Produccion de Proteinas Recomibinantes

Revista Mexicana de Ingeniera Qumica

CONTENIDO

Volumen 8, nmero 3, 2009 / Volume 8, number 3, 2009

213 Derivation and application of the Stefan-Maxwell equations

(Desarrollo y aplicacin de las ecuaciones de Stefan-Maxwell)

Stephen Whitaker

Biotecnologa / Biotechnology

245 Modelado de la biodegradacin en biorreactores de lodos de hidrocarburos totales del petrleo

intemperizados en suelos y sedimentos

(Biodegradation modeling of sludge bioreactors of total petroleum hydrocarbons weathering in soil

and sediments)

S.A. Medina-Moreno, S. Huerta-Ochoa, C.A. Lucho-Constantino, L. Aguilera-Vzquez, A. Jimnez-

Gonzlez y M. Gutirrez-Rojas

259 Crecimiento, sobrevivencia y adaptacin de Bifidobacterium infantis a condiciones cidas

(Growth, survival and adaptation of Bifidobacterium infantis to acidic conditions)

L. Mayorga-Reyes, P. Bustamante-Camilo, A. Gutirrez-Nava, E. Barranco-Florido y A. Azaola-

Espinosa

265 Statistical approach to optimization of ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae in the

presence of Valfor zeolite NaA

(Optimizacin estadstica de la fermentacin etanlica de Saccharomyces cerevisiae en presencia de

zeolita Valfor zeolite NaA)

G. Inei-Shizukawa, H. A. Velasco-Bedrn, G. F. Gutirrez-Lpez and H. Hernndez-Snchez

Ingeniera de procesos / Process engineering

271 Localizacin de una planta industrial: Revisin crtica y adecuacin de los criterios empleados en

esta decisin

(Plant site selection: Critical review and adequation criteria used in this decision)

J.R. Medina, R.L. Romero y G.A. Prez

Revista Mexicanade Ingeniera Qumica

1

Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingeniera Qumica, A.C.

Volumen 10, Numero 2, Agosto 2011

ISSN 1665-2738

1Vol. 10, No. 2 (2011) 209-223

PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES EN Escherichia coli

RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTION IN Escherichia coliAlvaro R. Lara

Departamento de Procesos y Tecnologa Universidad Autonoma Metropolitana-Cuajimalpa Artificios 40, Col.Hidalgo, Delegacion Alvaro Obregon, Mexico, D. F., C.P. 01120

Recibido 11 de Febrero 2011; Aceptado 11 de Abril 2011

ResumenLa produccion de protenas recombinantes (PR) es una de las aportaciones mas importantes de la biotecnologamoderna. El hospedero bacteriano mas importante para la produccion de PR es Escherichia coli, aunque otros comoBacillus subtilis y Bacillus megaterium estan cobrando cada vez mas importancia. Debido a su impacto economicoy en el sector de la salud humana, el presente trabajo se enfocara principalmente a la produccion de PR terapeuticasen E. coli. Se abordaran en general los aspectos de diseno del vector, la cepa, el cultivo y la purificacion de laPR, con enfasis en las oportunidades que la ingeniera metabolica ofrece para mejorar la produccion de PR y lasestrategias de cultivo.

Palabras clave: protena recombinante, Escherichia coli, ingeniera metabolica, biorreactores.

AbstractRecombinant proteins production (RP) is one of the most important contributions of modern biotechnology.The most important bacterial host for RP production is Escherichia coli, although Bacillus subtilis and Bacillusmegaterium are also gaining importance. Due to its economical relevance and impact on human health, the presentreview is focused on the production of RP in E. coli. General aspects of vector design, strain selection as well ascultivation and downstream processing are covered. Particularly, the opportunities to improve cultivation schemesand downstream through metabolic engineering are discussed.

Keywords: recombinant proteins, Escherichia coli, metabolic engineering, bioreactors.

1 Introduccion

La produccion de PR en bacterias es unatecnologa que surgio hace cerca de 30 anos yrespondio a una necesidad de proveer protena deuso terapeutico con un abasto asegurado (que nodependiera de fuentes animales) y calidad constante.La primera PR aprobada para su uso en humanos fuela insulina humana producida en Escherichia coli porla empresa Genentech. Desde entonces, la tecnologade produccion de PR ha tenido un avance muyimportante. Hasta el ano 2010, el numero de productosbiofarmaceuticos aprobados por la Administracion deAlimentos y drogas de los EUA (FDA) sumaba mas

de 200, de los cuales la gran mayora son PR (Walsh,2010). La importancia economica de las PR de usoterapeutico es innegable: las 10 PR de mayor ventadurante 2009 sumaron un total de 50,000 millones dedolares en ventas (Walsh, 2010), lo que representa casila mitad de las reservas internacionales de Mexico al15 de septiembre de 2010.

Muchas de las PR terapeuticas requierenmodificaciones post-traduccionales que no puedenser llevadas a cabo por cepas bacterianas silvestres,por lo que son preferentemente producidas por celulaseucariontes superiores. A pesar de ello, la bacteria E.

Autor para la correspondencia. E-mail: [email protected]

Publicado por la Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingeniera Qumica A.C. 209

Alvaro R. Lara./ Revista Mexicana de Ingeniera Qumica Vol. 10, No. 2 (2011) 209-223

coli sigue siendo una plataforma ampliamente usadapara la produccion de PR, ya que presenta una seriede ventajas importantes (Demain y Vaishnav, 2009):i) su genoma es conocido desde hace varios anos, loque ampla considerablemente las posibilidades de sumanipulacion genetica, ii) existe una gran cantidadde conocimiento acumulado sobre su fisiologa ymetabolismo, iii) se tienen varios vectores bienestablecidos para la produccion de PR, iv) puedecrecer rapido en medios muy simples, con altosniveles de produccion de PR. Actualmente, cerca del30 % de las PR de uso terapeutico son producidasempleando E. coli (Ferrer-Miralles y col., 2009), lasmas importantes pueden consultarse en la tabla 1. Deun total de 58 productos aprobados por la FDA en elperiodo 2006-2010, 17 son producidos usando E. coliy 32 empleando celulas de mamfero (Walsh, 2010).Una vision global de los aspectos involucrados en la

produccion de protena recombinante por bacterias semuestra en la Fig. 1. Dichos aspectos se abordaran alo largo del presente trabajo.

2 Vectores de expresionLa informacion genetica de la protena a producirusualmente se inserta en un vector (plasmido) deexpresion. Los elementos esenciales de un vector deexpresion para bacterias se muestran en la Fig. 2. Eltamano del plasmido es muy variable. En general,se prefieren plasmidos de alto numero de copias (porarriba de 500 copias por celula). El numero de copiases, en principio, funcion del origen de replicaciondel plasmido (aunque las condiciones ambientales delcultivo y el estado fisiologico de la bacteria tienen unafuerte influencia sobre el numero de copias -Sayadi ycol., 1989-).

Tabla 1. Principales protenas recombinantes de uso terapeutico producidas por E. coli(adaptada de Graumann y Premstaller, 2006).

