TBC

On closer inspection, caseous tan necrotic tissue is seen to constitute the granulomas in this gross appearance of a Ghon complex. Most patients with primary tuberculosis are asymptomatic, and the granulomas resolve.

Note the subpleural granuloma at the right along with the granuloma in the hilar lymph node, typical findings for the Ghon complex of primary tuberculosis

•  Prevalenza dell’infezione: 2 miliardi •  Nuovi casi per anno: 8 milioni •  Morti per anno: 2 milioni (esclusi HIV) •  Morti evitabili: ~ 30%

Epidemiologia

Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing. WHO Report 2003.

Le ragioni di una attenzione globale

A distanza di oltre 120 anni dalla scoperta del bacillo tubercolare e nonostante l’efficacia dei farmaci, la TB è la prima causa di morte da singolo agente infettivo.

Epidemiologia

Una malattia persistente

Rappuoli R. Nat Med 2004

La tubercolosi

•  nel MONDO –  2.000.000 morti all’anno –  8.000.000 nuovi casi all’anno –  1/3 della popolazione mondiale infettato

•  in ITALIA –  4.287 casi notificati nel 2001

5.7 casi per 100000 abitanti nel 2013, in tutto 3153 (circa il 50% in soggetti di nazionalità non italiana). 68% a localizzazione polmonare 300 soggetti sono deceduti a causa dell’ infezione TBC (circa 1%)

Tra il 1995 e il 2007 l’incidenza della tubercolosi ha registrato un decremento del 19%, passando da 10 casi ogni 100 mila abitanti (1995) a 7,7 casi ogni 100 mila abitanti nel 2007, un tasso leggermente più alto rispetto al 2006 (7,4 per 100 mila), che pone l’Italia al di sotto del limite che definisce la classificazione di Paese a bassa prevalenza (10 casi per 100 mila abitanti). A seguito della revisione del sistema di notifica della tubercolosi (dal 1999), oltre ai nuovi casi di tubercolosi, è possibile rilevare anche i casi di Tb recidiva, che sono stati poco meno del 10% (dal 1999 al 2007) del totale dei casi segnalati. Il picco si è registrato tra il 2001 e il 2002, con valori, rispettivamente, del 13% e del 12%.

Infezione da M. tuberculosis

•  Malattia tubercolare – se il sistema immunitario non riesce a

controllare l’infezione •  Infezione latente (assenza di malattia)

– se l’infezione rimane sotto il controllo del sistema immunitario

M. tuberculosis, infezione

Esposizione al M. tuberculosis Assenza di infezione (5%)

Infezione (95%) TBC attiva (5%) (entro 2 anni)

TBC latente (95%) Riattivazione (5%)

nessuna riattivazione (90%)

Related species

•  M. tuberculosis: humans only •  M. bovis: TB in cows, rarely in man •  M. avium: TB-like disease in AIDS patients •  M. leprae: causative agent of leprosy •  M. kansasi: TB-like disease in AIDS

patients •  M. scrofulaceum: cervical adenitis in

children

Dall’esposizione alla malattia Esposizione a caso contagioso

Infezione: MTB prolifera nei fagociti e vengono reclutate

cellule infiammatorie

TB attiva e sintomatica: I soggetti possono trasmettere

la malattia ad altri

* Rischio molto maggiore negli immunodepressi

(nel 95% dei casi le cellule T controllano l’infezione, che rimane subclinica)

Infezione latente: MTB controllato dal sistema immunitario per tutto il

resto della vita

Non infezione: i macrofagi alveolari (mφ) uccidono MTB

Riattivazione (5% di rischio durante il resto

della vita) *

(il 5% va incontro a malattia attiva entro 1-2 anni) *

Patogenesi

Fondamentale è il rapporto tra attività battericida dei mφ e virulenza dei bacilli Fondamentale è l’immunità cellulo-mediata

General characteristics

•  Nonmotile •  Rod shaped •  Obligate aerobe: found in upper lung •  Facultative intracellular parasite:

macrophages •  Special media: Middlebrook’s or

Lowenstein-Jensen –  4-6 weeks to get colonies –  Chains of cells in smears

Colonies of Mycobacterium tuberculosis on Lowenstein-Jensen medium. CDC

General characteristics

•  Acid-fast – Not typical Gram stain –  Impermeability by certain dyes and

stains unless heated and treated with acidified organic compounds

– Need >10,000 organisms per sputum sample

An acid fast stain is used to diagnose the presence of mycobacteria in tissue and cytologic preparations. Note the thin red rod-like organisms

Peptidoglycan

LAMArabinogalactan Mycolic acid

mannophosphoinositide

•  Cord factor –  Serpentine cording –  Toxic to mammalian cells –  Virulence factor

