL de la solución de nitrato de plata, agregar dos gotas de la solución de cromato de potasio. Mezclar y adicionar 1 mL de leche, mezclar.

Interpretación:Si se produce una coloración rojo ladrillo, la cantidad de cloruros en la leche expresada como cloruro de sodio es de 2.3 g/L, se produce inmediatamente una coloración amarillo canario. En este caso la muestra es sospechosa de haber sido adicionada con cloruros, por lo tanto debe efectuarse la determinación cuantitativa.

4.5 Conservantes

4.5.1 Identificación del formaldehído

Colocar 3 mL de leche en un tubo de ensayo, agregar 3 gotas de la solución de cloruro férrico, agitar; por las paredes agregar con cuidado, sin que se mezcle con la leche, ácido sulfúrico en cantidad suficiente para que se forme una capa de 1-2 cm de espesor.

I nterpretación : En presencia de formaldehído aparecerá un anillo de color violeta, cuando la concentración de formaldehído en la leche es alta, la prueba es menos sensible, para hacerla más sensible se deben hacer diluciones de la muestra.

4.5.2 Identificación de hipocloritos-cloraminas-dióxido de cloro

Prueba 1

Colocar 5 mL de leche en un tubo de ensayo, agregar 1.5 mL de solución de yoduro de potasio, mezclar bien por agitación. Anotar el color de la leche.

Prueba 2

Si no cambia el color de la leche, agregar 4 mL de HCL diluido, mezclar bien con una varilla de vidrio y observar el color de la cuajada.

Prueba 3


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Colocar luego el tubo de baño maría calentado previamente a 85ºC y dejar en reposos 10 minutos (durante este tiempo la cuajada sube a la superficie), enfriar rápidamente colocando el tubo en agua fría. Anotar el color de la cuajada y el líquido.

Prueba 4

Agregar luego el líquido por debajo de la cuajada 0.5 a 1 mL de la solución de almidón. Observar el color inmediatamente.

I nterpretación:

Concentración cloro

disponible ppm

1.000 500 200 100 40 20

Prueba 1 Pardo amarillento

Amarillo intenso

Amarillo pálido difuso

- - -


Amarillos intenso

Amarillo claro

- - -


Amarillo intenso

Amarillo Amarillo Amarillo pálido

Amarillento

Prueba 4 Azul violáceo

Azul violáceo

Azul violáceo

Rojo violáceo oscuro

Rojo violáceo

Rojo violáceo.

5. RESULTADOS

Prueba de alcohol:________________________________________________________

Prueba de densidad a 15/15 con termolactodensímetro__________________________

Tiempo de reducción del azul de metileno:____________________________________

Identificación de harina y almidones:_________________________________________

Identificación de cloruros:__________________________________________________

Identificación de formaldehído:_____________________________________________

Identificación de hipocloritos-cloraminas-dióxido de cloro:________________________


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Dictamen de la calidad de leche analizada_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES

8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIÓN1. Cúal es el fundamento de las prueba de la fosfatasa para evaluar el pro-

ceso de pasteurización?

2. Enumere cuatro enzimas que se encuentren naturalmente en la leche y como se pueden emplear en el control de la calidad de la leche?

3. Defina que es el punto isoeléctrico de la leche

4. Explique la técnica de cuantificación de células somáticas en la leche y porque se emplea como un criterio de calidad.

5. Describa en qué consiste el método de estandarización de la grasa y para que se emplea?

6. Describa el método de crioscopia empleado para medir la cantidad de agua presente en la leche.

7. Describa el porque en la leche se pueden encontrar micotoxinas y sus-téntelo con un articulo.

8. Explique la prueba de la lactofiltración que se emplea en leches?



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PRÁCTICA NO. 7PRUEBA DE ANTIBIÓTICOS Y DETERMINACIÓN DE ACIDEZ

(EXPRESADO COMO ÁCIDO LÁCTICO)

1. INTRODUCCIÓN

La leche utilizada como materia prima para obtener productos alimentarios, puede contener sustancias antibacterianas que inhiben y/o reducen la actividad de los cultivos iniciadores, lo que eventualmente, puede conducir a la obtención de productos lácteos de escasa calidad y acarrear pérdidas económicas. Por tanto, es necesario que la leche utilizada para preparar los cultivos finales y la usada para la fabricación de los diversos productos lácteos este exenta de agentes inhibidores.

Los fermentos lácteos son generalmente el origen de la acidificación debida a la transformación de la lactosa en ácido láctico. Si el fenómeno es espontáneo se debe normalmente a Streptococcus lactis, que se desarrolla a temperatura ambiente. Cuando la acidez alcanza 35 a 40ºD, la caseína flocula al someter la leche a ebullición. A los 60-70ºD, el fenómeno se produce a temperatura ambiente.Además de los fermentos lacticos, otros microorganismos pueden producir la acidificación de la leche: Coliformes, Enterococos, Estafilococos, Micrococos, etc.

Determinar la acidez de la leche y establecer la presencia de antibióticos son pruebas fundamentales para dar inicio a la fermentación de leches. Para la determinación de la acidez pueden utilizarse dos métodos diferentes, la titulación con una base o pruebas con potenciómetro (pH metro), el criterio para la selección del método depende fundamentalmente del productor, sin embargo es claro que las pruebas de titulación son cuantitativas, mientras que las pruebas con pH son cualitativas.

