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STRUCTURE ET HÉTÉROGÉNÉITÉ DESIMMUNOGLOBULINES G DU PORC ÉTUDE DU

CLIVAGE PAR LA PEPSINE (1)J.-J. Metzger, Geneviève Marret, Annie Barde

To cite this version:J.-J. Metzger, Geneviève Marret, Annie Barde. STRUCTURE ET HÉTÉROGÉNÉITÉ DES IM-MUNOGLOBULINES G DU PORC ÉTUDE DU CLIVAGE PAR LA PEPSINE (1). Annales deRecherches Vétérinaires, INRA Editions, 1972, 3 (2), pp.289-306. <hal-00900709>

STRUCTURE ET HÉTÉROGÉNÉITÉDES IMMUNOGLOBULINES G DU PORC

ÉTUDE DU CLIVAGE PAR LA PEPSINE (1)

J.-J. METZGERGeneviève MARRET Annie BARDE

Station de Virologie et d’Immunologie, I. N. R. A., .,

78 - 7’A!HefU<!/- Gftg’KOK

- RÉSUMÉ

L’étude de la structure des immunoglobulines G porcines par l’analyse des fragments obtenusaprès clivage de la molécule par la pepsine a été poursuivie. Nous avons utilisé trois préparationsdifférentes de molécules : soit les IgG normales non retenues sur DEAE-cellulose, soit la mêmepréparation ayant subi une réduction douce suivie d’alkylation radioactive afin de marquer préfé-rentiellement les liaisons disulfures intercaténaires soit, enfin, une préparation d’anticorps purifiésantidinitrophénol. Par la détermination des propriétés physico-chimiques, antigéniques et ducaractère anticorps des fragments obtenus, nous avons pu caractériser les principaux fragmentsF(ab)’2, son monomère Fab’ ainsi que lefragment!Fc’. Par contre, il n’a pas pu être mis en évidenceune fragilité plus grande d’une des deux sous-classes d’IgG, contrairement à ce qui a été affirmépar d’autres auteurs pour le clivage pepsique ou papaïnique. Par gel-filtration en milieu disso-ciant, il a été possible d’obtenir une séparation partielle du fragment Fd’ de la chaîne lourdeet des chaînes légères. Sur les cartes peptidiques des différents fragments, les peptides supportantles principales liaisons disulfures intercaténaires de la molécule d’IgG porcine, ont été localisées.

I. - INTRODUCTION

Malgré de très nombreuses études publiées sur la structure des immunoglobu-lines yG du porc, études portant sur l’analyse des chaînes lourdes et légères consti-tutives de la molécule (FRANCK, ig6i, 1966), la présence de déterminants alloty-piques (RASMUSSEN, i965 ; ReiNÈK, KOSTKA et TRAVNICÈK, I9E)6) ou encore la

(1) Cette étude a pu être réalisée en partie grâce à un contrat avec la Communauté économique euro-péenne.

structure primaire de la chaîne légère (FRANÈK et ZoRiNÂ, Ig67 ; FRANEK, KEÍL et

SopM, 1969 ; NOVOTNV, FRANCK, KEÍL ET SORM, 1969) peu de résultats ont étéobtenus concernant la possibilité du clivage de cette molécule par les enzymesprotéolytiques. Au cours d’un travail précédent, nous avons présenté la carac-térisation des fragments de l’immunoglobuline G porcine obtenus après hydrolyseménagée par la papaïne ou par la trypsine (METz&ER et FouG>âR!AU, 1968). Cesdeux enzymes font apparaître les fragments Fab et Fc qu’il est difficile de séparerétant donnée leur analogie de charge électrique et de masse. Outre ces deux frag-ments, d’autres’produits du clivage (fragment intermédiaire, fragment Fc’ et

peptides) démontrent l’hétérogénéité des substrats IgG. Il ne nous a cependant pasété possible de relier la sensibilité à l’hydrolyse enzymatique à un caractère desous-classe des IgG porcines.

