Einfluss der SIV-Infektion und einer antiretroviralen...

Aus dem

Institut für Anatomie und Zellbiologie der Philipps-Universität Marburg

Arbeitsgruppe Molekulare Neurowissenschaften

Leiter: Prof. Dr. med. E. Weihe

Einfluss der SIV-Infektion und einer antiretroviralen Therapie auf die Expression von vesikulären

Transmitterproteinen im Striatum von Rhesus Affen

Inaugural - Dissertation zur Erlangung des

Doktorgrades der gesamten Humanmedizin (Dr. med.)

dem Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Nedye Naumann

aus Gronau, Westf.

Marburg, 2015

1

Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg am 14.12.2015.

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. H. Schäfer

Referenten: Prof. Dr. med. E. Weihe, PD Dr. med. C. Depboylu

1. Korreferent: Prof. Dr. Czubayko

2

für Frank

3

Inhaltsverzeichnis

I. ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................................................... 6

II. ABSTRACT ............................................................................................................................ 8

III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................... 10

1. EINLEITUNG .............................................................................................................. 13

1.1 Das humane Immundefizienz-Virus (HIV) ...........................................................................................13 1.1.1 Aufbau und Replikationszyklus des HIV ................................................................................................ 14 1.1.2 Die antiretrovirale Therapie ................................................................................................................. 15 1.1.3 Neuro-AIDS ........................................................................................................................................... 17 1.1.4 Das simiane Immundefizienz-Virus (SIV) .............................................................................................. 19 1.1.5 Die SIV-Infektion von Rhesus Affen ...................................................................................................... 19

1.2 Funktionelle Anatomie der Basalganglien ..........................................................................................20 1.2.1 Das Striatum ......................................................................................................................................... 22 1.2.2 Nervenzellen des Striatums .................................................................................................................. 22 1.2.3 Neurochemie des Striatums ................................................................................................................. 23

1.2.3.1 Das dopaminerge (DAerge) System im Striatum ......................................................................... 24 1.2.3.2 Striatale TH+ Neurone .................................................................................................................. 25 1.2.3.3 Das glutamaterge System im Striatum ......................................................................................... 26 1.2.3.4 Das GABAerge System im Striatum .............................................................................................. 27 1.2.3.5 Das cholinerge System im Striatum ............................................................................................. 27 1.2.3.6 Auswirkungen einer HIV-Infektion auf das DOPAerge/DAerge und cholinerge System im

Striatum ....................................................................................................................................... 28

1.3 Vesikuläre Speicherung von Neurotransmittern .................................................................................30 1.3.1 Ausgewählte vesikuläre Transporterproteine ...................................................................................... 31 1.3.2 Der vesikuläre Monoamin-Transporter 2 (VMAT-2) ............................................................................. 31 1.3.3 Der vesikuläre ACh-Transporter (VAChT) ............................................................................................. 33 1.3.4 Der vesikuläre Glutamat-Transporter 1 (VGLUT-1) .............................................................................. 34 1.3.5 Der vesikuläre GABA-Transporter (VGAT) ............................................................................................ 35

2 ZIELSETZUNG UND FRAGESTELLUNG .............................................................. 37

3 MATERIAL UND METHODEN ............................................................................... 38

3.1 Materialien ........................................................................................................................................38

3.2 Methoden ..........................................................................................................................................41 3.2.1 Charakterisierung der Versuchstiere und Gruppierungen ................................................................... 41

3.3 Gewinnung des Probenmaterials........................................................................................................42

4

3.3.1 Präparation und Fixierung, ZNS Gewebegewinnung ............................................................................ 42 3.3.2 Vorbereitung der Objektträger ............................................................................................................. 43 3.3.3 Schnitte von in Paraffin eingebetteten Geweben ................................................................................ 44 3.3.4 Übersichtsfärbungen mit Giemsa ......................................................................................................... 44

3.4 Immunhistochemische Methoden ......................................................................................................45 3.4.1 Antikörper und Detektionssysteme ...................................................................................................... 45 3.4.2 Einfache enzymatische Immunhistochemie (IHC) ................................................................................ 47 3.4.3 Immunhistochemische Doppelfluoreszenzmarkierung ........................................................................ 49 3.4.4 Coronare Schnittebenen....................................................................................................................... 51

3.5 Auswertungen und statistische Analysen ...........................................................................................52 3.5.1 Bestimmung der optischen Dichte der TH+, ChAT+, VAChT+, VGLUT-1+, VGAT+ und VMAT-2+

Nervenfasern ........................................................................................................................................ 52 3.5.2 Quantifizierungen der TH+, ChAT+ und VAChT+ Neurone ................................................................... 53 3.5.3 Darstellung der Immunreaktivität der Neuroinflammation ................................................................. 54

3.5.3.1 Auswertung der Iba-1+ mikroglialen Entzündungsreaktion......................................................... 54 3.5.3.2 Auswertung der GFAP+ astroglialen Entzündungsreaktionen ..................................................... 55

4 ERGEBNISSE .............................................................................................................. 56

4.1 Darstellung der lentiviralen Entzündungsreaktion..............................................................................56 4.1.1 Der Einfluss einer lentiviralen Infektion und deren antiretrovirale Behandlung auf die striatale

Viruslast ................................................................................................................................................ 56 4.1.2 Iba-1 als Marker für immunaktive Zellen ............................................................................................. 57 4.1.3 GFAP als Marker für Astrozyten und Astrogliose ................................................................................. 58

4.2 Effekte einer lentiviralen Infektion und der antiretroviralen Behandlung auf das monoaminerge System im Striatum ..................................................................................................59

4.2.1 Irreversible VMAT-2-Reduktion bei teilweiser Erholung der TH-Faserdichte ..................................... 59 4.2.2 Phänotypisierung der TH+ Neurone ..................................................................................................... 62

4.3 Effekte von lentiviraler Infektion und antiretroviraler Therapie auf das cholinerge System im Striatum ............................................................................................................................................63

4.3.1 Abnahme der VAChT+ Faserdichte bei unveränderter ChAT+ Faserdichte .......................................... 63 4.3.2 Abnahme VAChT+ und ChAT+ Neurone ohne Effekt der antiretroviralen Behandlung ....................... 65

4.4 GABAerge und glutamaterge Faserdichte bleiben von lentiviraler Infektion unbeeinflusst ................67

5 DISKUSSION .............................................................................................................. 68

5.1 Reversibilität der SIV-induzierten mikroglialen Enzündungsreaktion durch die antiretrovirale Therapie ............................................................................................................................................69

5.2 Reversibilität der SIV-induzierten Astrozytose durch die antiretrovirale Behandlung ........................69

5.3 Deutliche Restitution des TH+ Faserverlustes durch die antiretrovirale Therapie ...............................70 5.3.1 Unveränderte Zahl von TH+ Neuronen im Striatum ............................................................................. 72

5

5.4 Bedeutung der irreversiblen Reduktion der VMAT-2+ Faserdichte .....................................................73

5.5 SIV-induzierte Reduktion der ChAT+ und VAChT+ Neuronenzahl bei unveränderter ChAT+ Faserdichte im Striatum ....................................................................................................................76

5.6 Bedeutung der nur teilweise reversiblen VAChT+ Faserdichte ...........................................................78

5.7 Keine Beeinträchtigung vesikulärer Speicherproteine für GABA und Glutamat während der SIV-Infektion .....................................................................................................................................79

6 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................... 81

7 ANHANG ..................................................................................................................... 97

7.1 Verzeichnis der akademischen Lehrer ................................................................................................97

7.2 Danksagung ........................................................................................................................................98

6

I. Zusammenfassung

Seit dem Ausbruch der AIDS-Pandemie sind komplexe kognitive und sensomotorische

neurologische Komplikationen im Zuge einer HIV-Infektion bekannt. Sie werden als

HAND (HIV-associated neurocoginitve diseases) zusammengefasst und stellen trotz

antiretroviraler Therapien nach wie vor ein relevantes gesundheitliches und

sozioökonomisches Problem dar. Prävention und Therapie von HAND sind nicht

zufriedenstellend gelöst. Neuroinflammation im ZNS wird als wichtiger pathogenetischer

Faktor in der Entwicklung von HAND angesehen. Regionen-spezifische Veränderungen

in cerebralen Transmittersystemen sind ein weiterer Faktor HAND-assoziierter

neurologischer Dysfunktionen. Das Striatum gilt als besonders vulnerable Region.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, wie sich die klassischen

Transmittersysteme im Striatum im Zuge einer SIV-Infektion des Rhesus-Makaken und

deren antiretroviraler Therapie transient oder permanent verändern. Insbesondere sollte

geklärt werden, inwieweit die vesikulären Transportproteine der klassischen

Transmittersyteme im Striatum von der SIV-Infektion betroffen sind und ob, wie in

anderen ZNS-Regionen beobachtet, dissoziierte oder konkordante Veränderungen

entsprechender transmittersynthetisierender Enzyme auftreten. Des Weiteren sollte

geklärt werden, wie sich die Veränderungen striataler Transmitterenzyme und

vesikulärer Transporterproteine zur neuroinflammatorischen Signatur mikroglialer und

astrozytärer Reaktionen im Zuge der SIV-Infektion und deren antiretroviralen Therapie

verhalten.

Zur Klärung dieser Fragen wurden immunhistochemische Analysen von striatalem

Gewebe aus vier Versuchsgruppen des SIV-Modells durchgeführt: 1. Nicht-infizierte

Kontrollgruppe, 2. SIV-infizierte, nicht an AIDS erkrankte Gruppe von Rhesus Makaken

(SIV/-AIDS), 3. SIV-infiziert, an AIDS erkrankt (SIV/+AIDS), 4. SIV-infiziert, an AIDS

erkrankt und anschließend antiretroviral behandelt (SIV/+AIDS/+ddG). Das

entsprechende striatale Gewebe stand im Rahmen des durch die Volkswagen-Stiftung

geförderten Kooperationsprojektes "Mechanism of neuronal dysfunction in a primate

model for CNS viral and immune disease" der AG Weihe und der AG Eiden (NIMH,

NIH, Bethesda, MD) zur Verfügung.

Eine striatale Viruslast (SIV gp41+) wurde ausschließlich in der SIV/+AIDS Gruppe

nachgewiesen. Die neuroinflammatorische Signatur der SIV-Infektion wurde durch

Quantifizierung der gegenüber der Kontrollgruppe beobachteten parallelen Zunahme

Iba-1 (Iba-1+) positiver Mikrogliazellen sowie Iba-1+ Monozyten/multinukleärer

7

Riesenzellen einerseits und GFAP-positiver Astrozyten andererseits erfasst. In der SIV/-

AIDS Gruppe zeigte sich eine mäßige mikrogliale und astrozytäre

neuroinflammatorische Signatur. In der SIV/+AIDS Gruppe war eine maximale

neuroinflammatorische Signatur zu verzeichnen. Unter antiretroviraler Therapie war das

Niveau der neuroinflammatorischen Signatur auf dem Niveau der SIV/-AIDS Gruppe.

Der vesikuläre Monoaminotransporter-2 (VMAT-2), der im Striatum im Wesentlichen die

nigrostriatale dopaminerge (DAerge) Innervation repräsentiert, war in der SIV/+AIDS

Gruppe deutlich reduziert. Die SIV-induzierte Reduktion der striatalen VMAT-2+

Faserdichte wurde durch die antiretrovirale Therapie nicht auf Kontrollniveau nomalisiert.

Im Gegensatz zur Persistenz der reduzierten striatalen VMAT-2+ Faserdichte wurde die

SIV-induzierte Reduktion der striatalen Tyrosinhydroxylase-positiven (TH+) Faserdichte

durch die antiretrovirale Behandlung fast auf Kontrollniveau normalisiert. Dagegen blieb

die Anzahl intrinsischer striataler TH+ Neurone von einer SIV-Infektion und

antiretroviraler Therapie unbeeinflusst. Der vesikuläre Acetylcholin-Transporter (VAChT),

der ein Marker für die cholinerge Innervation im Striatum ist, war in der SIV/+AIDS

Gruppe um ca. 40% gegenüber der Kontrollgruppe reduziert. Die antiretrovirale

Behandlung führte nur zu einer geringen Restitution der VAChT+ Faserdichte. Dagegen

zeigte sich die Cholinacetyltransferase-positive (ChAT+) Faserdichte im Striatum

während der SIV-Infektion und ihrer antiretroviralen Therapie nicht verändert. Im

Gegensatz zu der unveränderten ChAT+ Faserdichte ergab die Analyse der ChAT+

Neuronenzahl eine bemerkenswerte numerische Reduktion in der SIV/-AIDS Gruppe. In

der SIV/+AIDS Gruppe war die ChAT+ Neuronenzahl noch stärkter reduziert. Diese

Reduktion zeigte sich gegenüber der antiretroviralen Behandlung resilient. Im

Gegensatz zu den charakterisitschen transienten und permanenten

inflammationsabhängigen oder -unabhängigen Veränderungen für cholinerge und

monoaminerge Transmittertransporter und deren synthetisierenden Enzyme im Striatum

waren der vesikuläre GABA Transporter (VGAT) für die GABAerge und der vesikuläre

Glutamat-Transporter-1 (VGLUT-1) für die glutamaterge Neurotransmission während der

SIV-Infektion und ihrer antiretroviralen Therapie nicht verändert. Die Ergebnisse der

vorliegenden Arbeit zeigen, dass das Striatum während einer lentiviralen Infektion/AIDS-

Erkrankung von selektiven Veränderungen der cholinergen und monoaminergen

Transmittersysteme betroffen ist, die sich als therapieresistent erwiesen oder durch die

antiretrovirale Behandlung nur partiell normalisiert wurden. Daraus ist zu schließen,

frühzeitig im Verlauf der HIV-Infektion mit BHS-gängigen antiretroviralen Medikamenten

zu intervenieren, um nachhaltige Schädigungen von cholinergen und monoaminergen

Transmittersystemen zu präventieren.

8

II. Abstract

Since the outbreak of the AIDS pandemic complex cognitive and sensorimotor

complications in the course of a HIV-infection have been observed. They are

summarized as HAND (HIV-associated neurocognitive diseases) and still pose, in spite

of antiretroviral therapy, a relevant public health and socioeconomic problem.

Prevention and treatment of HAND are not solved yet satisfactorily. Neuroinflammation

in the CNS is considered to be an important pathogenetic factor in the development of

HAND. Among others, regions-specific changes in cerebral transmitter systems provide

another factor of HAND-associated neurological dysfunction. The striatum has been

shown to be particulary vulnerable during a HIV-infection.

The aim of the present thesis was to examine transient and permanent changes of

classical neurotransmitter systems in the striatum in the course of SIV-infection of

rhesus macaques and their antiretroviral therapy. In particular, it should be clarified to

what extent the vesicular transporters of classical transmitter systems in the striatum

are affected by the SIV-infection, and whether, as observed in other CNS regions,

dissociated or concordant changes of corresponding transmitter-synthesizing enzymes

occur. Furthermore, we investigated how changes of striatal transmitter enzymes and

vesicular transporters relate to the neuroinflammatory signature of microglial and

astrocytic reactions in the course of SIV-infection and their antiretroviral therapy.

In order to answer these questions immunocytochemical analysis were performed on

striatal tissues of four experimental groups in the SIV model of rhesus macaques: 1.

Uninfected control group, 2. SIV-infected, without AIDS group (SIV/-AIDS), 3. SIV-

infected, suffering from AIDS (SIV/+AIDS), 4. SIV-infected, suffering from AIDS and

subsequently antiretroviral treatment (SIV/+AIDS/+ddG). The used striatal tissue

samples are taken from the research collaboration "Mechanism of neuronal

dysfunction in a primate model for CNS viral and immune disease" (supported by the

Volkswagen foundation) of Weihe and Eiden (NIMH, NIH, Bethesda, MD).

A striatal virus load (SIV/ gp41+) was detected exclusively in the SIV/+AIDS group.

Compared to the control group the neuroinflammatory signature of the SIV-infection

was captured by quantification of the observed parallel increase of Iba-1 positive

monocytes/ multinucleated giant cells on the one hand and GFAP positive astrocytes

on the other hand. A moderate microglial and astrocytic neuroinflammatory signature

was already seen in the SIV/-AIDS group. The SIV/+AIDS group had a maximum

9

neuroinflammatory signature. The level of the neuroinflammatory signature was in the

course of antiretroviral treatment as high as the level seen in the SIV/-AIDS group.

The vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2), which essentially represents the

nigrostriatal DAergic innervation, was significantly reduced in the SIV/+AIDS group.

The SIV-induced reduction of striatal VMAT2 fiber density was not normalized to the

level of control by antiretroviral therapy. In contrast to the persistence of reduced

striatal VMAT2+ fiber density, the SIV-induced reduction of the TH+ fiber density was

normalized almost to the control level by the antiretroviral treatment. By contrast, the

number of intrinsic striatal TH+ neurons remained unaffected by SIV-infection and

antiretroviral treatment.

Compared to the control group the vesicular acetylcholine transporter (VAChT), which

is a marker for the cholinergic innervation in the striatum, was reduced to

approximately 40% in the SIV/+AIDS group. The antiretroviral treatment resulted in a

only small restitution of VAChT+ fiber density. By contrast, the cholinergic acetylcholine

transferase (ChAT) fiber density in the striatum showed no changes during SIV-

infection and its antiretroviral therapy.

In contrast to the unchanged ChAT+ fiber density there was a remarkable numerous

reduction of ChAT+ neurons in the SIV/-AIDS group. The ChAT+ neuronal number was

even more reduced in the SIV/+AIDS group.

Unlike the characteristic transient and permanent inflammationdenpendent or -

independent changes of cholinergic and monoaminergic vesicular transporters and

their synthesizing enzymes in the striatum, there were no changes observed in the

vesicular GABA transporter (VGAT) for the GABAergic and vesicular glutamate

transporter 1 (VGLUT1) for the glutamatergic neurotransmission during SIV-infection

and its antiretroviral treatment.

The results of this work show that selective changes of cholinergic and monoaminergic

transmitter systems occur in the striatum during a lentiviral infection/AIDS disease,

which are not affected by antiretroviral treatment, or at least are partially normalized by

antiretroviral therapy.

The conclusion is to intervene early in the course of HIV-infection with brain-blood-

barrier current antiretroviral drugs in order to prevent sustained damage to cholinergic

and monoaminergic transmitter systems.

10

III Abkürzungsverzeichnis

6-Cl-ddG 6-Chloro-2’,3’-Dideoxyguanosin

AADC aromatische Aminosäure-Decarboxylase

ABC Avidin-Biotin-Komplex

ACh Acetylcholin

AChE ACh-Esterase

AIDS erworbenes Immundefizienz-Syndrom

AMPA Aminomethylphosphonsäure

ANI asymptomatische neurokognitive Beeinträchtigung

ANOVA Analyse der Varianz

ARC AIDS-bezogene Krankheitszustände

ART antiretrovirale Therapie

BHS Blut-Hirn-Schranke

BIV bovines Immunodefizienz-Virus

BSA bovines Serumalbumin

cART kombinierte antiretrovirale Therapie

CCR5 CC-Motiv-Chemokinrezeptor 5

CXCR4 CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 4

CD Cluster der Differenzierung

ChAT Cholin-Acetyl-Transferase

COMT Katechol-O-Methyl-Transferase

COX Cyclooxygenase

DA Dopamin

DAT DA-Transporter

DAB 3,3’-Diaminobenzidin

DHTBZ Dihydrotetrabenazin

DNA Desoxyribonuklein-Säure

DS dorsales Striatum

EAATs exzitatorische Aminosäure-Transporter

https://de.wikipedia.org/wiki/Aminomethylphosphons%C3%A4ure

11

ELISA enzymgekoppelter Immunadsorptionstest

GABA Gamma-Aminobutyr-Säure

GFAP gliales fibrilläres Säureprotein

Glu Glutamat

GPe Globus pallidus externus

GPi Globus pallidus internus

gp120 Glykoprotein 120

gp41 Glykoprotein 41

HAD HIV-assoziierte Demenz

HAND HIV-assoziierte neurokognitive Dysfunktion

HIV humanes Immunodefizienz-Virus

HIVE HIV-Enzephalitis

Iba-1 inoniertes Clacium-bindendes Adaptermolekül-1

IHC Immunhistochemie

IL Interleukin

INF Interferon

L-DOPA L-3,4-Dihydroxyphenylalanin

LDCV grosse, elektronendichte Vesikel

Lsg. Lösung

MND moderate/milde neurokognitive Störung

MAO Monoaminoxidase

MPTP 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6 Tetrahydropyridin

MSN mittelgrosse, dornentragende Neurone

NC Nucleus caudatus

NMDA N-Methyl-D-Aspartat

NNTRI nicht-nukleosidische RT-Inhibitoren

NRTI nukleosidische RT-Inhibitoren

OTs Objektträger

PBMC periphere mononukleäre Blutzellen

12

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

Put Putamen

PI Protease-Inhibitoren

RKI Robert-Koch-Institut

RNA Ribonukleinsäure

ROS reaktive Sauerstoffspezies

RT reverse Transkriptase

SDF-1 Gewebszellmediator Faktor-1

SEM Standardfehler vom Mittelwert

SIV simianes Immunodefizienz-Virus

SIVE SIV-Enzephalitis

SLC Transportprotein für gelöste Stoffe

SNc Substantia nigra pars compacta

SNr Substantia nigra pars reticularis

STN Nucleus subthalamicus

STR Striatum

SSV kleine synaptische Vesikel

SV synaptischer Vesikel

TBZ Tetrabenazin

TH Tyrosinhydroxylase

TNF Tumornekrosefaktor

TEXANs toxische Substanzen ausstossende Antiporter-Systeme

VAChT vesikulärer ACh-Transporter

VGAT vesikulärer GABA-Transporter

VGLUT-1 vesikulärer Glutamat-Transporter 1

VMAT-2 vesikulärer Monoamin-Transporter 2

VS ventrales Striatum

WHO Weltgesundheitsbehörde

ZNS zentrales Nervensystem

Einleitung

13

1. Einleitung

1.1 Das humane Immundefizienz-Virus (HIV)

Auslöser der Immunschwächekrankheit AIDS (Aquired Immune Defiency Syndrome) ist

das HIV. Der erstmaligen Beschreibung der erworbenen, bis heute schwerwiegendsten,

Immunschwächekrankheit AIDS als klinische Entität im Jahr 1981 (Gottlieb et al. 1981;

Masur et al., 1981) folgte die Virusisoloation aus Lymphozyten an AIDS erkrankter

Patienten im Jahr 1983 (Barre Sinoussi et al., 1983). Seit dem Auftritt der ersten Fälle

hat die Ausbreitung des HIV pandemische Ausmaße angenommen, die bisher zu mehr

als 25 Mio. Todesfälle durch AIDS geführt hat. Die UNAIDS-Organisation schätzt die

Zahl der Menschen weltweit, die Ende 2012 mit HIV/AIDS lebten, auf 35,3 Millionen

(UNAIDS, 2013). In Deutschland betrug der Anteil HIV-Infizierter Ende 2012 ca. 78000,

wobei die Zahl der Neuinfektionen mit ca. 820 rückläufig war (RKI, 2013). Das HIV

infiziert in erster Linie CD4-positive (CD4+) Zellen (insb. T-Helfer-Lymphozyten), die eine

zentrale Rolle bei der Immunantwort auf Infektionen spielen. Bei einem gesunden

Menschen beträgt die Menge an T-Helfer-Zellen 800-1200 /µl Blut. Sinkt die Menge

unter 200 T-Helfer-Zellen/µl werden Erkrankte anfälliger für Infektionen und entwickeln

im Vollbild die Immunschwächekrankheit AIDS.

Aus dem Jahr 1959 stammt die älteste gesicherte Infektion. Aus einer seropositiven

Plasmaprobe aus Afrika konnte die Virussequenz amplifiziert und charakterisiert werden

(Zhu et al., 1998). Der Ursprung der HI-Viren wird in unterschiedlichen

Immunschwächeviren von Chimpansen aus West- und Zentralafrika vermutet, wobei

eine direkte und eine über Gorillas führende indirekte Übertragung auf Menschen

angenommen wird (Hahn et al., 2010). Es werden zwei Typen von HIV unterschieden:

HIV-1 und HIV-2. Während HIV-2 in Westafrika lokal verbreitet ist, dominiert HIV-1

weltweit. HIV-2 wird eine geringere Viruspathogenität zugeschrieben, da es sich weniger

effizient repliziert. Während der pandemischen HIV-Ausbreitung erfolgte eine genetische

Diversität. So wird HIV-1 weiter in 4 Gruppen (M, N, O und P), in Subgruppen und in

zirkulierende rekombinante Formen untergliedert. Der HIV Subtyp-B hat sich in den

letzten Jahren zum dominierenden Virusstamm weltweit entwickelt (Lau und Wong,

2013). Die unvorhersehbare und dynamische Ausbreitung der genetischen Stämme und

die Entwicklung von neuen rekombinanten Virusvarianten beeinflussen erheblich die

diagnostische Sicherheit, antiretrovirale Therapie und den Krankheitsverlauf.