En la determinación de antibióticos se utiliza fundamentalmente pruebas químicas que se basan en la búsqueda de penicilinas o pruebas biológicas cuyo principio es el cultivo iniciador, por costos muchas empresas utilizan de rutina las biológicas y las químicas en control de hatos.

2. OBJETIVO

Determinar la presencia de antibiótico y la acidez de una leche cruda mediante titulación.


3.1 Reactivos (por grupo de trabajo) Fenoftaleína al 1% (3 gotas) Monitores: Disolver la fenolftaleína en Etanol. Hidróxido de sodio al 0.1N (2 mL) Cultivo stárter (2 mL)


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3.2 Materiales Tubo de 16 x 150 estéril (1) Pipeta de 10 ml (1) Pipeta pasteur (1) Pipeta de 10 ml estéril (1) Pipeta de 2 ml estéril (1) Bureta Vaso de precipitado o compota Soporte universal Nueces

3.3 Equipos Baño serológico a 45oC

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Prueba de acidez

Tomar 9 ml de leche en un vaso de precipitado y adicionar 3-5 gotas de fenoftaleína 1%, iniciar la titulación con hidróxido de sodio 0.1N, lentamente, parar cuando la leche cambie a rosa pálido, anotar los mL de NaOH gastados y realizar el siguiente cálculo:

ml de NaOH x 10 = Grados Thorner

ml de NaOH ÷10 = % de ácido láctico

4.2 Prueba de antibióticos

Tomar 10 mL de leche y colocarlos en un tubo estéril, adicionar 2 mL de cultivo starter, mezclar y llevar a incubar a 45oC, durante dos horas.

Interpretación:Si después de la incubación hay formación de coágulo, no hay presencia de antibiótico, si la leche continua líquida después de dos horas de incubación es presuntivo de la presencia de antibiótico en la leche.

5. RESULTADOS

5.1 Prueba de acidez

ml de NaOH gastados: __________

Grados Thorner: __________

% de ácido láctico: __________

5.2 Prueba de antibióticos


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Formación de coágulo: Si ___ No ___

Presencia de antibiótico: Si ___ No ___

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


¿Porque motivo no esta permitido para conservar alimentos en general el uso de antibióticos?

Cómo se puede evaluar la presencia de antibióticos en la eche con una metodología diferente a la vista en laboratorio.

Cuales son los principales inhibidores naturales de la leche cruda y explique

brevemente? ¿En la legislación colombiana se prohíbe el uso de aditivos tales como

antibióticos?

Explique cómo los detectaría RAPIDAMENTE en una empresa láctea la presencia de antibióticos con un método diferente al realizado en laboratorio?



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PRACTICA No. 8ELABORACIÓN DE YOGURT

1. INTRODUCCIÓN

El yogurt se puede obtener a partir de la leche de de todas las especies de animales y aunque la más común es la vaca, la cabra y la oveja, también se han utilizado leches de camella y búfala. Existen distintos tipos de yogurt, pero los más importantes son los yogures firmes o consistentes y los yogures batidos. Para la fabricación de este se utiliza leche entera o desnatada la cual debe almacenarse a temperatura adecuada y realizarle un tratamiento térmico equivalente a la pasteurización, debe ser libre de antibióticos e inhibidores y su acidez no debe ser superior a 0.16% de acido láctico, así mismo debe tener un 15% de sólidos para mejorar la consistencia del yogurt i evitando la sinéresis.

El yogurt es un producto lácteo que se obtiene de la fermentación de la lactosa de la leche por la adición de un cultivo mixto de bacterias ácido-lácticas (LAB) (S.salivarius var. thermophyllus y Lb. bulgaricus), en estos cultivos iniciadores la lactosa entra a la célula por medio de un sistema permeasa y a continuación es hidrolizada a glucosa y galactosa por una β – galactosidasa, posteriormente la glucosa es metabolizada vía glicolitica.

2. OBJETIVO

Elaborar un yogurt y entender el fenómeno de fermentación


3.1 Reactivos (por grupo de trabajo) NaOH 0.1 N (10 mL) Fenoftaleína 1% (9 gotas) Colorantes de Gram Aceite de inmersión

3.2 Materiales (por grupo de trabajo) Malla de asbesto (1) Trípode (1) Soporte universal (1) Nueces (1) Cuchillo Cuchara Olla Vaso de precipitado de 50 mL (1) Bureta Láminas Cultivo iniciador (20 ml) Azúcar (1 lb) Fruta (mora o fresa, limón) Bolsa de leche pasteurizada Recipiente de vidrio para la conserva


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Recipiente plástico para el yogurt Cultivo iniciador Pipeta de 10 mL (1) Pipeta pasteur (1)

3.3 Equipos Microscopio Incubadora a 45ºC4. PROCEDIMIENTO

4.1 Elaboración de la conserva

Haga una selección de las frutas, retire aquellas que están dañadas y lávelas con abundante agua.

En el caso de la fresa córtela en rodajas, pésela y anote el peso y colóquelas en la olla, adicione limón (para evitar el pardeamiento enzimático) y adicione azúcar (unos 40 gramos), deje unos 5 minutos, esto permitirá que la fruta libere agua.

Coloque en la olla y adicione azúcar (en una proporción 3:1) (fruta:azúcar), mezcle las materias primas y lleve al fuego. Mezcle constantemente para evitar que se pegue el producto. Lleve a ebullición y determine el punto final mediante el ensayo de la lámina o la prueba de la cuchara.