Poursuivant la caractérisation des IgG du porc, nous présentons ici les résultatsconcernant leur hydrolyse ménagée par la pepsine selon la technique de NISONOFFet al. (Ig6o), la définition des différents fragments obtenus par l’action de cette enzymesur les IgG porcines avant ou après une réduction douce suivie d’alkylation et surdes anticorps antidinitrophénol ainsi que les propriétés physico-chimiques, anti-géniques et immunologiques de ces fragments. Sur cartes peptidiques, nous avonstenté de comparer ces fragments, leurs produits d’hydrolyse par la trypsine et leurschaînes constitutives afin de localiser les peptides supportant les principales liaisonsdisulfures intercaténaires (METZGER et FOUGEREAU, Ig69).NISONOFF (1960) travaillant sur la molécule d’immunoglobuline de lapin, a

montré que la pepsine libère un fragment F(ab’)a qui conserve la fonction d’anti-corps divalent, c’est-à-dire capable de former un précipité avec l’antigène multi-valent, alors que le fragment Fab, obtenu selon la technique de PORTER (1959)par la papaïne, ne possède qu’un seul site anticorps. Ces deux fragments possèdenttoute l’antigénicité propre à la chaîne légère ainsi que la moitié NH.-terminale dela chaîne lourde (fragment Fd pour Fab et fragment Fd’ pour F(ab’)a) en généraldépourvue d’antigénicité. Au cours de notre travail, nous montrons qu’une partiedes immunoglobulines G porcines donne naissance à un fragment Fab’, possédantl’aptitude à fixer le haptène, mais ne comportant aucune déficience antigéniquepar rapport au fragment classique F(ab’)., bien que de masse moléculaire deux foisplus faible. Cependant, par les techniques que nous avons utilisées, aucune sensi-bilité particulière de l’une des sous-classes à l’action de la pepsine n’a pu être miseen évidence, contrairement à ce qui a pu être observé pour le clivage par enzymesprotéolytiques chez l’Homme ou chez d’autres espèces animales (BOURNE, 1970;JEFFERIS et STANWORTH, Ig6g ; I!ESUE, M>;LAM!D et COHEN, 1971 ; ZIKÀN, BI,AZ!Ket CERNA, 1970.)

II. - MATÉRIEL ET METHODES

Le sérum de porc est obtenu sur des animaux d’abattoir ou sur des animaux immunisés aulaboratoire. Les immunoglobulines G et les autres réactifs, sauf indications, sont préparés selonles techniques décrites précédemment (METZGER et FOUGEREAU, 1967 et 1968). Les produitschimiques sont de qualité pure pour analyse.

i. - .D!g’M<!OM par la pepsine

La digestion par la pepsine est réalisée selon la technique de NisorroFF et al. (1960). Unesolution de i à 2 p. ioo d’IgG en tampon acétate de sodium o,r M, pH 4,5 est hydrolysée par lapepsine (3 fois cristallisée de chez N. B. C.) dans un rapport enzyme/substrat de i/5o. L’hydro-lyse est poursuivie pendant r8 à 2o heures à 37 °C et la réaction est arrêtée par ajustement du pHà 8,o à l’aide de soude i,o N.

2. - Séparation des fragments

L’hydrolysat pepsique est ensuite centrifugé et déposé sur une colonne de Sephadex G-iooéquilibrée en un tampon carbonate-bicarbonate d’ammonium o,05 M au pH 8,5 et de dimensions5 X 100 cm. La position de l’élution des divers fragments est déterminée par la lecture de ladensité optique à 280 nm à l’aide d’un Uvicord r i (L. K. B. Suède) à enregistrement automatiqueou d’un spectrophotomètre PMQ rr (Zeiss, R. F. A.). Les pics d’absorption sont lyophylisés et lesprotéines conservées en dessiccateur sous vide.

3. - Réduction des liaisons disulfures et marquage de l’IgG par alkylation radioactive

Deux grammes de l’immunoglobuline G sont dissous en 100 ml de tampon Tris-Hel 0, M,NaCI 0,15 M, au pH 8,0, contenant de l’EDTA 3 mM. La réduction par le réactif de Cleland(dithiothréitol o,5 mM) est réalisée pendant 60 mn à la température ordinaire et sous atmosphèred’azote. L’alkylation par l’acide iodoacétique est effectuée en deux temps afin de réduire lespertes en matériel radioactif : pendant 15 5 mn à l’aide de o, mCi d’acide14C1-iodoacétique (N. V. Phi-lipps-Duphar Hollande) puis 25 minutes par l’alkylant froid i mM (acide iodoacétique recris-tallisé deux fois N. B. C.). Le pH de la réaction est constamment maintenu à 8,o par addition deNaOH i M. Puis l’IgG marquée est dialysée pour éliminer l’excédent de réactifs et lyophilisée.

