oxidasa piranosa

8/4/2019 oxidasa piranosa

1/10

V o l . 5 8 , N o . 1 1P P L I E D AND E N V I R O N M E N T A L M I C R O B I O LO G Y , N o v . 1 9 9 2 , p . 3 6 6 7 - 3 6 7 60 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 2 / 1 1 3 6 6 7 - 1 0 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 2 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

U l t r a s t r u c t u r a l a n d I m m u n o c y t o c h e m i c a l S t u d i e s on t h eH 2 0 2 - P r o d u c i n g Enzyme P y r a n o s e O x i d a s e i n P h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m Grown u n d e r L i q u i d C u l t u r e C o n d i t i o n sGEOFFREY D A N I E L , ` * JINDRICH VOLC,2 ELENA KUBATOVA,2 AND THOMAS NILSSON'D e p a r t m e n t o f F o r e s t P r o d u c t s , S w e d i s h U n i v e r s i t y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s , Bo x 7 0 0 8 , S - 7 5 0 - 0 7 ,U p p s a l a , S w e d e n , 1 and I n s t i t u t e o f M i c r o b i o l o g y , C z e c h o s l o v a k i a n Aca demy o f S c i e n c e s ,P r a g u e 4 , C z e c h o s l o v a k i a 2

R e c e i v e d 2 5 M a r c h 1 9 9 2 / A c c e p t e d 1 8 A u g u s t 1 9 9 2T h e u l t r a s t r u c t u r a l d i s t r i b u t i o n o f t h e s u g a r - o x i d i z i ng enzyme pyr anose 2 - o x i d a s e ( P O D ) i n h y p h a e o fP h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m K - 3 grown u n d e r l i q u i d c u l t u r e c o nd i t i on s o p t i m a l f o r t h e e n z y m e ' s p r o d u c t i o n

was s t u d i e d b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y i m m u n o c y t o c h e m i s t r y . U s i n g t h e 3 - d i m e t h y l a m i n o b e n z o i ca c i d - 3 - m e t h y l - 2 - b e n z o t h i a z o l i n o n e h y d r a z o n e h y d r o c h l o r i d e H202 p e r o x i d a s e s p e c t r o p h o t o m e t r i c assay, PO Dwas d e t e c t e d i n m y c e l i a l e x t r a c t s f r o m d a y s 7 t o 1 8 , w i t h maximum a c t i v i t y r e c o r d e d on d a y 1 2 . O n s e t o f PO Da c t i v i t y o c c u r r e d i n t h e s e c o n d a r y p h a s e o f h y p h a l d e v e l o p m e n t a t a t i m e o f s t a t i o n a r y g r o w t h , g l u c o s el i m i t a t i o n , a n d pH i n c r e a s e . PO D was a l s o d e t e c t e d e x t r a c e l l u l a r l y i n t h e c u l t u r e f l u i d f r o m d a y s 7 t o 1 8 , w i t hmaximum a c t i v i t y r e c o r d e d o n d a y 1 3 . A t e a r l y s t a g e s o f d e v e l o p m e n t ( 3 t o 4 d a y s ) , u s i n g a n t i - P O D a n t i b o d i e sa n d i m m u n o g o l d l a b e l i n g , PO D was l o c a l i z e d i n m u l t i v e s i c u l a r a n d e l e c t r o n - d e n s e b o d i e s a n d i n c e l l membraner e g i o n s . A f t e r 1 0 t o 1 2 d a y s o f g r o w t h , a t maximum PO D a c t i v i t y , PO D was c o n c e n t r a t e d w i t h i n t h ep e r i p l a s m i c space w h e r e i t was a s s o c i a t e d w i t h m e m b r a n e - b o u n d v e s i c l e s a n d o t h e r membrane s t r u c t u r e s . A tl a t e r s t a g e s o f d e v e l o p m e n t ( 1 7 t o 1 8 d a y s ) , when t h e m a j o r i t y o f h y p h a e were l y s e d , PO D was o b s e r v e da s s o c i a t e d w i t h r e s i d u a l i n t r a c e l l u l a r membrane s y s t e m s a n d v e s i c l e s . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p yi m m u n o c y t o c h e m i c a l s t u d i e s a l s o d e m o n s t r a t e d a n e x t r a c e l i u l a r d i s t r i b u t i o n o f t h e enzyme a t t h e s t a t i o n a r yg r o w t h p h a s e , s h o w i n g i t s a s s o c i a t i o n w i t h f u n g a l e x t r a c e l l u l a r s l i m e . I n s t u d i e s o f l i g n i n o l y t i c c u l t u r e s o f t h esame f u n g u s , PO D was f o u n d t o h a v e a s i m i l a r i n t r a c e l l u l a r a n d e x t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n i n sl im e a s t h a tr e c o r d e d f o r c u l t u r e s grown w i t h c o r n s t e e p . POD's p e r i p h e r a l c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n s h o w s s i m i l a r i t i e s t ot h e c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f t h a t r e p o r t e d p r e v i o u s l y f o r H 2 0 2 - d e p e n d e n t l i g n i n a n d manganese p e r o x i d a s e s i nP . c h r y s o s p o r i u m .

H y d r o g e n p e r o x i d e h a s b e e n i m p l i c a t e d i n l i g n i n - a n dc e l l u l o s e - d e g r a d i n g s y s t e m s o f b o t h w h i t e r o t a n d b r o w n r o tb a s i d i o m y c e t e f u n g i . W i t h l i g n i n o l y t i c f u n g i , H202 a c t s a s ac o s u b s t r a t e f o r l i g n i n p e r o x i d a s e d u r i n g o x i d a t i o n o f l i g n i n( 3 2 ) a n d f o r M n ( I I ) p e r o xi d a s e d u r i n g o x i d at i o n o f M n ( I I ) ( 9 ,2 5 ) . W i t h b r o w n r o t f u n g i , H202 i s t h o u g h t t o p l a y a r o l e i nt h e i n i t i a l v e r y r a p i d a n d d e s t r u c t i v e a t t a c k o f c e l l u l o s e b ym e d i a t i n g t h e p r o d u c t i o n o f h y d r o x y l r a d i c a l s . To h a v e ac o m p l e t e u n d e r s t a n d i n g o f f u n g a l l i g n o c e l l u l o s e - d e g r a d i n gp r o c e s s e s , i t i s t h e r e f o r e i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e t h e s o u r c eo f H 2 0 2 . P r e s e n t l y , a r a n g e o f o x i d a s e e n z y m e s i n c l u d i n gg l u c o s e 1 - o x i d a s e ( 1 8 , 1 9 ) , p y r a n o s e 2 - o x i d a s e ( P O D ) ( s y n =g l u c o s e 2 - o x i d a s e [ 7 ] ) , g l y o x a l o x i d a s e ( 2 0 ) , m e t h a n o l o x i -d a s e ( 2 4 ) , a n d f a t t y - a c y l c o e n z y m e A o x i d a s e ( 1 2 ) h a v e b e e np r o p o s e d a s p o s s i b l e d o n o r s o f H202 i n b a s i d i o m y c e t e f u n g i .O f t h e s e e n z y m e s , p e r h a p s t h e g r e a t e s t e v i d e n c e f o r i n v o l v e -ment h a s b e e n p r e s e n t e d f o r t h e s u g a r o x i d a s e s a n d g l y o x a lo x i d a s e . G l y o x a l o x i d a s e h a s b e e n i d e n t i f i e d i n c u l t u r e f l u i d sf r o m l i g n i n o l y t i c c u l t u r e s o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o n u m( 2 0 ) a n d more r e c e n t l y i n e x t r a c t s f r o m wood c h i p s d e g r a d e db y t h e same f u n g u s ( 6 ) . T h e e n z y m e i s , h o w e v e r , o n l yr e p o r t e d t o u t i l i z e s e c o n d a r y f u n g a l m e t a b o l i t e s . S i m i l a r l y ,b o t h o f t h e s u g a r o x i d a s e s , g l u c o s e 1 - o x i d a s e a n d POD, h a v eb e e n i d e n t i f i e d i n m y c e l i a l e x t r a c t s f r o m t h e w h i t e r o t f u n g u sP . c h r y s o s p o r i u m ( 7 , 2 6 ) . I n a d d i t i o n , PO D h a s b e e n r e -p o r t e d p r o d u c e d f r o m a r a n g e o f o t h e r w h i t e r o t a n d , t o a

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

l e s s e r e x t e n t , b r o w n r o t b a s i d i o m y c e t e f u n g i ( 1 4 , 1 5 , 2 3 , 3 7 ) .S u g a r o x i d a s e s h a v e f u r t h e r b e e n p o s t u l a t e d t o f u n c t i o n i nc o n c e r t w i t h l a c c a s e t o m a i n t a i n a l a c c a s e - g l u c o s e : q u i n o n eo x i d o r e d u c t a s e c y c l e d u r i n g w h i c h t h e y a r e t h o u g h t t oh i n d e r s p o n t a n e o u s r e p o l y m e r i z a t i o n o f q u i n o n e i n t e r m e d i -a t e s p r o d u c e d b y l a c c a s e , t h e r e b y i n c r e a s i n g t h e e f f i c i e n c yo f d e p o l y m er i z a t i o n d u r i n g l i g n i n d e g r a d a t i o n ( 1 1 , 3 1 ) .T h e p r e s e n t work d e s c r i b e s e n z y m a t i c , i m m u n o c y t o -c h e m i c a l , a n d u l t r a s t r u c t u r a l s t u d i e s t o d e t e r m i n e t h e i n t r a -a n d e x t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f PO D i n c u l t u r e s o f P .c h r y s o s p o r i u m K - 3 g r o w n u n d e r c o n d i t i o n s o p t i m a l f o r t h ee n z y m e ' s p r o d u c t i o n a s w e l l a s i n l i g n i n o l y t i c c u l t u r e s . PO D( , B - D - g l u c o s e : o x y g e n 2 - o x i d o r e d u c t a s e ; E C 1 . 1 . 3 . 1 0 . ) wasc h o s e n i n s t e a d o f g l u c o s e 1 - o x i d a s e ( E C 1 . 1 . 3 . 4 . ) f o r t h i swork b e c a u s e o f i t s r e p o r t e d o c c u r r e n c e i n a r a n g e o f w h i t er o t f u n g i a n d b e c a u s e o f i t s r e p o r t e d a c t i v i t y on x y l o s e i na d d i t i o n t o D - g l u c o s e , b o t h i m p o r t a n t wood s u g a r s . A l -t h o u g h g e n e r a l l y c o n s i d e r e d a s a n i n t r a c e l l u l a r e n z y m e ,PO D h a s b e e n r e c o r d e d i n c u l t u r e f l u i d s o f l i g n i n o l y t i cc u l t u r e s o f P a n u s t i g r i n u s 1 4 4 , s u g g e s t i n g a p o s s i b l e e x t r a -c e l l u l a r r o l e d u r i n g l i g n o c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n ( 1 0 ) .