Apague la conserva e inmediatamente vierta en el frasco de conserva, tape y enfríe rápidamente

4.2 Elaboración del Yogurt

Tome la leche y realice la prueba de acidez, verificado el grado de acidez, adicione la leche en una olla e incorpore azúcar en un porcentaje del 3%, mezcle y lleve a calentar a 45oC

Adicione un inóculo del 2% del cultivo iniciador y mezcle completamente

Incube a 45oC durante 4 horas.

Observe la consistencia a la hora 1, 2 y 4, determine la acidez a la hora 4 y haga coloración de Gram

Aparte realice una determinación del grado de acidez del cultivo iniciador anote los resultados.

Una vez terminada la fermentación adicione la conserva y mezcle suavemente para evitar la sinéresis.

Enfríe antes de tomar


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5. RESULTADOS

Producto ml NaOH % Acidez

Leche inicial

Inóculo inicial

Hora 4

Coloración de Gram del producto terminado:

_____________________________________

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


1. En la siguiente gráfica se muestra el comportamiento de crecimiento de St. Thermophilus y Lb. Bulgaricus, que papel desempeñan estos microorganis-mos en la producción de yogurt?. A quien se debe la producción de acetal-dehído principalmente y qué efecto tiene sobre éste producto la relación simbiótica de estos dos microorganismos?


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2. Según su composición, como se clasifican los cultivos estárteres, explique cada uno de ellos.?

3. Cuales son los objetivos del tratamiento térmico en la realización del yo-gurt?



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PRÁCTICA No. 10 VALORACION DE LA FUERZA DEL CUAJO

1. INTRODUCCIÓNLa coagulación de la leche puede ser llevada a cabo por enzimas proteolíticas de muy variado origen: bacterianas, fúngicas, vegetales o animales. Muy pocas entre estas son compatibles con la tecnología de quesos. El cuajo de ternera es el agente coagulante usado tradicionalmente y sirve como referencia a otros preparados.Este cuajo esta constituido principalmente por la proteasa acida quimosina y en menor proporción por la pepsina.

Otras proteasas utilizadas son las pepsinas bovinas y procinas, y las de origen fungico de Endothia parasiticus, Mucor pusillos o Mucor miehei(llamados cuajos microbianos). Mexclas de enzimas de diferentes origen son frecuentemente utilizadas. La quimosina es la mejor opción para la elaboración de quesos, ya que debido a su alta especificad permite obtener quesos con adecuada textura, buen sabor y altos rendimientos.La concentración del cuajo, fuerza del cuajo o poder coagulante del cuajo, esta determinado por e numero de centímetros cúbicos de leche que coagula un centímetro cubico de cuajo a una temperatura dada y tiempo determinado, de aquí se deriva que un cuajo normal sea aquel que a 35ºC de temperatura cuaja en 40 minutos 10000 litros de leche por cada litro de cuajo, o sea que, que tiene una fuerza de 1:10000. Este cuajo viene en forma liquida y es el mas usado; el cuajo en polvo puede venir en 1:100000 o 1:150000, es mas puro y conserva mejor su actividad; el cuajo de origen microbiano viene con una fuerza aproximada de 1:250000; por ultimo la fuerza del cuajo cristalizado es de 1:10000000.

2. OBJETIVO

-Determinar la fuerza del cuajo que se utilizará en la elaboración de quesos.

-Determinar el tiempo de coagulación de un sustrato de leche estándar, después de adicionar un preparado enzimático usado como un agente coagulante de la leche


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3.1 MATERIALES

- Pipeta de 10 mL, 5mL, y de 1mL

- Matraz de 125 ó 250 mL

- Balanza de precisión

- Baño termostatado

- Fiola de 100 Ml

- 200 mL leche en polvo libre de inhibidores

3.2 REACTIVOS

- Agua para beber

- Cuajo en polvo y pastilla

- Cloruro de sodio o sal común

- Cloruro de calcio (solución)

4. MÉTODO

- Calentar 100 ml de leche a 35ºC en un baño maría.

- Añadir 10 ml de solución de cloruro de calcio al 0.1 M

- Agregar 10 ml de solución de cuajo que contengan 0.1 g de cuajo,

reactivada con agua tibia y sal.

- Tomar el tiempo desde la adición del cuajo hasta que se presente la

coagulación de la leche.

- Cálculos para hallar la fuerza:

F = 2400 x K

D x C

Donde: K = cantidad de leche

D = tiempo de coagulación (s)

C = cantidad de cuajo (g)


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5. RESULTADOS

- Calcular la fuerza de los dos tipos de cuajo.- Calcule cuantos gramos de cada cuajo se necesitan si se desea coagular 50 litros de leche

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


- Enumere tres factores físicos que afecten la coagulación?

- Que importancia tiene una alta concentración de caseina alfa sobre la

coagulación?

- Enumere que microorganismos recombinantes se usan hoy en día para la

producción de la quimosina?

- Dibuje como la quimosina afecta la estructura de la caseína?


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PRÁCTICA No. 9 ELABORACIÓN DE QUESO DOBLE-CREMA

1. INTRODUCCIÓN

El queso es el producto fresco o madurado obtenido por drenaje (de liquido) tras la coagulación de la leche, nata, leche desnatada o parcialmente desnatada, grasa de la leche o una combinación de dichos ingredientes. Su clasificación depende de diversos factores: según su contenido de humedad se clasifica en duros, semiduros y blandos; según el método de coagulación de la caseína se clasifican en quesos al cuajo (enzimáticos), queso de coagulación láctica (ácido láctico), queso de coagulación de ambos métodos; y según al mi-croorganismo utilizado en la maduración y la textura del queso, se clasifican en quesos de ojos redondeados, granulares y quesos de textura cerrada.

