DAGNOSTICO DE LABORATORIO Y PRUEBAS IN … · Universidad Nacional Mayor de San Marcos Lima (Perú)...

Métodos de diagnóstico inmunológicoin vivo e in vitro en Enfermedades por

Hipersensibilidad de Tipo I y IV

Métodos de diagnóstico inmunológicoin vivo e in vitro en Enfermedades por

Hipersensibilidad de Tipo I y IV

Dr. Juan Rodríguez-Tafur DávilaProf. Asociado de Inmunología Clínica y Farmacología

Facultad de MedicinaUniversidad Nacional Mayor de San Marcos

Lima (Perú)

Dr. Juan Rodríguez-Tafur DávilaProf. Asociado de Inmunología Clínica y Farmacología

Facultad de MedicinaUniversidad Nacional Mayor de San Marcos

Lima (Perú)

• La Historia Clínica es fundamental en el diagnóstico de la Alergia.

• Antecedentes familiares y personales• Clínica • Repercusión de la enfermedad• Factores desencadenantes y agravantes

• La Historia Clínica es fundamental en el diagnóstico de la Alergia.

• Antecedentes familiares y personales• Clínica • Repercusión de la enfermedad• Factores desencadenantes y agravantes

LA HISTORIA CLINICA

Metodología Diagnóstica MetodologMetodologíía Diagna Diagnóóstica stica Valoración de la Exposición Ambiental

• Detección de alergenos principales en muestras domiciliarias

• Diagnóstico de Sensibilización sistémica• Demostración de anticuerpos IgE circulantes y de

respuestas celulares específicas a los alergenosMonitoreo de la Inflamación órgano-específica

• Recuento de células inflamatorias y cuantificación de mediadores solubles en diversos líquidos y muestras biológicas

ValoraciValoracióón de la Exposicin de la Exposicióón Ambiental n Ambiental •• DetecciDeteccióón de alergenos principales en muestras n de alergenos principales en muestras

domiciliariasdomiciliarias•• DiagnDiagnóóstico de Sensibilizacistico de Sensibilizacióón sistn sistéémicamica•• DemostraciDemostracióón de anticuerpos IgE circulantes y de n de anticuerpos IgE circulantes y de

respuestas celulares especrespuestas celulares especííficas a los alergenosficas a los alergenosMonitoreo de la InflamaciMonitoreo de la Inflamacióón n óórganorgano--especespecííficafica

•• Recuento de cRecuento de céélulas inflamatorias y cuantificacilulas inflamatorias y cuantificacióón de n de mediadores solubles en diversos lmediadores solubles en diversos lííquidos y muestras quidos y muestras biolbiolóógicasgicas

ExposiciExposicióón Ambientaln AmbientalMetodología

• ELISA cuantitativo• RIDA (western blot para antigenos)• Pruebas de detección rápida

Algunos alergenos identificables• Dermatophagoides pte Der p 1, Der p 2• Dermatophagoides far Der f 1, Der f 2• Blomia tropicalis Blo t 5• Lepidoglyphus destructor Lep d 2• Gato: Fel d 1• Perro: Can f 1• Cucaracha: Bla g 1, Bla g 2• Aspergillus: Asp f 1

MetodologMetodologíía a

•• ELISA cuantitativoELISA cuantitativo•• RIDA (RIDA (westernwestern blotblot para para antigenosantigenos))•• Pruebas de detecciPruebas de deteccióón rn ráápidapida

Algunos alergenos identificablesAlgunos alergenos identificables•• DermatophagoidesDermatophagoides ptepte Der p 1, Der p 2Der p 1, Der p 2•• Dermatophagoides farDermatophagoides far Der f 1, Der f 2Der f 1, Der f 2•• Blomia tropicalisBlomia tropicalis Blo t 5Blo t 5•• Lepidoglyphus destructorLepidoglyphus destructor Lep d 2Lep d 2•• Gato: Gato: Fel d 1Fel d 1•• Perro: Perro: Can f 1Can f 1•• Cucaracha:Cucaracha: Bla g 1, Bla g 2Bla g 1, Bla g 2•• Aspergillus:Aspergillus: Asp f 1Asp f 1

ExposiciExposicióón Ambientaln Ambiental

Criterios de causalidad alergenos - enfermedad• La fuerza de asociación es grande tanto en estudios poblacionales,

como controlados y prospectivos• Observaciones consistentes en distintas regiones• Claro gradiente de relación dosis-respuesta• Existe evidencia experimental en desafíos específicos y

respuesta a medidas de control ambiental

Indicaciones para valorar del nivel de exposición• Establecer factores de riesgo• Monitorear si las mediadas de control ambiental se estan tomando

correctamente.

Criterios de causalidad alergenos Criterios de causalidad alergenos -- enfermedadenfermedad•• La fuerza de asociaciLa fuerza de asociacióón es grande tanto en estudios poblacionales, n es grande tanto en estudios poblacionales,

como controlados y prospectivoscomo controlados y prospectivos•• Observaciones consistentes en distintas regionesObservaciones consistentes en distintas regiones•• Claro gradiente de relaciClaro gradiente de relacióón dosisn dosis--respuestarespuesta•• Existe evidencia experimental en desafExiste evidencia experimental en desafííos especos especííficos y ficos y

respuesta a medidas de control ambiental respuesta a medidas de control ambiental

Indicaciones para valorar del nivel de exposiciIndicaciones para valorar del nivel de exposicióónn•• Establecer factores de riesgoEstablecer factores de riesgo•• Monitorear si las mediadas de control ambiental se Monitorear si las mediadas de control ambiental se estanestan tomando tomando

correctamente.correctamente.