Molecula Observaciones Companas productoras

Activador del tejido del plasminogeno Forma cuerpos de inclusion RocheInsulina humana y analogos Forma cuerpos de inclusion Eli Lilly, Aventis, Probiomed

Hormona de crecimiento humano Forma cuerpos de inclusion o esacumulada en periplasma

Genentech, Eli Lilly, Pfizer, NovoNordisk, Probiomed y otros

Analogo pegilado de hormona decrecimiento humana

Pegilacion aleatoria Pfizer

Hormona paratiroidea humana Forma cuerpos de inclusion Eli LillyCalcitonina de salmon Secretada Unigene

Factor estimulante de la coloniade granulocitos, pegilado

Forma cuerpos de inclusion,pegilacion N-terminal

Amgen

Interferon -2a pegilado,interferon -2b

Pegilacion aleatoria Hoffmann-La Roche, Schering

Interferon alfacon-1 Forma cuerpos de inclusion ValeantInterferon -1b Forma cuerpos de inclusion Schering AG, ChironInterferon -1b Forma cuerpos de inclusion Genentech, Intermune

Antagonista del receptor deinterleucina-1

Amgen

Interleucina-2 ChironToxina de fusion de la difteria Seragen / Ligand

Interleucina-11 Genetics InstituteLipoprotena r OspA Lipoprotena SmithKline Beecham

Peptido natriuretico tipo B Forma cuerpos de inclusion Scios/ Johnson & JohnsonFactor de necrosis TNF Boehringer Ingelheim

Toxina pertussis Componente de vacunacombinada

Chiron

Subunidad B de la toxina delcolera

SBL Vaccine

Asparginasa Componente de vacunacombinada

Merck

210 www.rmiq.org


DISEO DEL VECTOR:

-Nmero de copias

- Promotor

-Presin de seleccin

SELECCIN DE LA CEPA PRODUCTORASELECCIN DE LA CEPA PRODUCTORA:

-Altos niveles de produccin

-Buen desempeo en el proceso

M difi d f ilit l ifi i-Modificada para facilitar la purificacin

CULTIVO BACTERIANO:

-Diseo ptimo del medio

-Alta densidad celular

-Estrategias de operacin

PURIFICACIN:

R l l-Ruptura celular

-Separacin de protenas bacterianas

-Eliminacin de endotoxinas

Fig. 1. Principales pasos involucrados en laproduccion de protena recombinante.

Generalmente se asume que un alto numero de copiasdel plasmido resulta en un alto numero de copias delgen de interes, y por lo tanto, la cantidad de PRproducida sera mayor cuanto mayor sea el numero decopias. Modificaciones al origen de replicacion depMB1 (por ejemplo, la familia de plasmidos pUC)son muy empleadas en la produccion de PR. Sinembargo, el empleo de plasmidos con alto numerode copia tambien induce una alta carga metabolica

para la celula (observada como una reduccion enla velocidad de crecimiento y en el rendimiento debiomasa en sustrato). Tambien se ha observadoque una alta concentracion de ARN mensajero pudeconducir a destruccion de los ribosomas y muertecelular (Baneyx, 1999). Un numero de copias menoral de los plasmidos pUC puede favorecer una mayorproduccion de PR (Jones y col., 2000). En este punto,tambien influyen factores como la estabilidad del ARNmensajero (Carrier y col., 1998).

En todo caso, debera encontrarse el nivel deexpresion optimo para la PR producida en una cepade E. coli en particular, lo cual tambien dependeradel promotor empleado. El promotor a emplear debeser cuidadosamente seleccionado con el fin de poderregular la intensidad de induccion. Una expresion muyalta del gene heterologo puede conducir a la formacionde cuerpos de inclusion (agregados intercelularesde protena), que pueden ser una ventaja para lapurificacion de PR, pero que tambien requieren pasosadicionales en la purificacion, ademas de requerirrecuperar el plegamiento adecuado de la PR antes dela formulacion del producto final.

Existen varios promotores que han sido usadosen experimentos de laboratorio, muchos de los cualesson poco practicos para la produccion industrial dePR. La Tabla 2 muestra algunos ejemplos de lospromotores mas comunes. Un problema encontradocon varios de estos promotores es la expresion basal(expresion del gene heterologo en condiciones noinducidas). Idealmente el promotor a usar deberaser completamente regulable, muy fuerte, con unaexpresion basal mnima, a la vez que permitieradiferentes grados de induccion, preferentemente

P

SUR

R P SD GeneHeterlogo TT AmpR Ori35 10

P

Codndeinicio Codndeparo

Fig. 2. Estructura general de un vector de expresion bacteriano. Como ejemplo se muestra el promotor hbridotac. El regulador (R) ejerce su efecto sobre el promotor (P), cuyas secuencias -10 y -35 estan separadas por unespaciador de 17 bases. La flecha indica la direccion de la transcripcion. El sitio de union a ribosoma (SUR)consiste de la secuencia Shine-Dalgarno (SD) seguida de un espaciador rico en A+T cuya longitud optima es de 8bases, que preceden al gen heterologo. La secuencia de termino de la transcripcion (TT) es necesaria para estabilizarel ARN mensajero. La resistencia a antibiotico (ampicilina, AMP) facilita la seleccion de celulas transformadas.Ori representa el origen de replicacion del vector. (Adaptado de Palomares y col., 2004).

www.rmiq.org 211


Tabla 2. Promotores mas comunes empleados para la produccion de PR. (Adaptado de Jana y Deb, 2005).

Promotor Regulacion Induccion* Desventajas

lac (lacUV5) lacI, lacIq IPTG, termica Bajo nivel de expresion relativo a otros sistemas.Expresion de fuga

trp Agotamiento detriptofano, IAA

Expresion de fuga

tac lacI, lacIq IPTG, termica Expresion de fuga.pL cIts 857 Termica La induccion necesita de temperaturas altas (> 40 C).

Es difcil lograr una induccion parcial.T7 lacI, lacIq IPTG, termica Expresion de fuga. Es difcil lograr altas densidades

celulares.PhoA phoB, phoR Agotamiento de

fosfatosNo es titulable, limita las opciones de formulacion demedio de cultivo.

Ara araC L-arabinosa Existen pocos vectores disponibles. La glucosa reprimecatabolicamente la induccion.

*IPTG: Isopropil -D-1 tiogalactopiranosido, IAA: acido indolacrlico

mediante un cambio en las condiciones de cultivo, paraminimizar efectos toxicos y maximizar la formacionde PR. Mientras que los promotores lac y trp sehan usado para experimentos de laboratorio durantemucho tiempo, son poco habituales a escala industrial.El promotor lac requiere la adicion de un inductorque no es metabolizado (IPTG) y que es altamentetoxico. Esto representa una gran desventaja paraprocesos industriales, ya que se debe garantizarque dicho inductor sea completamente eliminado delproducto, y ademas no debe ser enviado a aguasresiduales municipales. En el caso del promotortrp (al igual que el promotor PhoA), la induccionocurre cuando se agota un nutriente (triptofano enel caso del primero, fosfatos en el segundo caso).Esto dificulta el control de la fisiologa bacterianay determinar el momento preciso de la induccion.Tambien impone una restriccion en la formulacionde los medios de cultivo. En el caso de que seaplique un inductor metabolizable, como la arabinosa,el cultivo esta sujeto a adaptar su metabolismo a dichafuente de carbono, que puede no ser la optima para laproduccion de una PR (Sorensen y Mortensen 2005).

Un promotor mas atractivo para aplicacionesindustriales es el promotor pL/pR del fago lambda.Este promotor esta regulado por la protena cI857,que impide efectivamente la transcripcion de los genesbajo control de pL/pR a temperaturas por debajo delos 37 C. Dada la naturaleza termolabil de cI857,cuando la temperatura se incrementa (normalmente a42 C), la expresion es muy potente (Valdez-Cruz ycol., 2009).

El empleo del promotor pL/pR permite obteneraltas densidades celulares (concentraciones de

biomasa mayores a 40 g/L, medidas como pesoseco), manteniendo el nivel de expresion del geneheterologo a un nivel despreciable (normalmentecuando las temperaturas del cultivo estan entre 28y 32 C). El incremento de temperatura es unaoperacion sencilla a varias escalas de produccion ypermite manipular con exactitud el momento de lainduccion (por ejemplo, una vez alcanzada una ciertadensidad celular) sin agregar elementos secundariosal medio de cultivo, con la consecuente reduccion decostos. Aunque el incremento de temperatura es maslento a medida que aumenta la escala del biorreactor,un calentamiento mas lento puede de hecho favorecerla produccion de PR (Caspeta y col., 2009). Unade las desventajas de la induccion por temperaturaes que las celulas necesariamente experimentan unestres fisiologico conocido como choque termico, queconduce a respuestas generalizadas en el fluxoma,metaboloma y transcriptoma de E. coli (Wittmann ycol., 2007) y que limitan el crecimiento y las funcionescelulares una vez que se ha iniciado la induccion.