•  Wax-D –  In cell envelope – Major component of Freund’s complete adjuvant (CFA)

Virulence factors and mechanisms

•  No toxins, no capsules, no fimbriae •  Slow generation time: antigen threshold

not met to trigger AMI •  Lipid concentration in cell wall:

impermeability, resistance to antimicrobial agent or complement or lysozyme

•  Cord factor: toxic to mammalian cells; inhibitor of PMN migration

Sometimes the bug outsmarts the phagocyte

Shigella escapes from the phagolysosome (in epitjhelial cells) or kill the cell (macrophages) Legionella diverts the nascent endosome away from the phagocytic pathway Histoplasms limits phagocome acidification Yersinia inhibits NADPH activity

Interference with phagosome maturation

Il MTB inibisce la fusione fagosoma-lisosoma. Come? Calcio?

Internalization

•  Inhibits phagosome-lysosome fusion –  Prevents recruitment of PI(3)K and EEA1 (early

endosome docking protein, Rab5 effector) •  Prevents recruitment of lysosomal hydrolyses •  Prevents acidification

•  Reduction of IL-12 production –  Normally stimulates Th1 response

•  Intracellular growth: cytoplasmic and/or phagosome

Mycobacterium tuberculosis is probably the smartest

Stage 1

• Spread person to person• Aerosol • Small droplet (5µm)

Stage 1

•  Droplet inhaled •  Larger droplets lodge

in nose and throat •  Smaller droplets reach

alveoli (small air sacs) Bacteria nonspecifically endocytosed by alveolar macrophagesIf dose is low and immune system healthy, macrophages activate and clear infection. High bacterial dose and/or immune deficiency, alveolar macrophages not activated and unable to destroy intracellular organisms.

Batteriemia

Storia naturale della tubercolsi

Granuloma tubercolare cellule giganti di Langhans e cellule epiteliodi

Cellula  gigante  di  Langhans  

Granuloma tubercolare: cellule di Langhans

E  

Granuloma tubercolare: necrosi caseosa

Cellule epitelioidi

Reazioni da ipersensibilità

Disease •  Five stages

–  Only small percent of M. TB. Infections progress to disease

–  Even smaller percent progress to Stage 5

•  Progression depends on –  Infectious dose –  Immune status of host –  Strain of M. TB. –  Prior exposure –  Vaccination?????

Stage 1

• Spread person to person• Aerosol • Small droplet (5µm)

Stage 1

•  Droplet inhaled •  Larger droplets lodge

in nose and throat •  Smaller droplets reach

alveoli (small air sacs) Bacteria nonspecifically endocytosed by alveolar macrophagesIf dose is low and immune system healthy, macrophages activate and clear infection. High bacterial dose and/or immune deficiency, alveolar macrophages not activated and unable to destroy intracellular organisms.

Stage 2

•  7-21 days post-infection •  M. TB. multiplying unrestricted within

unactivated macrophages •  Macrophage bursts: release bacilli •  Additional macrophages extravasate

to the scene – Many are not activated and do not

destroy

Stage 3

•  Lymphocytes begin to infiltrate – T cells recognized M. TB. antigen in context of

MHC molecules – T-cell activation – Production of INF-γ –  INF-γ activates macrophages – Activated macrophages now destroy M. TB.

Stage 3

•  Individual becomes tuberculin-positive –  result of vigorous CMI response

•  Immune pathology begins –  TNF-α, IL-1, INF-γ, lysosomal enzymes,

•  Tubercle formation begins –  Macrophages in vicinity of bacilli fuse to form

giant cells –  Layer of macrophages and T cells forms

around a growing focus of damaged tissue containing bacilli

–  Walled-off lesion called a tubercle

On closer inspection, caseous tan necrotic tissue is seen to constitute the granulomas in this gross appearance of a Ghon complex. Most patients with primary tuberculosis are asymptomatic, and the granulomas resolve.

Note the subpleural granuloma at the right along with the granuloma in the hilar lymph node, typical findings for the Ghon complex of primary tuberculosis

Stage 3

– Center of tubercle characterized by “caseation necrosis” (semi-solid or cheesy consistency)

– Bacilli persist, but do not replicate, in center of tubercles because anoxic and low pH.

•  Granulomatous response –  the cell-mediated (T cells and phagocytes)

response that produces the tubercle

Stage 4

•  Bacilli replicate in poorly activated macrophages at periphery of tubercle

•  Growing tubercle may invade bronchus – Spread to rest of lung and into

blood stream – Formation of secondary lesions

Stage 5

•  The caseous centers of tubercle liquefies

•  Bacilli escape tubercle •  Cavitation of tubercle

The caseous necrosis is extensive, and cavitation is prominent. Such patients can be highly infectious.