4. - Cartes peptidiques et autoradiographies

La protéine ou le fragment est placé en tampon Tris-HCl 0,1 M à pH 8,o contenant del’urée 8 M, réduit en o,2 M 2-mercaptoéthanol (2-ME) pendant une heure sous azote puis alkylépar l’acide iodoacétique 0,3 M à pH 8,o pendant 30 minutes à l’abri de la lumière. La protéineest ensuite transférée en tampon carbonate o,05 M pH 8,5 par gel-filtration sur Sephadex G-25puis lyophilisée après hydrolyse par la trypsine (A-grade, traitée par le TPCK pour éliminerl’activité chymotrypsique, de chez Calbiochem) en rapport enzyme/substrat : 1/50, pendant3 heures sous agitation douce.

Les cartes peptidiques sont réalisées selon les méthodes déjà décrites. Les électrophorèsessont faites à pH 1,9, 4,7 ou 6,5 selon les expériences, sous une tension de 2 750 volts. Les mar-queurs Pentel bleus (12,5 cm à pH I,g) et rouges (14 cm à pH 4,! et 16 cm à pH 6,5) sont utilisésen même temps qu’un mélange connu d’acides aminés afin de standardiser les différentes cartespeptidiques. Les chromatographies descendantes sont développées dans le mélange butanol,acide acétique, pyridine et eau (15/3/10/12) déjà décrit (METZGER, NOVOTN! et FRANEK, 1971).

Les autoradiographies sont développées après un contact du film sensible (Kodirex, émulsiondouble face, Kodak France) avec la feuille de la carte peptidique pendant une à trois semaines.Pour déterminer la radioactivité spécifique de chaque peptide, la tache radioactive est découpéeet comptée en liquide de scintillation sur un compteur (Tri-Carb de chez Packard). Nousn’avons pas opéré de correction pour « l’extinction » de la radioactivité.

5. - Autres méthodes

Les ultracentrifugations en gradient linéaire de saccharose 5 à 20 p. 100 sont réalisées entampon phosphate 0,01 M pH 7,6 NaCl o,15 M. La vitesse de 38 ooo tr/mn est maintenuependant18 heures sauf indication contraire, (rotor SW 39, centrifugeuse L2 de chez Beckman). Les gra-dients sont collectés en perçant le fond du tube et les fractions de trois gouttes sont analysées,soit pour leur densité optique après coloration de Folin-Ciocalteus, soit pour leur radioactivité.

Les immunoélectrophorèses et les double-diffusions en gel sont réalisées selon la micromé-thode de SCHEIDEGGER en agarose i p. 100 (Indubiose, produit biologique français) dissous en untampon Véronal de force ionique o,05 au pH 8,6. (OUCHTERLONY, Ig58 ; SCHEIDEGGER, 1955.)

L’obtention des immuns sérums sur lapins comporte deux injections intramusculaires à21 jours d’intervalle de i à 2 mg d’antigène émulsionné avec de l’adjuvant complet de FREUND,sous un volume total de I ml. Les saignées sont effectuées une semaine après la dernière inoculation.

Les anticorps anti-dinitrophénol (anti DNP) sont préparés selon la technique d’EisErr (1964)et leur repérage effectué selon la technique de FOUGEREAU (1966) lors de centrifugations engradient de saccharose en présence du haptène radioactif : DNP-l’C-lysine 1,0 mCi/mM.L’hydrolyse partielle de l’IgG par la trypsine est réalisée selon les techniques précédemmentdécrites (METZGER et FOUGEREAU, 1968). L’hydrolyse des fragments F(ab’)2 et Fab’ par la trypsine(rapport enzyme/substrat i/5o) est effectuée en tampon carbonate d’ammonium o,o25 M pH 8,zpendant 60 minutes à 37° C, le pH étant maintenu constant par addition de soude o,5 M.

III. - RÉSULTATS

1. - Clivage des immunoglobulines G par la pepsine

Les immunoglobulines G porcines ont été clivées par la pepsine puis l’hydro-lysat est chromatographié sur une colonne de Sephadex G-ioo. Le diagramme del’élution en fonction de la densité optique est présenté sur la figure i. Le premierpic des IgG non hydrolysées est suivi d’un pic de fragments ayant une masse molé-culaire d’environ ioo 00o pour un Kav (1) de o,y. Ce pic se révèle hétérogène car il

Ve - Vo(1) Le Kav est défini comme le rapport Vt - V, où Vo représente le volume d’exclusion, Vt le volume

total de la colonne et Ve le volume d’exclusion de la protéine considérée. Le volume spécifique du gel aété négligé.

présente un épaulement dans sa partie ascendante pour un Kav de 0.11. Pour unKav de 0,34 apparaît un deuxième pic symétrique de fragments possédant les mêmescaractères que les fragments du pic précédent. Un fragment homogène s’élue pourun Kav de o,5o suivi enfin des petits peptides qui sortent près du volume d’exclusionou avec lui.