Existen ademas promotores inducibles atemperaturas bajas (maxima actividad a 20 C)derivados de pL (Lim y col., 2000). Estos promotores,aunque mucho menos estudiados, pueden resultaratractivos para su aplicacion industrial, debido a que seacoplaran los siguientes beneficios: el cultivo puedeoperarse a una temperatura optima para el crecimientode E. coli (37C), y una vez alcanzada la densidadcelular deseada, la temperatura puede reducirseconduciendo a la expresion del gen heterologo. Lasolubilidad del oxgeno es 33 % mayor a 20 C quea 37 C, lo que resulta ampliamente benefico paraaumentar la transferencia de oxgeno al biorreactor,

212 www.rmiq.org


siendo esta una de las principales limitaciones en loscultivos de alta densidad celular, como se explicaramas adelante. Por otra parte, ha sido propuesto queaunque la velocidad de transcripcion y traducciones menor a bajas temperaturas, la velocidad deplegamiento de la protena es practicamente la mismaa 20 C que a 37 C, lo que sera benefico para producirprotenas correctamente plegadas y evitar la formacionde cuerpos de inclusion.

El gene heterologo debe ser optimizado para suexpresion en la bacteria, principalmente en el uso decodones y sobre-expresando ARNs de transferenciapoco comunes. El ARN mensajero es una molecula devida media muy corta, especialmente en E. coli, dondepuede degradarse en menos de 20 s (Wang y col.,2004). Es posible incrementar la estabilidad del ARNmensajero alterando su conformacion y eliminando laexpresion de nucleasas como la RNAsa III (Sorenseny Mortensen, 2005).

Normalmente el plasmido de expresion contieneun gene que proporciona resistencia a antibiotico (enel ejemplo de la Fig. 2, resistencia a ampicilina).Esto permite emplear una presion de seleccion paraasegurar que se cultivan unicamente las celulas quecontienen plasmidos, ya que debido a efectos desegregacion, el plasmido podra perderse y las celulaslibres de plasmido creceran mas rapido (al carecerde la carga metabolica impuesta por el plasmido),desplazando a las celulas portadoras del mismo, con laconsecuente perdida de productividad. Sin embargo,la expresion del gene de resistencia al antibiotico esprobablemente el origen principal de carga metabolica(Rozkov y col., 2004). Con la finalidad de reducirla carga metabolica, se han desarrollado sistemas quepermiten seleccionar durante el cultivo a las celulasportadoras de informacion genetica, contenida en elplasmido, que complemente alguna auxotrofa, porejemplo, a algun aminoacido (Cranenburgh y col.,2001; Vidal y col., 2008). Dichas estrategias hanmostrado ser muy eficientes, y tambien resultan en unareduccion de costos en los cultivos industriales.

3 Seleccion de la cepa deproduccion

Un paso importante para alcanzar altasproductividades consiste en la seleccion de la cepade produccion adecuada. Para ello deben considerarseaspectos cineticos, el genotipo y el fenotipo de lascepas. En general se buscan cepas con baja tasa demutacion o de insercion de secuencias provenientes

del plasmido. Las cepas derivadas de E. coli K-12y E. coli B son las mas empleadas. Los avances enel conocimiento de la fisiologa de E. coli y en eldesarrollo de herramientas moleculares han permitidola obtencion de cepas disenadas especficamente parala produccion de protena recombinante. En particular,la cepa BL21 es preferida en el ambito industrial.Ademas de carecer de las proteasas Lon y Omp-t (locual reduce considerablemente la degradacion de laPR dentro de la bacteria), produce bajas cantidadesde acetato (un subproducto metabolico altamenteindeseable del que se hablara mas adelante), lo queresulta ampliamente atractivo (Phue y col., 2005).Otras cepas derivadas de BL21 incluyen versionescarentes de la RNAsa E (BL21 Star-pLysS), versionesdisenadas para incrementar la produccion de PR querequieren el uso de codones raros en E. coli (cepadenominada Rosetta) y versiones que contienen copiasextra de los genes argU, ileY y leuW que codificanpara ARNs de transferencia y que reconocen codonespoco usuales en E. coli (cepa denominada BL21-CodonPlus). La cepa AD494 es una mutante de K-12 en la tioredoxina reductasa (trxB) que permite laformacion de enlaces disulfuro en citoplasma, queusualmente son reducidos en E. coli, lo que es uncuello de botella para el plegamiento de las PR. Lacepa Origami (tambien derivada de K-12) contieneademas una mutacion en la glutationa reductasa(gor), para facilitar mas la formacion de enlacesdisulfuro (Sorensen y Mortensen 2005; Graumanny Premstaller, 2006).

Todas las cepas modificadas que se hanmencionado estan disponibles comercialmente. Laeleccion de una cepa en particular dependera devarios factores, incluyendo el tamano de la PR aproducir, la presencia de enlaces (o puentes) disulfuro,la posibilidad de optimizar el uso de codones, entreotros. Es importante senalar que en los ultimos anosha existido una intensa investigacion para mejorarlas capacidades de produccion de PR en cepas de E.coli mediante ingeniera metabolica. Ese punto seratratado mas adelante.

Las bacterias Gram-positivas como Bacillussubtilis y Bacillus megaterium tambien se han usadopara la produccion de PR. De hecho, B. subtilis es muyimportante en la produccion industrial de proteasasy de algunas vitaminas. Al carecer de membranaexterna, estas bacterias pueden secretar una grancantidad de protenas plegadas al medio extracelular ycontienen una baja cantidad de pirogenos (Fu y col.,2007). Sin embargo, los plasmidos recombinantesson poco estables en B. subtilis, y los rendimientos

www.rmiq.org 213


de PR son menores que en bacterias Gram-negativas,principalmente debido a la alta actividad de proteasas,cuya produccion aumenta cuando B. subtilis encuentracondiciones de estres (Huang y col., 2003), quetambien pueden conducir su esporulacion. A pesar delas ventajas que dichas bacterias pueden tener en laproduccion de PR, es poco probable que en el cortoplazo sean relevantes para el mercado farmaceutico.Por el contrario, su importancia en la industria deenzimas y qumica fina probablemente crezca.

4 Cultivo bacterianoPara maximizar la productividad de PR, se prefierealcanzar altas densidades celulares en el biorreactor.En un biorreactor de escala de laboratorio, se puedenalcanzar rutinariamente densidades mayores a los100 g/L de biomasa empleando las condiciones decultivo adecuadas. Existen, sin embargo, limitacionesen la escala industrial que hacen que valores tan altosde biomasa no sean alcanzables. Se ha acumuladouna considerable experiencia en el cultivo de E.coli, lo que ha permitido mejorar notoriamente lasproductividades de los cultivos. La Tabla 3 resumealgunos de los valores mas altos de PR producidaen cultivos de E. coli. A pesar de los considerablesavances, hay todava muchas dificultades tecnicas quesuperar. Enseguida se detallan algunos de los aspectosmas importantes para el diseno y operacion de cultivosde alta densidad celular de E. coli.

4.1 Medio de cultivo

El medio de cultivo debe estar balanceado parala produccion de biomasa y PR. Para ello, debe

tomarse en cuenta la composicion de la biomasa.Los principales componentes incluyen la fuentede carbono, nitrogeno, fosforo, azufre, potasio, ymagnesio. Es necesario tambien incluir cofactoresenzimaticos como Mb, Co, Ni, Fe, Ca, Cu, Mn, entreotros. Los factores de crecimiento como la tiaminason necesarios para un adecuado crecimiento. Aunqueen cultivos en matraz agitado se agregan mono y difosfato de potasio para formar un amortiguador depH, esto no es necesario en cultivos en biorreactor,en los que el pH es controlado mediante la adicionde acido o base. Tambien debe observarse que variosde los componentes del medio pueden resultar toxicosa ciertas concentraciones; por ejemplo, el amonio estoxico a partir de 3 g/L (Shiloach y Fass, 2005). Estacantidad de amonio puede ser limitante para cultivosde alta densidad celular si se agrega en su totalidadal inicio del cultivo. Sin embargo, el pH puedecontrolarse con hidroxido de amonio, que ademas deservir como base es una fuente de amonio facilmenteasimilable, reduciendo con ello la acumulacion deiones amonio. El medio de cultivo puede contenerfuentes complejas de nitrogeno, como extracto delevadura o casaminoacidos. No obstante, existe unaclara tendencia a eliminar el uso de componentescomplejos, ya que no permiten un control adecuado dela fisiologa, y reducen la reproducibilidad del cultivo.