El queso doble-crema, es un queso artesanal propio de la sabana cundiboyacense, cuya principal característica es la fermentación de la leche cruda y la posterior cocción de la cuajada para obtener un queso hilado. Es utilizado en la elaboración de diversos productos, para la elaboración de este queso se utiliza la mezclas de leches crudas frescas y crudas ácidas.

2. OBJETIVO

Elaborar un queso crema, a partir de leches crudas ácidas y crudas frescas


3.1 Reactivos (por grupo de trabajo) NaOH 0.1N (5 mL) Fenoftaleina al 1% (6 gotas)

3.2 Materiales (por grupo de trabajo) Leche cruda ácida (1 litro) Leche cruda (2 litros) Enzima Sal Sartén de teflón Olla Colador Cucharas DE TEFLON Cuchillo Vaso de precipitado de 50 mL Soporte universal Nueces Trípode (1) Malla de asbesto (1)


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Bureta Termómetro Pipeta de 10 mL (2) Pipeta pasteur Tela de pañal o gaza

6. PROCEDIMIENTO PARA APLICAR EL CUADRO DE PEARSON

Es un cuadro sencillo utilizado en las industria láctea para ajustar concentración de grasa, ajustar acidez empleando un balance de sus componentes

Tome las dos leches y realice la titulación

Después de la titulación determine la cantidad de cada leche usada para obtener el porcentaje de 0.42% de ácido láctico para ello utilice el cuadrado de Pearson. Ver el siguiente ejemplo:

En este caso por cada 280 ml de leche ácida se deben adicionar 700 ml de leche fresca.

Mezcle las leches y lleve a calentar a 30oC, aparte disuelva un cuarto de pastilla de la enzima en unos 50 ml de leche y adicione a la mezcla de la leche. Deje reposar por 20-30 min, terminado el tiempo revise la cuajada para determinar si ya se puede realizar el corte. Introduzca un cuchillo dentro de la cuajada y si este sale limpio puede realizar la cuajada, para esto corte horizontal, vertical y trasnsversalmente con un máximo de grosor de 1 cm.

Terminado el proceso mezcle la cuajada y caliente lentamente a 37oC durante 20 min para acelerar el proceso de desuerado.

Desuerado: pase la cuajada a través de un colador, que tenga un cedazo, para separar el suero de la cuajada.

0,42 %

1.12 %

0,14 %

0.28

0.7


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Tome la cuajada, adiciónele sal a un porcentaje del 1% y llévela nuevamente a la olla, adicione un poco de suero y caliente fuertemente, con la cuchara empiece a hilar el queso, retire el exceso de suero.

Cuando el queso tenga la textura ideal (sin restos de suero), moldear

5. RESULTADOS

Titulación leche ácida: ml gastados de NaOH: ________. % de ácido láctico: _________

Titulación leche fresca: ml gastados de NaOH: ________. % de ácido láctico: _________

ml de leche ácida a utilizar: ____________ml de leche fresca a utilizar: ___________

Realice un análisis de costos del queso teniendo como base el precio del litro de leche.

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


1. Como se emplea el cuadro de Pearson para establecer el contenido de gra-sa de una leche? Realice un ejemplo

2. Enumere y explique los principales factores físicos de los que depende la maduración del queso.

3. Los fermentos lácticos que normalmente se utilizan para la fabricación de los diferentes quesos, pueden ser destruidos por un virus, llamado bacterió-fago o simplemente fago. Como ataca este fago y como se puede detectar?

4. Cómo la adición de cloruro de calcio mejora la coagulación del queso?

5. Descrina como pueden actuar benéficamente las bacteriosinas sobre el queso?



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PRÁCTICA No. 11SELECCIÓN DE CEPAS CON CAPACIDAD PROBIÓTICA

1. INTRODUCCIÓN

Actualmente se define como probióticos a microorganismos vivos que al ser ingeridos producen beneficios a la salud mas allá de los nutrientes propios. Para su uso clínico los probióticos deben tener una serie de características como son: ser de origen humano, resistentes al ácido y a la bilis, capaces de colonizar el tracto intestinal, producir sustancias antimicrobianas y poseer capacidad probiótica demostrable. Su efecto benéfico lo obtienen a partir de una mejor respuesta inmunitaria, mejor digestión de la lactosa, regulación de la motilidad intestinal, influencia positiva sobre la carga microbiana intestinal y disminución en la producción de carcinógenos. Los principales microorganismos utilizados como probióticos son bacterias como Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. rhannosum, L. casei, L. reuteri, Bifidobacterium termophilus, B. bifidium, B. longum, B. infantis, Streptococcus lactis, S. cremoris, Propinobacterium sp, Enterococcus sp. y levaduras como Saccharomyces boulardii, S. cerevisiae y Candida utilis.

2. OBJETIVO

Reconocer las principales características que debe cumplir una cepa para ser considerada como probiótico.


3.1 Preparacion del tubo No 2 de la escala de Mac Farland (Monitores)

Cloruro de Bario (BaCl2) al 1% Ácido Sulfúrico (H2SO4) al 1 %

A un tubo de 13x100 nm agregue 0.1ml de BaCl2 y 4.9 ml de H2SO4 para tener un volumen final de 5ml. En un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm compruebe la absorbancia que debe estar alrededor de 0.25-0.27 que equivale aproximadamente a 6x108 UFC/ml.