MATERIALS ANDMETHODSF u n g a l s t r a i n s . P . c h r y s o s p o r i u m K - 3 ( 1 6 ) w a s u s e d f o re n z y m e p r o d u c t i o n a n d f o r t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y( T E M ) i m m u n o c y t o c h e m i c a l s t u d i e s . P . c h r y s o s p o r i n u m K - 3was o b t a i n e d f r o m t h e C z e c h o s l o v a k i a n A c a d e m y o f S c i en c e

3 6 6 7


2/10

3 6 6 8 D AN IE L E T AL.C u l t u r e c o l l e c t i o n o f b a s i d i o m y c e t e s ( s t r a i n CCBAS 5 7 1 ) .T h e f u n g u s i s r o u t i n e l y m a i n t a i n e d o n 2 . 5 % m a l t a g a r p l a t e s .L i q u i d c u l t u r e c o n d i t i o n s . A g i t a t e d f u n g a l c u l t u r e s ( 1 5 0r p m ) w e r e s e t u p a s p r e v i o u s l y o u t l i n e d ( 3 6 ) , u s i ng 8 0 m l o fmedium p e r 5 0 0 - m l E r l e n m e y e r f l a s k . T h e c u l t u r e mediumc o n t a i n e d ( p e r l i t e r o f t a p w a t e r ) 2 0 g o f D - g l u c o s e , 1 5 g o fc o r n s t e e p s y r u p ( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M o . ) , a n d1 . 5 g o f M g S O 4 . 7 H 2 0 . T h e m e d i u m was a d j u s t e d t o pH 5 . 5w i t h 6 M N a O H b e f o r e a u t o c l a v i n g . S a m p l e s f o r a n a l y s i sw e r e t a k e n o v e r a 1 8 - d a y g r o w t h p e r i o d b y u s i n g t h e e n t i r ec o n t e n t s o f s i n g l e o r d u p l i c a t e f l a s k s . E s t i m a t e s o f m y c e l i a lg r o w t h w e r e d e t e r m i n e d g r a v i m e t r i c a l l y . T h e p r e s e n c e o fg l u c o s e i n t h e g r o w t h medium w a s d e t e r m i n e d b y u s i n gC l i n i s t i x i n d i c a t o r p a p e r ( A m e s , M i l e s L a b o r a t o r i e s , S l o u g h ,U n i t e d K i n g d o m ) .L i g n i n o l y t i c c u l t u r e s . N o n a g i t a t e d c u l t u r e s o f P . c h r y s o -s p o r i u m K - 3 w e r e s e t u p b y t h e m e t h o d o f K i r k e t a l . ( 2 1 ) .M y c e l i a l s a m p l e s w e r e r e m o v e d a f t e r a 6 - d a y g r o w t h p e r i o da n d p r o c e s s e d f o r TEM i m m u n o c y t o c h e m i s t r y a s p r e v i o u s l yd e s c r i b e d ( 4 ) . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , l o s s o f c o l o r o f P o l y B4 1 1 ( S i g m a ) o c c u r r e d a f t e r 3 t o 6 d a y s i n d i c a t i n g l i g n i n o l y t i cc o n d i t i o n s .PO D p u r i f i c a t i o n . M y c e l i a h a r v e s t e d f r o m 1 2 - d a y - o l d c u l -t u r e s g r o w n w i t h c o r n s t e e p w e r e d i s r u p t e d , a n d a c r u d ee x t r a c t was o b t a i n e d . T h i s e x t r a c t w a s t h e n s u b j e c t e d t op u r i f i c a t i o n b y h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n o n p h e n y l - S e p h a -r o s e C L - 4 B , t h e n a n i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o n MonoQ HR 5 / 5 , a n d f i n a l l y b y g e l f i l t r a t i o n o n S u p e r o s e 6 HR 1 0 / 3 0c o l u m n s ( s e e r e f e r e nc e 3 6 f o r f u r t h e r d e t a i l s ) . T h e p u r i f i e de n z y m e f o r m e d a s i n g l e b a n d w i t h t h e p o l y c l o n a l PO Da n t i s e r u m a s d e t e r m i n e d b y i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s w i t h aP h a s t S y s t e m ( P h a r m a c i a , U p p s a l a , S w e d e n ) . P u r i f i e d PODp r o d u c e d i n t h i s way was u s e d f o r s u b s e q u e n t a n t i b o d yp r o d u c t i o n a n d a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o r e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) s t u d i e s .E n z y m e a s s a y s . P y r a n o s e o x i d a s e a c t i v i t y w a s a s s a y e d b ym e a s u r i n g p r o d u c t i o n o f H202 a s d e s c r i b e d b y V o l c a n dE r i k s s o n ( 3 5 ) . E a c h m i x t u r e ( 2 . 0 m l ) c o n t a i n e d 2 0 0 , u m o l o fN a p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 5 ) , 1 0 0 , u m o l o f D - g l u c o s e , 5 . 0, u m o l o f DMAB ( 3 - d i m e t h y l a m i n o b e n z o i c a c i d ; F l u k aC h e m i e , B u c h s , S w i t z e r l a n d ) , 0 . 1 , u m o l o f MBTH ( 3 - m e t h y l -2 - b e n z o t h i a z o l i n o n e h y d r a z o n e h y d r o c h l o r i d e ; F l u k a Chem-i e ) , 8 5 n k a t o f h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( S i g m a C h e m i c a l C o . ) ,a n d e n z y m e e x t r a c t t o b e a s s a y e d . T h e r e a c t i o n was m o n i -t o r e d a t 5 9 0 n m a t 2 5 C . One u n i t ( 1 U = 1 6 . 6 7 n k a t ) o f t h eenzyme was d e f i n e d a s t h e a m o u n t o f a c t i v i t y t h a t w o u l dp r o d u c e 1 , u m o l o f H202 p e r m i n u n d e r t h e a s s a y c o n d i t i o n s .Enzyme a s s a y s w e r e p e r f o r m e d o n t h e e x t r a c t s f r o m 2 . 0 g( f r e s h w e i g h t ) a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 3 6 ) .P o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . A n t i s e r u m t o POD was r a i s e d i nN e w Z e a l a n d W h i t e r a b b i t s i m m u n i z e d o v e r a 6 - m o n t hp e r i o d a f t e r m u l t i p l e i n t r a c u t a n e o u s i n j e c t i o n s o f t h e p u r i f i e de n z y m e i m m u l s i f i e d i n F r e u n d ' s c o m p l e t e a d j u v a n t ( D i f c oL a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h . ) . T h e i m m u n o g l o b u l i n f r a c t i o n( i m m u n o g l o b u l i n G ) was s u b s e q u e n t l y p r e p a r e d b y ammo-n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n b y s t a n d a r d t e c h n i qu e s ( 1 7 ) . I n t h eE L I S A , t h e POD a n t i s e r u m p r o d u c e d a s t r o n g p o s i t i v ec r o s s - r e a c t i o n w i t h t h e PO D a n t i g e n ( A 4 0 5 = 1 . 7 2 v e r s u sc o n t r o l A 4 0 5 = 0 . 0 1 a t 1 : 1 0 0 d i l u t i o n , 1 5 - m i n d e v e l o p m e n tt i m e ) . I n c o n t r o l ELISA s t u d i e s , t h e POD a n t i b o d y d i d n o ts h o w c r o s s - r e a c t i v i t y w i t h g l u c o s e 1 - o x i d a s e ( , B - D - g l u c o s e :o x y g e n 1 - o x i d o r e d u c t a s e ; EC 1 . 1 . 3 . 4 ) f r o m A s p e r g i l l u s n i g e r( S i g m a C h e m i c a l C o . ) w i t h a n a n t i b o d y d i l u t i o n o f 1 : 1 0 0 a n di n a d i l u t i o n s e r i e s ( 1 0 - 1 t o 1 0 - 6 ) o f t h e e n z y m e a n t i g e n .L i g h t m i c r o s c o p y . F o r l i g h t m i c r o s c o p y , s e m i - t h i n s e c t i o n s( 0 . 5 p , m ) o f r e s i n e m b e d d e d m y c e l i a l p e l l e t s w e r e s t a i n e d

T i m e ( D a y s )F I G . 1 . PO D p r o d u c t i o n b y P . c h r y s o s p o r i u m K - 3 . S y m b o l s : O ,m y c e l i a l d r y w e i g h t ; * , pH v a l u e s ; PO D a c t i v i t y i n f u n g a l e x t r a c t( @ ) a n d c u l t u r e f i l t r a t e ( 0 ) .

w i t h 0 . 5 % ( w t / v o l ) a q u e o u s t o l u i d i n e b l u e ( p H 7 . 0 ) a n de x a m i n e d b y b r i g h t - f i e l d i l l u m i n a t i o n w i t h a L e i t z O r t h o p l a nm i c r o s c o p e .TEM. M y c e l i a l f r a c t i o n s f o r f i x a t i o n w e r e r e m o v e d f r o mc u l t u r e s a f t e r 3 , 4 , 1 0 , 1 2 , 1 6 , a n d 1 8 d a y s o f g r o w t h , w h i c hr e p r e s e n t e d s t a g e s d u r i n g i n i t i a t i o n , a t m a x i m a l PO D p r o -d u c t i o n , a n d i n s c e n e s c e n t s t a g e s o f t h e h y p h a e ( F i g . 1 ) .S a m p l e s ( n o r m a l l y 1 0 t o 2 0 p e l l e t s o f m y c e l i u m ) f o r u l t r a -s t r u c t u r a l a n d i m m u n o l o g i c a l s t u d i e s w e r e f i x e d f o r 3 h i n 3%( v o l / v o l ) g l u t a r a l d e h y d e c o n t a i n i n g 2% p a r a f o r m a l d e h y d e i n0 . 1 M N a c a c o d y l a t e ( p H 7 . 2 ) b u f f e r a t room t e m p e r a t u r e .S a m p l e s w e r e t h e n w a s h e d t h r e e t i m e s i n b u f f e r a n d p o s t -f i x e d i n 1% ( w t / v o l ) osmium t e t r o x i d e i n 0 . 1 M b u f f e r f o r 1 ha t r o o m t e m p e r a t u r e . A d d i t i o n a l s a m p l e s w e r e p r e - a n dp o s t f i x e d a s d e s c r i b e d a b o v e b u t i n t h e p r e s e n c e o f r u t h e -n i u m r e d ( R R) ( 0 . 0 1 % [ w t / v o l l ) t o c o n t r a s t e x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e s . A f t e r f u r t h e r w a s h e s i n b u f f e r a n d d i s t i l l e dw a t e r , s a m p l e s w e r e d e h y d r a t e d i n a n e t h a n o l s e r i e s ( 2 0 t o1 0 0 % ; 10% s t e p s , 1 0 m i n e a c h ) , i n f i l t r a t e d w i t h London r e s i n( L o n d o n R e s i n C o. , B a s i n g s t o k e , U n i t e d K i n g d o m ) , a n dp o l y m e r i z e d o v e r n i g h t a t 6 0 C . O t h e r s a m p l e s w e r e f i x e d f o r3 h i n 4% ( v o l / v o l ) p a r a f o r m a l d e h y d e c o n t a i n i n g 1% ( v o l /v o l ) g l u t a r a l d e h y d e o r 8% p a r a f o r m a l d e h y d e i n t h e s a m eb u f f e r a n d t h e r e a f t e r d e h y d r a t e d a n d i n f i l t r a t e d w i t h r e s i n a sd e s c r i b e d a b o v e . S e l e c t e d m a t e r i a l was s e c t i o n e d w i t h aR e i c h e r t FC4 u l t r a m i c r o t o m e , a n d s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d o nn i c k e l g r i d s . P o s t s t a i n i n g , when p e r f o r m e d , was c o n d u c t e dw i t h 4% a q u e o u s u r a n y l a c e t a t e ( 5 m i n ) a n d l e a d c i t r a t e ( 2 7 )( 1 5 m i n ) . O b s e r v a t i o n s w e r e made w i t h a P h i l i p s 2 01 o r CM/12TEM o p e r a t e d a t v a r i o u s a c c e l e r a t i n g v o l t a g e s .ELISA c o n d u c t e d o n t h e e f f e c t s o f g l u t a r a l d e h y d e - p a r a -f o r m a l d e h y d e f i x a t i o n o n a n t i g e n i c i t y o f t h e POD a n t i g e n f o ri t s a n t i b o d y s h o w e d A 4 0 5 v a l u e s o f 1 . 5 3 ( 3 % g l u t a r a l d e -hyde-2% p a r a f o r m a l d e h y d e ) a n d 1 . 5 6 ( 4 % p a r a f o r m a l d e -