ExposiciExposicióón Ambientaln AmbientalNiveles de riesgo para algunos alergenos

intradomiciliarios• Fel d 1 1 a 8 ug/ gr. polvo• Bla g 2 > 10 unidades/ gr. polvo

Niveles de exposición a Dermatophagoides en sujetos atópicos alérgicos y su correlacion con el riesgo:Riesgo ug Der p1/gr. polvo # ácaros• Débil < 0,2 < 10• Moderado de 0,2 a 2 de 10 a 100• Alto de 2 a 10 de 100 a 500• Muy alto > 10 > 500

Niveles de riesgo para algunos alergenos Niveles de riesgo para algunos alergenos intradomiciliariosintradomiciliarios•• FelFel d 1d 1 1 a 8 ug/ gr. polvo1 a 8 ug/ gr. polvo•• BlaBla g 2g 2 > 10 unidades/ gr. polvo> 10 unidades/ gr. polvo

Niveles de exposiciNiveles de exposicióón a Dermatophagoides en sujetos n a Dermatophagoides en sujetos atatóópicos alpicos aléérgicos y su rgicos y su correlacioncorrelacion con el riesgo:con el riesgo:Riesgo Riesgo ugug Der p1/gr. polvoDer p1/gr. polvo # # áácaroscaros•• DDéébilbil < 0,2 < 0,2 < 10< 10•• ModeradoModerado de 0,2 a 2 de 0,2 a 2 de 10 a 100de 10 a 100•• AltoAlto de 2 a 10 de 2 a 10 de 100 a 500de 100 a 500•• Muy alto > 10Muy alto > 10 > 500> 500

Monitoreo de la InflamaciónMonitoreo de la InflamaciMonitoreo de la Inflamacióónn

Métodos no invasivos• Determinaciones en la vía aérea• Determinaciones en sangre circulante• Determinaciones en orina

Métodos invasivos• Lavado bronquioalveolar• Biopsias

Métodos no invasivos• Determinaciones en la vía aérea• Determinaciones en sangre circulante• Determinaciones en orina

Métodos invasivos• Lavado bronquioalveolar• Biopsias

Marcadores en Vía Aérea (+ usados en investigacion clinica)

Marcadores en VMarcadores en Víía Aa Aéérea rea (+ usados en (+ usados en investigacioninvestigacion clinicaclinica))

AIRE EXHALADO• Oxido nítrico

• Analizador de quimioluminiscencia• A partir de los 5 años• ↑ en asma atópico sintomático, severidad del asma

ESPUTO INDUCIDO• Células y mediadores de la inflamación• mRNA para citocinas por RT-PCR

• Nebulización ultrasónica con 3,5% ClNa por 20’• Correlación con actividad inflamatoria

AIRE EXHALADOAIRE EXHALADO•• Oxido nOxido níítricotrico

•• Analizador de quimioluminiscenciaAnalizador de quimioluminiscencia•• A partir de los 5 aA partir de los 5 aññosos•• ↑↑ en aen asma atsma atóópico sintompico sintomáático, severidad del asmatico, severidad del asma

ESPUTO INDUCIDOESPUTO INDUCIDO•• CCéélulas y mediadores de la inflamacilulas y mediadores de la inflamacióónn•• mRNA para citocinas por RTmRNA para citocinas por RT--PCRPCR

•• NebulizaciNebulizacióón ultrasn ultrasóónica con 3,5% ClNa por 20nica con 3,5% ClNa por 20’’•• CorrelaciCorrelacióón con actividad inflamatorian con actividad inflamatoria

Marcadores en Sangre Circulante(+ usados en investigacion clinica)

Marcadores en Sangre CirculanteMarcadores en Sangre Circulante(+ usados en (+ usados en investigacioninvestigacion clinicaclinica))

CÉLULAS INFLAMATORIAS• Eosinófilos (LFA-1, EG2)• Linfocitos T (CD3, CD4, CD8, CD25, CD23)• mRNA intracitoplasmático para citocinas

MEDIADORES INFLAMATORIOS • ↑ de ECP, EPO, EPX y MPO (correlación con HRB, función

pulmonar, síntomas y tratamiento)CITOCINAS y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN

• ↑sICAM-1 (correlación con severidad AB, RA, DA)• ↑sIL-2R (marcador de fatalidad y corticoresistencia)• ↑sVCAM-1 ( asma y quertatoconjuntivitis vernal)

CCÉÉLULAS INFLAMATORIASLULAS INFLAMATORIAS•• EosinEosinóófilos (LFAfilos (LFA--1, EG2)1, EG2)•• Linfocitos T (CD3, CD4, CD8, CD25, CD23)Linfocitos T (CD3, CD4, CD8, CD25, CD23)•• mRNA intracitoplasmmRNA intracitoplasmáático para citocinastico para citocinas

MEDIADORES INFLAMATORIOS MEDIADORES INFLAMATORIOS •• ↑↑ de de ECP, EPO, EPX y MPO (correlaciECP, EPO, EPX y MPO (correlacióón con HRB, funcin con HRB, funcióón n

pulmonar, spulmonar, sííntomas y tratamiento)ntomas y tratamiento)CITOCINAS y MOLCITOCINAS y MOLÉÉCULAS DE ADHESICULAS DE ADHESIÓÓNN