Tomando en cuenta un rendimiento de biomasatpico de 0.5 g biomasa/g glucosa, se requeriranal menos 200 g/L de glucosa para llegar a unaconcentracion celular de 100 g/L. La glucosa es toxicaa concentraciones superiores a los 50 g/L, por lo queno puede emplearse una concentracion de glucosainicial tan alta (Shiloach y Fass, 2005; Lara y col.,2008). Por otro lado, la produccion de acetato debida

Tabla 3. Algunas de las mayores concentraciones de PR alcanzadas en cultivos de alta densidad celular de E. coli(adaptada de Choi y col., 2006).

Protena Cepa Condicion de cultivo y Concentracion Referenciafuente de carbono alcanzada

Protena verdefluorescente

W3110PTS GalP+

Alimentacion exponencial,glucosa, extracto de levadura

25 g/L Lara y col. (2008)

Factor decrecimiento ILGF-2

BL21 (DE3) pH-stat, medio R, glucosa,extracto de levadura

9.7 g/L Hu y col. (2004)

Protenamorfogeneticade hueso

TG1 Alimentacion exponencial,medio definido, glucosa,cuerpos de inclusion

8.6 g/L Vallejo y col. (2002)

Protena verdefluorescente

W3110PTS GalP+

Lote, glucosa (100 g/L),extracto de levadura

8.3 g/L Lara y col. (2008)

Aminolevulinatosintetasa

MG1655 Lote, medio LB consuplemento optimizado

5.2 g/L Xie y col. (2003)

214 www.rmiq.org


a altas velocidades de consumo de glucosa impedirallegar a altas densidades celulares. Para evitar esto, sehan desarrollado modos de operacion del cultivo masapropiados.

4.2 Transferencia de oxgeno al biorreactor

Los cultivos de E. coli para la produccion de PR sonllevados a cabo bajo condiciones aerobias. De estamanera se obtienen mayores rendimientos de biomasay producto, debido a que la generacion de energaes mayor que bajo condiciones anaerobias. Ademas,bajo condiciones anaerobias la glucosa o fuente decarbono es oxidada solo parcialmente por E. coli,lo que conlleva a la acumulacion de subproductosde fermentacion acido-mixta, que resultan toxicos.La demanda de oxgeno para la oxidacion completade glucosa a CO2 es una funcion directa de lavelocidad de crecimiento de la bacteria conocida comovelocidad especfica de consumo de oxgeno (qO2 ). Lavelocidad de consumo de oxgeno (VCO) en un cultivose obtiene multiplicando la velocidad especfica deconsumo por la concentracion de biomasa:

VCO = qO2 X (1)Para evitar que la bacteria este limitada por oxgeno,se requiere suministrar oxgeno al biorreactor a unavelocidad que sea al menos igual que la velocidadde consumo. La velocidad de transferencia deoxgeno (VTO) al biorreactor es una funcion demuchas variables de operacion del biorreactor, comola velocidad de agitacion, potencia volumetricasuministrada, constante de transferencia de masa(kLa), temperatura, presion, composicion del gas deentrada al biorreactor, entre otros.

Los parametros operacionales como la velocidadde agitacion no se pueden incrementar mas alla deun lmite economicamente permisible, por lo que laVTO en biorreactores normalmente no excede los 0.15mmolO2/g h (Knoll y col., 2007). Esta VTO permitiramantener condiciones aerobias a un cultivo de E. colide no mas de 40 g/L, creciendo a una velocidad de0.4 h1. Evidentemente, la VTO de los biorreactoresconvencionales no permitira el desarrollo de altasdensidades celulares en cultivos de E. coli. Paramantener condiciones aerobias en un biorreactor sepuede recurrir a otras estrategias. Por ejemplo,emplear aire enriquecido con oxgeno u oxgeno puropara aumentar la solubilidad del oxgeno y con ellola VTO. Tambien se puede manipular parametrosoperacionales del biorreactor para incrementar lasolubilidad del oxgeno. Por ejemplo, se ha reportado

una VTO de casi 1 mol O2/L h en un biorreactoroperado a una presion de 10 bar (Knoll y col., 2007).Se ha demostrado que el uso de presiones elevadasen los biorreactores no afectan la fisiologa ni laproductividad de cultivos de E. coli recombinante(Lara y col., en prensa). La VTO maxima delbiorreactor puede llegar a ser el parametro quedetermine la biomasa alcanzable. Tambien puedemanipularse la fisiologa del cultivo para reducir laVCO, como se explica mas adelante.

4.3 Modo de operacion y sobreflujometabolico

Como se menciono anteriormente, la produccion deacetato bajo condiciones aerobias es un problemaconstante en los cultivos de E. coli. La produccionde acetato es indeseable ya que representa un derrochede esqueletos carbonados, afecta el pH y el gradientede protones transmembranal, entre otros efectos. Porejemplo, en la Fig. 3, se muestra la drasticadisminucion en el contenido de plasmido de celulasde E. coli como resultado de acumulacion de acetato(Lara y Ramrez, en prensa).

La produccion de acetato bajo condicionesaerobias se atribuye a un desbalance entre losflujos de carbono proveniente de glucosa (la cual estransportada a traves del sistema de fosfotransferasa,PTS) en la glicolisis y el ciclo de los acidostricarboxlicos, lo que conduce a una acumulacionde acetil coenzima A, la cual se transforma aacetato que se transporta hacia afuera de la celula(De Anda y col., 2006). En la Fig. 4 puedenverse detalles de estos procesos metabolicos. Estefenomeno de produccion de acetato es conocido comosobreflujo metabolico. Una manera de evitar elsobreflujo metabolico es restringir la velocidad deconsumo de glucosa mediante la adicion controladade una solucion concentrada al biorreactor. Estopuede hacerse mediante esquemas de alimentacionconstante, alimentacion con incremento lineal, conincremento exponencial, o empleando algoritmos decontrol mas sofisticados para controlar el consumomediante efectos indirectos del metabolismo, como lavariacion de la tension de oxgeno disuelto (TOD) o elpH.

Un enfoque diferente ha permitido eliminar elacetato producido por E. coli mediante el uso demembranas semi-permeables (enfoque denominadocomo biorreactor con dialisis). Con esta tecnica se halogrado la produccion de mas de 190 g/L de biomasa(Fuchs y col., 2002). Este enfoque, sin embargo, no

www.rmiq.org 215


Fig. 3. Contenido especfico de plasmido en funciondel acetato acumulado en un cultivo de E. coli porlote alimentado bajo condiciones aerobias y a pHconstante.

Glucosa Acetato

PTS

G6PPEP Pir

G6P

2 PEPAcetato

2 PEP

AcCoA

CATCAT

Fig. 4. Esquema simplificado del metabolismoaerobio de E. coli mostrando la produccion deacetato. La glucosa es transportada y simultaneamentefosforilada a glucosa-6-fosfato (G6P) traves delsistema de fosfotransferasa (PTS), el cual transfiereun grupo fosfato del fosfoenol piruvato (PEP), el cualse convierte en piruvato (Pir). El flujo glucoltico esmayor que el del ciclo de los acidos tricarboxlicos(CAT), lo que conduce a la acumulacion de acetilcoenzima A (AcCoA). La AcCoA es convertida aacetato, el cual es exportado de la celula y acumuladoen el medio de cultivo.

impide el desperdicio de carbono ni contempla elcontrol de la fisiologa en el biorreactor.