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


3/10

IMMUNOCYTOCHEMICAL STUDIES ON PYRANOSE OXI D ASE 3 6 6 9h y d e - 1 . 0 % g l u t a r a l d e h y d e ) . P o s t f i x a t i o n i n OS04 p r o d u c e d ac a . 50% l o s s i n a n t i g e n i c i t y ( A 4 0 5 = 0 . 7 6 ) . R es u l t s r e p or t e dh e r e a r e f o r s a m p l e s f i x e d i n 3% g l u t a r a l d e h y d e - 2 % p a r a -f o r m a l d e h y d e a n d t h e n o s m i u m , i n w h i c h t h e u l t r a s t r u c t u r a lp r e s e r v a t i o n was s u p e r i o r t o t h a t o b t a i n e d w i t h t h e o t h e rf i x a t i v e s u s e d .TEM i m m u n o c y t o c h e m i s t r y s t u d i e s . U l t r a t h i n s e c t i o n s f o ri m m u n o l a b e l i n g w e r e p r o c e s s e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 4 ) .S e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t 4 C i n a n t i - P O D ( 1 : 1 0 0 )c o n t a i n i n g 1% ( w t / v o l ) b o v i n e s e r u m a l b u m i n a n d 0 . 0 5 %Tween 2 0 a n d s u b s e q u e n t l y g o l d l a b e l e d w i t h g o a t a n t i -r a b b i t I g G 1 5 - n m g o l d p r o b e s ( B - 2 3 4 0 ; J a n s s e n L i f e S c i e n c eP r o d u c t s , B e e r s e , B e l g i u m ) . P o s t s t a i n i n g when p e r f o r m e dwas d o n e w i t h u r a n y l a c e t a t e a n d l e a d c i t r a t e a s d e s c r i b e da b o v e . C o n t r o l s i n c l u d ed o m i s s i o n o f t h e p r i m a r y a n t i s e r u ms t a g e a n d u s e o f a n t i - P O D p r e a d s o r b e d w i t h POD.

RESULTSE n z y m e p r o d u c t i o n . PO D p r o d u c t i o n a s m e a s u r e d b y t h eD MAB -MBTH H202 p e r o x i d a s e a s s a y i n c o r n s t e e p c u l t u r e si s s h o w n i n F i g . 1 . POD w a s f i r s t d e t e c t e d a f t e r 7 d a y s d u r i n gt h e s t a t i o n a r y p h a s e o f g r o w t h a s b o t h t h e m y c e l i a l m a s s w a s

d e c r e a s i n g a n d t h e g l u c o s e l e v e l s w e r e b e c o m i n g d e p l e t e d .A f t e r 8 d a y s o f g r o w t h , n o g l u c o s e w a s d e t e c t e d w i t h t h eC l i n i s t i x i n d i c a t o r p a p e r . Maximum m y c e l i a l POD a c t i v i t ywas r e c o r d e d a f t e r 1 2 d a y s o f g r o w t h ( 2 . 1 5 U g [ d r yw e i g h t ] - 1 ) , when t h e pH h a d i n c r e a s e d f r o m pH 4 . 5 t o 8 . 2 .T h e e n z y m e w a s a l s o d e t e c t e d i n t h e e x t r a c e l l u l a r c u l t u r ef l u i d w i t h maximum a c t i v i t y ( 8 . 8 7 m U / m l ) r e c o r d e d a f t e r a1 2 - t o 1 3 - d a y g r o w t h p e r i o d ( F i g . 1 ) . D u r i n g t h e e x p e r i m e n t ,t h e t o t a l pH i n c r e a s e d f r o m 4 . 5 t o 8 . 5 ( F i g . 1 ) .L i g h t m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s o n m y c e l i a l p e l l e t s . U n d e rt h e p r e s e n t s h a k e c u l t u r e c o n d i t i o n s , P . c h r y s o s p o r i u m K - 3p r o d u c e d s m a l l y e l l o w p e l l e t s o f m y c e l i a w h i c h i n c r e a s e d t oa maximum d i a m e t e r o f a p p r o x i m a t e l y 3 t o 4 . 0 mm a f t e r 3 t o4 d a y s o f g r o w t h . P r o d u c t i o n o f p e l l e t s i s a w e l l - k n o w ng r o w t h c h a r a c t e r i s t i c f o r t h i s f u n g u s u n d e r s h a k e c o n d i t i o n sa n d i s n o t o b s e r v e d i n s t a t i o n a r y c u l t u r e s . L i g h t m i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n s o f s m a l l e r p e l l e t s ( 2 0 0 t o 4 0 0 , u m ) s h o w e d t h e mt o c o n s i s t o f a n o u t e r r i n g o f m y c e l i a s u r r o u n d i n g a c e n t r a lr e g i o n o f l o o s e l y p a c k e d h y p h a e . D u r i n g t h e c u l t u r e p e r i o d ,t h e o u t e r r i n g o f m y c e l i a b e c a m e d e n s e l y p a c k e d a n d i n t e r -m e s h e d w i t h s l i m e . O b s e r v a t i o n s o n m y c e l i a l p e l l e t s a f t e r 3t o 4 d a y s d u r i n g t h e a c t i v e g r o w t h p h a s e s h o w e d h y p h a e t oh a v e a d e n s e l y s t a i n i n g c y t o p l a s m c o n t a i n i n g f e w v a c u o l e sa n d c o n s i d e r a b l e n u m b e r s o f s t o r a g e b o d i e s . A t t h i s s t a g e ,f e w s p o r e s o r l y s e d h y p h a e w e r e p r e s e n t . E x t r a c e l l u l a r s l i m ew h e r e p r e s e n t a p p e a r e d t o b e c l o s e l y a p p l i e d t o t h e h y p h a lc e l l w a l l s . A f t e r 1 0 d a y s o f g r o w t h , many o f t h e h y p h a es h o w e d a l e s s d e n s e l y s t a i n i n g c y t o p l a s m a n d v a c u o l a t i o nh a d i n c r e a s e d . E x t r a c e l l u l a r s l i m e was now p r o m i n e n t s u r -r o u n d i n g h y p h a e , f o r m i n g a c o m p l e x m y c e l i u m - s l i m e n e t -work i n b o t h t h e i n n e r a n d o u t e r r e g i o n s o f t h e p e l l e t s . Tw ot y p e s o f s l i me w e r e n o t e d , n a m e l y ( i ) a l o o s e l y p a c k e dm a t e r i a l i n t e r s p e r s e d b e t w e e n c e l l s a n d ( i i ) a m o r e c o m p a c td e n s e r s l i m e c l o s e l y s u r r o u n d i n g i n d i v i d u a l o r s m a l l g r o u p so f h y p h a e . A t t h i s s t a g e , t h e r e l a t i v e n u m b e r s o f l y s edh y p h a e a n d a s e x u a l s p o r e s h a d i n c r e a s e d i n c o m p a r i s o n w i t ht h o s e s e e n a t 4 d a y s . A f t e r 1 6 t o 1 8 d a y s o f g r o w t h , d u r i n gt h e s c e n e s c e n t p h a s e , t h e m a j o r i t y o f h y p h a e w e r e l y s e d b u twere s t i l l h e l d t o g e t h e r i n a n e x t e n s i v e e x t r a c e l l u l a r s l i m em a t r i x .TEM a n d TEM i m m u n o c y t o c h e m i s t r y . F o r u l t r a s t r u c t u r a la n d i m m u n o c y t o c h e m i c a l o b s e r v a t i o n s , s m a l l e r p e l l e t s ( 2 0 0t o 4 0 0 , u m ) w e r e s e l e c t e d , a n d o b s e r v a t i o n s w e r e made

