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Research Collection
Doctoral Thesis
Untersuchungen über Oligonucleotide mit 2-Deoxy-D-ribose, 2,3-Dideoxy-D-glucopyranose und D-Allopyranose alsZuckerbausteine
Author(s): Giger, Alfred
Publication Date: 1992
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000694127
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Diss. ETH Nr. 9975
UNTERSUCHUNGEN ÜBER OLIGONUCLEOTIDE MIT
2-DEOXY-D-RIBOSE, 2,3-DIDEOXY-D-GLUCOPYRANOSE UND
D-ALLOPYRANOSE ALS ZUCKERBAUSTEINE
ABHANDLUNG
zur Erlangung des Titels
DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt von
ALFRED GIGER
dipl. Chem. ETH
geboren am 17. September 1964
von Entlebuch LU
Angenommen auf Antrag von
Prof. Dr. A. Eschenmoser, Referent
Dr. Ch. Leumann, Korreferent
Zürich 1992
Für Andrea,meinen Vater
und in Erinnerung an
meine Mutter
Ich danke meinem verehrten Lehrer
Herrn Prof. Dr. A. Eschenmoser
unter dessen Leitung ich diese Arbeit ausführen durfte, für sein Interesse an
deren Entstehen, für die anregenden Diskussionen, sowie für die von Ihm
grosszügig gewährte wissenschaftliche Freiheit, dank der auch das eine oder
andere zuweilen überraschende Resultat zustande gekommen war.
Ich danke allen Mitgliedern der Gruppe für die angenehme Atmosphäre,die während meiner Doktorandenzeit geherrscht hat und für den fleissigen
Besuch unseres Weihnachtsfestes im E 33.
Ich will auf keinen Fall versäumen, die Grillparties auf der Terrasse zu
erwähnen, die vom harten Kern der Gruppe (Reto Fischer, Andreas Helg,Peter Lohse und Markus Tarköy) mit bemerkenswerter Häufigkeit veran¬
staltet wurden.
Ich erinnere mich mit grosser Dankbarkeit an den viel zu früh
verstorbenen Dr. J. Schreiber, der mir mit vielen Tips und Hilfen im
Umgang mit der HPL-Chromatographie zur Seite stand. Eine bessere
Kombination von Berater und Techniker konnte man sich nicht vorstellen.
Frau Dr. Dorothea Felix danke ich herzlich dafür, dass Sie für alle
grösseren und kleineren Sorgen immer ein offenes Ohr hatte.
Ich danke allen Leuten, mit denen ich in 'meinem' Labor - dem E 33 -
arbeiten konnte, für das Ertragen meines Ordnungswahns und weiterer
meiner angenehmen und unangenehmen Eigenschaften. Diese tapferenLeute sollten nicht ungenannt bleiben, es waren: Dr. Christian Leumann,
Dr. Robert P. Hammer (Ihm danke ich auch für das Ueberlassen einiger
Resultate.), Dr. Nicolas W. Hird (Seine berühmt-berüchtigten FOAD-Parties
werden unvergesslich bleiben.), Katrin Groebke und Elke Karaus.
Zuhause mussten nicht nur Andrea, sondern auch unsere Freunde Ursula
und Markus meine Launen während der Zeit der Dissertation aushalten.
Ursula danke ich speziell für die Hilfe bei der Uebersetzung des Summarys.Ganz spezieller Dank gebührt Dr. Christian Leumann, der mich in das
grosse, weite Feld der DNA-Chemie führte und mich durch manches
undurchdringlich erscheinende Dickicht leitete. Er war es auch, der unsere
monatliche Zusammenkunft zum Literaturaustausch initiierte. Ich möchte
ihm an dieser Stelle noch für das Ueberlasen einiger seiner Resultate
danken. Ich danke ihm besonders für die grosse Hilfsbereitschaft bei der
Korrektur der Dissertation und für die Uebernahme des Korreferates.
Diese Arbeit wurde vom Stipendienfonds der Basler Chemischen
Industrie und vom Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der
wissenschaftlichen Forschung unterstützt.
-I-
Inhaltsverzeichnis
A Zusammenfassung VII
B Summary X
C Allgemeiner Teil 1
C.l Einleitung und Problemstellung 1
C.2 Synthese der Nucleosidbausteine 10
C.2.1 ß-Homo-deoxyuridin 10
C.2.2 Synthese der a-Nucleosidbausteine 15
C.2.2.1 a-Homo-deoxyadenosin 15
C.2.2.2 a-Homo-thymidin 17
C.2.3 ß-Homo-deoxy-7-carbaadenosin 18
C.2.4 ß-D-Allpyranosyl-isoguanin 27
C.3 Herstellung der Oligonucleotide 33
C.4 Das Paarungsverhalten der Homo-DNA 41
C.4.1 Einführung in die Methodik der DNA Untersuchung 41
C.4.2 Die AT-Paarung 50
C.4.2.1 Einleitende Bemerkungen 50
C.4.2.2 Alternierende AT-Sequenzen von Homo-DNA 51
C.4.3 Die AU-Paarung 55
C.4.4 Zum Problem der AC-Paarung 61
C.4.4.1 Alternierende AC/CA-Sequenzen von Homo-DNA 61
C.4.4.2 Nicht alternierende AC-Sequenzen von Homo-DNA 71
a) Blockweise AC-Sequenzen von Homo-DNA 71
b) ein weiterer Hinweis für die Antiparallelität der 73
AA-Paarung
C.4.5 Gemischtbasige Oligonucleotide 77
C.4.5.1 Schmelzverhalten der einzelnen Oligonucleotide 77
a) DNA-Oligonucleotide 78
-n-
b) Homo-DNA-Oligonucleotide 78
C.4.5.2 Zur Frage der Strangorientierung 84
C.4.5.3 Kreuzungsexperimente von Homo-DNA mit DNA - ein 89
weiterer Beweis für die Autonomie der Homo-DNA
C.4.6 ct-Homo-DNA-Oligonucleotide 93
C.4.7 Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltende Oligonucleo- 96
tide
C.4.7.1 Einführung 96
C.4.7.2 Homo-deoxy-7-carbaadenosin und die Aufklärung der 97
AA-Paarung
C.4.7.3 Beitrag von Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthalten- 101
den Oligonucleotiden zur AC-Paarung
C.4.7.4 Einige neue Informationen zur AT-Paarung 102
C.4.7.5 Der Purin-Purin-Purin Triplex 104
C.5 Herstellung und Eigenschaften von Oligonucleotiden 110
der Allopyranosyl - Reihe mit ß-D-AUopyranosyl-isoguanin
C.5.1 Einleitung 110
C.5.2 Hexamer- und Octameroligonucleotide von ß-D-Allopy- 115
ranosyl-isoguanin
C.5.3 Allo(Gg) und allodg) 118
C.5.4 Allo(G4l4) und allo(GI)4 134
C.5.5 Untersuchungen zur Frage der Strangorientierung von 142
Allopyranosyl-NA (parallel / antiparallel)C.5.6 Zusammenfassung der Eigenschaften von Allopyra- 146
nosyl-NA Oligonucleotiden, die Isoguanin enthalten
C.5.6.1 Gedanken zur Basenpaarung im G2I und im I2G Triplex 146
C.5.6.2 Zusammenfassung der UV-Schmelzkurven und 148
CD-Spektren
C.5.7 Ein Vergleich der GI-Basenpaarung von Homo-DNA vs. 150
Allopyranosyl-NA
D Experimenteller Teil 154
D.l Allgemeine Bemerkungen 154
-m-
D.2 Abkürzungen 164
D.3 Lösungsmittel und Reagenzien 166
D.4 ß-Homo-deoxyuridin 170
D.4.1 l-(4',6'-Di-0-acetyl-^3'-dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)- 170
uracil
D.4.2 H2',3'-Dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)uracil 173
D.4.3 l-{2',3'-Dideoxy-6'-0-[(4/4'-dimethoxytriphenyl)methyl]- 174
ß-D-glucopyranosyl}uracil
D.4.4 l-{4'-CH(2-Cyanoethoxy)(N,N-diisopropylarnino)phos- 176
phino]-2',3'-dideoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)me-
thyl]-ß-D-glucopyranosyl}uracil
D.4.5 l-(2'^'-Dideoxy-6'-(4,4,-dimethoxy)-triphenylmethyl- 179
4'-0-[3-(4-nitro-phenoxycarbonyl)-propionyl]-ß-D-
glucopyranosyD-uracil (Aktivester von ddU)
D.4.6 l-(2',3'-Dideoxy-6'-(4,4'-dimethoxy)-triphenylmethyl- 181
4'-0-[3-(CPG-amido)-propionyl]-ß-D-glucopyranosyl)-
uracil (ddU-CPG-Träger)
D.5 a-Homo-deoxyadenosin 182
D.5.1 N6-Benzoyl-9-(2'^'-dideoxy-a-D-glucopyranosyl)adenin 182
D.5.2 N6-Benzoyl-9-{2',3'-dideoxy-6'-0-](4,4'-dimethoxytriphe- 184
nyl)methyl]-a-D-glucopyranosyl}adenin
D.5.3 N6-Benzoyl-9-(4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N4Sf-diisopropyl- 186
amino)phosphino]-6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)me-
thyl]-2',3'-dideoxy-a-D-glucopyranosyl}adenin
-IV-
D.5.4 N«-Benzoyl-9-{2'^'-dideoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphe- 189
nyl)methyl]-4'-0-[3-(4-nitro-phenoxycarbonyl)propionyl]
-ct-D-glucopyranosyl}adenin und N6-Benzoyl-9-{2',3'-di-
deoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)methyl]-4,-0-[3-(CPG-
amido)propyl]-a-D-glucopyranosyl}-adenin
D.6 a-Homo-thymidin 190
D.6.1 l-(4',6'-Di-0-acetyl-2',3'-dideoxy-a-D-glucopyranosyl)- 190
thymin
D.6.2 l-(2',3'-Dideoxy-a-D-glucopyranosyl)thymm 191
D.6.3 l-{2'^'-Dideoxy-6'-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)methyl]- 192
a-D-glucopyranosy1) thymin
D.6.4 l-{4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopropylamino)phos- 194
phino]-6'-0-[(4,4'-dirnethoxytriphenyl)methyl]-2',3'-di-
deoxy-a-D-glucopyranosyl)thymin
D.6.5 l-{2',3'-Dideoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)methyl]- 197
4'-0-[3-(4-nirro-phenoxycarbonyl)-propionyl]-a-D-gluco-
pyranosyljthymin und l-{2',3'-Dideoxy-6'-0-[(4,4'-dime-
thoxytriphenyl)methyl]-4'-0-[3-(CPG-amido)-propyl]-a-D-
glucopyranosyljthymin
D.7 6-Chlor-7-carbapurin 198
D.7.1 2-Cyano-4,4-diethoxy-ethylbutanoat 198
D.7.2 4-Amino-5-(2',2'-diethoxy)ethyl-6-hydroxy-2-mercapto- 199
pyrimidin
D.7.3 4-Amino-5-(2',2'-diethoxy-ethyl)-6-hydroxypyrimidin 200
D.7.4 7-Carbahypoxanthin 201
D.7.5 6-Chlor-7-carbapurin 201
D.8 ß-Homo-deoxy-7-carbaadenosin 202
-V-
D.8.1 4,6-Di-0-benzoyl-2,3-dideoxy-D-glucose 202
D.8.2 6-Chlor-7-carba-9-(4',6'-di-0-benzoyl-2'^,-dideoxy-ß-D- 204
glucopyranosyl)purin
D.8.3 6-Amino-7-carba-9-(2',3'-dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)- 206
purin
D.8.4 6-(Benzamido)-7-carba-9-(2',3'-dideoxy-ß-D-glucopyrano- 208
syl)purin
D.8.5 6-(Benzamido)-7-carba-9-{2',3'-dideoxy-6'-0-[(4,4'-dime- 210
thoxytriphenyl)methyl]-ß-D-glucopyranosyl}purin
D.8.6 6-(Benzamido)-9-(4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopro- 212
pylamino)phosphino]-2',3'-dideoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxy-
triphenyl)methyl]-ß-D-glucopyranosyl}-7-carbapurin
D.9 ß-D-Allopyranosyl-isoguanin 215
D.9.1 2,6-Dichlor-9-(2',3',4',6'-tetra-0-acetyl-ß-D-allopyranosyl)- 215
purin
D.9.2 6-Amino-2-chlor-9-(ß-D-allopyranosyl)purin 217
D.9.3 2-Allyloxy-6-(N,N-dibenzoyl-amino)-9-(2',3',4',6'-tetra- 219
O-benzoyl-ß-D-allopyranosyDpurin
D.9.4 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-(ß-D-allopyranosyl)purin 221
D.9.5 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{(4',6'-0-tetraisopropyldisi- 223
loxan-1,3-diyl)-ß-D-allopyranosyl)purin
D.9.6 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{2',3'-0-isopropyliden-(4',6'- 225
0-tetra-isopropyldisiloxan-l,3-diyl)-ß-D-allopyranosyl]purin
D.9.7 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{2',3'-0-isopropyliden-ß-D- 227
allopyranosyljpurin
D.9.8 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphe- 229
nyl)methyl]-2',3'-0-isopropyliden-ß-D-allopyranosyl}purin
D.9.9 2-Allyloxy-6-(benzairddo)-9-(4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N- 231
diisopropylamino)phosphino]-6'-0-[(4,4'-dimethoxytri-
phenyl)methyl]-2',3'-0-isopropyliden-ß-D-allopyrano-
syljpurin
-VI-
D.9.10 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphe- 234
nyl)methyl]-2',3'-0-isopropyliden-4'-0-[5-(4-nitropheno-
xycarbonyl)pentyl]-ß-D-allopyranosyl}purinD.9.11 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphe- 236
nyl)methyl]-2',3'-0-isopropyliden-4'-0-[5-(CPG-amido)-
pentyl]-ß-D-allopyranosyl}purin
D.9.12 9-(ß-D-Allopyranosyl)isoguanin 237
D.10 HPLC Reinigung der Oligonucleotide (Tabelle) 239
D.ll Tm-Werte, termodynamische Daten und CD-Daten der 247
Oligonucleotide (Tabelle)
D.12 Bemerkungen zur Nomenklatur 253
E Literaturverzeichnis 254
-vn-
A Zusammenfassung
Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Synthese, Charakterisierung und
besonders der Aufklärung der AU-, AT- und die für die Homo-DNA eigene
AC-Paarung und dem Vergleich mit den analogen Sequenzen in der
natürlichen DNA.
Des weiteren wurden Oligonucleotide in der Reihe der Homo-DNA von
Adenin- und Thymin-haltigen Sequenzen mit a-Konfiguration am
anomeren Zentrum hergestellt und deren Eigenschaften untersucht.
Darauf wurde ein neues Nucleosid, Homo-deoxy-7-carbaadenosin, zur
strukturellen Aufklärung der AA-, AT- und AC-Paarungen, sowie, in
Zusammenarbeit mit K. Zimmermann [81], zur erstmaligen Darstellungeines Purin-Purin-Purin Homo-DNA Triplexes eingeführt. Die Synthesedieses Nucleosids erfolgte in Analogie zu derjenigen in der
Deoxyribofuranosylreihe, die in der Literatur von Seela [39] beschrieben ist.
Die Oligonucleotidsynthese aller Sequenzen erfolgte nach der von
Caruthers [31] und Letsinger [32] eingeführten Phosphoramiditmethode.Die Palette der bisher durch Arbeiten von Böhringer [18], Roth [21] und
Hunziker [22] bekannten Paarungseigenschaften von Homo-DNA konnten
durch die Resultate in dieser Arbeit wie folgt erweitert werden:
- Eine AU-Paarung in Homo-DNA ist deutlich schwächer als eine AT-
Paarung. Die grössere Stabilität der AT-Paarung beruht auf dem
betragsmässig grösseren Enthalpieterm des Paarungsprozesses.- Die AU-, wie auch die AT-Paarung in Homo-DNA Oligonucleotiden sind
stärker als die entsprechenden Paarungen der natürlichen DNA. Die
vergleichsweise grössere Stabilität ist entropisch bedingt.- In der Homo-DNA Reihe existiert eine AC-Paarung. Diese Paarung ist
deutlich schwächer als die entsprechende AT- und AU-Paarung.
Diese schwächere Paarung ist auf einen weniger negativen
Enthalpieterm des Paarungsprozesses zurückzuführen.
- Die AC-Paarung in Homo-DNA kann durch Protonierung des Homo-
deoxycytidins nicht beeinflusst werden.
- Blockweise AC Sequenzen der Homo-DNA Serie (dd(AsCs) und dd(A4C4»
gehen keine AC-, sondern eine AA-Paarung ein.
- Es konnte gezeigt werden, dass die AA-gepaarten Stränge in Homo-DNA
antiparallel orientiert sind.
-Vffl-
a-Homo-deoxy-adenosin- und a-Homo-thymidin-Oligonucleotide paaren
weder mit sich selbst, noch gehen sie eine ocA-aT-Paarung, noch eine
aA-ßT-Paarung ein. Diese Experimente wurden von R.P. Hammer
[82] ausgeführt.
Oligonucleotidstränge von Homo-DNA, die Watson-Crick-artig paaren,
sind antiparallel orientiert. Dieses Resultat wurde in
Zusammenarbeit mit C. Leumann [20] erhalten.
• Homo-DNA paart nicht mit einem entsprechenden parallelen oder
antiparallelen DNA-Komplementärstrang. Dieses Resultat wurde in
Zusammenarbeit mit C. Leumann [20] erhalten.
Oligonucleotide, die Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthalten, paaren nicht
mit sich selbst. Das bedeutet, dass eine AA-Paarung nicht Watson-
Crick-artig gepaart sein kann. Zusammen mit den Informationen
von BOhringer [18] ergibt sich als einzige verbleibende Möglichkeitfür die AA-Paarung in Homo-DNA eine reverse Hoogsteen-artige
Basenpaarung.
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Homo-DNA bildet Purin-Purin-Purin Triplexe wie im Fall von dd(G6) •
dd(l6> • dd(7CHA5-A) gezeigt wurde. Der Schmelzprozess diese
Triplexes erfolgt stufenweise (Arbeiten z.T. von K. Zimmermann [81]
durchgeführt).Eine AC-Basenpaarung in Homo-DNA ist reverse Hoogsteen-artig
verknüpft. Dies folgt aus dem Schmelzexperiment mit Homo-deoxy-
7-carbaadenosin/Homo-deoxycytidin. Unter der Voraussetzung, dass
die Oligonucleotidstränge parallel orientiert sind und die Basen anti
zum Zuckergerüst stehen, muss eine AC-Paarung ebenfalls aus
antiparallel orientierten Oligonucleotidsträngen aufgebaut sein.
-IX-
Die Synthese des Allopyranosyl-isoguanin wurde in Anlehnung an die
Synthese von Homo-deoxy-isoguanosin von Fräser [47] durchgeführt. Die
Schutzgruppenstrategie für Allose wurde von Fischer [50] und Helg [51]
entworfen.
In der Reihe der Allopyranosyl-NA konnten anhand von
Oligonucleotiden, die die Basen Guanin und Isoguanin enthalten die
folgenden neuen Basenpaarungsmuster aufgefunden werden:
- Allo(Ig) zeigte einen deutlich höheren Schmelzpunkt als alle bisher
bekannten Allopyranosyl-NA Oligonucleotide.- AlIoCGsJ/allods) bilden in wässriger Lösung zwei koexistierende Triplexe,
einen (allo(Gg)}2' allo(Ig) mit einer Schmelztemperatur von etwa
81°C und einem {allo(Ig)}2 allo(G8) Triplex mit einer
Schmelztemperatur um 37°C. Bei den Schmelzprozessen scheint es
sich um Triplex-zu-Einzelstrang Uebergänge zu handeln. Im Fall des
G2I Triplex weist die Hybridisierungskurve gegenüber der
Schmelzkurve eine grosse Hysterese von 40°C auf. Dies impliziert
möglicherweise die vorgängige Bildung eines (thermodynamisch
instabileren) Gl-gepaarten Duplexes (Abb. C5.36), der als Rezeptor für
allo(Gg) oder allo(I8) dient.
- Allo(G4l4) scheint ebenfalls ein höheres Assoziat zu bilden.
- Allo(GI)4 scheint im Gegensatz zu aIlo(Gg)/allo(l8) ausschliesslich
Duplexstrukturen zu bilden, die weniger stabil sind als die
entsprechenden Duplexe in der Homo-DNA Reihe oder die Triplexe
des G2I und I2G Typs in Allopyranosyl-NA Oligonucleotiden.- Es bestehen deutliche Hinweise darauf, dass Gl-gepaarte Allopyranosyl-NA
Oligonucleotidsequenzen, die nur Duplexstrukturen bilden, eine
antiparallele Strangorientierung bevorzugen.
-X-
B Summary
The goal of this work is composed of the synthesis, characterisation and
especially the Classification of AU-, AT- and the, for homo-DNA exclusive,
AC-pairing and their comparison with analogous sequences of natural
DNA.
Furthermore, oligonucleotides of the homo-DNA series of adenine- and
thymine- containing sequences with an cc-configuration at the anomeric
center were prepared and their properties examined.
A new nucleoside, homo-deoxy-7-carbaadenosine, was introduced to
elucidate the structure of the AA-, AT- and AC-pairing and to achieve, in
collaboration with K. Zimmermann [81], for the first time a purine-purine-
purine homo-DNA triplex. The synthesis of this nucleoside was performed
analogously to the synthesis of the corresponding 7-carbaadenine
Compound in the DNA series described by Seela and co-workers [39].
The synthesis of all the oligonucleotides followed the phosphoramiditmethod developed by Caruthers [31] and Letsinger [32].
The palette of known pairing characteristics and properties of homo-DNA
oligonucleotides, created by the results of the research done by Böhringer
[18], Roth [21] and Hunziker [22], could thus be enlarged through the results
of this work as follows:
- An AU-pairing is clearly weaker than an AT-pairing in the homo-DNA
series. The greater stability of the AT-pairing is due to the more
negative enthalpy term of the pairing process.
- The AU- as well as the AT-pairing in homo-DNA is stronger than the
corresponding pairing in DNA. This effect is due to entropic factors.
- In homo-DNA there exists an AC-pairing. This pairing is clearly weaker
than the corresponding AT- and AU-pairing. This weaker pairing can
be traced back to the less negative term of enthalpy of the pairing
process.
- The AC-pairing can not be influenced by protonation of the homo-
deoxycytidine.- Blockwise homo-AC sequences (dd(AsCs) und dd(A4C4)) do not pair as AC-
but as AA-base pairs.- One could show, that AA-paired oligonucletide Strands in homo-DNA are
oriented in an antiparallel manner.
-XI-
a-Homo-deoxy-adenosine and a-homo-thiymidine oligonucleotidesneither pair with themselves, nor do they pair in an ccA-aT- or an
otA-ßT- fashion. These experiments were carried out by R.P. Hammer
[82].
Oligonucleotide Strands of homo-DNA which pair in a Watson-Crick
manner are antiparallel oriented. These experiments were carried out
in collaboration with C.Leumann [20].
• Homo-DNA does not pair with its corresponding parallel or antiparallel
complementary DNA oligonucleotide Strand. These experimentswere carried out in collaboration with C.Leumann [20].
Oligonucleotides which contain homo-deoxy-7-carbaadenosine do not pair
with themselves. This means that adenine can not pair with adenine
in a Watson-Crick fashion. Together with the results of Böhringer's
experiments [18] there is only one possibility left for an AA-pairing in
homo-DNA: a reverse Hoogsteen base pairing:
IMHO^ •- »-*
\ 1 »'
Homo-DNA forms a purin-purin-purin triplex as could be shown in the
case of dd(G6) • dd(I6) • dd(7CHA5-A). The melting process of this
triplex takes place stepwise.An AC-pairing in homo-DNA is connected in a reverse Hoogsteen
fashion. This is the conclusion of the melting experiment of a homo-
deoxy-7-carbaadenosine/homo-deoxycytidine oligonucleotide. Given
the condition that the bases are Standing anti to the sugar backbone,
an AC-pairing must be built up by antiparallel oriented
oligonucleotide Strands.
-xn-
The synthesis of allopyranosyl-isoguaninnucleoside was performed
analogous to the synthesis of homo-deoxyisoguaninnucleoside by Fräser
[47]. The strategy of the protecting groups was designed by Fischer [50] and
Helg [51]. In the series of allopyranosyl-NA oligonucleotides, the following
new Information on base pairing was discovered:
- Allods) has a much higher melting temperature than all other examined
allopyranosyl-NA oligonucleotides.- Allo(Gg)/allo(Ig) seems to form two coexisting triplexes, (allo(Gg)}2 • allods)
with a melting temperature of about 81°C and an [allo(Ig)}2 • allo(Gg)
triplex with a melting temperature of about 37°C. Both melting
processes seem to be triplex-to-single Strand transitions. For the G2I
triplex, the hybridisation curve has a large hysteresis of 40°C. This
could possibly mean the prior formation of a (thermodynamicallymore unstable) Gl-paired Duplex (figure C5.36) which can perform as
a receptor for allo(Gg) or allodg) as well as, in particular, build up the
thermodynamically more stable G2I triplex.- Allo(G4I4) seems to form higher associates as well.
- Allo(GI)4 seems to form, in contrary to the allo(Gg)/allo(Ig) System,
exclusively duplex structures which are less stable than the
corresponding duplexes in homo-DNA or the triplexes G2I and I2G in
allopyranosyl-NA oligonucleotides.- There is strong evidence that Gl-paired allopyranose-NA oligonucleotide
sequences which form duplex structures, prefer an antiparallel Strand
orientation.
-1-
C Allgemeiner Teil
C.l Einleitung und Problemstellung
Die chemische Synthese von Adenin durch Pentamerisierung von HCN [1] -
mit anderen Reaktionen einer der Grundpfeiler der präbiotischen Chemie -
kontrastiert stark mit der komplexen enzymatischen Bildungsweise von
Adenosin, welche die Natur einschlagen muss [2].
NH3/H205 HCN
Abb. Cl.l: Reaktionsschema der Oro'schen Adenin-
synthese [1].
Ganz ähnlich liegt auch der Fall der einfachen a-Aminosäuren und der
Kohlehydrate, resp. -phosphate. Es existieren sehr einfache, rein chemische
Zugänge zu diesen Stoffklassen, die biologischen Bildungsweisen sind jedoch
sehr verschlungen. Als Zugang aus einfachen Grundstoffen für die Klasse der
(einfachen) racemischen a-Aminosäuren gilt das Miller'sche Experiment [3].
Glycin, Alanin, Sarcosin,
ß-Alanin, Valin, Asparagin-Röckfluss
säure Glutaminsäure,^-
elektr a-Aminobuttersäure, Glykol-
Entladung säure, Milchsäure, Ameisen¬
säure, Essigsäure, Buttersäure
Hp + H2(g) + CH4(g) + NH3(g)
Abb. C1.2: Aus einfachsten Edukten gelang es Miller [3], verschiedene proteinogene
Aminosäuren und andere organische Säuren darzustellen.
-2- Allgemeiner Teil
Für die Kohlehydrate mit gerader Kohlenstoffzahl fand Butlerow [4] einen
einfachen Zugang durch die Formosereaktion, deren Produkte von Emil Fischer
[5] durch Isolierung des Osazons von d,l-Laevulose konstitutionell abgesichertwerden konnte. Diese Formosereaktion, deren ursprüngliche Bedingungen
Ca(OH)2 in wässrigem Formaldehyd waren, lieferte jedoch eine grosse Vielfalt
der verschiedensten racemischen Triosen, Tetrosen, Pentosen, Hexosen und
höheren Zuckern, sowohl Ketosen, wie auch Aldosen.
Existiert auch für Kofaktorstrukturen (wie z.B. Folsäure, Flavin,
Dihydronicotinsäure, Thiamin, Pyridoxal und die Familie der Porphrinoide) ein
Zugang aus einfachen Grundsubstanzen? In unserer Gruppe wurde die Frageunter anderen von C. Strupp [6] zu beantworten gesucht. Er untersuchte die
mögliche Bildung von Flavinen unter potentiell präbiotischen Bedingungen1.Das Azaanaloge von Dihydronicotinsäure und weitere für andere präbiotischeReaktionen wichtige Bausteine wurden von Y.-B. Xiang [7] hergestellt. U.P.
Trinks [8] stellte aus den präbiotisch zugänglichen Substanzen schliesslich
verschiedene Pteridine, sowie 2,6-Diaminopurin, dessen HydrolyseprodukteGuanin und Xanthin, sowie 2,4-Diaminopyrimidin und seine
Hydrolyseprodukte Uracil und Cytidin her. K. Koch [9] versuchte, ausgehend von
diesen Nucleobasen und verschiedenen Zuckern resp. Zuckerphosphaten, eine
Nucleosidierung unter potentiell präbiotischen Bedingungen durchzuführen,
was aber leider nicht gelang.
J. Ferris und S. Drenkard [10], [11] zeigten einen photolytischen Zugang zum
Aziridin-2-carbonitril aus 2-Aminopropennitril. E. Wagner und J. Guck [12], [13]
setzten dieses Aziridin-2-carbonitril mit Phosphorsäure in homogener und
heterogener Phase zu Glycolaldehydphosphat um (vgl. Abb. C1.3).
1 Die Bedingungen für eine 'präbiotische' Reaktionsführung waren:
- kein molekularer Sauerstoff- kein Wasser
- Ausgangsstoffe: Derivate von Cyanwasserstoff, Cyanacethylen und Ammoniak
- Aktivierung und Katalyse durch: Wärme, Licht, Basen, mineralische Oberflächen ('Säuren'und 'Basen')
nach Y.-B. Xiang [7].
-3- Allgemeiner Teil
H2C=^CN
NH,
hv
[10]
,\ CN H3P04>L-^
[13]CfeHOPO
CN
NH,
H20,80°C
[13]
•0,,HOPO
M•OH
'OH
Abb. C1.3: Konstitutioneller Zusammenhang zwischen 2-Aminopropennitril und
Glycolaldehydphosphat.
Das Glycolaldehydphosphat ist, wie die Arbeiten von Müller und Pi'rscft [14],
[15], [16] zeigten, Edukt der Bildung von racemischen 2,4,6-Hexose-triphosphaten
unter basischen Bedingungen und zusammen mit 0.5 Aequivalent Formaldehyd
zu racemischen Pentose-2,4-diphosphaten.Mit diesem Edukt gelang es, die Produktevielfalt der Formosereaktion drastisch
zu vereinfachen.
Pitsch [16] konnte rac-Pentose-2,4-diphosphat mit ähnlich beeindruckender
Selektivität herstellen. Das Hauptprodukt war hierbei Ribose-2,4-diphosphat.
HgO, NaOH rac-Tetrose-2,4-diphosphatrac-Hexose-2,4,6-triphosphat
P03--Ca*
Art des Zuckers prozentualer Anteil an der
Hexosetriphosphatfraktion
rac-Allose-2,4,6-triphosphat 51
rac-Altrose-2,4,6-triphosphat 18
rac-Mannose-2,4,6-triphosphat 10
rac-Gulose-2,4,6-triphosphat 8
rac-Talose-2,4,6-triphosphat 7
rac-Glucose-2,4,6-triphosphat 5
rac-Idose-2,4,6-triphosphat 3
rac-Galactose-2,4,6-triphosphat 2
-4- Allgemeiner Teil
CHyO, Hfi, NaOH
iP03"Ca**
x>P03-Ca^ rac-Pentose-
—-opcyca" H2o,NaOH 2,4-diphosphaI
CHjOH
Art des Zuckers prozentualer Anteil an der
Pentosediphosphatfraktion
rac-Ribose~2,4-diphosphat 48
rac-Xylose-2,4-diphosphat 25
rac-Arabinose-2,4-diphosphat 16
rac-Lyxose-2,4-diphosphat 11
H^PCTV^NdPOsHsHO
rac.-Hexose-2,4,6-triphosphat(Hauptprodukt: rac-Allose-2,4,6-
triphosphat)
rac.-Pentose-2,4-diphospat(Hauptprodukt: rac-Ribose-2,4-
diphosphat)
Abb.C1.4: Der Weg von 2-Aminopropennitril zu rac-Hexose-2,4,6-triphosphaten und
rac-Pentose-2,4-diphosphaten.