•• ↑↑sICAMsICAM--1 (correlaci1 (correlacióón con severidad AB, RA, DA)n con severidad AB, RA, DA)•• ↑↑sILsIL--2R (marcador de fatalidad y 2R (marcador de fatalidad y corticoresistenciacorticoresistencia))•• ↑↑sVCAMsVCAM--1 ( asma y 1 ( asma y quertatoconjuntivitisquertatoconjuntivitis vernal)vernal)

Marcadores en Orina (+ usados en investigacion clinica)Marcadores en Orina Marcadores en Orina (+ usados en (+ usados en investigacioninvestigacion clinicaclinica))

EDX (Neurotoxina Derivada de Eosinófilos)• ↑ en síndromes eosinofílicos, asma atópico • Correlaciona con severidad del asma y respuesta terapéutica en niños,

pero cae tras desafío con alergeno• LTE4 (Leucotrieno E4)

• Refleja producción total, excreción biliar y función renal• ↑ en asma por AAS, asma nocturno, EIA, provocación con alergenos,

pero no correlaciona con obstrucción9α11β-PGF2 y PGD-M (Metabolitos de PGD2)

• Origen en MC• ↑ en mastocitosis, EIA, provocación con alergenos o AAS

EDX (Neurotoxina Derivada de EosinEDX (Neurotoxina Derivada de Eosinóófilos)filos)•• ↑↑ en sen sííndromes eosinofndromes eosinofíílicos, asma atlicos, asma atóópico pico •• Correlaciona con severidad del asma y respuesta terapCorrelaciona con severidad del asma y respuesta terapééutica en niutica en niñños, os,

pero cae tras desafpero cae tras desafíío con alergenoo con alergeno•• LTE4 (Leucotrieno E4)LTE4 (Leucotrieno E4)

•• Refleja producciRefleja produccióón total, excrecin total, excrecióón biliar y funcin biliar y funcióón renaln renal•• ↑↑ en asma por AAS, asma nocturno, EIA, provocacien asma por AAS, asma nocturno, EIA, provocacióón con alergenos, n con alergenos,

pero no correlaciona con obstruccipero no correlaciona con obstruccióónn99αα1111ββ--PGPGFF22 y PGDy PGD--M (Metabolitos de PGD2)M (Metabolitos de PGD2)

•• Origen en MCOrigen en MC•• ↑↑ en mastocitosis, EIA, provocacien mastocitosis, EIA, provocacióón con alergenos o AASn con alergenos o AAS

Marcadores en OrinaMarcadores en OrinaMarcadores en Orina

Ventajas• Muestra de fácil obtención• Niveles urinarios representan producción sistémica total• Pueden ser referidos a la tasa de filtración glomerular

• Desventajas• Elevaciones transitorias pueden no ser detectadas• Afectado por metabolismo renal• Desconocimiento de la fuente de origen

• El marcador ideal debería correlacionar con evidencias de inflamación en la biopsia.

VentajasVentajas•• Muestra de fMuestra de fáácil obtencicil obtencióónn•• Niveles urinarios representan producciNiveles urinarios representan produccióón sistn sistéémica totalmica total•• Pueden ser referidos a la tasa de filtraciPueden ser referidos a la tasa de filtracióón glomerularn glomerular

•• DesventajasDesventajas•• Elevaciones transitorias pueden no ser detectadasElevaciones transitorias pueden no ser detectadas•• Afectado por metabolismo renalAfectado por metabolismo renal•• Desconocimiento de la fuente de origenDesconocimiento de la fuente de origen

•• El marcador ideal deberEl marcador ideal deberíía correlacionar con a correlacionar con evidencias de inflamacievidencias de inflamacióón en la biopsia.n en la biopsia.

Métodos Invasivos MMéétodos Invasivos todos Invasivos

LAVADO BRONQUIOALVEOLAR• Células inflamatorias

• ↑ de Eo y MC en asma atópico• ↑ de PMN en asma, fibrosis quística y cultivos bacterianos

positivos• ↑ de Células Epiteliales en niños con asma e infantes con

sibilancias • Componentes solubles

• ↑ sICAM-1 (correlación con frecuencia y severidad)• ↑ IFN-gamma• ↑ ECP

LAVADO BRONQUIOALVEOLARLAVADO BRONQUIOALVEOLAR•• CCéélulas inflamatoriaslulas inflamatorias

•• ↑↑ de de Eo y MC en asma atEo y MC en asma atóópicopico•• ↑↑ de de PMN en asma, fibrosis quPMN en asma, fibrosis quíística y cultivos stica y cultivos bacterianos bacterianos

positivospositivos•• ↑↑ de Cde Céélulas Epiteliales en nilulas Epiteliales en niñños con asma e infantes con os con asma e infantes con

sibilancias sibilancias •• Componentes solublesComponentes solubles

•• ↑↑ sICAMsICAM--1 (correlaci1 (correlacióón con frecuencia y severidad)n con frecuencia y severidad)•• ↑↑ IFNIFN--gammagamma•• ↑↑ ECPECP


BIOPSIA BRONQUIAL• Células inflamatorias

• ↑ de Eo (EG2) en lámina propia, aún en asma leve• ↑ de MC en atópicos

• Evidencias de remodelación• Engrosamiento de la membrana de colágeno subepitelial

• Los cambios histológicos ocurren en forma precoz y pueden anteceder al desarrollo de los síntomas

BIOPSIA BRONQUIALBIOPSIA BRONQUIAL•• CCéélulas inflamatoriaslulas inflamatorias

•• ↑↑ de Eo (EG2) en lde Eo (EG2) en láámina propia, amina propia, aúún en asma leven en asma leve•• ↑↑ de MC en atde MC en atóópicospicos