r a n d o m l y o n h y p h a e f r o m t h e p e r i p h e r a l r e g i o n s o f t h ep e l l e t s .( i ) T h r e e - t o f o u r - d a y c u l t u r e p e r i o d . Hyphae a f t e r 3 t o 4d a y s o f g r o w t h f i x e d i n g l u t a r a l d e h y d e - p a r a f o r m a l d e h y d ed i s p l a y e d a c o m p a c t c y t o p l a s m i c s t r u c t u r e , a w e l l - d e v e l -o p e d e n d o m e m b r a n o u s s y s t e m , a n d n u m e r o u s m i t o c h o n d r i a( F i g . 2 a a n d b ) . Hyphae w e r e p a c k e d w i t h e l e c t r o n - l u c e n ts t o r a g e s t r u c t u r e s a s w e l l a s l e s s e r n u m b e r s o f l a r g e r mem-b r a n e - b o u n d e l e c t r o n d e n s e b o d i e s ( F i g . 2 ) . T h e s e e l e c t r o n -d e n s e b o d i e s c o n t a i n e d a m o r p h o u s m a t e r i a l s a t v a r i o u ss t a g e s o f a p p a r e n t d e g e n e r a t i o n ( F i g . 2 c a n d d ) . I n a d d i t i o nt o n u c l e i , h y p h a e c o n t a i n e d a w e l l - d e v e l o p e d m i c r o t u b u l a rs y s t e m , w i t h b a n d s o f t e n r u n n i n g a l o n g t h e l e n g t h o f t h eh y p h a e . Membrane s t r u c t u r e s a n d m u l t i v e s i c u l a r b o d i e sw e r e a l s o p r o m i n e n t a n d w e r e o f t e n a s s o c i a t e d w i t h t h ee l e c t r o n - d e n s e b o d i e s a n d o u t e r c e l l membrane ( F i g . 2 b a n dd ) . M u l t i p l e p r o j e c t i o n s o f t h e o u t e r c e l l membrane a n d o t h e rmembranous m a t e r i a l s w e r e a l s o o b s e r v e d i n t h e p e r i p l a s m i cs p a c e ( i . e . , c e l l m e m b r a n e - f u n g a l c e l l w a l l i n t e r f a c e ) b e n e a t ht h e f u n g a l c e l l w a l l ( F i g . 2 c ) .U s i n g PO D a n t i b o d i e s , PO D w a s l o c a l i z e d i n t h e p e r i p l a s -m i c s p a c e , a n d a n o v e r a l l p o s i t i v e l a b e l i n g o f e l e c t r o n - l u c e n tr e g i o n s w a s n o t e d ( F i g . 3 a t o e ) . T h e c o n t e n t s o f t h ee l e c t r o n - l u c e n t r e g i o n s , p a r t i c u l a r l y membrane s t r u c t u r e s ,w e r e s p e c i f i c a l l y l a b e l e d , a s w e l l a s m u l t i v e s i c u l a r b o d i e s( F i g . 3 b , d , f , a n d g ) . F r e q u e n t l y , m y c e l i a l s t r u c t u r e s w e r eo b s e r v e d i n w h i c h o n e h y p h a h a d d e v e l o p e d w i t h i n t h ec o n f i n e s o f a n e x i s t i n g h y p h a ( i . e . , i n t r a h y p h a e [ 3 0 1 ) ( F i g .3 d ) . B o t h h y p h a e , h o w e v e r , s h o w e d t y p i c a l f u n g a l c e l l w a l l s .S u c h i n t r a h y p h a e s h o w e d p e r i p h e r a l a n d i n t r a c e l l u l a r mem-b r a n e POD l a b e l i n g c h a r a c t e r i s t i c s s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e df o r n o r m a l h y p h a e ( c f . F i g . 3 a a n d d ) . I n c o n t r a s t , t h ed i s r u p t e d i n t r a c e l l u l a r c o n t e n t s o f t h e o u t e r e n c a p s u l a t i n gh y p h a e , p a r t i c u l a r l y membrane s t r u c t u r e s , s h o w e d s t r o n gPO D l a b e l i n g s i m i l a r t o t h a t o f l y s e d c e l l s ( F i g . 3 d ) .A t t h i s p h a s e o f d e v e l o p m e n t , s o m e e x t r a c e l l u l a r s l i m ewas n o t e d , b u t g e n e r a l l y t h i s w a s c l o s e l y p r e s s e d t o t h eo u t e r h y p h a l c e l l a n d s p e c i f i c l a b e l i n g was n o t r e c o g n i z e d .( i i ) T e n - t o 1 2 - d a y c u l t u r e p e r i o d . A f t e r 1 0 t o 1 2 d a y s o fc u l t u r e , h y p h a e s h o w e d a t e n d e n c y f o r a n i n c r e a s e i n c e l lv a c u o l a t i o n a n d b o t h a d e g e n e r a t i o n a s w e l l a s d e c r e a s e i nt h e n u m b e r s o f e l e c t r o n - d e n s e s t r u c t u r e s . A s i m i l a r p a t t e r no f PO D l a b e l i n g , w i t h t h e c e l l membrane a n d p e r i p l a s m i cs p a c e o f h y p h a e r e a c t i n g m o s t s t r o n g l y , a s s e e n f o r 3 - t o4 - d a y - o l d h y p h a e , was n o t e d ( F i g . 4 c a n d d ) . I n t r a h y p h a ew e r e a p p a r e n t , a n d a s t r o n g l a b e l i n g f o r POD w i t h m e m b r a -n o u s s t r u c t u r e s i n t h e e n c a p s u l a t i n g h y p h a e w a s n o t e d ( F i g .4 a ) . T h e m e m b r a n o u s c o n t e n t s w i t h i n d e g e n e r a t e d e l e c t r o n -d e n s e b o d i e s a l s o l a b e l e d s t r o n g l y , i n d i c a t i n g t h a t POD wasa s s o c i a t e d w i t h t h e s e s t r u c t u r e s ( F i g . 4 b ) .A c h a r a c t e r i s t i c f e a t u r e o f many h y p h a e a t t h i s p h a s e o fmaximum POD a c t i v i t y was t h e p r e s e n c e o f a p r o n o u n c e dp e r i p l a s m i c s p a c e ( F i g . 4 c ) , a p p a r e n t l y p r o d u c e d b y c o n t r a c -t i o n o f t h e c e l l c y t o p l a s m f r o m t h e f u n g a l c e l l w a l l . Mem-b r a n o u s s t r u c t u r e s a n d v e s i c l e s w i t h i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c el a b e l e d s t r o n g l y f o r t h e p r e s e n c e o f POD, a s d i d s i m i l a rs t r u c t u r e s i n t h e c o n t r a c t e d c y t o p l a s m ( F i g . 4 c ) . T h e c o n -t e n t s a n d m e m b r a n o u s s t r u c t u r e s a s s o c i a t e d w i t h i n d i v i d u a lm u l t i v e s i c u l a r b o d i e s s h o w e d l a b e l i n g , a s d i d , o n o c c a s i o n ,m e m b r a n e s o f t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . L a b e l i n g o f m u l -t i v e s i c u l a r b o d y m e m b r a n e s w e r e n o t e d , s u g g e s t i n g t h a t t h i sma y r e p r e s e n t a r o u t e o f POD s e c r e t i o n i n t o t h e p e r i p l a s m i cs p a c e ( F i g . 4 e ) . S m a l l i n v o l u t i o n s o f t h e c e l l membrane w e r eo b s e r v e d , p r o d u c i n g a s m a l l l o c a l i z e d p e r i p l a s m i c s p a c ec o n t a i n i n g m e m b r a n e - b o u n d v e s i c l e s p o s i t i v e l y l a b e l e d f o rPO D ( F i g . 4 f a n d g ) . P a r t i a l l y l y s e d c e l l s t y p i c a l l y s h o w e d a

V O L . 5 8 , 1 9 9 2


4/10

3 6 7 0 D A N I E L ET AL.

F I G . 2 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s s h o w i n g g e n e r a l u l t r a s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f h y p h a e f r o m 4 - d a y - o l d c u l t u r e s . ( a ) L o n g i t u d i n a ls e c t i o n s h o w i n g d e n s e c y t o p l a s m , a m o r p h o u s e l e c t r o n - d e n s e b o d i e s ( E d ) , e l e c t r o n - l u c e n t r e g i o n s ( E l ) , n u c l e u s ( N ) , m i c r o t u b u l e b u n d l e ( M ) ,a n d m i t o c h o n d r i a ( M t ) . ( b ) T r a n s v e r s e s e c t i o n s h o w i n g f e a t u r e s s i m i l a r t o t h o s e i n p a n e l a a n d a l s o a c e n t r a l m u l t i v e s i c u l a r b o d y ( a r r o w ) a n ds t r u c t u r e s w i t h i n a p e r i p l a s m i c s p a c e ( P s ) . ( c ) O b l i q u e s e c t i o n s h o w i n g m e m b r a n o u s p r o t r u b e r a n c e s ( M p ) f r o m t h e o u t e r c e l l m e m b r a n e i n t ot h e p e r i p l a s m i c s p a c e . M e m b r a n o u s m a t e r i a l s a p p e a r t o b e p r o d u c e d w i t h i n t h e c e l l c y t o p l a s m ( a r r o w s ) . ( d ) A s s o c i a t i o n o f a m o r p h o u se l e c t r o n - d e n s e ( E d ) a n d m u l t i v e s i c u l a r b o d i e s ( M v b ) . T h e m u l t i v e s i c u l a r b o d y a p p e a r s t o h a v e d i r e c t c o n t a c t w i t h t h e o u t e r c e l l m e m b r a n e( C m ) a n d p e r i p l a s m i c s p a c e ( P s ) ( a r r o w ) . B a r s : a , 1 . 0 , m ; b , 0 . 5 L m ; c , 0 . 2 5 , u m ; d , 0 . 1 p , m . A b b r e v i a t i o n s : C m , c e l l m e m b r a n e ; C w , f u n g a lc e l l w a l l ; E l , e l e c t r o n - l u c e n t r e g i o n ; E d , e l e c t r o n - d e n s e b o d y ; M , m i c r o t u b u l e b u n d l e ; M t , m i t o c h o d r i a ; M p , m e m b r a n o u s p r o t r u b e r a n c e s ;M v b , m u l t i v e s i c u l a r b o d y ; N , n u c l e u s ; P s , p e r i p l a s m i c s p a c e .

s t r o n g p o s i t i v e POD l a b e l i n g o f membranous s t r u c t u r e s a n dv e s i c l e s i n t e r m e s h e d i n t h e d i s r u p t e d c e l l c y t o p l a s m o r i n t h enow e n l a r g e d p e r i p l a s m i c s p a c e ( F i g . 5 a a n d b ) . E x t r a c e l l u -l a r s l i m e p r o j e c t i n g f r o m h y p h a e l a b e l e d p o s i t i v e l y f o r POD,p a r t i c u l a r l y t h a t s u r r o u n d i n g l y s e d h y p h a e .I n c l u s i o n o f RR d u r i n g f i x a t i o n c a u s e d a n o v e r a l l p i n k i s h -r e d s t a i n i n g o f t h e f u n g a l p e l l e t s a t a l l g r o w t h p h a s e s . Ac o n s p i c u o u s f e a t u r e o f i n c l u d i n g RR s e e n i n h y p h a e f r o mb o t h 1 2 - d a y - o l d a n d , t o a l e s s e r e x t e n t , 4 - d a y - o l d c u l t u r e swas t h e d e v e l o p m e n t o f c h a r a c t e r i s t i c e l e c t r o n - d e n s e a g g r e -g a t e s o f R R - O s 0 4 i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c e ( F i g . S c ) . I n s o m eh y p h a e , t h e a g g r e g a t e s w e r e s m a l l a n d f i n e l y d i s t r i b u t e d a tt h e c e l l w a l l i n t e r f a c e , w h e r e a s i n o t h e r e x a m p l e s , t h e

a g g r e g a t e s w e r e l a r g e a n d a p p e a r e d t o p r o j e c t f r o m t h e o u t e rs i d e o f t h e c e l l m e m b r a n e ( F i g . 5 c ) .( i i i ) S i x t e e n - t o 1 8 - d a y c u l t u r e p e r i o d . A t t h i s s t a g e , t h em a j o r i t y o f h y p h a e w e r e l y s e d a n d c o n t a i n e d a d i s r u p t e d c e l lc y t o p l a s m i n w h i c h v e s i c l e s a n d m e m b r a n e s t r u c t u r e s w e r ep r o m i n e n t . H y p h a e w e r e g e n e r a l l y e n m e s h e d i n a c o m p l e xn e t w o r k o f e x t r a c e l l u l a r s l i m e o f w h i c h a c e r t a i n f i b r i l l a rf r a c t i o n c l o s e t o t h e e x t e r n a l f u n g a l c e l l w a l l s t a i n e d s t r o n g l yw i t h R R . I n l y s e d c e l l s , POD was l o c a l i z e d p r e f e r e n t i a l l yw i t h v e s i c u l a r s t r u c t u r e s , b o t h w i t h t h e i r s u r r o u n d i n g mem-b r a n e s a n d i n t r a c e l l u l a r c o n t e n t s ( F i g . 6 a a n d b ) . V e r y o f t e n ,s t r o n g l a b e l e d w h o r l e d m e m b r a n o u s s t r u c t u r e s a n d v e s i c l e sw e r e t h e o n l y r e m a i n i n g s t r u c t u r e s v i s i b l e i n t o t a l l y l y s e d