86 p. 100 du poids de la protéine initiale se retrouvent dans les quatre premierspics. Ces fragments représentent successivement m,8 p. 100, 44,5 P. 100, 25,7 p. 100et 18,0 p. 100 du poids total des fragments recueillis. La détermination des massesmoléculaires des fragments selon la méthode d’ANDREWS (1964) nous indique desvaleurs voisines de 100 ooo, 50 ooo et de 25 ooo respectivement pour les fragmentsdes pics 2, 3 et 4.

2. - Clivage des immunoglobulines G partiellement réduites et alkyléessur les liaisons disulfures intercaténaires

L’expérience décrite sur la figure i a été réalisée sur une préparation d’IgG dontcertaines des liaisons disulfures intercaténaires ont été réduites et alkylées par l’acideiodoacétique marqué au 14C. Une étude précédente nous a montré que dans les condi-tions expérimentales choisies, la liaison entre les chaînes lourdes et légères est pré-férentiellement clivée ainsi que certaines des liaisons inter-chaînes lourdes (METZ-GER, et FouGExEnu ig6g). L’hydrolyse effectuée sur la molécule non préalable-ment clivée donne le même résultat avec seulement une légère diminution del’intensité du troisième pic.

Tous les pics d’absorption optique sont marqués par l’agent alkylant radioactifà l’exception du quatrième. Au niveau des petits peptides, la courbe de la radioac-tivité ne couvre pas la courbe de la densité optique mais semble la précéder : les plusgros des peptides sont les plus intensément marqués. En faisant le rapport de laradioactivité sur la densité optique à l’intérieur de chacun des pics, nous avons notésuccessivement 37, 40,4, 58 et 11,5. Aucune correction n’a été apportée pour lavaleur des lignes de base. I,’analyse de ce rapport montre que le fragment du troi-sième pic provient plutôt des molécules les plus réduites alors que les molécules moinstouchées par la réduction-alkylation préalable sont plus résistantes à l’action de lapepsine. Enfin, le fragment du quatrième pic ne semble pas supporter de liaisondisulfure intercaténaire, analogue en cela au fragment Fc’ de l’hydrolyse par lapapaïne.

3. - Clivage des anticorps par la Pepsine

Une préparation d’anticorps antidinitrophénol (DNP) comprenant lesdeux sous-classes IgG1 et IgG2 a été réalisée puis hydrolysée afin de déterminerl’activité anticorps des différents fragments obtenus par l’hydrolyse pepsiqueménagée.

Les anticorps (13,5 mg) sont dissous en tampon acétate de sodium 0,2 M pH 4,5 5(1,35 ml). Une partie (0,35 ml) de la solution sert de témoin non hydrolysé. La pep-sine (0,2 mg) est ajoutée au reste de la solution et l’hydrolyse est poursuivie pendant12 heures pour la moitié de l’échantillon et 20 heures pour le reste. La réaction estarrêtée par neutralisation du milieu. Puis les trois préparations sont soumises à

l’ultracentrifugation en gradient linéaire de saccharose de 5 à 20 p. 100 en présencedu haptène radioactif (FOUG!R!AU, ig66 ; M!TZG!R et FOUGEREAU, 1968). Lesrésultats sont exprimés sur la figure 2. Les anticorps non hydrolysés présententune activité de fixation du haptène selon un pic de coefficient de sédimentationde 7 S. Ce pic est précédé d’un palier d’activité en position 10 S pouvant représenterdes dimères non spécifiques. Après 12 heures d’hydrolyse pepsique, l’activité anti-

corps se concentre en un pic 5,5 S lui-même suivi d’un pic de coefficient de sédi-mentation 4,1 S. Après 2o heures d’hydrolyse, l’image est encore plus nette du faitde la disparition complète des molécules 7 S. La proportion relative des deux picsreste la même pour les deux temps d’hydrolyse. Cette observation montre que lesdeux pics apparaissent simultanément dans le temps et donc ne semblent pas dériverl’un de l’autre. La valence de ces deux fragments n’a pu être déterminée faute dematériel.

4. - A ntigénicité de ces fragments

Différents antisérums ont été utilisés afin de caractériser ces fragments. L’immu-noélectrophorèse de l’hydrolysat pepsique de l’IgG porcine, révélée à l’aide d’unantisérum capable de reconnaître les deux sous-classes, ne présente aucun dédou-blement de ses arcs de précipitation pouvant représenter une différence antigéniquede ces fragments (fig. 3).

