EXPOSICION-TRABAJO INTEGRADOR

5/12/2018 EXPOSICION-TRABAJO INTEGRADOR - slidepdf.com

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Fecha: 18 de Septiembre del 2007

Expositor : Bach. Januusz Ruiz del Aguila

TRABAJOINTEGRADOR

ISO 17025

VALIDACION

METODO PARA LA DETERMINACION DEANTIOXIDANTES FENOLICOS EN MEZCLADE CEREALES POR HPLC



Demostrar que la técnica analítica correspondiente ala norma AOAC: 983.15 Phenolic Antioxidants in fatand oils es aplicable para el alcance del método

1.OBJETIVOS

Aplicar los conocimientos de validación de métodos,adquiridos en el diplomado.



2. ALCANCE

El presente método de ensayo es aplicable para ladeterminación de antioxidantes fenólicos como sonPG, TBHQ, BHA y BHT en alimentos cocidos dereconstitución instantánea (papilla y enriquecidolácteo) y mezcla de cereales.

PG TBHQ BHA BHT



3.RESUMEN

El método se lleva a cabo en dos pasos. La extracción dela grasa de la muestra y la extracción de los compuestos(antioxidantes) con acetonitrilo saturado.

Precisión del sistema y del método :RSD aceptable de3.78% y 4.23% respectivamente.

Linealidad del sistema :r = 0,9909 para el PG, r = 0,9884para el TBHQ, r = 0,9864 para el BHA y r =0,9879 para elBHT.

Veracidad del método: % Recuperación

PG :101,98%; TBHQ :98,88% ; BHA :101,16% y BHT:100,86 %, lo cual nos demuestra que el método es verazsegún los criterios de evaluación.



3.RESUMEN

La Robustez del método se evaluó ante la variación dealgunos parámetros como el flujo, la columna, temperaturadel horno, volumen de inyección y filtro de jeringa. Losresultados obtenidos mostraron diferencias absolutasmayores que Smètodo ¥2 por lo que los valores propuestospara estas variables se consideran críticas al no presentarrobustez en el estudio.

La sensibilidad del método : LOD entre 1,05 y 2,11 y valoresde LOQ entre 1,15 y 3,37.

La incertidumbre de la medición para los antioxidantes PG, TBHQ,BHA y BHT f ueron de 4,29; 2,49; 3,87 y 3,36 ug/g (ppm)respectivamente.



6.PROCESO DE VALIDACION

6.2. DISEÑO DE LOS PARAMETROS DE VALIDACION YEVALUACION ESTADISTICA



6.2. DISEÑO DE LOS PARAMETROS DE V ALID ACION YEV ALU ACION ESTADISTICA

El análisis se realizará con el estudio de la pureza u homogeneidad del picocorrespondiente a cada antioxidante.

ESPECIFICIDAD - SELECTIVIDAD

La prueba se realizará mediante una comparación de los cromatogramas

siguientes:

1. Cromatogramas de la solución estándar de antioxidantes f enólicos (PG, TBHQ, BHA yBHT) en solución de dilución (acetonitrilo y metanol1:1) con sus respectivos espectrosde absorción de los picos eludíos.

2. Cromatograma del blanco de muestra; es decir una muestra de Inkamix sin lapresencia de antioxidantes.

3. Cromatograma de la muestra de Inkamix (mezcla de cereales) con adición de lamezcla de estándares con sus respectivos espectros de absorción de los picos eluídos.



6.2.2. Diseño del ensayo para determinar linealidad del sistema y del método

Concentración y número de repeticiones

Mezcla de Estándares(PG, TBHQ, BHA, BHT)

Muestra con adición.

50 ppm; n=6

90 ppm ; n= 470 ppm; n= 6

90 ppm; n=6110 ppm ; n=4110 ppm; n=6

130 ppm; n=6150 ppm ; n=4150 ppm; n=6


Evaluación Estadística:

Se empleó el paquete estadístico MINITAB para evaluar el modelo deregresión

La evaluación estadística comprende en hallar la ecuación de regresión, elcoeficiente de correlación



6.2.3. Diseño del ensayo para determinar precisión del método

Muestra

DIA 1 DIA 2

Analista 1 Analista 2 Analista 3 Analista 1 Analista 2 Analista 3

Papilla n = 15 n = 15 n = 15 n = 15 n = 15 n = 15


Evaluación Estadística

1. Se empleó el diseño de la Norma ISO 5725-2

2. Se verificó los supuestos de distribucion normal Con el test denormalidad del residual del Anova y prueba De homogeneidad devarianzas con el software del Minitab.



