Técnicas de Caracterización y

purificación

carga

hid

rofo

bic

idad

Propiedades de las proteínas utilizadas

para caracterizar y purificar

Carga

Tamaño

Forma

Actividad biologica

Hidrofobicidad

PM

Estabilidad relativa

Solubilidad

Punto isoelectrico

Salting-in / Salting-out / PH /Precipitación con (NH4)2SO

4

Fraccionamiento por campo eléctrico

(electroforesis)

Movilidad electroforética = Velocidad relativa a la

fuerza del campo electrico

f = coeficiente de friccion

Electroforesis en papel

“Proteinograma”

A PH = 8 - 9

Electroforesis en gel de poliacrilamida

(PAGE)

Tipos de Electroforesis

• PAGE Nativa

• PAGE Desnaturalizante (SDS , SDS+ condiciones reductoras, urea)

• Isoelectroenfoque

• Bidimensional

Electroforesis nativa

1 2 3 4

q/m = q/m = q/m = q/m

Efecto “colador”

Kr

Kr

PM nativo

t = tiempo de

incubación a

75C

t

SDS

PAGE SDS

La mayoría de las proteínas incorporan el SDS con una relación constante de

masa, de ahí que las moléculas en SDS tengan la misma densidad de carga,

por lo tanto :

Movilidad = 1/PM

Determinación de PM

Isoelectroenfoque

Resolución:

diferencia proteínas

que difieren en 0.02

unidades de pH en

sus pI

Bidimensional

Fraccionamiento basado en el coeficiente de

reparto

El coeficiente de reparto caracteriza la distribución de una sustancia

entre dos fases: la fase móvil y la fase estacionaria

K = Cs/Cm

Fases: liquido-liquido, liquido-solido

Fase estacionaria:

• Partículas de sólidos

• Partículas de sólidos con líquido

Contínua

Batch

Gradiente

Elución

Fases sólidas y estacionarias

Tipos de cromatografías

Intercambio iónico

•Técnica independiente de la forma, tamaño y PM

•Soportes: Celulosa, agarosa, vinilbenceno

•Antes hacer un desalado (diálisis, filtración en gel)

•En general elución por gradiente (de PH o con agentes caotrópicos)

Gradiente de pH

Gradiente de fuerza ionica

Filtración molecular o Exclusión

molecular

• Separa por distinto tamaño molecular (cutoff o limite de exclusion)

• Se puede usar para desalado

• Se puede usar para estimar PM

• Para purificación se usa generalmente hacia el final

Vt=v0+vi+vg

Vg=volumen ocupado por la matriz solida de gel

V0=volumen libre en el exterior de las partículas del gel(volumen de exclusion)

Vi=volumen del solvente retenido en los poros (volumen de inclusion)

ve

Cromatografía de fase reversa

•Se basa en “interacciones hidrofóbicas”

•La fase estacionaria son generalmente compuestos alifáticos de

distinta longitud de cadena (C4, C8, C16 etc)

•Elución por gradiente (usando mezclas de agua y solventes

orgánicos)

•Muy alta capacidad resolutiva (mezclando distintas propiedades

fisicoquimicas)

Cromatografía de Afinidad

•Reconocimiento de ligandos

•Alta resolución y especificidad ( disminuye mucho el numero de pasos

en la purificación)

•Alto tiempo de preparación

Fraccionamiento basado en propiedades

dinámicas

Fuerza centrifuga masa efectiva factor de flotacion

velocidad de desplazamiento Coeficiente de friccion

Sedimentación

La unidad Svedverg se refiere a 1 10-13 segundos

Tipos de protocolos en sedimentación

1. Centrifugación en un gradiente de densidad

Centrifugation zonal: se forma un gradiente de densidades

sirve para separa moléculas por tamaño y/o conformación: glicerol,

sacarosa. Proteínas, macromoléculas

Equilibrio de sedimentacion: velocidad lenta – la sedimentacion se

equilibra con la difusion

Sirve para separar moléculas que difieran en su densidad

(isopycnic centrifugation) Cl2Cs.