F I G . 3 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s s h o w i n g i n t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f PO D i n P . c h r y s o s p o r i u m f r o m 4 - d a y - o l d c u l t u r e s . ( a )T r a n s v e r s e s e c t i o n o f a h y p h a g i v i n g a n o v e r v i e w o f t h e s p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f PO D i n t h e p e r i p h e r a l c e l l c y t o p l a s m i n a s s o c i a t i o n w i t h t h ec e l l m e m b r a n e ( a r r o w s ) . ( b ) T r a n s v e r s e s e c t i o n o f a h y p h a s h o w i n g a s s o c i a t i o n o f PO D w i t h t h e c e l l m e m b r a n e ( C m ) a n d i n t r a c e l l u l a re l e c t r o n - l u c e n t r e g i o n s ( E l ) . ( c ) T r a n s v e r s e s e c t i o n o f a h y p h a w i t h l o c a l i z a t i o n o f PO D i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c e ( P s ) a n d c e l l m e m b r a n e ( C m ) .( d ) H y p h a l t r a n s v e r s e s e c t i o n s h o w i n g a t y p i c a l i n t r a h y p h a l s t r u c t u r e s u r r o u n d e d b y t h e s h e l l o f a n o u t e r l y s e d h y p h a . T h e s p a t i a l d i s t r i b u t i o no f PO D i n t h e i n t r a h y p h a w a s s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n n o r m a l h y p h a e . M e m b r a n o u s s t r u c t u r e s ( M s ) a n d v e s i c l e s c o n t a i n e d i n t h e l y s e do u t e r h y p h a w e r e l a b e l e d s t r o n g l y f o r POD. B o t h h y p h a e a r e s u r r o u n d e d b y a p p a r e n t l y n o r m a l c e l l w a l l s . ( e ) H i g h e r m a g n i f i c a t i o n s h o w i n gl a b e l i n g o f t h e c e l l m e m b r a n e ( C m ) a n d a n i n t r a c e l l u l a r v e s i c l e ( v ) s t r u c t u r e . ( f a n d g ) PO D a s s o c i a t e d w i t h e l e c t r o n - l u c e n t ( E l ) r e g i o n s a n da m u l t i v e s i c u l a r b o d y ( M v b ) . T h e f r e q u e n t a s s o c i a t i o n o b s e r v e d b e t w e e n m e m b r a n e s t r u c t u r e s o f m u l t i v e s i c u l a r b o d i e s a n d t h e c e l lm e m b r a n e ( C m ) may r e p r e s e n t a p o s s i b l e r o u t e f o r PO D s e c r e t i o n . B a r s : a t o d , 0 . 5 p m ; e a n d g , 0 . 1 p , m ; f , 0 . 2 p , m .

A P P L . E N v I R O N . M I C R O B I O L .


5/10

V O L . 5 8 , 1 9 9 2 IMMUNOCYTOCHEMICAL STUDIES ON PYRANOSE OXIDASE 3 6 7 1


6/10


~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ -# ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~w~~~Cx;ftI

3 6 7 2 D A N I E L ET AL.


7/10

IMMU NO CYTOCHEMIC A L STUDIES ON PYRANOSE OXIDASE 3 6 7 3

F I G . 5 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s s h o w i n g P . c h r y s o s p o r i u m h y p h a e f r o m 1 2 - d a y - o l d c u l t u r e s a f t e r i m m u n o c y t o c h e m i s t r y o rt r e a t m e n t w i t h R R . ( a ) O b l i q u e s e c t i o n s h o w i n g a t y p i c a l p a r t i a l l y l y s e d h y p h a . POD was c o n c e n t r a t e d i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c e ( P s ) ,a s s o c i a t e d w i t h m e m b r a n e - b o u n d v e s i c l e s ( v ) a n d o t h e r s t r u c t u r e s . L a b e l i n g o f membrane s t r u c t u r e s ( M s ) i n t h e d i s r u p t e d c e l l c y t o p l a s m wasa l s o a p p a r e n t . ( b ) H i g h m a g n i f i c a t i o n s h o w i n g l a b e l i n g o f b o t h v e s i c l e s ( v ) a n d v e s i c l e m e m b r a n e s s i t u a t e d i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c e o f ap a r t i a l l y l y s e d c e l l . ( c ) L o n g i t u d i n a l s e c t i o n s h o w i n g p r e s e n c e o f e l e c t r o n - d e n s e a g g r e g a t e s o f R R - O s 0 4 i n h y p h a e f r o m m y c e l i a l p e l l e t st r e a t e d w i t h R R . A g g r e g a t e s w e r e l o c a l i z e d i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c e w h e r e t h e y a p p e a r e d t o p r o j e c t f r o m t h e o u t e r r e g i on s o f t h e c e l lm e m b r a n e ( C m ) ( a r r o w s ) . B a r s : a a n d c , 0 . 5 p L m ; b , 0 . 2 5 p L m .

h y p h a e ( F i g . 6 b ) . T h e p r e s e n c e o f PO D i n p e r i p h e r a l c e l lr e g i o n s w a s v a r i a b l e , a n d w h i l e s o m e h y p h a l g h o s t w a l l ss h o w e d a s t r o n g p r e s e n c e o f PO D ( F i g . 6 c ) , o t h e r h y p h a el a b e l e d o n l y p o o r l y , s u g g e s t i n g t h e a b s e n c e o f POD.E x t r a c e l l u l a r s l i m e s u r r o u n d i n g h y p h a e l a b e l e d m o s ts t r o n g l y f o r POD i n s a m p l e s f i x e d i n p a r a f o r m a l d e h y d e o n l ya n d e m b e d d e d i n L o n d o n r e s i n ( F i g . 6 d a n d e ) . T h e g r e a t e s tl a b e l i n g a n d e v i d e n c e f o r PO D w a s o b s e r v e d i n s l i m e s u r -r o u n d i n g l y s e d h y p h a e . S l i m e m a t e r i a l s p r o c e s s e d a f t e rp a r a f o r m a l d e h y d e f i x a t i o n w e r e , h o w e v e r , p o o r l y d e f i n e d ,a n d i t was n o t p o s s i b l e t o v i s u a l i z e a f i b r i l l a r s t r u c t u r e a f t e rPO D l a b e l i n g ( F i g . 6 e ) . F i b r i l l a r s t r u c t u r e s a f t e r RR t r e a t -m e n t w e r e o b s e r v e d i n o n l y a m i n o r p o r t i o n o f t h e e x t r a c e l -l u l a r s l i m e , o f t e n i n c l o s e c o n t a c t w i t h t h e h y p h a e .B o t h c o n t r o l s i n c l u d e d i n t h e l a b e l i n g e x p e r i m e n t s , i n c l u d -i n g o m i s s i o n o f t h e PO D s t a g e a n d u s e o f a n t i - P O D p r e a d -s o r b e d w i t h POD, p r o d u c e d n e g a t i v e r e s u l t s .L i g n i n o l y t i c c u l t u r e s . S t u d i e s d o n e o n m y c e l i a l f r o m 6 - d a y -o l d s t a t i c l i g n i n o l y t i c c u l t u r e s o f P . c h r y s o s p o n i u m K - 3s h o w e d a l a b e l i n g p a t t e r n s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d f o rc o r n s t e e p c u l t u r e s . PO D was o b s e r v e d a s s o c i a t e d w i t hi n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s t r u c t u r e s a n d was a l s o l o c a l i z e da l o n g t h e c e l l m e m b r a n e ( F i g . 6 f a n d h ) . E x a m p l e s o fi n t r a h y p h a e w i t h i n a u t o l y s e d h y p h a e w e r e a l s o n o t e d ( F i g .

6 g ) . O n l y a weak i n d i c a t i o n f o r PO D w a s n o t e d i n e x t r a c e l -l u l a r s l i m e m a t e r i a l s e n m e s h i n g f u n g a l h y p h a e ( F i g . 6 f ) .DISCUSSION

W i t h l i q u i d c u l t u r e s o f P . c h r y s o s p o r i u m K - 3 g r o w n w i t hc o r n s t e e p , maximum PO D p r o d u c t i o n o c c u r r e d a f t e r 1 2 d a y sd u r i n g t h e s e c o n d a r y p h a s e o f m y c e l i a l g r o w t h when g l u c o s ew a s d e p l e t e d a n d t h e pH o f c u l t u r e medium h a d r i s e n o v e r8 . 0 . T h e s e c u l t u r e c h a r a c t e r i s t i c s a r e s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e dp r e v i o u s l y f o r POD p r o d u c t i o n b y T r a m e t e s ( C o r i o l u s ) v e s i -c o l o r a n d P . c h r y s o s p o r i u m ( 7 , 2 3 ) . A t t h e f i n e s t r u c t u r a ll e v e l , maximum POD p r o d u c t i o n was c o r r e l a t e d w i t h a ni n c r e a s e i n h y p h a l v a c u o l a t i o n , c y t o p l a s m i c d i s r u p t i o n , a n dc e l l l y s i s a n d o c c u r r e d when h y p h a e w e r e e n r o b e d i n e x t r a -c e l l u l a r s l i m e . A t t h i s t i m e , PO D was l o c a l i z e d p r e f e r e n t i a l l yw i t h i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c e a n d i n t r a c e l l u l a r l y a s s o c i a t e dw i t h m e m b r a n e s t r u c t u r e s . POD was a l s o f o u n d a s s o c i a t e dw i t h e x t r a c e l l u l a r s l i m e , p a r t i c u l a r l y a t l a t e r s t a g e s o f d e v e l -o p m e n t a n d e s p e c i a l l y s u r r o u n d i n g a u t o l y s e d c e l l s . A t e a r -l i e r p h a s e s o f h y p h a l d e v e l o p m e n t ( i . e . , 3 t o 4 d a y s ) , PO Dwas p r e f e r e n t i a l l y l o c a l i z e d w i t h i n i n t r a c e l l u l a r membranes t r u c t u r e s a s s o c i a t e d w i t h e l e c t r o n - d e n s e b o d i e s a s w e l l a sa l o n g t h e c e l l m e m b r a n e - f u n g a l w a l l i n t e r f a c e . I m m u n o c y t o -