-5- Allgemeiner Teil
In unserer Arbeitsgruppe wurde die Frage gestellt, weshalb ausschliesslich aus
Pentofuranosen und nicht etwa aus Hexopyranosen ableitbare Nucleinsauren
von der Natur ausgewählt wurden "Es war die experimentelle Erfahrung der so
leicht und so selektiv erfolgenden Bildung von Hexose-2,4,6-tnphosphaten aus
Glycolaldehydphosphat gewesen, die uns seinerzeit zur Frage gefuhrt hat
Warum eigentlich hat die Natur Pentosen und nicht Hexosen als
Zuckerbausteine ihrer Nucleinsauren gewählt7 Denn aus chemischer Sicht sind
Hexosen offenbar nicht minder elementare Molekulstrukturen als Pentosen, und
bezuglich einer gegebenenfalls prabiologischen Bildung wäre ersteren eine
vergleichbare (wenn nicht gar höhere) Chance einzuräumen als letzteren
Offenbar müssen es funktionelle, strukturell bedingte und sich schlussendlich
auf Unterschiede in der chemischen Reaktivität beziehende Grunde sein, die für
die letztlich biologische Ueberlegenheit der Pentose-Nucleinsauren gegenüber
nicht (oder nicht mehr7) existierenden Hexose-Nucleinsauren verantwortlich
sind" [17]
Es sollte versucht werden, anhand von direkten Vergleichen der Eigenschaften
von Ohgomeren von Pentofuranose-Ohgonucleotiden und Hexopyranose-
Ohgonucleotiden Unterschiede der Paarungseigenschaften zwischen diesen
beiden grundsatzlich verschiedenen Ohgonucleotidfamihen zu suchen und
aufzuzeigenZur Untersuchung dieser Fragestellung wurde zunächst eine möglichst
einfache Pyranose gewählt Alle strukturellen Vorgaben des Zucker-Phosphat-
Ruckgrats von DNA und RNA sollten so weit wie möglich beibehalten werden
Anstelle einer 3,5-Verknupfung des Zucker-Phosphat-Ruckgrats m DNA, resp
RNA wurde eine 4,6-Verknüpfung in einer Hexose-NA unter Beibehaltung der
ß-Konfiguration am anomeren Zentrum gefordert Um die Synthese der Hexose-
NA Modellverbindung zu Beginn möglichst zu vereinfachen, wurde eine
Hexose ohne die zwei Hydroxygruppen, die nicht an einer
Phosphodiesterbindung beteiligt sind - also die Hydroxygruppen am C(2) und am
C(3) - gewählt Dies erleichterte durch das Wegfallen von zwei Stereogenen
Zentren und das Wegfallen von zwei funktionellen Gruppen, die sonst noch
geschützt werden mussten, die Synthese des Zuckerbausteines und der
Nucleoside
Die synthetisch sehr einfach aus 3,4,6-Tn-O-acetyl-D-glucal zugängliche 2,3-
Dideoxy-D-glucopyranose [18] erfüllt sämtliche oben geforderten Voraus-
-6- Allgemeiner Teil
Setzungen. Sie wurde deshalb in unserem Laboratorium als erste
Modellverbindung verwendet, um Hexose-Oligonucleotide mit
Pyranoseeinheiten zu untersuchen w Homo-DNA.
Der augenfällige Unterschied von Homo-DNA zu 2'-Deoxyribofuranosyl-NA
besteht in einer zusätzlichen Methylengruppe, wodurch der Pentofuranosering
zu einem Hexopyranosering erweitert wird.
0 o
0=P-0" 0=P-0"1 I
o o
VO VyO^Base/•Base T J
+J
<y o^^
o=p-o- 0=P-0"i i
o o
Lo ky.O^Base
0X>Base 0XJh2I I
DNA Homo-DNA
Eine zu Beginn der Arbeiten über Homo-DNA durchgeführte Konfor¬
mationsanalyse [19] zeigte, dass der Wert des endozydischen Torsionswinkels 5
(zur Definition der Torsionswinkel vergleiche man die Abb. C1.5) in der
natürlichen DNA für die Helicität eines DNA-Doppelstranges von grosser
Bedeutung ist.
Im Rahmen von drei wohldefinierten Kriterien (der verallgemeinerte
Anomereffekt soll gültig sein, keine 1,5 Repulsionen und eine gauche-gaucheKonformation am Phospodiestergruppe) existiert nur eine repetitive,
geringstgespannte und paarungsfähige Konformation eines Einzelstrang-
oligonucleotids. Diese Konformation ist linear. Es zeigte sich ferner, dass der
Wert des endozydischen Torsionswinkels für die Helicität der DNA
entscheidend ist. Eine später von Dobler mit dem MacMoMo - Programm
durchgeführte Berechnung der Abhängigkeit der Stranghelicität vom
Torsionswinkel 5 unter folgenden Voraussetzungen: aliphatisches Rückgrat-
-7- Allgemeiner Teil
element mit idealisierten Konformationen (Torsionswinkel: a = - 60°, ß = 180°, y= 60°, 6 = variabel, e = 180°, £ = -60°), Standardbildungslängen (C-C: 1.53 A, C-O:
1.45 A, P-O: 1.60 Ä) und tetraedrische BildungsWinkel, ergab ein Resultat, das in
Abb C1.6 dargestellt ist und dessen dramatische Aussage für sich spricht. Ist der
endozydische Winkel 8 >60°, so wie er dies in Pentose-NA zu sein hat, ergibt sich
obligat eine helicale Struktur des Zucker-Phosphat-Rückgrats des Oligonucleotid-
einzelstrangs.
Oß
'3SKJA
O ^J a H""|^
o^x
Base
Abb. C1.5: Lineare, paarungsfähige Konformation des Homo-DNA-
Einzelstrangs (idealisiert) mit Angabe der Torsionswinkel.
-8- Allgemeiner Teil
I -i Pitch
linear
helical
0 30 60 90 120 150 180 8 [°
6-Ring 5-Ring
Abb. C1.6: Einfluss von 8 auf die Helicität der DNA [19].
Furanose °
II H-UB
1 HO
RNA
(Furanose)
Pvranosen o
__^-p<
| H-i-H
o
II
-o--~\-o-o
-o-
1 HO
Allose-NAHomo-DNA
(als Testnucleotid für Hexose-DNA's und -NA's)
Abb. C1.7: Schematische Darstellung von Oligonucleotiden mit Furanosen und
Pyranosen.
-9- Allgemeiner Teil
Eine Erweiterung des Pentofuranose- zu einem Hexopyranosering als
Zuckerbaustein von Oligonucleotiden führt neben den dramatischen
Auswirkungen auf das Zucker-Phosphat-Rückgrat, wie Abb. C1.6 zeigt, auch zu
einer Aenderung der Lage der Nucleobase relativ zum Zuckerring.Molecular Modelling1 durch Relaxation eines als Startstruktur linear gesetzten
Homo-DNA Oligonudeotideinzelstranges ergaben ebenfalls eine beinahe lineare
Oligonucleotidstruktur für Homo-DNA mit einem Pitch (Ganghöhe) von 120-
130Ä.
Schon die ersten Paarungsversuche, die Mitglieder unserer Forschungsgruppe
(M. Böhringer [18], C. Leumann [20], H.-J. Roth [21] und J. Hunziker [22]) mit
Homo-DNA durchführten, ergaben sehr interessante Ergebnisse.
Die wichtigsten Eigenschaften von Homo-DNA, welche diese Mitarbeiter der
Gruppe gefunden haben, sind:
- Homo-DNA paart mit Homo-DNA, nicht aber mit natürlicher DNA.
- In der Homo-DNA existiert neben der AT- und GC- auch eine AA- und
eine GG-Paarung, die nicht nach dem von Watson und Crick 1953
gefundenen Basenpaarungsmuster assoziieren [23].
- Die Paarungen von Homo-DNA Oligonucleotiden sind deutlich stabiler
als die analogen Paarungen der DNA-Reihe. Die höhere Stabilität
der Basenpaarungen des Duplexes ist auf die weniger ungünstige
(weniger negative) Entropieänderung (AS) beim Paarungsvorgang
zurückzuführen.
- Die Oligonudeotidstränge eines Homo-DNA Duplexes sind antiparallel
orientiert.
- Als Zusammenfassung der Ergebnisse der Schmelzexperimente konnte
eine Reihenfolge der Stärke der Basenpaarung aufgestellt werden:
GC > AA - GG > AT
Problemstellung für die eigenen Arbeiten
Es sollten Daten über das Paarungsverhalten weiterer Homo-DNA
Oligonucleotide beschafft werden, um damit zu Vorstellungen über den
1 Durchgeführt von Prof. Dr. K. Müller (F. Hoffmann-La Roche, Basel)
-10- Allgemeiner Teil
Konstitutionstyp der Basenpaarungen in der Homo-DNA zu gelangen. Parallel
dazu sind auch die analogen DNA-Oligonucleotide zu synthetisieren und mit
den Resultaten der Homo-DNA zu vergleichen.Im Verlaufe der Arbeit stellte sich zudem die Aufgabe der Synthese von Homo-
DNA Oligonucleotiden, die anstelle von Adenin 7-Carbaadenin als Nucleobase
enthalten. Untersuchungen solcher Art modifizierter Oligonucleotide sollte
Auskunft über den Konstitutionstyp der Adenin-Adenin Paarung geben.
C.2 Synthese der Nucleosidbausteine
C.2.1 ß-Homo-deoxyuridin
Nucleosidierungsreaktionen wurden früher jeweils durch Reaktion von
Halozuckern und Quecksilber- oder Silbersalzen der Nucleinsäurebasen
durchgeführt [z.B. 24]. Hubert und Johnson [25] verwendeten O-alkylierte
Pyrimidinbasen und am anomeren Zentrum halogensubstituierte Zucker. Baker
et al. [26] benutzten als Katalysatoren erstmals Lewissäuren, um die Elektrophiliedes C(l') zu erhöhen. Eine weitere Verbesserung wurde von Nishimura et al. [27]
durch Silylierung der Nucleinsäurebasen erzielt. Silylierte Basen sind in den für
Nucleosidierungsreaktionen üblicherweise verwendeten Lösungsmitteln
(CH3CN, 1,2-Dichlorethan) gut löslich, was zu einer viel schnelleren Reaktion in
homogener Lösung führte. Da die Stabilität der silylierten Basen gering ist,
mussten sie jeweils erst kurz vor der Nucleosidierung hergestellt und sofort
verwendet werden. Die logische und äusserst erfolgreiche Weiterentwicklungwurde dann durch H. Vorbrüggen et al. eingeleitet [28]: Sie silylierten die Base in
CH3CN und gaben dann zur homogenen Lösung den Zucker und die Lewissäure
zu. Es konnte, dank geeigneter Lewissäuren, auf die häufig instabilen Halozucker
verzichtet werden. An deren Stelle konnten viel stabilere am O(l) acylierte oder
alkylierte Zucker verwendet werden.
In unserer Forschungsgruppe wurden Nucleosidierungsreaktionen nach der
letztgenannten Methode von Vorbrüggen durchgeführt, da sie in einer einfachen
Reaktionsführung in einem Schritt zum gewünschten Produkt mit guter
Ausbeute führte.
-11- Allgemeiner Teil
ACO
AcO
AcO
MeOH,BF3 Et20^-
Toluol, 40 Min.,
OTJ, 81%
AcO
AcO
-V'OCH,
H2, Pd/C
MeOH, HOAc
3d, RT, 82%
HO
HO
3.2MNaOH
MeOH, 10 Min.
'OCH, 0"C,89%
AcO
AcO
OCH,
OCH,
Abb. C2.1: Synthese der Zuckerbausteine 3 und S für Homo-DNA nach [29].
Der Zuckerbaustein 3 [29], der zur Nudeosidierung verwendet wurde, wurde,
wie von Böhringer beschrieben [18], ausgehend von Triacetylglucal 1 über das
Enopyranosid 2 im Kilolabor der ETH Zürich hergestellt (Abb. C2.1).
Für alle Nucleosidierungsreaktionen mit Purinbasen, die im Rahmen dieser
Arbeit durchgeführt wurden, wurde jeweils 4,6-Dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-D-
methylglucopyranosid 5 verwendet. 5 wurde direkt aus 3 via Abspaltung der
beiden Acetylschutzgruppen an den Hydroxygruppen am C(4) und C(6) in
methanolischem Natriumhydroxid bei 0°C und anschliessender Veresterung der
nunmehr freien Hydroxygruppen mit Benzoylchlorid in Pyridin bei 0°C in einer
Totalausbeute von 69% hergestellt.
Die Nudeosidierung von silyliertem Uracil 6 mit 3 in CH3CN bei 40°C unter
SnCl4-Katalyse verlief in 60% Ausbeute (vgl. Abb. C2.2). Durch Flash
Chromatograpie konnte das a-konfigurierte Nucleosid (20%) abgetrennt werden.
-12- Allgemeiner Teil
AcO-% n JL HMDS> TMSiO, SnCU ^^
^OCH3 H«, X CH3CN,40°C, AcO^\>~-V' "V"
N O 16 h, 60% OH
6
NHyMeOH12 h, RT, 88%
DMTO-v0fy° DMTC,,DMAP,N(E.)3
HO-^ qf^f
Ho^^N-VNH**
HO'^-^N^NHHO ^^ IT Pyridin, 4 h. RT, 93%HO ^^^ jf
O O
9 8
Abb C2 2 Nudeosidierung, Entschutzung und sei Schützen der 6'-Hydroxygruppe als
4,4'-Dimethoxy-tnphenylmethylether (DMT) nach Khorana und Mitarbeiter [30]
Die ß-Konfiguration am anomeren Zentrum von 7 konnte mit einem NOE
Experiment bewiesen werden (vgl Abb C2 3) Einstrahlen auf das Signal des
Protons bei 3 83 ppm (H-C(5')) ergab neben Resonanzen der Protonen am C(3),
C(4) und C(6) einen ausgeprägten NOE am Signal des H-C(l') (5 73 ppm) Das ist
nur bei einer ß-Konfiguration am anomeren Zentrum möglich
o7°
AcO- \ n
-13- Allgemeiner Teil
Abb. C2.3: NOE-Experiment mit 7. Da bei Einstrahlung auf das H-C(5') Proton
das H-CO') ein NOE zeigt, muss es sich bei dem Proton, auf das eingestrahlt
wurde, um ein a-Proton handeln, und die Konfiguration von 7 ist somit ß.
Die Behandlung von 7 mit NH3 gesättigtem Methanol führte zur Abspaltungder Acetylschutzgruppen und lieferte das freie Nudeosid 8 in 88% Ausbeute. Im
Hinblick auf die Oligonudeotidsynthese nach Caruthers [31] und Letsinger [32]
nach der Phosphittriestermethode wurde das freie Nucleosid 8 in Pyridin mit
DMAP und Triethylamin als Hilfreagenzien mit 4,4'-Dimethoxy-
triphenylchlormethan (DMT) an der 6'-Hydroxygruppe verethert, was in über
90% Ausbeute das DMT-gesdiützte Nucleosid 9 lieferte.
Zur Fixierung des ersten Nucleosids an die Festphase "Long-Chain AlkylamineControUed Pore Glass" wurde ein Teil des DMT geschützten Nucleosids 9 in
Pyridin mit Bernsteinsäureanhydrid verestert (vgl. Abb. C2.4). Die Carboxygruppeder resultierenden Säure 10 wurde nadi Gait [33] in Dioxan mit 4-Nitrophenolund DCC umgesetzt. Man erhielt in einer Totalausbeute von 40% über beide
Stufen den sogenannten Aktivester 11 von ß-Homo-deoxyuridin. Umsetzen
dieses Aktivesters 11 bei RT in DMF mit der freien Aminogruppe von "Long
Chain Alkylamine ControUed Pore Glass" lieferte ß-Homo-deoxyuridinbeladenes Trägermaterial 12 (Beladungsdichte: 31 umol/g). Um die nicht mit 11
-14- Allgemeiner Teil
derivatisierten Aminogruppen zu blockieren, wurden diese mit Essigsaure-
anhydrid in Pyridin zu Acetamiden umgesetzt ('capping').
DMTO
HO
f^^Y* Bernstemsaureanhydrid
3_^^0 ^ ^NH DMAP, Pyridin.18 "• RT
Yo
DMTO-
HO,
o 10
4-Nitrophenol, DCC,
Pyridin, Dioxan, 3 S h, RT
40% (über beide Stufen)
t
r^V° r**V<TO—v n
I I. DMTO—V n' '
H Q^£^NyNH DMF, N(B)3, PyrKim o^^H^m
^°
1202N^ ° 11
DMTO-
Abb C2 4 Synthese der an die Festphase gebundenen Starteinheit, ausgehend vom DMT-
geschutzten Nucleosid über den Aktivester
Ausgehend vom DMT-geschutzten Nucleosid 9 wurde der in der
Oligonucleotidsynthese verwendete Baustein, das 4-0-(2-Cyanoethoxy)-
phosphoramidit, nach Koster und Mitarbeitern [34] in CH2CI2 bei RT in über 90%
Ausbeute hergestellt
-. ^O CI-P(OR)(N(.-Pr)2)
DMTO-^ 0fY ('-P^BN DMT°
nu \^ y CH2CI2,1h, RT,91% P-
>^S^
° R0' ^N<lPr>2
ro
NH
R=^^'CN
13
Abb C2 5 Phosphoramidit nach Koster und Mitarbeitern [34]
Diese Cyanoethylschutzgruppe in Phosphoramiditen besitzt gegenüber den
früher verwendeten Methylschutzgruppen den Vorteil, dass sie nicht noch in
-15- Allgemeiner Teil
einem speziellen Schritt entfernt werden muss. Die Methylgruppe musste
jeweils noch extra mit Thiophenol entfernt werden. Die Abspaltung der
Cyanoethylgruppe wird bei basischer Behandlung der Oligonucleotide nach
deren Synthese im gleichen Arbeitsschritt wie die Entfernung der Schutzgruppender Basen und der Ablösung des Oligonucleotids von der Festphase in
wässrigem, konzentriertem Ammoniak ablaufen.
C.2.2 Synthese der a-Nucleosidbausteine
C2.2.1 a-Homo-deoxyadenosin (9-(2',3'-Dideoxy-a-D-glucopyranosyl)adenin)
Die Synthese der Monomereinheiten der a-Nucleoside und die Unter¬
suchungen der daraus hergestellten Oligomere wurden von R.P. Hammer [82]
durchgeführt.Vom Anomerengemisch (14a/14ß nach der Vorschrift von Böhringer [18]
synthetisiert, a : ß jeweils etwa im Verhältnis von 3 : 4 erhalten), das man nach
der Nucleosidierungsreaktion erhielt, konnte das ß-Anomere auf der
benzoylgeschützten Stufe selektiv kristallisiert werden. Versuche, dieses auch für
das a-Anomere durchzuführen, misslangen.
Es gelang allerdings, auf der Stufe des N6-Benzoyl-9-(2',3'-dideoxy-a,ß-D-
glucopyranosyl)-adenin 15 das a-Anomere bis zu einem Verhältnis a : ß > 20 :1,
wenn auch mit schlechter Ausbeute (< 10%), durch Kristallisation aus heissem
Methanol und Zugabe von CH3CN anzureichern, wobei das ß-Anomer in
Lösung blieb (Abb. C2.6).
Dieses a-Nudeosid wurde nach Standardverfahren an der 6'-Hydroxygruppe als
4,4'-Dimethoxy-triphenylmethylether selektiv blockiert, was 16 in 70% Ausbeute
ergab. Dieses wurde unter gegenüber anderen Nucleosiden leicht modifizierten
Bedingungen mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-cyanoethoxyphosphin und Kata¬
lyse durch Diisopropyl-ammoniumtetrazolid in die von unserer Gruppe
verwendete Form des Phosphoramidits 17 in 73% Ausbeute überführt.
Ausgehend vom DMT-geschützten a-Nucleosid 16, wurde analog dem ß-
Nucleosid von Homo-deoxyadenosin der Aktivester 18 und dann der mit der
ersten Homo-deoxyadenosin Starteinheit versehene CPG-Festphasenträger 19
hergestellt. Nach Blockieren der freien Aminogruppen des "Long Chain
-16- Allgemeiner Teil
Alkylamine CPG" mit Essigsaureanhydrid in Pyridin wurde eine Beladungs¬
dichte der Festphase von 20 0 umol/g bestimmt
o^,ho
BzO
'*\S~-^H. --X 1)THFMeOHH20-5 41 HO'X-"—1BzO
_
U_/ 25NNaOH, 115Eq >N
j\_ 0°C,30Mm \rt //~ NHBz 2 ) Knstalhsation aus
N
NM8OH/CH3CN, 10%
NHBz
14 (aß. 5 1) 15(aß>20 1)
IDMTC1, (i-Pr)2EtN, DMAP,
Pyridin, RT, 4 h, 70%
DMTO DMTO
O V^-|_
P(ORHN(i Pr)2)2 HO^\>—^,F>K.„r,, xN>T *1 Dnsopropylammonium vN~~rf ^1
RONOPrfc^J
1tetrazol,d,CH2CI2 <J N
N-^" RT,4h,73% N-4^"R = "y\*'CN NHBz NHBz
17 16
1) BernstemsäureanhydridDMAP, Pyridin, RT, 16 h
2) 4-Nrtrophenol, DCC,Dioxan, RT, 4 h,
42% (über beide Stufen)
DMTO CPG-NHZ, DMF, Pyridin,l N(Et)3, RT, 14 h DMTO
<~~»' \ Beladungsdichte 20 0 umol/g lQ
NHBz OjN ^^ 7NHBz
19 18
Abb C2 6 Syntheseschema zur Verlangerungseinheit (Phosphoramidit) 17 und zum
Festphasentrager 19 von a-Homo-deoxyadenosin
-17- Allgemeiner Teil
C2.2.2 a-Homo-thymidin (l-(2',3'-Dideoxy-a-D-glucopyranosyl)thymin)
Nach der Vorschrift von Roth [21] wurde mittels Trimethylsilylchlorid und
Hexamethyldisilazan erschöpfend silyliertes Thymin mit Methyl-4,6-0-diacetyl-
2,3-dideoxy-a,ß-D-glucopyranosid 3 unter SnCU - Katalyse in CH3CN, analog der
modifizierten 'Silyl-Hilbert-Johnson' Methode von Vorbrüggen [28], zu den
entsprechenden Nucleosiden 20a und 20ß umgesetzt. Das aus dieser Reaktion
erhaltene Anomerengemisch konnte sehr leicht durch 'flash'-Chromatographie
aufgetrennt werden.
Analyse der Kopplungskonstanten der Zuckerringprotonen im :H-NMR und
NOE-Experimente von Roth [21] belegen klar, dass beim Acetylderivat 20a von a-
Homo-thymidin ein Pyranosesessel mit axialen Substituenten am C(4') und C(5'),dafür aber einem aequatorialen Basensubstituent am C(l') vorliegt.
Die Hydrolyse der Esterfunktionen nach der Vorschrift von Roth [21] durch
Stehenlassen der Lösung von 20a in mit NH3 gesättigtem Methanol führte in
75% Ausbeute zu a-Homo-thymidin 21 (vgl. Abb. C2.7). Die 6'-Hydroxygruppe
von 21 wurde in Pyridin mit 4,4'-Dimethoxy-triphenylchlormethan umgesetzt.
Man erhielt in 51 % Ausbeute das am 0(6') als 4,4'-Dimethoxy-
triphenylmethylether geschützte Nucleosid 22.
Die Herstellung des Phosphoramiditbausteins 23 erfolgte wiederum wie
diejenige zum Phosphoramidit von a-Homo-deoxyadenosin mit Bis-(N,N-
diisopropylamino)-cyanoethoxyphosphin und Diisopropylammoniumtetrazolidin CH2CI2 mit 74% Ausbeute. Die Aktivestersynthese 24 und das Beladen der
Festphase CPG mit dem a-Homo-tymidin 25 wurde, in Anlehnung an die bei ß-
Homo-thymidin von Roth [21] erfolgreich durchgeführte Synthese, ausgeführt.
25 konnte nach Blockieren der noch nicht reagierten freien Aminogruppen der
Festphase mit einer Beladungsdichte von 21.0 umol/g erhalten werden.
Die anschliessende Synthese der Oligonucleotide am DNA-Synthesizer, die
Entschützung und Ablösung der Oligonucleotide von der Festphase, sowie die
Trennung mit HPL-Chromatographie und das Entsalzen über SepPak C18 konnte
nach dem gleichem Muster wie bei den ß-Homo-DNA Oligonucleotiden
durchgeführt werden.
-18- Allgemeiner Teil
HO.
~0-7^N
AcO.
NO' H
NBj/MbOH
0 RT,24h,75%
20a
DMTO,
PtORHNO-PrfefeDiisopropylammonium-tetrazolid, CH2CI2RT, 3 h, 74%
-0-7~~N
O' H
N(i-Pr)2 23
R-^-^V^0
-o-7"~-n
CT H
21
Pyndln, DMTCI
RT, 30 Min,51%
1 ) Bemstainsaureanhydnd,DMAP, Pyndn.RT, 16 h
2)4-Nitrophenol, DCC,
Dioxan, RT, 4 h,
72% (über beide Stufen)
DMTO,
0,N
XXj^tCPG-NHj, DMF, Pyndin,
N(Et)a. RT, 14 h
Beladungsdichte 21 0 |imol/g
-0"7~N
N
O* H
24
DMTO,
&S-W'0-7—N
NO* H
25
Abb.C2.7: Syntheseschema zum Phosphoramidit 23 von a-Homo-thymidin und zur
Festphase 25, die mit CX6')-DMT geschützten a-Homo-thymidin derivatisiert ist.
C.2.3 ß-Homo-deoxy-7-carbaadenosin (Homo-7-deazaadenosin)
Man stellte 7-Carbaadenin 33 nach Davoll [37] her und schützte in Analogie zu
Ness [38] in einer Benzoesäureanhydridschmelze das N(6) als Monobenzoat (vgl.
Abb. C2.8).
-19- Allgemeiner Teil
4.5 Eq K2CQ3,1.0 cq r\2w3, n
/V^°V^ ?, 0.05EqNal^ JX ^\ X
N26 27 28
NHg/MeOHRT,22h
u C 4 h, 34% über 2 Stufen f / |N -TJ c
30_.
N
O
NH,
1 Eq Na, Thioharnstoff, EtOH,4.5 h, 42% ^
NH2
NH»„ .,. , ,
NH.2
Raney-Nickel
in wässr. NaOH-.^
-
->^-„ ^.
'2
H2N' N'^SH'
^' H2N^N
31 32
1.5Eq1NHCIRT,3h,71%
NHBz NH2Benzoesäureanhydrid
N
N-^N*^N-^N*1 140OC-2h.79%
H H
34 33
Abb. C2.8: Synthese des N(6)-benzoylgeschützten 7-Carbaadenin nach Davoll und Ness [37] und
[38].
Nucleosidierungsversuche von 34 mit 4,6-Dibenzoyl-2,3-dideoxy-methyl-a-D-
glucopyranosid 5 nach der Methode von Vorbrüggen [28] blieben trotz
Variationen der Silylierungsreagenzien und verschiedener Lewissäuren
-20- Allgemeiner Teil
erfolglos. Es wurden jeweils nur Edukte (5 und 34) sowie das Dibenzoylglucal 35
isoliert.
BzO
BzO--V*-~0v \^0V-^ BZ0^X.C|
35 36a/36ß
Seela und Mitarbeiter [40] beschrieben bei ihrer Synthese zum 9-(2'-Deoxy-ß-D-
ribofuranosyl)-7-carbaadenin1 einen Weg, der über eine SN2-artig verlaufende
Substitution eines am anomeren Zentrum C(l) halogensubstituierten Zuckers, 6-
Chlor-7-carbapurin 41 und KOH unter phasentransferkatalytischen Bedingungenin CH3CN verlief. Er verwendete dabei den von Hofer beschriebenen
Chlorozucker 2-Deoxy-3,5-di-0-(4-toluoyl)-l-chlor-a-D-ribofuranose.Auf Anregung aus diesen Arbeiten wurde analog der Vorgehensweise von
Hofer [24] l-Chlor-4,6-dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-D-glucopyranose 36 und 6-Chlor-7-
carbapurin (vgl. Abb. C2.9) hergestellt.
1 In der Natur existiert auch ein Nucleosid mit 7-Carbaadenin als Base, nämlich das sogenannteTubercidin (9-(ß-D-Ribofuranosyl)-7-carbaadenin). Es hat antivirale Eigenschaften und wurde von
Nishimura et al. [25] aus Streptomyces Arten isoliert. Tolman et al. [26] bestimmten die Struktur und
synthetisierten Tubercidin aus Tetra-O-acetyl-(jl-D-ribofuranose) und 8-Brom-7-carba-7-cyanopurinin einer Schmelze zu einem Nucleosid, woraus in mehreren Schritten Tubercidin hergestellt wurde.
-21- Allgemeiner Teil
Br^N^Ov0-.
26
NC
39
27
4 5 Eq KjCOa,0 05 Eq Nal
^-
4 h, 48% ff
OH
-oX J
H2N^N^
Raney-Nickelinwassr NaOH
1 h, 64% ff
15Eq1NHCIRT, 48 h, 90%
•yAc
N
28
-VnA
1 Eq Na, Thioharnstoff
EtOH, 3 5 h, 56%^
OH
-° X XH2N N'*SH
38
N-^-N^ 45 Min, 56% N^|\|^
40 41
Abb C2 9 Synthese von 7-Carbahypoxanthm 40 und davon ausgehend 6-Chlor-7-carbapunn 41
nach Davoll [40]
Der Versuch einer Kopplung von 41 mit 36 lieferte nach den identischen
Bedingungen, wie Seela und Mitarbeiter [40] sie angewendet hatten, nur am
anomeren Zentrum hydrolysierten Zucker 44
Die Idee einer Substitution am Chlorozucker 36a/36ß wurde noch nicht
aufgegeben Es wurde also 6-Chlor-7-carbapurin 41 mit 1 Aequivalent
Kahummethoxid (als Losung in Methanol) deprotomert, vom Losungsmittel
befreit und am HV getrocknet Dieses Kaliumsalz des Aglycons 43 wurde in
CH3CN suspendiert und der Chlorozucker 36a/36ß (a • ß > 20 . 1), in CH3CN
gelost, zugegeben (Abb C2.12). Schon nach wenigen Minuten war nach DC-
Kontrolle ein neuer Produktfleck zu sehen, der sich nach Aufarbeitung als
Anomerengemisch des Nucleosidierungsproduktes 42a/42ß (a ß > 1 2)
herausstellte Aus diesem Anomerengemisch Hess sich 42ß selektiv aus
Diethyleter kristallisieren
-22- Allgemeiner Teil
NHBz
neu.N N
BzO
BzO
OCH
34
BzO
BzO^c, * od —-°^?rH
^
3 6 41 42a/42ß
Abb. C2.10: Uebersicht über die zwei prinzipiellen Nucleosidierungsreaktionen, die
versucht wurden.
Der Chlorozucker 36a/36ß, der in dieser Reaktion verwendet wurde, wurde
nach Wilcox et al. [41] durch Reaktion von Tris-(N,N-dimethylamino)phosphinin THF und anschliessender Zugabe von CCI4 bei -78°C in situ aus dem stabilen
4,6-0-Dibenzoyl-2,3-dideoxypyranose 44 hergestellt (vgl. 1H-NMR Abb. C2.13 b))
und ohne weitere Reinigung direkt in die Nucleosidierungsreaktion eingesetzt.
44 wurde durch milde saure Hydrolyse des Methylpyranosids 5 in einem CH3CN-
MeOH-Wassergemisch in 67% Ausbeute hergestellt und in situ weiterverarbeitet.
Die ß-Konfiguration am anomeren Zentrum von 42ß konnte analog dem Fall
von a-Homo-thymidin mit einem NOE Experiment bewiesen werden (Abb.
C2.ll). Einstrahlen auf das Signal des Protons bei 6.21 ppm (H-C(l')) ergab neben
relativ schwachen Resonanzen der Protonen am C(2'), C(3'), C(8) und C(2) einen
starken NOE auf das Signal des H-C(5') (4.31 ppm). Das ist nur bei einer ß-
Konfiguration am anomeren Zentrum möglich.
BzO
VWBzO'
KJ42
-23- Allgemeiner Teil
Abb. C2.ll: NOE-Experiment mit 42ß. Da bei Einstrahlung auf das H-C(l') Proton das
H-C(5') ein NOE zeigt, muss es sich bei dem Proton, auf das eingestrahlt wurde, um ein
a-Proton handeln, und die Konfiguration von 42 ist somit ß.
Nucleosidierungsreaktionen von l-Chlor-a-D-2-deoxyribofuranosid mit dem
Anion der Nucleobasen unter phasentransferkatalytischen Bedingungenverlaufen nach Untersuchungen von Seela und Mitarbeitern [39] SN2-artig unter
Inversion am anomeren Zentrum.
Wir beobachteten als Produkte unserer Nucleosidierungsmethode mit dem
Chlorozucker 36 Anomerengemische der Nucleosidderivate 42a/42ß. Es
interessierte nun, ob die Nudeosidierung in unserem Fall nicht SN2-artig
verläuft, oder aber ob die Synthese des Chlorozuckers 36 nach Wilcox und
Mitarbeitern [41] nicht selektiv zum a-Anomeren führt.