6.2.4. Diseño del ensayo para determinar veracidad ( Adición de estándares)

Muestra Concentración de mezcla deestándares añadido (PG, TBHQ,

BHA, BHT)

Repeticiones

Mezcla deCereales 90 ppm n =4110 ppm n =4

130 ppm n =4


Evaluación Estadística:Se empleará el estadístico t de student. Si el t calculado < t (E = 0,05; n-1g.l.), entonces no existe diferencia significativa entre la recuperaciónpromedio y el 100% de recuperación.




n

X

Srecup

-

t

0

calculado

Q

!

6.2.4. Diseño del ensayo para determinar veracidad ( Adición de estándares)

Donde:

recuperación promedio.!

X

100

Srecup = desviación estándar de la recuperación.n = número de datos.tablas = 2.201 ( g.l. 11; : 0,05)




6

.2.5. Diseño para determinar sensibilidad del métodoMezcla de Estándares(PG, TBHQ,BHA, BHT)

Repeticiones

15 ppm n=6

25 ppm n=6

35 ppm n=645 ppm n=6

Evaluación estadística:Método de Extrapolación a concentración cero en la curva de regresión a bajasconcentraciones del analito. tomándose los valores de las concentraciones vs. los

promedios y desviaciones estándar de las respuestas para la obtención de lascurvas correspondientes para tomar los intercepto a valores de respuesta cero .Las f órmulas de cálculo son las siguientes:




6

.2.5. Diseño para determinar sensibilidad del método

b

S Y LODtección LímitedeDe bl bl 3

)(

!

b

S Y LOQónantificaci LímitedeCu bl bl 10

)(

!

Donde:

Ybl = Promedio de la respuesta de la nueva curva a concentración cero.Sbl = Desviación estándar del blanco (a concentración =0)b = Pendiente de la curva de calibración




6.2.6. Diseño de Placket & Burmann para determinar Robustez

Variable/Ensayo 1 2 3 4 5 6 7 8

Flujo (ml/min)VA

0,2 0,2 0,2 0,2 0,15 0,15 0,15 0,15

Columna(cm)

VB

15 15 10 10 15 15 10 10

Temperatura dehorno(ºC)VC

35 27 35 27 35 27 35 27

Volumen de

inyección (uL)VD

10 10 8 8 8 8 10 10

Filtro de jeringa(um)VE

0,45 0,2 0,45 0,2 0,2 0,45 0,2 0,45

Resultado s t u v w x y z



Parámetro Diferencia Absoluta

Flujo (ml/min); VA

Columna(cm); VB

Temperatura de horno(ºC); VC

Volumen de inyección (uL); VD

Filtro de jeringa (um); VE

`VA `= ¼ (s+t+u+v) ± ¼ (w+x+y+z)

`VB` = ¼ (s+t+w+x) ± ¼ (u+v+y+z)

`VC` = ¼ (s+u+w+y) ± ¼ (t+v+x+z)

`VD` = ¼ (s+t+y+z) ± ¼ (u+v+w+x)

`VE` = ¼ (s+t+x+z) ± ¼ (t+v+w+y)


Evaluación estadística:Se calculará el ef ecto de cada variable haciendo la media de los cuatroanálisis que contienen la variable en su valor más alto y aquellos quecorresponden al valor más bajo como se indica en la siguiente tabla:

Si | VB | > S ¥2 Dif erencia Signif icativa




6.2.7. Diseño para determinar la Incertidumbre del método

Se determinará la Incertidumbre global del método (EURACHEM) , utilizandola data de validación : Precisión, Veracidad y Homogeneidad

U Precisión = incertidumbre estándar = Rprom/ (1.128*2)Rprom =Rango promedio de duplicados

Uveracidad =

Umrc: Incertidumbre estándar del material de ref erencia

DSpromedio: Desviación estándar de promedios.

Uhomogenidad : incertidumbre estándar = DSprom/ (0.8862*3)DSprom: Desviación estándar promedio

2 2( ) (DSpromedio/ n)U mrc



Title of the presentation - DD/MM/YY

6.4. RESULTADOS DE LINEALIDAD

Resultados de linealidad del sistema




6.4.1. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA LINEALIDAD DEL SISTEMA

6.4.1.1. Análisis de Regresión con el software MINITAB: ANTIOXIDANTE PG

Prueba de Hipótesis para el coeficiente de regresión ò pendiente

H0 (Hipótesis nula) : F1 = 0 Criterio de decisión : Pvalue < 0,05H1 (Hipótesis alterna) : F1 { 0 ò Fc > Ftabla

Ecuación de RegresiónPG = - 634275 + 52018 C onc r = 0,9969S = 140332 R-Sq = 99.4% R-Sq (adj) = 99.4%

A). Análisis de Varianza (Minitab)Source DF SS MS F P

Regression 1 1.13647E+14 1.13647E+14 5770.95 0.000Error 34 6.69563E+11 1.96930E+10Total 35 1.14317E+14




Conc

P G

1501251007550

8000000

7000000

6000000

5000000

4000000

3000000

2000000

S 140332

R-Sq 99.4%

R-Sq(adj) 99.4%

Fitted Line Plot

PG = - 634275 + 52018 Conc

Conclusión: Como el Pvalue < 0,05 se rechaza la hipótesis nula H0, por lo queexiste relación lineal entre la concentración y la respuesta en el rango deestudio.