F I G . 4 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s s h o w i n g s p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f PO D i n P . c h r y s o s p o r i u m h y p h a e f r o m 1 2 - d a y - o l d c u l t u r e s a tt h e t i m e o f maximum POD a c t i v i t y . ( a ) T r a n s v e r s e s e c t i o n s h o w i n g a c h a r a c t e r i s t i c i n t r a h y p h a . S u c h h y p h a e were more f r e q u e n t l y o b s e r v e da f t e r 1 2 d a y s t h a n a t 4 d a y s . T h e s p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f PO D was s i m i l a r t o t h a t s e e n a t 4 d a y s . M s , m e m b r a n o u s s t r u c t u r e . ( b ) A s s o c i a t i o no f PO D w i t h m e m b r a n o u s s t r u c t u r e s i n e l e c t r o n - d e n s e ( E d ) b o d i e s f r o m t h e more c e n t r a l c y t o p l a s m o f a h y p h a . ( c ) H y p h a l l o n g i t u d i n a ls e c t i o n s h o w i n g a c o n t r a c t e d c e l l c y t o p l a s m a n d a p r o n o u n c e d p e r i p l a s m i c s p a c e ( P s ) . Membrane s t r u c t u r e s ( M s ) a n d v e s i c l e s i n t h ep e r i p l a s m i c s p a c e s h o w e d s t r o n g e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f POD. E l e c t r o n - l u c e n t ( E l ) r e g i o n s i n t h e c o n t r a c t e d c e l l c y t o p l a s m a l s o s h o w e ds t r o n g l a b e l i n g f o r POD. ( d ) H i g h m a g n i f i c a t i o n s h o w i n g c o n c e n t r a t i o n o f PO D a l o n g t h e c e l l m e m b r a n e a n d i n n e r f u n g a l c e l l w a l l ( C w ) w h e r ea p e r i p l a s m i c s p a c e i s n o t e v i d e n t . F r e q u e n t l y i n h y p h a e a l s o t r e a t e d w i t h R R , more i n t e n s e l a b e l i n g o c c u r r e d i n r e g i o n s s h o w i n g s t r o n gs t a i n i n g w i t h t h e d y e ( a r r o w s ) . ( e ) PO D a s s o c i a t e d w i t h a m e m b r a n e w h o r l e d s t r u c t u r e w h i c h i s a l s o i n c o n t a c t w i t h t h e c e l l m e m b r a n e a n dp e r i p l a s m i c s p a c e . ( f a n d g ) F r e q u e n t l y , PO D wa s a s s o c i a t e d w i t h m e m b r a n e - b o u n d v e s i c l e s ( v ) i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c e ( P s ) , w h e r e s m a l li n v o l u t i o n s o f t h e o u t e r c e l l m e m b r a n e ( C m ) were e v i d e n t . B a r s : a a n d c , 0 . 5 p . m ; b , d t o g , 0 . 1 , u m .

V O L . 5 8 , 1 9 9 2


8/10

3 6 7 4 D A NIE L ET A L .

F I G . 6 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s s h o w i n g s p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f PO D i n P . c h r y s o s p o r i u m h y p h a e f r o m 1 7 - d a y - o l d c o r n s t e e pc u l t u r e s a n d f r o m 6 - d a y - o l d l i g n i n o l y t i c c u l t u r e s . ( a ) T r a n s v e r s e s e c t i o n s h o w i n g h i g h l y d i s r u p t e d h y p h a w i t h o n l y m e m b r a n e s t r u c t u r e s a n dv e s i c l e s ( v ) r e m a i n i n g . ( b ) L o n g i t u d i n a l h y p h a l s e c t i o n o f a h i g h l y l y s e d c e l l s h o w i n g s t r o n g l a b e l i n g f o r PO D on r e s i d u a l membrane s t r u c t u r e s( M s ) . T h e m e m b r a n e s t r u c t u r e s ma y r e p r e s e n t r e m n a n t s o f d i s r u p t e d m u l t i v e s i c u l a r b o d i e s . ( c ) H y p h a l s h e l l w i t h PO D a s s o c i a t e d w i t h t h ec e l l w a l l a n d i t s r e s i d u a l m a t e r i a l s . ( d a n d e ) E x t r a c e l l u l a r s l i m e , b o t h c l o s e t o a n d a t a d i s t a n c e f r o m h y p h a e , s h o w i n g l a b e l i n g f o r t h e p r e s e n c eo f POD. A s l i m e f i b r i l l a r s t r u c t u r e was n o t e v i d e n t . ( f t o h ) L o n g i t u d i n a l a n d t r a n s v e r s e s e c t i o n s o f h y p h a e f r o m l i g n i n o l y t i c c u l t u r e s . PO Dwas l o c a l i z e d a l o n g t h e c e l l membrane a n d w i t h membrane s t r u c t u r e s ( M s ) i n t h e c e l l v a c u o l e s ( Cv ) ( a r r o w s ) . L i k e c o r n s t e e p c u l t u r e s ,i n t r a h y p h a e i n a u t o l y s e d h y p h a e w e r e a l s o n o t e d . S p a r s e l a b e l i n g was n o t e d f o r PO D i n t h e e x t r a c e l l u l a r s l i m e . B a r s : a t o c a n d g , 0 . 5 p m ;d , e , a n d h , 0 . 2 5 p . m ; f , 1 . 0 p L m .

c h e m i c a l l a b e l i n g o f h y p h a e a f t e r 3 t o 4 d a y s o f d e v e l o p m e n tf u r t h e r i n d i c a t e d a n e a r l i e r o c c u r r e n c e o f POD t h a n t h a tr e c o r d e d b y t h e DM AB-MBTH H202 p e r o x i d a s e m e t h o d( i . e . , 7 d a y s ) , i n d i c a t i n g t h e r e l a t i v e g r e a t e r s e n s i t i v i t y o f t h ei m m u n o l o g i c a l a s s a y .

A s i g n i f i c a n t f e a t u r e o f h y p h a e f r o m 3 - a n d 1 0 - d a y - o l dc u l t u r e s was t h e p r e s e n c e o f m u l t i v e s i c u l a r b o d i e s . I n t e r n a lv e s i c l e s i n t h e s e s t r u c t u r e s w e r e o f t e n i n t e r c o n n e c t e d a n d o no c c a s i o n s i n c o n t a c t w i t h t h e c e l l m e m b r a n e . S t r o n g PO Dl a b e l i n g i n d i c a t e s t h a t s u c h m u l t i v e s i c u l a r b o d i e s r e p r e s e n t