-24- Allgemeiner Teil
Cl
BzO
BzO^V>-^v-OH//\AJ
44 41
BzO
BzO' N^—""Cl
36
BzO
P(N(CH3)2)3
IT-TB^C 1)CH3CN.45Min,RT
a ß = V2
2) Kristallisation aus
Ether 28% (anome-
renrein)
1 Eq KOMe
MeOH,
30 Min, RT
Cl
AJ43
Bz°r=\
Nj^.N
NHa^teOH,'
Autoklav, 20 h,
,'130',C,83%
42
HO,
HO,
l ^\ „.ua)TMSiO, Pyridin, 0°C T F=\
HO"*\^-^ T T b)BzCI,0«C HO^C^-^ T T
37
N^N c)2MNH3aq0°C, 73%
N^.N
38
DMTCI, (i-Pr)2EtN,
Pyndin,45 Mm ,
RT, 77%
OMTO C,-P(0R)-N(,-Pr)2DMTO f=\
Q-^>-^ T « („PrUFtNTHF HO^V^ T IIOIp
RO' SN(i-Pr)2
lu (i-Pr)2EtN,THF,
HO
*'
1h, RT, 59%Njs.N
4039
r. y\^.CN
Abb. C2.12: Syntheseweg zum Phosphoramidit 40 von Homo-deoxy-7-
carbaadenosin.
-25- Allgemeiner Teil
Zur Untersuchung des Mechanismus der Nucleosidierungsreaktion wurde
kristallines l-Chlor-4,6-dibenzoyl-2,3-dideoxy-D-glucopyranose 36a (enthält noch
ca. 15% hydrolysierten Zucker 44; vergleiche JH-NMR Abb. C2.13 a)), das analog
Hofer [24] von K. Groebke [42] direkt aus l-Methyl-4,6-dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-D-
glucopyranose 5 hergestellt wurde, verwendet. Dieser Chlorozucker 36a, der
keine detektierbaren Mengen an ß-Anomeren enthielt, wurde in die
Nucleosidierungsreaktion, die nach dem gleichen Vorgehen wie diejenige mit
dem in situ erzeugten Chlorozucker 36a/36ß durchgeführt wurde, eingesetzt. Im
1H-NMR-Spektrum des Rohproduktes (dazu wurde die Reaktionslösung ohne
Aufarbeitung direkt eingeengt und das 1H-NMR gemessen) konnte neben nicht
nucleosidischen Zuckerspaltprodukten ausschliesslich das ß-konfigurierteNucleosid 42ß detektiert werden (vgl. C2.14 e)).
Das Signal der anomeren Protonen ist scharf von anderen Signalen getrennt.
Bei der Analyse der Nucleosidierungsprodukte ist besonders das Signal des H-
C(2) um 8.6 ppm zur Abschätzung der Anomerenverhältnisse von grosser Hilfe.
a)
Ul-
b)
l_u-JX_
Abb. C2.13: Gemische aus l-Chlor-4,6-0-dibenzoyi-2,3-dideoxy-D-glucopyranosid,
Zuckerspaltprodukten und hydrolysiertem Zucker 44.
a) Kristallines 36a, aus einer Synthese nach Hofer [24]
b) Sowohl a- wie auch ß-Anomere von 36 im Verhältnis von etwa 3:1, wie es bei einer
Chlorozuckersynthese nach Wilcox [41] jeweils entsteht. Eine solche Reaktionslösung wurde,
nach beendeter Reaktion eingeengt, sofort in CDC1S gelöst und davon ein Roh- H-NMR
gemessen.
-26- Allgemeiner Teil
Abb. C2.14: 'H-NMR (Varian Gemini; 200 MHz),
c) Chlorobase 41: die Hauptverunreinigung in den NMR-Spektren der Nucleosidierungsreaktionen
(Spektren d) und e)).
d) NMR-Spektrum einer Nucleosidierungsreaktion mit einem Chlorozucker, hergestellt nach
Wilcox [41] vor der Aufarbeitung (Eduktspektrum von 36ct/36ß zu dieser Reaktion (a:ß=3:l): b»
e) NMR-Spektrum des Rohgemischs der Nudeosidierung mit dem anomerenreinem, kristallinen 1-
Chlor-4,6-0-dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-D-gluco-pyranosid, das nach Hofer [24] hergestellt
worden war (Eduktspektrum von 36a zu dieser Reaktion: a))
f) Anomerenreines ß-Nucleosid 42 nach Umkristallisation aus Diethylether
Aus den beschriebenen Experimenten lässt sich zusammenfassend schliessen,
dass selbst in der Reihe der Dideoxypyranosen eine Nucleosidierungsreaktionunter den angegebenen Bedingungen mit l-Chlor-4,6-0-dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-
D-gluco-pyranosid 36, wie im Fall der Ribofuranosylreihe beschrieben, SN2-artigunter Inversion am C(l) abläuft. Die Tatsache, dass in der beschriebenen
Nucleosidierungsreaktion a/ß-Gemische auftreten, ist auf ein
Diastereomerengemisch des Eduktes 36a/36ß am anomeren Zentrum
zurückzuführen, was sich durch Analyse des JH-NMR Spektrum nach der
Methode von Wilcox et al. [41] hergestellten Chlorozuckers (Abb. C2.13 b)) und
des daraus hergestellten Nucleosidierungsproduktes 42a/42ß (Abb. C2.14 d))
zeigen Hess.
Die Ammonolyse des diacetylierten Nucleosid 48 (vgl. Abb. C2.12) in mit NH3
gesättigtem Ammoniak bei 15 bar und 130°C führte einerseits zur Abspaltung der
-27- Allgemeiner Teil
Benzoylgruppe und anderseits zur Substitution des 6-Chlorsubstituenten, wobei
das ß-Homo-7-carbaadenosin 37 in 83% Ausbeute erhalten wurde Die
anschliessende selektive Monobenzoylierung am N(6) nach Galt [33] in Pyridinnach vorübergehender Blockierung der 4'- und der 6'-Hydroxygruppen als
Trimethylsilylether, anschliessender Zugabe von Benzoylchlond und
ammomakalischer Aufarbeitung (zur Ueberfuhrung des am N(6) dibenzoyhertenin das monobenzoylierte Derivat) lieferte 38 in 73% Ausbeute Die anschliessende
Bereitstellung des Nucleosidbausteins 40 für die Homo-DNA-Synthese führte in
bekannter Manier durch Reaktion des Nucleosiddenvates 38 mit 4,4'-Dimethoxy-
tnphenylchlormethan in Pyridin mit 77% Ausbeute zum 4,4'-Dimethoxy-
triphenylmethylether 39 Die Umsetzung von 39 mit Chloro(2-cyano-
ethoxy)(dnsopropylamino)phosphin in THF mit Ethyldnsopropylamin
(Hunigsbase) als Katalysator führte in einer Ausbeute von 59% zum
Phosphoramidit 401
C.2.4 ß-D-Allopyranosyl-isoguanin2
Die Herstellung des Allopyranosyl-isoguaninnucleosids ist in Abb C2 16
abgebildet Sie erfolgte im wesentlichen analog dem von Fräser [47] und Peng [48]
beschriebenen Syntheseweg zum Homo-deoxy-isoguanosin Dieser Weg
beinhaltete eine Nudeosidierung von 4,6-Dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-D-
methylglucopyranosid 5 und 2,6-Dichlorpunn 49 als Nucleobase
Die Umsetzung des Zuckerdenvates der Allose 48 mit Dichloropunn 49 in
CH3CN mit N,0-Bis-(trimethylsilyl)-acetamid als Silylierungsreagens für die
Nucleobase und Trimethylsilyltrifluormethansulfonat als Lewissaure bei 65°C
lieferte ausschliesslich das ß-konfigunerte Nucleosid 50
Die Umsetzung des Nucleosids 50 in mit NH3 gesättigtem Methanol im
Stahlautoklaven bei 90°C führte zur Abspaltung der Acetylgruppen am
Zucker und zu einer selektiven Substitution des Chlorsubstituenten am C(6) des
1 Die Zuordnung der ,3C-NMR-Signale der Nucleobasen erfolgte in Anlehnung an Seela und
Mitarbeiter [39], [40]2 Das RNA-Analoge - 9-(ß-D-Ribofuranosyl)-isoguanm - wird als Crotonosid bezeichnet Crotonosid
ist kein Bestandteil von natürlichen Oligonucleotiden Die erste Isolierung von Crotonosid aus der
Bohne crotonum tiglium gelang Cherbuhez [43] Die erste Synthese des Nucleosids gelang Davoll
[44] durch Hydrolyse des am N-2 diazotierten 9-(Ribo-ß-D-furanosyl)-diaminopunn Das Aglyconiso-Guanin wurde von Purrmann [45] aus Schmetterhngsflugeln isoliert und von E Fächer bereits
1897 durch Einwirkung von Iodwasserstoffsaure auf 2-Ethoxy adenin dargestellt [46]
-28- Allgemeiner Teil
Basenteils des Nucleosids 50. Man erhielt in 67% Ausbeute das Nucleosidderivat
51. Zum Beweis der ß-Konfiguration von 51 wurde ein NOE-Experiment
durchgeführt. Einstrahlen auf das Signal des Protons bei 6.21 (H-C(D) ergab
neben Effekten an den Resonanzen der Protonen am C(8) und 0-C(2') einen
starken NOE am Signal des H-C(5') (3.75 ppm). Somit ist die ß-Konfiguration des
Nudeosids 51 bewiesen (Kopplungskonstanten vgl. experimenteller Teil).
OH
HOl
51 T
NH,
0 70 60 50 40 30 20 lOppm
Abb. C2.15: NOE-Experiment mit 51. Da bei Einstrahlung auf das H-C(l') Proton das H-C(5') ein
NOE zeigt, muss es sich bei dem Proton, auf das eingestrahlt wurde, um ein a-Proton handeln, und
die Konfiguration von 51 ist somit ß.
Die Schwierigkeit in der Synthese der Allopyranosylisoguaninnucleosidde-rivate 51 und 52 lag in der Handhabung dieser Verbindungen, die, verglichen
mit den entsprechenden Verbindungen der Homo-deoxyribonucleoside, deutlich
-29- Allgemeiner Teil
polarer sind1. Aus diesem Grund wurde der AUylether 52, der durch Reaktion
von 51 mit dem Natriumsalz von AUylalkohol bei 80°C hergestellt wurde, nicht
isoliert. Man neutralisierte nach der Allyletherbildung das überschüssige
Natriumallylat durch Zugabe einer aequimolaren Menge
Pyridiniumhydrochlorid. Das Lösungsmittel (AUylalkohol) wurde am RV
entfernt. Das auf diese Weise erhaltene Nucleosiderivat 52 wurde direkt in
Pyridin mit Benzoylchlorid zum vollständig benzoylierten Derivat 53 umgesetzt.
Die Reaktion von 51 zu 53 konnte mit 80% Ausbeute über zwei Stufen
durchgeführt werden. Die Isolierung des Hexabenzoylderivates 53 aus der
Reaktionslösung und nachfolgende Chromatographie an Kieselgel erfolgte ohne
weitere Probleme nach Standardmethoden.
Die Reaktion zur N(6) monobenzoylierten Verbindung 54 wurde in einem
THF, Methanol, Wassergemisch mit 2N NaOH (0.3 M NaOH) bei 0°C
durchgeführt. Da die Hydrolyse der Esterfunktionen im Zuckerteil im Vergleichzum Homo-deoxy-isoguanosin z.T. langsamer ablaufen, musste die Reaktion
genau mit DC verfolgt werden. Es gibt in dieser Reaktion keinen Zeitpunkt, bei
dem alles Edukt (oder teilweise am Zucker entschützte Zwischenprodukte)
verschwunden sind und gleichzeitig noch keine vollständig debenzoylierte
Verbindung vorhanden wäre. Die Reaktion wird zu dem Zeitpunkt durch
Zugabe von Ammoniumchlorid gestoppt, bei dem ein Maximum an
Produktbildung festzustellen ist.
Die nachfolgende Reaktion mit TIPDSiCk (l,3-Dichlor-l,l,3,3-tetraisopropyl-
disiloxan) nach Markiewicz [49] in Pyridin führte selektiv zum Silylderivat 56
mit einer Ausbeute von 81%. Die Selektivität ist erklärbar durch die kinetisch
bevorzugte Reaktion einer primären Hydroxygruppe mit TIPDSiCk.
1 So z.B. konnte eine Probe von 300 mg 52 konnte nur noch mit reinem Methanol von einer
Kieselgelsäule eluiert werden.
58.lsoguamn
Allopyranosyl-2',3,-0-Isopropyliden-geschutzten6'-DMT-undvonSynthese16C2Abb.
58
f-.„T
/=N
HO'
DMTO
82%h,53
RT,Pyridin,
DMAPDMTa,
°^^%57'
^HO
JN^^55
92%h,4RT,
3EqN(Bu)4F.THF,
56os/
=nyo'\<:-Nieinoxy-/=NyCr\
81%h,54RT,TIPDSiCI2,Pyridin,
t>s,:
Methoxy-
2-o'Sl-pX-U-
^o.54
Toh
°^^,53
VXi35M,„0.,20M,n,NV}£**
^NHBzN^LqL14N^k^N(Bz)2THFMeOHH20-5Ok
/=NHO
/=NBz0
6l51
N^NOHmyV
^NH2^N..O
/=N,
67%h,12
Autoklav90°C,
NhtyMeOH
C|50
N^NOAc
Stufenzweiüber80%
h160°-250C,
BzCIPyridin,
O^^52
HO'80°C,7h
AllylalkoholNa,
HO
7ohN^.NOHTT
ho^-VV^
68%h,931
65°cCH3CN,
Cl
4948
^?BY°»TV^L^AC°
/=N*•=?ClAcO
TeilAllgemeiner-30-
-31- Allgemeiner Teil
Die Wahl für die cychsche 2',3'-0-Isopropyhden - Schutzgruppe für die
Hydroxylfunktionen am C(2') und C(3') ergab sich in Analogie zur
Allosepyranosyl-NA Synthese nach Fischer [50] und Helg [51], welche diese
Schutzgruppe aus praparativ synthetischen Gründen gewählt haben So ist es
infolge der stenschen Verhaltnisse für die vorgesehene Ohgonucleotidsyntheseam DNA-Synthesizer zwingend, eine möglichst kleine Schutzgruppe zu wählen
Eine zyklische Schutzgruppe, welche die 2'- und die 3'-Hydroxygruppe
gleichzeitig schützt, ist aus stenschen Gründen sicherlich gut geeignet Des
weiteren darf die Schutzgruppe bei den Bedingungen, die wahrend der Syntheseam Synthesizer auftreten, nicht abgespalten werden Diese Bedingungen fordern,
dass eine 2,3 -O-Schutzgruppe genugende Stabilität in saurem Milieu aufweisen
muss, so dass sie bei den Detntyherungsbedingungen (3% Tnchloressigsaure in
1,2-Dichlorethan) wahrend des Synthesezyklus nicht auch abgespalten werden
Die Verwendung von Silylschutzgruppen für die 2'-, 3'-Hydroxygruppen ist im
Falle der Allose-NA ausgeschlossen, da bereits die Tetraisopropyldisiloxyl-
schutzgruppe zur Diskriminierung der 4'-Hydroxygruppe hinzugezogen wurde
Unter den Abspaltungsbedingungen für diese Schutzgruppe werden wohl auch
ein Teil der anderen Silylether gespalten Die gewählte Isopropyhden-Gruppelasst sich bei pH 2 innerhalb von 2-4 Stunden bei 55°C vollständig entfernen,
ohne dass Depunnisierung in betrachtlichem Ausmass eintritt1
Das Nucleosiddenvat 55 wurde in CHCI3 wahrend 37 Std mit 2-Methoxypropen
in 76% Ausbeute zum zyklischen Ketal 56 umgesetzt
Die Abspaltung der Tetraisopropyldisiloxan - Schutzgruppe in 56 mit Tetra-
butylammoniumfluond in CHCI3 ergab in 92% Ausbeute 57, das anschliessend in
Pyridin an der nunmehr freien primären Hydroxygruppe zum entsprechenden
4,4 -Dimethoxy-tnphenylmethylether 58 m 82% Ausbeute umgesetzt werden
konnte
Das derart geschützte Nucleosid 58 wurde nach Standardverfahren m CHCI3 mit
91% Ausbeute zum Phosphoramidit 59 umgesetzt (Abb C2 17), das gegenüberden Homo-deoxynbonucleosiden eine deutlich erhöhte Basenempfindhchkeitaufweist (zur Diskussion vgl Fischer [50] und Helg [51]) Deshalb musste 59 unter
milden Bedingungen extrahiert und chromatographiert werden
1 Ein Entschutzungsversuch von A Helg [51] mit einem Dimer ailo(C-G), wobei nur der Zucker von
alloG 2,3 -O-isopropyhden geschützt war, ergab eine Halbwertszeit von etwa 15 Min
-32- Allgemeiner Teil
DMTO^
DMTO
•v
.NHBz k n N. >#k. ^NHBz
^ty CI-P(OR)-N(i-Pr)2
6-V y CHCl3,45Min.,RT,91%R(Y»f\/^ <X ^ N(iPr):
58 59
Abb. C2.17: Synthese des Phosphoramidits 59 aus dem DMT-geschützten Allopyranosyl-
isoguanin 58.
Die Umsetzung von 58 mit Bis-(4-nitrophenyl)-adipinsäureester 61 in THF :
Pyridin = 1:1 führte in einer Stufe mit 58% Ausbeute zum entsprechendenAktivester 62 (Abb. C2.18). Dieser Aktivester wurde anschliessend direkt mit
"Long Chain Alkylamin CPG" in DMF umgesetzt. Man erhielt mit dem
geschützten Startnucleosid beladenenen Träger 63 mit einer Beladungsdichte
von 25.0 umol/g.
-33- Allgemeiner Teil
DMTO_.N
._ NO
^ OzN'
58 61
PyrkJin/THFABK 40°C
DMT9 ,=N
DMF, N(Ef)3, Pyridin, 5.5 d, RT
Beladungsdichte: 25.0 umol/g
DMTONl
NHBz
HI I O N- N
63
Abb. C2.18: Beladen des CPG mit dem verwendeten Allopyranosyl-isoguanin Aktivester
62 zur derivatisierten Festphase 63.
C.3 Herstellung der Oligonucleotide
Es wurden zwei verschiedene Geräte zur Oligonucleotidsynthese verwendet,
die beide nach der von Caruthers [31] und Letsinger [32] entwickelten
Phosphittriestermethode arbeiten. Die zwei DNA-Synthesizer unterscheiden sich
-34- Allgemeiner Teil
insbesondere in der Bereitstellung der Phosphoramiditlösungen und der
postsynthetischen Behandlung der Oligonucleotide.
Synthesizer 380 B DNA Synthesizer (ABI):
Am ABI Synthesizer wurden alle natürlichen DNA-Oligomere und alle, kein
Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltenden Homo-DNA Oligomere hergestellt.
Die Zusammensetzung der Phosphoramiditlösungen wurden nach einer im
experimentellen Teil angegebenen Formel berechnet. Das Syntheseprotokoll, das
für den ABI-Synthesizer verwendet wurde, entspricht genau dem von Böhringer
[18] modifizierten Verfahren mit einer auf 3x2 Min. verlängerten Kopplungszeit
(genaues Protokoll vgl. [18]). Die Ausbeuten der einzelnen Kopplungen wurden
durch Messen der Absorption der Detritylierungslösung relativ zum
vorangegangenen Kopplungsschritt bestimmt. Sie lagen für die Phosphoramidite
der Homo-DNA Reihe durchwegs über 98% je Kopplungschritt.
Nach beendeter Oligonucleotidsynthese wurden die Oligomere noch am Träger
von der letzten Dimethoxytritylschutzgruppe befreit.
Synthesizer Gene Assembler Plus (Pharmacia LKB):
Auf diesem DNA-Synthesizer wurden alle Homo-deoxy-7-carbaadenosin
enthaltenden Oligonucleotide, sowie die Allopyranose-NA Oligonucleotide
hergestellt. Es wurden 0.1 M Phosphoramiditlösungen in CH3CN hergestellt [52].
Auch für diesen Synthesizer wurde das Syntheseprotokoll dahingehend
abgewandelt, dass man die Kopplungszeit auf 6 Min. erhöhte (vgl. nachfolgende
Tabelle 'Synthese des DNA-Synthesizer Gene Assembler Plus').
Die Kopplungsausbeuten lagen für Phosphoramidite von Homo-deoxy-7-
carbaadenosin und Allopyranosyl-guanin um 96% und für Allopyranosyl-
isoguanin zwischen 90 und 95%. Auch beim Pharmacia Synthesizer Modell
wurde jeweils eine Enddetritylierung noch vor der Ablösung des Oligonucleotids
von der Festphase durchgeführt.
-35- Allgemeiner Teil
Syntheseprotokoll des DNA-Synthesizer Gene Assembler Plus (Pharmacia):
Zeitdauer Reagens, das durch die Festphase in
der Kartusche durchgespült wird
Fluss
[ml/min.]
1.0 min. 1,2-Dichlorethan 2.5
2.9 min. 3% Trichloressigsäure
in 1,2-Dichlorethan
2.5
2.0 min. 1,2-Dichlorethan 2.5
0.2 min. CH3CN 2.5
zwei Mal
0.1 min.
0.1 min.
0.1 min.
0.5 M Tetrazollsg. in CH3CN
0.1 M Phosphoramiditlsg. in CH3CN
0.5 M Tetrazollsg. in CH3CN
0.9
0.8
0.9
6.0 min Spülen des Tetrazol/Phosphor-
amiditgemischs durdi die Kartusche
2.5
vier Mal
0.1 min.
0.1 min.
6% DMAP in CH3CN
20% v/v CH3CN:Ac20:sym. Collidin =
50:20:30
1.0
1.0
0.3 min. CH3CN 2.5
0.3 min. 0.01 M I2 in 260 ml CH3CN, 120 ml
H20, 24 ml sym. Collidin
2.5
0.5 min. CH3CN 2.5
Für den nächsten Synthesezyklus wieder bei der ersten
Zeile beginnen
Die Homo-DNA Oligonucleotide und die Allopyranosyl-NA Oligonucleotide
wurden nach erfolgter Synthese auf verschiedene Art weiterbehandelt:
- a) Homo-DNA Oligonucleotide:wurden jeweils für 14 Std. bei 55°C in konz. Ammoniak vom Träger
abgespalten und dabei gleichzeitig von den Schutzgruppen der Nucleobasen und
der Phosphate befreit. Solcherart behandelte Oligonucleotide wurden mittels
HPLC von den Fehlsequenzen bis zu einer geschätzten Reinheit von >97%
abgetrennt. Nach Entsalzen HPLC-gereinigter Oligonucleotide über SEP-PAK
standen die hergestellten Oligonucleotide für weitere Messungen zur Verfügung.
-36- Allgemeiner Teil
Fertig synthetisiertes n-mer
Oligonucleotid nach
(n -1) -SynthesezyklenDMTO
*N(i-PR)2 +11EqTetrazol
2.9 min
Detrltyllerung(3% Tnchloressigsaure
1,2-Dichlorethan)
Capplng(3% DMAP
10%Ac2O
CH3CN/
sym Collidin)
.8 min.
Oxldatlon
(0.01 Ml2
CH3CN/sym. Coliidin/H20)
DMTO-
Starteinheit (4'-Ende) des
zu synthetisierenden n-mer
Abb. C3.1: Schematische Uebersicht über die Oligonucleotid-Festphasensynthese auf dem
Gene Assembler Plus (entspricht, mit Ausnahme der Zeiten und der Reagenzien¬
zusammensetzung, dem Prinzip des ABI 380 A) nach Caruthers [31] und Letsinger [32].
-37- Allgemeiner Teil
- b) Entschützung Guanin oder Isoguanin enthaltender Allopyranosyl-NA
Oligonucleotide:Von Oligonucleotiden, die Isoguanin enthalten, wurden zuerst die Allyl-
schutzgruppen in Anlehnung an Noyori und Mitarbeiter [53] noch am Träger
Palladium(0)-katalytisch entfernt1. Darauf wurde das derart entschützte, immer
noch kovalent an das Trägermaterial gebundene Oligonucleotid für 14 Std. bei
55°C in konz. wässrigem Ammoniak suspendiert. Dabei wurde das
Oligonucleotid von der Festphase gelöst und die restlichen Basen- und
Phosphatschutzgruppen abgespalten. Die so behandelten Oligonucleotidewurden HPL-chromatographisch aufgetrennt. Zur Entfernung der Ketalschutz-
gruppe wurden diese Oligonucleotide in HCl - Lösung bei pH 2.0 gelöst und so
lange bei 55°C belassen, bis ein Optimum zwischen Zersetzungsprodukt und
noch nicht vollständig entschütztem Oligonucleotid eingetreten ist (HPLC -
Kontrolle), was bei jedem Oligonucleotid unterschiedlich lange dauert (vgl.
nachfolgende Tabelle).
Oligonucleotidsequenz Zeitdauer der Entschützung;
pH2.0,55°C
allo(I6) 13 Std.
allo(I8) 16 Std.
aIlo(G4I4) 4.5 Std.
allo(GI)4 5.0 Std.
allo(GGIGII) 4.0 Std.
allo(IIGIGG) 4.0 Std.
Zur Beendigung der Ketalspaltung wurde jeweils ein Ueberschuss an festem
NaHC03 zugegeben und das entsprechende, nunmehr von sämtlichen
Schutzgruppen befreite Oligonucleotid HPL-chromatographisch abgetrennt
(Tabelle Kapitel D.10, Fussnote2 gibt jeweils die Bedingungen für die Trennung
der Oligonucleotide nach der Ketalabspaltung an, während die Bedingungen für
1Bei Allose-NA Oligonucleotiden hat es sich als sehr vorteilhaft erwiesen, die DMT-Schutzgruppedes zuletzt an das Oligonucleotid gekoppelten Nucleotids erst nach Ablösung vom Trägerabzuspalten, was die Abtrennung der kürzeren Oligonucleotide stark vereinfachte. Bei
AUopyranosyl-isoguanin enthaltenden Oligonucleotiden war es jedoch nicht möglich, diese DMT-
Gruppe am Oligonucleotid zu belassen, da sie, wie in einem Vorversuch unter Allylent-schützungsbedingungen gezeigt werden konnte, vermutlich infolge der Reaktionstemperatur nicht
stabil war.
-38- Allgemeiner Teil
die Trennung vor der Ketalspaltung unter der Fussnote1 in derselben Tabelle
angegeben sind). Die produkthaltigen Fraktionen wurden über SEP-PAK entsalzt.
Die Abspaltung der Isopropylidenschutzgruppe der 2',3'-Hydroxygruppen am
Oligonucleotid unter sauren Bedingungen wird am Beispiel von allo(I8)
illustriert (vgl. Abb. C3.2). Der Gradient auf einer Aquapore RP-300, 7 uM war,
mit Ausnahme des Chromatogramms nach 16 Std. (Gradient 0 - 25% B in 30
Min.) bei allen folgenden Chromatogrammen derselbe,nämlich 0 - 30% B in 30
Min.1. Die aufgetragene Menge Oligonucleotid war in jedem Chromatogramm
gleich gross. Die Chromatogramme können also direkt miteinander verglichen
werden.
Es wurden jeweils Proben der Reaktionslösung nach 0 (Edukt), 15 und 30
Minuten, nach 1, 2, 4, 8, und 16 Stunden entnommen und analysiert (Abb. C3.2).
Mit Fortgang der Reaktion ist eine deutliche Zunahme der polareren
Zwischenprodukte zu erkennen, welche partiell entschützten Zwischenpro¬
dukten entsprechen dürften.
Nach zwei Stunden Reaktionszeit bemerkte man schon deutlich den
Produktpeak mit einer Retentionszeit von 13.4 Min. Dessen Intensität nahm mit
der Reaktionsdauer immer mehr zu, während diejenigen der apolaren
Zwischenprodukte immer kleiner wurden. Nach 16 Stunden waren schon erste
Zersetzungsprodukte von allods) (vermutlich Depurinisierungsprodukte) zu
erkennen.
1Laufmittel für die HPL-Chromatographie:- A: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0, H20- B: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0,20% H20,80% CH3CN.
-39- Allgemeiner Teil
r¥-
Wl
—i——i—i—i i—
10 20 30 40 in*n
0 10 20 10 40 min
r-»tI ' I ' 1 • I ' 1 '
0 10 20 30 40 min
, . , 1 1 . , r—
0 10 20 30 40 r
r-Y-
0 10 20 30 40 r
10 20 30 40 II
Waschsignal
Abb. C3.2: Abspaltung der 2,/3,-0-Isopropylidenschutzgruppen von allott,) bei pH 2.0 und 55°C
-40- Allgemeiner Teil
Ein 'Time of Flight'-Massenspektrum1 von allo(I8) mit einer Molmasse des
Monoanions von 2937.5 zeigte eine gemessene Masse von 2932.2 (Abb. C3.3). Die
Abweichung von 5 Masseneinheiten vom berechneten Wert rührt daher, dass
zur Probelösung für dieses Experiment kein Eichgemisch (ein Proteingemisch
aus: Hypertensin M - H+: 1030.2; Synacthen (2932.5); Calcithonin (3416.9); Hirudin
(6962.5)) zugegeben werden konnte. Es mussten deshalb die Kalibrierungsdaten
eines vorangegangenen Experiments übernommen werden. Dieses
Massenspektrum zusammen mit der HPL-Chromatographie zeigte, dass der
gewählte Syntheseweg für Isoguanin-haltige Allopyranosyl-NA Oligonucleotidedurchführbar ist und alle Schutzgruppen vollständig abgespalten werden.
Intensität
-35 0M
CS allo(I8)
-30 0 N
-25 0 l
-200
-15 0
.OS ©
I Ot
-10 0 /
_ SO^^^W^w-v^vJK^
2500 3000 3400
m/z
Abb. C3.3: Time of Flight'-Massenspektrum von allouV, Detektion: negative Polarität.
Dieses Experiment wurde freundlicherweise durch Dr. Schär von der Ciba-Geigy AG ausgeführt.
-41- allgemeiner Teil
C.4 Das Paarungsverhalten der
Homo-DNA
C.4.1 Einführung in die Methodik der DNA
Untersuchung
Zur Untersuchung über das Paarungs- oder Assoziationsverhalten von
Oligonucleotiden wurden verschiedene physikalisch-chemische Methoden
verwendet, die sich schon seit längerem in der DNA-Analytik etabliert hatten.
Das wichtigste in unserer Gruppe verwendete Hilfmittel war die Messung der
Absorption des Oligonucleotids in einer wässrigen Lösung (üblicherweise 150
mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1-150 uM an Oligonucleotid) als Funktion der
Temperatur bei konstanter, geeigneter Wellenlänge. Das Lösen einer DNA-
Paarung entspricht im allgemeinen einem kooperativen Prozess, verbunden mit
einer Aenderung der molaren Extinktion des Oligonucleotids. Wenn nun die
Absorptionen als Funktion der Temperatur aufgetragen wird, ergibt sich dabei
eine charakteristische, sigmaoide Kurvenform. Nichtpaarende Oligomere zeigen,
je nach Sequenz und Nucleotidbasenart, eine lineare Zu- oder Abnahme der
Absorption1. Diese lineare Aenderung der molaren Extinktion wird verursacht
durch das Aufheben einer gering geordneten räumlichen Struktur, wie sie
beispielsweise durch Basenstapelungswirkungen benachbarter aromatischer
Systeme verursacht werden [54]2, [44].
Die typische sigmaoide Form der Schmelzkurve in DNA - Duplexen wird auf
die diskontinuierliche Entordnung der Nucleobasen zueinander während des
Schmelzprozesses und dem damit einhergehenden 'destacking' der Basen
zurückgeführt [56], [57]. Dieses 'destacking' führt wie bei den nichtpaarenden
Oligomeren zu einer, diesmal aber - wie schon erwähnt - diskontinuierlichen
Zunahme der Absorption.
1 Nimmt die Absorption der Lösung zu, spricht man von einer Hyperchromie, nimmt sie hingegen ab,von einer Hypochromie.2 In dieser Literaturstelle wird auch eine kurze, theoretische Herleitung über die Absorptions¬änderung beim Uebergang vom Doppel- zum Einzelstrang gegeben.
-42- allgemeiner Teil
Temperatur¬erhöhung
denaturieren
Helix, geordnet,Basen gestapelt
Coil (Knäuel),
ungeordnet, nicht
gestapelt
Abb. C4.1: Schematische Darstellung des Schmelzprozesses. Die ungeordnete Anordnung
(Einzelstrang) entspricht dem Zustand in 'geschmolzenem' Zustand, in dem keine
Beinflussung der n-Systeme von benachbarten Basen ('base stacking') mehr stattfindet.
Um ein deutlicheres Bild über den Dissoziationsprozess zu erhalten und um
relative, miteinander vergleichbare Werte zu erhalten, wurde nicht die
Absorption, sondern die relative, prozentuale Hyperchromizität (in einigen
wenigen Fällen die Hypochromizität so z.B. für alle Gl-gepaarten Oligonucleotide
der Homo-DNA Reihe1) verwendet.
Hyperchromizität:
% H(T) = 100%{D(T)-D°
D°
Dabei ist D° der minimalste Absorptionswert im Laufe eines Schmelz- oder
Hybridisierungsexperiments [54, Seite 22], [55, Seit 409].