HIV gehört zu der Familie der Lentiviren, welche eine Gattung innerhalb der Retroviren

bilden. Lentiviren sind komplexe, behüllte Einzel(+)-Strang RNA-Viren, deren

viruseigene Integrase die durch die reverse Transkriptase (RT) gebildeten DNA-

Doppelstränge in das Genom der Wirtszelle integriert. Im Gegensatz zu einfachen

Einleitung

14

Retroviren haben Lentiviren zusätzliche regulatorische Enzyme, die für eine erhöhte

Virusreplikation zuständig sind. Desweiteren zeichnen sich Lentiviren durch lange

Inkubationszeiten (Monate bis Jahre) aus (lentus = langsam), die zur Entwicklung

chronischer Krankheiten führen.

Zu den Primaten-Lentiviren werden HIV-1, und HIV-2 sowie das simiane

Immundefizienz-Virus (SIV) gezählt. Die experimentelle SIV-Infektion von Rhesus Affen

ist ein etabliertes Modell für die Erforschung der HIV-Neuropathogenese (Eiden et al.,

1999).

1.1.1 Aufbau und Replikationszyklus des HIV

Das HIV infiziert CD4+ Makrophagen, T-Lymphozyten und dendritische Zellen. HI-

Virionen haben einen Durchmesser von ca. 100 nm, bestehen aus einem inneren

Kapsid und einer Hüllmembran (Palmer und Goldsmith, 1988). Das Kapsid ist aus 2000

p24-Proteinen aufgebaut und umschließt zwei einzelsträngige RNA, die die Kopien der

neun Virusgene enthalten. Dazu gehören die drei Strukturgene gag (für Kernproteine),

pol (für die Enzyme Integrase, RT und Protease) und env (für Hüll- und

Membranproteine) (Trono, 1995). Für eine erfolgreiche Replikation und Infektion des HIV

sind die drei regulatorischen Gene tat, ref und nef und die drei Hilfsgene vif, vpr und vpu

notwendig. Die Kapsidproteine bilden die Enzyme RT, Integrase und Protease (Weiss,

1996; Ganser-Pornillos et al., 2008). In der HIV-Hülle ist das komplexe env-Protein

eingebettet, das aus einem transmembranen Anteil (gp41) und einem

Oberflächenprotein (gp120) besteht. Beide vermitteln das Eindringen des HIV in die

Wirtszelle. Hierbei bindet das Glykoprotein gp120 an den CD4-Rezeptor (Sattenau et al.,

1988) und an membranständige Chemokinkorezeptoren, die die Präferenz von

Virusvarianten für bestimmte Zelltypen zeigen (Broder und Collman, 1997). Der

Chemokinrezeptor CCR5 (Kofaktor für makrophagotrope Virusvarianten) wird auf

Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert, während CXCR4 (Kofaktor für

lymphotrope Virusvarianten) auf aktivierten T-Zellen vorzufinden ist. Das mit gp120

nicht-kovalent verbundene transmembrane Glykoprotein gp41 induziert daraufhin die

Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran der Wirtszelle (Freed et al., 1990).

Genetische Varianten von Chemokinrezeptoren werden mit einer HIV-Resistenz in

Verbindung gebracht. So wird ein nicht-funktioneller CCR5-Rezeptor (heterozygoter

CCR5-+/Δ32 oder homozygoter CCR5-Δ32/Δ32 Genotyp) mit einer verlangsamten

Progression oder gar Resistenz der HIV-Infektion assoziiert (Vassart et al. 1996; Seage

et al., 2001; Patino et al., 2002; uvm.). Dementsprechend sind Chemokinrezeptoren

Einleitung

15

noch immer Gegenstand von Forschungsansätzen, die einen neuen Behandlungsansatz

für die Prävention oder Behandlung einer HIV-Infektion untersuchen.

Nach Fusionierung der Virushülle mit der Zellmembran werden die Virus-RNA und -

Proteine in die Zelle freigesetzt. Es entsteht ein für Nukleotide durchlässiger RT-

Komplex (Hsu und Wainberg, 2000), der die virale Einzelstrang-RNA in Doppelstrang-

DNA umschreibt (Hughes und Whitcomp, 1992). Nach dem Transport der transkribierten

DNA in den Zellkern wird diese mit Hilfe der HIV-Integrase in das Genom der Wirtszelle

integriert (Provirus) und bei deren Zellteilung mit vermehrt. Dies ermöglicht die

Expression viraler Gene durch die zelluläre RNA-Polymerase-II. Das virale Protein rev

vermittelt den Export der nicht oder einfach gespleißten HIV-RNA aus dem Zellkern in

das Zytoplasma (Green und Peterlin, 2002; Wu, 2004), die dann durch die zelluläre

Maschinerie zu regulatorischen und akzessorischen Proteinen translatiert werden. An

der Zellmembran interagieren die verschiedenen Viruskomponenten unter Bildung neuer

Viruspartikel miteinander, die dann als unreife Viruspartikel durch Knospung an der

Zelloberfläche freigesetzt werden. Durch die Spaltung der gag und gag/pol

Vorläuferproteine durch die virale Protease erfolgt die Reifung zu infektiösen Viren

(Modrow et al., 1994; Freed, 1998; Sierra et al., 2005).

Der Verlauf einer HIV-Infektion wird in drei Phasen unterteilt. Die Primärinfektion verläuft

meistens klinisch inapparent. Grippeähnliche Symptome sorgen darfür, dass eine akute

HIV-Infektion meist unerkannt bleibt. Innerhalb der ersten Tage nach der Infektion

kommt es allerdings schon zu einer starken Virusvermehrung in aktivierten Lymphozyten

in Lymphknoten (Schacker et al., 2001). Auch in der folgenden, oft mehrjährigen

Latenzperiode treten meistens keine gravierenden Symptome auf. In dieser Phase

nimmt die Schwächung des Immunsystems zugunsten des Virus zu. Diese

fortschreitende Schwächung begünstigt das Auftreten von klinischen Symptomen, die

aber nicht zu den AIDS-definierenden Krankheiten gehören. Dies deutet auf die dritte

Phase der HIV-Infektion, den ARC (AIDS-Related Complex) hin. Auf die weitere

Schwächung des Immunsystems folgt die Diagnose AIDS, die schwere opportunistische

Infektionen und bösartige Tumoren mit sich bringt.

1.1.2 Die antiretrovirale Therapie

Ziel der antiretroviralen Therapie (ART) ist es, den HIV Replikationszyklus zu hemmen,

um eine Unterdrückung der Krankheitsprogression und eine Restitution der zellulären

Immunität zu erreichen. Angriffspunkte hierfür bieten beispielsweise die reverse

Transkription und Integration, der HIV-Eintritt sowie die Prozessierung von

Vorläuferproteinen durch die Protease. Die 1996 eingeführte Kombinations-Therapie

Einleitung

16

(cART: Combined Antiretroviral Therapy) besteht meist aus zwei nukleosidischen RT-

Inhibitoren (NRTI), die mit einem nicht-nukleosidischen RT-Inhibitor (NNRTI) oder

Protease-Inhibitor (PI) kombiniert werden. Die Einführung der cART bedeutet für HIV-

Infizierte eine Verlängerung der Lebenszeit durch eine Reduzierung der viralen Last. Die

in den letzten Jahren eingeführten Kombinationstherapien zeichnen sich durch

einfachere Dosierungsvorgaben, weniger toxischen Effekten und vor allem durch eine

geringere Anfälligkeit für die Entwicklung von Resistenzen aus (Weinberg 2008). Der

Einsatz von RNA-Liganden als antiretrovirale Moleküle und die autologe Transplantation

von genetisch veränderten hämatopoetischen Stammzellen bilden gute

Zukunftsperspektiven für neuere Therapie-Strategien (Burnett, 2009; Dassie et al.,

2013).

In der vorliegenden Arbeit wurde aus der NRTI-Gruppe der lipophile und äußerst

effektive Wirkstoff 6-Chloro-2’,3’-Dideoxyguanosin (6-Cl-ddG) verwendet. Seine

Entwicklung erfolgte im Rahmen von Forschungsarbeiten, um die Einflüsse einer

antiretroviralen Therapie auf Neuro-AIDS zu untersuchen. Zahlreiche Experimente mit

SIV-infizierten Rhesus Makaken konnten die gute ZNS-Wirksamkeit von 6-Cl-ddG durch

eine verringerte cerebrale Viruslast und eine Reduktion der immun- und

gliopathologischen Veränderungen belegen (Otani et al., 1997; Fuji et al., 1998;

Depboylu et al., 2004).

Obwohl in der antiretroviralen Therapie rasante Fortschritte erzielt wurden, ist die Art der

Therapie, auch unter dem Aspekt, eine neuroprotektive Wirkung zu erzielen, und der

Zeitpunkt des Therapiebeginns noch immer Gegenstand unzähliger Diskussionen. Es

wird angenommen, dass die Art der antiretroviralen Medikation unter dem Aspekt der

Bluthirnschranke (BHS)-Gängigkeit einen Einfluss auf die Entstehung der HAND haben.

Die gängige HAART scheint in der Kontrolle der cerebralen HIV-Infektion zu scheitern

(Heaton et al., 2011). Befürworter einer frühen BHS-gängigen antiretroviralen Therapie

sehen in ihr eine präventive Maßnahme gegen die Entstehung der HAND (Zink et al.,

2010; Sanmarti et al., 2014). Es wurde gezeigt, dass eine bessere Suppression der

ZNS-Viruslast mit einer verbesserten neurokognitiven Funktion einhergeht (Letendre et

al., 2004; Patel et al., 2009). Letendre et al. erschufen 2008 ein Ranking-System für die

Effektiviät von BHS-gängigen antiretroviralen Medikamenten. Es basiert auf ihren

chemischen Eigenschaften, der Liquorkonzentration und ihrer antiretroviralen Effektivität.

Weitere Arbeiten fanden heraus, dass die Kombination mit Medikamenten, die eine

höhere BHS-Gängigkeit aufweisen, zu einer verbesserten neurokognitiven Funktion

beitragen könnte (Cusini et al., 2013). Dennoch gibt es bisher keine eindeutigen Studien,

die die Effektivität der HAART bezüglich der Verbesserung neurokognitver

Dysfunktionen aufweisen. Auch konnte bisher nicht dargestellt werden, welche cART-

Einleitung

17

Zusammenstellung am besten für die Prävention oder Verbesserung von HAND

geeignet ist.

1.1.3 Neuro-AIDS

Mit der Einführung der cART im Jahre 1996 ist die HIV-Infektion zu einer behandelbaren

Erkrankung geworden, die jedoch noch immer nicht heilbar ist. Heute wird für

neurologische Manifestationen einer HIV-Infektion der Begriff HIV-assoziierte

neurokognitive Störung (HAND: HIV-Associated Neurocognitive Disorder) verwendet.

Dieser umfasst die für dieses Krankheitsbild geprägten Begriffe wie HIV-assoziierte

Demenz, HIV-Enzephalopathie und HIV-assoziierter motorisch-kognitiver Komplex. Die

Symptomausprägung wird in drei Schweregrade klassifiziert: asymptomatische

neurokognitive Beeinträchtigung (ANI: Asymptomatic Neurocognitve Impairment), milde

neurokognitive Störung (MND: Mild Neurocognitive Disorder) und HIV-assoziierte

Demenz (HAD: HIV-Associated Dementia).

Unter der cART zeigt sich die Inzidenz von HAND nicht so rückläufig wie die der

anderen AIDS-definierenden Krankheiten (Dore et al., 1999). Zwar werden bei

antiretroviral behandelten Patienten nicht mehr die schweren Ausprägungen von HAND

beobachtet, dafür werden aber leichte neurokoginitve Störungen in bereits frühen

Erkrankungsstadien nachgewiesen. Cerebrale Manifestationen der HIV-Infektion mit

kognitiven und motorischen Störungen steigen mit der Lebenserwartung naturgemäß an.

Aus diesem Grunde ist Neuro-AIDS noch immer ein Alltagsproblem der HIV-Medizin.

Diese Beobachtungen rücken die Erforschung von neuroprotektiven Therapiestrategien

in den Fokus von gegenwärtigen Forschungsansätzen. Hierbei werden eine mögliche

irreversible Hirnschädigung vor einer Therapieinitiierung, eine insuffiziente Suppression

der viralen Last im ZNS durch nicht ZNS-gängige Pharmaka und auch die

neurotoxischen Effekte der Therapie selbst diskutiert. Laut der WHO entwickeln ca. ein

Drittel der HIV-infizierten Erwachsenen eine demenzielle Erkrankung, die mit einer

schlechten Prognose einhergeht. Ursächlich wird die rasch progrediente HAD zum einen

direkt auf die HIV-Infektion, die sich in Form einer subkortikalen Demenz äußert (Berger

und Arendt, 2000), und zum anderen auf Folgen der opportunistischen Infektionen und

Neoplasien des Gehirns zurückgeführt. Frühe Symptome bilden neben Konzentrations-

und Merkfähigkeitsstörungen auch Beeinträchtigungen der Feinmotorik und Symptomen,

die einem Parkinson-Syndrom ähneln. Zusätzlich werden demyelinisierende

Neuropathien, Meningoenzephalitiden und auch neuropsychiatrische Störungen

beobachtet.

Einleitung

18

Bereits in der frühen Infektionsphase dringt das HIV in das ZNS ein und befindet sich

hier vornehmlich in Makrophagen und Mikroglia (Abb. 1). Diese setzen Chemokine,

Zytokine und Virusproteine frei, die weitere nicht-infizierte Makrophagen und Mikroglia

aktivieren (Kaul et al. 2000, Williams und Hickley, 2002). Diese Prozesse fördern die

Ausschüttung von neurotoxischen Substanzen (Arachidonsäure, Sauerstoffradikale,

TNFα, Glutamat und Stickoxide), die sowohl zu einer direkten neuronalen Schädigung,

als auch zu einer Verstärkung der inflammatorischen Prozesse führen. Zeitgleich kommt

es im Rahmen dieser Prozesse zu einer Aktivierung von Astrozyten, die die

Permeabilität der BHS weiter erhöhen. Der Interaktion zwischen Astrozyten und

Makrophagen/Mikroglia wird eine zentrale Rolle in der Neuropathogenese der HIV-

Enzephalopathie zugesprochen (Gonzales-Sarano und Martin-Garcia, 2005).

Abb. 1.1: Darstellung der Invasion des HI-Virus ins zentrale Nervensystem.

Die "Trojan Horse Theory" geht davon aus, dass das HIV durch Invasion in mononukleäre Zellen des

peripheren Blutes sich, ohne durch das Immunsystem erkannt zu werden, replizieren kann. So kann es als

blinder "Passagier" die BHS überwinden. Im ZNS infiziert das Virus parenchymale Mikroglia (und evtl. auch

Astrozyten). Die immunpathologischen Prozesse führen zur Entstehung von mehrkernigen Riesenzellen, die

typisch für eine HIV-Enzephalitis sind. Aktivierte und infizierte Mikroglia/mononukleäre Zellen führen über

zytochemische Prozesse zu einer Progression des Inflammationsgeschehens und der neuronalen

Schädigung. Schema modifiziert nach Bertoune (2014).

Einleitung

19

1.1.4 Das simiane Immundefizienz-Virus (SIV)

SIV gilt als Ursprungsvirus für das menschliche Immunschwächevirus HIV. Die

erstmalige Isolierung des SIV mit Zeichen einer Immundefizienz gelang 1985 bei Rhesus

Affen (Macacca mulatta) (Daniel et al., 1985; Kanki et al., 1987). Als natürliche Wirte für

das SIV sind Paviane, Mangabenaffen und die grüne Meerkatze bekannt, bei denen das

Immunschwächevirus keine klinische Manifestation auslöst. Erst eine

Interspeziestransmission von evolutionsbedingten Virusrekombinationen auf andere

Primatenarten wie Rhesus Affen und Menschen führt zu einem pathogenen Verlauf.

Bisher sind mehrere SI-Virusstämme aus mindestens 20 nicht-humanen

Primatenspezies aus Zentralafrika isoliert worden. Phylogenetische Analysen führen das

HIV-1 auf das Chimpansenvirus SIVcpz zurück. Da SIVcpz eine Mosaikstruktur aus SIVrcm

(aus Mangabenaffen) und SIVgsn (aus Meerkatzen) besitzt, wird eine cross-spezies

Übertragung auf Chimpansen (Pan troglodytes) von kleineren Affenarten angenommen,

die ihre Beutetiere darstellen (Sharp et al., 1998; Bailes et al. 2003). Die Abstammung

von HIV-2 konnte auf SIVsm (aus der Makakenart der Halsbandmangaben) zurückgeführt

werden (Sharp et al. 2001, Marx et al., 2004). SIV und HIV gehören zu derselben

Subgruppe der Lentiviren (Primaten-Lentiviren). Beide verbindet eine große strukturelle

Verwandtschaft, die sich in der Übereinstimmung der Organisation ihres Genoms und

ihrer Gensequenzen (Hahn et al., 2000) widerspiegelt.

1.1.5 Die SIV-Infektion von Rhesus Affen

Die SIVmac-Infektion von Rhesus Affen ist das am häufigsten verwendete Tiermodell, weil

der Wirt und das Virus der menschlichen HIV-Infektion/AIDS-Erkrankung sehr ähneln

(Ter Meulen et al., 2002; Burudi et al., 2001). Beide Virusstämme zeigen einen hohen

Tropismus für CD4 exprimierende Monozyten, Lymphozyten und dendritische Zellen

(Desrosiers, 1990; Levy, 1996). Die daraus resultierende Abnahme der CD4-Zellen führt

in beiden Wirten zu einem vermehrten Auftreten von Lymphadenopathien,

opportunistischen Infektionen, Diarrhoen und Neoplasien. SIV-infizierte Rhesus

Makaken können wie HIV-infizierte Menschen motorische und kognitive Störungen

entwickeln (Eiden et al., 1994).

Das in der vorliegenden Arbeit eingesetzte lympho- und makrophagotrope SIVδB670

besitzt den Vorteil, dass es einen schnellen Infektionsverlauf und eine höhere Rate an

neuronalen Schäden aufweist (Clemens et al., 2008). Es eignet sich besonders für die

Untersuchung der Neuropathogenese einer retroviralen Infektion.

Erste typische neuropathologische Veränderungen äußern sich in Form einer

Meningoenzephalitis durch perivaskuläre Monozyteninfiltrate, mehrkernige Riesenzellen

Einleitung

20

und parenchymale Mikrogliaknötchen. Derartige Läsionen werden begleitet von einer

reaktiven Astrogliose (Weihe et al., 1993) und werden besonders in den Basalganglien,

der Pons und der weißen Substanz gefunden (Sopper et al., 2002).

1.2 Funktionelle Anatomie der Basalganglien

Die Basalganglien bilden eine funktionelle Einheit neuronaler Regelkreise, die im

motorischen System als komplexe Kontrollelemente für die Somatomotorik fungieren.

Darüber hinaus sind sie auch bei der Koordination von höheren integrativen kognitiven

und emotionalen Prozessen beteiligt (de Long et al., 1990; Groenewegen, 2007).

Informationen aus dem gesamten cerebralen Cortex werden in den Basalganglien

verarbeitet und über den Thalamus wieder in corticale Bereiche weitergeleitet. Zu den

bilateral gelegenen Basalganglien gehören das Striatum, der Globus pallidus mit einer

pars externa (GPe) und pars interna (GPi), der Nucleus subthalamicus (STN) und die

Substantia nigra mit einer pars compacta (SNc) und einer pars reticularis (SNr) (Gerfen

und Wilson, 1996; Kreitzer und Malenka, 2008). Aktuell wird die Funktionalität der

Basalganglien mit mindestens fünf Funktionsschleifen erklärt, die unterschiedliche,

somatotop geordnete, anatomisch und funktionell getrennte Bereiche der Basalganglien,

des Thalamus und des Cortex parallel durchlaufen (Alexander und Crutcher, 1990;

Hazrati und Parent, 1994). Entsprechend werden skelettomotorische, okulomotorische,

präfrontale und limbische Schaltkreise unterschieden. Diese Funktionsschleifen

veranschaulichen die Integrationsfunktion der Basalganglien bei der Auswahl eines

motorischen Programms und dienen in der Klinik als Erklärungsmodell für entstehende

Symptome bei Funktionsausfällen. Die Steuerung von Bewegungsabläufen wird mit der

motorischen Funktionsschleife erklärt (Albin et al., 1995; Crutcher, 1990). In diesem

Modell bildet das Striatum die Haupteingangsstruktur, während der GPi und die SNr die

Ausgangsstrukturen darstellen. Unterschieden wird ein direkter, bewegungsfördernder

Weg (Striatum - GPi) von einem indirekten, bewegungshemmenden Weg (Striatum -

GPe - STN- GPi) (Abb. 1). Eine weitere Regulation motorischer Abläufe unter

Umgehung des Striatums wird mit dem hyperdirekten Weg erklärt, der als cortico-

subthalamico-pallidale Verbindung beschrieben wird (Nambu et al., 2002).

Zu den Basalganglienerkrankungen werden unter anderem das Morbus Parkinson und

die Chorea Huntington gezählt. Eine Störung im Wechselspiel der Impulsabgabe wird

beispielsweise bei der Parkinson-Krankheit erkennbar. Hierbei entsteht ein

dopaminerges (DAerges) Defizit im Striatum durch eine Degeneration DAerger Neurone

der SNc, das zu einem Überwiegen des indirekten Weges führt. Die Parkinson-

Symptome entstehen durch eine Steigerung der inhibitorischen Aktivität der

Einleitung

21

Ausgangskerne (hypokinetische Erkrankung). Bei Chorea Huntington vermindert sich die

inhibitorische Aktivität der Ausgangskerne (hyperkinetische Bewegungsstörung). Auch

werden kognitive Störungen bei pathologischen Veränderungen der Basalganglien

beschrieben (Bonelli und Cummings, 2008).

A Basalganglienschleife B Striatale Neurone

Abb. 1.2: Vereinfachte Darstellung der Basalganglienschleife unter physiologischen Bedingungen nach Alexander und Crutcher (1990): die cortiko-striato-thalamo-cortikale Feedbackschleife.

A: Rote Pfeile: exzitatorisch; blaue Pfeile: inhibitorisch.

1. Der "direkte Weg": Striatum – Globus pallidus internus (GPi)/Substantia nigra pars reticularis (SNr). Der

Weg wirkt über eine Hemmung der Bewegungsinhibition bewegungsfördernd.

2. Der "indirekte Weg": Striatum – Globus pallidus externus (GPe) – Nucleus subthalamicus (STN) –

GPi/SNr. Der Weg wirkt indirekt bewegungshemmend über eine Förderung der inhibitorischen

Ausgangskerne.

DAerge Afferenzen aus der Substantia nigra pars compacta (SNc) wirken über D1- und D2-Rezeptoren

modulierend auf beide Wege.

B: Schematische Darstellung von klassischen striatalen Neuronentypen nach Kreitzer A.C. (2009).

MSN: Medium Spiny Neuron (GABAerge Projektionsneurone); FS: Fast Spiking Interneuron (cholinerge,

grosse Interneurone); LTS: Low Thresholdspiking Interneuron (cholinerge, mittelgrosse Interneurone); TAN:

Tonically Active Interneuron (cholinerge Interneurone).

1.

2.

Einleitung

22

1.2.1 Das Striatum

Das Striatum ist das Eingangskerngebiet der Basalganglien. Es gilt als zentrale

Schaltstelle motorischer Impulse, die durch Ordnung, Temporegulierung und

Koordination von Bewegungsschleifen eine zentrale Rolle bei der Planung und

Initiierung von Willkürbewegungen spielt. Es besteht aus einem Caput, einem Corpus

und einer Cauda. Es wird anatomisch und funktionell in zwei Subareale unterteilt, die

Teil der assoziativen und der sensomotorischen Basalganglienfunktionsschleife sind.

Das dorsale Striatum (DS) gliedert sich in den an den Seitenventrikel grenzenden

Nucleus caudatus (NC) und das lateral des Pallidums liegende Putamen (Put), die

entwicklungsgeschichtlich aus derselben Struktur im Vorderhirn hervorgehen. Sie bilden

eine funktionelle Einheit und werden bei Primaten durch die Capsula interna, die

zwischen dem Neocortex und dem Thalamus verlaufende Faserbündel enthält,

auseinandergedrängt. Das ventrale Striatum (VS) wird auch als Neostriatum bezeichnet

und enthält zusätzlich den Nucleus accumbens, einen Teil des Tuberculum olfactorium

und das Nucleus amygdaloideus centralis. Dem Begriff "Streifenkörper" liegen die

innerhalb der Capsula interna gelegenen Zellbrücken zugrunde. Im Striatum enthalten

sind zwei Arten von Kompartimenten: große Teile mit motorischen, ACh-Esterase

(AChE)-haltigen Verbindungen (Matrix) und kleinere Abschnitte (Striosomen), die mit

dem limbischen System in Verbindung stehen (Crittenden und Graybiel, 2011).

1.2.2 Nervenzellen des Striatums

Bei der anatomischen Einteilung bilden Projektionsneurone und Interneurone die

hauptsächlichen Neuronenpopulationen des Striatums (Kreitzer, 2009) (Abb. 2).