Grafica de la regresión




B). Análisis del coeficiente de correlación con t de student

H0 (Hipótesis nula): No correlación entre concentración y respuesta

T calculado = 73.88T tabla (E = 0,05; n-2 g.l.), = 2,032 ; G.L.=n-2=34

Conclusión: Como tcalculado >>> ttabla; se rechaza laHipótesis nula de no correlación, siendo la correlación signif icativa aun nivel de signif icación del 5%.

2-n

r -1

r t

2calculado !

2-36

0,9969-1

0,9969 t

2calculado !



PG TBHQ BHA BHT PG TBHQ BHA BHT PG TBHQ BHA BHT

90.2867 85.9737 89.2638 147.8183 89.6416 83.0371 89.8119 143.8757 86.2438 79.2393 87.3751 141.7299

88.8636 84.7749 88.7996 147.5796 88.5658 82.5563 89.1976 142.1015 84.251 77.8427 86.0756 139.6811

88.1952 84.0701 89.7571 144.3993 88.6813 82.679 90.0357 142.7243 83.0747 75.7074 82.6016 136.6475

91.4800 87.557 92.557 147.6926 89.5936 82.036 89.6147 142.6143 83.8686 76.5749 84.0226 141.1319

91.6135 88.1106 92.3751 148.5583 89.6742 82.549 90.4458 141.7564 84.424 77.2695 84.712 143.3124

90.7937 87.7058 93.1625 146.7885 90.1308 83.1198 92.4613 140.3974 82.9857 76.7314 84.6367 145.8045

89.4419 86.8429 91.6186 145.1915 92.6415 84.7611 94.6322 144.2489 85.7131 79.0951 87.0933 139.2551

88.9971 85.6617 90.009 143.6889 92.4775 85.5712 95.4212 142.0683 89.7086 81.4543 91.029 141.1962

88.1836 85.7672 88.9119 139.9043 92.6239 86.5044 95.7060 142.7547 88.0666 80.7259 89.1019 138.5857

89.7543 85.6123 90.5863 143.707 96.4703 88.6448 97.5935 143.4138 89.0407 79.932 90.4463 143.525990.3366 86.8867 92.0996 142.8523 95.2305 88.2163 97.8952 140.4473 88.9609 79.5582 89.4189 138.8612

90.6926 84.9909 92.6659 144.7433 94.6963 86.2639 97.1908 140.336 88.5104 78.9238 89.5781 137.1109

88.7671 85.907 89.4091 143.6478 94.5562 87.6465 96.4916 146.7293 85.1112 77.4605 85.1569 141.4622

87.5570 84.7217 88.7762 149.4533 94.925 87.8882 96.3454 147.228 85.5736 77.9493 85.6737 139.2507

89.4145 86.0041 90.0857 151.7591 94.3244 86.73 95.9941 142.4688 86.3815 78.8469 85.618 140.1333

88.1314 84.5148 88.9995 146.1017 93.8991 88.3805 97.1132 148.5695 87.0067 80.2035 87.4439 149.9207

89.1183 85.1017 90.9258 145.9397 92.8409 84.636 94.6986 147.9958 87.458 79.8709 87.4459 148.3757

88.0205 84.8954 89.9121 143.305 93.4328 87.3808 96.8921 147.8952 86.5125 78.6308 85.8401 144.7391

90.9083 87.7923 93.7923 148.0884 89.8365 83.6541 92.8742 142.3936 85.2228 78.8568 86.5399 146.8203

91.4030 87.2195 91.6358 147.2057 91.9511 85.9884 94.8589 147.2657 83.8289 76.1169 83.9793 145.1442

89.2755 84.9899 92.6554 146.6787 91.1561 84.7135 94.9589 147.1356 86.6714 79.151 85.1428 147.0626

87.7018 84.0939 87.6517 141.0086 89.1006 81.9835 92.2014 143.3009 88.3547 79.5358 88.8694 137.9584

88.1197 83.4338 89.4084 139.5899 90.4856 82.0077 92.2811 142.2502 88.4395 81.0473 89.6161 139.5521