•• Evidencias de remodelaciEvidencias de remodelacióónn•• Engrosamiento de la membrana de colEngrosamiento de la membrana de coláágeno subepitelialgeno subepitelial

•• Los cambios histolLos cambios histolóógicos ocurren en forma precoz y gicos ocurren en forma precoz y pueden anteceder al desarrollo de los spueden anteceder al desarrollo de los sííntomasntomas


BIOPSIA NASAL Y O LAVADO NASAL• Células inflamatorias

• ↑ de Eo (EG2) Ba y MC en atópicos• mRNA para citocinas en células T y macrófagos

• ↑ de mRNA para INF-gamma e IL-12 tras ITBIOPSIA CUTANEA

• Células inflamatorias y citocinas• Marcación con TNF-alfa en urticaria por frío• Marcación con EG2, CD4, CD30, IL-4, ICAM-1, VCAM-1, en parches

con ácaros en DA

BIOPSIA NASAL Y O LAVADO NASALBIOPSIA NASAL Y O LAVADO NASAL•• CCéélulas inflamatoriaslulas inflamatorias

•• ↑↑ de Eo (EG2) Ba y MC en atde Eo (EG2) Ba y MC en atóópicospicos•• mRNA para citocinas en cmRNA para citocinas en céélulas T y macrlulas T y macróófagosfagos

•• ↑↑ de mRNA para INFde mRNA para INF--gamma e ILgamma e IL--12 tras IT12 tras ITBIOPSIA CUTANEABIOPSIA CUTANEA

•• CCéélulas inflamatorias y citocinaslulas inflamatorias y citocinas•• MarcaciMarcacióón con TNFn con TNF--alfa en urticaria por fralfa en urticaria por frííoo•• MarcaciMarcacióón con EG2, CD4, CD30, ILn con EG2, CD4, CD30, IL--4, ICAM4, ICAM--1, VCAM1, VCAM--1, en parches 1, en parches

con con áácaros en DA caros en DA

Diagnóstico inmunológico in vivo.

• Pruebas de hipersensibilidad inmediata:– prick-test, prick to prick.– cutirrección– intradermorreacción

• Hipersensibilidad tardía:– patch-test

• Pruebas de provocación

Diagnóstico inmunológico in vivo.Pruebas cutáneas.

Hipersensibilidad inmediata

Diagnóstico inmunológico in vivo.Pruebas cutáneas.

Hipersensibilidad inmediata

Diagnóstico inmunológico in vivo.Pruebas cutáneas. Prick

• Limpiar la piel con un antiséptico incoloro,marcar los puntos de la prueba con marcador o cinta adhesiva

• Limpiar la piel con un antiséptico incoloro,marcar los puntos de la prueba con marcador o cinta adhesiva



• Colocar una gota de cada extracto alergénico, y de los controles positivo (histamina 1/100) y negativo (salino 0,9%) sobre la piel.

• Colocar una gota de cada extracto alergénico, y de los controles positivo (histamina 1/100) y negativo (salino 0,9%) sobre la piel.

• Pasar una lanceta verticalmente en relación a la superficie cutánea a través de la gota del extracto y erosionar la piel superficial, sin producir sangrado, retirandola al cabo de un segundo (normas de la EAACI).

• Para evitar el sangrado, usar lancetas de 1 mm.

• Pasar una lanceta verticalmente en relación a la superficie cutánea a través de la gota del extracto y erosionar la piel superficial, sin producir sangrado, retirandola al cabo de un segundo (normas de la EAACI).

• Para evitar el sangrado, usar lancetas de 1 mm.





• En la punción modificada la lanzeta se inserta dentro de la piel en ángulo de 45º y se pasa a través de la gota del extracto. Ségun se retira, se levanta ligeramente la piel, con lo que se produce una ligera lesión cutánea, que deberá ser superficial y no producir sangrado.

• En la punción modificada la lanzeta se inserta dentro de la piel en ángulo de 45º y se pasa a través de la gota del extracto. Ségun se retira, se levanta ligeramente la piel, con lo que se produce una ligera lesión cutánea, que deberá ser superficial y no producir sangrado.





• Tras esperar 15 minutos, marcar el contorno de la pápula con un rotulador de punta fina.

• Tras esperar 15 minutos, marcar el contorno de la pápula con un rotulador de punta fina.



• Aplicar cinta adhesiva con el fin de que el dibujo se adhiera a ésta y retirarla.

• Pegarla en la hoja de pruebas cutáneas, como documento para archivar en la historia clínica del paciente

• Aplicar cinta adhesiva con el fin de que el dibujo se adhiera a ésta y retirarla.

• Pegarla en la hoja de pruebas cutáneas, como documento para archivar en la historia clínica del paciente



• Limpiar la piel con un antiséptico incoloro dejar secar.

• Marcar la zona con un rotulador de punta fina.• Realizar una escarificación de 2-4 mm de

longitud en las capas superficiales de la piel con una lanceta o aguja fina, sin producir sangrado.

• Limpiar la piel con un antiséptico incoloro dejar secar.

• Marcar la zona con un rotulador de punta fina.• Realizar una escarificación de 2-4 mm de

longitud en las capas superficiales de la piel con una lanceta o aguja fina, sin producir sangrado.