1. Projektionsneurone: Mit 90-95% bilden GABAerge Projektionsneurone, die wegen der

dornenhaften Ausstülpungen ihrer Dendriten auch Medium spiny neurons (MSNs,

mittlere Zelldurchmesser 12-20 µm) genannt werden, die Mehrheit der striatalen

Neurone. Entsprechend ihrer axonalen Projektionen unterscheiden sich die MSNs

sowohl neurochemisch als auch in der Expression von DAergen Rezeptortypen.

- Striatonigrale Neurone verwenden die Neurotransmitter Substanz P und Dynorphin,

exprimieren D1- und muskarinerge M4-Rezeptoren. Sie projezieren zur SNr und GPi

(direkter Weg).

- Striatopallidale Neurone enthalten Enkephalin, exprimieren D2- und purinerge A2A-

Rezeptoren. Sie senden Efferenzen zum GPe (indirekter Weg) (Smith et al., 1998).

Beide Neuronentypen zeigen ähnliche Eigenschaften, unterscheiden sich jedoch in der

Art der Modulation durch ACh und DA (Shen und Surmeier, 2007).

Einleitung

23

MSNs gelten als Empfangsstation sämtlicher ins Striatum eintretender Afferenzen. So

erhalten sie neurochemische Informationen aus dem Cortex (erregende glutamaterge

Fasern aus dem motorischen, sensorischen und präfrontalen Assoziationscortices), dem

Thalamus, der Area tegmentalis ventralis (DAerge Afferenzen) und aus der SNc

(DAerge Neurone hemmen über D2-Rezeptoren den indirekten Weg und aktivieren über

D1-Rezeptoren den direkten Weg) (Joel und Weiner, 2000). Diese neurochemischen

Impulse entscheiden über die inhibitorisch GABAerge Wirkung der Projektionsneurone

des Striatums auf nachfolgende Elemente der Basalganglienschleife.

2. Interneurone: Diese machen nur 5-10 % der Neuronenpopulation aus und werden

weiter unterteilt.

- Mittelgroße GABAerge Zellen (physiologische Unterteilung: a. Parvalbumin+, b.

Somatostatin+, Neuropeptid Y+, and Nitrit Oxid Synthase+, und c. Calretinin+

Interneurone (Bennet und Bolam 1993; Cowan et al., 1990; Smith und Parent, 1986). Sie

unterscheiden sich in ihren neurophysiologischen Entladungsmustern (Kawaguchi et al.,

1995). Die TH+ Interneurone werden ihnen zugeordnet.

- Große cholinerge Zellen zeigen eine hohe Spontanentladungsrate (Wilson et al., 1990).

Interneurone erhalten auch glutamaterge Afferenzen aus dem Cortex und dem

Thalamus, sie enden an den dendritischen Ausstülpungen der MSNs (Boutons) und

anderen Interneuronen. Ihre Hauptaufgabe besteht in der Modulation der striatalen

Efferenzen (Tepper et al., 2004).

Diese Einteilungen zeigen die große Heterogenität innerhalb der Projektionsneurone und

der Interneurone im Striatum. Zusätzlich zu den unterschiedlichen physiologischen

Eigenschaften der Neuronenpopulationen exprimieren sie separate Rezeptoren für DA

und ACh.

1.2.3 Neurochemie des Striatums

In den Basalganglien haben die Neurotransmitter die Funktion, den cortikalen

Informationsfluss zu ermöglichen und den erforderlichen Bedingungen anzupassen.

Innerhalb des Striatums werden über eigenständige, aber trotzdem eng miteinander in

Verbindung stehende Transmittersysteme, die inhibitorischen oder exzitatorischen

Netzwerke koordiniert. Die wichtigsten, an der neurochemischen Kommunikation der

Neurone beteiligten Neurotransmitter sind DA, GABA, Glutamat und ACh.

Die räumliche Organisation der Synapsen an den Neuronen gibt Aufschluss über die

Funktionsweise und gegenseitige Beeinflussung der neuronalen Aktivität. So erhalten

beispielsweise die in 1.2.2 beschriebenen striatalen MSNs an den Köpfen ihrer

Einleitung

24

dornenhaften Ausstülpungen vor allem exzitatorische glutamaterge Afferenzen, während

an den Dornenhälsen eher DAerge Afferenzen ankommen. Dies führt zu der Annahme,

dass die glutamaterge Neurotransmission durch DA moduliert wird (Bolam et al., 1999).

Die enge Interaktion der Transmittersysteme zeigt sich auch durch das Vorkommen von

Glutamat-Rezeptoren an DAergen Synapsenendigungen und DA-Rezeptoren an der

glutamatergen Präsynapse. Beide Rezeptorarten wurden darüber hinaus auch auf

GABAergen Projektioneuronen im Striatum nachgewiesen (Tarazi und Baldessarini,

1999).

1.2.3.1 Das dopaminerge (DAerge) System im Striatum

Den Ursprung der dichten DAergen Innervation des Striatums bilden größtenteils die

DAergen Neurone der SNc (projezieren ins DS) und der VTA (projezieren ins VS). Hier

sei die DA-Synthese anhand der mesostriatalen Neurone beschrieben. Die Synthese

erfolgt präsynaptisch an den DAergen Terminalen. Die Aminosäure L-Tyrosin, aus

Phenylalanin synthetisiert oder extrazellulär aufgenommen, wird durch das Enzym

Tyrosinhydroxylase (TH) hydroxyliert. Es entsteht L-DOPA (3,4-Dihydroxyphenylalanin),

das im nächsten Schritt durch das Enzym aromatische Aminosäure-Decarboxylase

(AADC) decarboxyliert und dadurch zu DA umgewandelt wird. DA wird als aktiver

Neurotransmitter über den vesikulären Monoamin-Transporter 2 (VMAT-2) in

präsynaptische Vesikel verpackt oder lokalisiert sich als extravesikuläres DA im

zytoplasmatischem Kompartiment. Bei physiologischer Stimulation wird DA als

neurochemischer Modulator in den synaptischen Spalt ausgeschüttet. Dort erreichen die

DA-Moleküle durch Diffusion die postsynaptische Membran striataler

Empfängerneurone, deren Rezeptorart über die hemmende (D2-Rezeptor) oder

exzitatorische (D1-Rezeptor) Wirkung entscheidet. Hauptprojektionsziele der DAergen

Neurone der SNc bilden die MSNs im Striatum. Die MSNs haben die Funktion, die

cortikalen Informationen über zwei Signalwege zu den Ausgangskernen der

Basalganglien zu leiten.

Wie in 1.2.2 beschrieben ist die Expression von D1- und D2-Rezeptoren auf jeweils

einen MSN-Typen beschränkt. Daraus resultiert die unterschiedliche Wirkung von DA

auf GABAerge Neurone des Striatums, deren Erregung oder Hemmung die Modulation

der direkten (striatonigralen) und indirekten (striatopallidalen) Funktionsschleife

ermöglicht. Die synaptische Erregung wird durch die Wiederaufnahme von DA-

Molekülen über den membranständigen DA-Transporter (DAT) in die präsynaptische

Zellendigung oder deren Abbau zu Homovanillinsäure durch die Enzyme

Monoaminoxidase (MAO) und Katechol-O-Methyl-Transferase (COMT) beendet.

Einleitung

25

Überdies ist auch eine neurotoxische Wirkung von DA bekannt. Die leichte Autooxidation

von extravesikulärem zytoplasmatischem DA führt zur Bildung freier Radikaler und somit

zu oxidativem Stress (Stokes et al., 1999). Freie Radikale zerstören

Zellwandbestandteile von Mitochondrien und können zum Zelltod führen (Halliwell,

1992).

TH AADC L-Tyrosin L-Dihydroxyphenylalanin Dopamin (L-DOPA)

Abb. 1.3: DA-Biosynthese.

Die Enzyme TH und AADC werden für eine vollständige DA-Synthese benötigt. DOPAerge Neurone

exprimieren nur die TH.

Abkürzungen: TH: Tyrosinhydroxylase; AADC: aromatische Aminosäure-Decarboxylase.

1.2.3.2 Striatale TH+ Neurone

TH ist als erstes und geschwindigkeitsbestimmendes Enzym an der Synthese von

Katecholaminen beteiligt. Es katalysiert unter Verwendung des Cofaktors

Tetrahydrobiopterin und molekularem Sauerstoff die Hydroxylierung der Aminosäure L-

Tyrosin in die Aminosäure L-DOPA, aus dem entsprechend der enzymatischen

Ausrüstung die Neurotransmitter DA, Adrenalin und Noradrenalin gebildet werden

können. Das Enzym TH ist in den Zellkörpern und Axontermini von catecholaminergen

Neuronen zytoplasmatisch lokalisiert.

Neben den nigrostriatalen DAergen Neuronen, die TH und AADC exprimieren, führten

grundlegende Entdeckungen in den letzten Jahren zu einer neuen Einteilung der TH+

Neurone im Striatum. In den Striata von nicht-humanen Primaten (Dubach et. al, 1987;

Tandé et al., 2006) und Menschen (Cossette et al., 2005; Huot et al., 2007) wurden TH+,

aber AADC-negative (AADC-) oder -anteilig -positive Neurone nachgewiesen. Sie

wurden als DOPAerge, TH+ Neurone beschrieben, die zusätzlich im Nucleus

accumbens und im Cortex lokalisiert sind. Sie scheinen kein VMAT-2 zu exprimieren

(Weihe et al., 2006; Ugrumov, 2013; Depboylu, 2014). Die genaue Funktion dieser

monoenzymatischen, TH+ Zellen (Weihe et al., 2006) ist unbekannt. In Tiermodellen der

Parkinson-Krankheit konnte eine reaktive Zellzahlzunahme dieser TH-Neurone im DAerg

Einleitung

26

denervierten Striatum gezeigt werden (Tashiro et al., 1989; Meredith et al., 1999; Tandé

et al., 2006; Depboylu, 2014). Demzufolge besteht die Annahme, dass diese Neurone

eine potentielle L-DOPA/DA-Quelle darstellen könnten (Ugrumov, 2013). Wegen ihrer

enzymatischen Ausstattung wäre eine kompensierende DA-Synthese mithilfe von

benachbarten AADC+ Nervenfasern (serotoninerg) oder AADC exprimierenden Zellen

denkbar (Kerber et al., 2015). Neben einer Verbesserung der durch einen DA-Mangel

bestehenden Symptomatik bei neuropathologischen Krankheitsbildern besteht auch die

Gefahr, dass Kompensationsmechanismen im DAergen System zu erhöhten, lokal

unkontrollierten DA-Konzentrationen führen, die in Abwesenheit von vesikulären

Speichermechanismen die neurotoxische Wirkung von DA verstärken.

1.2.3.3 Das glutamaterge System im Striatum

Im Säugetiergehirn ist die Aminosäure L-Glutamat der wichtigste exzitatorische

Neurotransmitter. Ca. 80-90% aller cerebraler Neurone sind glutamaterg (Cotman et al.,

1981). Glutamat kann aus α-Ketoglutarat und Aspartat durch die Aspartat-

Aminotransferase, aus Glutamin durch eine Glutaminase und aus α-Ketoglutarat durch

die Ornithin-Aminotransferase synthetisiert werden. Wichtige glutamaterge Neurone des

Gehirns sind die cortikalen Pyramidenzellen, die unter anderem den Ursprung des

Tractus corticostriatalis bilden. Die Glutamat-Freisetzung im Striatum findet in den

Axonterminalen von thalamischen und subthalamischen Projektionsneuronen statt.

Ferner kommt der Botenstoff Glutamat auch in Gliazellen vor (Fonnum, 1984). Glutamat

wird präsynaptisch mittels verschiedenen vesikulären Glutamat-Transporter (VGLUT) in

Vesikel verpackt. Glutamat bewirkt über verschiedene Rezeptorarten (v.a. inotrope

NMDA- und metabotrope Rezeptoren), die heterogen in allen Zellgruppen in den

Basalganglien vorzufinden sind (Greenamyre, 2001), eine postsynaptische

Depolarisation. Die neurochemische Exzitation wird durch Wegdiffusion von Glutamat

aus dem synaptischen Spalt limitiert. Hierfür wird über zellmembrangebundene

Glutamat-Transporter (EAATS, Excitatory Amino Acid Transporters) ein

Diffusionsgradient aufgebaut, der für eine aktive Glutamat-Aufnahme aus dem

synaptischen Spalt verantwortlich ist. EAATs kommen größtenteils auf Astrozyten vor,

die eine Vielzahl des Glutamats im Rahmen des Glutaminzyklus (hier Austausch von

Glutamin zwischen Astrozyten und Neuronen) aufnehmen (Danbolt, 2000; O´Shea,

2002).

Trotz der astrozytären Kontrolle der Glutamat-Spiegel im extrazellulärem Raum bewirkt

der Botenstoff auch an benachbarten Synapsen eine zusätzliche Modulation der

Einleitung

27

GABAergen, glutamatergen und monoaminergen Neurotransmission (Sem´yanov, 2005;

Hassel und Dingledine, 2006; Drew et al., 2008).

Neben seiner Funktion als exzitatorischer Neurotransmitter hat Glutamat auch

neurotoxische Wirkungen und wird daher auch als "Exzitotoxin" bezeichnet (Onley,

1990). Eine übermäßige Stimulation von NMDA-Rezeptoren führt zu einen erhöhtem

Ca2+-Einstrom in die Nervenzellen und führt zu einer unkontrollierten Aktivierung Ca2+-

abhängiger zytoplasmatischer Enzyme und somit zu einer direkten oder indirekten

Schädigung v.a. von postsynaptischen Nervenzellmembranen (Beal, 1992; Rothman

und Onley, 1995). Darüberhinaus ist bekannt, dass sie apoptotische und nekrotische

Prozesse induzieren können (Lau und Tymiansky, 2010). Eine erhöhte Glutamat-

Freisetzung und Aktivierung von NMDA-Rezeptoren wurden bei einer Reihe von akut

oder chronisch verlaufenden neurologischen Krankheiten (z.B. akute ischämische

Insulte, Epilepsie, Chorea Huntington, Morbus Alzheimer, Amyotrophe Lateralsklerose,

Morbus Parkinson) nachgewiesen.

1.2.3.4 Das GABAerge System im Striatum

Das biogene Amin γ-Aminobuttersäure (GABA) ist der wichtigste inhibitorische

Neurotransmitter im ZNS. Es entsteht aus Glutamat mittels der Glutamat-Decarboxylase

(GAD). GABA wirkt über GABAA- (membranöser Chloridionenkanal) und GABAB-

(metabotrope Rezeptoren, die prä- und postsynaptisch inhibierend wirken) Rezeptoren

(De Feudis, 1977; Kerr und Ong, 1995; Barnard et al., 1998). Über 90% der striatalen

MSNs sind GABAerge Neurone, die den Ursprung der striatonigralen und

striatopallidalen Bahnen bilden. Daneben bilden striatale GABAerge Neurone

synaptische Kontakte zu den MSNs und zu anderen benachbarten Interneuronen

(Jeahae et al., 2015). Diese GABAergen Verbindungen limitieren und modulieren die

cortikale Erregung der MSNs. Je nach Zelltyp kann die inhibitorische Wirkung von GABA

im Striatum sowohl zu einer exzitatorischen Antwort führen (Hemmung von GABAerger

MSNs) als auch einen inhibitorischen Effekt haben (Unterdrückung der Glutamat-

Ausschüttung corticostriataler Neurone). Die Interneurone selbst werden von

pallidostriatalen Neuronen beeinflusst. Extrazelluläres GABA wird in Gliazellen oder in

die Präsynapse aufgenommen.

1.2.3.5 Das cholinerge System im Striatum

Auch der Neurotransmitter ACh spielt eine wichtige Rolle bei der Basalganglienfunkion.

Das Enzym Cholinacetyl-Transferase (ChAT) katalysiert die Synthese von ACh, indem

Einleitung

28

es die Acetylgruppe aus Acetyl-CoA auf Cholin überträgt (Fonum und Sorenssen, 1972).

Durch sein ubiquitäres Vorkommen in cholinergen Neuronen, eignet sich ChAT zu deren

Detektion und Visualisierung. Quantifizierte ChAT-Reduktionen gelten als Indiz für eine

cholinerge Dysfunktion (Mesulam et al., 1984).

Mittels des vesikulären ACh-Transporters (VAChT) wird ACh in neurosekretorische

Speichervesikel verpackt. Nach seiner Freisetzung in den synaptischen Spalt bindet

ACh im Striatum an nikotinerge (ligandengesteuerte Ionenkanäle, nAchR) oder an

muskarinerge Rezeptoren (metabotrope Membranproteine, mAChR) (Zhou et al., 2002;

Changeux, 2010). Das Enzym AChE spaltet ACh in seine Bestandteile Cholin und

Acetat. Obwohl cholinerge Neurone nur 1-3% der Neurone im Striatum darstellen, bilden

sie eine der am stärksten mit ACh ausgestatteten Region im Gehirn (Graybiel, 1990;

Mesulam et al. 1992; Contant et al., 1996). Die cholinergen striatalen Interneurone

werden aufgrund ihrer autonomen, kontinuierlich-langsamen Aktivität als tonisch-aktive

Neurone (TAN: Tonically Active Neurons) bezeichnet (Benett und Wilson, 1999; Apicella,

2007). Sie treten in Kontakt mit DAergen Neuronen der SNc und der VTA (Zhou et al.,

2002). Die cholinergen striatalen Interneurone werden in ihrer Entladungsrate über viele

Mechanismen reguliert, die das komplexe Zusammenspiel der neurochemischen

Modulation im Striatum verdeutlichen. So findet cholinerge Transmissionskontrolle über

einen konzentrationsmindernden, hohen AChE-Gehalt im Striatum und über eine

negative Rückkopplung durch muskarinerge M4-Rezeptoren (Ding et al., 2006) statt.

Auch DA wirkt über zusätzlich an den Interneuronen vorhandenen D2- (vermindern die

synaptische Entladungsrate) und D5-Rezeptoren (an somatodendritischen Synapsen,

erhöhen die Entladungsrate) modulatorisch auf die tonische ACh-Aktivität (Yan et al.,

1997; Pisani et al., 2000). Darüberhinaus werden cholinerge Interneurone aus

thalamischen und cortikalen Strukturen über inotrope Glutamat-Rezeptoren und

GABAerge-Rezeptoren reguliert (Calabresi et al., 2000). Funktionsstörungen im

striatalen cholinergen System spielen eine Rolle bei Erkrankungen wie Morbus

Alzheimer, Morbus Parkinson oder Chorea Huntington.

1.2.3.6 Auswirkungen einer HIV-Infektion auf das DOPAerge/DAerge und cholinerge System im Striatum

Im ZNS verursacht eine HIV-Infektion direkt durch die Toxizität seiner viralen Proteine

und indirekt durch die Aktivierung von Makrophagen, Mikroglia und Astrozyten neuronale

Schäden und Dysfunktionen. Wenngleich keine Region im Gehirn von einer HIV-

Infektion verschont bleibt, sind die Basalganglien ein wesentlicher Ort für die

Virusreplikation und HIV-assoziierte Neuropathologie (Kumar et al., 2009). Menschen

Einleitung

29

mit HIV/AIDS haben eine Vielzahl von neurologischen Problemen, von denen einige auf

eine abnormale, DAerge Transmission zurückgeführt wurden. Dazu zählen die

subcortikale Demenz, Parkinson-Symptome und Psychosen. Eine Vielzahl von

Publikationen weisen auf eine durch die HIV-Infektion ausgelöste nigrostriatale

Dysfunktion hin. Klinische Manifestationen äußern sich bei untersuchten Patienten und

im Tiermodell in Form von kognitiven und motorischen Defiziten (Berger und Arendt,

2000; Koutsilierie et al., 2002). In allen untersuchten Hirnarealen wurden bei Patienten

mit HAD erniedrigte DA-Konzentrationen gemessen (Sarder et al., 1996). Besonders war

dies im Putamen, dem Caudatus, dem Globus pallidus und der Substantia nigra der Fall.

Untersuchungen an humanen Postmortem-Hirngewebe geben Hinweise, dass die

cerebrale Reduktion der DA-Konzentration mit einer Degeneration der DAergen Neurone

in der Substantia nigra korreliert (Reyes et al., 1991; Ioth et al., 2000). Dies erlaubt die

Annahme, dass der DA-Gehalt in verschiedenen Hirnarealen durch die DA-Produktion in

der Substantia nigra reguliert wird (Kumar et al., 2009). Darüber hinaus fanden sich bei

SIV-infizierten Rhesus Makaken bereits im asymptomatischen Frühstadium erniedrigte

DA-Konzentrationen in den Basalganglien (Scheller et al., 2005). Im Rattenmodell der

HIV-Infektion konnte gezeigt werden, dass Parkinson-ähnliche Symptome durch das

bereits in der frühen Phase der Infektion die BHS passierende HIV-Oberflächenprotein

tat verursacht werden können. Das tat-Protein blockiert dabei selektiv die

Genexpression der TH in den DAergen Neuronen des Mittelhirns der Ratte (Zauli et al.,

2000). Eine Reduktion der TH-Faserdichte wurde im Hirngewebe von Patienten mit

HIVE nachgewiesen (Gelman et al., 2006). Mittels moderner funktioneller Bildgebung

konnte bei Therapie-naiven HIV-Patienten bereits in der asymptomatischen Phase ihrer

Erkrankung erhöhte DA-Konzentrationen im Striatum nachgewiesen werden. Jedoch

zeigten sich keine adaptiven Anpassungen der DA-Transporter und DA-Rezeptoren. Die

dadurch resultierende Verstärkung der neurotoxischen Wirkung von DA wurde als ein

möglicher Grund für die im Laufe einer HIV-Infektion bekannten fortschreitenden Störung

des DA-Systems im Striatum gesehen (Scheller et al., 2010).

HIV-induzierte Störungen des cholinergen Systems werden mit kognitiven Dysfunktionen

in Verbindung gebracht. ChAT fungiert als biochemischer Marker kognitiver Funktionen

(Sakurada et al., 1990). Eine dramatische Reduktion der ChAT-Dichte wurde bereits im

Frühstadium der Infektion im Putamen SIV-infizierter Rhesus Affen (Koutsilierie et al.,

2000) gezeigt. Die neurochemische Bedeutung von Veränderungen des cholinergen

Systems im Striatum bei einer HIV-Infektion sind von Bedeutung bei der HAD, HIVE und

HIV-induzierten motorischen Störungen. Eine Reduktion der corticalen und

hippocampalen cholinergen Innervation wurde für die SIVE beschrieben (Depboylu et

al., 2011).

Einleitung

30

1.3 Vesikuläre Speicherung von Neurotransmittern

Die vesikuläre Speicherung und darauf folgende Freisetzung von Neurotransmittern

spielt eine zentrale Rolle bei der neurochemischen Signalvermittlung. Vorteile dieser

vesikulären Speicherung sind deren Schutz vor enzymatischem Abbau und die

ausreichende Ausstattung der Neurone mit Botenstoffen bei gesteigerter Aktivität.

Darüber hinaus haben vesikuläre Speicher die Funktion, Nervenzellen vor eventuellen

toxischen Wirkungen direkt durch die Neurotransmitter zu schützen, wie es für DA

bekannt ist (Nickell et al., 2014). Synaptische Vesikel (SV) haben einen Durchmesser

von 40-80 nm. Ihre Membran besteht aus einer Lipiddoppelschicht, die

Membranproteine mit unterschiedlichen Funktionen enthalten. Die Mehrzahl bilden die

für die Exozytose essentiellen Proteine, während Transporterproteine mit nur etwa 10-

15% vertreten sind. Vesikuläre Transporterproteine transportieren die Neurotransmitter

über die vesikuläre Membran ins Lumen der Vesikel. Sie kontrollieren nicht nur die

Qualität und Quantität des Vesikelinhalts, sondern sind auch an der dynamischen

Regulation der Neurotransmission beteiligt (Eiden, 2000). Jeder Vesikel ist nur mit ein

bis zwei Energie (ATP)-verbrauchenden vesikulären ATPasen (v-ATPase) ausgestattet,

die den für den aktiven Transport der Neurotransmitter in die Vesikel erforderlichen

Protonengradienten aufbauen. Folglich ist die Ausstattung der SV mit vesikulären

Transporterproteinen und ATPasen maßgeblich für die Regulation der Speicherung von

Neurotransmittern (Takamori et al., 2006; Fei et al., 2008).

SV lassen sich in zwei Klassen einteilen: Die "dense core"/"large dense core" Vesikel

(LDCVs, große elektronendichte Vesikel, entstammen dem trans-Golgi Netzwerk im

Zellsoma, speichern Peptide und Hormone, sind 70-300 nm in Durchmesser) und die

"small synaptic vesicles" (SSVs, entstammen aus Kompartimenten der endosomalen

Synapsenendigung, speichern niedermolekulare Neurotransmitter, sind 40 nm in

Durchmesser, in neuroendokrinen Zellen werden deren Analoga als "small synaptic like

vesicles" bezeichnet). Neuronale SSVs speichern ACh, Glutamat, GABA und Glycin

(Südhof und Jahn, 1991; Edwards, 1992). VMAT-2 als Transporterprotein für

monoaminerge Transmitter ist im Striatum größtenteils in SSVs lokalisiert (Nirenberg et

al., 1997; Fei et al., 2008).