87.9907 84.2696 88.1377 140.585 90.0556 82.9679 93.0242 142.8317 89.1548 81.538 88.9318 135.8195

88.1786 82.8748 91.106 139.9346 90.3064 84.1407 93.6411 136.5533 91.2725 81.6207 90.8098 147.1727

90.9350 86.2424 92.7728 142.6638 91.7434 83.4238 95.3719 136.2897 92.1562 81.2575 93.7947 149.3912

89.7310 84.5879 92.1216 143.5404 91.9114 84.7444 96.4061 136.5662 91.5932 80.6752 92.8714 148.9833

85.0449 81.3372 86.7346 144.2569 88.1248 82.4101 91.4556 145.8766 89.1776 81.1159 89.6682 148.1452

86.9590 82.8633 88.2613 150.1358 91.3239 85.3242 94.4526 146.1103 87.0829 79.5696 87.2249 146.6581

84.4895 80.1603 83.8864 145.1628 90.6148 82.8157 92.7572 145.2012 89.4156 81.9084 90.8956 146.981

Dia 1

Dia 2

ANALISTA 1DIA

ANALISTA 3 ANALISTA 2

6.4. RESULTADOS DE PRECISION

Resultados de precisión en base a la concentración




6.4.3 . ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA PRECISION DEL METODO

Antioxidante PGDatos de contenido PG en enriquecido lacteo (ppm)

Laboratorio

(p=6)

L AB-1 90.337 90.693 88.767 87.557 89.415 90.287 88.864 88.195 91.480 91.614 90.794 89.442 88.997 88.184 89.754

L AB-2 88.131 89.118 88.021 90.908 91.403 89.276 87.702 88.120 87.991 88.179 90.935 89.731 85.045 86.959 84.490

L AB-3 89.642 88.566 88.681 89.594 89.674 90.131 92.642 92.478 92.624 96.470 95.231 94.696 94.556 94.925 94.324

L AB-4 93.899 92.841 93.433 89.837 91.951 91.156 89.101 90.486 90.056 90.306 91.743 91.911 88.125 91.324 90.615

L AB-5 86.244 84.251 83.075 83.869 84.424 82.986 85.713 89.709 88.067 89.041 88.961 88.510 85.111 85.574 86.382

L AB-6 87.007 87.458 86.513 85.223 83.829 86.671 88.355 88.440 89.155 91.273 92.156 91.593 89.178 87.083 89.416

Réplicas de medición (n=15)

Media Aritmética o

Promedio (xi)

Desv.Estándar (si) Varianza (si2) Dif erencia (xi-xpt)

Dif erencia2

(xi-xpt)2

h Mandel[Dif erencia(xi-xpt)] /

[v(1/(p-1))(7

(xi-xpt)2)]

k Mandel [si(vp)]

/ [v(7 si2) ]

89.625 1.226 1.503 0.329 0.108 0.149 0.59388.400 1.971 3.887 -0.896 0.802 -0.406 0.95492.282 2.687 7.220 2.986 8.916 1.353 1.30091.119 1.580 2.495 1.823 3.322 0.826 0.76486.128 2.253 5.077 -3.169 10.040 -1.436 1.090

88.223 2.336 5.457 -1.073 1.152 -0.486 1.130(xpt) (sp) (s2p)

89.296 2.009 4.273

7si2 7 (xi-xpt)2

25.640 24.340Valor Tabulado(1%) 1.870 1.470

Valor Tabulado

(5%)1.660 1.330

Suma

Promedio dePromedios




Media Aritmética

(xi)

Desv.Estándar (si)

ni x (xi) ni x (xi)2 ni ni2 ni-1) x si2

89.625 1.226 1344.377 120490.040 15 225 21.04888.400 1.971 1326.007 117219.673 15 225 54.41492.221 2.786 1383.314 127570.527 15 225 108.69791.119 1.580 1366.783 124539.718 15 225 34.93286.128 2.253 1291.914 111269.521 15 225 71.08388.223 2.336 1323.347 116749.872 15 225 76.401(xpt) (sp)

89.286 2.025

8!7ni x (xi) 8!7ni x (xi)28!7ni 8!7ni2 8!7ni-1) x si2

8035.743 717839.350 90 1350 366.575

Suma

Promedio

4.364

Desviación

Estándar de

Repetibilidad

(sr )

2.089

Desviación

Estándar

Relativa

Repetibilidad

(RSDr )

2.34%

4.505

DesviaciónEstándar

entre

laboratorios

(sL)

2.122Desviación

Estándar entre

laboratorios

(RSDL)

2.38%

8.869

Desviación

Estándar de

Reproducibili

dad (sR)

2.978Desviación

Estándar de

Reproducibilidad

(RSDR)