9/10

IMMUNOCYTOCHEMICAL STUDIES ON PYRANOSE OXIDASE 3 6 7 5c y t o p l a s m i c s i t e s o f POD. M u l t i ve s i cu l a r b o d i e s w e r e a l s oo b s e r v e d a s s o c i a t e d w i t h t h e e n d o m e m b r a n o u s s y s t e m a n dc e l l m e m b r a n e , w h e r e t h e y ma y r e p r e s e n t a n i m p o r t a n t s t e pi n t h e p a t h w a y f o r t h e e n z y m e t o t h e p e r i p l a s m i c s p a c e a n ds e c r e t i o n . M u l t i v e s i c u l a r b o d i e s h a v e b e e n r e p o r t e d p r e v i -o u s l y f r o m o t h e r f u n g i , w h e r e t h e i r p r e s e n c e h a s b e e nc o r r e l a t e d w i t h i n c r e a s e d e n z y m e p r o d u c t i o n a n d e x t r a c e l -l u l a r s e c r e t i o n ( 2 ) . T h e s e c r e t o r y p a t h w a y o f e x t r a c e l l u l a re n z y m e s f r o m f u n g a l h y p h a e i n t o t h e i r i m m e d i a t e s u r r o u n d -i n g s i s , h o w e v e r , p r e s e n t l y p o o r l y u n d e r s t oo d, a n d b o t hm o l e c u l a r s i e v i n g o f p r o t e i n s t h r o u g h l i v i n g c e l l w a l l s ( 3 3 )a n d r e l e a s e v i a c e l l a u t o l y s i s ( 3 ) h a v e b e e n r e p o r t e d a s l i k e l yp r o c e s s e s .S i n c e maximum m y c e l i a l PO D p r o d u c t i o n w a s c o r r e l a t e di n t h e p r e s e n t s t u d y b y a n i n c r e a s e i n h y p h a l c y t o p l a s m i cd i s r u p t i o n , i t s r e l e a s e ma y h a v e o c c u r r e d p r i m a r i l y d u r i n gc e l l a u t o l y s i s . H y p h a l a u t o l y s i s i s f u r t h e r t h o u g h t t o r e s u l t i na n i n c r e a s e i n c e l l w al l p o r o s i t y ( 3 ) , w h i c h w o u l d a l s o b ec o n s i s t e n t w i t h r e l e a s e o f a r e l a t i v e l y h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h te n z y m e s u c h a s POD. D u r i n g d e g r a d a t i o n o f w o o d , l y s e dh y p h a e a r e f r e q u e n t l y o b s e r v e d i n c l o s e p r o x i m i t y t o v i a b l ec e l l s . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s o f l i m i t e d n i t r o g e n , c e l l a u t o -l y s i s c o u l d f a c i l i t a t e r e c y c l i n g o f t h e e x i s t i n g m y c e l i a l p r o -t e i n p o o l f o r f u r t h e r g r o w t h . R e c e n t l y , h y p h a l a u t o l y s i s h a sb e e n a l s o c o r r e l a t e d w i t h l i g n i n p e r o x i d a s e r e l e a s e f r o ml i g n i n o l y t i c c u l t u r e s o f P . c h r y s o s p o r i u m ( 2 2 ) .One o f t h e m a j o r c r i t e r i a p u t f o r w a r d f o r a r o l e f o r H 2 0 2 -p r o d u c i n g e n z y m e s i n l i g n o c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n i s t h a t t h ee n z y m e s h o u l d b e e x t r a c e l l u l a r o r a t l e a s t h a v e a s u b c e l l u l a rl o c a t i o n s o t h a t H202 ma y b e f r e e l y r e l e a s e d t o t h e o u t s i d ee i t h e r t o f u n c t i o n t o g e t h e r w i t h H 2 0 2 - d e p e n d e n t e n z y m e s( e . g . , p e r o x i d a s e s ) o r t o a c t d i r e c t l y o n t h e s u b s t r a t e . I n t h ep r e s e n t w o r k , PO D was l o c a l i z e d p r e f e r e n t i a l l y o n mem-b r a n e s t r u c t u r e s i n e l e c t r o n - l u c e n t v e s i c l e s , m u l t i v e s i c u l a rb o d i e s , a n d i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c e o f a p p a r e n t l y h e a l t h yh y p h a e . A p e r i p l a s m i c d i s t r i b u t i o n f o r s i t e s o f H202 p r o d u c -t i o n h a s b e e n r e p o r t e d p r e vi o u s l y f o r o t h e r w h i t e r o t f u n g i( e . g . , T . v e r s i c o l o r [ 1 3 ] ) , i n c l u d i n g P . c h r y s o s p o n u m u n d e rl i g n i n o l y t i c c o n d i t i o n s ( 8 ) , a s d e t e r m i n e d by u s i n g t h e 3 , 3 ' -d i a m i n o b e n z i d i n e s t a i n i n g r e a c t i o n . T h e p e r i p l a s m i c s i t e s o fH 2 0 2 p r o d u c t i o n r e p o r t e d b y F o r n e y e t a l . ( 8 ) a r e s i m i l a r i nd i s t r i b u t i o n t o t h a t o b s e r v e d h e r e w i t h POD a n t i b o d y l a b e l -i n g a n d RR s t a i n i n g . B o t h T . v e r s i c o l o r a n d P . c h r y s o s -p o n i u m a r e a l s o w e l l - k n o w n p r o d u c e r s o f b o t h POD a n dp e r o x i d a s e e n z y m e s ( 2 3 , 3 4 ) . W h i l e t h e t r u e c h e m i c a l n a t u r eo f t h e s t a i n i n g r e a c t i o n w h i c h p r o d u c e d RR a g g r e g a t e s i n t h ep e r i p l a s m i c s p a c e i s n o t c u r r e n t l y u n d e r s t o o d , RR i s knownt o b i n d t o e l e c t r o n - n e g a t i v e s i t e s o n a v a r i e t y o f p r o t e i n s a n dp o l y s a c c h a r i d e s . A s i m i l a r p e r i p l a s m i c l o c a t i o n o f RR a g g r e -g a t e s h a s a l s o b e e n n o t e d i n h y p h a e o f T . v e r s i c o l o r a n dO u d e m a n s i e l l a m u c i d a d u r i n g t h e d e g r a d a t i o n o f wood ( 5 a ) .T h e s p e c i f i c l o c a l i z a t i o n o f a s u g a r - o x i d i z i n g a n d H 2 0 2 -p r o d u c i n g e n z y m e i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c e h a s , h o w e v e r ,n o t t o o u r k n o w l e d g e b e e n r e p o r t e d p r e v i o u s l y .K e l l e y a n d R e d d y ( 1 8 ) r e p o r t e d t h e H202 s u g a r - o x i d i z i n ge n z y m e i n e x t r a c t s f r o m l o w - n i t r o g e n - c o n t a i n i n g c u l t u r e s o fP . c h r y s o s p o r i u m a s g l u c o s e 1 - o x i d a s e . We c o n s i d e r t h a tu n d e r o u r e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , t h e s u g a r - o x i d i z i n g e n -zyme l o c a l i z e d was u n l i k e l y t o b e g l u c o s e 1 - o x i d a s e , s i n c et h e p r e s e n t PO D a n t i b o d i e s d i d n o t s h o w c r o s s - r e a c t i v i t yw i t h g l u c o s e 1 - o x i d a s e f r o m A . n i g e r i n a n ELISA ( s e eM a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . I n a d d i t i o n , t h e Mrs o f t h e t w oe n z y m e s a r e a l s o w i d e l y d i f f e r e n t ( P O D , 3 0 0 , 0 0 0 ; g l u c o s e1 - o x i d a s e , 1 8 0 , 0 0 0 ) . PO D was a l s o l o c a l i z e d i n P . c h r y s o -s p o r i u m K - 3 h y p h a e f r o m l i g n i n o l y t i c c u l t u r e s , s u g g e s t i n g

t h a t t h i s e n z y m e i s l i k e l y t o b e p r o d u c e d u n d e r c o n d i t i o n s o fl i g n i n d e g r a d a t i o n .H y d r o g e n p e r o x i d e p r o d u c e d b y o x i d a s e e n z y m e s i n t h ep e r i p l a s m i c s p a c e o f f u n g al h y p h a e o r t h a t r e l e a s e d d u r i n gh y p h a l a u t o l y s i s ma y b e a b l e t o d i f f u s e i n t o t h e e x t r a c e l l u l a rs u r r o u n d i n g s a n d f u n c t i o n i n s i t u w i t h l i g n i n - d e g r a d i n g e n -z y m e s d u r i n g l i g n o c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n . B o t h l i g n i n a n dM n (I I )- d e p e n d e n t p e r o x i d as e s a r e known t o h a v e a p e r i p l a s -m i c d i s t r i b u t i o n a n d t o o c c u r e x t r a c e l l u l a r l y d u r i n g woodd e g r a d a t i o n ( 1 , 4 , 5 , 2 8 , 2 9 ) . R e c e n t ELISA s t u d i e s ( 3 a ) o nwood d e g r a d e d b y T . v e r s i c o l o r a n d 0 . m u c i d a , b o t h knowne f f e c t i v e p r o d u c e r s o f p e r o x i d a s e a n d POD, h a v e s h o w n t h ep r e s e n c e o f b o t h e n z y m e s i n e x t r a c t s . T h i s e v i d e n c e t o -g e t h e r w i t h p r e s e n t u l t r a s t r u c t u r a l f i n d i n g s f o r a s i m i l a rp e r i p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f PO D a n d e x t r a c e l l u l a r r e l e a s es u g g e s t s t h a t t h i s s u g a r - o x i d i z i n g e n z y m e c o u l d r e p r e s e n t a ni m p o r t a n t d o n o r o f H202 f o r H 2 0 2 - d e p e n d e n t p e r o x i d a s e sd u r i n g l i g n o c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n b y P . c h r y s o s p o n u m .Work i s now i n p r o g r e s s t o d e t e r m i n e t h e u l t r a s t r u c t u r a ld i s t r i b u t i o n o f t h e s e t h r e e e n z y m e s i n s i t u d u r i n g woodd e g r a d a t i o n .ACKNOWLEDGMENTS

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d p a r t l y b y t h e S w e d i s h C o u n c i l f o rF o r e s t r y a n d A g r i c u l t u r a l R e s e a r c h a n d b y t h e C z e c h o s l o v a k i a n a n dS w e d i s h A c a d e m i e s o f S c i e n c e s .REFERENCES

1 . B l a n c h e t t e , R . A . , A . R . A b a d , R . L . F a r r e l l , a n d T . D . L e a t h e r s .1 9 8 9 . D e t e c t i o n o f l i g n i n p e r o x i d a s e a n d x y l a n a s e b y i m m u n o -c y t o c h e m i c a l l a b e l i n g i n wood d e c a y e d b y b a s i d i o m y c e t e s .A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 1 4 5 7 - 1 4 6 5 .2 . C a l o n g e , F . D . , A . H . F i e l d i n g , a n d R . J . W. B y r d e . 1 9 6 9 .M u l t i v e s i c u l a r b o d i e s i n S c l e r o t i n a f n u c t i g e n a a n d t h e i r p o s s i b l er e l a t i o n t o e x t r a c e l l u l a r e n z y m e s e c r e t i o n . J . G e n . M i c r o b i o l .5 5 : 1 7 7 - 1 8 4 .3 . C h a n g , P . L . Y . , a n d J . R . T r e v i t h i c k . 1 9 7 4 . Ho w i m p o r t a n t i ss e c r e t i o n o f e x o e n z y m e s t h r o u g h a p i c a l c e l l w a l l s o f f u n g i .A r c h . M i c r o b i o l . 1 9 : 3 2 8 - 2 9 3 .3 a . D a n i e l , G . U n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n .4 . D a n i e l , G . , T . N i l s s o n , a n d B . P e t t e r s s o n . 1 9 8 9 . I n t r a - a n de x t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f l i g n i n p e r o xi d a s e d u r i n g t h e d e g r a -d a t i o n o f s o l i d wood a n d wood f r a g m e n t s b y P h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i n u m b y u s i n g t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n di m m u n o g o l d l a b e l i n g . A p p l . E n v i r o n . M i c r o . 5 5 : 8 7 1 - 8 8 1 .5 . D a n i e l , G . , B . P e t t e r s s o n , T . N i l s s o n , a n d J . V o l c . 1 9 9 0 . U s e o fi m m u n o g o l d c y t o c h e m i s t r y t o d e t e c t M n ( I I ) - d e p e n d e n t a n dl i g n i n p e r o x i d a s e i n wood d e g r a d e d b y t h e w h i t e r o t f u n g iP h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m a n d L e n t i n u l a e d o d e s . C a n . J .B o t . 6 8 : 9 20 - 9 3 3 .5 a . D a n i e l , G . , a n d J . V o l c . U n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n .6 . D a t t a , A . , A . B e t t e r m a n n , a n d T . K . K i r k . 1 9 9 1 . I d e n t i f i c a t i o n o fa s p e c i f i c m a n g a n e s e p e r o x i d a s e among l i g n i n o l y t i c e n z y m e ss e c r e t e d b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m d u r i n g wood d e c a y .A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 7 : 1 4 5 3 - 1 4 6 0 .7 . E r i k s s o n , K . - E . , B . P e t t e r s s o n , J . V o l c , a n d V . M u s i l e k . 1 9 8 6 .F o r m a t i o n a n d p a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f g l u c o s e - 2 - o x i d a s e , aH202 p r o d u c i n g e n z y m e i n P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m .A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . 2 3 : 2 5 7 - 2 6 2 .8 . F o r n e y , L . J . , C . A . R e d d y , a n d H . S . P a n k r a t z . 1 9 8 2 . U l t r a -s t r u c t u r a l l o c a l i z a t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e p r o d u c t i o n i n l i g n -i n o l y t i c P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i n u m c e l l s . A p p l . E n v i r o n .M i c r o b i o l . 4 4 : 7 3 2 - 7 3 6 .9 . G l e n n , J . K . , a n d M. H . G o l d . 1 9 8 5 . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r -i z a t i o n o f a n e x t r a c e l l u l a r M n ( I I ) - d e p e n d e n t p e r o x i d a s e f r o mt h e l i g n i n - d e g r a d i n g b a s i d i o m y c e t e P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o -r i u m . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 42 : 3 2 9 - 3 4 1 .1 0 . G o l o v l e v a , L . A . , 0 . V . M a l t s e v a , N . M. M y a s o e d o v a , a n d A . A .L e o n t i e v s k y . 1 9 8 6 . P a n u s t i g n i n u s 1 4 4 - d e g r a d i n g l i g n i n , p . 2 8 -3 0 . I n P r o c e e d i n g s o f t h e 3 r d I n t e r n a t i o n a l C o n f e r e n c e o n

V O L . 5 8 , 1 9 9 2


10/10

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .B i o t e c h n o l o g y i n t h e P u l p a n d P a p e r I n d u s t r y , S t o c k h o l m .S T F i / S P C I , S t o c k h o l m .1 1 . G r e e n , T . R . 1 9 7 7 . S i g n i f i c a n c e o f g l u c o s e o x i d a s e i n lignind e g r a d a t i o n . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 6 8 : 7 8 - 8 0 .1 2 . G r e e n e , R . V . , a n d J . M. G o u l d . 1 9 8 4 . F a t t y a c y l - c o e n z y m e Ao x i d a s e a c t i v i t y a n d H202 p r o d u c t i o n i n P h a n e r o c h a e t e c h r y -s o s p o n i u m m y c e l i u m . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 1 5 7 :9 9 2 - 9 9 9 .