Die sogenannte Schmelztemperatur Tm-Wert ist definiert als diejenige
Temperatur, bei der die Hälfte der totalen Menge Oligonucleotid gepaart und die
andere Hälfte ungepaart vorliegt. Im Hyperchromizität vs. Temperatur -
Diagramm ist sie bestimmt als die Temperatur, bei der die Absorption genau
1 Für alle Oligonucleotide und Oligonucleotidgemische gilt, dass ihre Absorption im allgemeinenwährend des Schmelzens steigt. Wenn aber im temperaturabhängigen UV mindestens ein
isosbestischer Punkt vorkommt, wie er z.B. bei allen (GD-Oligonucleotiden auftritt, so muss gelten,dass die Absorption in gewissen Wellenlängenbereichen während des Schmelzprozesses abnimmt.
-43- allgemeiner Teil
zwischen der Maximal- und der Minimalabsorption der Oligonucleotidlösung
liegt (Abb. C4.2) [58]. Bei asymmetrischen Schmelzkurven wurde die
Schmelztemperatur als Schnittpunkt der Winkelhalbierenden der beiden
Tangenten der Schmelzkurve mit der Schmelzkurve bestimmt (Abb. C4.2).
Winkel
halt
ITC] ITC]
Abb. C4.2: Graphische Bestimmung des Schmelzpunktes. Die gestrichelten Linien sind die
Tangenten an die Schmelzkurven (dicke, geschwungen Kurven) im Hyperchromizität vs.
Temperatur - Diagramm.
Die eben angegebene Variante konnte sehr gut bei erkennbaren Basislinien
angewendet werden. Tm-Werte von Schmelzkurven mit nicht eindeutigeruierbaren Basislinien (z.B. Schmelzkurven, die sich schon im Schmelzbereich
befinden) wurden durch die Bestimmung des Wendepunktes eines durch die
Messpunkte gelegten Polynoms 9. Grades mathematisch berechnet1. Der Wende¬
punkt einer idealen sigmaoiden Funktion entspricht genau dem Punkt bei je
50% des Einzelstranges in gepaartem und ungepaartem Zustand, also genau dem
Schmelzpunkt. Dieses Verfahrens wurde ausschliesslich für die Sequenzenallo(GGIGII) und allo(IIGIGG) verwendet.
Die erste Methode Hess sich auch uneingeschränkt auf Oligonucleotide der
Homo-DNA und der Allopyranose-NA Reihen übertragen. Sie lieferte in
reproduzierbarer Art Tm-Werte und thermodynamische Daten der Duplex-
bildung.
1 Dieses Prozedere wurde mit Hilfe des Programmes Passage© (David Guenther & Chris Tigges,1987) auf einem MacintoshO-Computer durchgeführt.
-44- allgemeiner Teil
Die Bestimmung der thermodynamischen Daten AH, AS, und AG einer Paarung
lässt sich nach Marky & Breslauer [58] und [59] auf drei prinzipiell verschiedene
Arten aus der Analyse der Schmelzkurven durchführen:
© Man benutzt nur eine Schmelzkurve und normiert diese derart, dass dem
Minimalwert 0 und dem Maximalwert 1 zugeordnet wird.
a Ist der Anteil des
Einzelstranges
Abb. C4.3: Bestimmung des Molenbruchs des Einzelstranges aus einer Schmelzkurve bei
einer bestimmten Temperatur.
Die van't Hoffsehe Schmelzenthalpie ist dann gegeben durch (Herleitung vgl.[59]):
AHvh(T)=6RT2Üy1
AHVH(T)=4RT2f|Yl
für nicht selbstkomplementäre Sequenzen
für selbstkomplementäre Sequenzen
R ist die universelle Gaskonstante (R = 1.9872 cal • K-1 • moF)
Bei der Schmelztemperatur gilt für selbstkomplementäre Sequenzen:
AHVH(Tm) = 4 RT2^L
-45- allgemeiner Teil
Der Ausdruck in Klammern ist nichts anderes als die Steigung der Tangente bei
der Schmelztemperatur an die normierte Schmelzkurve, was gleichbedeutendmit dem Wert der Ableitung bei der Schmelztemperatur ist (Abb. C4.4).
Tangente an die normierte
Schmelzkurve bei der
Schmelztemperatur Tm
Abb. C4.4: Bestimmung der van't Hoffsehen Schmelzenthalpie aus
der Steigung der Tangente an die Schmelzkurve beim Schmelzpunkt.
Die Berechnung von AS erfolgt über die Berechnung von AG.
Zur Berechnung von AS wird angenommen, dass die van't Hoff'sche
Schmelzenthalpie AHvh temperaturunabhängig ist.
Zuerst muss über die Gleichgewichtskonstante bei einer festgesetzten
Temperatur (meist 298 K) die Gibbs - freie Enthalpie berechnet werden.
logK(Tm)
logK298
AHVH
2.3 •R 1,298 lm)
Dabei ist:
K(Tm):a/2
(l-a)2-Crfür selbstkomplementäre
Oligonucleotidsequenzen
-46- allgemeiner Teil
2aK(Tm) = : für nicht selbstkomplementäre
(l-a)2-CT
Oligonucleotidsequenzen
a = ist der Molenbruch des Einzelstranges (bei Tm ist er definiert als 0.5, vgl. Abb.
C4.3)
er = Totalkonzentration an Oligonucleotid
Der Wert Keq(298 K) der nach der ersten Gleichung berechnet wurde, wird in
AG = -RTln(Keq)
eingesetzt. Man erhält AG0 (298 K) und daraus AS° (T = 298 K einsetzen) nach:
AG(298K) = AH-TAS
@ Eine zweite Möglichkeit zur Ermittlung der van't Hoff'schen
Schmelzenthalpie mit nur einer Schmelzkurve erhält man auch aus der
Ableitung der auf 1 normierten Schmelzkurve. Durch Einsetzen der
Temperaturen T1/4 und T3/4 (vgl. Abb. C4.5) bei der Halbwertsbreite des Peaks
dieser Ableitung in die nachfolgende Gleichung erhält man AHvh für den
Schmelzprozess.AS lässt sich in Anlehnung an die erste Methode berechnen. Diese beiden
Methoden haben den Nachteil, dass eigentlich eine Basislinienkorrektur für den
Effekt, den die Temperaturerhöhung auf das Einzelstrangoligonucleotid ausübt,
durchgeführt werden müsste, um zu relevanten Daten zu gelangen. Für eine
erste Abschätzung geben diese Daten doch schon einigen Aufschluss. Ohne
Basislinienkorrektur kann ein Fehler von = 20 % auftreten [58].
3.2AHvh = -
TTTf—TT/f—) für selbstkomplementäre Sequenzen
4.37AHvh = -
TT/t—. 1 ij—\ für nicht selbstkomplementäre Sequenzen
-47- allgemeiner Teil
1. Ableitung der
normierten
Schmelzkurve
(It)v 3T 'max
(ff)
r m
max
t
1 /4 3/4
Abb. C4.5: Die Bestimmung der Werte T,/4 und T3/«.
® Eine dritte Möglichkeit, um von Schmelzkurven zu thermodynamischenDaten eines Schmelzprozesses zu gelangen, ergibt sich aus der Konzentrations¬
abhängigkeit der Schmelztemperatur von der Oligonucleotidkonzentration bei
sonst gleichen Messbedingungen.Die Abhängigkeit lautet (detailierte mathematische Herleitung in [59]:
T"1 =
R-(n-l)
AH -ln(c) + (AS-(n-l) -R -ln(2) + R -ln(n)) • AH"'
wobei gilt:
Tm = Schmelztemperatur [°K]
c = Oligonucleotidkonzentration [moH]
n = Ordnung des Schmelzprozesses
Erklärung der Ordnung des Schmelzprozesses n:
{d(A)m}2^2d(A)m
d(A)mxd(T)m <+ d(A)m + d(T)m
2xd(A)mxd(T)m <-> d(A)mxd(T)m + d(T)n
2xd(A)mxd(T)m «-» 2 d(A)m + d(T)m
{d(A)mxd(T)m}2 <"> 2 d(A)m + 2 d(T)m
n = 2 (selbstkomplementär)
n = 2 (nicht selbstkomplementär)n = 2
n = 3
n = 4
- 48 - allgemeiner Teil
1/T [K]
Achsenabschnitt = {AS-(n-1)-R-ln(2) + R-In(n)}-AH"1
(für selbstkomplementäre Sequenzen)
>v Steigung = R-(n-1)-AH"1
1In c
Abb. C4.6: Bestimmung der thermodynamischen Parameter nach der Methode der
konzentrationsabhängigen Schmelztemperaturen nach Marky & Breslauer [59].
Die Auftragung der reziproken Schmelztemperaturen gegen den natürlichen
Logarithmus der Oligonucleotidkonzentration liefert aus der Steigung die van't
Hoff'sche Schmelzenthalpie und aus dem Achsenabschnitt die Schmelzentropie
(vgl. Abb.C4.6). Die Gibbs-freie Enthalpie lässt sich dann sehr leicht berechnen:
AG(T)=AH-TAS
Eine modellunabhängige Auswertung der thermodynamischen Parameter für
die Duplexierung ergibt sich durch Differential Scanning Calorimetry (DSC). Die
Theorie zu dieser Methode wird von Breslauer in [58] gegeben. Das Integral der
Funktion in einem cp vs. T Diagramm liefert AHcai (cal = calorimetrisch
bestimmt). Eine Auftragung der molaren Wärmekapazität, dividiert durch die
jeweilige Temperatur, gegen die Temperatur aufgetragen (cp/T vs. T Diagramm),liefert als Fläche unter der Kurve die molare Entropie des Schmelzvorganges
ASca].
Zur Bestimmung des stöchiometrischen Verhältnisses zweier verschiedener
miteinander paarenden Oligonucleotide kann ein sogenanntes 'mixing curve'
Experiment durchgeführt werden. Dabei wird das Verhältnis der zwei
Oligonucleotidsequenzen zueinander bei gleichbleibender Oligonucleotidtotal-
-49- allgemeiner Teil
konzentration variiert1. Darauf wird bei konstanter Temperatur (unterhalb der
Schmelztemperatur des DNA-Komplexes) die Absorption bei einer geeigneten
Wellenlänge gemessen. Die Auftragung der Absorption gegen den Molenbruch
führt dann zu einem leicht interpretierbaren Diagramm (vgl. Abb. C4.7). Anhand
des erhaltenen Diagramms kann ein 1 : 1 von einem 2 : 1, 1 : 2 oder anderen
relativen Verhältnissen unterschieden werden. Eine ausführliche Beschreibungdieser Methode findet sich in [55 (Seite 1135)]. Mit einem 'mixing curve'
Experiment alleine lässt sich allerdings ein stöchiometrisches Verhältnis nicht
definitiv belegen. Ein Vielfaches des gefundenen Verhältnisses (z B. 2 : 2 anstelle
von 1 : 1) kann nicht ausgeschlossen werden. Die Bestimmung der thermodyna¬mischen Daten mittels konzentrationsabhangigen Schmelztemperaturen und
einem DSC-Experiment liefert, zusammen mit einer 'mixing curve', einen
vollständigen Datensatz, mit dem eindeutig ein stöchiometrisches Verhältnis
eines DNA-Komplexes bestimmt werden kann.
Absorption Absorption Absorption
0 100 0 50 100 0 50 67 100% A
100 0 100 50 0 100 50 33 0% B
Abb C4 7: Das Diagramm links zeigt den Kurvenverlauf, wenn keine Interaktion der beiden
Oligonucleotide A und B eintritt. Im mittleren Diagramm ist das Absorptionsverhalten für
einen 1. 1 Paarungskomplex aufgezeichnet Das Diagramm rechts repräsentiert das Absorp¬
tionsverhalten von zwei Oligonucletiden, die nur einen 1 2 Komplex (gestrichelte Linie)
sowie für ein System von zwei Oligonucleotiden, die sowohl einen 1 .1 Komplex sowie durch
Anlagerung eines weiteren Oligonucleobdstrangs an den entstandenen Duplex noch einen 1 2
Triplex ausbilden (ausgezogene Linie; z B AU2 > AU + U>A + 2Uim Fall von poly A mit
polyU[61])
* Die einfachste und genaueste Methode dazu besteht dann, dass man von jedem Oligonucleotid eine
Stammlosung mit der exakt gleichen Konzentration an Oligonucleotid herstellt und deren
Verhältnis zueinander durch verschiedene Volumenanteile variiert
-50- allgemeiner Teil
Eine weitere Methode zur Charakterisierung von Oligonucleotiden ergibt sich
aus deren CD-Spektren. Einerseits besteht in der Aufnahme von CD-Spektren bei
verschiedenen Temperaturen eine ergänzende UV-spektroskopische Methode
zur Bestimmung der Schmelztemperatur (Breslauer verwendet häufig eine
temperaturabhängige Messung der molaren Eliptizität bei einer bestimmten,
konstanten Wellenlänge so z.B. in [60]). Anderseits ist die CD-Spektroskopie eine
empfindliche Sonde für lokale Aenderungen der Konformation oder
Konfiguration eines Oligonucleotids. So konnte in natürlicher DNA leicht
zwischen A-, B-, C- und Z-Konformationstypen der DNA mittels CD-Spektros¬
kopie unterschieden werden. Theoretische Herleitungen des CD-Effektes von
Nudeosiden, Nudeotiden und Oligonudeotiden finden sidi in [54], [55], [62], [63].
Als weiteren qualitativen Hinweis über eine Paarung wurde auch die nicht
denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) verwendet [64].
C.4.2Die AT-Paarung
C.4.2.1 Einleitende Bemerkungen
Roth [21] gelangte beim Versuch dd(A6) mit dd(Vt) zu paaren, zur
überraschenden Feststellung, dass in der Homo-DNA Reihe eine starke AA-
Paarung existiert. Diese wurde in der Folge von Böhringer [18] weiter untersucht.
Roth [21] fand weiter, dass ein monobasiger AA-gepaarter Homo-DNA Duplexauch nicht durch ein monobasiges Homothymidinoligonucleotid derselben
Länge gebrochen werden kann.
Dieser Befund konnte mit folgenden Experimenten bewiesen werden:
- Die mathematische Summe der Hyperchromizitäten der Schmelzkurve der
Komponenten dd(T6) und {dd(A6))2 entspricht genau der gemessenen
Hyperchromizität der 1 :1 Mischung von dd(A6> + ddO"6)- Dabei entsprachdie Schmelztemperatur von {dd(A6)}2 derjenigen Schmelztemperatur von
dd(As) + dd(T6).
- Das CD Spektrum von {dd(Ai0)}z entspricht demjenigen von dd(Ai0) + dd(T10).
-51- allgemeiner Teil
Wir stellten uns nach diesen Ergebnissen die Frage ob denn in der Homo-DNA
eine AT-Paarung nach dem Komplementaritätsprinzip der natürlichen DNA
überhaupt existiert. Vorversuche mit dd(AU)„ von Leumann [20] und Goebel [65]
zeigten, dass solche Oligonucleotide auf Grund ihrer Schmelztemperatur und
Hyperchromizität eine andere Paarung als die bisher beobachteten AA-
Paarungen nahelegen. Diese Resultate waren Anlass zu einer systematischen
Untersuchung von alternierenden Homo-deoxy-(AT)- und Homo-deoxy-(AU)-
Oligonucleotidsequenzen.
C.4.2.2 Alternierende AT-Sequenzen von Homo-DNA
Zur Untersuchung der Eigenschaften der alternierenden Oligonucleotide des
Typs dd(AT)„ (n = 3 - 6) wurden diese hergestellt und gereinigt.
Die UV-Schmelzkurven von solchen Oligonucleotiden zeigen ausnahmslos
einen sigmaoiden Kurvenverlauf. Mit zunehmender Sequenzlänge nimmt die
Schmelztemperatur zu (dokumentiert in Abb. C4.8).
dd(AT)n% Hyperchromizität
30
dd(AT)6 68°C
dd(AT)5 58°C
dd(AT)4 45°C
dd(AT)3 28°C
-i——i——i—•—i——i——i——i
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.8: Schmelzkurven von alternierenden Homo-(AT)n Oligonucleotidsequenzen
unterschiedlicher Länge, alle in einem Puffer aus 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl,
pH 7.0 bei 260 nm gemessen. dd(AT)3: 28°C (115 uM, 20% Hyp.); dd(AT)4:45°C (102
uM, 24% Hyp.); dd(AT>5:58°C (92 pM, 24% Hyp.); dd(AT),: 68°C (85 uM, 25% Hyp.).
-52- allgemeiner Teil
Die Schmelztemperaturen nehmen bei allen hier untersuchten Oligonucleo¬tiden mit zunehmender Oligonucleotidkonzentration zu, was zeigt, dass es sich
nicht etwa um intramolekulare Basenpaarungen, sondern um intermolekulare
Duplexe handelt
Solche alternierende AT-Ohgonucleotide gehen immer eine AT-Basenpaarung
ein, die sich in der temperaturabhangigen UV-Absorptionsmessung durch eine
im Vergleich zur AA-Paarung deutlich erhöhte Hyperchromizität äussert (AA-
Paarung = 8%, AT-Paarung =23%)
Die Bestimmung der thermodynamischen Daten zur weiteren
Charakterisierung der (AT)-Ohgonucleotide wurden im Fall von dd(AT)g nach
Marky & Breslauer [59] durchgeführt (Methode ® in Kapitel C 4 1) Aus der
linearen Beziehung der reziproken Schmelztemperatur und dem naturlichen
Logarithmus der Oligonucleotidemzelstrangkonzentration konnte AHvh und
ASvh bestimmt werden (Abb C410)
dd(AT)6% Hyperchromizität
30 -i
25-
20-
15-
10-
5-
.>*!*
•i•«.
40uM
93uM
.36uM
•85uM
ffl.^V/f *
, , , , I—I—I——I—I—I—I—I
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb C4 9 Vier der neun Schmelzkurven von dd(AT)6, die zur Bestimmung der thermodynamischen
Daten des Schmelzprozesses nach Breslauer [67] benutzt wurden dd(AT)(: 1 8 uM 54 2°C, 4 0 uM
560°C, 52 uM 582°C, 93 uM 593°C, 95 uM 59 4°C, 132 uM 602°C, 364 ^M 64 5°C, 528 p.M
66 6°C, 85 uM 67 5°C Alle Messungen wurden im Standardpuffer (150 mM NaCl, lOmM Tns HCl,
pH 7 0 bei 260 nm mit einer Aufheizrate von 1 0°C/min durchgeführt
-53- allgemeiner Teil
1/T [K]
3.04e-3 -
l^«w
3.00O-3 -
2.96e-3 -
BS.
-14.0 -13.0
1 '
-12.0 -11.0
1 '
-10.0 -9.0ln(c)
y = - 3.2984 10-5 • x+ 2.6233 10"3 R2 = 0.987
Abb. C.4.10: Auftragung des natürlichen Logarithmus der Oligonucleotidkonzentration
gegen die reziproke Schmelztemperatur zur Bestimmung der thermodynamischen Daten
anhand der linearen Regression (unterhalb der Grafik angegeben), die durch die
Messpunkte definiert ist.
Tabelle 1
AH°VH
[kcal mol"1]
AS°
[cal mol"1 K"1]
TAS°(298K)
[kcal mol*1]
AG° (298 K)
[kcal mol"1]
dd(A6)1 -39.4 -101 -30.2 -9.2
dd(AT)6 -60.2 -158 -17.1 -13.1
dd(AU)6 -51.2 -138 -41.1 -10.1
d(AT)6 -65.2 -200 -59.7 -5.5
d(AU)6 -52.5 -158 -46.9 -5.6
Die mittlere Duplexierungsenthalpie pro AT-Basenpaarwechselwirkung (AA:
39.4/5 = 7.9; AT: 60.2 /ll = 5.5) ist dabei deutlich schwächer als diejenige der AA-
Paarung. Die grössere Stabilität der AA-Paarung ist also im wesentlichen vom
Unterschied der Paarungsenthalpie abhängig. Wir schliessen daraus, dass die AT-
Paarung schwächer als die AA-Paarung ist2.
*Die thermodynamischen Daten für dd(A«) wurden von M. Böhringer bestimmt [18].2Die thermodynamischen Daten der AT-Dodecamerduplexe sind weitere Hinweise dafür, dass es
sich wirklich um einen AT-gepaarten Duplex und nicht etwa um einen AA-gepaarten Duplex mit
intermittierenden Homo-T-Nucleosiden handelt. Im Fall einer AA-Paarung (6 AA-Basenpaare im
Dodecamer dd(AU)6) würde man erwarten, dass die entsprechende Paarungsenthalpie des
-54- allgemeiner Teil
Zum Zweck eines Vergleichs der AT-Paarung in Homo-DNA mit derjenigen in
natürlicher DNA wurden die analogen alternierenden d(AT)„ (n = 3 - 6)
hergestellt und deren Paarungseigenschaften untersucht (Abb. C4.ll).
d(AT)n% Hyperchromizität
50-i
40-^—— d(AT)6 28°C
d(ATk 23°C
30- Z»~~~—d(AT)4 17°C
20-
10-^,—~d(AT)3 --°C
0 10 20 30 40 50 60 70
i i i
80 90 100°C
Abb. C4.11:Schmelzkurven von alternierenden Deoxy-(AT)-Oligonucleotiden mit unterschiedlicher
Länge. Alle Schmelzexperimente wurden in einem Puffer aus 150 mM NaCl, 10 mM Tris • HCl, pH 7.0
durchgeführt und die Absorption bei 260 nm gemessen. d(AT)3: - °C (58 uM, -% Hyp.); d(AT)4:17°C
(127 UM, 25% Hyp.); d(AT)5:23°C (83 uM, 30% Hyp.); d(AT>6 (45 uM, 35 % Hyp.).
Die zwei Schmelzkurven in Abb. C4.12 illustrieren deutlich die Unterschiede
und Gemeinsamkeiten der AT-Paarung von Homo-DNA und DNA. Beide
Kurven zeigen eine grosse Hyperchromizität von 25 % (Homo-DNA) resp. 35 %
(DNA). Beide besitzen, wie ein Vergleich mit anderen Oligonucleotidsequenzen
zeigt, eine sehr breite, relativ flach ansteigende Schmelzkurve.
Dodecamers nicht etwa (betragsmässig) grösser, sondern eher kleiner wäre als im dd(A6)-Dup!ex(ebenfalls 6 AA-Paarungen). Vergleiche hierzu die Erfahrungen aus alternierenden Homo-(TG)-
Oligomeren (Hunziker [22]).
-55- allgemeiner Teil
d(AT)6 - dd(AT)6% Hyperchromizität
40-
30
20
10
d(AT)6 4.0 uM
-*-r *t—i—i i i i i—i i i—i— i
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb.C4.12: Vergleich der AT-Paarung eines Homo-DNA und eines DNA
Dodecamers bei gleichen Messbedingungen: dd(AT)(: 56°C (4.0 uM, 25% Hyp.);
d(AT)4: (35 pM, 35% Hyp.) (150 mM NaCl, 10 mM Tris • HO, pH 7.0,260 nm).
Zum Vergleich der Natur der Paarung der Oligonucleotide wurden die thermo¬
dynamischen Daten von d(AT)6 wie im Fall des Homo-DNA Oligonucleotids
dd(AT>6 bestimmt.
Dieser Vergleich der thermodynamischen Daten (Tabelle 1, Seite 53) der beiden
Duplexe zeigt eindeutig, dass die stärkere Paarung in einem Homo-DNA
Oligomer gegenüber einem DNA Oligomer auf eine betragsmässig deutlich
geringere Entropieänderung zurückzuführen ist.
Dies ist ein deutlicher Hinweis auf einen höheren Präorganisationsgrad des
Homo-DNA Einzelstranges zur Duplexierung, was sich empirisch auf die höhere
konformationelle Stabilität des Pyranosesessels von Homo-DNA im Vergleich
zum konformationell flexibleren Furanosefünfrings zurückführen lässt.
C.4.3Die AU-Paarung
Erste Paarungsuntersuchungen von Adenin und Uracil enthaltenden Homo-
DNA-Oligonucleotiden wurden von C. Leumann [20] und M. Goebel [65] mit
alternierenden Oligonucleotidsequenzen der allgemeinen Formel dd(AU)„ (n = 3
-56- allgemeiner Teil
- 5) durchgeführt. Die Ergebnisse der UV-Schmelzkurven (Abb. C4.13) zeigen,
dass eine Assoziation dieser Oligonucleotide eingetreten sein muss. Die
Schmelzkurven der jeweiligen Oligonucleotidsequenzen zeigten einen
deutlichen kooperativen, sigmaoiden Verlauf, mit einer Schmelztemperatur, die
leicht unter den Werten von Homo-DNA-(AT)-01igonucleotiden liegen.Die Tatsache dass die Tm-Werte konzentrationsabhängig sind, lässt nur den
Schluss zu, dass es sich um intermolekulare Duplex-zu-Einzelstrang Uebergänge,
und nicht etwa um intramolekulare Schmelzprozesse (z.B. 'Hairpin' -
Bildungen) handelt.
Wie in der Reihe der natürlichen Nucleinsauren ist also auch Homo-DNA zu
einer Purin-Pyrimidin Adenin-Uracil Basenpaarung fähig.Es wurde erwartet, dass die Schmelztemperatur mit zunehmender Kettenlänge
des Oligonucleotids als Folge der grösseren Zahl möglicher Basenpaarungen
ansteigt, was aus Abbildung C4.13 eindeutig hervorgeht.
dd(AU)n% Hyperchromizität
20-*/• './.••
15-
10-
• •
. .«—
•i
*
•
*
dd(AU)3 20°C
dd(AU)4 32°C
-dd(AU)5 43°C
dd(AU)6 54°C
5-
••,••:•:••••0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.13: Die Schmelztemperatur von einem AU-gepaarten Duplex ist abhängig von
der Oligonucleoudlänge: dd(AU)3: 20°C (153 pM, 20% Hyp.); dd(AU)4: 32°C (97 pM,
20% Hyp.); dd<AU)„: 43°C, (78 uM, 20% Hyp.); dd(AU)6: 54°C (80 pM, 20% Hyp.). Alle
Schmelzkurven wurden in einem Puffer 150 mM NaCl, 10 mM Tris • HCl, pH 7.0 bei 260
nm gemessen.
Die Zunahme je neue AU-Basenpaarung beträgt <• 5.5°C.
-57- allgemeiner Teil
% Hyperchromizität25-
dd(AU)6
3.6 aM
7.1 uM
37 uM
78 uM
-i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.14: Einige der zur Bestimmung der thermodynamischen Daten von dd(AU)6
benutzten Schmelzkurven: 3.6 uM: 42.0°C; 4.5 pM: 42.4°C; 7.1 uM: 44.4; 37.2 uM:
51.1°C;78.1pM:54.1<>C.
Anhand des Dodecamers dd(AU>6 wurden die thermodynamischen Daten des
Duplex zu Einzelstrang Uebergangs aus den 1/Tm vs. ln(c) Wertepaaren analogder Bestimmung der entsprechenden Daten der dd(AT)6 und d(AT)6 Oligonuc¬leotiden nach Marky & Breslauer [59] bestimmt. Die Werte sind in Tabelle 1 (Seite
53) aufgelistet. Für die Reihe der Homo-(AU)-OHgnucleotide gilt als Hinweis auf
eine AU-Paarung (und nicht etwa eine AA-Paarung mit intermittierenden
Homo-U-Nucleosiden) genau dieselbe Begründung, wie sie auch für die Homo-
AT-Paarung in der Fussnote 2 in Kapitel C.4.2.2 gegeben wurde.
Man konnte darauf mit den alternierenden Homo-(AU)-Sequenzen einen
direkten Vergleich zu den Homo-(AT)-01igonucleotiden ziehen. Die Hyperchro¬
mizität der alternierenden Homo-(AU)-Oligonucleotide sind in etwa vergleich¬bar mit denjenigen der Homo-(AT)-01igonucleotide, die Schmelztemperaturender Homo-(AU)-OHgonucleotide liegen aber um etwa 15°C tiefer als die
entsprechenden Oligonucleotide der AT-Reihe (Abb. C4.19).
- 58 - allgemeiner Teil
dd(AT)6 - dd(AU),% Hyperchromizität
25-
20-
15-
10-
5-
0-
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.15: Der direkte Vergleich zwischen dd(AU)« und dd(AT)6 zeigt, dass die
Schmelztemperatur von dd(AT)<, höher liegt, als diejenige von dd(AU)6. dd(AT)6:56°C (4.0 pM, 25%
Hyp.), dd(AU)6:40°C (4.0 pM, 20 % Hyp.).
Ein Vergleich der thermodynamischen Daten von dd(AU)6 und dd(AT)6 (vgl.Tabelle 1, Seite 53) zeigt deutlich, dass die Homo-(AU)-Paarung im Vergleich zur
Homo-(AT)-Paarung durch den betragsmässig kleineren Enthalpieterm eindeutig
weniger begünstigt ist.
Ein Vergleich der alternierenden AU-Oligonucleotide zwischen der Homo-
DNA und der DNA Serie führt zu ganz ähnlichen Unterschieden, wie sie sich
auch beim analogen Vergleich der AT-Oligonucleotide gezeigt hatten:
- Die Schmelztemperaturen der Homo-DNA Oligonucleotide liegen deutlich
über denjenigen der Deoxyribosereihe, die Hyperchromizität der
vollständigen Schmelzkurven der DNA Reihe ist aber deutlich höher als
diejenige der Homo-DNA Reihe (vgl. nachfolgende Tabelle).
- Die Gegenüberstellung der zwei vollständigen Schmelzkurven dd(AU)6 und
d(AU)6 (Abb. C4.20) zeigte auch die grosse Hyperchromizität von d(AU)n
Oligonucleotiden von etwa 35%, während dd(AU)„ Oligonucleotide eine
Hyperchromizität von deutlich unter 25 % aufweisen. Genau derselbe
Effekt wurde schon beim Vergleich von dd(AT)„ zu d(AT)n festgestellt
(Abb. C4.12).
.*^*Add(AT)6 4.0 uM
dd(AU)6 4.0 uM
-59- allgemeiner Teil
% HyperchromizitätSO-
d(AU)6 - dd(AU)6
d(AU)6 25°C_
Abb. C4.16: Wie beim Vergleich der AT-Paarung zwischen Homo-DNA und
DNA, zeigen sich im Fall der AU-Paarung genau dieselben Unterschiede und
Gemeinsamkeiten (dd(AU)6: 52°C (37 pM, 20% Hyp.); d(AU)»: 25°C (35 uM, 35%
Hyp.).
dd(AU)„ d(AU)„
n = 3 20°C (153 uM, 20 % Hyp.) < 0°C (140 uM, -% Hyp.)
n = 4 32°C (97 uM, 20% Hyp.) < 5°C (100 uM, -% Hyp.)
n = 5 43°C (78 uM, 20% Hyp.) 16°C(47uM,30%Hyp.)
n = 6 52°C (38 uM, 20% Hyp.) 24°C (35 UM, 36% Hyp.)
Es ist bemerkenswert, dass eine Homo-DNA-(AU)-Paarung derart viel
schwächer ist als eine Homo-DNA-(AT)-Paarung. Wie man aus dem Vergleich
der thermodynamischen Daten der DNA Analogen d(AU)( und d(AT)6
feststellen kann, ist auch hier das gleiche Verhalten festzustellen (vgl. Tabelle 1,
Seite 53). Der Enthalpieterm der Duplexierung ist nämlich sowohl in der Homo-
DNA, wie auch in der DNA Reihe für AT-gepaarte Oligonucleotide
betragsmässig grösser. Dieser Effekt kann also nicht mit dem modifizierten
Zuckerbaustein alleine zusammenhängen. Es handelt sich eindeutig primär um
einen basenspezifischen Effekt.
-60- allgemeiner Teil
Zur Frage nach dem Basenpaarungstypus von Homo-(AT)/(AU)-
Oligonucleotiden
Aus Experimenten von Roth [21] und Kapitel C.4.5.2 ist bekannt, dass Purin-
Pyrimidin gepaarte Duplexe eine antiparallele Strangorientierung aufweisen.
Aus NMR-Untersuchungen von dd(T6> ist bekannt, dass auch die Pyrimidinbase
anti zum Pyranosering steht1. Wenn wir diese Annahmen als vorgegeben
akzeptieren, so existieren nur noch zwei der vier verschiedenen in Abb. C4.17
skizzierten Möglichkeiten für einen AT-gepaarten Duplex. Die Möglichkeiten II
und III entfallen, da sie bei anti Orientierung der beiden glycosidischen Bindung
einen Duplex mit parallel orientierten Oligonucleotiden implizieren oder aber
die eine der beiden glycosidischen Bindungen muss im Duplex syn orientiert
sein, um zu einer antiparallelen Strangorientierung zu gelangen.
-, ,„--*X
R I^
ii
R/
v—N
V-N
R1 III
R-N N-o,
O H% HN^„
4 IV
Abb. C4.17
1 Bisher konnte noch in keinem der NMR-spektroskopisch untersuchten Homo-DNA Duplexe im
gepaarten Zustand eine anti Orientierung der nucleosidischen Bindung nachgewiesen werden.