3.34%

ESTIMADORES DE PRECISIÓN

Varianza de Repetibilidad (sr 2) sr

2=

[T5/(T3-p)A

Varianza entre laboratorios (sL2) sL

2=

[[(T2T3)-(T12)/(T3(p-1))]-sr2] x [(T3(p-

1))/((T32)-T4)]

Varianza de Reproducibilidad (sR2)

sR2 = sL2 + sr 2




ANÀLISIS DE VARIABILIDAD ENTRE ANALISTAS PARA EL

ANTIOXIDANTE PG

H0 (Hipótesis nula) : W2 = 0 Criterio de decisión: Pvalue > 0,05H1 (Hipótesis alterna) : W2 { 0

95% Bonf erroni conf idence intervals f or standard deviations

Analista N Lower StDev Upper 1 30 1.31266 1.72917 2.493862 30 1.74216 2.29496 3.309863 15 1.60328 2.33607 4.12230

Bartlett's Test (normal distribution)Test statistic = 2.70; p-value = 0.259



A n a l i s t a

95%Bonferroni Confidence Intervals for StDevs

3

2

1

4.54.03.53.02.52.01.51.0

Bartlett's Test

0.154

Test Statistic 2.70

P-Value 0.259

Levene's Test

Test Statistic 1.92

P-Value

Antioxidante PG

Conclusión :p-value = 0.259; por lo tanto p-value> 0,05 y no hay dif erenciasignif icativa entre los resultados de los 3 analistas evaluados.




6.4. RESULTADOS DE VERACIDAD DEL METODO

Concentración Repetición PG TBHQ BHA BHTAñadida 1 93.7603 90.1215 94.1291 91.0501

2 92.7581 88.9679 91.4641 87.4588

90 ppm 3 91.8044 87.3373 88.6622 85.4377

4 92.9258 89.079 90.4128 88.2442

Promedio92.81215 88.876425 91.16705 88.0477

DS 0.80216088 1.15014808 2.28802284 2.32464486

RSD 0.86428434 1.29409805 2.50970371 2.64021078

1 116.4914 113.7927 117.3001 112.79

2 114.7057 110.6202 113.9485 110.6644

110 ppm 3 115.4709 112.6145 114.4985 110.2848

4 116.0219 113.2195 115.9662 113.2458

Promedio 115.672475 112.561725 115.428325 111.74625

DS 0.76768535 1.38085383 1.51077328 1.48820919

RSD 0.66367158 1.22675255 1.30884103 1.331775511 148.7675 145.1637 147.3615 141.6317

150 ppm 2 143.2152 139.3871 141.9991 154.3748

3 150.2536 148.1086 150.6109 155.3611

4 143.6618 140.6966 143.4733 159.3198

Promedio 146. 474525 143.339 145.8612 152.67185

DS 3.56247871 4.02816772 3.89137649 7.66403409

RSD 2.43214901 2.81023847 2.66786266 5.01993923

CONCENTRACIÓNMuestra de Mezcla de Cereales

Resultados de la veracidad del método (Estándar añadido)




Porcentaje de Recuperaciòn(%)Concentraciòn

PG TBHQ BHA BHT104.178111 100.135 104.5878889 101.1667778

103.064556 98.8532222 101.6267778 97.17644444

C1= 90 ug/g 102.004889 97.0414444 98.51355556 94.93077778

103.250889 98.9766667 100.4586667 98.04911111

Promedio 103.124611 98.7515833 101.2967222 97.83077778105.901273 103.447909 106.6364545 102.5363636

104.277909 100.563818 103.5895455 100.604

C2=100 ug/g 104.973545 102.376818 104.0895455 100.2589091

105.474455 102.926818 105.4238182 102.9507273

Promedio 105.156795 102.328841 104.9348409 101.587599.1783333 96.7758 98.241 100

95.4768 92.9247333 94.66606667 102.9165333C3=150 ug/g 100.169067 98.7390667 100.4072667 103.5740667

95.7745333 93.7977333 95.64886667 106.2132

Promedio 97.6496833 95.5593333 97.2408 103.17595

Resultado expresado en porcentaje de recuperación



6.4.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA VERACIDAD DEL METODO.


Donde:

!

X recuperación promedio.

!0

Q100

Srecup = desviación estándar de la recuperación.n = número de datos.tablas = 2.201 ( g.l. 11; : 0,05)

n

X

Srecup

-

t

0

calculado

Q

!

Antioxidante PG TBHQ BHA BHT

PROM 101.98 98.88 101.16 100.86

DS 3.58 3.34 3.86 3.09

RSD 3.52 3.38 3.81 3.07

n= 12 12 12 12

tcal -1.910 1.164 -1.039 -0.968

Para los 4 antioxidantes, el tcal < tablas , por lo que secomprueba la veracidad del método.