Die klassischen Neurotransmitter werden unabhängig vom Vesikeltyp über verschiedene

Transporterproteine in Vesikel verpackt. Als spezifische Transporterproteine gelten für

Glutamat die VGLUTs (vesikuläre Glutamat-Transporter), für ACh der VAChT

(vesikulärer ACh-Transporter), für Monoamine die VMATs (vesikuläre Monoamin-

Transporter) und für GABA der VGAT (vesikulärer GABA-Transporter).

Einleitung

31

1.3.1 Ausgewählte vesikuläre Transporterproteine

In dieser Arbeit wurde der Einfluss der SIV-Infektion und deren antiretrovirale

Behandlung auf vesikuläre Transmittersysteme im Striatum auf histomorphologischer

Ebene untersucht. Dysfunktionen in der vesikulären Speicherung von Neurotransmittern

werden mit der Neuropathogenese von einer Reihe von Erkrankungen in

Zusammenhang gebracht. Die biochemischen Mechanismen, die während einer HIV-

/AIDS-Erkrankung zu einer Dysfunktion der DAergen Neurotransmission führen, sind

nicht gänzlich verstanden (Berger und Arendt, 2000; Koutsilieri et al., 2001; Wang et al.,

2004; Kumar et al., 2009; Shapshak et al., 2011). Obwohl die vesikuläre Speicherung

von Neurotransmittern eine neuroprotektive Funktion innehält, ist sie in der HIV-

Neuropathogenese kaum erforscht.

In Anbetracht der Tatsache, dass sie bei der Pathogenese von Neuro-AIDS/HIV kaum

erforscht sind, werden hier zusätzlich Arbeiten vorgestellt, die die Bedeutung einer

Transporterproteindysfunktion verdeutlichen.

1.3.2 Der vesikuläre Monoamin-Transporter 2 (VMAT-2)

Dem Genlocus entsprechend werden die VMATs zusammen mit dem ihnen genetisch

verwandtem VAChT der SLC-18-Transporterproteinfamilie zugeordnet. Zu den

monoaminergen Neurotransmittern gehören catecholaminerge und serotonerge

Botenstoffe. Im Säugerorganismus existieren zwei Isoformen von vesikulären

Monoamin-Transportern, VMAT-1 (SLC-18A1) und VMAT-2 (SLC-18A2) (Eiden und

Weihe et al., 2004). Phylogenetische Untersuchungen teilen die VMATs einer größeren

Familie von Transporterproteinen, den TEXANs (Toxic-extruding-antiporter-system), zu

(Schuldinger et al., 1995). In diesem Modell bedienen sich die strukturell sehr ähnlichen

Transporterproteine von Prokaryonten und Eukaryonten an demselben

protonengesteuertem Antiportersystem (Abb. 1.4), das bei Prokaryonten allerdings die

Funktion der Toxinausschleusung aus der Bakterienmembran hat und auch mit der

Entwicklung von Antibiotikaresistenzen in Verbindung gebracht wird (Schuldinger et al.,

1995). VMAT-1 und VMAT-2 besitzen eine 78%ige Homologie ihrer

Aminosäuresequenzen. Die größte Divergenz existiert in ihrer luminalen Schleife, die bei

VMAT-2 einen größeren Glykolisierungsgrad aufweist (Erickson et al., 1996). Sowohl

VMAT-1 als auch VMAT-2 akzeptieren Monoamine als physiologische Substrate (Peter

et al., 1994). Adulte humane und rodente Gehirne exprimieren ausschließlich VMAT-2

(Schäfer et al., 2013). Im ZNS findet sich VMAT-2 in allen DAergen, adrenergen,

noradrenergen, serotonergen und histaminergen Zellgruppen. Die DAergen Zellgruppen

in der SNc sowie in der VTA zeigen eine besonders starke Expression von VMAT-2.

Einleitung

32

VMAT-1 hat eine ähnliche Struktur und Funktion, erkennt aber Histamin nicht als

Substrat und fehlt im ZNS.

Grundlegende Forschungsarbeiten der letzten Jahre erbrachten neue Erkenntnisse über

die Aktivität und Bedeutung von VMAT-2. VMAT-2+ Nervenendigungen im Gehirn

können mithilfe von 11C-DHTBZ (Dihydrotetrabenazin, PET-Ligand) visualisiert werden.

Solche PET-Untersuchungen an Patienten mit Morbus Parkinson, Chorea Huntington

oder Schizophrenie und auch an Gehirnen von gesunden Probanden zeigen eine

dynamische Regulierung der an der Katecholaminsyntese beteiligten Enzyme des

Gehirns. VMAT-2 hingegen erwies sich als ein Protein mit einer statischen Position. Die

Menge von VMAT-2 kann demnach mit der Anzahl der vorhandenen monoaminergen

Nervenendigungen in bestimmten Gehirnregionen gleichgesetzt werden (Frey et al.,

1996; Suzuki et al., 2001; Zubieta et al., 2000,2001; Bohnen et al., 2006). Arbeiten, die

für die VMAT-2-Visualisierung TBZ (Tetrabenazin) als Liganden verwendeten, zeigten

eine Reduktion der VMAT-2+ Dichte bei fortgeschrittener Parkinson-Krankheit (Brown et

al., 2001). TBZ inhibiert VMAT-2 ähnlich stark wie Reserpin, hat aber den Vorteil, dass

es keine Affinität für VMAT-1 besitzt. Der Nachteil von TBZ besteht darin, dass es im

Vergleich mit Katecholaminen eine höhere Affinität für VMAT-2 aufweist, und dass die

Katecholaminkonzentration auch durch eine direkte Interaktion mit TBZ verändert wird.

Dies führt dazu, dass nur unspezifische Aussagen über die VMAT-2-Funktion getroffen

werden können (Killborn et al., 2010).

Entsprechend seiner phylogenetischen Abstammung vermittelt VMAT-2 eine

neuroprotektive Funktion, indem es endogene und exogene Toxine durch vesikuläre

Aufnahme abpuffern kann. Abgesehen von DA, können auch Toxine wie MPTP (1-

Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6 Tetrahydropyridin) und Methamphetamin über VMAT-2 in

Vesikel verpackt werden (Guillot et al., 2009). Die Bedeutung einer Detoxifizierung durch

VMAT-2 konnte im Mäusemodell unterstrichen werden. Eine genetische Reduktion der

VMAT-2 Expression zeigte bei zusätzlicher MPTP-Behandlung eine größere Schädigung

der DAergen Nerventerminalen im Striatum (Takahashi et al., 1997; Gainetdinov et al.,

1998). Ein Defekt von VMAT-2, der zu einem Verlust DAerger Fasern im Striatum von

Menschen und Primaten führt, wird als möglicher früher Mechanismus bei der

Entstehung des Parkinson-Krankheit diskutiert (Pifl et al., 2014).

Einleitung

33

A VMAT-2 B DAerger Metabolismus

Abb. 1.4: Illustrationen von VMAT-2 und dem DAergen Metabolismus.

A: Darstellung des VMAT-2-Protonenantiportersystems, der die vesikuläre Aufnahme von Monoaminen ermöglicht, nach

Eiden und Weihe (2011).

B: DAerger Metabolismus und Entstehung von DAergen Radikalen, die oxidativen Stress verursachen, nach

biomedsearch.com.

1.3.3 Der vesikuläre ACh-Transporter (VAChT)

Der VAChT (SLC18-A3) ist genetisch mit den VMATs verwandt und transferiert ACh in

die SVs. Hierbei werden zwei Protonen aus dem Vesikellumen gegen ein zytosolisches

ACh-Molekül ausgetauscht (Schuldinger et al., 1995). Sein Vorkommen ist auf die SSVs

des zentralcholinergen und peripheren Nervensystems, das motorische, kognitive und

vegetative Prozesse vermittelt, beschränkt (Gilmore et al., 1996; Weihe et al., 1996).

VAChT und die für die ACh-Synthese essentielle ChAT werden als Marker für cholinerge

Neurone und deren Fortsätze verwendet (Schäfer und Weihe, 1994, 1998).

Außergewöhnlich ist die Kolokalisation von dem humanen VAChT-Gen mit dem ChAT-

Gen auf Chromosom 10q11.2. Genauer gesagt ist die VAChT-kodierende Sequenz

innerhalb des ChAT-Genlokus enthalten. Dementsprechend werden in cholinergen

Neuronen beide Gene vom sogenannten "Cholinergen Genlokus" gesteuert. Diese

präzise Koregulation ermöglicht die Aufrechterhaltung der cholinergen Funktion

(Erickson et al., 1994; Weihe et al., 1998). In vitro Analysen deuten darauf, dass VAChT

ein sehr langsamer Transporter ist (Varoqui und Erickson, 1996), der auch das

Recycling von synaptischen Vesikeln aus der präsynaptischen Membran limitiert. VAChT

soll zudem die Ausschüttungrate von ACh regulieren (Song et al., 1997; Prado et al.,

Einleitung

34

2006; Lima et al., 2010). Tatsächlich konnten auch pharmakologische Experimente, die

das für eine VAChT-Inhibition spezifische tertiäre Amin Vesamicol benutzen, auch die

Bedeutung von VAChT für die Regulation der zentralen cholinergen Transmission

aufzeigen. Zusätzlich wurden viele Anstrengungen unternommen, um Vesamicol-

Analoga für die Visualisierung von cholinergen Neuronen per funktionelle

Nuklearbildgebung (PET, SPECT) möglich zu machen. Cholinerge Neurone im Striatum

spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Motorik und des Belohnungssystems.

Die überraschende Entdeckung, dass sie - zumindest in der Maus - neben VAChT auch

VGLUT-3 exprimieren (Schäfer et al., 2002; Boulland et al., 2004) führte zu der Frage,

inwieweit dieser auch die ACh-Speicherung in SVs mit beeinflusst. Eine selektive

VAChT-Blockierung führte, im Gegensatz zu dem erwarteten cholinergen Defizit im

Striatum, vielmehr zu einer, wie bei einer Hochregulierung von DA-Rezeptoren

bekannten, Verstärkung der Sensitivität striataler MSNs gegenüber DA und DA-

Agonisten (Guzman et al., 2011). Diese Konstellation bietet eine neue Therapieoption

mit VAChT als ein möglicher Angriffspunkt in der Behandlung der Parkinson-Krankheit,

die durch ein DA-Defizit und eine verstärkte cholinerge Aktivität striatal gekennzeichnet

ist.

1.3.4 Der vesikuläre Glutamat-Transporter 1 (VGLUT-1)

Die Aufnahme von Glutamat in sekretorische Vesikel wird auch durch einen von der v-

ATPase angetriebenen Austausch mit Protonen durch VGLUTs gewährleistet. Die

VGLUTs gehören zu der SLC17-Transporterproteinfamilie, in der drei Formen (VGLUT-1

bis -3) beschrieben werden. VGLUT-1 und VGLUT-2 werden in unterschiedlichen

glutamatergen Neuronen des ZNS exprimiert. Ihre Verteilung ist komplementär. VGLUT-

3 hingegen ist in verschiedenen cholinergen und monoaminergen Zelltypen mit VAChT

und VMAT-2 kolokalisiert (Schäfer et al., 2002; Reimer und Edwards, 2004; Fei et al.,

2008). Das spricht für die zusätzliche Rolle von Glutamat als Kotransmitter. Alle drei

Formen sind spezifisch für ihr Substrat Glutamat. Es werden keine anderen

Aminosäuren ins Vesikellumen transportiert (Maycox et al., 1990).

Plasmamembrantransporter (EAATs) haben begründet in der zytotoxischen Wirkung von

extrazellulärem Glutamat eine stärkere Affinität für Glutamat als die vesikulären

VGLUTs. Eine hohe zytoplasmatische Konzentration an Glutamat (ca. 100 mM) sorgt für

eine ausreichende Sättigung der VGLUTs (Danbolt, 2001). Auf einem Vesikel befinden

sich ca. 10 Kopien der VGLUTs (Takamori et al., 2006), wobei für die Füllung der

Vesikel eine mRNA-Kopie ausreichend ist (Daniels et al., 2006). Ob der VGLUT-

Überschuss in der Vesikelmembran ein Sicherheitssystem für die Erhaltung der SVs

Einleitung

35

darstellt oder gar das Recyclen von SVs verlangsamt und damit eine limitierende Rolle

hat, ist unklar. Im adulten Gehirn ist VGLUT-1 das am häufigsten synthetisierte

Transporterprotein für Neurotransmitter. VGLUT-1 gilt als Marker glutamaterger

cortikaler Nervenendigungen (Fujiyama et al., 2004). Auch zeigt sich eine starke

Immunreaktivität für VGLUT-1 im Striatum (Hisano, 2003; Schäfer et al., 2013). Für die

essentielle Bedeutung der glutamatergen Neurotransmission spricht, dass VGLUT-1-

Deletionsmutanten starke neurologische Beeinträchtigungen haben und bedingt

lebensfähig sind. Passend zu dem ubiquitärem Vorkommen der VGLUTs im ZNS und

deren Aufgabe, die Glutamat-Neurotransmission zu regulieren, gibt es Beweise für

Veränderungen der VGLUT-Expression bei diversen neurologischen Erkrankungen.

1.3.5 Der vesikuläre GABA-Transporter (VGAT)

Im Gehirn dominiert GABA als inhibitorischer Botenstoff, während im Rückenmark und

im Hirnstamm neben GABA auch Glycin vorkommt. Für die vesikuläre Speicherung von

beiden Neurotransmittern in SSVs ist bis heute nur ein Transporterprotein, der

vesikuläre GABA-Transporter (VGAT), der auch als Transporter für inhibitorische

Aminosäuren (VIAAT) bezeichnet wird, bekannt (Chaudhry et al., 1998; Eiden et al.,

2004). VGAT gilt als Marker für inhibitorische Nervenendigungen. Seinem Genlokus

entsprechend ist er der einzige Vertreter der SLC32-Transporterproteinfamilie. Diese

gehört zusammen mit den SLC36- und SLC38-Proteinfamilien zu der für Säugetiere

spezifischen Superfamilie der protonengesteuerten Aminosäuretransporter. Die

Zuteilung verdeutlicht die evolutionäre Distanz von VGAT zu SLC17- (VGLUT-1 bis -3)

und SLC18-Transportproteinfamilien (VMAT-1 und -2, VAChT), die im Gegensatz zu

VGAT Homologien mit bakteriellen Transporterproteinen aufweisen (Gasnier, 2004).

Topologieananlysen verdeutlichen, dass die VGAT-Transmembrandomänen sich in

ihrem Aufbau von anderen v-ATPasen unterscheiden. Die bei VGAT gefundene

ungerade Anzahl an Transmembranproteinen lässt eine enge Verwandtschaft zu den in

Pflanzen vorkommenden Aminosäurepermeasen vermuten (Wipf et al., 2002).

Desweiteren weist der C-Terminus von VGAT im Gegensatz zu anderen v-ATPasen in

das Vesikellumen (Martens et al., 2008). Das spricht dafür, dass VGAT durch andere

Mechanismen reguliert wird.

Der Transportmechanismus für die vesikuläre Speicherung durch VGAT konnte in

neueren Arbeiten gezeigt werden. Es stellte sich heraus, dass VGAT ein vesikulärer

Chlorid- und GABA/Glycin-Kotransporter ist, der von einem positiven, intraluminalem

Membranpotential (im Gegensatz zu den protonengetriebenen Transporterproteinen, die

einen pH-abhängigen Gradienten aufbauen) angetrieben wird (Juge et al., 2009). Zudem

Einleitung

36

bestehen Hinweise, dass VGAT zusätzlich die über GABA-Rezeptoren auch inhibitorisch

wirkende Aminosäure β-Alanin, mit demselben Mechanismus für die vesikuläre

Aufnahme von GABA und Glycin, aufnehmen kann (Juge et al., 2013).

Auch bei VGAT ist es durch sein ubiquitäres Vorkommen im ZNS und seiner Rolle in der

inhibitorischen Neurotransmission offensichtlich, dass dessen Defekte/Funktionsverluste

zu schweren neurologischen Ausfällen führen können. Ein Verlust von VGAT bei

Knockout-Mäusen führte zu einer Sterblichkeit in frühen Embryonalstadien, zur Bildung

von Omphalozelen, gekrümmten Körperhaltungen und zu einer Gaumenspalte (Saito et

al., 2010). Es existieren kaum Forschungsarbeiten über mögliche Auswirkungen von

inflammatorischen Prozessen/Infektionen auf die VGAT-Funktionalität.

Zielsetzung und Fragestellung

37

2 Zielsetzung und Fragestellung

Das zentrale Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen einer lentiviralen Infektion und

deren antiretrovirale Behandlung auf Prozesse der vesikulären Neurotransmission im

Striatum des Rhesus Affen am SIV-Modell zu untersuchen. Die Annahme, dass eine

mögliche Dysfunktion in der vesikulären Speicherung von Neurotransmittern die

Neuropathogenese von HIV/AIDS zusätzlich verursacht/begründet oder auch bei einer

inadäquaten Therapie zu deren Progression beiträgt, soll durch immunhistochemische

Analysen untersucht werden. Hierzu wurden im SIV-Modell der HIV-Infektion die

synaptische Faserdichte von vesikulären Neurotransmitterproteinen, die Anzahl der

cholinergen und DOPAergen/DAergen Neurone und das Ausmaß der

Neuroinflammation im Striatum quantifiziert. Reversible und irreversible Veränderungen

wurden durch den Einsatz einer ZNS-permeablen antiretroviralen Therapie aufgedeckt.

Dabei wurden im Speziellen folgende Fragen untersucht:

- Wie stellt sich das Neuroinflammationsgeschehen (mikrogliale und astrozytäre

Zellreaktionen) im Striatum bei einer lentiviralen Infektion dar?

- Wie wirkt sich eine lentivirale Infektion auf die DAerge Faserinnervation und auf

DOPAergen/DAerge Neurone im Striatum aus? Handelt es sich hierbei um eine

Innervationsdefizit oder um einen neuronalen Zellverlust?

- Wie wirkt sich eine lentivirale Infektion auf das cholinerge System im Striatum

aus? Gibt es unterschiedliche Veränderungen für synthetisierende Enzymen und

vesikuläre Transmitterproteine?

- Inwieweit ist die striatale Expression der vesikulären Transmittertransporter

durch eine lentivirale Infektion verändert? Wodurch kann eine unterschiedliche

Beeinträchtigung erklärt werden?

- Ist die Behandlung mit einer lipophilen antiretroviralen Substanz effektiv,

Veränderungen von Transmittersystemen im Striatum zu normalisieren?

Material und Methoden

38

3 Material und Methoden

Paraffinschnitte des Striatums von SIV-infizierten Rhesus Makaken wurden

immunhistochemisch untersucht. Verglichen wurden dabei eine gesunde nicht infizierte

Kontrollgruppe mit einer Gruppe von Rhesus Affen, die mit SIV inokuliert wurden aber

nicht an AIDS erkrankten, und mit einer Gruppe an AIDS erkrankter Affen. Als vierte

Gruppe wurden Affen untersucht, die an AIDS litten und antiretroviral mit 6-Cl-ddG

behandelt wurden. Zur Quantifizierung wurden standardisierte immunhistochemische

Methoden mit etablierten Antikörpern verwendet. Koexistenzen wurden mittels

Immunofluoreszenz-Doppelmarkierung analysiert.

Experimentelle Gruppen von Rhesus Makaken:

1) Kontrollgruppe (Control)

2) SIV-infizierte, aber nicht erkrankte Gruppe (SIV/-AIDS)

3) SIV-infizierte und an AIDS erkrankte Gruppe (SIV/+AIDS)

4) SIV-infizierte und an AIDS erkrankte sowie mit 6-Cl-ddG behandelte Gruppe

(SIV/+AIDS/+ddG)

3.1 Materialien

Verbrauchsmaterialien

Hersteller

Dippinggefäße Amersham, Buckinghamshire, UK

Färbeküvette nach Schiefferdecker Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe und

Hellendahl

Inkubationskammern neoLab Migge Laborbedarf-Vertriebs GmbH,

Heidelberg

Kolbenhubpipetten Eppendorf AG, Hamburg

Laborflaschen Schott AG, Mainz

Messbecher und –zylinder Schott AG

Objektträger (SuperFrost) 76 x 26 mm &

Deckgläser

ROTH, Karlsruhe

Papierfilter Whatman Ltd., Maidstone, Kent, UK

Super PAP Pen Immunotech, Beckman Coulter Company


39

Chemikalien Hersteller

Aceton ROTH

Bovines Serumalbumin Serva, Heidelberg

DePex Serva

3-3, Diaminobenzidin Sigma, Deisenhofen

Essigsäure Riedel de Haen, Seelze

Ethanol ROTH

Giemsa Färbelösung Merck, Darmstadt

Isopropanol Merck

Methanol Merck

Natriumacetat Merck

Di-Natriumcarbonat Merck

Natriumchlorid Merck

Tri-Natriumcitrat Merck

Tris-hydrochlorid ROTH

Natriumcitrat-dihydrat Merck

Di-Natriumhydrogencarbonat Merck

Natriumdihydrogenphosphat Merck

Natronlauge Baker, Deventer, Holland

2-Propanol, Rotipuran ROTH

Salzsäure Merck

TESAP (3-Triethoxy-propylamin) Merck

Tritom X100 Sigma

Tyramid Reagent Pack Perkin Inc., Waltham, MA, USA

Vectastain Elite ABC Kit Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA

Vectastain Elite Avidin-Biotin-Blocking Kit Vector Laboratories Inc.

Wasserstoffperoxid ROTH

Xylol Merck


40

Geräte und Instrumente Hersteller

Absaugpumpe KNF Neuberger

Hybridisierungsofen 400 HY-E (60°C) Bachofer, Reutlingen

Foto-Leuchttisch-Kamera Norther Light, Nikon

IBM Computer

Inkubationsofen (16°C/37°C) WTB Binder Labortechnik, Reiskirchen

Kochplatte Rommelsbacher

Laborwaage PT 3010 Sartorius AG, Göttingen

Laserscanningmikroskop (Olympus BXWI) Olympus Optical Co., Hamburg

Laser für das Laserscanningmikroskop

(Omnichrome Series 43, Modell 643-OLYM-A03)

Melles Griot Laser Group, Carlsbad, USA

Magnetrührer IKA Labortechnik, Staufen

Olympus BX40 F Stereomikroskop Olympus Optical Co.

Olympus Fluoview BX50WI, Konfokales

Laserscanningmikroskop

Olympus Optical Co.

Olympus Provis AX70 Stereomikroskop Olympus Optical Co.

pH-Meter CG 840 B Schott AG

Reinstwasseranlage (Milli-Q) Millipore Corporation, Billerica, MA, USA

Rotationsmikrotom HM 35 Microtom International GmbH, Walldorf

SPOT RT3 Mikroskop Kamera (Slider 2.3.1) Spot Imaging Solutions, Diagnostic

Instruments, Inc., Sterling Heights, MI, USA

Tissue-Tek Paraffin-Ausbettstation Sakura Finetik, Zoeterwoude, Holland

Tissue-Tek VIP Gewebe Einbettautomat VOGEL, Medizinische Technik und

Elektronik, Gießen

Trockenplatte (Präzitherm) Störck Tronic, Stuttgart

UEC-Force IV Mikroliterzentrifuge UNIEQUIP Laborgeätebau und Vertrieb

GmbH, Martiensried

Umluftofen (Typ UT 6) Thermo Electron Corporation, Langenselbod

Vortex IKA Labortechik


41

Software Hersteller

Adobe Photoshop Adope Systems GmbH, München

FluoView Olympus optical C.

Graph Pad Prism 4 GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA

ImageJ 1.44 National Institutes of Health, Bethesda, MA,

USA

MCDI M4 Image Analysis System Imaging Research, St. Catharine, ON, Kanada

Microsoft Excel Microsoft Corportation, Redmont, WA, USA

Spot Advanced Version 3.5.7.1 Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights,

MI, USA

3.2 Methoden

3.2.1 Charakterisierung der Versuchstiere und Gruppierungen

Junge Rhesus Makaken aus dem, von der American Association for Accredition of

Laboratory Animal Care anerkannten, BIOQUAL Animal Facility in Rockville (MD, USA)

wurden für die Versuchsreihe gehalten. Eine Infektion der Tiere mit simianen Retrovirus

-1 und -2 oder Herpes Virus Simiae wurde vor Versuchsbeginn ausgeschlossen. Für die

Virusinokulation wurde das einst von da Cunha et al. (1995) beschriebene SIVδB670, der

in humanen mononukleären Zellen (hPBMC) kultiviert und bis zu seiner Verwendung in

flüssigem Stickstoff gelagert wurde, verwendet. Das zellfreie SIVδB670, stellt einen

neurovirulenten rekombinanten Viruskomplex dar, der Makrophagen- und T-Zell-

trophische Viren enthält (Zink et al., 1997). Die Virusinokulation erfolgte per intravenöser

Gabe einer zehnfach infektiösen Dosis für Rhesus Makaken. Die Bestätigung einer

nachhaltigen Infektion gelang durch Detektion von SIV p26 mittels ELISA und

Virusisolation aus PBMC (Rausch et al., 1994). Die Diagnose von AIDS wurde bei den

Rhesus Makaken durch Symptome wie Appetitlosigkeit mit einer Reduktion des

Körpergewichts bis zu 10%, opportunistischen Infektionen, Auftreten von Haut- und

Schleimhauteffloreszenzen und einer zu einer Flüssigkeitssubstitution notwendigen

Diarrhoe gestellt (Eiden et al., 1992). In der Zeitdauer von 4,5 bis 8 Monaten zwischen

Virusinokulation und Tötung litten die erkrankten Tiere weiterhin unter kognitiven und

motorischen Beeinträchtigungen, Apathie, Inkontinenz und Anämie.