-61- allgemeiner Teil
Der Paarungstyp IV kann aufgrund der beobachteten Paarung von dd(7CHAs-A)
mit dd(T6) ausgeschlossen werden. Die für diesen Duplex (ddTCHA-T-Paarung)
gemessene Schmelztemperatur ist sehr gut mit derjenigen von d(AT)3
vergleichbar. Aufgrund einer eingehenden NMR-Analyse wurde gezeigt (Roth
[21]), dass im selbstkomplementären Duplex dd(A5T5) alle Basen in anti-
Konformation und Watson-Crick-artigen Paarung vorherrschen müssen. Wir
folgern daraus, dass alternierende Oligo-Homo-(AT) und -(AU) Sequenzen eine
Watson-Crick artige Paarung eingehen [23] (Abb. C4.18). Dies entspricht dem
ersten in Homo-DNA gefundenen Basenpaarungstyp nach natürlichem Muster.
„
Jt ,-»-Y^°"/,N-Tl VN O
^OH
^ Jl *'
ho rHO
Abb. C.4.18: Watson-Crick-artig verbrückte AU-Paarung mit
antiparalleler Orientierung der Oligonucleotidstränge .
C.4.4Die AC-Paarung
C.4.4.1 Altemierende (AC)/(CA)-Sequenzen von Homo-DNA
Aus Experimenten von gemischtbasigen Homo-DNA Sequenzen, die
Aufschluss über die Strangorientierung im Duplex und über Kreuzpaarung von
Homo-DNA mit DNA-Oligonucleotiden lieferten, stellte man fest, dass AC-
reiche Oligonucleotide Selbstpaarung zeigen (Kapitel C.4.5). Zur systematischen
Ueberprüfung der Existenz einer Paarung analog zu den Homo-(AU)- und
Homo-(AT)-01igonucleotiden, haben wir auch alternierende dd(AC)„ (n = 3 - 6)
-62- allgemeiner Teil
sowie dd(CA)n (n = 3 - 6) hergestellt und die Paarungseigenschaften mittels UV-
Schmelzkurven und CD-Spektroskopie überprüft.
Die Tm-Werte von dd(AC)„ und dd(CA)„ Oligonucleotiden bewegten sich etwa
in derselben Grössenordnung (vgl. Abb. C4.19 und C4.20).
% Hyperc15-1
hromizität
dd(AC)n
10-
5-
0-
/"'** *
**y*a^- ^-—"«ddtAQg 28°C
£,«1^^^"*"""* ' '"" dd(AC)5 20°C
^^*',,,,M,,,~,,,H,-,**~ dd(AC)4 <20°C
C
' i ' i
10 20
i i i i i i i i i i i i i i
30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.19: Homo-(AC) Oligonucleotide verschiedener Kettenlänge. Dass die
Schmelztemperaturen mit zunehmender Kettenlänge zunehmen, ist ein Beweis,
dass eine Paarung - wie auch immer geartet - vorliegt (dd(AC)3: <0°C (6.6 pM, -%
Hyp.); dd(AC),: <20°C (11.1 uM, -% Hyp.); dd(AC)5: 20°C (8.5 pM, 14% Hyp.);
dd(AC)«: 28°C (8.1 pM, 13% Hyp.)). Alle Schmelzkurven wurden in einem Puffer
150 mM NaCl, 10 mM Tris • HCl, pH 7.0 bei 260 nm gemessen.
In der Homo-DNA zeigte es sich, dass die Schmelzpunkte von dd(CA)„ durchs
Band weg bei vergleichbaren Konzentrationen leicht (um 1 - 3°C) höher liegen
als diejenigen der dd(AC)„ Serie bei vergleichbaren Bedingungen. Die
Schmelztemperaturen liegen aber deutlich tiefer als die Schmelztemperaturen
von dd(AT)„ (ungefähr 30°C) und dd(AU)„ Oligonucleotiden (ungefähr 15°C)
gleicher Länge unter denselben Messbedingungen.
-63- allgemeiner Teil
% Hyperchromizität20-
dd(CA)n
15
10
5
0
..-.<*********••**•*•*••,
s/S
dd(CA)6 29°C
dd(CA)5 19°C
*dd(CA)4 <20°C
dd(CA)3 <0°C
>—T— | 1 r—i— | | | l | l | l |
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.20: Schmelzkurven der dd(CA). Reihe. dd(CA),: <0°C (6.3 pM, -% Hyp.);
dd(CA)«: <20°C (6.4 pM, -% Hyp.); dd(CA),: WC (8.1 pM, 16% Hyp.); dd(CA)s: 29°C
(8.3 pM, 16% Hyp.). Alle Messungen wurden im Standardschmelzpuffer bei 260 nm
gemessen.
% Hyperc30-
25-
20-
15-
10-
hromizität
dd(AT)6 59°C•
*
^^^„^—.—...„. dd(AC)6 28°C
/. /
C
"' i i i i i i i i i i
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.21: Vergleich der UV-Schmelzkurven von dd(AT)„ dd(AU)„ dd(AC)t und
dd(CA),. dd(AT)6: 59°C (9.3 pM, 25% Hyp.); dd(AU),: 44°C (7.1 pM, 20% Hyp.);
dd(AC)6:28°C (8.1 pM, 13% Hyp.); dd(CA)4:29°C (83 pM, 16% Hyp.).
Wie aus Abbildung C4.21 ersichtlich ist, besitzen die Schmelzkurven der
Oligonudeotide dd(AC>6 und dd(CA)6 vergleichbare Hyperchromizitäten.
-64- allgemeiner Teil
% Hyperchromizität15-1
10
5-
dd(AC)6
••• X
„-."--.—-— 1.8 uM
5J— 8.1 Jm'—.-^-w 16.7 uM
""—«- 40.3 uM
i——i——i——i——i——i——i——i——i——i
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.22: Einige der zur Bestimmung der thermodynamischen Parameter von
dd(AC), verwendeten Schmelzkurven: 1.76 pM: 25°C; 2.8 pM: 26.4°C; 35 pM: 26.7°C;
4.4 uM: 27.1°C; 8.1 pM: 28.5°C; 115 pM: 30.0°C; 16.7 pM: 31.0°C; 40.3 pM: 34.6°C.
% Hyperchromizität20-i
dd(CA)e
1.2 uM
3.2 pM8.3 uM
23 uM
38 uM
—i—i—i—i—i—i—i— i i—i—i—i—i—i
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.23: Zur Bestimmung der thermodynamischen Daten des Schmelzprozesses
von dd(CA)t wurden folgende Schmelzkurven verwendet: 1.18 pM: 245°C; 2.4 pM:
26.7 °C; 3.2 pM: 26.7°C; 5.1 pM: 28.8°C; 8.3 pM: 29.4°C; 12.3 pM: 29.9°C; 23.0 pM:
31.9°C; 37.9 pM: 33.7°C. Man beachte in den obigen Abbildungen auch, dass bei
höheren Konzentrationen die Hyperchromizität der Schmelzkurve bei höheren
Temperaturen immer mehr absinkt.
-65- allgemeiner Teil
Die Bestimmung der thermodynamischen Daten nach Methode ® in KapitelC.4.1 lieferte die thermodynamischen Daten AH, AS und AG der beiden
Dodecamersequenzen dd(AC)6 und dd(CA)6.
AH°vh
[kcal mol-1]
AS0
[cal mol-1 K"1]
TAS°(298K)
[kcal mol-1]
AG° (298 K)
[kcal mol-1]
dd(AC)6 -61.6 -180 -53.7 -7.9
dd(CA)6 -53.0 -151 -45.1 -7.9
Die AC-gepaarten Homo-DNA-Duplexe zeigen vergleichbare Paarungsenthal¬
pien wie die AT- resp. AU-gepaarten Homo-DNA-Oligonucleotide, was aus dem
Vergleich mit den thermodynamischen Daten der Dodecamersequenzen dd(AT)«
und dd(AU>6 in Tabelle 1 (Seite 53) hervorgeht. Die im Vergleich zum AT-
gepaarten Duplex betragsmässig kleinere Gibbs-freie Paarungsenthalpie der AC-
Oligomere ist offensichtlich im betragsmässig grösseren Entropieterm zu suchen.
Aufgrund der leichten Protonierbarkeit von Cytosin, sowie der Tatsache, dass in
DNA-Triplexen CGC+ Basenpaarungen in leicht saurem Medium auftreten,
wurde in der Folge untersucht, ob es sich bei der beobachteten Paarung um eine
AC- oder AC+-Paarung handelt. Dazu wurden UV-Schmelzexperimente in
verschieden gepufferter Lösung durchgeführt.Aus Abbildung C4.24 geht hervor, dass die Schmelztemperatur kaum pH-
abhängig ist. Aufgrund dieser Ergebnisse ist also eine AC+-Basenpaarung
auszuschliessen.
Die Tatsache, dass sich beim Schmelzen von dd(AC)6 bei pH 4 eine im Vergleichzu den anderen Schmelzkurven viel grössere Hyperchromizität einstellt, weist
darauf hin, dass eine Zersetzung des Oligonucleotids eingetreten ist. Dies konnte
auch dadurch gezeigt werden, dass ein Schmelzprozess bei pH 3.5 nicht mehr
reversibel ist (Abb. C4.25). Die HPLC-Kontrolle nach diesem Schmelzexperiment
zeigte eindeutig Zersetzung des Oligonucleotids (vermutlich Depurinisierung)an.
- 66 - allgemeiner Teil
Abb. C4.24: dd(AC)6 bei verschiedenen pH-Werten gemessen. pH 4 (Essigsäure): -°C (3.4
pM, '19% Hyp.'); pH 5 (Natriumacetat): 23°C (7.2 pM, 11% Hyp.); pH 6
(NaCacodylat): 28°C (7.7 pM, 12% Hyp.); pH 7 (Tris-Puffer): 28°C (8.1 pM, 13% Hyp.);
pH 8 (Tris-Puffer): 28°C (8.1 pM, 13% Hyp.); pH 9 (Tris-Puffer): 31°C (8.1 pM, 11%
Hyp.).
dd(AC)6 Zersetzung in saurem Milieu% Hyperchromizität
20-i
15-Kühlen
10-
.
5- „*• Erwärmen
0- .*•*.-.*..-••
-5-
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.25: dd(AC), pH 3.5 Tm: -°C (3.0 pM, - % Hyp.); 150 mM NaCl, 10 mM
NaFormiat, pH 35, 260 nm.
Ein Vergleich mit natürlicher DNA zeigt einen weiteren grossen Unterschied
zur Homo-DNA: Natürliche d(AC)n-respektive d(CA)n-01igonucleotide zeigen
-67- allgemeiner Teil
kein kooperatives Schmelzverhalten (man vergleiche dazu die Schmelzkurven
in Abb. C4.26 und C4.27).
Abb. C.4.26: Oligonucleotide der DNA-Reihe mit alternierender AC-Sequenz
zeigen keine Basenpaarung.
d(CA)n% Hyperchromizität
20-
15-
d(CA)6 7.1 uM
10- ^^g, d(CA)5 7.7 uM
&W*^ d(CA)4 7.7 uM
5-
0-
d(CA)3 7.1 uM
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.27: DNA mit alternierender CA-Sequenz zeigen ebenfalls, wie erwartet,
kein Schmelzverhalten. Alle UV-Schmelzexperimente wurden im Standard-
schmelzpuffer pH 7.0 bei 260 nm durchgeführt.
-68- allgemeiner Teil
Zur Frage nach dem Basenpaarungstyp einer AC-Paarung
Grundsätzlich existieren zwei Möglichkeiten für eine Paarung von dd(AC)„-
Oligonucleotiden mit antiparallel oder parallel orientierten Oligonucleotid-
strängen:- eine AC-Paarung oder
- zwei AA-gepaarte Oligonucleotidstränge mit jeweils intermittierenden Homo-
deoxycytosinnucleosiden.
i i i i i i i i i i i i i i i i
dd-ACACACAC dd-ACACACAC
I I I I II I I oder I I I ICACACACA-dd CACACACA-dd''' i i i i i i i i
Die zweite Möglidikeit ist unwahrscheinlich, da auch vergleichbare dd(TG)n (n
= 3-5) Oligonucleotide unter ähnlichen Messbedingungen kein Assoziationsver¬
halten zeigen. In diesem System tritt also weder eine GG- mit intermittierenden
Homo-thymidinnucleosiden, noch eine GT-Paarung auf. Eine GG-Paarung wäre
von vergleichbarer Stabilität wie eine AA-Paarung. Somit ist also im Fall von
dd(AC)n-01igonucleotiden eine AA-Paarung mit intermittierenden Homo-
deoxycytidinnucleosiden sehr unwahrscheinlich.
Ein weiterer Hinweis, der direkter die AA- resp. die AC-Paarung betrifft, erhält
man durch den Vergleich der thermodynamischen Daten von dd(AC>6 und
dd(A«):
AH°VH
[kcal mol-1]
AS0
[cal mol'1 K-1]
TAS°(298K)
[kcal mol-1]
AG0 (298 K)
[kcal mol-1]
dd(AC)6 -61.6 -180 -53.7 -7.9
dd(A«) -39.4 -101 -30.2 -9.2
Es gibt keine Erklärung, weshalb eine AA-Paarung, bei der sich noch
Cytosinnucleotide zwischen den AA-Basenebenen befinden, viel stärker sein
sollte als eine solche ohne diese Cytosinnucleotide mit gleicher Anzahl AA-
Wechselwirkungen (man vergleiche dazu die AH-Wert in der obenstehenden
Tabelle).
-69- allgemeiner Teil
Protonierte Cytosinbasen lassen sich ausschliessen, da die reversiblen
Schmelztemperaturen pH unabhängig sind1. Es muss sich also bei der Paarung
von dd(AC)„ und dd(CA)„ Oligonucleotiden um eine AC- und nicht um eine
AA-Paarung handeln.
Es ergeben sich dann die zwei in Abbildung C4.28 gezeigten Möglichkeiten für
eine AC-Basenpaarung.
HO HO
Abb. C4.28
I wäre Watson-Crick-artig und II Hoogsteen-Watson-Crick-artig verknüpft. Die
Folge davon ist, dass Fall I, die reverse Watson-Crick-artige Basenpaarung, zu
einem parallelen Doppelstrang und Fall II, die reverse Hoogsteen-artige
Basenpaarung, zu einem antiparallelen Doppelstrang führen würde. Ein
paralleler Doppelstrang wurde bislang noch nie in der Homo-DNA Reihe
nachgewiesen, was somit I unwahrscheinlicher werden lässt. Zur Ueberprüfung,
ob eine Paarung vom Typ I oder Typ II auftritt, wurde ein dd(7CHA-C)6
hergestellt. Die Tatsache, dass dieses Oligonucleotid keine Selbstpaarung zeigt,
heisst, dass ein Paarungsmuster nach dem Typ I auszuschliessen ist. Aufgrund
1 Aufgrund der Tatsache, dass es sich um eine AC- und nicht um eine AC*-Paarung handelt, wurden
Basentautomere nicht in diese Betrachtungen miteinbezogen.
-70- allgemeiner Teil
des fehlenden H-Brückenacceptors an der Postion 7 der Purinbase und der
fehlenden Selbstpaarung von dd(7CHA-C)6 muss ein Paarungstyp I für dd(AC)n
ausgeschlossen werden (vgl. Kapitel C.4.7.3). Aus diesen Erfahrungen würde man
erwarten, dass eine AC-Paarung somit nach Typ II stattfindet und strukturell mit
einer AA- resp. GG-Paarung verwandt ist (man vergleiche dazu auch Abb. C4.29).
9.H—N s*<
<>Tjn ihrV
A-C G -G
Abb. C4.29: Die Basenpaarungen von Homo-deoxyadenosin-Duplex, einem Homo-
deoxyadenosin/Homo-deoxycytosin-Duplex und einem Homo-deoxyguanosin-Duplex.
Zur Ueberprüfung dieses Paarungsmusters wurden CD-Spektren von dd(AC>6
gemessen und mit den CD-Spektren von dd(A6) und dd(AT)5 verglichen. Der
empirische Vergleich der CD-Spektren (Abb. C4.40) legt eigentlich einen
ähnlichen Konstitutionstyp zum AT-Typ und nicht zum AA-Typ nahe.
Daraus ergibt sich eigentlich ein Widerspruch zu dem zuvor beschriebenen
Experiment, das eine Watson-Crick artige AT-ähnliche Paarung ausschliesst und
eine Hoogsteen-artige Basenpaarung eindeutig favorisiert.
Inwiefern allerdings solche CD-Spektren von Purin-Purin- und Purin-
Pyrimidin-gepaarten Oligonucleotiden miteinander verglichen werden dürfen,
ist unbekannt.
-71- allgemeiner Teil
C.4.4.2 Nicht alternierende AC-Sequenzen von Homo-DNA
a) Blockweise Homo-AC-Oligonucleotide
Man wollte wissen, ob beim Uebergang von alternierenden dd(AC)5 zum nicht
alternierenden, aber dennoch selbstkomplementären dd(A5C5) ein Wechsel von
einer AC- zu einer AA-Paarung eintritt. Dies war bei den AT-Oligonucleotidennicht der Fall (Roth [21]). Sowohl dd(AT)s, wie auch dd(A5T5) zeigten im CD
Spektrum eindeutig eine AT-Paarung. Der Wechsel trat erst beim Uebergang
zum dd(A6T4) ein. Dies erschien aber im Fall der AC-Paarung nicht unmöglich,
da die AC-Paarung im Vergleich zur AT-Paarung noch viel schwächer als die
AA-Paarung ist. Man erwartete genau dasselbe Verhalten bei AC, wie es bei AH1
von Diedrichsen [89] gefunden wurde, nämlich den Uebergang von einer AH-
Paarung im alternierenden Fall (dd(AH)s) zu einer AA-Paarung in einer
blockweise gleichen Oligonucleotidsequenz (dd(A5H5) und innerhalb dieser
blockweisen Sequenzen einen Wechsel zur AH-Paarung : dd(A4H4) zeigt gemäss
CD-Spektrum wieder ein AH-Paarung), da die AH-Paarung etwa ähnlich
schwach ist wie die AC-Paarung2.Schon die Schmelzkurve der Sequenz dd(A5C5), die eine Schmelztemperatur
von 35°C und einer Hyperchromizität von nur noch 2.5% ergab, war ein
eindeutiges Indiz für den Wechsel der Paarungspartner.Diese Werte liegen viel näher bei den für dd(A5) gefundenen 32°C (9% Hyp.,
11.0 uM) [18] als denjenigen von dd(AC)s mit 20°C (14% Hyp. bei 8.4 pJvI). Dass die
Schmelztemperaturen von dd(A5C5) bei kleinerer Konzentration als im Experi¬
ment mit dd(A5) noch etwas höher liegen, kann mit dem stabilisierenden Effekt
von überhängenden Enden (sog. 'dangling ends') erklärt werden (vgl. Abb.C4.30).
' H steht für Hypoxanthin, dessen Nucleosid mit Inosin bezeichnet wird. In unserer
Forschungsgruppe wird das Kürzel I für Isoguaninnucleoside benutzt.2 Die Schmelztemperatur des dd(AH)6 Dodecamers beträt 43°C (6.1 pM), der entsprechendedd(AC)6 29°C (8.1 pM), während dd(AT)6 mit 59°C (9.3 pM) deutlich höher liegt.
handeln.
AC-Paarung
eine
um
wohl
dabei
sich
es
wird
konnte,
werden
gezeigt
auch
Wie
Paar
ung.
anderen
einer
zu
AA-
einer
von
Wechsel
den
für
Beweis
als
Spektren
verschiedenen
der
Zusammenfassung
C430:
Abb.
CCCCAAAA-dd
Hyp.
)4.5%
nM,
(10.3
°C
16
=Tm
II
II
dd-AAAACCCC
100°C
80
60
40
20
0
L
s
..
ffU"C
&s^^
\1/
*VC
Ar
dd<A.)
Hyp.
)9%
UM,
(11.1
32°C
=Tm
AAAAA-dd
II
III
dd-AAAAA
100*C
60
60
40
20
0
100'C
60
60
40
20
0
CCCCCAAAAA-dd
35°C(7.2nM,2.5%Hyp.)
=Tm
II
II
Idd-AAAAACCCCC
\-1-
\
Xt
*
1-
^%
%H
3-
100*C
80
60
40
20
0
CACACACACA-dd
20oC(8.4nM,14%Hyp.)
=Tm
II
II
II
II
II
dd-ACACACACAC
-73- allgemeiner Teil
10
Der Wechsel von der AA- zur AC-Paarung% Hyperchromizität
15-i
dd(AC)5 20°C
dd(A5) 32°C
""* dd(A5C5) 35°C
i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—|—i—|—i—i
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.31: Vergleiche zwischen dd(As), dd(A5C5) und dd(AC)s; dd(Aj): 32°C (11.0 UM,
9% Hyp.); dd(A5C5): 35°C (7.2 pM, 25% Hyp.); dd(AC)5: 20°C (8.4 pM, 14% Hyp.).
Selbst das Oligonucleotid dd(A4C4) mit einer Schmelztemperatur von 16°C (10.3
|xM) bei einer Hyperchromizität von 4.5% zeigt beim Vergleich des CD-
Spektrums mit denjenigen von dd(A5C5) und dd(Ag) eindeutig eine AA-
Paarung. Es konnte in einer gleichgearteten Reihe (blockweise geordnete
Sequenz) kein Uebergang von einer AA-Paarung zur anderen (AC-Paarung)
gefunden werden, wie es bei AT-Paarungen der Fall ist [21] und es von U.
Diedrichsen beim Uebergang von dd(A4H4) (AH-Paarung) zum dd(AsHs) (AA-
Paarung) [89] gezeigt werden konnte.
b) Ein weiterer Hinweis für die Antiparallelität der AA-Paarung
Die beiden Nonamere dd(AAAACCCAA) und dd(AACCCAAAA) wurden
hergestellt, um zu untersuchen, ob eine AA-Paarung parallel oder antiparallel
ist. Es wurde versucht, diesen Beweis mit AC-haltigen Oligonucleotiden zu
erbringen, da dd(A) mit dd(C) die schwächste der untersuchten Adenin-
Pyrimidin-Basenpaarung ausbildet und somit am wenigsten Fehlpaarungen zu
erwarten sind.
Mit den zwei AC-Sequenzen alleine und deren 1 : 1 Gemisch wären die in
Abbildung C4.32 dargestellten Paarungsmöglichkeiten denkbar.
-74- allgemeiner Teil
Paarungsmöglichkeiten der
einzelnen Oligonucleotide
i i i i i i i i i
dd-AAAACCCAA
II I I II
dd-AAAACCCAA
Paarungsmöglichkeiten des
1:1 Gemischs der beiden
Oligonucleotide
6 x AA-Paarung
i i i i i i i i i
AAAACCCAA-dd
II I I II
AAAACCCAA-ddi i i i i i i i
6 x AA-Paarung
paralleleStrangorientierung
i i i i i i i i
dd-AACCCAAAAII I I
dd-AAAACCCAA
4 x AA-Paarung
dd-AAAACCCAA
I I I I
AACCCAAAA-dd
4 x AA-Paarungantiparallele
Strangorientierung
AAAACCCAA-dd
II I I
dd-AACCCAAAA
i i i i i i i i i
dd-AAAACCCAAII I I IIAAAACCCAA-dd
6 x AA-Paarung
4 x AA-Paarung
Abb. C4.32: Unter der Voraussetzung, dass eine neue Spezies beim 1 :1 Gemisch entsteht (was
eindeutig aus dem Gelexperiment hervorgeht), ergeben sich bei einer reinen AA-Paarung (vgl.
CD-Spektren Abb. C4.30) die oben skizzierten Möglichkeiten bei paralleler oder
antiparalleler Strangorientierung.
Das CD-Spektrums der beiden einzelnen Oligonudeotide und des 1 : 1 Gemischs
waren einander sehr ähnlich und typisch für eine AA-Paarung (mit einem
-75- allgemeiner Teil
Minimum bei 255 - 258 nm und einem Maximum bei 277 - 282 nm). Das CD-
Spektrum des 1 : 1 Gemischs sieht demjenigen der einzelnen Oligonucleotidesehr ähnlich. Es wird also keine Aenderung der Basenpaarungspartner eingetre¬ten sein. Es kann demzufolge nicht sein, dass in den einzelnen Oligonucleotidenneben AA- noch AC-Paarungen auftreten und dann im 1 : 1 Gemisch nur noch
AA-Paarungen.Bei gleichbleibender Oligonucleotidtotalkonzentration wurden nun von den
Oligonucleotiden einzeln und vom 1 : 1 Gemisch UV-Schmelzkurven gemessen.
Die UV-Schmelzkurven der beiden Oligonucleotiden allein (vgl. Abb. C4.33)
zeigten keinen grossen Unterschied zueinander. Aber auch die
Schmelztemperatur des 1 :1 Gemischs lag nur geringfügig höher als diejenige der
beiden einzelnen Oligonucleotide.
Sehr
% Hyperc10-
nelzkurven zur Antiparallelität der AA-Paarunghromizität
8-
6 -
4- /•'...••" "• dd(AAAACCCAA)T
2-
/C 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.33: Das 1:1 Gemisch der beiden Oligonucleotide, die jeweils zueinander
den antiparallel orientierten Komplementärstrang bilden, ergaben eine höhere
Schmelztemperatur als die Oligonucleotide alleine. dd(AAAACCCAA): <15°C
(9.4 pM, -% Hyp.); dd(AACCCAAAA): <15°C (9.6 pM, -% Hyp.); 1:1 Gemisch:
21°C(je4.1pM;9%Hyp.).
Ein nicht denaturierendes Polyacrylamidgelexperiment zeigte, dass in einem 1 :
1 Gemisch1 der beiden Oligonucleotide eine neue Bande, die weniger weit läuft
1 Das Verhältnis der beiden Stränge scheint in dieser Bahn nicht exakt 1 :1 gewesen zu sein. Es hat
einen kleinen Ueberschuss dd(AAAACCCAA) in der Probe.
-76- allgemeiner Teil
als die beiden Einzelstänge, entsteht. Das Assoziat, das aus den beiden
Oligonucleotiden entsteht, scheint also stabiler zu sein als das, welches bei
Selbstpaarung der beiden Oligonucleotide entsteht.
Abb. C434: Polyacrylamidgel (20 :1 BIS), 0.1 M
Tris, 0.1 M Borsäure, 5 mM MgQi pH 8.1, 8W,
18 h, 3°C, Angefärbt mit 'stains all' Lösung.
Zusammenfassend kann man aus den CD-Spektren schliessen, dass es sich bei
der Paarung um eine AA-Paarung und nicht eine gemischte Paarung mit AA-
und AC-gepaarten Duplexen handeln muss. Das Gelexperiment beweist, dass
eine neue Spezies im 1 : 1 Gemisch entstanden sein muss. Die Schmelzkurven
und auch das Gelexperiment zeigen, dass das im 1 : 1 Gemisch entstandene, neue
Assoziat etwas stabiler ist als die je durch die zwei Einzelstränge gebildeten
Assoziate. Diese Resultate sind nur dann alle in Einklang zu bringen, wenn wir
eine AA-Paarung mit antiparallel orientierten Oligonucleotidsträngenvoraussetzen.
-77- allgemeiner Teil
C.4.5 Gemischtbasige Oligonucleotide
Diese Paarungsexperimente wurden in Zusammenarbeit mit C. Leumann [21]
durchgeführt und sind der Vollständigkeit halber in die vorliegende Arbeit
aufgenommen worden.
Mit den im nachfolgenden Text besprochenen Oligonucleotidsequenzenwurden vor allem zwei Fragen zu beantworten gesucht:
© Ist die Orientierung von Watson-Crick-artig gepaarten Purin-Pyrimidin
Oligonucleotiden antiparallel?® Existiert eine DNA - Homo-DNA Paarung?
Diese Fragen konnten mit Hilfe von Schmelzexperimenten und
Gelelektrophorese abschliessend beantwortet werden.
Die Sequenzen der Hepta- und Octanucleotide, die für diese Experimenteverwendet wurden (Abb. C4.35), wurden so gewählt, dass möglichst einfache,
eindeutige Paarungen gemäss den Watson-Crick'schen Basenpaarungsmustern
eintreten. Die drei in Abbildung C4.35 in den Spalten zuoberst stehenden
Oligonucleotide (dd(AACTACT), dd(AACATACT) und d(AACATACT)) sind
jeweils die Stammsequenzen, die zweitobersten Oligonucleotidsequenzen sind
jeweils die parallel und die dritten Oligonucleotidsequenzen die antiparallelorientierten Komplementärstränge zum Stammoligonucleotid derselben Spalte.
dd(AACTACT) dd(AACATACT) d(AACATACT)
ddCTTGATGA) ddOTGTATGA) d(TTGTATGA)
dd(AGTAGTT) dd(AGTATGTT) d(AGTATGTT)
Abb.C4.35
C.4.5.1 Schmelzverhalten der einzelnen Oligonucleotide
Die in Abbildung C4.35 aufgeführten Oligonucleotide mussten daraufhin
überprüft werden, ob deren Selbstassoziation genügend klein ist, dass man einen
Unterschied bei der Assoziation des Stammoligonucleotids mit dem parallelen
-78- allgemeiner Teil
oder dem antiparallelen Komplementärstrang überhaupt erst von einer
eventuellen Selbstassoziation unterscheiden kann.
Die Oligonucleotidsequenzen wurden derart gewählt, dass sie zu einer
möglichst eindeutigen Watson-Crick-artig verknüpften Basenpaarung führen
sollten.
a) DNA Oligonudeotide:
Die UV-Schmelzkurven der einzelnen Oligonucleotide zeigen eine lineare
Zunahme der Extinktion der Oligonucleotide, die nur auf ein Destacking der
Basen, aber nicht auf das Auseinanderbrechen einer Oligonucleotidpaarung
zurückgeführt werden kann (vgl. Abb. C4.36).
% Hyperchromizität20-
15-
10-
5-
d(AGTATGTT 9.2 uM
^^^Z dfTTGTATGA) 10.2 uM
^-•^i^11** d(AACATACT) 8.8 uM
0 - i "i- i i i i > i • i i i i
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.36: Schmelzkurven der DNA Oligonucleotide, die wie erwartet kein
Assoziationsverhalten zeigen.
b) Homo-DNA Oligonucleotide:
Die analoge Untersuchung zeigt für die entsprechenden Octamere der Homo-
DNA Reihe ein anderes Verhalten: zwei der verwendeten Oligonucleotide
zeigen kein beobachtbares Schmelzverhalten, aber dd(AACATACT) besitzt eine
sigmaoide UV-Schmelzkurve mit einem Tm-Wert von 20°C bei den
untersuchten Bedingungen (vgl. C4.37).
-79- allgemeiner Teil
% Hyperc20-
15-
10-
5-
0-
C
hromizität
.'*" "*~*"—•—-«.h. dd(AACATACT) 8.9 uM•
•
•
•
^"r" i r»T—i—r i | r—i—i—r > i » i • i • i
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb.C4.37: Schmelzkurve der Homo-DNA Oligonucleotide. Die Schmelztemperaturen
sind in der untenstehenden Tabelle aufgelistet.
Oligonucleotidsequenz Schmelztemperatur
dd(AACATACT) Tm = 20°C (8.9 uM, 14 % Hyp.)
dd(AGTATGTT) Tm = -(9.2uM,-%Hyp.)
dd(TTGTATGA) Tm = -(8.9uM,-%Hyp.)
Die Schmelztemperatur von 20°C für das Octamer dd(AACATACT) würde eine
Paarung mit 4 AT und 4 AC gepaarten Basenpaare nicht ausschliessen (wie sie in
Abbildung C4.38 links oben dargestellt ist), denn ein AT-gepaartes Octamer
(dd(AT)4) hat eine Schmelztemperatur von 45°C und ein AC-gepaartes Octamer
(dd(AC>4) hat eine Schmelztemperatur von <20°C. Die Schmelztemperatur von
dd(AACATACT) von 20°C liegt sicher in einem Bereich, der für eine solche
Paarung noch zulässig wäre. Die bisherigen Kenntnisse über AT-Paarungen
(Watson-Crick-artig) in AT-haltigen Oligonucleotiden (Roth [21] und Kapitel
C.4.2), sowie AC-Paarungen (reverse Hoogsteen-artig) in AC-haltigen
Oligonucleotiden (Kapitel C.4.4) legen nahe, dass diese zwei Paarungen nicht in
einem Duplex koexistieren können (vgl. Abb. C4.39).