Les protéines du premier pic d’élution possèdent tous les déterminants anti-géniques de l’IgG native et leur élution dans le pic exclu du gel les caractérise commedes IgG ayant résisté à l’hydrolyse enzymatique. Le deuxième fragment présente uneidentité antigénique totale vis-à-vis des chaînes légères et partielle vis-à-vis deschaînes lourdes. En effet, une immunoélectrophorèse d’un hydrolysat papaïniqueest soumise à une immunodiffusion vis-à-vis de ce fragment. On observe sur la figure 3les continuités antigéniques entre ce fragment et les fragments Fab et Fc de l’IgG.Par contre, l’épuisement de l’antisérum anti-IgG par le fragment du pic 2 élimine

totalement la réactivité de cet antisérum contre le fragment Fab tout en conservantsa capacité de réagir avec les fragments Fc et Fc’. D’une mobilité très peu différente

de la molécule d’IgG, ce fragment ne donne à l’immunoélectrophorèse qu’une seuleligne de précipitation et réagit aussi bien avec les sérums spécifiques antichaîneslourdes qu’avec les sérums antichaînes légères (M!’rzG!R et HOUDAYER, 1972). Enfinles sérums préparés sur lapin contre ce fragment réagissent surtout avec le fragmentFab et plus faiblement avec le fragment Fc.

Analysé suivant la même méthode, le fragment du troisième pic n’a présentéaucune différence antigénique ou immunogénique avec le fragment du pic précédent,et, par immunodiffusion, nous n’avons pu voir aucune déficience antigénique. lueurspropriétés font donc penser aux fragments dimères et monomères F(ab’)2 et Fab’.

Dans le pic IV, le fragment possède une migration électrophorétique très rapide.Ses caractères antigéniques sont proches de ceux des fragments Fc’ et déficientspar rapport à lui. Il ne présente aucune antigénicité commune avec les chaîneslégères. Nous l’avons donc identifié comme le fragment pFc’ classiquement décrit.

Les peptides élués en fin de la chromatographie n’ont présenté aucune anti-génicité particulière.

5. - Propriétés des fragments F(ab’) ! et Fab’

Le caractère dimère du fragment F(ab’)2 est démontré par sa transformation

après réduction et alkylation en milieu non dissociant (NISONOFF, MARKUS et Wiss-

ig6i). Le fragment (i mg), dissous en tampon phosphate o,02 M

NaCl 0,15 M pH 6,8 (o,z ml), est réduit pendant 100 minutes en 2 mercapto-éthanol0,1 M à 370 C sous azote, puis alkylé en présence de o,2 M d’iodoacétamide. Unedeuxième préparation est réduite par le réactif de Cleland 0,01 M. Une troisième

préparation nous sert de témoin 5 S. Les trois échantillons sont soumis à une ultra-

centrifugation de 38 000 tours/mn pendant 26 heures, en gradient préformé desaccharose. La figure 4 montre que le coefficient de sédimentation du fragmentF(ab’)a passe de 5,1 S à 3,2 S après la réduction des liaisons disulfures. Ces valeurs,

légèrement différentes d’une expérience à l’autre, sont comparables à celles trouvéeslors des contrôles sur les fragments Fab’, et F(ab’),, à savoir 3,4 S et 5,o S pour unevaleur de 6,7 S attribuée à la molécule IgG native. Lorsque l’alkylation a été réaliséeavec l’iodoacétamide radioactive, le traceur se retrouve sur le fragment Fab’.

I;a comparaison des cartes peptidiques des hydrolysats trypsiques de ces deuxfragments n’a révélé aucune différence, ces cartes ayant été réalisées selon deuxélectrophorèses successives à pH q.,7 puis à pH 1,9 (fig. 5) ou bien par une électro-phorèse à pH 6,5 suivie d’une chromatographie descendante (fig. 9).

Par gel-filtration, profitant de la nécessaire différence de masse moléculaire,nous avons cherché à obtenir une séparation partielle des fragments !d’ de la chaînelourde et de la chaîne légère. Le fragment F(ab’)Z (50 mg) est réduit par le 2-mercapto-éthanol o,2 M pendant 2 heures à la température ordinaire en un tampon Tris-HCl 0,1 M pH 8,0, puis alkylé par l’iodoacétamide o,4 M. La solution est ensuite

passée sur colonne de Sephadex G-ioo équilibrée en acide propionique i M (fig. 6).Des quatre pics recueillis, la carte peptidique du troisième s’est révélée plus prochede celle des chaînes lourdes alors que le pic D présente une grande analogie avec leschaînes légères (fig. !). Par le calcul approché des masses moléculaires, nous avonstrouvé une valeur voisine de 3i 50o pour le fragment Fd’ (pic C de la fig. 6).