Sechs Affen dienten als Kontrollgruppe (Control), die nicht inokuliert wurden (MO44,

MO45, MO50, MO69, MO87, MO88). Zur Zeit der Tötung und Gewebeentnahme zeigten

dreizehn Affen eine hohe Virämie und AIDS (MO46, MO70, MO71, MO72, MO73,

MO74, MO78, MO79, MO82, MO86, MO89, MO90). Bei fünf SIV-infizierten Affen, die


42

kein AIDS entwickelten (da Cunha et al., 1995), lag eine geringe Virämie vor (MO75,

MO80, MO85, MO92, MO93).

Die antiretrovirale Behandlung erfolgte mit BHS-gängigen Nukleosidanaloga. Vier SIV-

infizierte Affen, die eine hohe Virämie aufwiesen, wurden mit 2´3´-Didesoxyinosin (ddI)

und/oder 6-Cl-ddG subkutan behandelt. Drei von diesen vier Affen (MO76, MO77,

MO91) erhielten zur Stabilisierung über einen Zeitraum von drei Wochen täglich 10

mg/kg ddI und danach für 6 Wochen täglich 75 mg/kg 6-Cl-ddG. Der vierte Affe (MO89),

der auch eine hohe Viruslast aufwies, wurde 3 Wochen lang mit 200 mg/kg 6-Cl-ddG

täglich behandelt (Depboylu et al., 2004). Die Zeitspanne zwischen Virusinokulation und

Euthanasie betrug 4,5 bis 6,5 Monate.

Charakterisierung und Gruppierung der Versuchstiere

Affennummer SIV-Inokulation AIDS Behandlung Virus SIVδB670 klinische Manifestation 6-Cl-ddG MO44 Nein Nein Nein MO50 Nein Nein Nein MO69 Nein Nein Nein MO87 Nein Nein Nein MO88 Nein Nein Nein MO75 Ja Nein Nein MO80 Ja Nein Nein MO85 Ja Nein Nein MO92 Ja Nein Nein MO93 Ja Nein Nein MO71 Ja Ja Nein MO74 Ja Ja Nein MO78 Ja Ja Nein MO79 Ja Ja Nein MO82 Ja Ja Nein MO86 Ja Ja Nein MO70 Ja Ja Ja MO72 Ja Ja Ja MO73 Ja Ja Ja MO76 Ja Ja Ja MO77 Ja Ja Ja MO89 Ja Ja Ja MO91 Ja Ja Ja

3.3 Gewinnung des Probenmaterials

3.3.1 Präparation und Fixierung, ZNS Gewebegewinnung

Zur Narkose erhielten die Tiere Ketamin (20 mg/kg) und Ketaminazepromazin (10

mg/kg). Anschließend wurde eine transkardiale Perfusion mit 2,0 l PBS, 400 ml/kg 1%

Formalin/PBS und 1,5 l/kg 4% Formalin/PBS durchgeführt. Gewebeproben zur


43

histologischen Aufaufarbeitung wurden direkt im Anschluss entnommen und nach

standardisierten Protokollen nummeriert. Die Erstfixierung über Nacht wurde in 4%

PFA/PBS vorgenommen (Depboylu et al., 2004). Die in dieser Versuchsreihe

verwendeten Gewebeblöcke wurden in Bouin-Holland´scher Lösung für 48 Stunden

nachfixiert. Über einen Zeitraum von vier bis sechs Wochen wurde die Fixans in täglich

frischem 70%-igem Isopropanol ausgewaschen. Die anschließende Dehydration in einer

Alkoholreihe aufsteigender Konzentration erlaubte die für das Schneiden der

Gewebeblöcke koordinierte Einbettung in Paraffin (Depboylu et al., 2004).

3.3.2 Vorbereitung der Objektträger

Die Objektträger (OTs) wurden vor der histologischen und immunhistochemischen

Aufarbeitung silianisiert, um eine gute Haftung der Hirngewebeschnitte zu gewährleisten.

Nach Austestung von käuflich beschichteten und mit Poly L-Lysin behandelten OTs

wurden für die Versuche TESAP-beschichtete OTs verwendet.

Abfolge

1. Spülen der OTs:

Die OTs wurden in Kunststoffwannen mit 60°C heißem Wasser mit und ohne Spülmittel

(in handelsüblicher Menge) gespült. Nun wurde mit demineralisiertem Wasser und dann

mit Reinstwasser (Aqua bidest) nachgewaschen (je 10 min). Abschließend erfolgte eine

Waschung mit 70%igem Isopropanol auf einem automatischem Schüttler (45 min).

2. Trocknen der OTs:

In einem Trockenschrank bei 60°C (2 h).

3. Beschichtung:

Nun folgte die Beschichtung der OTs mit TESAP (3-Triethoxysilyl-propylamin). Dazu

wurden die OTs in 2%igem TESAP/Aceton (4 ml TESAP in 200 ml Aceton) und zweimal

in Aceton (je 30 sec) gestellt. Dann wurden sie in Aqua bidest und demineralisiertem

Wasser gewaschen (je 10 sec).


In einem Trockenschrank bei 45°C (über Nacht). Aufbewahrung der OTs bis zur

Verwendung bei Raumtemperatur in OT-Kästen.


44

3.3.3 Schnitte von in Paraffin eingebetteten Geweben

Abfolge

1. Inbetriebnahme des Rotationsmikrotoms:

Nach einer Vorbehandlung in einem Wasserentgaser wird Aqua bidest im Mikrotom auf

42°C erwärmt.

2. Schneiden der Gewebeblöcke:

Der Paraffinblock wird mit Festlegung der Schnittebene am Mikrotom adjustiert.

Folgeschnitte von 7 µm Dicke werden angefertigt und auf dem erwärmten Wasserbad

belassen, um Knicke und Blasen auf den OTs zu verhindern. Die Gewebeschnitte

werden nun mit Hilfe eines feinen Pinsels auf die TESAP-beschichteten OTs gezogen

und zum Trocknen auf einer 41°C warmen Heizplatte belassen.


Im Trockenschrank bei 60°C über Nacht. Lagerung der Schnitte bei Raumtemperatur in

OT-Kästen.

3.3.4 Übersichtsfärbungen mit Giemsa

Zur Bestimmung des gleichen Hirnabschnitts und für weitere histologische

Untersuchungen wurde nach jedem 10. bis 15. Schnitt ein OT mit einem Hirnschnitt

belegt, der nach Giemsa gefärbt wurde.

Abfolge

1. Entparaffinierung und Hydratation:

Paraffinschnitte in Xylol (2x 5 min) und in Alkoholreihe absteigender Konzentration

(100%, 96%, 90%, 80%, 70% je 5 min) und Aqua dest (5 min) belassen.

2. Färbung:

Gewebeschnitte in frisch zubereiteter Giemsa-Lösung belassen (1 h). Nun folgt die

Differenzierung der Rottöne in CH3COOH-Wasser und die Differenzierung der Blautöne

in 96%igem Alkohol.

3. Konservierung:

Gefärbte Gewebeschnitte in absolutem Alkohol (3x 5 min) und Xylol (3x 5 min) belassen.

Abschließend mit DePex eindeckeln der OTs.


45

3.4 Immunhistochemische Methoden

Die Immunhistologie stellt eine zentrale Methode der histopathologischen Diagnostik und

Forschung dar. Die Techniken erlauben den morphologischen Nachweis von antigenen

Komponenten (Proteinen, Polysacchariden und anderen Strukturen) in Zellen und

Gewebeschnitten. In Paraffin eingebettetem Gewebematerial wurden Antigene (Epitope)

mit etablierten und geeigneten Antikörpern mittels einfacher enzymatischer

Immunhistochemie (IHC) und doppelmarkierter Immunfluoreszenz nachgewiesen.

3.4.1 Antikörper und Detektionssysteme

Die unterschiedlichen, an der Synthese und der vesikulären Speicherung von

Neurotransmittern beteiligte, Zellstrukturen im ventralen Striatum wurden mit etablierten

spezifischen Antikörpern detektiert. Diese Antigene waren TH, VMAT-2 und AADC für

das DAerge/monoaminerge, ChAT und VAChT für das cholinerge, VGLUT-1 für das

glutamaterge und VGAT für das GABAerge System. Für den Nachweis des

Entzündungsgeschehens während einer SIV-Infektion wurden gliales fibriläres

Säureprotein (GFAP) für Astrozyten (Weihe et al., 1993) und ionisiertes Ca2+-

Bindungsadaptermolekül-1 (Iba-1) für Mikroglia, Makrophagen und einwandernde

Monozyten (Imai et al., 1998) verwendet. Der Virusnachweis erfolgte mit dem SIV

Glykoprotein 41 (gp41). Die Erstellung von Titrationsreihen war für das Ermitteln der

optimalen Arbeitskonzentration hilfreich. Durch die Verwendung biotinylierter

Sekundärantikörper konnten die im Gewebe gebundenen Primärantikörper mit Hilfe von

Streptavidin-gekoppelten Avidin-Biotin-Peroxidasen und DAB (brauner Niederschlag,

Peroxydase-Substrat) und eventuelle Zugabe von Nickel (blau-schwarzer Niederschlag,

Komplexbildner) farblich dargestellt werden. Die Fluoreszenzdarstellung erfolgte

entweder mit direkt an den Sekundärantikörper bindenden oder indirekt an Streptavidin

gekoppelten Fluorchrome A647 (rote Fluoreszenz) oder A488 (grüne Fluoreszenz).


46

Verwendete Primärantikörper Bezeichnung Beschreibung Donorspezies Quelle Katalognr. Verdünnung AADC ChAT GFAP Iba-1 TH SIVmac251, gp41 VAChT VGAT VGLUT-1 VMAT-2

aromatische Aminosäure-Decarboxylase Cholin-Acetyl-Transferase (Marker für cholinerge Neurone und Fasern) saures Gliafaserprotein (Astrozytenmarker) ionisierendes Calzium-bindendes Adaptermolkül-1 (Marker für mononukleäre Zellen) Tyrosinhydroxylase transmembranes Glykoprotein 41 (Marker für SIV) vesikulärer ACh-Transporter (Marker für cholinerge Neurone und Fasern) vesikulärer GABA-Transporter (Marker für GABAerge Fasern) vesikulärer Glutamat- Transporter 1 (Marker für glutamaterge Fasern) vesikulärer Monoamin-Transporter 2 (Marker für monoaminerge Neurone und Fasern)

Kanninchen, p Ziege, p Meerschwein- chen,p Kaninchen, m Schaf, p Maus, m Hase, p Hase, m Meerschwein- chen, p Hase, p

Chemicon, Millipore, Temeluca, USA Chemicon PROGEN Biotechnik GmbH , Heidelberg Wako Pure Chemical Ind., Osaka, Japan Chemicon AIDS Reagent Program, NIH, Bethesda, MD USA LE Eiden, NIH Chemicon Erickson, New Orleans, USA LE Eiden

AB 136

AB 144P

GP 52

019- 19741

AB 142

KK41

80153

AB-5855

BNIP 437/ P436/7/01

80182

1:200/ 1:100(F)/

1:1000(F+T)

1:250

1:3000/ 1:100(F)

1:1000

1:1000/ 1:100(F)/

1:3000(F+T)

1:200

1:2000

1:1000

1:1000

1:2000/ 1: 100(F)/

1:10000(F+T)

Abkürzungen: F: Immunofluoreszenz, F+T: Immunofluoreszenz mit Tyramidverstärkung, p: polyklonal, m:

monoklonal.


47

Sekundärantikörper und Detektionssysteme

Bezeichnung Donorspezies Quelle Katalognr. Verdünnung Anti-Schaf-IgG-Biotin Anti-Hase-IgG-Biotin Anti-Ziege-IgG-Biotin Anti-Meerschweinchen-IgG-Biotin Anti-Ratte-IgG-Biotin Anti-Maus-IgG-Biotin Anti-Schaf-IgG-A647 Anti-Hase-IgG-A647 Anti-Ziege-IgG-A647 Streptavidin-Alexa-A488 Avidin-Biotin-Peroxidase

Esel Esel Esel Esel Esel Esel Esel Huhn Ziege

Dianova, Hamburg Dianova Dianova Dianova Dianova Dianova MoBiTec, Göttingen MoBiTec MoBiTec MoBiTec BIOZOL, München

713-065-147 711-065-152 705-065-147 706-065-195 712-065-153 715-065-151 A-21488 A-21443 A-21450 A-11073

1:200

1:200

1:200

1:200

1:200

1:200

1:100

1:100

1:100

1:200

1:500

3.4.2 Einfache enzymatische Immunhistochemie (IHC)

Bei der indirekten IHC erfolgt der Nachweis von Antigenen im Gewebeschnitt mit einem

konjugiertem Sekundärantikörper, der an den Fc-Teil des gegen das gesuchte Antigen

gerichteten Primärantikörpers bindet. Die Konjugation des Sekundärantikörpers mit

Biotin erlaubt die farbliche Darstellung der gesuchten Antigene mit Hilfe von

Chromogenen.

Hierbei ist die ABC-Methode (Avidin-Peroxidase-Komplex), ein Nachweisverfahren, das

sich die hohe Affinität des aus Hühnereiweiß gewonnen Glykoproteins Avidin für Biotin

zu Nutze macht, hilfreich. Die Fähigkeit des Avidins vier Moleküle des Vitamins Biotin

physikalisch zu binden (Bourne, 2000), führt zur Bindung des Avidin-Biotin-

Peroxidasekomplexes an den Sekundärantikörper. Das an Biotin gebundene Enzym

Peroxidase oxidiert Wasserstoffperoxid (H2O2) zu Wasser und Sauerstoffradikalen, die

das anschließend hinzugegebene wasserlösliche Chromogen 3,3-Diaminobezindin-

tetrahydrochlorid-Nickel (DAB-Ni) zu einem unlöslichen Phenazinfarbmolekül oxidieren.

Das schwarz/dunkelblaue DAB-Ni erlaubt die Verwendung von Xylol-haltigen

Eindeckmitteln.


48

Arbeitslösungen:

Phosphatpuffer (PBS, 50 mM): 6,55 g (9,5 mM) NaH2PO4 und 45 g NaCl und 36,05 g

(40,5 mM) Na2HPO4 in 4,5 l Aqua bidest lösen. Mit 1 M NaOH den pH auf 7,45 einstellen

und anschließend den Ansatz mit Aqua bidest auf 5 l auffüllen.

Triton X-100 (0,4%) : Mischen von 100 ml 10% PBS mit 900 ml Aqua bidest und mit 4 ml

Triton X-100.

Ablauf der Immunhistologie nach der ABC-Methode:

1. Entparaffinierung:

Paraffinschnitte in Xylol (3x 10 min) und in 100% Isopropanol (10 min) belassen.

2. Blockierung der endogenen Peroxidase:

Um unerwünschte Reaktionen des Chromogens mit der endogenen Peroxidase zu

verhindern, die zu einer unspezifischen Anfärbung der Proben führen können.

Inkubation der Gewebsschnitte mit frischem Ansatz von 0,1% H2O2/Methanol (30 min)

bei Raumtemperatur.

3. Rehydratation in Isopropanolreihe absteigender Konzentration:

100% Isopropanol (10 min), 96%/80%/70% Isopropanol (je 5 min) und anschließende

Wässerung in Aqua bidest (2x 5 min).

4. Antigendemaskierung:

Permeabilisierung des fixierten Gewebes durch Inkubation mit 0,4%igem Triton X100 in

5% BSA/50 mM PBS (30 min) und 1%igem BSA/50 mM PBS (15 min) bei

Raumtemperatur.

5. Blocken unspezifischer Bindung:

Blockierung gewebsendogener, unspezifischer Avidine und Biotine durch Inkubation der

Gewebeschnitte mit 30%igem Avidin/1%igem BSA/50 mM PBS (15 min) und 30%igem

Biotin/1%igem BSA/50 mM PBS (15 min) bei Raumtemperatur. Belassen in 1%iger

BSA/50 mM PBS-Lösung bis zum nächsten Arbeitsschritt.

6. Inkubation Primärantikörper:

Auftropfen des Primärantikörpers in der Arbeitsverdünnung und Inkubation in feuchter

Kammer bei 16°C (8 h) und anschliessend bei 37°C (2 h).

7. Waschen:


49

In Aqua bidest (3x 5 min) und 50mM PBS (10 min). Belassen in 0,5%iger BSA/50 mM

PBS-Lösung bis zum nächsten Arbeitsschritt.

8. Inkubation Sekundärantikörper:

Inkubation des jeweils spezifischen biotinylierten Sekundärantikörpers in der

Arbeitsverdünnung 1:200 in feuchter Kammer bei 37°C (45 min).

9. Waschen:

In Aqua bidest (3x 5 min) und 50 mM PBS (10 min). Belassen in 0,5%iger BSA/50 mM


10. Inkubation mit Avidin-Biotin-Komplex:

Auftropfen der bei Raumtemperatur zuvor (30 min) angesetzten ABC-Lösung (Ansatz:

Pro ml 1%iger BSA/50 mM PBS je 20 µl Lsg. A und Lsg. B). Inkubation in feuchter

Kammer bei 37°C (30 min).

11. Waschen:

In Aqua bidest (3x 5 min) und 50mM PBS (10 min). Belassen in 0,5%iger BSA/50 mM


12. Entwicklung mittels Chromogen:

In DAB-Nickel-Lösung (Ansatz: 16 ml DAB-Aliquot (100 mg) mit 8 ml Nickel-Aliquot (600

mg) in 800 ml 50 mM PBS lösen und filtrieren) die Gewebeschnitte unter starkem

Rühren vorinkubieren (5 min) und anschließend unter Zugabe von 112 µl H2O2 die

Farbreaktion starten (8 min). Die Reaktion wird durch die Überführung der

Gewebeschnitte in Aqua bidest gestoppt. Die Färbelösung wird durch die Zugabe von

einigen Tropfen Natriumhypochlorid neutralisiert.

13. Waschen:

In Aqua bidest (3x 5 min).

14. Dehydratation:

In Alkoholreihe aufsteigender Konzentration (70%, 80%, 96%, 100% je 10 min) und Xylol

(3x 10 min). Abschließendes Eindeckeln mit DePex und Deckgläschen.

3.4.3 Immunhistochemische Doppelfluoreszenzmarkierung

Die Doppelfluoreszenzmarkierung wurde durchgeführt, um eine genauere

Phänotypisierung der auf den untersuchten striatalen Schnitten befindlichen Neurone


50

und Fasern vorzunehmen. Dabei können evtl. Koexistenzen durch die Verwendung von

Primärantikörpern verschiedener Spezies nachgewiesen werden.

Arbeitslösungen

Phosphatpuffer (50mM PBS): s. 3.2.6

TN-Puffer (1 l): 30 ml NaCl (150 mM) mit 50 ml Tris/HCL (100 mM) in 920 ml Aqua

bidest mischen.

Ablauf

Vorgehen wie Protokoll unter 3.2.6 mit Auslassung der Antigendemaskierung mit

0,4%igem Triton X-100 und Detektion des zweiten Primärantikörpers mit anderem

Fluorochrom.

Doppelfluoreszenz mit Tyramidsignalverstärkung (CSA)

Basierend auf der ABC-Methode beinhaltet die CSA-Methode („catalysed-signal-

amplification“) die Zwischenschaltung einer speziellen Amplifikationsreagenz nach der

Inkubation mit dem Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex. Diese Reagenz beinhaltet

biotyniliertes Tyramid, das durch die gebundene Peroxidase in eine reaktive Form

überführt wird (Biotin-Präzipitation). Im folgenden Schritt vermittelt das abgelagerte

Biotin die Bindung von Peroxidase-markiertem Streptavidin. Die CSA-Methode hat eine

höhere Sensitivität als die herkömmliche ABC-Methode, da sie dazu führt, dass

zusätzliche Enzymmoleküle abgelagert werden.


51

3.4.4 Coronare Schnittebenen

Abb. 3.1: Zurordnung der coronaren Schnitte des Striatums.

Darstellung des Striatums am Beispiel TH-, VMAT-2- und VGLUT-1-immungefärbter Schnitte. Die

Grundlage für die Lokalisation der Striatumregionen bildete der Basalganglienatlas von Vaszquez und

Lanciego: The basal ganglia and thalamus of the long-tailed macaque in stereotaxic coordinates. A template

atlas based on coronal, sagittal and horizontal brain sections-ENKEPHALIN. Jose´ L. Lanciego, Alfonso

Vaszquez, 2012. Marke: 50 µm.

Abkürzungen: CN: Nucleus caudatus, Put: Putamen, Acb: Nucleus accumbens, SI: Substantia innominata,

OT: Tuberculus olfactorius, CL: Claustrum, LV: Seitenventrikel.

TH

VMAT-2

VGLUT-1


52

3.5 Auswertungen und statistische Analysen

Die Quantifizierung immunhistochemisch gefärbter Gewebeschnitte erfolgte unter dem

Hellfeldmikroskop (AX 70 von Olympus) und für die Übersichtsaufnahmen (Abb. 3.1)

unter der Fotoleuchttischkamera (NothernLight, Micro-Nikon). Die Bilder wurden mit

einer digitalen Kamera (Spot RT Slider) erfasst, mit einem computergestützten

Programm (SPOT Elite 3.5.7.1) aufgenommen und für die Quantifizierung an das

ImageJ (1.44) und das MCID M4 Image Analysing System Programm übertragen. Die

Auswertung der Fluoreszenzsignale erfolgte unter dem Olympus Fluoview Konfokalen

Laserscanningmikroskop BX 50 WI, wobei mehrere Schnitte von verschiedenen Affen in

der gleichen Ebene auf das Vorhandensein von Koexistenzen für die Phänotypisierung

analysiert wurden.

Die Qualität des Untersuchungsgewebes und der Reaktion wurde von einem erfahrenen

und gebildeten Untersucher kontrolliert und Ausweichendes aussortiert, um die

Vergleichbarkeit der Inkubationsergebnisse zu gewährleisten. Vorraussetzung hierfür

war die konstante Behandlung des Untersuchungsgewebes und der Inkubationsschnitte.

3.5.1 Bestimmung der optischen Dichte der TH+, ChAT+, VAChT+, VGLUT-1+, VGAT+ und VMAT-2+ Nervenfasern

Die Bestimmung der optischen Dichte zur Quantifizierung der Faserinnervation erfolgte

durch die Antikörperdetektionssysteme der entsprechend immunhistochemisch

gefärbten Striatumschnitte. Die inkubierten Gewebeschnitte wurden auf einem

Leuchttisch in 40-facher Vergrößerung abfotografiert. Die Bildanalyse erfolgte mittels

ImageJ. Es wurde die striatale Fläche eines jeden Schnittes markiert. Die gemessenen

Werte entsprechend der Dichte der Fasern, deren immunreaktive Fläche in Pixel

angegeben wurde, bildeten die Grundlage für die statistische Analyse. Die

Quantifizierung erfolgte, indem die optische Dichte des Hintergrunds von dem der bei

inkubierten Gewebeschnitten gemessenen optischen Faserdichte subtrahiert wurde.

Dies wurde für die jeweiligen Antikörper bei vier Affen mit jeweils fünf bis acht

Gewebeschnitten pro Tier und Gruppe der untersuchten Studienkohorte durchgeführt.

Pro Affe und Gruppe wurde ein Mittelwert der optischen Dichte berechnet. Die

Bestimmung der Mittelwerte pro Tier erlaubte die statistische Auswertung mit dem

Programm Graph Pad Prism 4 mittels Kruskal-Wallis und dem pairwise t-Test nach

Bonferroni-Hohn. Werte für p < 0,001 (**) und p < 0,01 (*) wurden als statistisch

signifikant angesehen. Die Qualifizierung und Quantifizierung der Faserdichte wurde

durchgeführt, nachdem die Objektträger mit einem Code versehen wurden. Dies

erlaubte eine einfache Verblindung der Untersucher. Eine Überprüfung der Richtigkeit


53

der durchgeführten Berechnungen wurde freundlicher Weise vom Institut für Biometrie

und Epidemiologie an der Phillips-Universität Marburg durchgeführt.