Stage 5 •  M. TB. grow and multiply extracellularly •  Bronchi become necrotic and rupture •  Bacilli disseminate throughout lung:

called Miliary TB = myriad of small millet seed (1-3 mm) sized granulomas

The small millet seed sized granulomas in this lung are typical for miliary tuberculosis.

•  Bacilli disseminate throughout body• Genitourinary, bones, joints, lymph nodes, peritoneum

Chronic TB infection

•  Latency and reactivation •  Even if severe symptomatic

disease is prevented – Granuloma persists – Bacilli are latent – Reactivation of bacilli replication

I linfociti T

•  Cellula-T nativa = non venuta in contatto con l’Ag

•  Cellula-T effettrice = cellula-T nativa venuta in contatto con l’Ag

•  Cellula-T memoria = cellula effettrice dopo l’allontanamento dell’antigene

•  Cellula-T effettrice = cellula-T memoria in occasione di un nuovo contatto con l’Ag

La Mantoux

•  Introdotta alla fine del 1800, è il più vecchio test diagnostico ancora in uso

•  Si basa sull’inoculo intradermico del PPD, (miscela di antigeni del M. tuberculosis, alcuni dei quali sono presenti anche nel BCG e nei micobatteri non tubercolari)

Charles Mantoux

Diagnosis •  Skin test: tuberculin or Mantoux test

–  PPD (purified protein derivative) –  Mixture of proteins from boiled M. TB. –  Injected intracutaneously: read 48-72 hours.

•  Stimulates preprimed CD4+ •  Cytokines PMNs monocytes macrophages •  Erythema: redness and swelling •  Induration (hardening): deposition of fibrin by monocytes

and macrophages –  Positive: lesion diameter is ≥ 10 mm: red, raised

and hard;

Mantoux

Linfocita T Cellula presentante l’Ag

richiamo e attivazione cellulare

indurimento e arrossamento

nel punto dell’iniezione

Rilascio di IFN-γ, TNF e IL8

Measured amount of PPDInjected intracutaneously

After PPD injected, small wheal appears

48-72 hrs reddish induration (firm bump) > 10 mm

The Internet Pathology Laboratory for Medical Education Florida State University College of Medicine http://www-medlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html - MENU

Punti di forza della Mantoux

•  Utile per predire la TBC attiva •  Il trattamento dei soggetti Mantoux-

positivi riduce drasticamente il rischio di passaggio alla tubercolosi attiva

•  Basso costo •  Non richiede l’intervento del laboratorio

Limiti della Mantoux §  Falsi positivi

- Esposizione a micobatteri non tubercolari (NTM) Falsi negativi -  Errori di inoculo -  Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza della misurazione) -  Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con tubercolosi

avanzata

-  Complicazioni -  Effetto booster

§  Problemi di ordine pratico -  Doppia presentazione del paziente -  Mancata lettura nel 30% dei casi

The ideal diagnostic test (the Kalashnikov paradigma)

Accurate Riproducible Specific Sensitive Predictive Discriminating Low risk Low cost Informative

Reazioni da ipersensibilità

Produzione di interferone-γ (IFN-γ)

•  L’infezione tubercolare stimola la risposta della cellule T

•  Le cellule-T attivate secernono citochine –  IFN-γ –  TNF –  IL8

•  Le cellule-T effettrici producono IFN-γ entro poche ore dalla stimolazione

•  Le cellule-T memoria devono prima proliferare trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi in grado di produrre IFN-γ prima di 24h

•  L’IFN-γ non è normalmente presente in circolo, è stabile e misurabile

I test basati sull’interferone-γ •  I linfociti del soggetto in esame vengono posti in

contatto con l’antigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo positivo contiene fitoemoagglutinina

•  Ricerca dell’IFN-γ dopo opportuna incubazione –  assenza di IFN-γ = ASSENZA DI INFEZIONE –  presenza di IFN-γ = INFEZIONE

•  presenza di IFN-γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO •  assenza di IFN-γ nel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO

La scelta degli antigeni

•  I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono interferone-γ se vengono in contatto con uno o più antigeni del M. tuberculosis –  PPD (purified proteic derivative) –  ESAT-6 (early secretory antigenic target 6) –  CFP-10 (culture filtrate protein 10)