6. - Fragments et sous-classes

Nous avons cherché à savoir si l’apparition des fragments Fab’ et F(ab’)a pou-vait être liée à l’existence des sous-classes IgG1 et IgG,, en s’aidant du fait que lesdifférences entre les sous-classes sont plus marquées au niveau des liaisons disul-fures inter-chaînes lourdes (MILSTEIN, ig6g).

Sur les préparations des fragments radioactifs F(ab’)2 et Fab’ de la figure i,

nous avons réalisé une hydrolyse ménagée par la trypsine dans des conditions quinous permettent d’obtenir des fragments Fab et Fe à partir de la molécule d’IgGintacte : en tampon carbonate d’ammonium o,025 M pH 8,2, le fragment est soumis

à l’action de la trypsine pendant une heure à 370 C (rapport enzyme/substrat de1/50) puis à une chromatographie sur colonne de Sephadex G-ioo. Les résultatsde l’élution sont présentés sur la figure 8. Le clivage du fragment F(ab’)z ne permetd’obtenir qu’une faible quantité d’un fragment dont la masse moléculaire est voisinede 50 ooo et qui peut représenter l’analogue d’un fragment Fabt. Cependant, 83 p. 100du fragment F(ab’)a résiste à l’hydrolyse et garde son caractère dimère, même aprèsune seconde hydrolyse effectuée dans les mêmes conditions. I,a même opéra-

tion effectuée sur le fragment Fab’ ne semble pas modifier les caractères de

l’élution, les fragments Fab’ et Fabt devant avoir les mêmes encombrements sté-

riques. Dans les deux cas, des peptides radioactifs apparaissent en fin de chroma-tographie.

I,es cartes peptidiques de ces divers fragments ont été réalisées et les tachesradioactives repérées par autoradiographie (fig. g), découpées et comptées pour leurradioactivité 14C en liquide de scintillation. Le tableau i présente ces résultats en

pourcentage, uniquement pour les peptides dont la radioactivité dépasse 10 p. 100de l’activité totale de l’échantillon.

Une séparation partielle des fragments Fd’ et de la chaîne légère a été tentéesur le premier pic de la figure 8 (le fragment F(ab’)a) par réduction et alkylation desliaisons disulfures en milieu urée 8 M puis séparation sur Sephadex G-ioo en urée5 M, acide formique 0,05 M. L’autoradiographie des cartes peptidiques nous a permisde caractériser, au niveau du fragment Fd’, deux peptides (nos 3 et 4 du tableau i) quiporteraient la liaison disulfure vers la chaîne légère. Les autres peptides (n-- 6 et 7)porteraient les liaisons inter-chaînes lourdes. Le peptide 8 serait celui de la chaînelégère.

IV. - DISCUSSION ET CONCLUSION

Le clivage des immunoglobulines G porcines par la pepsine permet d’obtenirles fragments divalents F(ab’), décrits par NISONOFF et al. (ig6o). Cependant, pourenviron 13 p. ioo des IgG initiales, on voit apparaître un fragment Fab’ dont lamasse moléculaire est deux fois plus faible que celle du fragment précédent. Cesdeux fragments ont la propriété de fixer l’antigène. Ils ont des coefficients de sédi-mentation respectifs de 5,1 S et de 3,5 S. L’identité de ces fragments a été confirméepar les caractères d’antigénicité et d’immunogénicité qui sont ceux de la chaînelégère accompagnés de quelques déterminants de chaîne lourde. Ces caractèressont identiques pour les deux fragments.1/épuisement des sérums anti F(ab’)$ et anti Fab’ à l’aide du fragment tryp-

sique Fab laisse persister une faible activité anti fragment Fc. Donc, l’extrémitéC-terminale du fragment Fd’ qui comprend une partie, au moins, de la région char-nière de la chaîne lourde, possède une antigénicité propre qui est indépendante ducaractère monomère ou dimère du fragment. Cette région de la molécule est spé-cifique des sous-classes (MILSTEIN, ig6g), or nous n’avons pu mettre en évidenceaucune différence antigénique qui pourrait se rapporter aux sous-classes IgG¡ et

IgGs porcines. De la même façon, les cartes peptidiques et les profils de sédimentationdes deux types de fragments Fab’ obtenus, soit par la réduction de F(ab’)2’ soit parla chromatographie de l’hydrolysat pepsique des IgG, se sont révélés identiques.Cependant, les résultats obtenus chez le cobaye montrent que, seule, l’analyse dela composition en acides aminés met en évidence des différences entre les fragmentsF(ab’)2 des deux classes d’IgG (Lesiie, MELAMED et Cox!!rr, 1971). Ainsi, l’originede ce fragment Fab’ peut être liée à l’existence de plusieurs points de clivage sur lamolécule de substrat ou encore à l’hétérogénéité de ce substrat. 1/analyse effectuéesur les sous-classes purifiées permettrait de répondre à cette alternative.