3.5.2 Quantifizierungen der TH+, ChAT+ und VAChT+ Neurone

Um eine Unterscheidung zwischen einer möglicherweise durch SIV-induzierten

synaptischen Schädigung von einem neuronalem Zellverlust treffen zu können, wurden

zusätzlich pro Gruppe bei vier Affen in fünf bis acht Serienschnitten des Striatums TH-,

ChAT- und VAChT-immungefärbte Neurone gezählt. Pro Schnitt wurden acht zufällig

ausgesuchte Areale des ventralen Striatums am Hellfeldmikroskop (400-fache

Vergrößerung) nach Neuronen mit klarem Nukleus untersucht und ausgezählt. Die

Verblindung des Untersuchers, statistische Auswertung und die Überprüfung fand wie in

3.5.1 angegeben statt.

A ChAT B TH

Abb. 3.2: Beispielaufnahmen in 40-facher Vergrößerung.

Mittels des Cell Counter Plug Ins der Bildanalysesoftware ImageJ wurden Neurone (hier mit einem gelben

Stern versehen) untersucht. Pro inkubiertem Gewebeschnitt wurden in acht randomisiert ausgewählten

Gesichtsfeldarealen Neurone ausgezählt. A: MO93, SIV/-AIDS; B: MO50, Ctrl.


54

3.5.3 Darstellung der Immunreaktivität der Neuroinflammation

Für die Darstellung der SIV-Infektion und der daraus resultierenden inflammatorischen

und glialen Reaktion wurden SIV gp41 sowie Iba-1 und GFAP verwendet. Sie diente

dem alleinigem Zweck der Visualisierung des Entzündungsgeschehens. Dafür wurden je

vier Gewebeschnitte aus den vier Gruppen der Studienkohorte mittels einfacher DAB-Ni-

IHC inkubiert, die anschließend mittels MCID-Programm in 20-facher Vergrößerung

fotografiert wurden.

3.5.3.1 Auswertung der Iba-1+ mikroglialen Entzündungsreaktion

Das Iba-1 ist ein Calcium-Bindeprotein, das spezifisch in Zellen monozytären Ursprungs

wie Mikroglia und Makrophagen exprimiert wird und an der Aktivierung ruhender

Mikroglia beteiligt ist. Es wird als anerkannter Mikroglia/Makrophagen-Marker verwendet.

Mikroglia-Zellen sind als Immunzellen des ZNS an neurodegenerativen und

inflammatorischen Prozessen, die durch eine lentivirale Infektion ausgelöst werden,

maßgeblich beteiligt. Zur qualitativen und quantitativen Auswertung wurde die Anzahl

und die Morphologie der Iba-1-immunpositiven Zellen analysiert (Abb. 3.3). Für jedes

Versuchstier wurden Scoring-Werte ermittelt, die statistisch und grafisch ausgewertet

wurden (One-Way ANOVA mit anschließendem Bonferroni’s Post-Test für multiples

Vergleichen mit dem Programm GraphPad Prism 4.0).

Scoring-System für Iba-1

Zellform: ruhend amöboid-fokal amöboid-diffus Gesamtscore Score 0

1

2

Multinukleäre Riesenzellen:

keine < 5 / cm2 > 5 / cm

Score 0

1

2

0 - 6

Mikrogliaknötchen: keine < 3 / cm2 > 3 / cm2 Score 0

1

0

Abb. 3.3: Bewertung der Iba-1-Expression.

Das Scoring-System erlaubt eine qualitative und quantitative Bewertung der Iba-1 Expression. Es wurden

Punktwerte von 0-2 für die Kriterien Zellform, Anzahl der multinukleären Riesenzellen und Mikrogliaknötchen

vergeben. Höhere Punktwerte stehen für eine ausgeprägtere Aktivierung der mikroglialen

Entündungsreaktion. Die Analyse erfolgte jeweils an vier Versuchstieren pro Versuchsgruppe. Dabei erfolgte

die Bewertung eines jeden Kriteriums mit jeweils genau einem Punktewert. Anschließend wurde aus den

einzelnen Punktewerten die Summe – der Gesamtscore – gebildet. Hierbei können Werte zwischen 0 (keine

Aktivierung der Mikroglia) und 6 (ausgeprägte Aktivierung der Mikroglia) erreicht werden.


55

3.5.3.2 Auswertung der GFAP+ astroglialen Entzündungsreaktionen

Das GFAP ist als Intermediärfilament im Zytoskellet von Astroglia lokalisiert und gilt als

klassischer Marker für diese im ZNS. Bei Infektionen und neurodegenerativen

Erkrankungen kommt es zu einer Aktivierung und Proliferation von Astrozyten

(Astrogliose). In der Folge der Aktivierung hypertrophieren die Astrozyten mit

konsekutiver Steigerung ihrer GFAP-Expression. Für die Quantifizierung einer durch

eine SIV-Infektion bedingten Gliose wurde das Scholl-Schema (Scholl, 1953)

angewandt. Hierbei wurde eine Serie konzentrischer Ringe mit einem Abstand von 10

µm um einen Mittelpunkt im Soma der Astrozyten gelegt (Abb. 3.4). Folgende Kriterien

für die Analyse mussten für die ausgewählten Astrozyten erfüllt sein: eindeutige

Lokalisation, Soma und Fortsätze vollständig mit DAB-Ni imprägniert und einfache

Differenzierbarkeit von benachbarten Astrozyten. Die Quantifizierung der

Astrozytenfortsätze erfolgte nach folgendem Schema. Die Länge der Fortsätze zwischen

zwei Ringen, die Anzahl der Fortsatzenden und die Anzahl der Kreuzungspunkte mit

jedem Ring wurden addiert. Die Auswertung erfolgte mittels dem ImageJ-Plug In: Sholl

Analysis. Die Bestimmung der Mittelwerte pro Tier erlaubte die statistische Auswertung

mit dem Programm Graph Pad Prism 4 mittels One Way ANOVA und dem pairwise t-

Test nach Bonferroni-Hohn.

Abb. 3.4: Grundprinzip der Scholl-Analyse.

Das Schema veranschaulicht das Messverfahren zur Quantifizierung der Astrozytenaktivität. Eine Reihe

konzentrischer Ringe wird mit einem Abstand von je 10 µm um den Mittelpunkt des Somas gelegt. Innerhalb

eines Ringes werden folgende Parameter errechnet: Kreuzungspunkt eines Astrozytenfortsatzes mit Ring,

Endigungen der Fortsätze und die Summe aller Fortsatzlängen. Die einzelnen Parameter werden pro

untersuchtem Astrozyten summiert. Die Analyse erfolgte computerunterstützt mithilfe des Plug Ins Scholl-

Analyse des Bildbearbeitsprogramms ImageJ.

= Längensummand

= Kreuzungsstelle

= Fortsatzendigung

Ergebnisse

56

4 Ergebnisse

4.1 Darstellung der lentiviralen Entzündungsreaktion

Der Beweis für die stattgefundene lentivirale Infektion und die darausfolgenden

Entzündungsreaktionen im Striatum wurde für die Untermauerung der nachfolgend

aufgeführten Ergebnisse ausgeführt. Zusätzlich konnte damit der Effekt einer

antiretroviralen Behandlung auf die zellulären Entzündungsreaktionen und auf die

Viruslast im untersuchten Gewebe dargestellt werden.

4.1.1 Der Einfluss einer lentiviralen Infektion und deren antiretrovirale Behandlung auf die striatale Viruslast

Für die Darstellung des verwendeten Modells wurde die Viruslast die untersuchten

striatalen Gewebeschnitte quantifiziert. Hier zeigte sich, dass das SIV nur in der an AIDS

erkrankten Gruppe (8,56 ± 2,5 /mm2) zu detektieren war (s. Abb. 4.7A). Die

virustragenden Zellen ließen sich besonders fokal an Gefäßen, subventrikulär,

meningeal, im Plexus choroideus und in der Capsula interna nachweisen (s. Abb. 4.7B).

Zellen monozytären Ursprungs wie Mikroglia, Makrophagen und multinukleäre

Riesenzellen waren SIV gp41+. Neurone, Endothelzellen und Makroglia konnten als

virustragende Zellen ausgeschlossen werden.

A SIV gp41+ IHC B SIV gp41+ Zellen

Contro

l

SIV/-A

IDS

SIV/+A

IDS

SIV/+A

IDS/+

ddG

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0 **** **

Siv

gp

41+

cells

/ mm

2

Abb. 4.1: Graphische Darstellung der Quantifizierung SIV gp41+ Zellen im Striatum.

A: Repräsentative Beispielbilder: a: SIV gp41+ Zellen in der Capsula interna. b: Bei Vergrößerung werden

die Mikrogliaknötchen sichtbar (MO89, SIV/+AIDS). c: Darstellung virustragender subventrikulärer Zellen. d:

Virustragende Zellen im Plexus choroideus (MO71, SIV/+AIDS). Marke: 50 µm in a, c und d; 25 µm in b.

B: SIV-infizierte Zellen zeigen sich nur im Gewebe der an AIDS erkrankten Affen. Die antiretrovirale

Behandlung führt zu einer vollständigen Rückbildung der viralen Last. Fehlerbalkendarstellung: SEM, ** p <

0,001.

___

a

b

c d

Ergebnisse

57

4.1.2 Iba-1 als Marker für immunaktive Zellen

Das Protein Iba-1 wird spezifisch in Makrophagen und Mikroglia, die als

inflammatorische Reaktion auf Neurodegeneration vermehrt gebildet werden, exprimiert.

Um die Intensität der Mikrogliaaktivierung zwischen den einzelnen Versuchsgruppen

vergleichen zu können, wurden die einzelnen Mikroglia/Makrophagen gezählt und ihre

Morphologie ausgewertet (s. Kap. 3.5.3). In der an AIDS erkrankten Gruppe war eine

signifikante Steigerung der mikroglialen und monozytären Iba-1-Expression (4,50 ± 1,38)

gegenüber der Kontrollgruppe (0 ± 0) und der nicht an AIDS erkrankten Gruppe zu

verzeichnen (s. Abb. 4.8A). Die Aktivierung mikroglialer Zellen, die von einer ruhenden

zu einer amöboiden Morphologie wechseln, war in den untersuchten striatalen Geweben

diffus zu verzeichnen. Multinukleäre Iba-1+ Riesenzellen und Mikrogliaknötchen konnten

vor allem in der weißen Substanz beobachtet werden.

In der antiretroviral mit 6-Cl-ddG behandelten Gruppe kam es zu einer starken

Reduktion der mikroglialen inflammatorischen Prozesse (1,58 ± 1,1), die jedoch noch im

Vergleich zu der nicht an AIDS erkrankten Gruppe (1 ± 0,9) in einem höheren Grad

persistierten.

A Iba-1+ IHC B Iba-1 Score

Contro

l

SIV/-A

IDS

SIV/+A

IDS

SIV/+A

IDS/+

ddG

0

1

2

3

4

5

6

**

******

Iba-

1 in

flam

mat

ion

sco

re

Abb. 4.2: Mikrogliale Inflammationsreaktion dargestellt durch die Iba-1-Aktivität im Striatum.

A: Repräsentative Beispielbilder: a: 20x Vergrößerung der Immunreaktivität für Iba-1. b und c: Bei

Vergrößerung eines Areals aus der Capsula interna ist die Mikrogliareaktion erkennbar (MO89, SIV/+AIDS).

d: Aufnahme von Iba-1+ Mikrogliaknötchen in der Capsula interna (MO70, SIV/+AIDS). Marke: 50 µm in a, b

und d; 25 µm in c.

a

b

c

d

___

Ergebnisse

58

B: Inflammationsscore: Signifikante Steigerung der Mikrogliaaktivierung im Gewebe symptomatischer

Versuchstiere gegenüber der nicht-infizieten Kontroll- und asymtpomatischen Versuchstiergruppe. Die 6-Cl-

ddG-Behandlung führt zu einer signifikanten Reduktion der Mikrogliaaktivierung auf annähernd Niveau der

asymptomatischen Versuchstiergruppe. Darstellung der Mittelwerte und SEM. ** p < 0,001. Der

Inflammationsscore umfasst morphologische Aktivitätsmerkmale und Inzidenz von multinukleären

Riesenzellen und Mikrogliaknötchen, nähere Erläuterungen s. Kapitel 3.5.3.

4.1.3 GFAP als Marker für Astrozyten und Astrogliose

GFAP wird in Astrozyten exprimiert und ist primär in deren sternförmigen Fortsätzen

nachweisbar. Als Folge von neurodegenerativen und entzündlichen Prozessen wird die

GFAP-Expression gesteigert. Die Astrogliose ist neben einer GFAP-Überexpression

zudem gleichzeitig gekennzeichnet durch eine hypertrophe Veränderung der Astrozyten

und ihrer Fortsätze sowie durch eine Zunahme der Astrozytenzahl. In der vorliegenden

Arbeit wurde die morphologische Veränderung der Astrozyten anhand der Sholl-Analyse

objektiviert (s. Kapitel 3.5.3). Darin berücksichtigt wird die Summe der Länge aller

Astrozytenfortsätze, der Verzweigungsgrad der Fortsätze und die Gesamtzahl aller

Astrozytenfortsätze. Die Ergebnisse zeigen, dass es in der an AIDS erkrankten Gruppe

(7,03 ± 4,5) zu einer starken Astrogliose kam. Die Behandlung mit 6-Cl-ddG erwies sich

als effektiv (2,42 ± 2,3).

A GFAP+ IHC B GFAP-Quantifizierung

Contro

l

SIV/+AID

S

SIV/+AID

S/+ddG0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

****

Shol

l-Sco

re

Abb. 4.3: Astrozytäre Inflammationsreaktion dargestellt durch die GFAP-Quantifizierung im Striatum.

A: Repräsentative Beispielbilder: a: Immunreaktivität für GFAP. b und c: Vergrößerung eines Areals aus der

Capsula interna ist die Astrogliose deutlich erkennbar (MO71, SIV/+AIDS). d: Repräsentative Aufnahme

einer GFAP-IHC in der Capsula interna von einem Kontrolltier (MO50, Control). Die GFAP-Färbung ist bei

Fehlen einer Immunreaktion deutlich weniger ausgeprägt. Marke: 50 µm in a und d; 25 µm in b und c.

a

b

c d

___

Ergebnisse

59

B: Graphische Darstellung der Astroglioseanalyse mittels Sholl-Score: Signifikante Steigerung der

Astrogliaaktivierung im Gewebe symptomatischer Versuchstiere gegenüber der nicht-infizieten Kontroll- und

asymtpomatischen Versuchstiegruppe. Die 6-Cl-ddG-Behandlung führt zu einer signifikanten Reduktion der

Astrogliaaktivierung etwa auf Niveau der asymptomatischen Versuchstiergruppe. Darstellung der Mittelwerte

und SEM. ** p < 0,001.

4.2 Effekte einer lentiviralen Infektion und der antiretroviralen Behandlung auf das monoaminerge System im Striatum

Um den Einflusses einer lentiviralen Infektion auf das monoaminerge System zu

erfassen wurde eine IHC für TH sowie VMAT-2 von striatalen Gewebeschnitten

durchgeführt. Um eine genauere Phänotypisierung zu den DOPAergen oder DAergen

Strukturen treffen zu können, wurden Doppel-Immunofluoreszenzfärbungen

durchgeführt und ausgewertet.

4.2.1 Irreversible VMAT-2-Reduktion bei teilweiser Erholung der TH-Faserdichte

Die monoaminerge Innervation des Striatums wurde durch eine optische

Dichtebestimmung von TH- und VMAT-2-immungefärbten Fasern bestimmt.

Bei der quantitativen Erfassung der TH+ Fasern zeigte sich eine signifikante Reduktion

der relativen optischen Faserdichte (ROD) in der an AIDS erkrankten Gruppe

(SIV/+AIDS) im Vergleich zu der Kontrollgruppe (Control) um fast 32% auf 50,2 ± 3,4 (p

< 0,001) (s. Abb. 4.1A). Solche Veränderung konnten in der asymptomatischen Gruppe

(SIV/-AIDS) nicht beobachtet werden (75,1 ± 2,5; p > 0,05). Die antiretrovirale

Behandlung konnte die Abnahme der TH+ Faserdichte zwar reduzieren (60,8 ± 2,4; p <

0,01), aber nicht komplett wieder auf Kontrollniveau normalisieren.

Um das Ausmaß der durch lentivirale Infektion ausgelösten Schädigung des

monoaminergen Systems abzuschätzen, wurde weiterhin die Anzahl der TH+ Neurone

im Striatum bestimmt. Eine One Way ANOVA Varianzanalyse zeigte keine Unterschiede

der striatalen TH+ Neuronenzahl in den untersuchten Gruppen (s. Abb. 4.1A). Weder in

der SIV/-AIDS (7,48 ± 1,1 /mm2; p > 0,05) noch in der SIV/+AIDS (7,72 ± 1,5 /mm2; p >

0,05) Gruppe wurden Veränderungen im Vergleich zu der Kontrollgruppe bei der TH+

Neuronenzahl festgestellt.

Dagegen war die optische Dichte von VMAT-2+ Fasernin den untersuchten striatalen

Arealen, im Vergleich zur Kontrollgruppe, um fast 35% auf 23,7 ± 4,3 /mm2 (p < 0,001)

bei der SIV/+AIDS Gruppe reduziert (s. Abb 4.1B). Die Dichte von VMAT-2+ Fasern in

der SIV/-AIDS Gruppe (33,5 ± 4,3 /mm2; p > 0,05) war nicht verändert im Vergleich zu

der Kontrollgruppe. Die AIDS-bedingte Abnahme der VMAT-2+ Faserdichte im Striatum

konnte durch die antiretrovirale Behandlung (25,1 ± 3,2 /mm2; p > 0,05) nicht wieder das

Normalniveau der Kontrollgruppe errreichen.

Ergebnisse

60

A TH+ Faserdichte B VMAT-2+ Faserdichte

Contro

l

SIV/-A

IDS

SIV/+AID

S

SIV/+AID

S/+ddG0

10

20

30

40

50

60

70

80

90n. s.

*

****

TH+

RO

D

Contro

l

SIV/-A

IDS

SIV/+AID

S

SIV/+AID

S/+ddG

5

15

25

35

45

55

n. s.

n. s.

****

VMA

T2+

RO

D

Abb. 4.4: Effekte der lentiviralen Infektion auf die TH+ sowie VMAT-2+ Innervation des Striatum.

A: TH+ Faserdichte im Striatum: Bestimmung mittels optischer Dichtemessung (ROD: relative optische

Dichte) der verschiedenen Versuchsgruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die ROD zeigt sich im

____ ____

Control

Control

SIV/+AIDS

SIV/-AIDS SIV/-AIDS

SIV/+AIDS

SIV/+AIDS/+ddG SIV/+AIDS/+ddG

Ergebnisse

61

Striatum der an AIDS erkrankten Gruppe deutlich gemindert mit einer nicht vollständigen Erholung der

Fasern durch die antriretrovirale Behandlung.

Die repräsentativen Aufnahmen stammen aus dem medialen Caudatus nahe der Capsula interna, siehe

jeweilige Übersichtsaufnahmen (Control: MO69, SIV/-AIDS: MO92, SIV/+AIDS: MO86, SIV+AIDS/+ddG:

MO76). Man erkennt einen ausgeprägten Faserverlust im Striatum der SIV/+AIDS im Vergleich zur Control.

Marke: 25 µm.

B: Graphische Darstellung der errechneten VMAT-2+ Faserdichte. Man erkennt bei der SIV/+AIDS -Gruppe

eine signifikante Abnahme der VMAT-2+ Fasern im Vergleich zur Control Gruppe. Die antiretrovirale

Behandlung führt nicht zu einer Reversibilität des Faserverlustes.

Die repräsentativen Bilder für die vier Versuchsgruppen sind aus dem medialen Caudatus, nahe der

Capsula interna (Control: MO50, SIV/-AIDS: MO92, SIV/+AIDS: MO76, SIV/+AIDS/+ddG: MO91). Optisch

erkennbar ist die Abnahme der Faserdichte in der SIV/+AIDS und der behandelten-Gruppe im Vergleich zu

der Kontrollgruppe. Marke: 25 µm.

** signifikanter Unterschied mit p < 0,001 und * signifikanter Unterschied mit p < 0,01; n. s., nicht signifikant

p > 0,05; Fehlerbalkendarstellung SEM, Kruskal Wallis One Way ANOVA, post hoc Bonferroni Holm Test.

A TH+ Zellzahl B TH+ Zelle

Contro

l

SIV/-A

IDS

SIV/+AID

S

SIV/+AID

S/+ddG0

1

2

3

4

5

6

7

8

9n. s.

TH+

neur

onal

num

ber/

mm

2

Abb. 4.5: Effekte der lentiviralen Infektion und der antiretroviralen Behandlung auf die TH+ Neuronenzahl im Striatum.

A: Die Grafik illustriert die quantitative Bestimmung der TH+ Zellkörperzahl im Striatum. Es ergeben sich

keine statistischen Unterschiede zwischen den analysierten Versuchskohorten.

B: Repräsentatives Bild zur Darstellung TH+ Neurone im Striatum (blauer Pfeil) eines Tieres von der

SIV/+AIDS Gruppe (MO70), Marke: 50 µm.

n. s., nicht signifikant p > 0,05. Fehlerbalkendarstellung SEM, Kruskal Wallis One Way ANOVA, post hoc

Bonferroni Holm Test.

Ergebnisse

62

4.2.2 Phänotypisierung der TH+ Neurone

Die TH-IHC ermöglicht die Markierung katecholaminerger Neurone. Um die DOPAerge

oder DAerge Dignität der untersuchten TH+ Neurone und Fasern im Striatum genauer

darzustellen, wurde eine Doppel-Immunofluoreszenz für TH und AADC durchgeführt und

mit konfokaler Laserscanningmikroskopie analysiert. Hierbei zeigte sich, dass der

Grossteil (ca. 87%) der untersuchten TH+ Neurone eine Koexistenz mit AADC

aufwiesen (s. Abb. 4.4A). Folgeschnittanalysen dieser TH+/AADC+ Neurone zeigten,

dass sie keine Komarkierung mit VMAT-2 hatten. Diese Neurone werden daher als

"nicht-exozytotische katecholaminerge Neurone" bezeichnet (Weihe et al., 2014).

Eine positive Immunreaktion wurde für VMAT-2 und TH lediglich in Nervenfasern

beobachtet (s. Abb. 4.4B). Sie repräsentieren die monoaminergen Efferenzen in das

Striatum.

A

B

Abb. 4.6: Koexpression von TH und AADC in Neuronen und Fasern sowie von TH und VMAT-2 in Fasern im Striatum.

A: Laserscanning Analyse zeigt, dass einige Neurone und Fasern sowohl TH (links, grün) als auch AADC

(mitte, rot) exprimieren und nach Überlagerung der Fluoreszenzsignale dann gelb erscheinen (rechts). In

den beiden oberen TH+ Neuronen ist AADC koexprimiert, nicht aber in dem rechts unteren TH+ Neuron. Die

Bilder stammen aus dem medialen Striatum, nahe der Capsula interna (MO69, Control).

B: Aufnahmen aus dem Caudatus, nahe der Capsula interna, Kolokalisation von VMAT-2 mit TH in

striatalen Nervenfasern und synaptischen Endigungen. Doppel-IF mit Tyramidverstärkung.

Ergebnisse

63

4.3 Effekte von lentiviraler Infektion und antiretroviraler Therapie auf das cholinerge System im Striatum

Um Aussagen über eine Beeinträchtigung der cholinergen Innervation im Striatum

während der SIV-Infektion treffen zu können, wurde zum einen die optische Dichte von

den ChAT+ und auch VAChT+ Fasern bestimmt, die Anzahl ChAT+ und VAChT+

striataler Neurone erfasst.

4.3.1 Abnahme der VAChT+ Faserdichte bei unveränderter ChAT+ Faserdichte

Interessanterweise hatten die durchgeführten ROD-Analysen der ChAT-Immunreaktivität

keine Veränderung im Striatum der SIV/-AIDS und SIV/+AIDS Gruppen im Vergleich zu

der Control Gruppe ergeben (s. Abb. 4.4A).

Die ROD von VAChT+ Fasern war in der frühen Phase der SIV-Infektion im Vergleich

zur Kontrolle nicht verändert. Jedoch zeigte sich eine signifikante Reduktion der

VAChT+ Faserdichte in der SIV/+AIDS Gruppe, die im Vergleich zu der Kontrollgruppe

um fast 40% (p < 0,001) sank. Die antiretrovirale Behandlung führte nur zu einer

geringen Restitution der cholinergen VAChT+ Innervation (p < 0,05).

Ergebnisse

64

A ChAT+ Faserdichte B VAChT+ Faserdichte

Contro

l

SIV/-A

IDS

SIV/+AID

S

SIV/+AID

S/+ddG0

10

20

30

40

50

60

n. s.C

hAT+

RO

D

Contro

l

SIV/+AID

S

SIV/+AID

S/+ddG0

10

20

30

40

50

60

*

****

VACh

T+ R

OD

Abb. 4.7: Effekte der lentiviralen Infektion und deren antiretroviralen Behandlung auf die ChAT+ und VAChT+ Faserdichte im Striatum.