6.4. RESULTADOS DE SENSIBILIDAD DEL METODO

Resumen del Análisis de Regresión para cada antioxidante

Concentraciòn Promedio Desv.Standard

15 ppm 607571.5 10258.957

25 ppm 977683 16593.429

35 ppm 1442263.8 15616.084

45 ppm 2041882.8 22964.885

Antioxidante PG


15 ppm 169592.67 7383.7119

25 ppm 280777.67 4077.1497

35 ppm 414378.67 5082.2634

45 ppm 590195.5 7335.6521

AntioxidanteTBHQ

Ybl = 476751X + 75472(Conc vs Prom)Sbl = 3714X + 7073,2(Conc vs DS)

Ybl = 139541X + 14884 (Conc vs Prom)Sbl = 162,93 X ± 204,02 (Conc vs DS)


15 ppm 187466.17 4582.5389

25 ppm 305991.5 5193.5462

35 ppm 451966.83 5614.492

45 ppm 632726.83 7798.5524

Antioxidante BHA


15 ppm 109046 2674.4667

25 ppm 172741.33 4441.8395

35 ppm 255173 3028.7041

45 ppm 355995.67 7339.1235

Antioxidante BHT

Ybl = 14876X + 24099(Conc vs Prom)

Sbl = 100,69 X + 2776,6 (Conc vs DS)Ybl = 82328X + 17419 (Conc vs Prom)Sbl = 153,97X + 455,97 (Conc vs DS)




Resumen de las curvas de calibración de cada antioxidante

PG = -634275 + 52018 Conc TBHQ = -148090 + 14774Conc

BHA = -161218 + 15387 Conc BHT = - 111088 +9102Conc

52018

)2,7073(375472)(

! LODtección LímitedeDe

Calculo del limite detección y cuantificación de cada antioxidante

52018

)2,7073(1075472)(

! LOQònantificaci LímitedeCu

Antioxidante PG:

LOD ( PG) = 1,86 ppm LOQ ( PG) = 2,81 ppm

Antioxidante TBHQ :

14774

)02,204(314884)(


14774

)2,204(1014884)(


LOD (TBH Q ) = 1,05 ppm LOQ (TBH Q ) = 1,15 ppm




15387

)6,2776(324099)(


15387

)6,2776(1024099)(


LOD (BHA ) =2,11 ppm LOQ( BHA )= 3,37 ppm

Antioxidante BHA :

Antioxidante BHT :

9102

)97,455(317419)(

! LODtección LímitedeDe 9102

)97,455(1017419)(


LOD (BHT ) = 2,06 ppm LOQ (BHT ) = 2,42 ppm



6.4. RESULTADOS DE LA ROBUSTEZ DEL METODO

Variable Ensayo 1 Ensayo 2 Ensyao 3 Ensayo 4 Ensayo 5 Ensayo 6 Ensayo 7 Ensayo 8

Flujo (ml/min) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,15 0,15 0,15 0,15

Columna 15 15 10 10 15 15 10 10

(cm)

Temperatura de

horno(ºC) 35 27 35 27 35 27 35 27

10 10 8 8 8 8 10 10

Filtro de jeringa 0,45 0,2 0,45 0,2 0,2 0,45 0,2 0,45

(um)

Antioxidante Areas (Respuesta)

PG 3726550 2887622 4543083 5040849 4359191 5888887 4984092 3339750

TBHQ 1090402 850907 1568326 1397687 1275808 1684236 1125463 971850

BHA 1116250 869153 1011736 1015151 1305852 1137222 1003887 1041846

BHT 717022 449512 532461 531230 764751 592250 523333 543269

Volumen de

inyección (uL)

Resultados para evaluación de la Robustez del método



Variable PG TBHQ BHA BHT

Flujo (ml/min) -593454 -37508.75 -119129.25 -48344.5VA

Columna(cm) -261381 -40493.25 88964.25 98310.5

VBTemperatura de

horno(ºC) 113952 38829.75 93588.25 105326.5

VC

-1223499 -471858.75 -109706.25 -46889

VDFiltro de jeringa

(um) 56629 166237.25 28252.75 29044

VE

Smètodo ¥2 69867,17 18386,16 26734,75 21505,37

Diferenciaabsoluta

Volumen deinyección (uL)

6.4. RESULTADOS DE LA ROBUSTEZ DEL METODO

6.4.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA ROBUSTEZ



6.4. RESULTADO DE LA ESPECIFICIDAD YSELECTIVIDAD DEL METODO

6.4.7. ANALISIS DE LA ESPECIFICIDAD Y SELECTIVIDAD

DEL METODO

a) Cromatograma de la mezcla de solución estándar de antioxidantes y susespectros de absorción a 280 nm




b) . Cromatograma del blanco de muestra (mezcla de cereales) antes de la adición

de estándares




c). Cromatograma de la muestra de mezcla de cereales

(Inkamix) con adición de mezcla de estándar deantioxidantes fenólicos y sus respectivos espectros.




