Universidad de AntofagastaFacultad de Ciencias del Mar y Recursos Biológicos

Magister en Biotecnología

“Purificación de Proteínas Recombinantes (GFP)”

04 de Diciembre de 2015

Integrantes:Alejandra BravoLoreto CavieresRonald HuarachiProfesora: Ana MercadoCurso: CC4

2

IntroducciónLa proteína verde fluorescente (o GFP, por sus siglas en inglés, Green Fluorescent Protein)

es una proteína producida por la medusa Aequorea victoria que emite bioluminiscencia en

la zona verde del espectro visible. El gen que codifica esta proteína ha sido clonado y se

utiliza habitualmente en biología molecular como marcador (Prasher et al., 1992). La

estructura de la proteína verde fluorescente es de 238 aminoácidos, que forman once

cadenas beta, cuyo conjunto forma un cilindro, en el centro del cual se encuentra una

hélice alfa (Prendergast et al., 1978). Contiene un cromóforo especial (constituido por los

aminoácidos 65, 66 y 67), un grupo químico que absorbe y emite luz. Cuando la luz UV o

luz azul impacta sobre el cromóforo, éste toma la energía de la luz y se excita. En la fase

siguiente, el cromóforo se libera de la energía emitiendo luz en longitud de onda verde.

Una característica importante es que la GFP no necesita aditivos para brillar, en contraste

con la aequorina y otras proteínas bioluminiscentes. Si así fuera, moléculas energéticas

deberían ser inyectadas en las células en forma constante. En cambio, es suficiente con

irradiar la GFP con luz UV o azul para que emita fluorescencia.

Las proteínas fluorescentes, entre las cuales se encuentra la GFP, son muy versátiles y se

utilizan en diversos campos como la microbiología, ingeniería genética y fisiología,

permitiendo ver procesos previamente invisibles (Pérez et al., 2009).

En el práctico anterior se realizó la transformación de bacterias Escherichia coli

insertándoles el plásmido pGLO de Bio-Rad, que contiene el gen de la GPF. Estas bacterias

trasformadas sintetizan la GPF, ya que esta proteína es codificada por el gen que fue

insertado en ellas mediante la metodología de transformación génica.

Como muchas de estas proteínas no son liberadas al medio externo por las bacterias, es

necesario romper la pared celular, para así extraerlas y separarlas de otras proteínas. Para

realizar esto se utilizan enzimas como lisozimas, además de métodos de centrifugación,

sonicación, cromatografía.

3

En este laboratorio practico, se realizó la purificación de la proteína GPF por medio de

cromatografía de interaccion hidrofóbica (HIC), una técnica ampliamente utilizada en la

industria biotecnológica para la purificación y separación de proteínas. Este proceso se

basa en la interacción entre los grupos hidrofóbicos superficiales de las proteínas y los

grupos activos de la matriz cromatográfica, lo que permite la unión reversible de las

proteínas a la matriz. La elución se logra generalmente mediante una disminución de la

fuerza iónica en la fase móvil (Manh et al., 2009).

Para ello se utilizó el kit de BioRad “Green Fluorescent Protein Chromatography Kit”,

mediante el cual se purifica la GFP del lisado bacteriano, por las columnas cromatograficas

que proporciona el kit.

Debido a que la proteína fluorescente verde es extremadamente hidrófoba en

comparación con las proteínas bacterianas, le permiten ser purificada a partir de proteínas

de células bacterianas utilizando columnas de HIC. Cuando se coloca en un tampón que

contiene una alta concentración de sal, las moléculas de la matriz HIC se une

selectivamente a las GFP hidrófobas al tiempo que permite las proteínas bacterianas

pasen a través de la columna. Entonces, simplemente bajando la concentración de sal del

tampón provoca que la GFP pueda eluir de la columna en forma pura, para ser

visualizadas mediante luz UV.

4

Objetivos

Realizar la extracción y purificación de la proteína verde fluorescente, GFP, a partir de las colonias de Escherichia coli transformadas con el plásmido pGLO.

5

Metodología

Concentración bacteriana:

1. A partir de un tubo de ensayo con 2 mL de cultivo LB de Escherichia coli. con una pipeta, se transfirio 1 mL de cultivo líquido de E. coli a un Epperdorf, luego se colocó en centrífuga a 10000 rpm durante 5 minutos.

2. Se descartó el sobrenadante y se observó el pellet bajo luz UV

3. Se añadió 250 µL de la solución Buffer TE al tubo. Se resuspendió el precipitado a fondo pipeteando arriba y abajo varias veces.