A: ChAT+ Faserdichte im Striatum: Bestimmung mittels optischer Dichtemessung (ROD: relative optische

Dichte) der verschiedenen Versuchsgruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Quantifizierung der

untersuchten Gewebestücke zeigte keine Unterschiede der ChAT+ Faserdichte.

Die Gruppen-repräsentativen Bilder stammen aus dem medialen Caudatus (Control: MO50, SIV/+AIDS:

MO70, SIV/+AIDS/+ddG: MO89). Marke: 25 µm.

Control

Control

SIV/+AIDS SIV/+AIDS

SIV/+AIDS/+ddG SIV/+AIDS/+ddG

____ ___

Ergebnisse

65

B: Die Grafik illustriert die optische Dichte der VAChT+ Innervation im Striatum. Man erkennt bei der

SIV/+AIDS Gruppe eine signifikante Abnahme der VAChT+ Faserdichte im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die

antiretrovirale Behandlung führt zu einer signifikanten Reduktion des Faserverlustes, kann diese aber nicht

wieder komplett herstellen. VAChT+ Faserdichte illustriert durch Aufnahmen im medialen Striatum. Marke:

50 µm.

** signifikanter Unterschied p < 0,001 und * p < 0,05, n. s., nicht signifikant p > 0,05;

Fehlerbalkendarstellung SEM, Kruskal Wallis One Way ANOVA, post hoc Bonferroni Holm Test.

4.3.2 Abnahme VAChT+ und ChAT+ Neurone ohne Effekt der antiretroviralen Behandlung

Die durchgeführte quantitative Neuronenanalyse ergab im Vergleich zu der

Kontrollgruppe eine Abnahme der Anzahl cholinerger Neurone im Striatum (s. Abb.

4.5A) in der früheren asymptomatischen Phase der SIV-Infektion (SIV/-AIDS) (10,4 ± 0,9

/mm2; p < 0,001), die sich in der SIV/+AIDS Gruppe weiter verstärkte (9,15 ± 0,7 /mm2; p

< 0,001). Die antiretrovirale Behandlung zeigte keine signifikante Besserung der

Neuronenzahl in AIDS im Vergleich zu AIDS ohne Behandlung (9,47 ± 1,9 /mm2; p >

0,05).

Die Anzahl von VAChT+ Neuronenzählung war im Vergleich zu der Control Gruppe

(8,13 ± 0,5) um fast 37% bei der SIV/+AIDS Gruppe (5,14 ± 0,6 /mm2; p < 0,001)

reduziert. Die antiretrovirale führte zu keiner Normalisierung der Neuronenzahl (6,13 ±

0,4 /mm2; p > 0,05).

Ergebnisse

66

A ChAT+ Neurone B VAChT+ Neurone

Contro

l

SIV/-A

IDS

SIV/+AID

S

SIV/+AID

S/+ddG0

5

10

15

n. s.**

****

ChA

T+ n

euro

nal n

umbe

r/ m

m2

Contro

l

SIV/+AID

S

SIV/+AID

S/+ddG0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

n. s.

***

VAC

hT+

neur

onal

num

ber/

mm

2

Abb. 4.8: Effekte der lentiviralen Infektion und der antiretroviralen Behandlung auf die striatale ChAT+ und VAChT+ Neuronenzahl.

A: Graphische Darstellung der ChAT+ Numerik in den vier Versuchsgruppen. Man erkennt bei den

SIV/+AIDS- und SIV/+AIDS/+ddG Gruppen eine signifikante Abnahme der ChAT+ Neuronenzahl im

Vergleich zur Control Gruppe. In der SIV/-AIDS Gruppe ist bereits eine Abnahme der Neuronenzahl

objektivierbar. Unten: Beispielbild der striatalen ChAT+ Neurone (MO89, SIV/+AIDS). Marke: 50 µm.

B: Graphische Darstellung der VAChT+ Numerik in den vier Versuchsgruppen. Die signifikante Abnahme

der VAChT+ Neuronezahl bei der SIV/+AIDS Gruppe ist auch in der mit 6-Cl-ddG behandelten Gruppe zu

beobachten. Unten: Beispielbild der striatalen VAChT+ Neurone (MO50, Control.) Marke: 50 µm.

** signifikanter Unterschied p < 0,001 und * p < 0,05, n. s., nicht signifikant p > 0,05;

Fehlerbalkendarstellung SEM, Kruskal Wallis One Way ANOVA, post hoc Bonferroni Holm Test.

Ergebnisse

67

4.4 GABAerge und glutamaterge Faserdichte bleiben von lentiviraler Infektion unbeeinflusst

Mögliche Effekte einer lentiviralen Infektion auf die Expression vesikulärer

Transmitterproteine für GABA und Glutamat (Typ 1) im Striatum wurden bisher nie

untersucht. Nachstehend sind die Ergebnisse für die ROD für VGAT und VGLUT-1

innerhalb der untersuchten Kohorten dargestellt. Ein Effekt einer lentiviralen Infektion auf

die vesikulären GABAergen und glutamatergen (Typ1) Transmitterproteine im Striatum

konnte nicht nachgewiesen werden. Die Analyse der jeweiligen optischen Faserdichten

ergab annähernd gleiche Werte für die untersuchten Kohorten (s. Abb. 4.6).

A VGAT+ Faserdichte B VGLUT-1+ Faserdichte

Contro

l

SIV/-A

IDS

SIV/+AID

S

SIV/+AID

S+ddG0

10

20

30

n. s.

VGA

T+ R

OD

Contro

l

SIV/-A

IDS

SIV/+AID

S

SIV/+AID

S/+ddG0

10

20

30

40

50

60n. s.

VGLU

T1+

RO

D

Abb. 4.9: Einfluss einer lentiviralen Infektion auf die GABAerge und glutamaterge Faserinnervation im Striatum.

A: Die Quantifizierung der optischen Faserdichte (ROD: relative optische Dichte) für VGAT+. Unten: VGAT+

Faserdichte demonstriert an einem repräsentativen Gewebeschnitt aus dem Putamen, nahe der Capsula

interna (MO74, SIV/+AIDS). Marke: 50µm.

B: Analyse der optischen Faserdichte für VGLUT-1 zeigt keinen Unterschied in den untersuchten Kohorten.

Unten: VGLUT-1+ Faserdichte dargestellt durch ein repräsentatives Bild aus dem Caudatus, nahe der

Capsula interna (MO50, Control). Marke: 50 µm.

n. s., nicht signifikant p > 0,05; Fehlerbalkendarstellung SEM, Kruskal Wallis One Way ANOVA, post hoc

Bonferroni Holm Test.

VGAT+

VGLUT-1+

Diskussion

68

5 Diskussion

Seit der Einführung der cART im Jahre 1996 gilt die HIV-Infektion als eine

behandelbare, jedoch noch immer nicht heilbare Erkrankung. Die gegenwärtige HIV-

Medizin wird bei gestiegener Lebenserwartung der betroffenen Patienten mit einer

Prävalenz neurokognitiver und sensomotorischer Störungen durch HIV selbst von ca.

20 bis 50% konfrontiert (Heaton et al., 2010; Simioni et al., 2010). Ein weiteres

Problem stellt die Limitierung der neuroprotektiven Effekte einer antiretroviralen

Behandlung dar. Forschungsarbeiten belegen, dass der Effekt der cART in Bezug auf

das Maß und die Beständigkeit einer neuroprotektiven Behandlung begrenzt ist

(Sacktor et al., 2001; Brew, 2004; Antinori et al., 2007; Tan und McArthur, 2011). Dies

rückt die Erforschung der HIV-Neuropathologie und neuer Behandlungsstrategien in

den Fokus gegenwärtiger Forschungsarbeiten. Ob eine mögliche Dysfunktion der

vesikuären Speicherung von Neurotransmittern zu der HIV-Neuropathogenese beiträgt,

wurde bisher kaum untersucht.

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss einer lentiviralen Infektion und deren

antiretroviraler Behandlung auf die Expression von vesikulären Transmitterproteinen im

Striatum von Rhesus Affen zu untersuchen. Hierfür wurden histomorphologische

Analysen der Striata für die untersuchten Versuchsgruppen durchgeführt. Ergänzend

wurden die Viruslast sowie die Neuroinflammation über die mikrogliale und astrozytäre

Enzündungsreaktion immunhistochemisch analysiert.

Zunächst werden hier die erhobenen Daten zusammenfassend erläutert und

nachfolgend deren Bedeutung einzeln diskutiert.

Die erhaltenen Ergebnisse legen die Interpretation nahe, dass eine lentivirale Infektion

bereits in der frühen asymptomatischen Phase der SIV/HIV-Infektion zu einer

Beeinträchtigung der DOPA/DAergen und cholinergen Neurotransmitter im Striatum

führt. SIV/HIV schädigt die VAChT+ cholinerge und VMAT-2+ monoaminerge

Innvervation im Striatum. Die antiretrovirale Behandlung mit 6-Cl-ddG normalisiert

weder die SIV-induzierte Reduktion der VAChT+ cholinergen noch die der VMAT-2+

monoaminergen Fasern/Synapsen wieder um. Im Gegensatz dazu wird die SIV-

induzierte Reduktion von TH+ Fasern im Striatum durch die antiretrovirale Behandlung

zu einem großen Teil wieder rückgängig gemacht. Dies deutet auf verschiedene

Effekte der 6-Cl-ddG Behandlung bezüglich der Synthese und Kompartimentierung von

DA hin. Zusätzlich kann eine hier beobachtete Reduktion der cholinergen

instrastriatalen Neurone ein mitverursachender Faktor für die Entstehung von

motorischen Störungen bei Neuro-AIDS sein. Die striatale VGAT+ GABAerge und

VGLUT-1+ glutamaterge Innervation bleiben dagegen während der SIV-Infektion

Diskussion

69

unbeeinflusst. Transiente und oder auch permanente Störungen der

Neurotransmitterhomöostase, die bereits in der frühen, asymptomatischen SIV/HIV-

Infektionsphase beobachtet wurden, erfordern den rechtzeitigen Einsatz von lipophilen,

antiretroviralen Therapeutika.

5.1 Reversibilität der SIV-induzierten mikroglialen Enzündungsreaktion durch die antiretrovirale Therapie

Die Analyse der mikroglialen Entzündungsreaktion erfolgte durch die morphologische

Analyse der Iba-1+ Mikrogliazellen in den Versuchsgruppen. Als einzige ortsansässige

Immunzellen des ZNS leiten die Mikrogliazellen die Immunantwort bei entsprechenden

Stimuli ein. Iba-1 gilt als anerkannter Mikroglia/Makrophagenmarker, welche im

Rahmen von inflammatorischen Prozessen durch eine verstärkte Aktivierung

Änderungen ihrer Morphologie vollziehen. Diese zeigt sich in der Umwandlung ihrer

ruhenden, ramifizierenden, zu einer hypertrophen, aktivierten Form (Kreutzberg, 1996).

Das Ergebniss dieser Arbeit spiegelt auch die Befunde von anderen Arbeitsgruppen

wieder, dass die Viruslast mit dem Vorhandensein von Mikrogliaknötchen und

multinukleären Riesenzellen assoziiert ist, und dass deren Auftreten durch eine BHS-

gängige antiretrovirale Therapie reduziert wird (Depboylu et al., 2004, 2006, 2011; Xing

et al., 2008). Die Mikrogliaaktivierung im Striatum zeigt sich besonders erhöht in der an

AIDS erkrankten Gruppe und erfährt einen Rückgang durch die 6-Cl-ddG Behandlung.

Die SIV-induzierten Veränderungen der Neurotransmitterfunktionalität hingegen treten

auch zum Teil bereits in der asymptomatischen Phase der SIV-Erkrankung, in der

bereits eine Mikrogliaaktivierung nachweisbar ist, auf. Nicht alle hier analysierten

neurochemischen Markerproteine reagieren auf die antiretrovirale Behandlung mit

einer Erholung ihrer Faserdichte/Neuronenzahl. Die offensichtliche Korrelation

zwischen der Viruslast und dem Entzündungsgeschehen im ZNS stützt die bereits

erwähnte Hypothese, dass die virale Replikation das Entzündungsgeschehen triggert.

Die Ergebnisse, dass auch das SI-Virus bei der behandelten Gruppe nicht mehr

nachweisbar ist, zeigt nochmals die Bedeutung und Notwendigkeit einer frühen

therapeutischen Intervention an, bereits zu Beginn der lentiviralen Infektion die

Viruslast im ZNS zu kontrollieren, um nachhaltige Schädigungen zu präventieren.

5.2 Reversibilität der SIV-induzierten Astrozytose durch die antiretrovirale Behandlung

Neben dem Vorkommen aktivierter Mikrogliazellen werden auch aktivierte Astrozyten

im Parenchym des ZNS während einer SIV/HIV-induzierten Neuroinflammation

Diskussion

70

beobachtet. GFAP ist als Hauptstrukturprotein von Astrozyten spezifisch für diese im

ZNS. Im Rahmen von inflammatorischen Prozessen kommt es zu einer Aktivierung und

Proliferation von Astrozyten. In diesen hypertrophierten Astrozyten kommt es zu einer

gesteigerten GFAP-Produktion. Diese veränderte Astrozytenmorphologie und

Zunahme der Astrozytenzahl wird als Astrogliose bezeichnet. Die Veränderungen der

Astrozyten können zu Funktionseinbußen ihrer vielfältigen Aufgaben wie die

Aufrechterhaltung der BHS, die Beteiligung an der neuronalen Signaltransduktion und

auch die Gewährleistung ihrer neuroprotektiven Rolle führen. Diese Auswirkungen

begründen den Bedarf, das Ausmaß einer Astrogliose bei Neuro-AIDS darzustellen.

Die immunhistochemischen Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigen, dass es

bei der an AIDS erkrankten Gruppe zu einer signifikanten Induktion einer Astrogliose

im Striatum kommt. Die antiretrovirale Behandlung erweist sich hier als eine effektive

Therapie. Die hier dargestellte Astrogliose deckt sich mit Ergebnissen

vorangegangener Arbeiten. Sie gilt als ein Kennzeichen der HIV/SIV-Enzephalitis

(Letvin und King, 1990; Weihe et al., 1993; Brew et al., 1995). Neben der reaktiven

Bildung von proinflammatorischen Zytokinen, der Modulation von K+-Kanälen, die zu

einer gesteigerten Depolarisation von Neuronen führt, bewirken sie zusätzlich eine

Verstärkung der Glutamat-Exzitozytose und tragen somit in einem großen Ausmaß zu

der HIV-assoziierten Neuropathologie bei (Ton und Huangui, 2013).

Diese Mechanismen begründen wahrscheinlich auch die in dieser Arbeit beobachtete

Astrogliose in striatalen Geweben von an AIDS erkrankten Tieren und stellen einen

Anreiz für die weitere Erforschung der Rolle einer Astrogliose als möglicher

Mitverursacher der im Striatum beobachteten Störung der Neurotransmission.

5.3 Deutliche Restitution des TH+ Faserverlustes durch die antiretrovirale Therapie

Nigrostriatale DAerge Neurone bilden die größte Quelle für striatale TH+ Fasern. Als

Schrittmacherenzym der Katecholaminsynthese ist TH an der DAergen

Informationsmodulation im Striatum maßgeblich beteiligt. Bekanntermaßen kommt es

während einer lentiviralen Infektion zu einer Störung der DAergen Neurotransmission

im Striatum, die mitursächlich für die Entstehung von Neuro-AIDS angesehen wird (s.

Kapitel 1.2.3.6). Berger und Arendt (2000) benennen die Basalganglien als ein

"Hauptziel der HIV-Infektion". Bereits 1996 bezeichneten Sarder et al. das DA-Defizit

als "neurochemische Basis von Parkinson-Symptomen bei AIDS". Koutsilierie et al.

(2002) wiesen auf die "Beteiligung von DA in der Progression der HAD" hin.

Diskussion

71

Auch in dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine SIV/AIDS-Erkrankung zu einer

signifikanten Reduktion der DAergen (TH+) Faserdichte im Striatum führt. Eine

bekannte Ursache für die Störung der TH-Funktion ist die durch das retrovirale tat-

Protein, das neben der Aktivierung und Beschleunigung der viralen Genreplikation

auch an der Mikrogliaaktivierung beteiligt ist, ausgelöste verminderte Expression der

TH in DAergen Neuronen der SNc. Entsprechend wurden bei AIDS-Patienten

Parkinson-ähnliche motorische Symptome beschrieben (Zauli et al., 2000; D`Aversa et

al., 2005). Das retrovirale Hüllprotein gp120 löste bei Ratten nach striataler Injektion

eine Abnahme der TH+ Faserdichte aus. Neben einem apoptotischen neuronalen

Zelltod und einem Faserverlust im Striatum konnte sogar eine retrograde Degeneration

DAerger Neurone in der SNc beoachtet werden (Nosheny et al., 2006).

Eine bereits im asymptomatischen Stadium der SIV-Infektion beschriebene Störung

der TH+ Faserinnervation (Scheller et al., 2005) konnte dagegen in der vorliegenden

Arbeit nicht bestätigt werden.

Die antiretrovirale Therapie mit dem BHS-gängigen 6-Cl-ddG konnte die SIV-induzierte

Reduktion von TH+ Faser mindern, aber nicht wieder komplett normalisieren. 6-Cl-ddG

wurde als Vertreter der NRTIs speziell für die Erforschung einer antiretroviralen

Behandlung bei Neuro-AIDS entwickelt. Es erfüllt die hierfür notwendigen

Eigenschaften wie eine für die BHS-Gängigkeit notwendige hohe Lipophilie, einen

großen antiretroviralen Effekt und eine Verbesserung der neurologischen Symptome

(Fujii et al., 1998; Otani et al., 1997; Depboylu et al., 2004). Ob eine Behandlung durch

6-Cl-ddG zu einer Erholung der DAergen Faserinnervation im Striatum führt, wurde

bisher nicht untersucht.

Therapeutische Überlegungen, um das zentrale DA-Defizit bei HIV/AIDS-Patienten

wieder auszugleichen, haben zu einer Vielzahl von experimentellen Ansätzen geführt.

Der Versuch, das DA-Defizit mit L-DOPA oder Selegilin wieder auszugleichen, führte

bei SIV-infizierten Affen zu gesteigerten DA-Konzentrationen, aber auch zu einer

Erhöhung der Viruslast und zu einer Zunahme von neuropathologischen Läsionen im

ZNS (Czub et al., 2001). Schlussfolgernd wurde angenommen, dass eine erhöhte

zentrale DA-Verfügbarkeit zu einer Progression von Neuro-AIDS führt. Da DA, neben

seiner Funktion als Neurotransmitter mit neurotoxischem Potential, auch als ein

immunmodulatorisches Molekül die Makrophagenfunktion reguliert, wurde dessen

Einfluss auf die HIV-Neuropathogenese weiter erforscht. Gaskill et al. (2012) gelang

der Nachweis, dass humane Makrophagen die mRNA für alle DA-Rezeptorarten

synthetisieren können. Außerdem konnten sie aufzeigen, dass DA selbst auch die

Sekretion von Zytokinen wie IL-10 moduliert. Erhöhte extrazelluläre DA-

Konzentrationen führen neben einer verstärkten Aktivierung von Makrophagen auch zu

Diskussion

72

einer Steigerung der HIV-Replikation durch die vermehrte Expression von D2-

Rezeptoren in Makrophagen (Gaskill et al, 2009). Eine erhöhte Anzahl von HIV-

infizierten Makrophagen führt durch deren gesteigerte Produktion von neurotoxischen

Substanzen zu einer Progression von Neuro-AIDS (Anderson et al., 2002; Kramer-

Hämmerle et al., 2005; Aquaro et al., 2005). Demnach spielt die HIV-Infektion in

Makrophagen eine zentrale Rolle in der Pathogenese von HAND. Diese Entdeckungen

wurden durch Beobachtungen an HIV-Patienten, die die DA-Konzentration im ZNS

steigernde Drogen wie Metamphetamin oder Kokain konsumierten, bestätigt. Es stellte

sich heraus, dass es dadurch zu gesteigerten DA-Konzentrationen im synaptischen

Spalt kommt, was wiederum zu einer vermehrten Aktivierung von Mikroglia führt und in

der Folge zu einer Erhöhung der zentralen Viruslast sowie zu einer Steigerung der

neuroinflammatorischen Prozesse (Purohit et al., 2011). Ebenfalls im SIV-Modell wurde

der neuroprotektive Effekt einer frühzeitig initiierten Minocyclin-Therapie diskutiert. Das

Tetracyklinderivat Minocyclin führte zu einer Reduktion der Viruslast in den

Basalganglien und zeigte auch einen guten Effekt gegen neuroinflammatorische

Prozesse (Zink et al., 2005; Ratai et al., 2010; Campbell et al., 2011). Daneben

schützte Minocyclin auch vor einem SIV-induzierten striatalen DA-Verlust (Meulendyke

et al., 2012).

Die in dieser Arbeit gezeigten Auswirkungen einer lentiviralen Infektion auf die TH+

Faserdichte im Striatum untermauern die notwendige neuroprotektive Therapie bei

HIV-Patienten. Diese besteht in der Anwendung liquorgängiger antiretroviraler

Substanzen bereits zu Beginn der HIV-Infektion mit dem Ziel, die Viruslast, als den die

AIDS-Neuropathologie bestimmenden Faktor, im ZNS zu supprimieren (Eggers, 2014).

Auch werden die neurotoxischen Effekte einer cART als mögliche Ursache für

neurologische Symptome bei HIV/AIDS-Patienten diskutiert. So zeigten sich

neurokognitive Störungen, die sich nach Absetzen der cART besserten (Al-Kindhi et

al., 2011; Heaton et al., 2011; Grund et al., 2013).

5.3.1 Unveränderte Zahl von TH+ Neuronen im Striatum

TH+ Neurone im Striatum repräsentieren eine Subpopulation von Interneuronen,

genauer die GABAergen Interneurone (s. Kapitel 1.2.2), die ca. 5% der striatalen

Neuronenpopulation ausmachen (Tepper et al., 2010; Unal et al., 2011). In dieser

Arbeit wurden die striatalen TH+ Neurone im Hinblick auf mögliche reaktive

Zellzahlveränderungen im Striatum von SIV-infizierten Affen analysiert.

Die IF-Analyse konnte zeigen, dass es sich bei der Mehrheit der untersuchten Neurone

um TH und AADC koexprimierende Neurone handelt, die kein VMAT-2 haben. Die

Diskussion

73

Expression von TH verleiht ihnen einen DOPAergen Charakter und ihre mehrheitliche

Ausstattung mit AADC zeigt, dass sie zu einer DA-Synthese fähig sind. Der genaue

Mechanismus ihrer möglichen DOPA/DA-Speicherung/Abgabe bleibt jedoch bei

fehlender VMAT-2-Expression unklar. Die Annahme, dass die untersuchten Neurone

eine non-exozytotische VMAT-2-unabhängige Neurotransmission vollziehen, wird

durch den Nachweis von DAT bei TH+ intrastriatalen Neuronen von humanen und

nicht humanen Primaten gestützt (Cossette et al., 2005; Tande et al., 2006; Huot et al.,

2007).

Eine Reihe von Arbeiten haben eine Zunahme der TH+ Neuronenzahl bei DAerger

Denervation des Striatums nachweisen können (Tashiro et al., 1989; Betarbet et al.,

1997; Huot und Parent, 2007; Tandee et al., 2006; Depboylu, 2014; Depboylu et al.,

2014). Diese Beobachtung wird dahingehend interpretiert, dass die TH+ Neurone

einen Kompensationsmechanismus gegen den lokalen DA-Verlust durch eine reaktive

DA-Synthese bewerkstelligen.

Die in dieser Arbeit durchgeführten IHC-Analysen sind im Hinblick auf die kleine

Morphologie der TH+ Neurone im Striatum und die mögliche Überlagerung und

dadurch Verkennung von TH+ Neuronen durch nigrostriatale TH+ Fasern kritisierbar

(Dubach et al., 1997; Mazloom und Smith, 2006). Um die Möglichkeit einer Verzerrung

der Ergebnisse zu minimieren, wurden nur TH+ Neurone mit einer deutlichen zellulären

Morphologie und sichtbarem Zellkern in die Analyse einbezogen.

Eine reaktive Zunahme oder Abnahme der TH+ Neuronenzahl bei Reduktion der TH-

Innervation durch eine lentivirale Infektion konnte in der vorliegenden Arbeit nicht

nachgewiesen werden.

5.4 Bedeutung der irreversiblen Reduktion der VMAT-2+ Faserdichte

In dieser Studie konnte erstmals im Affen-Modell der HIV-Infektion gezeigt werden,

dass eine lentivirale Infektion bei an AIDS erkrankten Tieren zu einer Abnahme der

VMAT-2+ Innervation im Striatum führt. Bemerkenswert ist, dass die antiretrovirale

Behandlung mit dem BHS-gängigen 6-Cl-ddG nicht zu einer Restitution der VMAT-2+

Faserdichte führte. Bei den mit SIV-inokulierten, aber nicht an AIDS erkrankten Tieren

fand sich noch keine Reduktion der VMAT-2+ Faserdichte.