MUESTRA : MEZCLA DE CEREALES(INKAMIX)

mg/Kg

Fecha Muestra P-1 P-2 P-3 Desv estand

1 2007-02-01 M-1 90,2867 88,8636 88,1952 1,0682

2 2007-02-02 M-2 91,4800 91,6135 90,7937 0,4399

3 2007-02-03 M-3 89,4419 88,9971 88,1836 0,6381

4 2007-02-04 M-4 89,7543 89,7799 90,4235 0,3792

5 2007-02-05 M-5 89,6416 87,6470 88,6813 0,9975

6 2007-02-06 M-6 89,5936 89,6742 90,1308 0,2897

7 2007-02-07 M-7 92,6415 92,4775 92,6239 0,0900

8 2007-02-08M

-8 96,4703 94,2632 95,2618 1,10529 2007-02-09 M-9 86,2438 84,2510 83,0747 1,6020

10 2007-02-10 M-10 83,8686 84,4240 82,9857 0,7253

Resultados

0,7335 C4 0,8862

Desv. Proceso 0,8277

Incertidumbre estandar 0,4779

HOMOGENEIDAD ( PG)

6.4. RESULTADO DE LA DETERMINACION DEINCERTIDUMBRE DEL METODO

Resultado de la incertidumbre estándar por efecto de lahomogeneidad (PG)





Incertidumbre estándar de la precisión (PG)

PG

mg/Kg

Fecha Muestra Replica 1 Replica 2 Rango

1 2007-01-02 Ref - AO 90.287 90.337 0.0499

2 2007-01-03 Ref - AO 88.131 88.864 0.7322

3 2007-01-04 Ref - AO 91.480 91.614 0.1335

4 2007-01-05 Ref - AO 91.403 90.908 0.4947

5 2007-01-06 Ref - AO 89.442 88.997 0.4448

6 2007-01-07 Ref - AO 87.702 88.120 0.4179

7 2007-01-08 Ref - AO 89.754 89.118 0.6360

8 2007-01-09 Ref - AO 88.179 88.767 0.5885

9 2007-01-10 Ref - AO 88.767 87.557 1.2101

10 2007-01-11 Ref - AO 85.045 84.251 0.7939

11 2007-01-12 Ref - AO 89.642 89.837 0.1949

12 2007-01-13 Ref - AO 93.899 92.841 1.0582

13 2007-01-14 Ref - AO 89.594 89.674 0.0806

14 2007-01-15 Ref - AO 89.837 89.101 0.7359

15 2007-01-16 Ref - AO 92.642 92.478 0.1640

16 2007-01-17 Ref - AO 90.486 90.306 0.1792

17 2007-01-18 Ref - AO 96.470 95.231 1.2398

182007-01-19 Ref - AO 91.324 91.743 0.4195

19 2007-01-20 Ref - AO 94.556 94.925 0.3688

20 2007-01-21 Ref - AO 88.125 89.709 1.5838

21 2007-01-22 Ref - AO 86.244 86.969 0.7252

22 2007-01-23 Ref - AO 87.007 87.458 0.4513

23 2007-01-24 Ref - AO 83.869 84.424 0.5554

24 2007-01-25 Ref - AO 85.223 85.713 0.4903

25 2007-01-26 Ref - AO 89.045 89.709 0.6636

R promedio 0.576

Desv estand 0.511

incert-estand 0.361

PRECISION




Incertidumbre estándar de la Veracidad (PG)

mg/Kg

Material de ref erencia 90.25

incertidumbre expandida 0.5

Factor de cobertura 2

Fecha Muestra Réplica 1 Réplica 2 Promedio1 2007-01-02 Ref - AO 88.864 88.195 88.529