Diagnóstico inmunológico in vivo.Pruebas cutáneas. Cutirreacción


• Colocar una gota de cada extracto a testificar (sin contaminar el dosificador), o el alimento fresco, y una gota de los controles positivo (histamina base 1/100 y negativo (salino 0,9%).



• Leer a los 15 minutos.• Dibujar la pápula y el eritema.• Transferir a cinta adhesiva.• Pegar la cinta adhesiva en hoja apropiada de HC.

• Leer a los 15 minutos.• Dibujar la pápula y el eritema.• Transferir a cinta adhesiva.• Pegar la cinta adhesiva en hoja apropiada de HC.



• Estirar la piel del antebrazo con una mano y con la otra se colocar la aguja en angulo de 45 grados con la piel, el bisel de la aguja deberaestar dirigido hacia la piel.

• Insertar cuidadosamente la aguja, moviendolahacia delante y hacia arriba como si se quisiera levantar la piel con la punta de la aguja.

• Descender el cuerpo de la jeringa, para eliminar el ángulo formado previamente con la superficie cutánea.

• Introducir el antígeno observando la formación de una pápula que deberá alcanzar unos 3 mmde diámetro, al inyectar 0.02 ml del alergeno.

• Como control positivo se utiliza histamina base al 1/10.000) y salino como control negativo.

• Estirar la piel del antebrazo con una mano y con la otra se colocar la aguja en angulo de 45 grados con la piel, el bisel de la aguja deberaestar dirigido hacia la piel.

• Insertar cuidadosamente la aguja, moviendolahacia delante y hacia arriba como si se quisiera levantar la piel con la punta de la aguja.

• Descender el cuerpo de la jeringa, para eliminar el ángulo formado previamente con la superficie cutánea.

• Introducir el antígeno observando la formación de una pápula que deberá alcanzar unos 3 mmde diámetro, al inyectar 0.02 ml del alergeno.

• Como control positivo se utiliza histamina base al 1/10.000) y salino como control negativo.

Diagnóstico inmunológico in vivo.Pruebas cutáneas. Intradermorx


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VENTAJAS CON RESPECTO AL PRICK-TEST

– Mayor sensibilidad.– Posibilidad de cuantificar la reactividad umbral.– Concentraciones de Ag 100 veces menores.

VENTAJAS CON RESPECTO AL PRICK-TEST

– Mayor sensibilidad.– Posibilidad de cuantificar la reactividad umbral.– Concentraciones de Ag 100 veces menores.



Diagnóstico inmunológico in vivo.Pruebas cutáneas. Prick-IDrx

VENTAJAS DEL PRICK CON RESPECTO A LA INTRADERMORREACCIÓN

– Mejor definición positivo-negativo.– Seguridad.– Rapidez.– Simplicidad.– Menores molestias para el paciente.– Mayor nº de testificaciones simultáneas.– Mejor correlación resultados – H. Clínica.– Extractos más estables.

Hipersensibilidad Tipo IV (Patch Test)Hipersensibilidad Tipo IV (Patch Test)

Epidermis Área paracortical de Ganglios linfáticos

Th1Th1

IFNγIL-2,3MIF

Activación y reclutamiento deMacrófagos: fagocitosis, lib.enzimas

MFG

Expresión de MHC-II y de moléculasDe adhesión ICAM-I en superficie deQueratinocitos y céls endoteliales

Liberación IL-1,6, GM-CSF

Activación y proliferación Linf T.Infiltrado LT, MFG, cels epitelioides,..

Edema, microvesículasEpidérmicasEccema de contacto

Diagnóstico inmunológico in vivo.Pruebas cutáneas. Patch test.


• Abrir el sobre y sacar el parche.• Retirar la lámina protectora del parche. • Evitar todo contacto con los antígenos.

• Abrir el sobre y sacar el parche.• Retirar la lámina protectora del parche. • Evitar todo contacto con los antígenos.

• Colocar el parche en la parte superior de la espalda del paciente aprox. a 5 cm del centro, de forma que el alergeno nº 1 esté situado en la parte superior izquierda del panel.

• Alisar el parche desde el centro hacia fuera asegurando que cada uno de los alergenos esté en contacto con la piel.

• Colocar el parche en la parte superior de la espalda del paciente aprox. a 5 cm del centro, de forma que el alergeno nº 1 esté situado en la parte superior izquierda del panel.

• Alisar el parche desde el centro hacia fuera asegurando que cada uno de los alergenos esté en contacto con la piel.






• Los parches deben ser retirados al cabo de 48 horas y la rx se lee entre 72 a 96 horas.

• Se hacen dos lecturas un las 48 horas, ésta debe ser completada con una lectura a las 72-96 horas.

• Los parches deben ser retirados al cabo de 48 horas y la rx se lee entre 72 a 96 horas.

• Se hacen dos lecturas un las 48 horas, ésta debe ser completada con una lectura a las 72-96 horas.

Diagnóstico inmunológico in vivo.Pruebas cutáneas. Patch test

Diagnóstico inmunológico in vivo.Pruebas cutáneas. Patch test

INTERPRETACION

? Reacción dudosa, ligero eritema.- Negativa.+ Positivo débil (eritema, infiltración, posibles pápulas).++ Positiva (eritema, infiltración, posibles pápulas,

vesículas).+++ Muy positiva (reacción bulosa).

INTERPRETACION

? Reacción dudosa, ligero eritema.- Negativa.+ Positivo débil (eritema, infiltración, posibles pápulas).++ Positiva (eritema, infiltración, posibles pápulas,

vesículas).+++ Muy positiva (reacción bulosa).