Die weitreichenden Auswirkungen einer beeinträchtigten VMAT-2-Funktion werden in

vielzähligen Arbeiten aufgezeigt. Eine regelrechte vesikuläre Verpackung von DA ist für

die Aufrechterhaltung einer neuronalen Integrität entscheidend. DAerge Neurone

reagieren besonders sensitiv auf inflammatorische Prozesse und oxidativen Stress

Diskussion

74

(Barnum und Tansey, 2010). Das basische zytosolische Milieu führt dazu, dass

extravesikulär gelagerte DA-Moleküle autooxidieren und dadurch hoch reaktive DA-

Quinone und Superoxide bilden. Zusätzlich führt der Metabolismus von DA durch MAO

zur Bildung des Nebenprodukts H2O2, das auch eine hohe toxische Wirkung auf

DAerge Neurone hat (Agrawalet al., 2010). Eine VMAT-2-Hemmung könnte bei

dementsprechend erhöhten zytosolischen DA-Konzentrationen zu einer gesteigerten

Schädigung von Neuronen und Neuronenfortsätzen führen. Vor allem wurde die

Bedeutung und der Ablauf dieser Mechanismen als eine mögliche Ursache für die

Pathogenese des Parkinson-Syndroms untersucht (Burke et al., 2004; Rees et al.,

2009; Goldstein et al., 2001; Zahid et al., 2011; Alter et al., 2013).

Das HIV-tat-Protein, das für die virale Replikation essentiell ist, wird von infizierten

Zellen als ein aktives Protein ausgeschüttet (Dingwall et al., 1989; Ensoli et al., 1990).

Dem tat-Protein wird eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der HAD

zugesprochen (Hudson et al., 2000; Ferris et al., 2008). Auch wird die durch das tat-

Protein bedingte Neurotoxizität als eine die DAerge Dysfunktion bei HIV/AIDS als mit

verursachen diskutiert (Berger und Arendt, 2000). Neben seiner Auswirkung auf die

TH-Expression (s. Kapitel 5.1) wurde das HIV-tat-Protein auch auf eine mögliche

Hemmung von VMAT-2 und somit einer Veränderung der DA-Sequestrierung im

Striatum untersucht. Dafür wurde in die Striata von Ratten das rekombinante HIV-tat1-72

verabreicht. Der Effekt der DA-Aufnahme in synaptosomale Vesikel wurde durch das

tat nachweislich um ca. 35% gesenkt (Theodore et al., 2012).

Die DAerge Neurotransmission wird v. a. durch die biochemische Interaktion zwischen

VMAT-2 und DAT reguliert. Die Wiederaufnahme von DA durch DAT bildet den

Hauptmechanismus für die Regulation des extrazellulären DA-Gehaltes (Gainetdinov

und Caron, 2003). Klinische PET-Studien belegten eine signifikante Reduktion der

DAT-Dichte im Striatum von HIV-Patienten mit HAD (Wang et al., 2004; Chang et al.,

2008). Es wurde angenommen, dass die durch das tat-Protein induzierte Neurotoxizität

durch dessen Reduktion der DAT-Aktivität begründet ist (Ferris et al., 2008; Zhu et al.,

2009). Im experimentellen Rattenmodell stellte sich heraus, dass das tat-Protein neben

einem Proteinkinase C mediierten Mechanismus zur Inhibition der DAT-Aktivität auch

zu einer Reduktion der VMAT-2-Expression führte und somit an der Entstehung der

Dysfunktion der DAergen Neurotransmission bei HIV-Patienten beteiligt war (Midde et

al., 2012). Zusätzlich wird die Auswirkung des tat-Proteins auch durch den Effekt von

sympathomimetisch wirkenden Drogen wie Metamphetamin hervorgehoben. Diese

üben ihre neurotoxische Wirkung an denselben Strukturen wie das tat-Protein aus. Bei

HIV-Patienten, die psychostimulierende Substanzen konsumierten, wurden viel

schwerwiegendere Manifestationen von Neuro-AIDS beobachtet (Bouwman et al.,

Diskussion

75

1998). Bei der experimentellen Exposition von striatalen Zellkulturen von Ratten mit

Metamphetamin und dem tat-Protein wurde deren synergistisch-toxischer Effekt durch

eine Zunahme des oxidativen Stresses und einer Degeneration der DAergen

Terminalen im Striatum aufgezeigt (Theodore et al., 2006a, 2006b).

Die hier durchgeführten IF-Analysen konnten eine Kolokalisation von VMAT-2 in den

meisten TH+ Fasern des Striatums, die hauptsächlich die DAergen Afferenzen aus der

SN und anteilig die serotonergen Fasern aus den Raphe-Kernen repräsentieren,

nachweisen. Die dargestellte Erholung der TH+ Faserdichte durch die antiretrovirale

Therapie zeigt am ehesten eine Regenerationsfähigkeit der DOPA/DAergen

Neurotransmission im Striatum. Die Bedeutung der Reduktion der "protektiven" VMAT-

2+ Faserdichte im Striatum von an AIDS erkrankten Rhesus Affen legt nahe, dass es

bei unzureichender vesikulärer Kompartimentierung zu einer Zunahme der

neurotoxischen Wirkung von DA kommen kann.

Die in dieser Arbeit aufgezeigte Ineffizienz des lipophilen NRTIs 6-Cl-ddG wirft Fragen

für andere adäquate Therapieoptionen auf. VMAT-2 wird gegenwärtig immer mehr als

ein möglicher Angriffspunkt für die Therapie von neurologischen Krankheiten wie

Morbus Huntington, Dystonie, Schizophrenie, Suchterkrankungen, Depressionen oder

Morbus Parkinson diskutiert. VMAT-2 als direktes pharmakologisches Ziel allein oder in

Kombination mit bereits angewendeten Substanzen, würde eine neuartige Modulation

der Neurotransmission durch Aufrechterhaltung der ursprünglichen exozytotischen

Signalvermittlung und deren Termination bewirken. Dieser pharmakologische Ansatz

verspricht eine Reduktion von Nebenwirkungen und Medikamentenresistenzen, die

durch erhöhte synaptische Neurotransmitterkonzentration oder kompensatorische

Veränderungen von Rezeptoraffinitäten oder -expressionen entstehen, wie sie

beispielsweise bei der medikamentösen Behandlung des Morbus Parkinson

beobachtet werden. Bekannte Substanzen, die auf die VMAT-2-Expression wirken

können, sind z. B. der D2-Agonist Pramipexol oder der D1/D2-Agonist Apomorphin.

Neben einer Verstärkung der vesikulären DA-Aufnahme wird ihnen ein

neuroprotektiver Effekt zugesprochen (Truong et al., 2003, 2004). Das

Amphetaminderivat Methylphenidat konnte im Rattenmodell auch die vesikuläre DA-

Aufnahme steigern und somit persistierende DA-Mängel wieder ausgleichen (Sandoval

et al., 2002; Hanson et al., 2004). Bei Metamphetamin-induziertem oxidativem Stress

führte das Hormon PACAP38 zu einer vermehrten VMAT-2-Expression im Striatum

(Guillot et al., 2008).

Leider limitieren die gegenwärtig für VMAT-2 verfügbaren Analyseinstrumente eine

pharmakologische Erprobung von neuen Substanzen. Radioaktive Liganden, die zu

einem besseren Verständnis der VMAT-2-Funktionalität geführt haben, erweisen sich

Diskussion

76

als ungeeignet, um ein großes Studienkollektiv von Versuchstieren zu untersuchen.

Auch die Erforschung von Zellkulturen zeigt eine Limiterung der Validität von in vivo

Experimenten (Bernstein et al., 2014).

5.5 SIV-induzierte Reduktion der ChAT+ und VAChT+ Neuronenzahl bei unveränderter ChAT+ Faserdichte im Striatum

Die im Striatum vorkommenden cholinergen Interneurone bilden nur ca. 2-3% der im

Striatum vorkommenden Neuronenpopulation. Ihre Aufgabe besteht in der Modulation

der GABAergen MSNs, die durch cortikostriatale Efferenzen aktiviert werden, im

Striatum (s. Kapitel 1.2.3.5). Das ACh synthetisierende Enzym ChAT ist ein Marker, um

den Funktionszustand cholinerger Neurone im ZNS beurteilen zu können (Oda, 1999).

Seine Quantifizierung in bestimmten Hirnregionen erlaubt die mögliche Abschätzung

kognitiver Dysfunktionen.

In dieser Arbeit wurden die ChAT+ Neurone im Striatum auf eine durch eine lentivirale

Infektion ausgelöste mögliche Veränderung der Zellzahl untersucht. Die Analysen

ergaben eine bereits in der frühen Phase der SIV-Infektion beginnende und sich nach

Ausbruch der AIDS-Erkrankung weiter steigernde allerdings geringfügige Reduktion

der ChAT+ Neuronenzahl im Striatum. Die antiretrovirale Behandlung hatte keinen

signifikanten Effekt auf die Reduktion der ChAT+ Neurone.

Vergleichbare Ergebnisse wurden im SIV-Modell belegt. Es wurde eine starke

Reduktion der ChAT-Aktivität im Putamen- und Hippokampusgewebshomogenaten

bereits im asymptomatischen Stadium der SIV-Infektion gemessen, die zudem keinen

Zusammenhang mit der Höhe der Viruslast im Gehirn zeigte. Diese frühe ChAT-

Reduktion wurde dahingehend interpretiert, dass eine Dyfunktion cholinerger Neurone

im ZNS auftritt, die die Pathogenese von HAD mit begründen (Koutsilieri et al., 2000).

Dabei wurde nicht gezeigt, ob die cholinerge Dysfunktion durch eine Zerstörung von

cholinergen Neuronen oder durch ein biochemisches ACh-Defizit ausgelöst wurde.

Die Subklassenunterteilung der HAND in asymptomatische (ANI), milde (MND) und

schwere (HAD) Unterformen dient der Beurteilung des Schweregrades einer kognitiven

Beeinträchtigung, die durch eine HIV-Infektion ausgelöst wird. Davon müssen kognitive

Störungenen abgegrenzt werden, die durch Koinfektionen, Malnutrition, psychische

Begleiterkrankungen, Drogenmißbrauch und die medikamentöse Therapie selbst

entstehen (Letendre, 2011). Während sich die Prävalenz von HAND annähernd

unverändert bei ca. 44% der HIV/AIDS-Patienten darstellt, hat sich seit Einführung der

antiretroviralen Kombinationstherapie der Schwerpunkt der Ausprägung zu den

milderen Formen hin verschoben (Elbirt et al., 2015). Die Bedeutung einer frühzeitigen

Diskussion

77

HAND-Diagnostik wird dadurch ersichtlich, dass eine ANI zu einer zwei bis sechsfach

erhöhten Wahrscheinlichkeit für die symptomatische Ausprägung einer HAND führt

(Grant et al., 2014). Die Notwendigkeit einer besseren Erfassung von betroffenen

Patienten hat dazu geführt, dass in den letzten Jahren viele neue Diagnoseelemente

entworfen wurden. Die CHARTER (CNS-HIV-Antiretroviral-Therapy-Effects)-Gruppe

wurde 2002 gegründet und hat als eine der ersten Gruppen antiretrovirale

Medikamente auf ihre Wirksamkeit gegen den ZNS-Befall untersucht. Sie entwarfen

numerische Einstufungsgrade (CPE: CNS-Penetration-Effectiveness-Score) für die

ZNS-Gängigkeit von antiretroviralen Medikamenten, die sich auf die Viruslast in

Liquorproben stützen. Die erzielten Studienergebnisse ergaben jedoch

widersprüchliche Korrelationen zwischen einem hohem CPE-Score und der in den

Studiengruppen beobachteten Ausprägung der kognitiven Beeinträchtigungen. Das

Auftreten von neurokognitiven Symptomen wurde bei nicht nachweisbarer

Virusreplikation im Liquor beobachtet (Marra et al., 2009). Diese Ergebnisse betonen

den neurotoxischen Effekt von ZNS-gängigen HIV-Medikamenten und führen zu

Diskussionen, wie und in welchem Umfang eine antiretrovirale Therapie in der

Behandlung von HAND eingesetzt werden sollte.

Auch die mangelnde Fähigkeit von 6-Cl-ddG, den in dieser Arbeit gezeigten Verlust

von striatalen ChAT+ Neuronen zu verhindern, könnte durch eventuelle neurotoxische

Effekte dieses NRTIs begründet sein. Mögliche neurotoxische Effekte von 6-Cl-ddG

hätten durch eine Erprobung dieses Medikaments an gesunden Versuchstieren

untersucht werden können. Eine weitere Möglichkeit wäre, dass es durch die lentivirale

Infektion bereits in frühen Stadien zu einer irreversiblen Schädigung von cholinergen

Neuronen im Striatum kommt. Inwieweit die hier gemessene Reduktion der ChAT+

Neurone von ca. 13% eine funktionelle Relevanz hat, konnte in dieser Arbeit nicht

näher charackterisiert werden. Die Tatsache, dass es hingegen nicht zu einer

Beeinträchtigung der ChAT+ Faserdichte im Striatum gekommen ist, lässt zusätzlich

vermuten, dass das Ausmaß der cholinergen Dysfunktion striatal noch begrenzt war.

Da die cholinergen Interneurone im Striatum trotz ihrer begrenzten Anzahl eine mit am

stärksten mit ACh ausgestattete Region im ZNS darstellen (s. Kapitel 1.2.3.5), bilden

sie möglicherweise ein großes Potential für Kompensationsmechanismen gegen eine

begrenzte cholinerge Dysfunktion.

Ergänzend zu der Analyse der ChAT+ Neurone wurde die VAChT+ Neuronenzahl auf

mögliche Veränderungen durch eine lentivirale Infektion untersucht. Wie bei den

ChAT+ Neuronen konnte in der an AIDS erkrankten Gruppe eine Reduktion der

VAChT+ Neuronenzahl objektiviert werden, die sich durch die antiretrovirale Therapie

nicht besserte. In Analogie zu der ChAT+ Neuronenzahlanalyse konnte die SIV/-AIDS

Diskussion

78

Gruppe hier leider nicht analysiert werden, da nicht mehr genügend Gewebeschnitte

zur Verfügung standen.

Die in dieser Arbeit nachgewiesene, SIV-induzierte Reduktion der ChAT+ und VAChT+

Neuronenzahl belegt, dass es zu einem irreversiblen realen Verlust von cholinergen

Neuronen im Striatum während der lentiviralen Infektion kommt.

5.6 Bedeutung der nur teilweise reversiblen VAChT+ Faserdichte

Cholinerge Neurone im Striatum bilden die einzige Quelle für die cholinerge Innervation

der MSNs. Die spontane Entladungsrate der cholinergen Neurone gewährleistet einen

hohen extrazellulären ACh-Gehalt (Bennett und Wilson, 1999; Wilson, 2005). Für die

Aufrechterhaltung der cholinergen Neurotransmission sind hohe ACh-Freisetzungen

notwendig. Dies erfordert die effiziente Aktivität von VAChT (Parsons, 2000).

Die Auswirkung einer lentiviralen Infektion auf die VAChT+ Faserdichte im Striatum

wurde bisher nicht untersucht.

Vor Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass die VAChT+ Faserdichte in AIDS bei

Rhesus Affen im frontalen, parietalen und hippocampal-entorhinalen Cortex irreversibel

reduziert ist (Depboylu et al., 2012). In diesem Zusammenhang wurde eine

verminderte COX-1-Expression in den cholinergen Projektionsneuronen des basalen

Vorderhirnkomplexes nachgewiesen (Depboylu et al., 2012). Eine verminderte

Synthese von Prostaglandinen, denen eine neuroptotektive Wirkung zugesprochen

wird, bietet eine Erklärung für die beschriebene Schädigung der Fortsätze und

Terminale von cholinergen Projektionsneuronen (Depboylu et al., 2012). In der

vorliegenden Arbeit wurde auch im Striatum eine durch eine SIV/AIDS ausgelöste

Reduktion der VAChT+ Faserdichte gefunden. Die antiretrovirale Behandlung zeigte

eine nur geringe Minderung der striatalen striatalen VAChT-Innervation. Die

Ergebnisse deuten auf einen Verlust von VAChT+ Fasern bei unbeeinträchtigter

ChAT+ Innervation im Striatum während der SIV-Infektion. VAChT ist ein besserer

Marker für cholinerge Terminalen als ChAT. IHC-Antiköper gegen VAChT erlauben

eine sensitivere Darstellung von cholinergen Terminalen. ChAT ist in den Perikarya

und proximalen/grösseren (Zellkörper-nahen) Fortsätzen konzentriert und in den

Endigungen spärlicher als VAChT exprimiert.

Die Deutung einer VAChT-Funktionsstörung wird durch die gleichzeitige Expression

von VGLUT-3 in cholinergen Neuronen im Striatum erschwert (s. Kapitel 1.3.3). Diese

können sowohl ACh als auch Glutamat speichern und freisetzen (Ren et al., 2011). Es

konnte gezeigt werden, dass ein und dieselben Neuronen an der Modulation von

Diskussion

79

verschiedenen Wegen beteiligt sein können. Die selektive VAChT-Blockierung in

einem eigens hierfür geschaffenem Mausmodell führte neben einer Reduktion der

cholinergen Aktivität im Striatum zu einer Verstärkung der DA-Affinität der MSNs

(Guzman et al., 2011). DA und ACh erfüllen gegensätzliche Funkionen in der

Modulation der striatalen Efferenzen. Die Aufrechterhaltung ihres Gleichgewichts ist

essentiell für die striatale Funktionstüchtigkeit (Calabresi et al., 2000; Zhu et al., 2002).

Die Komplexität der intrastriatalen cholinergen Neurotransmission wurde durch den

Nachweis, dass VGLUT-3 die ChAT-Aktivität beeinflusst, dargestellt. Ein VGLUT-3-

Verlust induzierte bei den untersuchten Mäusen einen hypocholinergen Phänotyp

(Gras et al., 2008). Aus den bisher gewonnen Erkenntnissen über die komplexen

Regulationsmechanismen cholinerger Interneurone im Striatum lassen sich nur vage

Aussagen über das Ausmaß und die Folgen eines cholinergen Funktionsverlustes

treffen.

Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse deuten auf eine Schädigung der synaptischen

cholinergen Neurotransmission, die begründet ist durch ein gestörtes Gleichgewicht bei

der vesikulären Speicherung von ACh. Diese grösstenteils irreversible Schädigung der

cholinergen Neurotransmission legt nahe, dasseinefrühen Intervention mit effizienten,

BHS-gängigen antiretroviralen Medikamenten notwendig ist.

5.7 Keine Beeinträchtigung vesikulärer Speicherproteine für GABA und Glutamat während der SIV-Infektion

Die Analyse eines möglichen Effektes einer lentiviralen Infektion auf die VGAT+ und

VGLUT-1+ Faserdichte im Striatum ergab keine Unterschiede in den untersuchten

Gruppen.

Glutamat, auch bekannt als Exzitotoxin, kann bei einer Dysregulation der

glutamatergen Neurotransmission zu einer Schädigung von Neuronen und deren

Terminalen führen (Doble, 1999; Lynch und Guttmann, 2002). Als wesentlichen

Einflussfaktor hierfür wird die Expressionsart der NMDA-Rezeptoren auf den

glutamatergen Neuronen gesehen (Liu et al., 2007). Zahlreiche Studien erbrachten

Hinweise, dass Glutamat durch seine exzitotoxischen Eigenschaften an der

Entstehung der HAND beteiligt ist. Die HIV-Infektion von Makrophagen und

Mikrogliazellen verursacht eine exzessive Glutamat-Ausschüttung verbunden mit einer

reduzierten Glutamat-Wiederaufnahme (Potter et al., 2013). So wurde gezeigt, dass

das HIV-tat-Protein seine neurotoxische Wirkung auch über eine NMDAR-Aktivierung

entfaltet (Wang et al., 1999). Auch wurde eine neuronale Zellschädigung durch eine

NMDAR-Überaktivierung, die bedingt ist durch die HIV induzierten inflammatorischen

Diskussion

80

Prozesse, gezeigt (Kaul et al., 2001). Zudem wurde bewiesen, dass es bereits im

asymptomatischen Stadium einer SIV-Infektion zu einer Steigerung der Glutamat-

Konzentration kommt (Bossuet et al., 2004). Wegen der Überlegung, dass eine

lentiviral bedingte Dysregulation der glutamatergen Vesikelproteine auch an der

Glutamat-Exzitotoxizität in neuronalen Strukturen beteiligt sein könnte, wurde die

VGLUT-1+ Faserdichte im Striatum analysiert.

Ergänzend zu der Analyse der glutamatergen Vesikelproteine wurden auch die

GABAergen vesikulären Transmitterproteine im Hinblick auf mögliche Veränderungen

untersucht. Da Glutamat und GABA Neurotransmitter sind, die in hohen Mengen in

exzitatorischen und inhibitorischen Neuronen synthetisiert werden, würden

Veränderungen ihrer Faserinnervation auf eine Störung der entsprechenden

Neurotransmission hinweisen. Warum die VGAT+ und VGLUT-1+ Fassern trotz ihres

ubiquitären Vorkommens im ZNS möglicherweise resistenter sind gegenüber

inflammatorischen Prozessen, wie sie nachweislich für eine SIV/HIV-Infektion

beschrieben werden, ist und bleibt unklar. Bisher wurden keine durch eine lentivirale

Infektion bedingten Dysfunktionen GABAerger Neurone und ihrer Fortsätze

beschrieben.

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96

Zubieta JK, Taylor SF, Huguelet P, Koeppe RA, Kilbourn MR, Frey KA. 2001. Vesicular monoamine transporter concentrations in bipolar disorder type I, schizophrenia, and healthy subjects. Biol Psychiatry, 49(2), 110–116.

Anhang

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7 Anhang

7.1 Verzeichnis der akademischen Lehrer

Meine akademischen Lehrer in Marburg waren die Damen/Herren Dres.

Aumüller, Barth, Bartsch, Basler, Bastians, Bauer, Baum, Baumann, Becker A., Becker

K., Becker S., Bein, Bette, Bien, Bösner, Burchert, Cetin, Czubayko, Daut, Depboylu,

Dettmeyer, Dodel, Donner-Banzhoff, Eberhart, Eilers, Ellenrieder, Elsässer, Fendrich,

Fuchs-Winkelmann, Görg C., Gress, Grosse, Grzeschik, Grimm, Hamer, Hertl,

Hildebrand, Hofer, Hofmann, Höglinger, Hoyer, Kann, Kinscherf, Kirchner, Klose,

Knake, Koolman, Kotschulla, Köhler, Krieg, Lill, Lohoff, Maier, Maisch, Martin, Max,

Metzelder, Moll, Moosdorf, Mueller, Müller, Mutters, Neubauer, Nimsky, Oertel, Oliver,

Pagenstecher, Plant, Renz, Richter, Ries, Rolfes, Rothmund, Röhm, Ruchholtz,

Schäfer J., Schäfer M., Schneider, Schütz, Seitz, Sekundo, Steinfeldt, Tackenberg,

Vassiliou, Vogelmeier, Vogt, Wagner, Weihe, Westermann, Werner, Wiegand, Wilhelm,

Wulf, Zemlin.

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7.2 Danksagung

An erster Stelle möchte ich bei Herrn Prof. Dr. E. Weihe, der es mir ermöglicht hat in

seiner Arbeitsgruppe zu promovieren, bedanken. Besonders die intensive Betreuung,

das stets offene Ohr und die vielen Diskussionen haben meine Forschungsarbeit

bereichtert. Seine fachliche Kompentenz und wissenschaftliche Kreativität haben mich

stets inspiriert.

Bei Herrn PD Dr. med. C. Depboylu möchte ich mich ganz herzlich für die hervorragende

Betreuung meiner Doktorabeit bedanken. Seine stetige Bereitschaft, mit mir Fragen und

Probleme zu besprechen und seine Unterstützung bei der Planung und Durchführung

haben mir meine Dissertation ermöglicht. Ebenso möchte ich mich für die große Mühe,

die er in die Korrektur meiner Dissertation investiert hat, bedanken.

Herrn Dr L. E. Eiden (NIH, USA) möchte ich ganz herzlich für die regelmäßigen

Sessions danken, die immer ein Vorankommen meiner Arbeit bedeutet haben.

Mein herzlicher Dank gilt allen Mitarbeitern der AG Weihe für die wundervollen Jahre der

Zusammenarbeit. Besonders bedanken möcht ich mich bei Frau Marion Zibuschka für

die Hilfsbereitschaft und Freundschaft. Auch gilt mein besonderer Dank Herrn Dr. MK

Schäfer, Herrn PD Dr. M. Bette, Herrn Prof. Dr. B. Schütz und Frau Dr. M. Bertoune für

ihre wertvollen Impulse und Hilfestellungen.

Für die finanzielle Unterstützung bedanke ich mich für das Stipendium des Fachbereichs

Medizin der Philipps-Universität Marburg. Herrn Roman Pahl aus dem Institut für

Biometrie und Epidemiologie der Universität Marburg gilt mein Dank für die Kontrolle der

statistischen Analysen.

Einfluss der SIV-Infektion und einer antiretroviralen...

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