DNA, lipoproteinas. También Ficoll, Percoll para células

2. Centrifugación por velocidad:

Particularmente sensible a cambios de masa y de conformación molecular.

Se puede determinar S y el PM

Determinación de S

Técnicas de desalado

•Ultracentrifugación

•Diálisis

•Columnas de desalado

La purificación se realiza en una serie de

pasos usando distintas tecnicas a cada paso

Condiciones generales a evaluar

• Calidad (% de pureza del producto de acuerdo a mis

objetivos)

secuenciación, cristalización

ensayo de actividad, productos alimenticios médicos

nativa?

• Cantidad técnicas de alta capacidad y de baja capacidad

preparativas

analíticas

• Costos

Pasos a seguir en una purificación

1. Definir un ensayo específico que identifique a la proteína (actividad

biológica) (específico, sensible, rápido y barato)

2. Elegir la fuente (matriz biológica)

3. Extraer la proteína de la fuente (proteínas intraceluares o

extracelulares)

4. Estabilización de la molécula

5. Aislamiento y concentración (fraccionamiento)

6. Determinar la pureza y calidad del producto final

1 Actividad Biológica

Cantidad de proteína que produce, por su acción biológica, un determinado cambio.

Este cambio puede ser:

• Un efecto biológico (Muerte celular, hemólisis, protección inmunológica)

• Variación en la cantidad de una sustancia química (producto de una reacción)

De esta forma podemos definir a la unidad de actividad biológica como :

Una unidad de Actividad Biológica es la cantidad de proteína que produce una

determinada cantidad de “efecto”

1. Toxina

Una unidad de AB para una toxina es la cantidad de proteína que produce la

muerte del 23% de los ratones de tal especie (siguen especificaciones…)

2. Enzima

Una unidad de AB para una enzima es la cantidad de proteína que produce 5.98

moles de producto en 1 minuto en condiciones …(siguen especificaciones…)

2 Elección de la Fuente

Matriz donde se encuentra la proteína de interés

• Concentración

• Accesibilidad

• Costo

• Facilidad de la extracción

3 Extracción de la proteína de la fuente

Lisis osmótica: técnica muy suave. Uso de sn hipotónicas + fuerzas

mecánicas. Para bacterias y células vegetales: lisozimas u otras enzimas

Molienda: a. Morteros b. Batidoras. Uso de sustancias abrasivas

Ultrasonido: sonicador. Eleva mucho la temperatura de la muestra

4 Estabilización

Factores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento

1 PH

2 Grado de oxidación (-SH)

3 Presencia de Metales pesados. Sustancias Contaminantes

4 Polaridad y fuerza iónica de la solución

5 Presencia de proteasas

6 Temperatura

5 Actividad de la molécula

Monitoreo del proceso de fraccionado

• Actividad Específica AE = Unidades totales en la fracción i

Total de proteínas en la fracción i

• Rendimiento R = Unidades totales en la fracción i

Unidades totales en la fracción original

• Porcentaje de purificación P = AE en la fracción i

AE en la fracción original

Actividad vs Actividad específica

5 Aislamiento y concentración

Fraccionamiento del extracto crudo

• Implica una serie de pasos en los cuales se aprovechan

propiedades fisicoquímicas o biológicas de la proteína de interés

para separarla del resto de las moléculas

• Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar el

rendimiento en la purificación, pureza y actividad específica de cada

fracción obtenida.

• Si bien no hay una sola secuencia de técnicas a seguir, en general

se recomienda empezar por técnicas de alta capacidad y seguir con

las de baja capacidad.

• En general se desea obtener una gran pureza (según los

objetivos) acompañada de un gran rendimiento.

Solubilidad diferencial

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de absorción

Cromatografía de exclusión molecular

Cromatografía de afinidad

Electroforesis

Isoelectroenfoque

Resolución Capacidad

La purificación se realiza en una serie de

pasos usando distintas tecnicas a cada paso

Rendimiento = actividad (i)/actividad(1) x 100

purificacion = act. sp (i)/act. Sp.(1) =2300 veces