El metodo de cultivo mas empleado para alcanzardensidades celulares altas y evitar la produccion de

acetato es el cultivo alimentado exponencialmente.En este cultivo se utiliza una fase lote corta, paraacumular biomasa a una velocidad de crecimientomaxima. Una vez agotada la fuente de carbono del lote(usualmente menos de 15 g/L de glucosa o glicerol),se inicia la alimentacion de una solucion concentradade glucosa (de hasta 700 g/L). La velocidad deadicion de glucosa se incrementa exponencialmentepara mantener una velocidad de crecimiento constante(y con ello condiciones fisiologicas bien definidas).Para evitar el sobreflujo metabolico, debe mantenerseuna tasa de consumo de glucosa menor al valorumbral que dispara el sobreflujo metabolico (Eitemany Altman, 2006). Este valor dependera de la cepa, elmedio de cultivo y la temperatura del mismo, peroes comun que corresponda a valores de velocidadespecfica de crecimiento menores a 0.15 h1.

Al reducir la tasa de consumo de sustrato sereducira por consecuencia la demanda de oxgenopara oxidarlo, lo que permite alcanzar densidadescelulares mayores a las que se alcanzaran en uncultivo por lote, pero sin limitacion por oxgeno. Yaque la variable objetivo en este tipo de sistemas es lavelocidad de crecimiento (una variable macroscopicaque se puede medir con mayor facilidad que lavelocidad especfica de consumo glucosa), los cultivospor lote alimentado se operan utilizando una bombaprogramable de acuerdo al algoritmo de controldescrito por la siguiente ecuacion (Lara y col., 2008):

F =(setYX/S

+ mS

) F cXF VLFcS F e

set (ttF ) (2)

Donde F es el flujo de alimentacion, set esla velocidad de crecimiento deseada, YX/S es elrendimiento de biomasa por sustrato, ms es elcoeficiente de mantenimiento (fraccion del sustratoempleada para funciones de mantenimiento celular),F es la densidad de la solucion de alimentacion,cXF y VLF son la concentracion de biomasa y elvolumen de lquido en el biorreactor al inicio de laalimentacion, cS F es la concentracion de glucosa enla solucion de alimentacion, t y tF son el tiempode proceso y el tiempo al inicio de la alimentacion,respectivamente. Con este metodo, ha sido posiblellegar a concentraciones de biomasa de mas de 100g/L.

La Tabla 3 muestra que las mayoresconcentraciones de protena recombinante alcanzadasse han logrado con cultivos alimentadosexponencialmente, o en modo pH-stat. Este ultimomodo de operacion consiste en agregar glucosa unavez que el pH se incrementa por encima de un valor

216 www.rmiq.org


determinado (debido a re-consumo de acetato). Unavez dosificada la glucosa, el pH vuelve a caer debidoal consumo de sustratos y produccion de acetato.Con este metodo se pueden mantener velocidadesde crecimiento relativamente altas evitando unaacumulacion excesiva de acetato.

Los cultivos por lote normalmente no permitenla acumulacion de altas densidades celulares, debidoa la acumulacion de acetato. Sin embargo, Laray col (2008) reportaron la produccion de mas de 8g/L de protena recombinante en un cultivo por loteempleando una cepa modificada. Las modificacionesal metabolismo central de esta cepa se explicaran masadelante.

4.4 Heterogeneidades ambientales

Otro problema comun en los cultivos industriales esla existencia de gradientes espaciales en parametrosrelevantes como pH, TOD, concentracion de sustrato,CO2 disuelto, entre otros. Esto se debe principalmentea que el escalamiento ascendente de los biorreactoresgeneralmente conduce a un incremento en el tiempode circulacion (tc), definido como el tiempo que unapartcula en el biorreactor tarda en dar un recorridoal mismo y regresar al punto de partida (Lara y col.,2006a). La Tabla 4 muestra que empleando loscriterios mas comunes de escalamiento, se obtienenincrementos sustanciales en el tiempo de circulacionen el biorreactor. Los criterios mostrados consistenen incrementar la escala de operacion del biorreactormanteniendo constante el parametro mencionado. Conexcepcion de una velocidad de agitacion constante(N), que mantendra el tc sin variaciones, los demascriterios conducen a incrementos de hasta 100 veces enel tc. Sin embargo, mantener N constante requiere demotores cada vez mas potentes, incluso inexistentes,que restringen este criterio para su aplicacion.

Como resultado, el incremento en el tc espracticamente inevitable. Esto conlleva a que existanregiones con diferentes concentraciones. Por ejemplo,la adicion del agente de control de pH (una solucionconcentrada de base) se adiciona normalmente lasuperficie del caldo de cultivo y tardara hasta 100 sen mezclarse completamente en el biorreactor. Lomismo ocurre con la solucion de glucosa en un cultivoalimentado. Una manera de estudiar los efectosque las condiciones de gran escala pueden teneren los cultivos es la simulacion de las condicionesesperadas, empleando biorreactores de laboratorio,enfoque denominado escalamiento descendente (Laray col., 2006a).

En biorreactores industriales, las bacteriasviajan cclicamente entre regiones con alta y bajaconcentracion de sustrato. Como resultado, sumetabolismo sufre desviaciones con exposiciones agradientes de sustrato de duracion tan corta como 2 s(Lara y col., 2009). Otro parametro importante quepresenta gradientes es la TOD, cuya importancia yaha sido explicada. La exposicion cclica de E. coli agradientes de TOD desata procesos transcripcionalesen tiempos tan cortos como 17 s (Lara y col., 2006b).Sandoval-Basurto y col. (2005) reportaron quegradientes de TOD con tc de 180 s tienen un fuerteimpacto en la produccion de proinsulina humana,provocando una disminucion de hasta 94 % en suproduccion. Esto demuestra la importancia de lasheterogeneidades en la produccion de PR por E. coli,que debe ser tomada en cuenta durante el escalamientode los procesos productivos, para un diseno masinformado de las cepas y procesos.

Tabla 4. Incremento en el tiempo decirculacion (tc) como resultado de los

criterios de escalamiento mas comunespara un escalamiento lineal con un factor

de 10. P/V: potencia volumetrica aplicada,N: velocidad de agitacion, UT : velocidaden la punta del impulsor, Re: numero de

Reynolds, kLa: coeficiente de transferenciade masa, vvm: volumen de aire porvolumen de medio por minuto, vs:

velocidad superficial del aire.(Tomado de Palomares y col., 2010).

Criterio Cambio en tc

P/V 4.55N 1.00

UT 10.00RE 100.00

kLa y vvm 9.40kLa y vs 4.55

5 Purificacion de PRLa purificacion de las PR producidas por E. colipuede seguir varias vertientes (Cisneros-Ruz y Rito-Palomares, 2005), dependiendo de la localizacion dela PR, la cual tambien proporciona ciertas ventajassegun cada caso, como puede verse en la Tabla 5.Si la PR fue acumulada en el citoplasma, el primerpaso es la ruptura celular, la cual se puede llevar acabo empleado medios mecanicos o qumicos. Lahomogeneizacion a alta presion es una operacion

www.rmiq.org 217


escalable para este fin. La acumulacion de PR en elcitoplasma con frecuencia lleva a la acumulacion decuerpos de inclusion, lo cual depende de factores comola secuencia de la protena, la fuerza del promotor,la temperatura, velocidad de crecimiento, entre otrosfactores, pero hasta el momento no es facil predecirsu formacion. En ocasiones es deseable la formacionde cuerpos de inclusion (incluso se agregan protenasde fusion para conducir a su formacion), ya queprotegen a la PR de la proteolisis, y pueden serseparados por centrifugacion continua. Sin embargo,los cuerpos de inclusion pueden tener agregadasgrandes cantidades de contaminantes como ADN,ARN y chaperonas, haciendo que la proporcion dePR en el cuerpo de inclusion llegue a ser tan bajacomo el 60 % (Singh y col., 2006; Ferrer Mirallesy col., 2009). En la industria se han establecidoprotocolos de separacion de estos contaminantes porcentrifugacion (Wong y col., 1996; Heeboll-Nielseny col., 2003). En el caso de productos solubles enel citoplasma, deben tomarse medidas para evitar laproteolisis del producto, como reducir la temperaturao agregar agentes acomplejantes. Si las protenas sonacumuladas en el espacio periplasmico, la aplicacionde un choque osmotico permite la extraccion de laprotena a la vez que causa muy poco dano a lascelulas.