Par réduction des liaisons disulfures puis par gel-filtration en milieu dissociant,nous avons pu séparer partiellement le fragment Fd’ de la chaîne légère et les carac-tériser par les cartes peptidiques. Contrairement aux résultats obtenus par UTsumiet Kr!xusx (1967) sur les IgG cuniculines, le fragment Fd’ est resté soluble dans nosconditions expérimentales. Cette méthode permet un abord plus direct de l’analysedu site actif des anticorps porcins, dans les mêmes conditions que pour les chaîneslégères (FRANEK, KEÍL et SORM, ig6g ; FRANEK, 1971).

Le marquage préalable de l’IgG sur les liaisons disulfures labiles montre que lefragment Fab’ provient surtout des molécules dont les liaisons disulfures ont étéréduites car la radioactivité spécifique de ce fragment est plus élevée que celle dufragment F(ab’)2; de même, le clivage par la trypsine est plus efficace sur les fragmentsles plus réduits. Or, la liaison entre la chaîne lourde et la chaîne légère est la pluslabile (METZGER et FOUGEREAU, n969). Ainsi, il nous a été possible de repérer surles cartes peptidiques de ces fragments, par autoradiographie, les peptides suppor-tant les principales liaisons disulfures intercaténaires de la molécule d’IgG deporc.

Ces études permettent une analyse de la région charnière des IgG porcines. Eneffet, cette région ne s’intègre pas dans les « domaines » (GA!,r, et !D!r;Nrnrr, i97o),mais elle joint en un pont flexible, deux fragments compacts : Fab et Fc (NoEr:x!rret al., ig6!). Elle est sensible aux attaques enzymatiques (SMITH et UTSUMI, 1967)et elle est différente selon la classe ou la sous-classe (MILSTEIN, 1969). Elle repré-sente donc une partie de la molécule intéressante du point de vue de l’évolution del’hétérogénéité des classes et des sous-classes dont la seule nécessité biologiqueapparente semble liée aux propriétés biologiques des anticorps mais non à la fonctionanticorps proprement dite.

Reçu pour publication en janvier 1972.

SUMMARY

THE STRUCTURE AND HETEROGENEITY OF IMMUNOGLOBULIN G PROTEINSOF THE PIG : STUDIES ON PEPSIN CLEAVAGE

The structure of pig immunoglobulin G proteins has been studied by analysis of fragmentsobtained by pepsin digestion. Three different preparations have been used : normal IgG notretained on DEAE-cellulose ; the same preparation after mild reduction and radioactive alky-lation in order to preferentially label the inter-chain disulphide bridges ; and finally a prepa-ration of purified anti-DNP antibodies. The physico-chemical and antigenic properties togetherwith the antibody activity of the fragments obtained permitted the characterization of theprincipal fragments F(abl ’2> its monomer (F(ab)’ as well as the pfc’piece. However evidence hasnot been obtained suggesting an increased fragility of one of the two sub-classes of IgG as sug-gested by other authors for pepsin or papain cleavage. Using gel-filtration under dissociatingconditions it has been possible to obtain a partial separation of the Fd’ fragments of the heavyand light chains. Peptide mapping of the different fragments has revealed those peptides car-rying the principal inter-chain disulphide bridges of pig IgG.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ANDREWS P., 1964. Estimation of the molecular weights of proteins by Sephadex gel-filtration. Bio-chem. J. 91, 222.BOURNE F. J., 1970. The Porcine immunoglobulins. Thèse de doctorat, Bristol, 1970.EISEN H . N., 1964. Preparation of purified anti 2-4 DNP antibodies. Methods in Med. res.

10, 94!FOUGEREAU M., 1966. Rôle des chaînes polypeptidiques de la molécule d’immunoglobuline y-G dans

l’expression de la spécificité anticorps : une nouvelle technique d’analyse du complexe haptène-anticorps.Ann. Biol. animale. Biochim. Biophys., 6, 189.FRANi&OElig; F., 1961. Dissociation of animal 7 S y-globulins by clivage of disulphide bonds. Biochem.