-80- allgemeiner Teil
antiparalleleOrientierung
i i i i i i i i
dd-AACATACT
I I I I II I ITCATACAA-dd''
4 x AT-Paarung (WC)4 x AC-Paarung (rev. H)
paralleleOrientierung
i i i i i i i i
dd-AACATACT
II I Idd-AACATACT'''
4 x AA-Paarung (rev. H)
i i i i i i i i
dd-AACATACT
I I I ITCATACAA-dd
2 x AA-Paarung (rev. H)2 x AT-Paarung (WC)
um ein
Nudeosid
verschoben
dd-AACATACT
II II I I
dd-AACATACT
1 x AA-Paarung (rev. H)
2 x AT-Paarung (WC)3 x AC-Paarung (rev. H)
i i i i i i i i
dd-AACATACT
I I I IITCATACAA-dd
3 x AA-Paarung (rev. H)2 x AC-Paarung (WC)
um ein dd-AACATACT
Nucleosid | I I I I Iverschoben dd-AACATACT
i i i i i i i i
1 x AA-Paarung (rev. H)
2 x AT-Paarung (WC)
3 x AC-Paarung (rev. H)
Abb. C4.38: Die verschiedenen Möglichkeiten, wie dd(AACATACT) sowohl mit paralleler,
als auch mit antiparalleler Strangorientierung und auch um ein Nucleosid verschoben mit sich
selbst paaren kann. Dabei bildet die Möglichkeit links oben sicherlich den stabilsten Duplex.
Der Uebergang von einer AT (Watson-Crick-artig) zu einer AC (reverse
Hoogsteen-artig) gepaarten Basenpaarung würde grosse sterische Anforderungenan das Zucker-Phosphat-Rückgrat stellen. Dies wird in Abbildung C4.39 dadurch
offensichtlich, dass die glycosidischen Bindungen von Homo-deoxycytosin zum
-81- allgemeiner Teil
Homo-thymidin bei der Ueberlagerung einer Homo-AC und einer Homo-AT-
Paarung sehr weit voneinander entfernt sind.
J
ft-
c6" T <xj>A-T A-C
(Watson-Crick) (reverse Hoogsteen)
Ueberlagerung von ATund AC-Paarung
(Watson-Crick und reverse
Hoogsteen-artig)
Abb.C4.39
Nicht auszuschliessen ist jedoch eine Duplexstruktur, die AC- und AT-
Basenpaarungen enthalten, die beide reverse Hoogsteen-artig verknüpft sind1.
Das CD-Spektrum von dd(AACATACT) (Abb. C4.40), das weder einem CD-
Spektrum für eine AC- noch einem für eine AT-Paarung entspricht, wäre in
diesem Fall plausibel, da die AT- und die AC-Paarung nur quasi-isomorph sind.
Dies wird insbesondere durch die Ueberlagerung der entsprechenden
Basenpaarungen in Abbildung C4.41 illustriert.
1 Eine solche AT-Paarung, die reverse Hoogsteen-artig verknüpft ist, existiert nach Helene und
Mitarbeitern [66] auch in einem d(aT,)d(ßA8)d(ßT,)-Triplex von DNA.
-82- allgemeiner Teil
Abb C440 CD-Spektrum von dd(AACATACT) bei 5°C
<$ \ H „
tT•h \\ H^H
A-T A-C
(reverse Hoogsteen) (reverse Hoogsteen)
H
ß-tf
-CK"
*J
Ueberlagerung von AT-
und AC-Paarungbeide Paarungen reverse Hoogsteen
Abb C 4 41
-83- allgemeiner Teil
Der Selbstpaarungsgrad der drei Heptanucleotide (dd(AACTACT),
dd(TTGATGA) und dd(AGTAGTT)) wurde in analoger Weise untersucht (vgl.
Abb. C4.42).
% Hyperchromizität
^— -»-»__«„ dd(TTGATGA)
10-
5- ^«.•-'•"""•"•»••««.H...» dd(AGTAGTT)
0-
•»•**
C 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.42: Schmelzkurven der drei Heptanucleotide:
dd(AACTACT): - °C (10.1 pM, - % Hyp.); dd(AGTAGTT): 17°C (9.3 pM, 6% Hyp.);
dd(TTGATGA): 20°C (9.7 pM, 15% Hyp.).
Oligonucleotidsequenz Schmelztemperatur
dd(AACTACT) Tm =-°C (10.1 uM,-% Hyp.)
dd(AGTAGTT) Tm = 17°C (9.3 uM, 6% Hyp.)
ddCTTGATGA) Tm = 20°C (9.7 uM, 15% Hyp.)
Auch bei den drei Heptamersequenzen zeigen die zwei zum Stammstrang
(dd(AACTACT)) parallel und antiparallel orientierten Komplementärstränge
eindeutig Selbstpaarung. Im Fall von dd(AGTAGTT) ist am plausibelsten, dass
mit den bisherigen Kenntnissen eine um ein Nucleosid verschobene
Basenpaarung eine Selbstpaarung ausbildet, wie dies in der eingerahmten
Basenpaarungsstruktur in Abbildung C4.43 dargestellt ist. Eine solche Paarung
würde im selben Oligonucleotidstrang sowohl GG- (reverse Hoogsteen
verknüpft, Hunziker [22]), als auch AT-Paarungen vorliegen. Die AT-
Basenpaarungen könnten wiederum, wie im Fall der Octamersequenz
dd(AACATACT) in reverse Hoogsteen-artig verknüpfter Weise gepaart sein.
Eine Selbstpaarung von dd(AGTAGTT), bei der jede Base des Oligonucleotids in
- 84 - allgemeiner Teil
antiparaller Orientierung mit einer Base gepaart ist (I in Abbildung C4.43), würde
4 GT-Basenpaarungen, die nach Untersuchungen von Hunziker [22] nicht
existieren, aufweisen.
m—r-n—i
dd-AGTAGTT
I I I ITTGATGA-ddi i i i i i i
i i i i i i i
dd-AGTAGTT
I I
TTGATGA-dd
Abb. C4.43: Die Paarungsmöglichkeiten für das Oligonucleotid dd(AGTAGTT).
Genau dasselbe Paarungsmuster gilt selbstverständlich auch für den
Oligonucleotidstrang, bei dem die Reihenfolge der Nucleoside umgekehrt ist,
also für den zum Stammstrang parallel orientierten Komplementärstrang
dd(TTGATGA). Dieser Befund deckt sich mit der Beobachtung, dass die
Schmelztemperaturen dieser zwei Oligonucleotide in etwa vergleichbar sind
(dd(AGTAGTT): 17°C (9%); dd(TTGATGA): 20°C (15%)). Nicht erklärbar ist
jedoch der Unterschied der Hyperchromizitäten der beiden Schmelzprozesse.
C.4.5.2 Zur Frage der Strangorientierung
Zu den Stammsequenzen der Heptamer- und Octamersequenzen
(dd(AACTACT) und dd(AACATACT)) wurde jeweils eine äquimolare Menge
sowohl des antiparallelen als auch des parallelen Komplementärstrang
zugegeben und eine temperaturabhängige Schmelzkurve aufgezeichnet.
Um ein Nucleosid
verschobene
Oligonucleotid-paarung
i i i i i i i
dd-AGTAGTT
II I I IITTGATGA-ddi i i i i i i
-85- allgemeiner Teil
Mischexperiment mit den Homo-DNA Sequenzen% Hyperchromizität
20-
15-.* .* dd(AACATACT) +
10-
/ ; ddfTTGTATGA)•
•
•'" / dd(AACATACT) +
5- .•• / (TTGTATGA)dd
*>* y'
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb C4 44 Das Schmelzexpenment zeigt, dass der zu dd(AACATACT) antiparallel orientierte
Watson-Crick-artig paarende Strang dd(AGTATGTT) den stabileren Duplex bildet
dd(AACATACT) + dd(TTGTATGA) 38°C (je 4 8 pM, 18% Hyp)
dd(AACATACT) + dd(AGTATGTT) 48°C (je 4 8 pM, 18% Hyp)
Beide Schmelzkurven wurden in 150 mM NaCl, 10 mM Tns HCl, pH 7 0 bei 260 nm gemessen
Es zeigte sich für den Fall von dd(AACATACT), dass beide Oligonucleotid-
gemische einen kooperativen Uebergang zeigten, dessen Tm-Werte jeweils
deutlich hoher waren als diejenigen der einzelnen Komponenten Diejenige
Losung, in dem der Komplementarstrang antiparallele Orientierung zum
Stammstrang aufweist, hat eine höhere Schmelztemperatur (Abb C4 44) Wir
können deshalb annehmen, dass die Strangorientierung in diesen Homo-DNA
Octamersequenzen bevorzugt antiparallel ist Die Tatsache, dass die
Stammsequenz auch mit dem parallel orientierten Oligonucleotid paart, ist
erklärbar durch eine partielle, verschobene Basenpaarung, aber ebenfalls mit
antiparalleler Strangorientierung zum Stammoligonucleotid, wie sie in
Abbildung C4 45 dargestellt ist
-86- allgemeiner Teil
antiparallelkomplemen¬tärer Strang
l i i l i l l l
dd-AACATACT
I I I I I I I I
TTGTATGA-dd
dd(AGTATGTT)C (je 4.8 uM, 20% Hyp.)
4 x AT (WC)und 4 x GC (WC)
Stammsequenz
parallelkomplemen¬tärer Strang
dd(TTGTATGA)
i i i i i i i~i
dd-AACATACT
I I I II I
AGTATGTT- dd
37c C (je 4.8 uM, 18% Hyp.)1 x AA (rev. H)
und 2 x GC (WC)
und 3 x AT (WC)
antiparallele Paarungder parallelkomplementären Stränge
Abb. C4.45: Antiparallel orientierte Paarung sowohl der antiparallel, wie auch der parallel
komplementären Oligonucleotidstränge.
Obwohl die Differenz der Schmelztemperaturen mit dem parallel und dem
antiparallel orientierten Komplementärstrang deutlich war, war es störend, dass
die Stammsequenz mit dem parallel orientierten Komplementärstrang eine so
starke Paarung eingeht. Aus diesem Grund hat man sich entschlossen, dasselbe
Experiment mit den Heptamersequenzen dd(AACTACT), dd(AGTAGTT) und
dd(TTGATGA) durchzuführen, was zu einem eindeutigeren Resultat führte
(Abb. C4.46).
Die Heptamer Stammsequenz (dd(AACTACT)) zeigt mit dem antiparallel
orientierten Oligonucleotidstrang eine Schmelzkurve mit einem deutlichen
sigmaoiden Verlauf, während die Stammsequenz mit dem parallel orientierten
Komplementärstrang offensichtlich keine Paarung eingeht. Der Schmelzkurven¬
verlauf dieses Oligonucleotidgemischs entspricht nämlich der Summe der
beiden UV-Schmelzkurven von dd(AACTACT) und dd(TTGATGA).
-87- allgemeiner Teil
% Hyperchromizität20-
15-
-dd(AACTACT) +
/ (TTGATGA)dd•
•
•
•
•
10- •
•
•
•
5- jST' ~~"„...,.
dd(AACTACT) +
y ddfTTGATGA)
0 1 1 1 1 1 < 1 1 1 1 1 1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.46: Dieses Schmelzexperiment zeigt, dass auch eine Watson-Crick-artige Paarung in Homo-
DNA eine antiparallele Strangorientierung aufweist.
dd(AACTACT) + dd(AGTAGTD: 42°C (je 5.0 pM, 18% Hyp.).
dd(AACTACT) + ddCTTGATGA): - °C (je 5.0 pM, - % Hyp.)
Diese beiden Schmelzkurven wurden bei denselben Bedingungen in 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl,
pH 7.0 bei 260 nm gemessen.
Die Purin-Pyrimidin Paarung nach einem Watson-Crick-artigen Basen¬
paarungsmodus in der Homo-DNA ist also antiparallel orientiert.
Zur Bestätigung der antiparallelen Orientierung bei der Watson-Crick-artig
gepaarten Purin-Pyrimidin-Paarung in der Homo-DNA wurde ein nicht denatu¬
rierendes Polyacrylamidgelelektrophoreseexperiment bei 20°C durchgeführt. Auf
die ersten drei Bahnen wurden die drei Oligonucleotide (dd(AACTACT),
ddCTTGATGA) und dd(AGTAGTT)) und auf die nächsten zwei ein 1 :1 Gemisch
des Stammoligonucleotids (dd(AACTACT)) mit seinem parallelen
(dd(TTGATGA) Bahn 4) und seinem antiparallelen (dd(AGTAGTT) Bahn 5)
Komplementärstrang aufgetragen. Auch aus diesem Experiment geht das im
Schmelzexperiment gefundene Resultat, einer antiparallelen Orientierung der
Oligonucleotidstränge, hervor. Eine Paarung äusserte sich im nicht
denaturierenden PAGE darin, dass die beiden Banden des Einzelstranges
verschwinden, dafür aber eine neue Bande, die weniger weit wandert, neu
entsteht. Die geringere Mobilität rührt daher, dass das Dimer weniger flexibel ist
und deshalb schlechter durch das Polyacrylamidnetzwerk gelangt.
-88- allgemeiner Teil
oT3
s H u 3 SS< E* (3 < e
H < «: S < «C tjU o t* o o
AACT TTGA3 «i 5BTl •0 •o •0 "0•o
1o1
•o1
•0 TJ1 1 -dd
Abb. C4.47:20% Acrylamid (30 :1 Bis), 0.1 M Tris, 0.1 M
Borsäure, 5 mM MgCl2, pH 8.1, 10 W, 16 h, 20°C,
Angefärbt mit 'stains all'-Lösung
Zu Kontrollzwecken wurde ein analoges UV-Schmelzexperiment mit DNA-
Octanucleotiden durchgeführt (Abb.C4.48). Die Schmelztemperatur der
antiparallel orientierten Oligonucleotidstränge war 22°C (je 4.6 uM, 25% Hyp.),
diejenige der Stammsequenz mit dem parallel orientierten Komplementärstrang
konnte nicht bestimmt werden. Sie dürfte aber unterhalb von 10°C liegen (je 5.1
uM Oligonucleotidkonzentration).
Dieses Resultat war vergleichbar mit dem entsprechenden Versuch mit Homo-
DNA. Dabei kann als Erklärung, weshalb auch der zum Stammstrang parallel
orientierte Oligonucleotidstrang assoziiert, genau dasselbe Paarungsschema (Abb.
C4.45) dienen. Nur muss der Einfluss der AA-Paarung bei der Paarung der DNA-
Oligonucleotidstränge, die für Homo-DNA noch eine gewisse Stabilisierung
ergeben kann, wegfallen.
-89- allgemeiner Teil
Mischexperiment mit den DNA Sequenzen% Hyperchromizität
£_,_
d(AACATACT) +n
„.-—-—* (TTGTATGA)d
„d(AACATACT) +
«««—'""'**"* dfTTGTATGA)
20
15
10
5
0
-."'
.*»-""
«tfV0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.48: Gleich wie im analogen Fall der Homo-DNA Oligonucleotide paart
auch der parallel orientierte Komplementärstrang mit dem Stammoligonucleotid
dd(AACATACT). Die Paarung ist aber wiederum deutlich schwächer als mit
dem antiparallel orientierten Komplementärstrang.
d(AACATACT) + dCTTGTATGA): <10°C (je 4.6 pM, -% Hyp.)
d(AACATACT) + d(AGTATGTT): 22°C (je 5.0 pM, 25 % Hyp.)
Diese Schmelzpunkte wurden im Standardpuffer bei 260 nm bestimmt.
C.4.5.3 Kreuzungsexperimente von Homo-DNA mit DNA - ein
weiterer Beweis für die Autonomie der Homo-DNA
Wie aus Experimenten von Roth [21]1 hervorgeht, scheint keine DNA - Homo-
DNA Paarung zu existieren.
Mit den zuvor schon verwendeten Oligonucleotiden wurde auch untersucht,
ob unter Einbezug aller vier Nucleobasen eine DNA - Homo-DNA Hybrid¬
paarung eintritt.
Zum DNA Oligonucleotid d(AACATACT) wurden in zwei verschiedenen
Experimenten dd(AGTATGTT) und dd(TTGTATGA) zugegeben, um zu sehen,
1 Roth fand [21], dass ein 1 :1 Gemisch von d(A10) und dd(T10) im UV-Schmelzexperiment dieselbe
Hyperchromizität aufweist wie die Summe der Hyperchromizitäten der beiden einzelnen
Oligonucleotide. Genauso zeigt der CD-Effekt des 1 :1 Gemischs der beiden Oligonucleotide keine
Aenderung gegenüber der Summe der CD-Effekte der beiden einzelnen Oligonucleotide. Diese beiden
Resultate zeigen für diesen Fall eindeutig, dass keine DNA - Homo-DNA Hybridpaarung eintritt.
-90- allgemeiner Teil
ob DNA und Homo-DNA eine Paarung eingehen und ob diese, falls sie
vorhanden wäre, parallel oder antiparallel orientiert ist.
Kreuzungsexperiment mit d(AACATACT) + dd(AGTATGTT)% Hyperchromizität
8
7
6
5
4
3
2-
i: y
„»•»•»
^"
^.•"•Ü5-.*""I~ 1 :1 Gemisch
/r
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.49: Da die Summe der Schmelzkurven der einzelnen Oligonucleotidkomponen-
ten genau dieselbe Schmelzkurve ergibt, wie das 1 :1 Gemisch von DNA Teststrang und
dem antiparallel orientierten Homo-DNA Komplementärstrang, ist bewiesen, dass
keine antiparallel orientierte DNA - Homo-DNA Paarung stattfindet.
dIAACATACT) + dd(AGTATGTT): -°C (je 4.5 pM, -% Hyp.)
Die Tatsache, dass die Summe der Hyperchromizitäten der UV-Schmelzkurven
der einzelnen Spezies nahezu identisch mit der Schmelzkurve des 1 : 1 Gemischs
dieser Spezies ist (für den Fall mit antiparalleler DNA - Homo-DNA
Strangorientierung vergleiche man mit Abbildung C4.49, für denjenigen mit
paralleler Strangorientierung mit Abbildung C4.50), zeigt als besonders klares
Beispiel, dass eine DNA - Homo-DNA Hybridpaarung selbst unter Einbezug aller
vier Nucleobasen nach dem Watson-Crick-artigen Basenpaarungsmuster nicht
eintritt.
-91- allgemeiner Teil
Kreuzungsexperiment mit d(AACATACT) + dd(TTGTATGA)% Hyperchromizität
8-
7-. y
6-
5-
4-
3-
2-
1 -
0
/
,*»".•»«•"'
,-•*„„£#. 1 : 1 GemiSCh
—I——l——l——l—'—i——l——l——I——l——l
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4J50: Auch mit dem zum DNA Teststrang parallel orientierten Homo-DNA
Oligonucleotidstrang findet keine Paarung statt.
d(AACATACT) + dd(TTGTATGA): -°C (je 55 pM, - % Hyp.).
Homo-DNA verhält sich also auch mit Watson-Crick-artiger Purin-Pyrimidin
Basenparung autonom.
Mit einem nicht denaturierenden Polyacrylamidgelexperiment konnte dieser
Befund bestätigt werden (vgl. C4.51). Auf Bahn 8 wurde ein 1 : 1 Gemisch von
d(AACATACT) und dd(AGTATGTT), was zu einem antiparallel orientierten
Duplex und auf Bahn 9 ein 1 : 1 Gemisch von d(AACATACT) und
dd(TTGTATGA), was zu einem parallel orientierten DNA - Homo-DNA Duplex
führen würde, aufgetragen. Wie man deutlich sieht, bleiben in den Bahnen 8
und 9 jeweils zwei Banden bestehen, die gleich weit laufen, wie die jeweiligen
Einzelstränge auf Bahn 1 (d(AACATACT)), 5 (dd(TTGTATGA)) und 6
(dd(AGTATGTT)). Es liess sich also auch im Gelexperiment zeigen, dass keine
Paarung zwischen Homo-DNA und DNA eintritt.
-92- allgemeiner Teil
in
•o 2•0 •0
H H
U §O < o 3 t* < u
(> H < o O
< O < H r-i H H S i< «: h h
< < AACAT TTGTArt <
t
AACA TTGT AACAT TTGTA1
AACAAGT Ü TTG <
T3 •0T3
2
I
Abb. C4.51: 20% Acrylamid (30 : 1 Bis), 0.1 M Tris, 0.1 M
Borsäure, 5 mM Mgd2, pH 8.1,8 W, 20 h, 3°C, Angefärbt mit
'stains all'-Lösung
Sowohl vom Homo-DNA als auch vom DNA Duplex (jeweils der beiden
antiparallel orientierten Komplementärstränge) wurden die thermodyna¬mischen Daten durch Analyse der oligonucleotidkonzentrationsabhängigen
Schmelztemperaturen nach Methode ® in Kapitel C.4.1 bestimmt (1 M NaCl).
-93- allgemeiner Teil
AH°VH
[kcal mol-1]
AS°
[cal mol"1 K-l]
TAS°(298K)
[kcal mol-1]
AG0 (298 K)
[kcal mol-1]
dd(AACATACT) +
dd(AGTATGTD
1.0 M Nad
-12.4 -106 -32.1 -10.3
d(AACATACT) +
d(AGTATGTT)
1.0 M NaQ
-51.3 -146 -44.3 -7.0
Auch hier bestätigt es sich einmal mehr, dass DNA zwar enthalpisch stabiler ist,
der für Homo-DNA günstigere Entropieterm aber eine deutlich grössere Stabilität
des Duplexes ermöglicht, wie aus dem Vergleich der AG-Werte hervorgeht.
C.4.6 oc-Homo-DNA Oligonucleotide1
Diese Paarungsexperimente wuden von R.P. Hammer [82] durchgeführt und
sind der Vollständigkeit halber in die vorliegende Arbeit aufgenommen worden.
Im Hinblick darauf, dass a-DNA sowohl mit ß-DNA, als auch mit dem
entsprechenden a-Komplementäroligonucleotid paart, wurde dies auch in der
Homo-DNA Serie untersucht. Diese Untersuchungen wurden der Einfachheit
halber bei monobasigen Oligonucleotiden der Homo-DNA Reihe mit Adenin-
und Thymin-Nucleosiden durchgeführt.
Wie aus den Schmelzkurven sowohl von dd(a-As) als auch von dd(a-A6)
hervorgeht, tritt keine AA-Paarung zwischen zwei Homo-DNA Strängen mit
einer a-Konfiguration am anomeren Zentrum auf (vgl. Abb. C4.52).
1 Helene et al. [66] untersuchten die Eigenschaften eines d(aT,) mittels CD-Spektroskopie. Sie
fanden, dass d(aT() mit d(ßAs) ebenfalls einen stabilen 1 :1 Komplex bilden. Imbach et al. zeigten,dass a-DNA-Oligonucleotide mit einer beliebigen Basensequenz mit einem komplementären ß-Oligonudeotid auch antiparallel paaren, dass die Paarung immer noch Watson-Crick-artig ist und
dass die Duplexstruktur dem B-Konformationstyp ähnlich ist, wie aus NMR-Experimentengeschlossen wurde [67], [68], [69].Ein d(aT.) Oligonucleotid bildet gleich wie ein d(ßT„)-01igonucleotid einen zum Purinstrangparallel orientierten T2A-Tripelstrang [70].
-94- allgemeiner Teil
dd(cc-A5) und dd(cc-A6)% Hyperchromizität
15'
10
0-T-
ddJa-As) Schmelzen p.•»
. ^* *
* *
.!»? dd(a-A6) Erhitzen
dd(a-A6) Abkühlen
-i—i—i—|—i—|—i—r——i——i——i——i——i
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.52: Reversible Schmelzkurven von dd(a-A«) 8.8 pM und dd(a-A5) 115
pM. Es findet keine Selbstassoziation von a-Homo-deoxy-adenosin statt.
Die Schmelzkurven eines 1 : 1 Gemischs von einerseits dd(a-As) und dd(ß-T$)
und anderseits dd(a-A6) und dd(a-Tj) zeigte ebenfalls keinen kooperativen
Uebergang, so dass eine Paarung zwischen aa-, wie auch aß-konfigurierten
Oligonudeotiden ausgeschlossen werden muss (Abb. C4.53).
dd(cc-A6) + dd(a-T6) / dd(a-A6) + dd(ß-T6)% Hyperchromizität
10- ^„dd(a-A6) + dd(a-T6)
8-
6-
**>'** je 10.0 uM
***^~*~
dd(«-A6) + dd(ß-T6)
jr"*'-******'^ je 5.0 uM
4-
2-4^
0 10 20 30 40 50 60 70 80 "C
Abb. C4.53: Es findet kein Paarung von a-Homo-deoxy-adenosin und a-Homo-thymidin
sowie von a-Homo-deoxy-adenosin und ß-Homo-thymidin Hexameren statt. Die
Konzentration an Oligonucleotid war im Experiment mit a-Homo-thymidin je 10.0 uM im
Experiment mit ß-Homo-thymidin je 5.0 pM. Die Schmelzkurven wurden im
Standardpuffer bei 260 nm bestimmt.
-95- allgemeiner Teil
Im Fall des alternierenden Oligonucleotids dd(aT-aA>3 liess sich eine Paarung
anhand der ersten gemessenen UV-Schmelzkurve (bei c = 7.3 uM, Abb. C4.54)
nicht ohne weiteres ausschliessen, denn sie zeigte von 0°C an mit steigender
Temperatur einen anfänglich steilen Kurvenverlauf, der mit höherer Tempera¬
tur abflachte.
dd(aT-oA)3 0.15 M und 1.5 M NaCl
% Hyperchromizität
2-
.-*• •••
„»»^* *•
r•«;..«"14.
..•:."
•V*
*•
—i—
10 20 30 40
7.3 uM, 0.15M NaCl
3p.M, 1.5MNaCI
50 °c
Abb. C4.54: Der Verdacht, dass es sich bei der Schmelzkurve von dd(aT-aA)j bei 7.3 pM um
den obersten Teil einer Schmelzkurve handeln könnte, konnte beseitigt werden, weil die
Erhöhung der NaCl- und der Oligonucleotidkonzentration zu keiner deutlichen Erhöhung
der Hyperchromizität und somit zur Erhöhung eines allfälligen Schmelzpunktes führte.
Diese Kurvenform hätte als das Ende eines Schmelzprozesses interpretiert
werden können. Um nun festzustellen, ob es sich wirklich um ein
Schmelzverhalten handelte, bestanden zwei verschiedene Möglichkeiten:- Synthese eines längeren Oligonucleotids, das im Fall einer Paarung einen
höheren Schmelzpunkt haben müsste und somit eine vollständige
Schmelzkurve im Temperatur vs. Hyperchromizität Diagramm ergeben
müsste.
- Die Zugabe von NaCl oder eines anderen Elektrolyten würde zu einer
verminderten Interstrang Phosphat-Repulsion führen [71], [72], was
wiederum zu einer Erhöhung der Schmelztemperatur führen würde.
Diese Erhöhung der Schmelztemperatur müsste sich darin äussern, dass
ein grösserer Teil der Schmelzkurve sichtbar würde und damit die
Hyperchromizität der Schmelzkurve mit höherer NaCl Konzentration
-96- allgemeiner Teil
deutlich höher liegen müsste. Gleichzeitig könnte in diesem Experiment
die Oligonucleotidkonzentration noch erhöht werden, was die
Schmelztemperatur noch weiter erhöhen sollte.
Dieses zweite Experiment wurde durchgeführt, und es zeigte sich, dass keine
Zunahme der Hyperchromizität beobachtet werden konnte. Es tritt also auch im
Fall von dd(aT-aA>3 keine Paarung ein.
Zusammenfassend lässt sich über a-Homo-DNA sagen, dass sowohl AA- wie
auch AT-Paarungen, wenn überhaupt, erst bei viel längeren Nucleotidsequen-
zenen eintreten. Mit Sicherheit sind aber eventuelle Basenpaarungen deutlich
schwächer als analoge Oligonucleotide in der Reihe der ß-Homo-DNA. Eine
gemischte Paarung zwischen Oligonucleotiden mit a- und ß-Konfiguration
existiert zumindest für Adenin- und Thymin-haltige Homo-DNA Oligonucleo¬
tide nicht.
C.4.7 Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltende
Oligonucleotide
C.4.7.1 Einführung
Die Synthese von Homo-deoxy-7-carbaadenosin und Oligonucleotide, die dieses
Nucleosid enthalten, wurden im Hinblick auf die Aufklärung der Struktur der
AA-Paarung in Angriff genommen. Sowohl auf diesem als auch auf anderen
Gebieten lieferten Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltende Oligonucleotidesehr aufschlussreiche Informationen. So trugen sie zur Aufklärung der Struktur
der AC-Paarung, der Absicherung der Watson-Crick-artigen AT-Basenpaarung
und zum ersten Zugang zu einem dd(T6) - 'dd(An)' Duplex bei1.
1 dd(An) steht in Anführungszeichen, da nicht ddA, sondern nur das 7-Carbaanaloge eben dd(7CHA)
verwendet wurde.
-97- allgemeiner Teil
C.4.7.2 Homo-deoxy-7-carbaadenosin und die Frage der
Konstitution der AA-Paarung
Aus den Arbeiten von Böhringer [18], unter anderem den NMR-Analysen, ging
hervor, dass die Nucleobase in dd(An) immer anti zum Zucker steht. Unter der
weiteren Voraussetzung der bewiesenen antiparallelen Orientierung der
Oligonucleotidstränge verblieben von den vorgeschlagenen Basenpaarungsstruk¬turen nur noch deren zwei (vgl. Abb. C4.55).
H N=\n ^.oh
'oh
übII
Imino-Paarung
Abb. C4.55: Die zwei Möglichkeiten einer Homo-AA-Paarung, die antiparallele
Strangorientierung bei anti-Orientierung der glycosidischen Bindung erlauben.
Nach den Ergebnissen von Diedrichsen [89] entfällt eine Iminopaarung. Eine
sehr willkommene Stützung dieser Resultate wurde durch Oligonucleotide, die
Homo-deoxy-7-carbaadenin enthalten, erbracht.
Wenn man einen H-Brückenacceptor durch eine neutrale Gruppe ersetzen
würde, könnte effizient eine H-Brücke selektiv eliminiert werden. Die
-98- allgemeiner Teil
exozyklische N(6) Aminogruppe kann nicht entfernt werden, da dann jeweils
beide Wasserstoffbrücken sowohl in I, wie auch in II wegfallen würden. Eine
Paarung wäre dann in jedem Fall ausgeschlossen.Wenn man aber das N(7) durch eine bezüglich Wasserstoffbrückenbildung
neutrale CH-Gruppe ersetzt, ist eine Basenpaarung im Fall I sehr wohl noch
möglich, bei II würde nur noch eine einzige H-Brücke je Basenpaar möglich sein,
und ein Duplex hätte, sofern er überhaupt noch entstünde, eine deutlich tiefere
Schmelztemperatur als der von dd(A6) gebildete Duplex.
dd(A6) - dd(7CHA5-A)% Hyperchromizität
8-«
6-
4-
dd(Ag) 9.5 uM•
•
•
•
•
2-•
•
0-
-2-
C
""•-•—w— dd(7CHA5-A) 8.7 p.M
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.56: Das Homo-deoxy-7-carbaadenosinoligonucleoHd zeigt im Gegensatz zu dd(Aj)
kein Schmelzverhalten. dd(A4): 43°C (9.5 pM, 7% Hyp.); dd(7CHAs-A): -°C (8.7 pM, -%
Hyp.).
Wie die Schmelzkurven in Abb. C4.56 sehr schön illustrieren, findet im Fall
von dd(7CHAs-A) keine Paarung mehr statt. Dieses Resultat zeigt indirekt, aber
nichts desto weniger eindeutig, dass die AA-Paarung dem Typ I entsprechenmuss.
In einer reverse Hoogsteen-artigen AA-Paarung sind die beiden Partner nicht
gleich verknüpft. Das eine Adenin paart als Pyrimidin Partner (Watson-Crick-
artig gepaart) und das andere als Imidazol Partner (Hoogsteen-artig gepaart).Im AA-gepaarten Homo-DNA Duplex sind verschiedene Abfolgen der Imidazol
resp. Pyrimidin Partner in einem Oligonudeotidstrang möglich (vgl. Abb. C4.57).
Homo-deoxy-7-carbaadenosin kann nur mit seinem Pyrimidinkern eine Watson-
-99- allgemeiner Teil
Crick-artige Paarung eingehen. Deshalb ist an der Stelle in Abbildung C4.57, wo
WC steht ein Homo-deoxy-7-carbaadenosin zu verstehen.
H WCn rH WC-n rH WCi rH WC
H WC- -H WC- -H WC- -WC H
H WC- -H WC- -H WC- -H WC
H WC- -H WC- -WC H- -WC H
H WC- -H WC- -WC H- -H WC
H wc-l LWC H-> LWC HJ LWC H
II III IV
Abb. C4.57: Müssen bei einer AA-Paarung in Homo-DNA die Watson-Crick-Donoren alle auf
einem Oligonucleotid angeordnet sein, müssen sie alternieren oder ist die Reihenfolge frei? WC
steht für Watson-Crick-artig gepaarte Nucleoside (Homo-deoxy-7-carbaadenosin) und H für
reverse Hoogsteen-artig gepaarte Nucleoside.
Das Oligonucleotid dd(7CHA3-Aj) entspricht dem Paarungsschema III und
dd(7CHA-A)3 dem Paarungsschema IV in Abbildung C4.57.