La recuperacion de la protena puede llevarsea cabo empleando filtros de diversos tamanos y/ocon superficie cargada. La filtracion tambien esescalable y esta bien establecida en la escala industrial.Los acidos nucleicos pueden ser removidos medianteextracciones o bien agregando agentes policationicoscomo la polietinilamina. La protena puede sercapturada o precipitada selectivamente empleando unavariedad de materiales que han sido desarrollados paraeste proposito, como algunas resinas de interaccionhidrofobica (Kato y col., 2004).

En el caso de obtener cuerpos de inclusion, laprotena debe replegarse. La eficiencia de este pasoes la influencia mas fuerte para la productividaddel proceso. La protena obtenida de los pasosanteriores tiene diferentes estados conformacionales.Para obtener la protena correctamente plegada y en sucaso, los puentes disulfuro, el metodo mas empleadoes disolver el agregado con agentes caotropicos,detergentes, o alcalinizar. Manipulando correctamenteel estado de oxidacion-reduccion de la solucion, esposible promover tanto el plegamiento correcto comola formacion de los puentes disulfuro (Singh y Panda,2005).

La purificacion final de la protena puede hacersemediante metodos cromatograficos como intercambio

anionico y cationico, interaccion hidrofobica ycromatografa de fase reversa. Una revision completade estos metodos esta fuera del alcance de este trabajo.La PR purificada debe ademas tener un contenidomnimo de protena bacteriana, particularmente deendotoxinas. Es comun tambien la eliminacion de unoo dos aminoacidos terminales (p. ej. Metionina) queno pertenecen a la secuencia original de la protena. Laadicion de polietilenglicol (PEGilacion) a la protenapermite reducir reacciones inmunogenicas adversas(Kumagai y col., 2010).

6 Ingeniera metabolica aplicadaa la produccion de PR

La ingeniera metabolica tiene como objetivo lamodificacion del metabolismo para incrementar lascapacidades celulares hacia la produccion o el fenotipodeseado. Las aplicaciones de la ingeniera metabolicaa la produccion de PR por E. coli son muy variadas,pero se resumiran solo algunas de ellas. Por ejemplo,una de las principales desventajas de la produccion dePR en E. coli es que la bacteria no es capaz de hacermodificaciones post-traduccionales. Se han hechoesfuerzos conducentes a introducir vas metabolicas deglicosilacion en E. coli que, aunque no son como lasde humanos, han dado buenos resultados para mejorarla funcion de la PR (Waker y col., 2002; Skretasy col., 2009). Otros desarrollos intentan modificarel estado de oxidacion-reduccion intracelular o enel periplasma para lograr la formacion de enlacesdisulfuro en E. coli (Masip y col., 2004, Nguyen y col.,2011). Para facilitar la purificacion y el procesamientopost-traduccional, tambien se ha buscado establecerestrategias eficientes para que la PR se transporte alespacio periplasmatico (DeLisa y col., 2003), lo quetambien ha sido un area de investigacion muy activa.

Las herramientas modernas de analisis fisiologicoglobal han permitido estudiar las respuestas de E. colia condiciones de produccion y elucidar estrategiasde mejora del metabolismo celular. Por ejemplo,Choi y col. (2003) estudiaron el transcriptoma decultivos de alta densidad celular de E. coli produciendoPR. Basados en sus resultados, seleccionaron yco-expresaron dos genes (glpF, codifica para untransportador de glicerol y prsA, codifica para unafosforibosil pirofosfato fosfotransferasa), lograndoaumentar la produccion de PR a mas del doble.Estudios proteomicos y del fluxoma tambien hanarrojado informacion valiosa sobre la fisiologabacteriana en cultivos de alta densidad celular (Lemuthy col., 2008).

218 www.rmiq.org


Tabla 5. Ventajas y desventajas de la localizacion de la PR producida en E. coli en losprocesos de purificacion (Adaptado de Choi y col., 2006).

Lugar de acumulacion Ventajas Limitaciones

Citoplasma Frecuentemente forma cuerpos deinclusion, se puede remover lamayora de los contaminantes

Requiere replegamiento posterior

Periplasma Se pueden formar puentesdisulfuro, se pueden emplearsenales de secrecion naturales

La traslocacion es emprica ymuchas veces ineficiente

Secrecion extracelular Facilidad de cosecha del productocon buena pureza en el

sobrenadante. Razonablementeeficiente para peptidos.

La maquinaria de secrecion noesta completamente estudiada y esineficiente para protenas grandes.

El estudio de respuestas transcripcionales agradientes ambientales empleando sistemas deescalamiento descendente ha permitido generar cepasmodificadas con una mejor produccion de PR. Laray col. (2006b) estudiaron la expresion de 21 genesen respuesta a oscilaciones de TOD. Basados ensus resultados, bloquearon parcialmente la ruta defermentacion acido-mixta, lo que resulto en una mayorvelocidad de crecimiento incluso bajo gradientes deTOD y aumentando al doble la produccion de PR bajocondiciones constantes u oscilantes de TOD (Lara ycol., 2006c).

Con el objetivo de reducir el sobreflujo metabolicoy mejorar el desempeno en cultivos de alta densidadcelular, Lara y col. (2008) emplearon una cepa deE. coli modificada en el sistema de transporte deglucosa. En esta cepa, el sistema nativo PTS fuebloqueado, y la glucosa es transportada a traves dela permeasa de galactosa, que esta sobre-expresada anivel cromosomal en la cepa modificada (De Anda ycol, 2006). Como se observa en la Fig. 5, el transportea traves de la permeasa de galactosa no depende dePEP como en el PTS (ver Fig. 4). Esto permitetener mas PEP disponible para funciones biosinteticas.Las cepas mutantes en el PTS tambien tienen unmayor flujo de carbono hacia la va de las pentosasfosfato, que incrementara la cantidad de precursoresde acidos nucleicos para mantener una mayor cantidadde plasmido.

Dado que la velocidad de consumo de glucosa eneste sistema es 33 % menor que en una cepa nativa, elsobreflujo metabolico es fuertemente reducido. Estoha permitido el cultivo de la cepa modificada en modolote empleando hasta 100 g/L de glucosa inicial, loque condujo a una produccion de 52 g/L de biomasay mas de 8 g/L de PR y solo 2 g/L de acetato (que

despues fue consumido por la bacteria), en contrastecon la cepa nativa, que produjo 34 g/L de biomasa,menos de 4 g/L de PR y cerca de 14 g/L de acetato.La concentracion de PR alcanzada en este estudio es lamas alta reportada para un cultivo por lote. Cabe hacernotar que ni el medio ni la cepa fueron optimizadaspara la produccion de la PR modelo (protena verdefluorescente), por lo que la produccion podra mejoraraun mas.

El cultivo por lote de esta cepa modificadaempleando altas concentraciones de glucosa es unaopcion atractiva ante los cultivos alimentados que,como se ha explicado, presentan desventajas comotiempos de cultivo prolongados y presencia degradientes de sustrato. Sin embargo, uno delos principales retos es el suministro de oxgeno,ya que se tiene una densa poblacion celularrespirando activamente. Se ha demostrado que lacepa es cultivada satisfactoriamente en biorreactorespresurizados empleando hasta 130 g/L de glucosainicial, con una mnima produccion de acetato,mientras que la sobre-presion del biorreactor llego acasi 5 bar y la VTO a 0.45 mol O2/L h (Knabben ycol., 2010). Esta VTO es la mas alta reportada para uncultivo por lote.