3.2 Cepas (por grupo de trabajo) Saccharomyves cerevisae var boulardii , en 10 ml de caldo YPG a 35°C

durante 12h (Tomado del banco de células del laboratorio de Biotecnolo-gía aplicada.

Salmonella sp en 10 ml de caldo BHI o caldo nutritivo a 37°C durante 12h.

E. coli en 10 ml de caldo BHI o caldo nutritivo a 37°C durante 12h.


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Sigella sp. en 10 ml de caldo BHI o caldo nutritivo a 37°C durante 12h.

3.3 Medios de cultivo (por grupo de trabajo) Maltosa, Xilosa, Galactosa, Arabinosa, Lactosa, Ramnosa, Rafinosa, Glucosa,

Celobiosa, Melobiosa y Manitol preparados al 1% (p/v) en caldo nutritivo con rojo de fenol 0.1 % (p/v) como indicador de pH. (11 tubos 13 x 100 tapa rosca con 5ml). NOTA: Los carbohidratos deben ser esterilizados a 7lb de presión, durante 7 minutos.

Caldo YPG adicionados concentraciones de sales biliares (desde 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 y 4.0% (p/p)). (9 tubos 13x100 tapa rosca).

Caldo YPG a pH 2, 3, 4, 5, 6 y 7 ajustado con HCl con una concentración de 0.1N. (6 tubos 13x100 tapa rosca)

Caldo YPG (3 tubos 13x100 con 5 ml) Agar BHI (3 cajas)

3.4 Reactivos (por grupo de trabajo) Solución salina 0.85%(p/v) (4 tubos de 13 x 100 tapa rosca con 5ml) Colorantes de Gram. Azul de lactofenol Aceite de inmersión

3.5 Materiales (por grupo de trabajo) Pitillos de 1cm de longitud estériles (4) Láminas Pipetas de 1 ml estériles (4) Asa redonda y recta. Tubo No 2 de la escala de Mac. Farland

3.6 Equipos Microscopio

4. METODOLOGIA

4.1 Identificación microscópica y bioquímica del microorganismo probiótico

Prepare una suspensión del microorganismo a estudiar como probiótico con una concentración equivalente al tubo No. 2 de la escala de Mac Farland

Haga coloración de Gram y de azul de lactofenol a la suspensión para la identificación microscópica.

Siembre 1-2 asadas en cada una de los tubos que contiene los carbohidratos con el rojo de fenol e incube a 35 ºC durante 24 horas.

La prueba positiva de asimilación de azúcares se interpreta por viraje de color (Rojo a Amarillo) del indicador de pH.

4.2 Tolerancia a pH


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Siembre 1-2 asadas en cada uno de los tubos de caldo YPG a diferentes pH e incube a 35ºC durante 24 horas.

La prueba positiva de tolerancia a pH se interpreta por el crecimiento del microorganismo en cada pH.

Realice coloración de Gram para observar las levaduras y descartar contaminantes.

4.3 Tolerancia a temperaturas

Siembre 1-2 asadas en cada uno de los tubos de caldo YPG e incube un tubo a 28°C, otro a 35ºC, y otro a 42°C durante 24 horas.

La prueba positiva de tolerancia a temperaturas se interpreta por crecimiento del microorganismo en cada.


4.4 Tolerancia a sales biliares

Siembre 1-2 asadas en cada una de los tubos de caldo YPG con diferentes concentraciones de sales biliares e incube a 35ºC durante 24 horas.

La prueba positiva se interpreta por crecimiento del microorganismo en cada concentración de sales biliares.


4.5 Enfrentamiento del microorganismo patógeno frente al microorganismo probiótico (Ensayo de Ritter)

Prepare una suspensión de cada uno de los microorganismos patógenos a evaluar con una concentración equivalente al tubo No 2 de la escala de Mac Farland

Haga una siembra masiva de la suspensión que contiene el microorganismo patógeno en una caja con agar BHI

Introduzca en el agar (hasta la mitad) los pitillos estériles, posteriormente inocule 0.1 ml con el cultivo del microorganismo probiótico dentro del pitillo.

Incube a 35-37ºC durante 24 horas.

La prueba positiva se interpreta si pasado el periodo de incubación se observa la formación de halos de inhibición alrededor del pitillo.


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5. RESULTADOS:

5.1 Identificación microscópica

Coloración de Gram:______________________________________________

Coloración de Azul de Lactofenol:____________________________________

5.2 Pruebas de Tolerancia

Complete la siguiente tabla anotando al frente de cada prueba si el resultado fue positivo o negativo.

Pruebas bioquímicas

Tolerancia pH

Tolerancia temperaturas

Tolerancia sales biliares

Maltosa _______Xilosa ________Galactosa ______Arabinosa ______Lactosa ________Ramnosa ______Rafinosa _______Glucosa _______Celobiosa ______Melodiosa ______Manitol _______

pH 2 ______

pH 3 ______

pH 4 ______

pH 5 ______

pH 6 ______

pH 7 ______

28ºC _______35ºC _______42ºC _______

0.5%_________1.0% _________1.5% _________2.0% _________2.5% _________3.0% _________3.5% _________4.0 % _________

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


1. ¿Cuál es el mecanismo de acción de un microorganismo probiótico frente a microorganismos patógenos?2. ¿Cuales son las características que debe cumplir un microorganismo para ser considerado como probiótico? 3. En qué consiste la microencapsulación de probióticos y cuáles son sus ventajas.4. Que otros tipos de pruebas se utilizan para la identificación de microorganismo con capacidad probiótica. (Soportar por medio de artículos).