6

4. Se añadió 1 gota de lisozima al pellet para iniciar la digestión enzimática de la pared celular de las bacterias. Luego se mezcló el contenido suavemente agitando el tubo, colocando la muestra en el congelador.

7

Fase 2: Lisis bacteriana.

1. Se retiró la muestra del congelador y se descongelo utilizando la calidez de la mano. Luego se colocó el tubo en la microcentrífuga y se sedimento el pellet a 10000 rpm por 5 minutos. Mientras se centrifugaba, se preparó la columna de cromatografía. Se quitó la tapa y el encaje de la parte inferior de la Columna de HIC. Todo el buffer pasó por la columna. (5-3 minutos).

2. Para la preparación de la columna cromatografía se añadió 2 mL de buffer de equilibración a la parte superior de la columna. Luego se escurrió el amortiguador a 1 mL en la columna. Se tapó la parte superior e inferior y se almaceno la columna a temperatura ambiente.

8

3. Después de quitar la muestra de la centrífuga, se examinó el tubo con la luz UV. Utilizando una nueva pipeta, se transfirió 250 µL del sobrenadante en un nuevo eppendorf, luego se añadió 250 µL de buffer binding al sobrenadante.

Fase 3: Purificación Cromatografica de proteínas.

1 . Se usaron tres tubos de recogida de 1, 2 y 3 y se colocó los tubos en bastidor de espuma. Se retiró las tapas de la parte superior e inferior de la columna y el lugar la columna en tubo de recogida 1.

9

2 Se transfirió 250 µL del sobrenadante sobre la parte superior de la columna. Y se dejó que el sobrenadante gotee por el lado de la pared de la columna. Después de que se detuvo el goteo se transfirió la columna al tubo 2

3 Con una pipeta, se añadió 250 µL de buffer Wash dejando que todo el volumen fluya en la columna, hasta detenerse el goteo, luego la columna se transfirió al tubo 3.

10

4 Se añadió 750 µL de Buffer TE y se dejó que todo el volumen fluyera en la columna.

5 Se examinaron los tres tubos de recogida, exponiéndolos a la luz UV.

11

Con la luz ultravioleta se observó la fluorescencia en el tubo 3 indicando la presencia de proteína GFP.

3 2 1

12

Resultados Luego de haber incubado los tubos a 32°C para el crecimiento bacteriano, se utilizaron

para el aislamiento y purificación de la proteína GFP. El primer paso a seguir fue la

centrifugación y que esta es una técnica que se utiliza para separar moléculas en base a

su tamaño con alta velocidad. De esta manera las células bacterianas formaron un pellet ,

el cual para verificar que contuviera la GFP, fue observado bajo luz UV. Porque si al

realizar este paso en el pellet no se pudiera observar la presencia de la GFP, sería inútil

realizar los siguientes pasos que conducían a la purificación de la proteína, si en la muestra

inicial no estaba contenida.

La aplicación del buffer TE se realiza ya que es un buffer de elución, que se utiliza para

resuspender la proteína y esta se reestructure.

13

Discusión

El contenido de los tubos de microcentrifuga que fluorecen en el

transiluminador corresponde a muestras, donde la proteína GFP se

encuentra presente. Esta proteína fue purificada (separada del resto de

contenido de la bacteria), mediante la técnica de cromatografía de

interacción hidrofóbica. Para determinar la concentración de proteína total

se debe cuantificar por espectrofotometría A 280nm o bien cargar las

muestras en un gel de poliacrilamida, para determinar la concentración de

estas.

14

Conclusión

La técnica de purificación de proteínas recombinante para GFP, es sencilla

y rápida para determinar si presencia de estás, mediante un

transiluminador. Si hay proteínas, fluorecen de color verde al estar en

contacto con luz UV.

Para complementar la técnica, se debe cuantificar el contenido de proteína

total y para determinar el tamaño de estás, se deber cargar a un gel de

poliacrilamida.

15

Referencias Mahn, A., Lienqueo, M. E., & Salgado, J. C. (2009). Methods of calculating protein

hydrophobicity and their application in developing correlations to predict hydrophobic interaction chromatography retention. Journal of Chromatography A, 1216(10), 1838-1844.

Pérez Millán, M. I., & Becú-Villalobos, D. (2009). La proteína verde fluorescente ilumina la biociencia. Medicina (Buenos Aires), 69(3), 370-374.

Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., & Cormier, M. J. (1992). Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene, 111(2), 229-233.

Prendergast, F. G., & Mann, K. G. (1978). Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea. Biochemistry, 17(17), 3448-3453.