Los ejemplos anteriores muestran el potencial dela ingeniera metabolica no solo para incrementar laproduccion de PR y su modificacion, sino tambienpara mejorar el desempeno de E. coli ante condicionesde proceso y facilitar las etapas de purificacion.

www.rmiq.org 219


Glucosa AcetatoH+

GalP

Glucosa H+ATP

G6PAcetato

ADP

2 PEP

AcCoA

CATCAT

Fig. 5. Esquema simplificado del transportede glucosa a traves de la permeasa de galactosa.La glucosa es fosforilada por la glucocinasa,consumiendo ATP en vez de PEP. La nomenclatura esla misma que en la Fig. 4.

PerspectivasEl mercado de PR producidas por bacterias es muyimportante a nivel mundial. Las ventajas de laproduccion de PR sobre otros organismos alientala investigacion para superar las desventajas desistemas microbianos, como lograr modificacionespost-traduccionales y producir protenas de elevadopeso molecular. Los avances recientes en este campo,mantienen vigente el interes en lograr sistemas deexpresion y de cultivo bacteriano cada vez maseficientes. La ingeniera metabolica y un mejorentendimiento de la fisiologa de la bacteria durante laexpresion y bajo condiciones de produccion industrialpermitiran sin duda incrementar los rendimientos yabriran nuevas opciones de procesamiento de PR.

ReferenciasBaneyx, F. (1999). Recombinant protein expression

in Escherichia coli. Current Opinion inBiotechnology 10, 411-421.

Carrier, T.A., Jones, K.L. y Keasling, J.D.(1998). mRNA stability and plasmid copy

number effects on gene expression from aninducible promoter system. Biotechnology andBioengineering 59, 666-672.

Caspeta, L., Flores, N., Perez, N.O., Bolvar, F. yRamrez, O.T. (2009). The effect of heating rateon Escherichia coli metabolism, physiologicalstress, transcriptional response, and productionof temperature-induced recombinant protein:A scale-down study. Biotechnology andBioengineering 102, 468-482.

Cisneros-Ruiz, M. y Rito-Palomares. M.(2005). Estrategias de bioingeniera para larecuperacion primaria de productos biologicos.Revista Mexicana de Ingeniera Qumica 4,131-139.

Cranenburgh, R.M., Hanak, J.A., Williams, S.G. ySherratt, D.J. (2001). Escherichia coli strainsthat allow antibiotic-free plasmid selection andmaintenance by repressor titration. NucleicAcids Research 29, E26.

Choi, J.H., Lee, S.J., Lee, S.J. y Lee, S.Y. (2003).Enhanced production of insulin-like growthfactor I fusion protein in Escherichia coli bythe coexpression of the down-regulated genesidentified by transcriptome profiling. Appliedand Environmental Microbiology 69, 4737-4742.

Choi, J.H., Keumb, K.C. y Lee, S.Y. (2006).Production of recombinant proteins by high celldensity culture of Escherichia coli. ChemicalEngineering Science 61, 876 - 885.

De Anda, R., Lara, A.R., Hernandez, V.,Hernandez-Montalvo, V., Gosset, G.,Bolvar, F. y Ramrez, O.T. (2006).Replacement of the glucose phosphotransferasetransport system by galactose permeasereduces acetate accumulation and improvesprocess performance of Escherichia colifor recombinant protein production withoutimpairment of growth rate. MetabolicEngineering 8, 281-290.

Delisa, M.P., Tullman, D. y Georgiou, G. (2003).Folding Quality Control in the Export ofProteins via the Bacterial Twin ArginineTranslocation Pathway. Proceedings of the.National Academy of Sciences of the U.S.A. 100,6115-6120.

220 www.rmiq.org


Demain, A.L. y Vaishnav, P. (2009). Production ofrecombinant proteins by microbes and higherorganisms. Biotechnology Advances 27, 297-306.

Eiteman, M.A. y Altman, E. (2006). Overcomingacetate in Escherichia coli recombinant proteinfermentations. Trends in Biotechnology 24, 530-536.

Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espn, J., Corchero,J.L., Vazquez, A. y Villaverde, A.(2009). Microbial factories for recombinantpharmaceuticals. Microbial Cell Factories 8,17.

Fu, L.L., Xu, Z.R., Li, W.F., Shuai, J.B., Lu, P. yHu, C.X. (2007). Protein secretion pathways inBacillus subtilis: implication for optimization ofheterologous protein secretion. BiotechnologyAdvances 25, 1-12.

Fuchs, C., Kostera, D., Wiebuscha, S., Mahrb, K.,Eisbrennerb, G. y Markla, H. (2002). Scale-up of dialysis fermentation for high cell densitycultivation of Escherichia coli. Journal ofBiotechnology 93, 243-251.

Graumann, K. y Premstaller, A. (2006).Manufacturing of recombinant therapeuticproteins in microbial systems. BiotechnologyJournal 1,164-186.

Heebll-Nielsen, A., Choe, W.S., Middelberg, A.P.y Thomas, O.R. (2003). Efficient inclusionbody processing using chemical extraction andhigh gradient magnetic fishing. BiotechnologyProgress 19, 887-898.

Hu, S.Y., Wu, J.L. y Huang, J.H. (2004). Productionof tilapia insulin-like growth factor-2 in highcell density cultures of recombinant Escherichiacoli. Journal of Biotechnology 107, 161-171.

Huang, H., Ridgway, D., Gu, T. y Moo-Young, M. (2003). A segregated model forheterologous amylase production by Bacillussubtilis. Enzyme and Microbial Technology 32,407-413.

Jana, S. y Deb, J.K. (2005). Strategies forefficient production of heterologous proteins inEscherichia coli. Applied Microbiology andBiotechnology 67, 289-298.

Jones, K.L., Kim, S.W. y Keasling, J.D. (2000).Low-copy plasmids can perform as well as orbetter than high-copy plasmids for metabolicengineering of bacteria. Metabolic Engineering2, 328-338.

Kato, Y., Nakamura, K., Kitamura, T., Hasegawa, M.y Sasaki, H. (2004). Hydrophobic interactionchromatography at low salt concentration for thecapture of monoclonal antibodies. Journal ofChromatography A 1036, 45-50.

Knabben, I., Regestein, L., Marquering, F.,Steinbusch, S., Lara, A.R. y Buchs, J. (2010).High cell-density processes in batch modeof a genetically engineered Escherichia colistrain with minimized overflow metabolismusing a pressurized bioreactor. Journal ofBiotechnology 150, 73-79.

Knoll, A., Bartsch, S., Husemann, B., Engel,P., Schroer, K., Ribeiro, B., Stockmann, C.,Seletzky, J. y Buchs, J. (2007). High celldensity cultivation of recombinant yeasts andbacteria under non-pressurized and pressurizedconditions in stirred tank bioreactors. Journal ofBiotechnology 132, 167-179.

Kumagai, I., Asano, R., Nakanishi, T., Hashikami,K., Tanaka, S., Badran, A., Sanada, H.y Umetsu, M. (2010). Integration ofPEGylation and refolding for renaturation ofrecombinant proteins from insoluble aggregatesproduced in bacteriaapplication to a single-chain Fv fragment. Journal of Bioscience andBioengineering 109, 447-452.

Lara, A.R., Galindo, E., Palomares, A.L. y Ramrez,O.T. (2006a). Living with heterogeneousbioreactors: Understanding the effect ofenvironmental gradients in cells. MolecularBiotechnology 34, 355-381.

Lara, A.R., Leal, L.I., Flores, N., Gosset, G., Bolvar,F. y Ramrez, O.T. (2006b). Transcriptional andmetabolic response of recombinant Escherichiacoli to spatial dissolved oxygen tensiongradients simulated in a scale-down system.Biotechnology and Bioengineering 93, 373-385.