2 2007-01-03 Ref - AO 88.131 89.118 88.625

3 2007-01-04 Ref - AO 91.480 91.614 91.547

4 2007-01-05 Ref - AO 91.403 90.908 91.156

5 2007-01-06 Ref - AO 88.997 88.184 88.590

6 2007-01-07 Ref - AO 88.120 87.991 88.055

7 2007-01-08 Ref - AO 90.337 90.693 90.515

8 2007-01-09 Ref - AO 90.935 89.731 90.333

9 2007-01-10 Ref - AO 88.767 87.557 88.162

10 2007-01-11 Ref - AO 85.045 86.959 86.002

11 2007-01-12 Ref - AO 89.642 88.681 89.161

12 2007-01-13 Ref - AO 92.841 93.433 93.137

13 2007-01-14 Ref - AO 89.594 89.674 89.634

14 2007-01-15 Ref - AO 91.951 91.156 91.554

15 2007-01-16 Ref - AO 92.642 92.624 92.633

16 2007-01-17 Ref - AO 90.486 90.056 90.271

17 2007-01-18 Ref - AO 96.470 95.231 95.850

18 2007-01-19 Ref - AO 91.743 91.911 91.827

19 2007-01-20 Ref - AO 94.556 94.324 94.440

20 2007-01-21 Ref - AO 91.324 90.615 90.969

21 2007-01-22 Ref - AO 84.251 83.075 83.663

22 2007-01-23 Ref - AO 87.007 87.458 87.232

23 2007-01-24 Ref - AO 83.869 84.424 84.146

24 2007-01-25 Ref - AO 85.223 86.671 85.947

25 2007-01-26 Ref - AO 89.709 88.067 88.888

26 2007-01-27 Ref - AO 88.440 89.155 88.797

PROMEDIO 89.60

Desv Estand 2.04

incer de MRC 0.25

incert verac 2.06

VERACIDAD PG




Incertidumbre expandida al 95% (PG)

UPG= 4.29mg/kg



Precisión del Método

%RSDr %RSDR

PG = 2,34TBHQ= 2.17BHA = 2,76BHT = 2,31

PG = 3,34TBHQ= 4,23BHA = 4,18BHT = 2,61

Veracidad del Método( %Recuperación)

PG = 101.98%TBHQ = 98.88 %BHA = 101,16 %BHT = 100,86 %

Sensibilidad delMétodo

Límite de Detección (LOD),ug/g

Límite de Cuantificación(LOQ);ug/g

PG = 1,86

TBHQ = 1,05BHA = 2,11BHT = 2,06

PG = 2,81

TBHQ = 1,15BHA = 3,37BHT = 2,42

Incertidumbre de lamedición

U PG

= s 4,29U TBHQ

= s 2,49U BHA

= s 3,87U BHT

= s 3,36

6.5. RESUMEN DE RESULTADOS

Resumen de los resultados de la validación



7. EXPRESION DE LOS RESULTADOS

Los resultados obtenidos de la determinación de antioxidantesf enólicos se deberán expresar de la siguiente manera:

Unidades : ug/g grasa extraída ó mg/kg ( ppm) de grasa extraída

Cif ras signif icativas: Está dado por la incertidumbre del método

para cada antioxidante.

P G = X s 4,29 ug /g grasa extraída (mg/Kg grasa extraída)

TBHQ = X s 2,49 ug/g grasa extraída (mg/Kg grasa extraída)

BHA=X s 3,87 ug/g grasa extraída (mg/Kg grasa extraída)

BHT=X s 3,36 ug/g grasa extraída (mg/Kg grasa extraída)



8. CONCLUSIONES

1. Según los resultados obtenidos podemos concluir que el métodopara la determinación de Antioxidantes Fenólicos en alimentoscocidos de reconstitución instantánea (papilla, alimento enriquecido) ymezcla de cereales por cromatograf ía líquida de alta per f ormance(HPLC), es preciso y exacto para los parámetros evaluados.

2. También se demostró la sensibilidad del método para cada uno delos antioxidantes obteniéndose un límite de detección (LOD) para elPG = 1,86 ug/g , para el TBHQ = 1,05 ug/g, para el BHA = 2,11 ug/g ypara el BHT = 2,06 ug/g. El límite de cuantif icación (LOQ) f ue para elPG =2,81 ug/g, para el TBHQ = 1,15 ug/g, para el BHA = 3,37 ug/g ypara el BHT = 2,42 ug/g. evaluados.



8. CONCLUSIONES

4. La incertidumbre de la medición se evaluó en f orma globalevaluando parte de la data obtenida de los ensayos de validación,combinándose las incertidumbres del proceso (precisión),Homogenidad y de trazabilidad (veracidad).

3. Durante el ensayo de robustez, los resultados obtenidos para lasvariables estudiadas indican que son parámetros críticos ya queninguna de ellas pasó el análisis de robustez, por lo que susdif erencias absolutas son mayores que Smétodo ¥2. Esto indica queal realizar cambios con los valores propuestos los resultados se

verían af

ectados.



GRACIASGRACIAS

DIPLOMADO EN SISTEMAS DE GESTION DE LA CALIDAD DELABORATORIOS DE ENSAYO Y CALIBRACION ISO/IEC 17025

EXPOSICION-TRABAJO INTEGRADOR

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