1 3 . H i g h l e y , T . L . , a n d L . M u r m a n i s . 1 9 8 5 . D e t e r m i n a t i o n o fh y d r o g e n p e r o x i d e p r o d u c t i o n i n C o r i o l u s v e r s i c o l o r a n d P o r i ap l a c e n t a d u r i n g wood d e g r a d a t i o n . M a t e r . O r g . 2 0 : 2 5 1 - 2 5 2 .1 4 . I z u m i , Y . , Y . F u r u y a , a n d H . Y a m a d a . 1 9 9 0 . I s o l a t i o n o f a newpyranose o x i d a s e p r o d u c i n g b a s i d i o m y c e t e . A g r i c . B i o l . C h e m .5 4 : 7 9 9 - 8 0 1 .1 5 . J a n s s e n , F . W . , a n d H . W. R u e l i u s . 1 9 6 8 . C a r b o h y d r a t e o x i d a s e ,a n o v e l enzyme f r o m P o n y p o r u s o b t u s u s . II . S p e c i f i c i t y a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f r e a c t i o n p r o d u c t s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a1 6 7 : 5 0 1 - 5 1 0 .1 6 . J o h n s r u d , S . C . , a n d K . - E . E r i k s s o n . 1 9 8 5 . C r o s s - b r e e d i n g o fs e l e c t e d a n d m u t a t e d h o m o k a r y o t i c s t r a i n s o f P h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m K - 3 . N ew c e l l u l a s e d e f i c i e n t s t r a i n s w i t h i n -c r e a s e d a b i l i t y t o d e g r a d e l i g n i n . A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l .2 1 : 3 2 0 - 3 2 7 .1 7 . J o h ns t o n e, A . , a n d R . T h o r p e . 1 9 8 7 . I m m u n o c y t o c h e m i s t r y i np r a c t i c e . B l a c k w e l l S c i e n t i f i c P u b l i c a t i o n s L t d . , O x f o r d .1 8 . K e l l e y , R . L . , a n d C . A . R e d d y . 1 9 8 6 . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c -t e r i z a t i o n o f g l u c o s e o x i d a s e f r o m l i g n i n o l y t i c c u l t u r e s o f P h a n -e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . J . B a c t e r i o l . 1 6 6 : 2 6 9 - 2 7 4 .1 9 . K e l l e y , R . L . , a n d C . A . R e d d y . 1 9 8 6 . I d e n t i f i c a t i o n o f g l u c o s eo x i d a s e a c t i v i t y as t h e p r i m a r y source o f h y d r o g e n p e r o x i d ep r o d u c t i o n i n l i g n i n o l y t i c c u l t u r e s o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o -sporium. A r c h . M i c r o b i o l . 1 4 4 : 2 4 8 - 2 5 3 .2 0 . K e r s t e n , P . J . , a n d T . K . K i r k 1 9 8 7 . I n v o l v e m e n t o f a newenzyme, g l y o x a l o x i d a s e , i n e x t r a c e l l u l a r H202 p r o d u c t i o n b yP h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 2 1 9 5 - 2 2 0 1 .2 1 . K i r k , T . K, E . S c h u l t z , W. J . C o n n e r s , L . F . L o r e n z , a n d J . G .Z e i k u s . 1 9 7 8 . I n f l u e n c e o f c u l t u r e p a r a m e t e r s on l i g n i n m e t a b o -l i s m b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . A r c h . M i c r o b i o l . 1 1 7 :2 2 7 - 2 8 5 .2 2 . L a c k n e r , R . , E . S r e b o t a i k , a n d K . M e s s n e r . 1 9 9 1 . I m m u n o g o l d -s i l v e r s t a i n i n g o f e x t r a c e l l u l a r l i g n i n a s e s s e c r e t e d b y P h a n e r o -c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 7 : 6 6 5 - 6 6 8 .2 3 . M a c h i d a , Y . , a n d T . N a k a n i s h i . 1 9 8 4 . P u r i f i c a t i o n a n d p r o p e r t i e so f pyranose o x i d a s e f r o m C o r i o l u s v e r s i c o l o r . A g r i c . B i o l .C h e m . 4 8 : 2 4 6 3 - 2 4 7 0 .2 4 . N i s h i d a , A . , a n d K . - E . E r i k s s o n . 1 9 8 7 . F o r m a t i o n , p u r i f i c a t i o na n d p a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f m e t h a n o l o x i d a s e , a H 2 0 2 - p r o -d u c i n g enzyme i n P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o n i u m . B i o t e c h n o l .

A p p l . B i o c h e m . 9 : 3 2 5 - 3 3 8 .2 5 . P a s z c z y n s k i , A . , V . - B . H u y n h , a n d R . C r a w f o r d . 1 9 8 6 . C o m p a r -i s o n o f l i g n i n a s e - I a n d p e r o x i da s e - M2 f r o m t h e w h i t e - r o t f u n g u sP h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 4 4 :7 5 0 - 7 6 5 .2 6 . R e d d y , C . A . , a n d R . L . K e l l e y . 1 9 8 4 . T h e c e n t r a l r o l e o fh y d r o g e n p e r o x i d e i n l i g n i n d e g r a d a t i o n b y P h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m , p . 5 3 5 - 5 4 2 . P r o c e e d i n g s o f t h e 6 t h I n t e r n a t i o n a lB i o d e t e r i o r a t i o n S y m p o s i u m , W a s h i n g t o n , D . C . C . A . B . I n t e r -n a t i o n a l , S l o u g h , U n i t e d K i n g d o m .2 7 . R e y n o l d s , E . S . 1 9 6 3 . T h e u s e o f l e a d c i t r a t e a t h i g h pH a s a ne l e c t r o n o p a q u e s t a i n i n e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . C e l l B i o l .1 7 : 2 0 8 - 2 1 3 .2 8 . R u e l , K . , a n d J . P . J o s e l e a u . 1 9 9 1 . I n v o l v e m e n t o f a n e x t r a c e l -l u l a r g l u c a n s h ea t h d u r i n g d e g r a d a t i o n o f P o p u l u s wood b yP h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 7 :3 7 4 - 3 8 4 .2 9 . S r e b o t n i k , E . , K . M e s s n e r , R . F o i s n e r , a n d B . P e t t e r s s o n . 1 9 8 8 .U l t r a s t r u c t u r a l l o c a l i z a t i o n o f l i g n i n a s e o f P h a n e r o c h a e t e c h r y -s o s p o r i u m b y i m m u n o g o l d l a b e l i n g . C u r r . M i c r o b i o l . 1 6 : 2 2 1 -2 2 7 .3 0 . S t a t e s , J . S . 1 9 7 5 . I n t r a h y p h a l h y p h a e i n t h e b a s i d i o m y c e t e ,G l o e o p h y l l u m ( L e n z i t e s ) s a e p i a n u m . M y c o l o g i a 6 7 : 4 1 7 - 4 2 0 .3 1 . S z k l a r z , G . , a n d A . L e o n o w i c z . 1 9 8 6 . C o o p e r a t i o n b e t w e e nf u n g a l l a c c a s e a n d g l u c o s e o x i d a s e i n t h e d e g r a d a t i o n o f l i g n i nd e r i v a t i v e s . P h y t o c h e m i s t r y 2 5 : 2 5 3 7 - 2 5 3 9 .3 2 . T i e n , M . , a n d T . K . K i r k . 1 9 8 4 . L i g n i n d e g r a d i n g e n z y m e f r o mP h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o n u m : p u r i f i c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n ,a n d c a t a l y t i c p r o p e r t i e s o f a u n i q u e H 2 0 2 - r e q u i r i n g o x y g e n a s e .P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 1 : 2 2 8 0 - 2 2 8 4 .3 3 . T r e v i t h i c k , J . R . , a n d R . L . M e t z e n b e r g . 1 9 6 6 . M o l e c u l a r s i e v i n gb y N e u r o s p o r a c e l l w a l l s d u r i n g s e c r e t i o n o f i n v e r t a s e i s o e n -z y m e s . J . B a c t e r i o l . 9 2 : 1 0 1 0 - 1 0 1 5 .3 4 . V o i c , J . , N . P . D e n i s o v a , F . N e r u d , a n d V . M u s i l e L 1 9 8 5 .G l u c o s e - 2 - o x i d a s e a c t i v i t y i n m y c e l i a l c u l t u r e s o f B a s i d i o -m y c e t e s . F o l i a M i c r o b i o l . 3 0 : 1 4 1 - 1 4 7 .3 5 . V o i c , J . , a n d K . - E . E r i k s s o n . 1 9 8 8 . P y r a n o s e - 2 - o x i d a s e f r o mP h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . M e t h o d s E n z y m o l . 1 6 1 B : 3 1 6 -3 2 2 .3 6 . V o l c , J . , E . K u b a t o v a , P . S e d m e r a , G . D a n i e l , a n d J . G a b r i e l .1 9 9 1 . P y r a n o s e o x i d a s e a n d p y r a n o s o n e d e h y d r a s e : e n z y m e sr e s p o n s i b l e f o r c o n v e r s i o n o f D - g l u c o s e t o c o r t a l c e r o n e b y t h eb a s i d i o m y c e t e P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . A r c h . M i c r o b i o l .1 6 5 : 2 9 7 - 3 0 1 .3 7 . V o l c , J . , P . S e d m e r a , a n d V . M u s i l e k 1 9 7 8 . G l u c o s e - 2 - o x i d a s ea c t i v i t y a n d a c c u m u l a t i o n o f D - a r a b i n o - 2 - h e x o s u l o s e i n c u l t u r e so f t h e b a s i d i o m y c e t e O u d e m a n s i e l l a m u c i d a . F o l i a M i c r o b i o l .2 3 : 2 9 2 - 2 9 8 .

3 6 7 6 D A N I E L ET AL.

oxidasa piranosa

Documents

Transcript of oxidasa piranosa