Lara, A.R., Vazquez-Limon, C., Gosset, G., Bolvar,F., Lopez-Mungua, A. y Ramrez, O.T. (2006c).Engineering Escherichia coli to improve cultureperformance and reduce by-product formation

www.rmiq.org 221


during recombinant protein production undertransient intermittent anaerobic conditions.Biotechnology and Bioengineering 94, 1164-1175.

Lara, A.R., Caspeta, L., Gosset, G., Bolvar, F. yRamrez, O.T. (2008). Utility of an Escherichiacoli strain engineered in the substrate uptakesystem for improved culture performance athigh glucose and cell concentrations: analternative to fed-batch cultures. Biotechnologyand Bioengineering 99, 893-901.

Lara, A.R., Taymaz-Nikerel, H., van Gulik, W.,Heijnen, J.J., Ramrez, O.T. y van Winden, W.(2009). Fast dynamic response of Escherichiacoli fermentation metabolism to aerobic andanaerobic glucose pulses. Biotechnology andBioengineering 104, 1153-1161.

Lara, A.R. y Ramrez, O.T. (2011). Productionof plasmid DNA for therapeutic applications.En: Methods in Molecular Biology 3rd ed., (A.Lorence, ed.). Humana Press. En prensa.

Lara, A.R., Knabben, I., Caspeta, L., Sassi, J.,Ramrez, O.T. y Buchs, J. (2011). Comparisonof oxygen enriched air vs pressurizedcultivations to increase oxygen transferand to scale-up plasmid DNA productionfermentations. Engineering in Life Sciences.En prensa.

Lemuth, K., Hardiman, T., Winter, S., Pfeiffer,D., Keller, M.A., Lange, S., Reuss, M.,Schmid, R.D. y Siemann-Herzberg, M. (2008).Global transcription and metabolic flux analysisof Escherichia coli in glucose-limited fed-batch cultivations. Applied and EnvironmentalMicrobiology 74, 7002-7015.

Lim, J., Thomas, T. y Cavicchioli, R. (2000).Low temperature regulated DEAD-boxRNA helicase from the antartic archaeon,Methanococcoides burtonii. Journal ofMolecular Biology 297, 553-567.

Masip, L., Pan, J., Haldar, S., Penner-Hahn, J.A.,Delisa, M.P., Georgiou, G., Bardwell, J.C.A.y Collet, J.F. (2004). Engineering a de novopathway for the formation of protein disulfidebonds in bacteria. Science 304, 1185-190.

Nguyen, V.D., Hatahet, F., Salo, K.E.H., Enlund,E., Zhang, C. y Ruddock L.W. (2011). Pre-expression of a sulfhydryl oxidase significantly

increases the yields of eukaryotic disulfide bondcontaining proteins expressed in the cytoplasmof E.coli. Microbial Cell Factories 10, 1.

Palomares, L.A., Estrada-Mondaca, S. y Ramrez,O.T. (2004). Production of recombinantproteins: challenges and solutions. Methods inMolecular Biology 267, 15-52.

Palomares, L.A., Lara, A.R. y Ramrez, O.T. (2010).Bioreactor Scale-Down. En: Encyclopediaof Industrial Biotechnology: Bioprocess,bioseparation and cell technology. (M.C.Flickinger, ed.), Pp. 1-13. John Wiley andSons, Nueva York.

Phue, J.N., Noronha, S.B., Hattacharyya, R., Wolfe,A.J. y Shiloach, J. (2005). Glucose metabolismat high density growth of E. coli B and E.coli K: Differences in metabolic pathways areresponsible for efficient glucose utilization inE. coli B as determined by microarrays andNorthern blot analyses. Biotechnology andBioengineering 90, 805-820.

Rozkov, A., Avignone-Rossa, C., Ertl, P., Jones, P.,OKennedy, R., Smith, J., Dale, J. y Bushell,M. (2004). Characterization of the metabolicburden on Escherichia coli DH1 cells imposedby the presence of a plasmid containing agene therapy sequence. Biotechnology andBioengineering 88, 909-915.

Sandoval-Basurto, E., Gosset, G., Bolvar, F. yRamrez, O.T. (2005). Culture of Escherichiacoli under dissolved oxygen gradientssimulated in a two-compartment scale-downsystem: metabolic response and productionof recombinant protein. Biotechnology andBioengineering 89, 453-463.

Sayadi, S., Barbotin, J.N. y Thomas, D. (1989).Effect of environmental growth conditionson plasmid stability, plasmid copy number,and catechol 2,3-dioxygenase activity infree and immobilized Escherichia coli cells.Biotechnology and Bioengineering 33, 801-808.

Shiloach, J. y Fass, R. (2005). Growing E. colito high cell density-A historical perspective onmethod development. Biotechnology Advances23, 345-357.

Singh, S.M. y Panda, A.K. (2005). Solubilization andrefolding of bacterial inclusion body proteins.

222 www.rmiq.org


Journal of Bioscience and Bioengineering 99,303-310.

Skretas, G., Carroll, S., DeFrees, S.,Schwartz, M.F., Johnson, K.F. y Georgiou,G. (2009). Expression of an activehuman glycosyltransferase (SialyltransferaseST6GalNAcI) in Escherichia coli strains withoxidizing cytoplasm. Microbial Cell Factories8, 50.

Sorensen, H.P. y Mortensen, K.K. (2005). Advancedgenetic strategies for recombinant proteinexpression in Escherichia coli. Journal ofBiotechnology 115, 113-128.

Vallejo, L.F., Brokelmann, M., Marten, S., Trappe,S., Cabrera-Crespo, J., Hoffmann, A., Gross, G.,Weich, H.A. y Rinas, U. (2002). Renaturationand purification of bone morphogenetic protein-2 produced as inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinant Escherichiacoli. Journal of Biotechnology 94, 185-194.

Valdez-Cruz, N.A., Caspeta, L., Perez, N.O.,Ramrez, O.T. y Trujillo-Roldan, M.A. (2009).Production of recombinant proteins in E. coliby the heat inducible expression system basedon the phage lambda pL and/or pR promoters.Microbial Cell Factories 9, 18.

Vidal, L., Pinsach, J., Striedner, G., Caminal,G. y Ferrer, P. (2008). Development of anantibiotic-free plasmid selection system basedon glycine auxotrophy for recombinant proteinoverproduction in Escherichia coli. Journal ofBiotechnology 134,127-136.

Wacker, M., Linton, D., Hitchen, P.G., Nita-Lazar, M, Haslam, S.M., North, S.J., Panico,M., Morris, H.R., Dell, A., Wren, B.W. yAebi, M. (2002). N-linked glycolylation inCampilobacter jejuni and its functional transferinto E. coli. Science 298, 1790-1793.

Walsh, G. (2010). Biopharmaceuticals benchmarks2010. Nature Biotechnology 28, 917-924.

Wang, Y., Liu, C.H., Storey, J.D., Tibshirani, R.J.,Herschlag, D. y Brown, P.O. (2004). Precisionand functional specificity in mRNA decay.Proceeding of the National Academy of Sciencesof the U.S.A. 99, 5860-5865.

Wittmann, C., Weber, J., Betiku, E., Kromer, J.,Bohm, D. y Rinas, U. (2007). Responseof fluxome and metabolome to temperature-induced recombinant protein synthesis inEscherichia coli. Journal of Biotechnology 132,375-384.

Wong, H.H., ONeill, B.K. y Middelberg, A.P.(1996). Centrifugal processing of celldebris and inclusion bodies from recombinantEscherichia coli. Bioseparation 6, 361-372.

Xie, L., Hall, M.A., Eiteman, A. y Altman, E. (2003).Optimization of recombinant aminolevulinatesynthase production in Escherichia coli usingfactorial design. Applied Microbiology andBiotechnology 63, 267-273.

Zhou, L., Zhang, K. y Wanner, B.L. (2004).Chromosomal expression of foreign and nativegenes from regulable promoters in Escherichiacoli. Methods in Molecular Biology 267, 123-134.

www.rmiq.org 223

Produccion de Proteinas Recomibinantes

Documents

Transcript of Produccion de Proteinas Recomibinantes