Wie man den Schmelzkurven von drei Oligonucleotidtypen in AbbildungC4.58 entnehmen kann, ist die Schmelztemperatur höher, je homogener die
Funktionen der Paarungspartner (Pyrimidin- oder Imidazolpartner) auf je einem
Oligonucleotidstrang verteilt sind.
% Hyperchromizität8-
6-
• • dd(A6) 9.5 pM
,CHdd(7"nA-A)3 17.0 uM
,CHdd(7onA3-A3) 15.8 uM
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.58: Die Schmelzkurven zeigen deutlich, dass alle Watson-Crick-Donoren in einer AA-
Paarung auf einem Oligonucleotidstrang angeordnet sein müssen, denn die Schmelztemperatur
-100- allgemeiner Teil
mit einem Funktionswechsel liegt schon deutlich unterhalb demjenigen von dd(A6), aber
deutlich höher als diejenige der Sequenz mit 5 Funktionswechsel dd(7CHA-A)3.
Sequenz Anzahl
Funktionswechsel
Tm[°C]
dd(7CHA-A)3 5 < 20°C (15.8 uM)
dd((7CHA)3-A3) 1 33°C (17.0 uM)
dd(A6) 0 43°C (9.5 uM)
Aus der Tatsache, dass die Blocksequenz dd(7CHA3-A3) eine tiefere
Schmelztemperatur aufweist als dd(A«), muss geschlossen werden, dass im Fall
von dd(A6) entlang des Oligonucleotids kein Paarungsfunktionswechselstattfindet, dass die Hoogsteen- und Watson-Crick-artig gepaarte Basen jeweils
homogen auf einem Strang vorliegen (vgl. I in Abb. C4.57), und dass ein
Funktionswechsel zu Struktur III in Abbildung C4.57, wie es im Fall von
dd(7CHA3-A3> unumgänglich ist, sich destabilisierend auswirkt. Diese Ordnungdürfte allerdings nicht fix sein, sondern müsste sich in einem schnellen
Austausch befinden, da die NMR - Experimente von Böhringer im Fall von
dd(A«) keinen Hinweis auf zwei verschieden gepaarte Oligonucleotidstränge
zeigen [18].
Von diesen Oligonucleotidsequenzen wurden noch CD-Spektren gemessen.
Wie man sieht, gleichen sich die Spektren immer mehr demjenigen von dd(A«)
an, je weniger Funktionswechsel sie haben.
5°C
Abb. C4.59: CD.Spektren bei 5°C von dd(A<): 16.7 pM; dd^Aj-A,):
19.0 pM; ddCT^A-A),: 233 pM.
-101- allgcmemer Teil
C.4.7.3 Beitrag von Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltenden
Oligonucleotiden zur Kentnis der AC-Paarung
Wie in Kapitel C.4.4 postuliert, existiert eine AC-Paarung. Diese AC-Paarung ist
relativ schwach. Sie ist die bisher schwächste aller aufgefundenen Paarungen, die
Homo-deoxy-adenosin mit einem anderen Nucleosid eingeht. Sie wurde bisher
nur in alternierenden AC-Sequenzen festgestellt, da in blockweisen Sequenzen
(dd(A4C4> und dd(A5C5)) jeweils eine AA-Paarung vorliegt, wie mittels CD-
Spektroskopie gezeigt wurde. Unter Annahme einer anti Orientierung der
glykosidischen Bindung von Homo-deoxy-adenosin und Homo-deoxy-cytidin bei
antiparalleler Strangorientierung würde also nur die Paarung, die in Abbildung
C4.60 mit Typ II bezeichnet wurde, erlaubt sein. Typ I wurde nämlich bei einer
anti Orientierung der glycosidischen Bindung eine parallele Strangorientierung
oder aber bei antiparalleler Strangorientierung eine syn-/anti-Orientierung der
glycosidischen Bindungen von Homo-deoxy-adenosin resp. Homo-deoxy-cytosin
voraussetzen.
HO HO
frO
H-N
H"
\
\
H
1
1
°Jho rHO II
Abb C4 60. Unter der Voraussetzung, dass die Nucleobasen in ihren stabilsten
tautomeren Formen eine AC-Paarung eingehen und dass der glycosidische Winkel der
Nudeotide bei einer AC-Paarung jeweils anti zum Zuckerring steht, sind I und II die
einzigen Möglichkeiten für eine Homo-AC-Paarung
-102- allgemeiner Teil
Die UV-Schmelzkurve von dd(7CHA-C)j (vgl. Abb. C4.61) zeigt mit steigender
Temperatur eine lineare Abnahme der Absorption bei 260 nm, also keine
Selbstpaarung. Das beweist, dass eine Hoogsteen-Paarung bei einer AC-
Interaktion vorhanden sein muss. Es verbleibt unter Einbezug der hauptsächlich
vorliegenden tautomeren Form von Cytosin nur die Möglichkeit einer
Basenpaarung der Struktur des Typs II, welche dann zu antiparalleler
Orientierung der Oligonucleotidstränge führt. Das Experiment zeigte also
gleichzeitig, dass die Oligonucleotidstränge antiparallel orientiert sind und damit
in den bisher bekannten Paarungseigenschaften der Homo-DNA keine
Ausnahme bildet.
dd(AC)6 - dd(7CHA-C)6% Hyperchromizität
15-#B##
..•"*' ——-~~— dd(AC)6 8.1 pM
10-•
•
5-
0-
•
•
••
^^*"'*,M*,*,*-**wdd(7CHA-C)6 8.0 uM
c 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.61: dd(7CHA-C)» zeigt im Gegensatz zu dd(AO« keinen kooperativen Schmelzübergang, was
beweist, dass eine AC-Paarung reverse Hoogsteen-artig gepaart sein muss.
C.4.7.4 Einige neue Informationen zur AT-Paarung
Die Eigenschaften der AT-Paarung wurde sehr ausführlich von H.-J. Roth in
seiner Arbeit beschrieben [21]. Ergänzend zu den NMR-Untersuchungen von
Roth [21] anhand des AT-gepaarten Oligonucleotids dd(A5T5) wurden unter
Verwendung des Homo-deoxy-7-carbaadenosinnucleosids Sequenzen
konstruiert, welche die Art der AT-Paarung auch mit Schmelzexperimenten
aufzeigen lässt. Bisher ist es aufgrund von Selbstpaarungseigenschaften von
Homo-deoxyadenosin Oligonucleotiden noch nicht gelungen, die AT-Paarung in
-103- allgemeiner Teil
monobasigen Homo-deoxyadenosin und Homo-thymidin Sequenzen zu
beobachten.
Mit monobasigen Homo-deoxy-7-carbaadenosin Sequenzen, die keine
Selbstpaarung des AA-Typs eingehen können, ist es gelungen, eine pseudo AT-
Paarung in monobasigen Oligonucleotiden aufzuzeigen und thermisch zu
denaturieren. Man vergleiche dazu die UV-Schmelzkurven in Abbildung C4.62.
Man erreichte mit diesem Experiment zwei Ziele:
- erstens wurde erneut bewiesen, dass A mit T wirklich nach dem Watson-Crick
Modus paart.- zweitens konnte zum ersten Mal ein Duplex aus monobasigen Oligonucleo¬
tiden 'dd(A6)' • dd(T6) hergestellt werden.
% Hyperc25-
20-
15-
10-
5-
dd(AT)3 - dd(7CHA5-A)-dd(T6)""""i^'
^dd(7CHA5-A)
/*"* -"-•*•—~+ dd(T6) je 88 ^M
.^"""———- dd(AI)3 12.8 uM
C
f 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.62: Vergleich des monobasigen dd(T6) • 'dd(A«)' - Duplex mit dem
alternierenden dd(AT)j Oligonucleotid. dd(7CHA5-A) • dd(T»): 23°C (je 8.8 pM, 24 %
Hyp.); dd(AT)3: 24°C (12.8 pM, 19% Hyp.).
Das CD Spektrum von dd^HAs-A) • dd(T6) (Abb. C4.64) weist deutlich auf eine
Watson-Crick-artige AT-Paarung hin (man vergleiche auch mit den CD-Spektren
von dd(AT)5 und dd(A5T5) in [21]).
-104- allgemeiner Teil
Abb. C4.64: Das CD-Spektrum von dd(7CHA5-A) • dd(T4) entspricht
ziemlich genau demjenigen der alternierenden Homo-AT-
Oligonucleotidsequenz dd(AT)j, die Roth [21] gemessen hat.
C.4.7.5 Der Purin-Purin-Purin Triplex1
Die Experimente in diesem Kapitel wurden zum Teil von K. Zimmermann [81]
durchgeführt.
Untersuchungen von Fräser [52] und Hunziker [22] über Paarungseigenschaftenvon Oligonucleotiden der Homo-DNA Serie, die Isoguanin und Guanin als
Basen enthalten, zeigten die Existenz einer Gl-Paarung, die vermutlich Watson-
Crick-artig dreifach verbrückt ist.
Dass diese Homo-GI Paarung dreifach verbrückt ist, wird aus den hohen
Schmelztemperaturen geschlossen (dd(Ge) + dd(l6>: 61°C je 9 uM). Diese
Schmelztemperaturen sind ähnlich hoch wie diejenigen des dreifach Watson-
Crick-artig verbrückten Homo-GC Duplexes in dd(G6) • dd(C6) (Tm= 58 °C, je
9uM).
Eine Gl-Paarung mit diesem Paarungsmuster (Abb. C4.65) besitzt bei geforderter
anti-Orientierung der glycosidischen Bindung im Duplex antiparallel
angeordnete Oligonucleotidstränge.
1 In natürlichen Oligonucleotiden konnte bisher nur ein Purin-Purin-Purin Tripelstrang von RNA
nachgewiesen werden, nämlich der (r(H.))2 • r(A,) durch Arnott [73]. Bei diesem Tripelstranghandelt es sich eigentlich nur um ein zu einem Purinringsystem vergrösserten (rdJ„))2 • r(A„) Triplex.
-105- allgemeiner Teil
..o.XV^'OHOH
HO
HO"
Abb.C4.65: Von Fräser [47] und Hunziker [22] postulierte Homo-G Homo-I
Paarung.
Im Hinblick auf die Frage nach der Möglichkeit einer Sequenzreproduktion via
Triplexstrukturen1 von Homo-DNA nach dem Hoogsteen-Modus wurden die
Paarungseigenschaften von dd(A6), dd(Gt) und dd(l6> in verschiedenen
stöchiometrischen Anteilen untersucht.
1 Felsenfeld und Rieh fanden anhand von Mischkurven, dass poly(U) und poly(A) einen stabilen 2 :1
Komplex bilden (75]. Der dritte Oligonucleotidstrang (poly(U)) lagert sich in einem solchen
Komplex in der major groove des poly(A)-polyCU) Duplexes an und paart reverse Hoogsteen-artigmit dem poly(A) Strang.
<-CK
Kurz nach diesen Versuchen wurden auch DNA Triplexe gefunden: d(A„) (d(T„))2 und auch solche
mit einem protonierten Cytosinoligonucleotid und einen GC-Duplex [76], [77], [78].
Amol konnte anhand einer Röntgenkristallstrukturanalyse zeigen, dass die von Rieh aufgestelltenVoraussagen zutreffen [79].
Folgendes Schema der vier wichtigsten Triplexe nach Dervan und Mitarbeitern [80] gibt Aufschluss
über die Orientierung der Oligonucleotide zueinander (Bemerkungen zur Abbildung:'-' bedeutet
jeweils, dass die 5'-3' Richtung nach unten zeigt,'+', dass die 5'-3' Richtung des Oligonucleotids aus
der Zeichenebene herauskommt).
+ ++++- +
arvc b>A-: oy^Gf d^GCEine Hoogsteen-Paarung ist also auch in natürlicher DNA, da allerdings nur in Triplexen, möglich(die AA- und die GG-Paarung in b) und c) entsprechen den von uns für Homo-DNA postulierten AA-
und GC-Paaningen) [80].
-106- allgemeiner Teil
In all diesen Versuchen konnten der hohen Selbstpaarungseigenschaften dieser
Sequenzen wegen nur Gemische von Duplexen beobachtet werden.
Die Duplexschmelztemperaturen der zugrundeliegenden Oligonucleotideweisen alle eine Schmelztemperatur von über 40°C bei 15 - 20 uM auf (Tm: dd(A6)
= 47°C, dd(G6) = 43°C, dd(I«) = 42°C). Dies ist insbesondere relevant, da die
Abspaltung des dritten Stranges mit einem Tm-Wert von etwa 20°C verknüpftsein müsste, wie in den folgenden Experimenten mit Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltenden Oligonucleotiden gezeigt werden konnte.
Das einzige Purinoligonucleotid, das genügend starke Watson-Crick-artige
Paarungen ausbilden könnte, ohne selbst eine hohe Schmelztemperatur bei
Selbstassoziation zu zeigen, war das dd((7CHA)j-A) (Kapitel C.4.7.2).
Ein nicht denaturierendes Polyacrylamidgel, auf dem ein 1:1:1 Gemisch an
dd(Ge): ddfU): dd(7CHA5-A) aufgetragen wurde, zeigte eine neue Bande, die als
Triplex gepaarte Spezies interpretiert wurde1. Aus diesem Grund wurde
versucht, auch mittels UV-Schmelzexperimenten die Triplexbildung zu
bestätigen (Abb. C4.66).
Purin-Purin-Purin Triplex mit Homo-DNA
% Hyperchromizität15
10
—CT i
/ dd(G6) + dd(l6) + dd(7CHA5-A)
i——i——i——i——i—i—i——i——i
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C4.66: Schmelzkurve eines 1:1:1 Gemischs von dd(G6): dduV: dd(7CHAr
A). Es zeigten sich zwei verschiedene, sauber getrennte Schmelzübergänge, die
sich nur mit dem Auseinanderbrechen eines Tripelstranges zu einem Duplex (bei
etwa 20°C) und bei etwa 63°C des übriggebliebenen Duplexes erklären lassen.
Tm: 21/63°C (je 6.0 pM, 7/6% Hyp.).
^Alle nicht denaturierenden G-I PAGE-Experimente werden von K. Groebke [42] erläutert und
detailiert besprochen.
-107- allgemeiner Teil
Tatsächlich erhielt man zwei sauber getrennte Uebergänge, die nur mit dem
Uebergang eines Tripelstranges zu einem Doppelstrang und einem Einzelstrang(tiefe Temperatur) und anschliessender Spaltung des verbliebenen
Doppelstranges erklärt werden können. Die Temperatur des zweiten
Schmelzprozesses stimmt sehr gut mit derjenigen des dd(G6) • dd(I6) Duplexüberein und ordnet somit dem Schmelzprozess bei der tieferen Temperatur den
Uebergang vom Triplex zum dd(7CHAs-A) und dem dd(G6) • dd(I6) Duplex zu.
Die Schmelzkurve des Tripelstranges ist vollständig reversibel.
Abb. C4.67: Das temperaturabhängige UV-Spektrum von dd(G«): dd«,)
: dd(7c"A5-A) -1:1:1, je 6.0 pM im Standardpuffer pH 7.0.
Das temperaturabhängige UV-Spektrum (Abb. C4.67) und die CD Messung (Abb.
C4.68) verdeutlichen diese Resultate in einer anderen Form. In der Grundaussage
entsprechen auch sie der in der Schmelzkuve gefundenen Tatsache von zwei
Uebergängen.
-108- allgemeiner Teil
Abb C4 68 Das temperaturabhängige CD-Spektrum von dd(G() dd(I4)
dd(7CHA5-A) = 1 1 1, je 4 65 pM im Standardschmelzpuffer pH 7 0 zeigt einen
deutlichen Unterschied für das Tnplex CD-Spektrum (3°C, 10°C) gegenüber dem
GI-Duplex + dd(7CHA5.A)-Spektrum (Kurven bei 350C, 50°C) Die Bande bei 297
nm verschiebt sich bathochrom, die Bande bei 270 nm verschwindet und die
Bande bei 252 nm verschiebt sich hypsochrom beim Uebergang vom Tnplex zum
Gl-gepaarten Duplex
dd(Gs) • ddO«) • dd(7CHA5-A)
Tm 21oC(je60pM,7%Hyp)
dd(G6)dd(I6) +dd(7CHA5-A)
Tm 63°C(je60pM,6%Hyp)
dd(G6) + dd(I6)
t
Abb C4 69 Schema des Schmelzprozesse des Tnplex dd(G«) dd(I«) dd(7CHArA)
1 Uebergang Zerfall des Tnplexes in einen GI-Duplex (21°C) und dann Zerfall des
GI-Duplexes in die Einzelstränge (63°C)
Wie aus Abb. C 4 70 hervorgeht, wird der dritte Strang (dd7CHAs-A) antiparallelzum Strang orientiert sein, an den er gebunden ist (also antiparallel an ddde)),
wenn wir die üblicherweise gefundene anti-Orientierung der glycosidischen
-109- allgemeiner Teil
Bindung voraussetzen. Das dem Tripelstrang zugrunde liegende Basentriplett
kann eigentlich nur diese Basenpaarung aufweisen, denn eine Paarung des 7-
Carbaadenin mit Guanin ist auszuschliessen
CMX.
-o. i=\-£^Ä"H-\ \. ....-'* V^
H
..-H'Y
HO
HO"
Abb. C4.69: Die einzige Möglichkeit, ein G-I-TCHA-Triplex bei vorgegebener
H-N(3) Tautomerie am Isoguanin zu formulieren.
Untersuchungen über Duplexstrukturen und Eigenschaften in der AI-Reihe
von Homo-DNA Oligonucleotiden wurden von K. Groebke [42] ausgeführt und
beschrieben. Die gegenüber einer isostrukturellen AI-Duplexpaarung gefundene
Schmelzpunktabsenkung von über 20°C hängt möglicherweise mit den
veränderten Ladungsrepulsionseffekten im Triplex gegenüber einem Duplex
zusammen.
-110- allgemeiner Teil
C.5 Oligonucleotide der Allopyra-nose-Reihe, die Allopyranosyl-isoguanin enthalten
C.5.1 Einleitung
Es ist aus Arbeiten von Fischer und Helg [50], [51] bekannt, dass Allopyranose-NA Oligonucleotide deutlich tiefere Schmelztemperaturen als Homo-DNA
Oligonucleotide mit der gleichen Sequenz haben. So ist die Schmelztemperatureines allo(A12) (Tm = 29°C, 10.0 uM, 56% Hyp.) sogar noch tiefer als diejenige des
nur halb so langen Homo-DNA Oligonucleotids dd(A6) (Tm = 43°C, 9.5 uM, 7%
Hyp.). Auch die CD-Spektren von Allopyranose-NA Oligonucleotiden
unterscheiden sich deutlich von den CD-Spektren der analogen Homo-DNA
Oligonucleotide, was auf eine andere Struktur der Allopyranose-NA
Oligonucleotide schliessen lässt.
Zwischen Allopyranose-NA und Homo-DNA bestehen allerdings auch
Gemeinsamkeiten. So ist in der Homo-DNA eine AU-Paarung deutlich
schwächer als eine AA-Paarung. In der Allopyranose-NA Reihe konnte bisher
noch keine AU-Paarung beobachtet werden. Weder allo(AU)«, noch
allo(UUAAAAUAAUUU) mit dem komplementären Oligonucleotid
allo(AAAUUAUUUUAA) zeigten Hinweise auf AU-Paarungen, sondern nur
auf AA-Paarungen, wie sich aus den CD-Spektren ergab.
Der Grund für die im Vergleich zur Homo-DNA drastisch abgeschwächten
Paarungen liegt vermutlich darin, dass die äquatoriale 2'-Hydroxygruppe der
Allopyranose eine Basenstapelung stört und deshalb die Schmelzenthalpie z.B.
des Adenin-Adenin gepaarten Duplexes gegenüber der Homo-DNA Reihe
drastisch abschwächt (Abb. C5.1).
-111- allgemeiner Teil
Abb. C5.1: Die äquatoriale 2'-Hydroxygruppe liegt direkt zwischen den
Basenebenen und stört auf diese Art das 'base stacking'.
Für diese Erklärung sprechen auch die thermodynamischen Daten von
allo(Ai2). Der Vergleich mit dem halb so langen und deshalb halb so viele
Wasserstoffbrücken (eine gleichgeartete AA-Basenpaarung wird hierbei
vorausgesetzt) aufweisenden dd(A«) ergibt folgende Daten:
AH°VH
[kcal mol-1]
AS0
[cal mol"1 K-1]
TAS°(298K)
[kcal mol-1]
AG0 (298 K)
[kcal mol-1]
dd(A6)1 -39.4 -101 -30.2 -9.2
allo(Au) -67.8 -202 -60.1 -7.7
Der Enthalpieterm von allo(Ai2> ist im Gegensatz zum Entropieterm
betragsmässig nicht doppelt so gross wie derjenige von dd(A6>, was bedeutet, dass
die Schwächung der AA-Paarung der Allopyranose NA gegenüber Homo-DNA
enthalpischer Natur ist.
Untersuchungen von K. Groebke mit Altropyranose-NA [42], bei der die 2'-
Hydroxygruppe axial steht, und von R.P. Hammer mit 2'-Deoxyallopyranose und
3'-Deoxyallopyranose [82] zeigten sehr deutlich den markanten Einfluss der
äquatorialen 2'-Hydroxygruppe von Allopyranose2. Mit Altropyranose-NA und
1 Die thermodynamischen Daten wurden von M. Böhringer (dd(A<)) [18], resp. R. Fischer (allo(A12))[50] nach der Methode ® in Kapitel C.4.1 gemäss Marky & Breslauer [59] bestimmt.2 Die Resultate der angetönten Experimente sind in wenigen Worten zusammengefasst:- Ein Altropyranosyl-adenin Dodecamer hat eine Schmelztemperatur von 39°C (8.5 pM, 20% Hyp.)[42].
-112- allgemeiner Teil
noch deutlicher mit 2'-Deoxyallopyranose-NA wurde gegenüber Allopyranose-
NA eine markante Erhöhung der Schmelztemperatur erzielt, während die
Schmelztemperatur bei 3'-Deoxyallopyranose-NA vergleichbar niedrig wie
diejenige von Allopyranose-NA ist.
Wie Fräser [47] in der Homo-DNA Reihe zeigte, bildeten Homo-deoxy-
isoguanin und Homo-deoxy-guanosin (neben dem Nucleotidpaar mit den
Aglycons Diaminopurin und Xanthin [42]) die stärkste Basenpaarung aus.
Bilden nun Isoguanin- und Guanin-haltige Allopyranose-NA Oligonucleotid-
duplexe mit deutlich höheren Schmelztemperaturen als z.B. allo(Gn) oder
allo(A„)? Paaren allfällige Duplexe in einer Watson-Crick-artigen Weise, wie im
Fall von Guanin und Isoguanin enthaltenden Homo-DNA Oligonucleotiden?
In Arbeiten von Benner und Mitarbeitern [83], [84] konnte gezeigt werden, dass
als Paarungspartner von Isoguanin sowohl Deoxyisocytidin als auch Thymidin
agieren konnten. Dies folgte daraus, dass durch Zugabe einer DNA-
.-*"*°^yx^!v>, I_T Paanm8
H^^H'*' T ] (Deoxy-isoguanosin in der Enolform)
Y
M ^H
I-iso-C Paarung(Deoxy-isoguanosin in der H-N(l)-Form)
Abb. C5.2: Benner [84] zeigte, dass N-9-(ß-D-deoxyribofuranosyl)-isoguanin nur mit
Thymidin und mit Deoxy-isocytidin eine Basenpaarung eingeht, dass Deoxy-isoguanosin
also entweder in der Form des Enoltautomeren oder aber im H-N(l) Tautomeren vorliegen
- Ein Hexamer von 2'-Deoxyallopyranosyladenin hat eine Schmelztemp. von 39°C (10 uM, 12%
Hyp.) [82]- Ein Hexamer von 3'-Deoxyallopyranosyladenin hat eine Schmelztemp. von 14°C (11.2 pM, 38 %
Hyp.) [82].Als Vergleiche dazu: allofA,): 16°C (11 pM, 48% Hyp.); dd(A«>: 43°C (9.5 pM, 9% Hyp.).
-113- allgemeiner Teil
muss. Die Replikation von Thymidin ist also ungenau, denn es paart sowohl mit
Deoxyadenosin, als auch mit Deoxy-isoguanosin.
Polymerase (Klenow Enzym) und verschiedenen Deoxynucleosidtriphosphatennur Deoxyisocytidin und Thymidin als Paarungspartner für ein Deoxyisoguaninenthaltendes Oligonucleotid eingebaut wurden. Dieses Resultat Hess sich als
Folge von verschiedenen tautomeren Formen von Isoguanin interpretieren.Dabei würde die Enolform eine Paarung mit Thymidin und die tautomere Form
mit dem Proton am N(l) eine Paarung mit Deoxy-isocytidin erklären (vgl. Abb.
C5.2).
Aus Arbeiten von Kazimierczuk und Mitarbeitern geht hervor, dass Isoguanin
in wässriger Phase in der tautomeren Form mit dem Proton am N(l) vorliegt
[85], [86], [87], [88]. Er glaubt, zeigen zu können, dass Isoguanosinribonucleosid in
wässriger Phase ausschliesslich in der tautomeren Form mit dem Proton am N(l)
vorliegt. In einer aussagekräftigen Arbeit synthetisierte er die, in Abbildung C5.3
skizzierten, substituierten Isoguaninbasen und verglich deren UV-Spektren in
Wasser mit denjenigen des Isoguanosinribonucleosids.
Aufgrund von am N(9) methyliertem Isoguanin als Modellverbindung des
Deoxyisoguanosinnucleosids und verschiedenen Alkylierungsprodukten davon
(II, III, IV in Abb. C5.3), konnte Kazimierczuk aus der Aehnlichkeit der UV-
Spektren von I und II mit demjenigen von Deoxyisoguanosin zeigen, dass
letzteres in der tautomeren Form mit dem Proton am N(l) vorliegt [86].
Dass die Energien der verschiedenen tautomeren Formen nahe beieinander
liegen, zeigt neben dem Experiment von Benner und Mitarbeiter [83], [84] auch
die Tatsache, dass in einem apolareren Lösungsmittel als Wasser, nämlich
Dioxan, dem UV-Spektrum nach, die Enolform vorherrscht1.
1 Das Verhältnis der Enolform zum H-N(l) Tautomeren in Dioxan war » 5:2 [102].
-114- allgemeiner Teil
Hv ^HN
N-
ICH3
K(H20) = <0.1
K(Dioxan)« 2.5
N
/Y^MHCH3
Deoxyisoguanosinnucleosidanaloges
II
Analoges zum H-N(l) Tautomeren
Analoges zum H-N(3) Tautomeren Analoges zum Enoltautomeren
Abb. C5.3: Die von Kazimierczuk und Mitarbeitern [86] synthetisierten Isoguaninderivate:
Modellverbindungen zu den verschiedenen möglichen tautomeren Formen für Isoguanin.
Die Ergebnisse von Benner [84] entsprechen denjenigen von Kazimierczuk [86]
aber in keiner Weise den von Fräser für die in der Homo-DNA Reihe
gefundenen Resultaten [47].
-115- allgemeiner Teil
C.5.2 Hexa- und Octanucleotide von Allopyra-nosyl-isoguanin
Die Eigenschaften dieser Oligonucleotide weichen drastisch von den
Eigenschaften anderer Allopyranose-NA Oligonucleotide ab.
Die Schmelztemperatur von allo(I() betrug, wie aus Abbildung C5.4 hervorgeht,18°C (12.7 uM, 22% Hyp.), und die von allo(I8) 29°C (8.7 uM, 27% Hyp.). Das ist
deutlich höher als diejenige von allo(Ag) (16°C, 11.0 uM, 48% Hyp.) oder für
allo(G8) (13°C, 9.8 uM, 14% Hyp.). Auch das CD-Spektrum von allo(I8)
unterscheidet sich sehr stark von demjenigen von allo(A8) und allo(Gs). Man
vergleiche dazu die in Abbildung C5.37 aufgeführte Uebersicht von CD-Spektren
und Schmelzkurven von allo(Gg) + allods), allo(Gg), allods) und allo(Ag).
Abb. C5.4: Schmelzkurven von allo(I() und allo(It) im Standardpuffer pH
7.0, bei 247 nm gemessen, alloü,): 18°C (12.7 pM, 22% Hyp.); allo(I„): 29°C
(8.7 pM, 27% Hyp.).
Bereits im Fall der monobasigen Allopyranosyl-isoguanin-oligonucleotide
ergeben sich Schwierigkeiten bei der Aufklärung der Basenpaarung.
Das CD-Spektrum von allo(I8) ist in Abb. C5.37 auf Seite 149 abgebildet.Mit den vier prinzipiell möglichen tautomeren Formen der Isoguaninbase lässt
sich eine grosse Anzahl Isoguanin - Isoguanin Paarungen formulieren. Unter
Ausschluss der unwahrscheinlichen Imino- und Enolformen, verbleiben noch
-116- allgemeiner Teil
die tautomeren Formen mit dem Proton entweder am N(l) oder am N(3).
Nehmen wir weiter an, dass eine reine Watson-Crick Paarung nicht eintritt1,
und schliessen eine Hoogsteen-artige Basenverknüpfung III2 aus, bleiben noch
die zwei in Abbildung C5.5 abgebildeten Möglichkeiten I und II für eine I-I-
Paarung.
H-N(l) tautomere Form H-N(3) tautomere Form
R
n H
R«
H—N
H-N(l) oder H-N(3)tautomere Form
antiparallele Orientierungder Oligonucleotidsträngebei anti-Orientierung der
glycosidischen Bindungreverse Hoogsteen
antiparallele Orientierungder Oligonucleotidsträngebei anti-Orientierung der
glycosidischen Bindungreverse Hoogsteen
parallele Orientierungder Oligonucleotidsträngebei anti-Orientierung der
glycosidischen Bindung
Hoogsteen
Abb. C5.5: Wenn die nachfolgend aufgezählten Annahmen akzeptiert werden, bleiben noch die
zwei skizzierten Möglichkeiten I und II für eine II-Paarung. Die Annahmen waren: Kein Enol- oder
Iminotautomeres von Isoguanin, antiparallele Orientierung der Oligonucleotidstränge sowie anti
Orientierung der glycosidischen Bindung.
Es war infolge der geringen Löslichkeit der Allopyranose-NA Oligonucleotidenicht möglich, mittels NMR-Spektroskopie zu zeigen, dass die glycosidische
Bindung anti orientiert ist. Diese Annahme wurde deshalb aus Analogie zur
Homo-DNA so postuliert.
1 Eine im Fall von Allopyranosyl-NA wohl begründete Annahme, da selbst bei Allopyranosyl-cytosin und Allopyranosyl-guanin enthaltenden Oligonucleotide keine WC-Paarung bewiesen
werden konnte.
2 Sie wurden aus Analogie zur Homo-DNA ebenfalls weggelassen.
-117- allgemeiner Teil
Es ist unmöglich, nur aufgrund von Schmelzkurven und CD-Spektren eine
dieser zwei Paarungsmöglichkeiten I oder II auszuschliessen.
Aus der Uebereinstimmung der UV-Spektren (vgl. Abb. C5.6) des freien
Allopyranosyl-isoguaninnucleosid (c)) und dem Oligonucleotid (allo(I8) d)) mit
der Base II (Abb. C5.3), (b)) von Kazimierczuk ist die Annahme der tautomeren
Form mit dem Proton am N(l) gerechtfertigt. Unter der Annahme, dass die
Zuordnung der tautomeren Formen zutrifft, müsste eine Basenpaarung im
Duplex nach Typ I in Abbildung C5.5 bevorzugt werden. Der geometrischeUnterschied der beiden Basenpaarungstypen I und II ist relativ gering, es handelt
sich im Prinzip nur um eine translatorische Verschiebung der Basen zueinander.
Abb. C5.6: UV-Spektren von N-9-(ß-D-Ribofuranosyl)-isoguanin (a)), N-9-Methyl-
N^N'-tethylenMsoguanin (b)), Allopyranosyl-isoguanin Nucleosid 65 (c)), allo(I8) bei
45°C (d)). a) und b) wurden von Kazimierczuk [86] in Wasser, c) und d) im Standardpuffer
pH 7.0 gemessen.
-118- allgemeiner Teil
C.5.3 Allo(G8) und allo(I8)
Die in der Homo-DNA gefundene starke Gl-Paarung war der Anlass zur
Untersuchung von Guanin- und Isoguanin-haltigen Allose-NA Oligonucleo¬
tiden.
Abb. C5.7: Drei Schmelzkurven von allo(Gt) + allod,) 1 : 1. Sie wurden im
Standardpuffer pH 7.0 bei 250 nm aufgenommen.
Ein Schmelzexperiment eines Gemischs von allods) und allo(G8) ergab eine
Schmelzkurve mit einem Tm-Wert von etwa 36°C.