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PRACTICA No. 12DESCRIPCIÓN DE ACTINOMYCETES

1. INTRODUCCIÓN

Los Actinomycetes son bacterias que producen filamentos delgados, ramificados, desarrollándose en un micelio en todos los géneros del suelo, excepto él genero Actinomyces. Los Actinomyces se asemejan a los hongos por su micelio aéreo y con ramificaciones, por otra parte la morfología y el tamaño de las hifas, los conidios y los fragmentos individuales de las especies cuyo micelio sufre fragmentación, son semejantes a estructuras que se observan en las bacterias, las colonias que se desarrollan sobre la superficie del agar tiene una consistencia firme y se adhieren fuertemente al sustrato, en algunos géneros la superficie es pulverulenta. Los actinos son habitantes de suelos cálidos, son causantes del olor característico de la tierra y degradan moléculas complejas como plaguicidas.

Producen una gran cantidad de metabolitos secundarios entre los que se encuentran: fitohormonas, antibióticos, antiparasitarios, herbicidas, antifungicos, enzimas (proteasas, amilasas e invertasas). Las condiciones de crecimiento in vitro son: temperatura entre 23°c y 37°c, pH entre 6.4 y 7.0, proteína como fuente de carbono y minerales como potasio, fósforo y magnesio.

2. OBJETIVO

Identificar las estructuras típicas macroscópicas y microscópicas de los Actinomycetes, además de su efecto antagónico frente a diferentes microorganismos.


3.1 Cepas (1 caja por lado de mesa) Actinomycetes Fusarium sp Bacillus sp Pseudomonas sp Staphylococcus aureus Escherichia coli

3.1 Medios de cultivo (por grupo de trabajo) Agar Nutritivo (1 caja) Agar ISP2 (1 caja) Agar Avena (3 cajas) Agar Avena (1 lámina) Agar Czapeck (1 caja) Agar PC (2 cajas)

3.2 Reactivos (por grupo de trabajo) Cristal Violeta


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Extracto crudo de Actynomicetes (0,2 mL)

3.3 Materiales (por grupo de trabajo) Laminillas estériles Cinta pegante Pinzas Asas Aguja de disección Caja de petri estéril (1) Pipeta de 1 mL estéril (1)

3.4 Equipos Incubadora a 30ºC Microscopio

4. METODOLOGÍA

4.1 Visualización Microscópica

4.1.1 Montaje de laminilla

Siembre de forma masiva el Actinomycete que encuentra en su mesón en los agares, ISP2, Nutritivo y Czapeck.

Tome 2 laminillas estériles con pinzas flameadas y colóquelas en cada uno de los medios de cultivo introduciéndolas en los agares formando un ángulo de 45°

Incube las cajas por 5 días a 30 °C.

Observe y anote los cambios en el crecimiento, pigmentación y otras características macroscópicas que se presenten.

Tome las laminillas manipulándolas con cuidado y colóquelas sobre una lámina.

Observe las laminillas al microscopio primero sin ningún tipo de tinción y luego utilice cristal violeta adicionándolo por un lado de la laminilla.

Observe las características microscópicas


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FIGURA 1. MONTAJE CON LAMINILLAS

4.1.2 Montaje en lámina

Siembre de manera masiva el actinomycete sobre la lámina que contiene una capa delgada de agar avena

Tome la lamina y colóquela al microscopio

Visualice con y sin cristal violeta

FIGURA 2. MONTAJE EN LÁMINA.

4.2 Antagonismo

4.2.1 Evaluación del extracto crudo para bacterias

A partir del extracto crudo tome 0.1ml distribuya sobre una caja de agar PC (deje secar el extracto en la caja).

En la caja de agar PC que contiene el extracto y en otro utilizada como control siembre por estría 4 bacterias. (Asegúrese de marcar por el reverso de la caja en sitio de la siembra)


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FIGURA 3. EVALUACION DE EXTRACTO CRUDO PARA BACTERIAS

4.2.1 Evaluación del extracto crudo para hongos

Tome dos cajas de agar avena y divídalas de modo que deje una franja central en la circunferencia de 3cm de ancho.

A una de las cajas adicione 0.1 ml de extracto y homogenice en la zona marcada con el asa redonda. (Tenga cuidado de no salirse del área de 3 cm)

A la otra caja siembre en la zona de 3 cm el Actinomycete que se encuentra en su mesón.

En las dos cajas siembre por punción a 1 cm de lado y lado de la zona de 3cm Fusarium spp.

Incubar a 30 C por 5 días

Lectura de resultados


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FIGURA 4. EVALUACION DE EXTRACTO CRUDO PARA HONGOS.

5. RESULTADOS

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES

8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIÓN Que agentes terapéuticos han sido aislados de actinomicetos y cómo

funcionan estos contra microorganismo patógenos?

Busque un artículo científico acerca del aislamiento de antinomycetes para producción de antimicrobianos, describa la metodología utilizada?

Que otras importancia biotecnológicas y para qué son utilizados los actinomicetes aparte de ser productores de antimicrobianos?

Cuáles son los componentes de la pared de los actinomycestos y en qué se diferencia con los hongos?