•  ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT

Specificità di ESAT-6 and CFP-10

MNM

Antigeni

M abscessus

-

-

M avium

-

-

M branderi

-

-

M celatum

-

-

M chelonae

-

-

M fortuitum

-

-

M gordonae

-

-

M intracellulare

-

-

M kansasii

+

+

M malmoense

-

-

M marinum

+

+

M genavense

-

-

M scrofulaceum

-

-

M smegmatis

-

-

M szulgai

+

+

M terrae

-

-

M vaccae

-

-

M xenopi

-

-

Antigeni

ESAT-6 CFP-10 ESAT-6

M tuberculosis

+

+

Ceppi BCG

gothenburg

-

-

moreau

-

-

tice

-

-

tokyo

-

-

danish

-

-

glaxo

-

-

montreal

-

-

pasteur

-

-

Sangue eparinato

ESAT-6 CFP-10 Mitogeno

Trasferimento in pozzetti e aggiunta dell’antigene

Incubazione overnight a 37oC Se sono presenti cellule-T effettrici

viene secreto IFN-γ

Recupero del plasma e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA, incubazione 120 min)

Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura

COLORE

Misura della DO e dosaggio dell’IFN-γcontro una curva di taratura

Metodo ELISA

K -

DO

450

nm

IFN-γ IU/ml

Metodo ELISA in-tube

Raccolta del sangue in provette eparinate

Incubazione per 16-24h a 37°C

Recupero del plasma e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA, incubazione 120 min)

Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura

COLORE

K neg ESAT6 + CFP10 mitogeno centrifugazione

Misura della DO e dosaggio dell’IFN-γcontro una curva di taratura

DO

450

nm

IFN-γ IU/ml

Sangue eparinato

ESAT-6 CFP-10 Mitogeno

Trasferimento dei linfociti (250.000 cell.) in pozzetti coated con Ab anti-IFN-γ

e aggiunta dell’antigene

Incubazione overnight a 37oC Lavaggio e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA,

incubazione 120 min)

Conteggio degli spot, al microscopio o con

lettore automatico

K -

Separazione e conteggio dei leucociti mononucleati

COLORE

Metodo ELISpot

•  Man mano che una cellula secerne IFN-γ questo viene legato dagli Ab sottostanti, si forma quindi uno spot

•  POSITIVO: quando si hanno spot con almeno uno degli antigeni –  se il K- ha 0-4 spot ed il pozzetto dell’Ag

ha più di 5 spot –  se il K- ha >5 e <10 spot ed il pozzetto

con l’antigene ha un numero di spot almeno doppio

•  NON VALIDO se K- >10 spot e/o K+ <20 spot

Metodo ELISpot: lettura

•  Test in vitro •  Nessun effetto booster •  Specificità elevata •  Non influenzati dalla vaccinazione con BCG •  Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non

è richiesta la collaborazione del paziente •  Interpretazione oggettiva •  Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari

Vantaggi dei metodi basati su IFN-γ

Valutazione clinica dei test basati su IFN-γ

•  Non esiste un gold standard per la tubercolosi latente – La sensibilità del test viene solitamente

stimata in soggetti con tubercolosi attiva, usando la coltura come gold standard

– La specificità viene solitamente stimata in soggetti ad alto rischio

La risposta IFN-γ ad ESAT-6/CFP-10 è predittiva del passaggio a TBC attiva?

•  La risposta IFN-γ correla con l’esposizione

•  Circa il 90% dei pazienti risponde •  In Etiopia, un follow up di 2 anni di

contatti conviventi col caso indice, ha dimostrato la correlazione della risposta ad ESAT-6 (ma non al PPD) con la progressione verso la malattia

» Doherty et al (JCM 2002)

ACCURATEZZA: quanto il valore fornito dall’ analisi è prossimo al valore reale del parametro che viene analizzato

PRECISIONE: quanto vicini tra loro sono i valori ottenuti in ripetute

determinazioni SPECIFICITA’: capacità di un test di individuare solo i soggetti

malati SENSIBILITA’: capacità di un test di individuare tutti i soggetti malati

veri negativi______ = specificità veri negativi + falsi positivi

veri positivi______ = sensibilità veri positivi + falsi negativi

Correlazione IFN-γ/Mantoux

IFN-γ Mantoux

Sensibilità 89.0% (105/118)

65.7% (50/76; 5 mm)

Specificità 98.2% (213/217)

35.4% (73/113; 10 mm)

Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004

Test IFN-γ vs. Mantoux

•  Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva: SOVRAPPONIBILE

•  Sensibilità nei casi di sospetta infezione latente: MAGGIORE per IFN-γ

•  I casi con Mantoux NEG e IFN-γ POS sono generalmente associati con l’esposizione

•  I casi con Mantoux POS e IFN-γ NEG non sono generalmente associati con l’esposizione

Da ricordare