Reaccion positiva por Hipersensibilidad aCorticoides

Reaccion positiva por Hipersensibilidad aCorticoides

Paneles internacionales incluyen al Pivalato de Tixocortol y a la BudesonidaPaneles internacionales incluyen al Pivalato de Tixocortol y a la Budesonida

Reaccion positiva de Hipersensibilidad aCorticoides por Patch Test

Reaccion positiva de Hipersensibilidad aCorticoides por Patch Test

Diagnóstico inmunológico in vitro.Diagnóstico inmunológico in vitro.

Diagnóstico inmunológico in vitro.

• Cuantificación de IgE:– Elisa– Quimioluminiscencia

• Test de liberación de histamina• Degranulación óptica de basófilos

Diagnóstico inmunológico in vitro.Cuantificación de IgE


• EIA (Enzimoinmunoanálisis)– Marcador es enzima unida covalentemente al Ag o al Ac.

Se mide la Actividad enzimática• Colorimétricos: se mide intensidad color• Fluorométricos (FEIA): fluorescencia al ser expuesta a lux UV• Luminiscentes: de reacción química o BQ

• Fase líquida o sólida (ELISA)• RIDA (western blot)

• EIA (Enzimoinmunoanálisis)– Marcador es enzima unida covalentemente al Ag o al Ac.

Se mide la Actividad enzimática• Colorimétricos: se mide intensidad color• Fluorométricos (FEIA): fluorescencia al ser expuesta a lux UV• Luminiscentes: de reacción química o BQ

• Fase líquida o sólida (ELISA)• RIDA (western blot)

Tecnica de CAP-RAST

Evaluación como clases de IgE Específica

Muy alto≥ 1006Muy alto50 ≤ x < 1005Muy alto17,5 ≤ x < 504

Alto3,5 ≤ x < 17,53Moderado0,7 ≤ x < 3,52

Bajo0,35 ≤ x < 0,71

Ausente o no detectable

< 0,350Nivel de AckU/lClase IgE



• En piel normal existen de 5.000 a 12.000 mastocitos/mm3

distribuidos sobre todo alrededor de los vasos• Existen de 5.000 a 500.000 moléculas de IgE pegadas a

cada mastocito, y pueden persistir entre 6 y 12 semanas• La vida media de la IgE específica en sangre es de 2,5 días.• Prick Cutáneo >>> Sensibilidad que IgE específica.

Inconvenientes CAP-ELISAInconvenientes CAP-ELISA

• Al ser la IgE extraordinariamente citofílica, sus resultados serán inferiores a los de las Prick Cutaneo

• Entonces es un error conceptual pedir CAP-ELISA porque la Prick Cutáneo haya sido negativa.

• PC negativa o dudosa, difícilmente de encontrará IgE específica en suero

• Bastante caras (sólo se deben realizar para un número limitado de alergenos)

• Al ser la IgE extraordinariamente citofílica, sus resultados serán inferiores a los de las Prick Cutaneo

• Entonces es un error conceptual pedir CAP-ELISA porque la Prick Cutáneo haya sido negativa.

• PC negativa o dudosa, difícilmente de encontrará IgE específica en suero

• Bastante caras (sólo se deben realizar para un número limitado de alergenos)

Indicaciones de CAP-ELISA (I)Indicaciones de CAP-ELISA (I)

• Dermatitis severa (ej D.atópica) y generalizada, sin zonas cutáneas accesibles a PC

• Control negativo: positivo por dermografismo (>5mm) Excepcional con la generalización del prick

• Imposibilidad de suspender anti-H1 u otros fármacos que inhiban las PC: útil el control + (existen otras alternativas: esteroides, CGDS..)

• Confirmación de significación clínica de unas PC positivas

• Dermatitis severa (ej D.atópica) y generalizada, sin zonas cutáneas accesibles a PC

• Control negativo: positivo por dermografismo (>5mm) Excepcional con la generalización del prick

• Imposibilidad de suspender anti-H1 u otros fármacos que inhiban las PC: útil el control + (existen otras alternativas: esteroides, CGDS..)

• Confirmación de significación clínica de unas PC positivas

Indicaciones de CAP-ELISA (II)Indicaciones de CAP-ELISA (II)

• Niveles de sensibilización extremadamente altos, en que puedan ser peligrosas los Prick Test (gran anafilaxia por betalactámicos, alimentos, venenos)

• Prick Test – o dudosos para hongos, con H Clínica sospechosa de alérgia, y Prick Test repetidamente negativas para otros alergenos.

• Alergenos tóxicos, insolubles en agua o sustancias altamente sensibilizantes.

• Seguimiento de Inmunoterapia.• Investigación.

• Niveles de sensibilización extremadamente altos, en que puedan ser peligrosas los Prick Test (gran anafilaxia por betalactámicos, alimentos, venenos)

• Prick Test – o dudosos para hongos, con H Clínica sospechosa de alérgia, y Prick Test repetidamente negativas para otros alergenos.

• Alergenos tóxicos, insolubles en agua o sustancias altamente sensibilizantes.

• Seguimiento de Inmunoterapia.• Investigación.

Diagnóstico inmunológico in vitro.Test de liberación de histamina

• Mediadores como la histamina son sustancias biológicamente activas que se liberan del mastocito de los tejidos o de los basófilos sanguíneos cuando se produce la reacción antígeno-anticuerpo.

• Este test nos permite estudiar de una forma directa in vitro la respuesta alérgica y conocer la reactividad frente a diferentes alergenos.