Cómo se clasifican filogenéticamente a los actinomycetes?

Describa una técnica diferente a la del laboratorio que se emplee para evaluar la producción de antibióticos?



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PRÁCTICA No 13EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE INACTIVACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN

DE UNA VACUNA TIPO BACTERIANA CONTRA Salmonella spp.

1. INTRODUCCIÓN

La vacunación consiste en la administración de un microorganismo, una parte de él, o un producto derivado del mismo (antígenos inmunizantes), con el objeto de producir una respuesta inmunológica similar a la de la infección natural, pero sin peligro para el vacunado. Se basa en la respuesta del sistema inmunitario a cualquier elemento extraño (antígeno) y en la memoria inmunológica.

Las vacunas en general, pueden ser administradas en forma simultánea, ya que no producen efectos distintos a los que se presentan si son aplicadas en forma separada. En algunos casos, la respuesta inmunitaria se ve potenciada en la aplicación simultánea de vacunas.

Tipos de vacunas:

Microorganismos vivos atenuadosSon preparaciones inmunógenas de virus o bacterias vivos, que alterados de tal manera que no resultan agresivos como para provocar la enfermedad porque han perdido su virulencia, pero sí generan una respuesta inmune importante. Ejemplos de ellas son las vacunas contra la polio (oral), fiebre amarilla, sarampión, rubéola, parotiditis y tuberculosis (BCG).

Microorganismos enteros inactivadosSuspensiones de bacterias o virus muertos mediante la acción de calor o de desinfectantes como el fenol o formaldehído. Como obviamente estos microorganismos muertos no se reproducen, se necesitan varias dosis (generalmente de alta concentración) en diferentes períodos de tiempo, para inducir la inmunidad. A menudo requieren adyuvantes (sustancia que incorporadas a la vacuna acelera, prolonga o potencia la respuesta inmunogénica)

ToxoidesSe obtienen a partir de toxinas bacterianas, un ejemplo de esto es la vacuna antitetánica generada a partir de la toxina de Clostridium tetani.

2. OBJETIVOS

2.1 Evaluar la eficacia de diferentes métodos de inactivación bacteriana2.2 Identificar los parámetros para seleccionar un método de inactivación en

la producción de una vacuna


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3.1 Cepas Salmonella spp. (una caja por lado de mesa)

3.2 Medios de Cultivo (por grupo de trabajo) Agar Mac Conkey (4 cajas) TSI (1 tubo) SIM (1 tubo) Citrato de Simmons (1 tubo) UREA (1 tubo) RM (1 tubo) VP (1 tubo)

3.3 Reactivos (por grupo de trabajo) Colorantes de Gram (un juego por mesa) Aceite de inmersión (un frasco por mesa) Formaldehído al 37% (50 mL en total) Solución salina estéril (0.85%) (7 tubos de 13 x 100 con 5 mL)

3.4 Materiales (por grupo de trabajo) Tubo N°2 de escala Mac Farland (uno por mesa) Beaker 100 mL (uno por mesa) Soportes (uno por mesa) Gradilla (1) Pipeta de 1 mL estéril (2) Micropipeta de 0,1 mL estéril (1) Asas

3.5 Equipos Microscopio Incubadora a 37°C

4. PROCEDIMIENTO

Verificar la pureza a la cepa mediante coloración de Gram

Realizar pruebas bioquímicas para identificación de la cepa: TSI, SIM, Citrato.

Preparar una suspensión del microorganismo patrón N° 2 de Mac Farland en 7 tubos con 5ml de solución salina estéril.

Adicionar formaldehído al 37% a 3 tubos con la suspensión bacteriana, de manera que se obtengan diferentes concentraciones: 0,5%, 1%, 1.5%.

Llevar a ebullición 3 tubos con la suspensión bacteriana a diferentes tiempos: 1 min, 3 min, y 5 min.


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Realizar un control negativo sin formaldehído ni ebullición.

Sembrar

nuevamente en el medio específico para el microorganismo.

5. RESULTADOS

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES


Método de inactivación

Crecimiento

Formaldehído

0,5%

1%1,5%

Temperatura

1 min

3 min5 min

Control Negativo


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PRÁCTICA No 14INOCULACION VIRAL EN RATON

1. INTRODUCCIÓN

Desde ratones a perros, los cerdos o las anguilas eléctricas, una gran variedad de especies animales contribuyen cada año a los descubrimientos médicos que posibilitan que millones de seres humanos vivan cada año. Con la investigación sobre estos animales, los científicos han descubierto curaciones y vacunas para un gran número de dolencias humanas y animales. La tendencia actual es a la disminución del uso de animales de laboratorio, para esto se han desarrollado otras tecnologías como cultivo celular y modelos de computación. Según una encuesta realizada en Estados Unidos hubo una caída del 40% en el número de los animales usados entre 1968 y 1978, el uso del animal de laboratorio alcanzó su máximo en 1970 y ha caído un 50% desde ese tiempo, las reducciones más grandes afectaron al uso de perros y de gatos. Sin embargo no ha sido posible reemplazar el uso de modelos animales en todos los casos y los animales continúan desempeñando un papel importante en la investigación biomédica. Las especies más utilizadas son:

Ratas, ratones y otros roedores: 85-90% Perros y gatos: menos de un 1% Primates no humanos: menos de 0,3%.