Biophys. Res. Communic. 4, 28.FRANkx F., 1966. On proteins. CI : Study of the polypeptide chain arrangement in pig y-globulin

through molecular and peptide map characteristics of individual polypeptide chains and higher sub-units. Collect. czechosl. chem. Communic., 31, 1142.FRANkx F., ZORINA O. M., 1967. On proteins. CX : Isolation and characterization of 7r and chains

representing structural types of pig Y-globulins light chains. Collect. czechosl. chem. Communie., 32, 3229.FRANKK F., KFIL B., SORM F., 1969. Variable structures in pig immunoglobulins X-chains.

F. E. B. S. Symposium, 15, 75.FRAN!K F., 1971. Aflinity labeling by m-nitrobenzenediazonium fluoroborate of porcine anti-dinitro-phenyl antibodies. Position of labeled tyrosine in the Y-chains. Europ. J. Biochem., 19, 176.GALL E. A., EDELMAN G. M., 1969. The antiboby problem. Ann. Rev. Biochem. 38, 415.JEFFERIS R., STANWORTH D. R., 1969. The relationship between the papain sensitivity of human

!y-G globulins and their heavy chain subclass. F. E. B. S. Symposium, Prague, 15, 213.LESLIE R. G. Q., MELAMED M. D., COHEN S., I97r. The products from papain and pepsin hydro-

lyses of guinea-pig immunoglobulins Yl-G and y.-G. Biochem. J., 121, 8z9.METZGER J.-J., FOUGEREAU M., I967 Caractérisation de deux sous-classes d’immunoglobulines y-G

chez le porc. C. R. Acad. Sei., Paris, 265, 724.METZGER J.-J., FOUGEREAU M., 1968. Caractérisations biochimiques des immunoglobulines G et M

porcines. Rech. vétér. 1, 37.METZGER J.-J., FOUGEREAU M., 1969. Heavy chain heterogeneity of y-G immunoglobulins in the pig.F. E. B. S. Symposium, Prague, I96g, 15, 187.METZGER J.-J., NOVOTNY J., FRANkx F., 1971. Heterogeneity of pig chains. F. E. B. S. Letters,

14, 237.METZGER J.-J., HOUDAYER M. I97z Europ. J. Immunol. (sous presse)MILSTEIN C., 1969. The variability of human immunoglobulin-G. F. E. B. S. Symposium, Prague 1969,

15, 43.NISONOFF A., WISSLER F. C., LIPMAN L. N., WOERNLEY D. L., I96o. Separation of univalent frag-ments from the divalent rabbit antibody molecule by reduction of disulfide bonds. Arch. Biochem.Biophys., 89, 230.

NISONOFF A., MARKUS G., WissLER F. C., rg6r. Séparation of univalent fragments of rabbit anti-body by reduction of a simple labile disulfide bond. Nature, 189, 293.NOELKEN M. E., NELSON C. A., BUCKLEY C. E., TANFORD ! C., Lg6’j. Gross conformation of rabbit

7 S y-globulins and its papain cleaved fragments. J. biol. Chem., 240, 218.NovoTNf J., FRANÙK F., KEIL B., SoRM F., 1969. Structural characteristics of pig immunoglo-bulins1t&dquo;chains. F. E. B. S. Symposium, Prague 1969, 15, 193.OUCHTERLONY O., r958. Diffusion in gels methods for immunological analysis. Progress in Allergy,

5, 1 et 6, 30.PORTER R. R., r959. The hydrolysis of rabbit y-globulins and antibodies with cystalline papain. Bio-

chem. J. 73, II9.RASMUSSEN B. A., rg6g!. Isoantigens of y-globulins in pigs. Science, 148, 1741.REjNEK J., KOSTKÀ J., TRAVNIÇEK J., 1966. Studies on the immunoglobulin spectrum of porcineserum and colostrum. Folia Microbiol. Tchecosl., 11, 173.SCHEIDEGGER J. J., 1955. Une microméthode de l’immunoélectrophorèse. Internation. Arch. Allergy,

7, 103.SMITH D. S., UTSUMI S., 1967. Structure at the hinge region in rabbit immunoglobulin-G. Nature,

216, 332.UTSUMI S., KnRUSx F., 1967. Chemical characterization of the peptic fragment of rabbit y-G immuno-

globulin.Biochemistry, 6, 2313.ZIKÀN J., BLAZEK J., CERNÀ J., 1970. Heterogeneity of pig IgG with respect to charge. in Deve-

lopmental aspects of antibody formation and structure. Prague-Slapy 1969. Eds. À terzl et Rihà, Academia,Prague, 1970.