• Mide por métodos fluorométricos o por radioinmunoensayo (RIA) la cantidad de histamina que se libera después de incubar leucocitos del paciente con un alergeno.

• Mediadores como la histamina son sustancias biológicamente activas que se liberan del mastocito de los tejidos o de los basófilos sanguíneos cuando se produce la reacción antígeno-anticuerpo.

• Este test nos permite estudiar de una forma directa in vitro la respuesta alérgica y conocer la reactividad frente a diferentes alergenos.

• Mide por métodos fluorométricos o por radioinmunoensayo (RIA) la cantidad de histamina que se libera después de incubar leucocitos del paciente con un alergeno.



• Se incuban 750 microl de sangre periférica de cada paciente (extraída en tubos con heparina) durante 30 minutos, a 37º C, en agitación, con 20 microl de los alergenos (excepto en los tubos control: total, basal y los incubados con anti-IgE)

• Tras añadir 1,6 ml de EDTA 1,5 mM a cada tubo se centrifuga a 1.600 rpm durante 30 minutos

• Se cuantifica la histamina presente en el sobrenadante, mediante una técnica fluorimétrica basada en la reacción de la histamina con el ortoftal-dialdehído (OPT) en un medio fuertemente alcalino.


• Ambas sustancias forman un complejo fluorescente que se cuantifica empleando un sistema automático TechniconAutoanalyzer AAII® monocanal de flujo continuo.

• Con este método se cuantifica la histamina a una velocidad de 40 muestras por minuto.

• Se consideraron positivas aquellas liberaciones superiores al 20%.


Diagnóstico inmunológico in vitro.Test degranulación de basófilos


• Existen determinados alergenos (alimentos y medicamentos), cuyos resultados en las pruebas in vitro no son en general tan concluyentes, en especial con los medicamentos.

• Consiste en un ensayo de estimulación de basófilos in vitro con los alergenos problema, para su estudio posterior mediante citometría de flujo



• La citometría de flujo es una técnica analítica adecuada para detectar basófilos activados (marcados con anticuerpos monoclonales) cuantificando la fluorescencia emitida por estos.



• Valora el porcentaje de basófilos que degranulan después de ponerlos en contacto con un alergeno, comparando con valores basales.

• Ha demostrado ser útil para el DX de alergia a neumoalergenos, alimentos y sobre todo de medicamentos (Beta-lactámicos) no es una prueba muy usada.

• Valora el porcentaje de basófilos que degranulan después de ponerlos en contacto con un alergeno, comparando con valores basales.

• Ha demostrado ser útil para el DX de alergia a neumoalergenos, alimentos y sobre todo de medicamentos (Beta-lactámicos) no es una prueba muy usada.

DiagnDiagnóóstico de Sensibilizacistico de Sensibilizacióónn

• IgE alergeno -específica • Anticuerpos contra antígenos mayores• Respuesta linfoproliferativa con alergenos• Producción de citocinas in vitro• Degranulación de basófilos• Liberación de mediadores

•• IgE alergeno IgE alergeno --especespecíífica fica •• Anticuerpos contra antAnticuerpos contra antíígenos mayoresgenos mayores•• Respuesta Respuesta linfoproliferativalinfoproliferativa con alergenoscon alergenos•• ProducciProduccióón de citocinas n de citocinas in vitroin vitro•• DegranulaciDegranulacióón de basn de basóófilosfilos•• LiberaciLiberacióón de mediadoresn de mediadores

Activación de Linfocitos ActivaciActivacióón de Linfocitos n de Linfocitos

Respuesta linfoproliferativa con alergenos• Medición de la síntesis de DNA mediante la

incorporación de 3H-timidina a los 7 días de cultivo con el alergeno

Cultivos celulares y liberación de citocinas• Medición de la producción de citocinas en el

sobrenadante de los cultivos mediante ELISA •Detección semicuantitativa de mRNA intracelular

para citocinas mediante RT-PCR

Respuesta linfoproliferativa con alergenosRespuesta linfoproliferativa con alergenos•• MediciMedicióón de la sn de la sííntesis de DNA mediante la ntesis de DNA mediante la

incorporaciincorporacióón de 3Hn de 3H--timidinatimidina a los 7 da los 7 díías de as de cultivo con el alergenocultivo con el alergeno

Cultivos celulares y liberaciCultivos celulares y liberacióón de citocinasn de citocinas•• MediciMedicióón de la produccin de la produccióón de citocinas en el n de citocinas en el

sobrenadantesobrenadante de los cultivos mediante ELISA de los cultivos mediante ELISA ••DetecciDeteccióón n semicuantitativasemicuantitativa de mRNA intracelular de mRNA intracelular

para citocinas mediante RTpara citocinas mediante RT--PCRPCR

Mediadores QuímicosMediadores QuMediadores Quíímicosmicos

Degranulación de basófilos• Test de degranulación de basófilos• BASOTEST

Liberación de mediadores• Liberación de Histamina• Liberación de Leucotrienos

• CAST

DegranulaciDegranulacióón de basn de basóófilosfilos•• Test de degranulaciTest de degranulacióón de basn de basóófilosfilos•• BASOTESTBASOTEST

LiberaciLiberacióón de mediadoresn de mediadores•• LiberaciLiberacióón de Histaminan de Histamina•• LiberaciLiberacióón de Leucotrienosn de Leucotrienos