Uno de los principales objetivos de los científicos de animales de laboratorio es asegurar que los animales de la investigación no se expongan a cualquier dolor o estrés innecesario. Mientras que el acta del bienestar animal regula específicamente la investigación animal, la estadística muestra que la mayoría de los experimentos no son dolorosos a los animales. Según el informe de 1997 de la secretaria de Agricultura de los E.E.UU., la mayoría de la investigación - 92% - no era dolorosa a los animales. En la mayoría de los casos, 54%, los animales no fueron expuestos ni estuvieron implicados en ningún procedimiento doloroso. En el 38% de casos, los animales recibieron anestesia o analgésicos durante los procedimientos que habrían podido implicar cierto


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dolor o estrés a los animales. En el 8% de los proyectos de investigación, los anestésicos o las analgesias no fueron utilizados porque habrían interferido con los resultados de la investigación o de la prueba.

Junto con ratas y otros roedores, los ratones son la especie más utilizada en la investigación médica. Su talla pequeña y bajo costo los hacen ideales para los experimentos de laboratorio. Además, los científicos pueden criar diversas líneas de ratones con deficiencias genéticas naturales para alcanzar los modelos específicos de enfermedades humanas. La investigación con los ratones ha ayudado a desarrollar vacunas contra la gripe, poliomielitis, fiebre amarilla y rabia.

Condiciones que se deben tener en cuenta para la utilización de ratones.

1. Periodo de adaptación al ambiente del laboratorio: Si no han crecido en el laboratorio, deben adaptarse mínimo 3 días.2. Condiciones biológicas:La edad, la ausencia de infecciones, entre otros, son factores que deben tenerse en cuenta en el uso de animales de experimentación.

Vías de inoculación

El ratón posee muchos sitios de inoculación como son, intradérmico, subcutáneo, vías respiratorias, intracerebral, escarificación, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. La escogencia de la mejor vía dependerá del virus que se está utilizando.

La cantidad de inoculo no ha de ser mayor de 0.03 ml ya que por su pequeño tamaño podría causar la muerte del animal.

2. OBJETIVOS

2.1 Conocer la utilidad de los ratones en diagnóstico e investigación

2.2 Identificar en el animal los sitios de inoculación, recordando su distribución anatómica.

2.3 Determinar los cuidados y condiciones que se deben tener en cuenta en la manipulación de ratones en el laboratorio.


3.1 Animales de Laboratorio (por grupo de trabajo) Ratones (2)


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3.2 Reactivos (por grupo de trabajo) Solución salina 0,85% estéril (2 tubo de 13 x 100 con 5 mL) Alcohol antiséptico Colorantes Gram

3.3 Materiales (por grupo de trabajo) Jeringa de tuberculina con aguja 27 corta (3) Guantes y tapabocas Algodón

3.4 Equipos Balanzas

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Pesar ratones

Para observar que la inoculación que se está realizando en el ratón de la manera adecuada y que no esta teniendo efectos adversos la sustancia inoculada, se deben marcar los ratones debidamente con cristal violeta y luego ser pesados antes de la inoculación y después de la inoculación

4.2 Inmovilización del ratón

Coloque el animal fuera de la jaula sobre una superficie rugosa, ubique sus dedos índice y gordo sobre el cuello del animal, teniendo en cuenta de no presionar con mucha fuerza.Una vez el animal esta inmóvil, con el dedo meñique enrede la cola del ratón entre sus dedos. El ratón debe quedar sostenido por una sola de sus manos y completamente inmovilizado. Su otra mano debe quedar libre para ser utilizada en el proceso de inoculación.

4.3. Inoculación subcutánea

Depositar al ratón sobre la rejilla permitiéndole agarrarse a ella con las patas delanteras y levantar la piel de la espalda con los dedos índice y pulgar.

Insertar la aguja en la base de la zona de piel que estamos sujetando mante-niendo la aguja paralela al cuerpo del ratón para evitar inocular en capas infe-riores a la piel.

Aspirar ligeramente para asegurarnos de no haber penetrado en algún vaso sanguíneo.


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Inyectar el volumen de muestra a una velocidad moderada.

Retirar la aguja y presionar la piel en la zona de inyección para evitar que el fluido salga por el punto de piel perforada.

Observar que no se produce sangrado.

Debido a que la muestra se deposita en la zona subcutánea, y si ésta se ha de-sarrollado correctamente, podremos observar la formación de un “abultamien-to” en el lugar de inyección que irá desapareciendo a medida que el fluido es dispersado

4.3. Inoculación intraperitoneal (IP)

Con el ratón correctamente inmovilizado (evitando cualquier movimiento du-rante el procedimiento) inclinarlo caudalmente y trazar una línea imaginaria que cruce su abdomen transversalmente justo sobre sus rodillas

La aguja deberá ser insertada sobre esta línea, en el lado derecho del animal y lo más cercano posible a la línea que divide longitudinalmente el abdomen (lí-nea roja). De esta manera disminuimos el riesgo de inyectar en ciego o vejiga urinaria.

La aguja debe alcanzar una profundidad de aproximadamente medio centíme-tro (ratón) y debe insertarse con una inclinación de unos 30º con respecto a la superficie del abdomen.

Aspirar para asegurarse de que no se ha alcanzado ningún vaso sanguíneo, cie-go o vejiga urinaria.

Si ningún fluido es aspirado, proceder a la inyección de la muestra.

Retirar la aguja y presionar ligeramente la zona de inyección.


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5. DISCUSIÓN

6. CONCLUSIONES




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Practica No. 5

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