•• CASTCAST

Mecanismo Metodología Técnica

Mediado por CIC Ag-Ac

IgG-específicaIgA-específicaInmunocomplejos

IDR, RASTInmunofluorescenciaPEG-CC, C1qBA

Hipersensibilidad celular

LinfoproliferaciónLiberación citocinas

T.T.B

Enteropatía por glutenDermatitis herpetiformeGastroenteritis eosinofílica alérgia

Anafilaxia, Urticaria, Asma Eccema atópico, Rinitis, Alergia Gastrointestinal

Aplicación

Mediado por IgE

Prueba cutáneaIgE-específicaLiberación mediadores

SPTRAST, FAST, ELISABASOTEST, CAST

Alergia a medicamentos Enterocolitis y colitis inducidas por alimentos

LABORATORIO INMUNOLOGICO ESPECÍFICO EN ALERGIAUtilidad en función del mecanismo

LABORATORIO INMUNOLOGICO ESPECÍFICO EN ALERGIAEficiencia Comparativa

Característica Prick Test RAST Liberación Mediadores

Proliferación Linfocitos

Sensibilidad ALTA ALTA VARIABLE BAJA

Especificidad ALTA VARIABLE ALTA BAJA

Costo $ $$$ $$$$$ $$$

Influido por medicación SI NO SI NO

Influido por síntomas SI NO NO NO

Correlación prueba de provocación BUENA BUENA BUENA POBRE

Diagnóstico inmunológico in vivo.Provocaciones



• Nasales• Bronquiales (no incluiremos por

costos de equipos).• Conjuntivales• Orales (no inlcuida fue tratada en

Round tables)

Diagnóstico inmunológico in vivo.Provocación nasal

• Consiste en pulverización de 0,1-0,2 ml de un extracto alergénico en la mucosa nasal del paciente. Esto puede hacerse mediante una jeringa o atomizador.

• Cuando la respuesta es positiva, el paciente experimenta estornudos (en los primeros 2 minutos), hidrorrea(generalmente siguiendo a los estornudos) y bloqueo nasal.



• Estos síntomas pueden cuantificarse, contando el número de estornudos producidos, pesando las secreciones producidas y midiendo el grado de bloqueo nasal inducido.

• Esta respuesta debe ser comparada a la producida por una solución control (suero fisiológico), para comprobar su especificidad.

• Estos síntomas pueden cuantificarse, contando el número de estornudos producidos, pesando las secreciones producidas y midiendo el grado de bloqueo nasal inducido.

• Esta respuesta debe ser comparada a la producida por una solución control (suero fisiológico), para comprobar su especificidad.

INDICACIONES– Para confirmar que una reacción cutánea positiva es clínicamente

relevante y que no se trata de una sensibilización subclínica. – Para descubrir alergia localizada en órgano de shock (en caso de

que existan). – Cuando es imposible llevar a cabo una provocación bronquial, en

pacientes asmáticos. – Como control en la inmunoterapia, investigación.



Diagnóstico inmunológico in vivo.Provocación conjuntival


• Test sencillo, rápido, preciso y con un bajo riesgo de reacciones sistémicas.

• Se usa la colocación de una gota de suero fisiológico (como control) en el saco conjuntival.

• Si no hay reacción se continúa con la administración de igual forma, de concentraciones crecientes de un extracto acuoso del antígeno problema una vez en cada ojo.

• Las provocaciones se realizan a intervalos de 20 minutos, finalizándose en caso de positividad (hiperemia y prurito ocular).

• Test sencillo, rápido, preciso y con un bajo riesgo de reacciones sistémicas.

• Se usa la colocación de una gota de suero fisiológico (como control) en el saco conjuntival.

• Si no hay reacción se continúa con la administración de igual forma, de concentraciones crecientes de un extracto acuoso del antígeno problema una vez en cada ojo.

• Las provocaciones se realizan a intervalos de 20 minutos, finalizándose en caso de positividad (hiperemia y prurito ocular).


Indicaciones– Diagnóstico de rinoconjuntivitis alérgicas. Cuando

existen dudas, a pesar de la historia y pruebas cutáneas, sobre la relevancia clínica de un determinado alergeno.

– Valorar respuesta a la inmunoterapia en investigación.

Conclusiones• Principales mecanismos implicados tipos I y IV de Gell y Coombs• Principales entidades clínicas: rinitis, asma, urticaria-angioedema,

dermatitis• Gran importancia de la Historia Clínica• Tests in vivo: PC, Patch-test y provocaciones

– La más utilizada Prick-test: rápido, sencillo. Barato y mayor sensibilidad que CAP

• CAP-ELISA sólo indicaciones precisas. Más cara que prick. No disponible en nuestro medio. Mayor sensibilidad del RIDA.

• Test de liberación de histamina: poco uso• Test de degranulación de basófilos:

– Todavía no extendido. – Mayor importancia en medicamentos

• Principales mecanismos implicados tipos I y IV de Gell y Coombs• Principales entidades clínicas: rinitis, asma, urticaria-angioedema,

dermatitis• Gran importancia de la Historia Clínica• Tests in vivo: PC, Patch-test y provocaciones

– La más utilizada Prick-test: rápido, sencillo. Barato y mayor sensibilidad que CAP

• CAP-ELISA sólo indicaciones precisas. Más cara que prick. No disponible en nuestro medio. Mayor sensibilidad del RIDA.

• Test de liberación de histamina: poco uso• Test de degranulación de basófilos:

– Todavía no extendido. – Mayor importancia en medicamentos

DAGNOSTICO DE LABORATORIO Y PRUEBAS IN … · Universidad Nacional Mayor de San Marcos Lima (Perú)...

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