Man sieht in Abb. C5.7, dass die verschiedenen UV-Schmelzkurven keine
einheitliche Form aufweisen. Vielmehr scheint es, als ob der Schmelzprozess aus
verschiedenen Teilübergängen zusammengesetzt ist. Eine genaue Bestimmung
der Schmelztemperatur war deshalb nicht bei allen Kurven möglich. Besonders
bei einer Duplexkonzentration von 4.20 |iM ist es klar, dass verschiedene
Uebergänge in den Schmelzvorgang involviert sind.
Dass dieser Schmelzprozess nicht etwa nur aus einer Ueberlagerung der
Schmelzvorgänge von allods) sowie allo(G8) zusammengesetzt war, konnte
(neben der höheren Schmelztemperatur des 1 : 1 Gemischs gegenüber den zwei
einzeln untersuchten Oligonudeotiden allods) und allo(G8) mit einem Vergleich
des CD-Spektrums von allo(I8), allo(G8), der mathematischen Summe dieser
beiden CD Kurven und dem CD-Spektrum des 1 : 1 Gemischs von allo(G8) +
allo(Ig) bei 5°C (also unterhalb der Schmelzpunkte aller beteiligten Spezies)
-119- allgemeiner Teil
gezeigt werden (vgl. Abb. C5.8). Die Summe der CD-Spektren der einzelnen
Oligonucleotide allods) und allo(G8) zeigte deutliche Unterschiede zum CD-
Spektrum des 1 :1 Gemischs. Es müsste also eine neue Paarung eingetreten sein.
Abb. C5.8: Da die mathematische Summe von allo(G8) und allod«) nicht
mit dem CD-Spektrum des 1 :1 Gemischs übereinstimmte, war bewiesen,
dass eine neue Spezies gebildet worden war. Alle Spektren wurden im
Standardpuffer pH 7.0 bei 5"C und einer Oligonucleotidtotalkonzentration
von etwa 8 pM aufgezeichnet.
Alle Kurven in Abb. C5.7 zeigen bei Temperaturen über 60°C noch einmal eine
leichte Zunahme der Hyperchromizität. Dieser Effekt ist bei der Kurve mit einer
Konzentration von je 3.04 uM am deutlichsten sichtbar. Da nicht klar war, ob
diese Absorptionszunahme der Lösung oligonucleotidabhängig war oder ob es
sich um einen Verdunstungseffekt der Oligonucleotidlösung handelte, wurde
ein Schmelzexperiment bis zu einer Temperatur von über 90°C durchgeführt.Tatsächlich konnte, wie Abbildung C5.9 zeigt, ein zweiter Uebergang festgestelltwerden. Dieser zweite Uebergang war durch eine Schmelztemperatur von etwas
über 80°C gekennzeichnet und besass eine bedeutend grössere Hyperchromizitätals der erste. Die Abkühlkurve weist eine extrem grosse Hysterese gegenüber dem
Uebergang bei höherer Temperatur von etwa 40°C auf. Wie aus der
Abkühlkurve weiter hervorgeht, scheint die Renaturierung unter den gewählten
Bedingungen (0.5°C/min. Kühlrate) in einem scheinbar konzertierten Prozess
-120- allgemeiner Teil
abzulaufen (vgl. Abb. C5.9). Beim erneuten Erwärmen derselben Probe bilden
sich dann, wie das Profil der UV-Schmelzkurve zeigte, dieselben zwei
Uebergänge aus, was die Reversibilität der beobachteten Paarungs- und
Entpaarungsprozesse bestätigt.
% Hyperchromizität40-
allo(G8) + allo(l8)je1.96]iM
r
—£- Abkühlkurve 35°C
1. Schmelzkurve 36/82°C
2. Schmelzkurve 37/82°C
'—i—r_i— i —i—i—i—"—i—i—i—i—i—i—i
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C5.9: Eine Oligonucleotidlösung von allo(G,): allod«) = 1:1 wurde auf
über 90°C erwärmt, wieder auf 0°C abgekühlt und erneut erwärmt. allo(G8):
allod,) je 1.96 uM: 1. Schmelzen: 36/82°C (12/18% Hyp.); Abkühlen: 35°C (40%
Hyp.); 2.Schmelzen: 37/82°C (17/19% Hyp.).
Die Hyperchromizitäten der zweiten Schmelzkurve sind nicht mehr gleich
gross, wie diejeningen der ersten. Dies könnte eine Folge davon sein, dass die
Probe zwischen dem Mischen und dem Aufheizen nicht genug Zeit hatte, um
ins thermodynamische Gleichgewicht zu gelangen (vgl. 'annealing'-Effekte in
natürlichen Oligonucleotiden).Die Abkühlkurve des Uebergangs bei 40°C ist etwa die Umkehrung des
Schmelzprozesses mit einer kleinen Hysterese von ungefähr 4°C (Tm(Schmelzen)
= 37.8°C, Tm(Hybridisieren) = 33.7°C bei einer Oligonucleotidkonzentration von
je 4.25 uM und einer Heiz- resp. Kühlrate von 0.5°C/min.). Dieses Resultat ergab
sich aus einem Schmelzexperiment, bei dem die Probe nur auf 70°C erwärmt und
dann wieder abgekühlt wurde (Abb. C5.10).
-121- allgemeiner Teil
allo(G8) + allo(l8) je 4.30 uM% Hyperchromizität
20-
15
10
Schmelzen
Hybridisieren
i——i——t——i——i—>—i——i——i——i——i
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C5.10: Der untere Teil der Schmelzkurve von allo(G8) + allod,) ist in
etwa reversibel. allo(G,) + allod,): je 4.3 pM Schmelztemperatur 38°C,
Hybridisierungstemperatur 34°C im Standardpuffer pH 7.0 bei 250 nm
gemessen.
Mit einem Experiment zur Bestimmung des stöchiometrischen Verhältnisses,
dargestellt in Abbildung C5.ll (man vergleiche dazu auch Kapitel C.4.1), bei 5°C,
einer Temperatur also, bei der, wie die UV-Schmelzkurve zeigt, alle
Stöchiometrie bei 5°C (abs 290 nm)
0.1 0.11—I—I—I—I—I—1—I—I I I—I—1—I—I—I—1—I-
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100% allo(l8)
Abb. C5.ll: Wie die Bestimmung des stöchiometrischen Verhältnis von allo(G,)
zu allod,) zeigte, lag bei 5°C (bei allen beobachteten Wellenlängen 240, 250,
260,270,280,290, und 300 nm) eindeutig ein 1:1 Gemisch vor.
-122- allgemeiner Teil
Oligonucleotide in gepaartem Zustand vorliegen, ergab für das Assoziat ein
Verhältnis der beiden Oligonucleotidstränge allo(G8) und allods) von 1:1. Das
entsprechende Experiment bei 60°C ist in Abbildung C5.14 dargestellt.
Die Absorptionen der verschiedenen prozentualen Zusammensetzungen der
beiden Oligonucleotide wurden bei verschiedenen Wellenlängen gleichzeitigbestimmt und aufgetragen. Cantor et Schimmel [55] berichten nämlich, dass der
Uebergang des Triplexes zum Duplex im Fall von {d(T)n}2 • d(A)„ nicht bei allen
Wellenlängen beobachtet werden konnte (vgl. Felsenfeld et al. [75]).
In unserem Fall ergab sich bei allen beobachteten Wellenlängen das gleiche
Ergebnis, mit dem Unterschied, dass nicht bei allen Wellenlängen ein so
deutlicher Knick in der Absorptionsänderung festzustellen war wie bei 290 nm.
Man konnte aber bei keiner Wellenlänge einen zweiten Knick feststellen.
Die UV-Spektren von allen Lösungen, deren Absorptionen in Abbildung C5.ll
aufgetragen wurden, wurden gemessen und in Abbildung C5.12 dargestellt. Man
sieht deutlich einen stufenweisen Uebergang von 100% allo(I8) zu allo(G8).
210 250 300 320 nm
Abb. C5.12: UV-Spektren der Lösungen, mit dem die Stöchiometrie bestimmt
wurden von 100% allo(G,) zu 100% allod,). Die totale Oligonucleotid¬
konzentration betrug jeweils 6.08 pM. Die Oligonucleotidlösungen wurden im
Standardpuffer pH 7.0 gemessen.
-123- allgemeiner Teil
Die Berechnung der thermodynamischen Parameter nach Marky & Breslauer
[59] müssen infolge der in Kapitel C.5.1 angegebenen Gründe1 mit Vorsicht
betrachtet werden, da die Schmelztemperaturen mit einem gewissen Fehler
behaftet sind. Die Auftragung der inversen absoluten Schmelztemperatur gegen
den natürlichen Logarithmus der Oligonucleotidtotalkonzentration sollte jedochzu vernünftigen Resultaten führen, da der absolute Fehler bei der Bestimmungder Schmelztemperatur für alle Experimente derselben Reihe etwa gleich gross
sein dürfte.
% Hyperc60-
allo(G8) + allo(l8)hromizität
50-
40-
30-
20-
.—•je 5.17 uM
J-* je 2.44 uM•"" je 1.17 uM
• <p~ je 3.16 uM
10-
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C5.13: Verschiedene Schmelzkurven von al!o(G,) und allod,) = 1:1, um
die thermodynamischen Parameter der Schmelzübergänge zu ermitteln.
Verwendet wurden: je 1.6 pM: 35.8/81.2°C; je 2.1 pM: 37.1/81.5°C; je 2.3 pM:
37.2/81.6°C; je 3.7 pM: 38.8/82.0°C; je 5.2 pM: 40.2/82.3°C. Alle Messungen
wurden im Standardpuffer pH 7.0 bei 250 nm durchgeführt.
Die thermodynamischen Daten der zwei Uebergänge aus den Schmelzkurven
ergeben nach dem 'two - State' - Modell analog Methode ® in Kapitel C.4.1 für
einen bimolekularen Schmelzprozess berechnet folgende Werte:
1 Diese Einschränkung bezieht sich vor allem auf die grosse Hysterese des 2. Ueberganges der
Schmelzkurve von allo(G,) + allod,), die darauf hindeutet, dass wir es mit einem durch eine
langsame Kinetik verzögerten Schmelzpunkt zu tun haben könnten.
-124- allgemeiner Teil
allo(G8) +
allods)
AH°VH
[kcal mol-1]
AS0
[cal mol"1 K"1]
TAS°(298K)
[kcal mol"1]
AG0 (298 K)
[kcal mol'1]
1. Uebergang -52.1 -143 -42.6 -9.5
2. Uebergang -267.1 -729 -217.0 -57.1
Die Schmelztemperaturen des Uebergangs bei 80°C liegen sehr nahe
beieinander. Es ist aber eindeutig, dass die Schmelztemperaturen bei kleineren
Oligonucleotidkonzentrationen tiefer liegen als bei höheren. Die Alternative, ein
monomolekularer Schmelzprozess, ist ausgeschlossen, da dies bedeuten würde,
dass allo(I8) und allo(G8) je eine intramolekulare Wechselwirkung eingehenmüssten. Da dies aber bei den Schmelzexperimenten mit nur allo(G8) oder
allo(I8) nicht beobachtet wurde, kann ein monomolekularer Prozess tatsächlich
ausgeschlossen werden.
Die extrem hohe Schmelzenthalpie1 von -267.1 kcalmol-1 (berechnet für einen
bimolekularen Schmelzprozess) für den zweiten Uebergang schliesst einen
normalen Duplexschmelzpunkt mit Sicherheit aus, während dies für den
Uebergang bei tieferer Temperatur mit einer Schmelzenthalpie von -52.1
kcalmoH durchaus möglich scheint.
Ein Versuch zur Bestimmung des relativen stöchiometrischen Verhältnisses
bei 60°C ergab keine schlüssigen Resultate (Abb. C5.14).
abs 290 nm
0.3
0.2
Stöchiometrie bei 60°C (abs 290 nm)
0.1
0.0
,00DB°'
—I——I——l——I—i—r-"—l——l——l— l —l
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100% allo(!8)
Abb. C5.14: Versuch zur Bestimmung des stöchiometrischen Verhältnisses von
aIlo(G,): allod,) bei 60°C.
1 Breslauer gibt einen Zusammenhang zwischen der Kurvenform und der Schmelzenthalpie [58]. Er
konnte herleiten, dass eine steile Schmelzkurve automatisch eine höhere Schmelzenthalpieimpliziert.
-125- allgemeiner Teil
Das hängt damit zusammen, dass beide Oligonucleotide vor der Vereinigungbei 60°C mehrheitlich als Einzelstrang vorlagen. Man müsste also bei 60°C die
Hybridisierungskurve (vgl. Abb. C5.15), die durch die Abkühlkurve
wiedergegeben wird, und nicht die Schmelzkurve (bei der alle Oligonucleotide zu
Beginn gepaart vorliegen) betrachten. Bei 60°C aber ist auf der Hybridisierungs¬kurve kein Zwischenniveau festzustellen, und man erhält deshalb eine Gerade
als Resultat aus der Auftragung der Absorption gegen die prozentuale
Zusammensetzung des Oligonucleotidgemischs, nämlich die Summe der
Absorptionen der Oligonudeotideinzelstränge.
allo(G8) + allo(l8) je% Hyperchromizität 6C
60-i
S5.17M.M°c
50-
*
*
*
•
«~
^•
40-
30-
*
*
•
•—- Schmelzen
*Hybridisieren
•
20-*
•
•
10- ^^-^0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C5.15: Durch Zugabe des einen Oligonudeotideinzelstranges zum
anderen muss eine Paarung erfolgen. Die Lösung befindet sich also auf der
Hybridisierungskurve. Es ist nun aber, wie man aus der Grafik ersieht,nicht
möglich, bei 60°C auf der Hybridisierungskurve auf das Zwischenniveau der
Schmelzkuve bei etwa 60°C zu gelangen, denn die Paarung der
Oligonucleotide setzt, wie die Hybridisierungskurve zeigt, erst unterhalb
60°C ein.
Um das stöchiometrische Verhältnis von allo(G8) und allods) bei 60°C doch
noch herauszufinden, überlegte man sich, ob die Probe nach jeder neuerlichen
Zugabe eines Anteils des einen Oligonucleotids zum anderen zuerst auf das
Niveau vor dem ersten Schmelzpunkt abgekühlt werden müsste, um eine
vollständige Paarung der Oligonucleotide zu erhalten und erst danach auf 60°C
zu erwärmen sei. Schnelles Aufheizen und Abkühlen auf 60°C resp. 10°C führte
-126- allgemeiner Teil
dazu, dass sich die Absorptionswerte bei 10°C und 60°C einander angleichen und
sidi beim Wert der Absorption bei 10°C (Abb. C5.16) treffen. Das zeigt, dass der
Paarungsprozess bei tieferen Temperaturen durch schnelles Aufheizen und
Abkühlen aus dem thermodynamischen Gleichgewicht gebracht wird.
Abs (250 nm)
0.20-
0.19-
•
a Abs250nm10°C
0.18- • • Abs 250 nm 60°C
0.17- G
•
3
C 2 4
I
6
' 'Nummer der
Messung
Abb. C5.16: Bei wiederholtem Aufheizen einer Oligonucleotidprobe (1 : 1 Gemisch
von allo(G,) und allod,) je 3.0 pM) auf 60°C (was bedeutet, dass der erste
Schmelzprozess abgelaufen ist) und anschliessendem Abkühlen auf 10°C (um diesen
Schmelzprozess wieder rückgängig zu machen) stellte man fest, dass sich die
Absorption bei 60°C derjenigen bei 10°C annähert. Der Schmelzübergang bei 40°C
scheint zu verschwinden! Die Messungen wurden im Standardpuffer pH 7.0 bei 250
nm durchgeführt.
Ob die vorher geäusserte Vermutung richtig war, sollte im folgenden
Experiment überprüft werden:
Schmelzen einer Oligonucleotidlösung allo(G8): allo(I8) = 1 : 1 bis 90°C,
Abkühlen auf 0°C (je mit 0.5°C/min. Aufheiz- resp. Kühlrate), anschliessend
wurde drei Mal rasch auf 60°C aufgeheizt und auf 10°C (beim dritten Mal auf 0°C)
abgekühlt. Man liess jeweils für 10 Min. bei den entsprechenden Temperaturen
äquilibrieren. Das abschliessende erneute Aufheizen der Oligonucleotidlösungauf 90°C ergab das in Abbildung C5.17 gezeigte Bild.
-127- allgemeiner Teil
Abb. C5.17: Das Experiment bestätigt die Vermutung, dass der untere
Schmelzprozess bei wiederholtem Aufheizen über die Schmelztemperatur
und nachfolgendem Abkühlen verschwindet. Dies ist aus dem Vergleich der
Verhältnisse der Hyperchromizitäten des zweiten zum ersten Uebergang
ersichtlich:
Experimentrelative Hyperchromizität bei hoher Temperaturrelative Hyperchromizität bei tiefer Temperatur
1. Schmelzkurve 0.91
2. Schmelzkurve 2.97
Das in diesem Experiment beobachtete Verschwinden des ersten
Schmelzüberganges zugunsten des zweiten lässt darauf schliessen, dass beide
Uebergänge durch eine langsame Bildungscharakteristik gekennzeichnet sind
und dass es sich deshalb um höhere Assoziate handeln muss.
Für höhere Assoziate sprechen insbesondere auch die thermodynamischen
Daten des Schmelzprozesses bei hoher Temperatur.
Das bei 5°C zu 1 : 1 bestimmte stöchiometrische Verhältnis von allo(G8): allods)
muss nicht unbedingt heissen, dass auch bei 60°C ein 1 : 1 Verhältnis der beiden
Oligonucleotide vorliegt. Es wäre durchaus denkbar, dass die eine der beiden
Spezies (mit einer Schmelztemperatur von 81°C) {allo(G8)}2* allo(I8) und die
andere (mit einer Schmelztemperatur von 37°C) allo(G8) • {allo(I8))2 ist, was bei
5°C ein Verhältnis allo(G8): allo(I8) von 1 :1 ergibt.
Deshalb wurden auch die Schmelzpunkte der Oligonucleotidlösungen mit
einem Verhältnis von allo(G8) : allo (I8) = 2 : 1, 1 : 1 und 1 : 2 bei derselben
Oligonucleotidtotalkonzentration aufgezeichnet.
-128- allgemeiner Teil
allo(G8): allo(l8), verschiedene rel. Verhältnisse
% Hyperchromizität50
..allo(G8): allo(l8)
40= 1:1
allo(G8): allo(l8)= 1 :2
allo(G8): allo(l8)
o -^^——i——i——i—>—i—i—f—'—I
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
= 2:1
Abb. C5.18: Bei gleicher Oligonucleotidtotalkonzentration sahen die
Schmelzkurven mit unterschiedlichen Anteilen an allo(G,) und allod,)
sehr verschieden aus.
allo(G,): allod,) =1:2:39/81°C (Totalkonz. 3.64 pM, 12/8% Hyp.)
1:1:36/82°C (Totalkonz. 3.88 pM, 9/35% Hyp.)
1:2:- /82°C (Totalkonz. 3.64 pM, 3/20% Hyp.)
Alle Schmelzkurven wurden im Standardpuffer pH 7.0 bei 250 nm gemessen.
Die Analyse der UV-Schmelzkurven in Abbildung C5.18 scheint die Vermu¬
tung zu bestätigen, dass der erste Uebergang von einem allo(G8) • {allo(I8)}2 und
der zweite von einem {allo(G8))2 • allo(I8) Tripelstrang herrührt, da bei einem
allo(G8): allo(I8) Verhältais von 1 : 2 die Hyperchromizität des ersten Uebergangs
gegenüber demjenigen bei einem Verhältnis von 1 : 1 deutlich grösser ist und bei
einem Verhältnis von allo(G8): allods) = 2:1 der erste Schmelzübergang kaum
existent ist.
In der folgenden Tabelle sind die relativen Verhältnisse der Hyperchromi¬
zitäten des ersten zum zweiten Uebergang bei den drei gemessenen Oligonucleo-
tidverhältnissen angegeben.
-129- allgemeiner Teil
Tabelle C5.1:
Verhältnis
allo(G8): allo(I8)
rel. Hyperchrom. bei hoher Temp. rel. Hyperchrom. bei hoher Temp.
rel. Hyperchrom. bei tiefer Temp.
1. Schmelzkurve
rel. Hyperchrom. bei tiefer Temp.
2. Schmelzkurve
2:1 9.05 3.37
1:1 4.18 1.43
1:2 0.73 0.66
Wie aus den drei Schmelzkurven in Abbildung C5.19 ersichtlich ist, ist die
Form der Abkühlkurve jeweils sehr ähnlich. Die Hyperchromizität beginnt bei
etwa 45°C mit sinkender Temperatur abzunehmen und läuft, je grösser der
allo(I8) Anteil ist, um so flacher aus.
% Hyperc25-
20-
15-
10-
5-
0-
hromizitätallo(G8): allo(l8) = 2 :1 a)
•
* \
••
la -V^-B/Jü /. Hyunüibieien o/ u
i i—*' ° c'"'"—' 41/81°C
* JZ..»..........»..^ 1 Sr!hnrint7fin -lrW°r.
>^J^^
C 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
% Hyperchromizität60-1
allo(G8): allo(l8) = 1:1 b)
-•- Hybridisieren 35°C
--2. Schmelzen 41/82°C
.— 1. Schmelzen -/82°C
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
-130- allgemeiner Teil
% Hyperchromizität25 -i
allo(G8): allo(l8) = 1:2 C)
*- Hybridisieren 36°C
1. Schmelzen 39/81 °C
2. Schmelzen -/81°C
10 20 80 90 100°C
Abb. C5.19: Die Schmelzkurven, Hybridisierungskurven und die zweiten Schmelzkurven
von allo(G8) + allod,) mit den angegebenen rel. Verhältnissen im Ueberblick.
Die Rekombination der Triplexe aus den Einzelsträngen wird via einen
thermodynamisch instabileren Duplex erfolgen, an den sich danach sofort ein
weiterer Einzelstrang angliedert.
Bei sehr langsamer Abkühlung würde bei einem Verhältnis von allo(Gs) :
allods) =2:1 wohl vornehmlich der stabilere, also der {allo(G8))2 • allo(I8) Triplex
gebildet werden. Es entstehen aber offenbar bei solchen Abkühlprozessen andere,
unter kinetischer Kontrolle gebildete Assoziate, die bei den Schmelzprozessen
(insbesondere beim zweiten Schmelzen) zu stärker strukturierten Schmelz¬
kurven führen.
So lässt sich beispielsweise eine Schmelztemperatur um 10°C erkennen, die von
einem allo(G8) Duplex herrührt (Abb. C5.19 a), 2. Schmelzkurve), sowie mit
grosser Wahrscheinlichkeit auch ein allo(I8) Duplex (Abb. C5.19, c), 2.
Schmelzkurve; Tm nicht sichtbar).
Die zweiten Schmelzkurven decken sich nicht mit den ersten, denn bei den
ersten Schmelzkurven war der erste Uebergang im Vergleich zum zweiten
Uebergang in allen UV-Schmelzexperimenten jeweils kleiner als im zweiten
Schmelzexperiment mit derselben Schmelzprobe. Diesen Sachverhalt wider¬
spiegelt die Tabelle C5.1, Seite 129 mit den Werten der in Abbildung C5.19
gezeigten UV-Schmelzkurven.
Um die Existenz von verschiedenen gleichzeitig koexistierenden, gepaarten
Spezies in der Reihe der allo(G8) und allo(I8) Gemische nachzuweisen, wurde
-131- allgemeiner Teil
eine nicht denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt1 (Abb.
C5.20).
Dazu wurden verschiedene relative Zusammensetzungen der einzelnen
Oligonudeotide auf die verschiedenen Bahnen aufgetragen.
Abb. C5.20: Nicht denaturierende PAGE, 18%, Acrylamid
(29 :1 BIS), 0.1 M Tris, 0.1 M Borsäure, 50 mM NaCl, pH
8.1; 8 W, 6 Std., 3°C; angefärbt mit 'Stains all', Marker =
Bromphenolblau.
Die Resultate aus der Polyacrylamidgelelektrophorese sind in der folgenden
Uebersicht zum Vergleich den Resultaten der Schmelzexperimente
gegenübergestellt.
allo(G8): allo(I8) = 1:0
Gel: eine scharfe Bande
Schmelzdiagramm (Abb. C5.37): nur ein Schmelzübergang
1 Allopyranose-NA Oligonucleotide zeigen eine gegenüber Homo-DNA stark verminderte Mobilität
im Gel, deshalb müsste der Acrylamidgehalt und der relative Anteil von N,N'-Methylen-bis-acrylamid (BIS) reduziert werden.
-132- allgemeiner Teil
allo(G8): allo(I8) = 2:1
Gel: Man erkennt eine deutliche Bande ({allo(G8)}2 • allo(I8) - Triplex), eine sehr
schwache Bande (allo(G8) • {allo(I8))2 - Triplex) sowie eine schwache
Bande auf der Höhe von {allo(G8))2.
Schmelzdiagramm (Abb. C5.19.a)): Es ist eine leichte Zunahme der
Hyperchromizität bis 15°C festzustellen, diese könnte vom
Schmelzen des {allo(G8))2 - Duplex herrühren. Bei einem Vergleichmit dem 1 : 1 Oligonucleotidgemisch von allo(G8) und allods) ist das
Verhältnis der Hyperchromizitäten des Uebergangs bei 40°C im
Verhälnis zu demjenigen bei 80°C sehr viel kleiner.
allo(G8): allo(I8) = 1:1
Gel: Neben der Bande für den (allo(G8)]2'allo(I8) - Triplex ist wiederum auch
eine schwächere Bande für den allo(G8) {allo(I8))2 - Triplexfestzustellen. Neben diesen beiden Banden für die Triplexe sind
sonst keine Banden mehr zu erkennen.
Schmelzdiagramm (Abb. C5.19 b)): Es sind nur die beiden Schmelzübergänge der
beiden Triplexe festzustellen. In genauer Analogie zum Gel-
Experiment ist die Hyperchromizität des Uebergangs bei 80°C (im Gel
die Intensität der Bande) gegenüber demjenigen bei einem
Verhältnis allo(G8): allo(I8) = 2:1 grösser (Hyperchrom. (2 :1; 80°C) =
17%; Hyperchrom. (1 : 1; 80°C) = 34%).
allo(G8): allodg) = 1:2
Gel: Die Intensität der Banden vom {allo(G8)}2 • allo(I8) - und allo(G8) • {allo(I8))2 -
Triplex ist jetzt ungefähr gleich. Man erkennt auch schon eine
äusserst schwache Bande, die vom allo(I8) - Duplex herrührt (auf der
Photographie vom Gel nicht sichtbar).
Schmelzdiagramm (Abb.C5.19 c)): Sehr deutliche Schmelzübergänge sowohl bei
40°C, als auch bei 80°C. Die Hyperchromizität des Ueberganges bei
40°C ist etwas grösser als diejenige bei 80°C.
a!lo(G8): allods) = 0:1
Gel: Man erkennt eine schwache Bande für den allods) Duplex.
Schmelzdiagramm (Abb. C5.4): Es ist nur ein diskreter Schmelzübergang um 29°C
zu erkennen.
Die Schmelzkurven von allo(G8) und allo(I8) bei verschiedenen relativen
Anteilen und die bei den gelelektrophoretischen Experimenten gefundenen
-133- allgemeiner Teil
Resultate stimmen sehr schön miteinander überein. Diese Uebereinstimmung
von zwei grundsätzlich verschiedenen Typen von Experimenten unterstützt die
These, wonach in allo(G8)/allo(I8) Systemen zwei Triplexe verschiedener
Konstitution koexistieren. Keines der gefundenen Resultate widerspricht diesem
Modell so sehr, dass dieses verworfen werden müsste. Das bei 5°C gefundene
stöchiometrische Verhältnis von 1 : 1 steht sehr wohl mit diesem Modell in
Einklang, denn das allo(G8): allo(Ig) Triplex Verhältnis von 2 : 1 würde erst bei
60°C vorherrschen, und da ist eine Bestimmung des stöchiometrischen
Verhältnisses der Oligonucleotide leider nidit möglich.Es konnten aber keine Gründe eruiert werden, weshalb der G2I Triplex derart
viel stabiler als der I2G Triplex sein sollte (vgl. auch das hypothetische
Basenpaarungsmodell für den G2I und den I2G Triplex Abb. C5.36).
Eine mit den experimentellen Resultaten kompatible Vorstellung über den
Paarungs- und Entpaarungsmechanismus ist in Abbildung C5.21 dargestellt.
Heizen
bei KT
zusammengeben
(alloUgJlj aUo(G,) GI-Duplex
/
\
37°C
^G-Triplex
82°C
QI-Triplex
-134- allgemeiner Teil
Abkühlen
Abkühlen
ab50°C
ab 50°C sofort
+ alWGg)
GI-Duplex ab = 37°C
+ allodg)
Gjl-Triplex
IjG-Triplex
Abb. C5. 21: Vorstellung des Schmelz- und Hybridisierungsprozesses von allo(G,) und allod,).
C.5.4 Allo(G4l4) und allo(GI)4
Im Hinblick auf die Beantwortung der Frage nach der Sequenzspezifizität der
Gl-Paarung wurden allo(G4l4) und allo(GI)4 hergestellt und deren
Paarungseigenschaften untersucht.
Das temperaturabhängige UV-Spektrum von allofGJ^ (Abb. C5.22) zeigte von
30°C zu 45°C eine grosse Aenderung der Absorption im Bereich zwischen 240
und 280 nm an. Ab»
1.0
200 250 300 350 400nm
Abb. C5.22: Temperaturabhängiges UV-Spektrum von allo(G4I4) bei
12.1 pM im Standardpuffer pH 7.0.
-135- allgemeiner Teil
Dieses temperaturabhängige UV-Spektrum Hess vermuten, dass allo(G4l4) bei
einer Detektion um 250 nm eine sehr scharfe Schmelzkurve mit einer grossen
Hyperchromizität aufweisen wird. Die Schmelzkurven bestätigten diese
Erwartung, denn innerhalb weniger Grad (= 11°C) war das vollständig gepaarte
Assoziat in die Einzelstränge gespalten, was durch das Abflachen der
Schmelzkurve angezeigt wird (Abb. C5.23).
% Hyperchromizität50-
40
30-
20
10 H
0
allo(G4l4)
-10
Tm = 40°C (10.1 uM)
—i——i——i——i—i—i——i • i——i——i—<—i
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C5.23: Allo(G4I4) zeigt einen ausgesprochen scharfen und steilen
Schmelzübergang allo(G4I4): 40°C (10.1 pM, 48% Hyp., 250 nm).
Die Schmelztemperatur bei einer Aufheizrate von 0.5°C/min. betrug 40°C
(c = 10 uM). Die Schmelztemperatur war oligonucleotidkonzentrationsabhängig,
was bedeutet, dass es sich um einen intermolekularen Schmelzprozess handeln
muss (Abb. C5.24).
Die Berechnung der thermodynamischen Daten wurde durch Auswertung der
Schmelztemperaturen in Abhängigkeit der Oligonucleotidkonzentration (vgl.Abb. C5.24) nach der Methode <3> in Kapitel C4.1 bestimmt.
Zur Auswertung der Schmelztemperaturen in Abhängigkeit der Oligonucletid-konzentration wurden als verschiedene Varianten bimolekulare (n = 2),
trimolekulare (n = 3) und tetramolekulare (n = 4) Schmelzprozesse in Betracht
gezogen. Die Frage der Interpretation der erhaltenen Resultate muss offen
bleiben.
-136- allgemeiner Teil
allo(G4l4) AH°VH
[kcal mol"1]
AS0
[cal mol"1 K-l]
TAS°(298K)
[kcal mol-1]
AG° (298 K)
[kcal mol-1]
n = 2 -128.2 -387 -115.3 -12.9
n = 3 -256.4 -772 -230.1 -26.3
n = 4 -384.7 -1164 -346.7 -38.0
allo(G4l4) bei versch. Konzentrationen% Hyperchromizität
50
40
30
20
10
0
-10
"•
'
••
*
%__ ...
8.86 uM
2.11 uM
12.1 uM
19.2 pM
50 60 70
—I
80 °C
Abb. C5.24: Schmelzkurven von allo(G4I4) im Standardschmelzpuffer pH 7.0
bei 250 nm gemessen. Für die thermodynamischen Daten wurden verwendet:
2.1 uM: 37.8°C; 3.5 pM: 38.2°C; 6.8 pM: 39.4°C; 10.1 pM: 40.2°C; 12.1 pM:
40.4°C; 19.2 pM: 40.9°C. Wie man sieht, sind die Schmelztemperaturen wie
schon beim zweiten Uebergang von allo(G,): allod,) = 1:1 nur sehr schwach
konzentrationsabhängig (Aufheizrate: 0.5°C/min.).
Die Ueberlagerung der Aufheiz- und Abkühlkurve ergeben eine grosse
Hysterese, das erneute Aufheizen einer abgekühlten Probe führte wiederum zum
gleichen Schmelzverhalten wie beim ersten Schmelzversuch (Abb. C5.25).
Diese Beobachtung unterstützt die These, wonach es sich nicht um Duplexe,
sondern um höhere Aggregate handelt. Die Reversibilität, demonstriert durch
die erste und die zweite Aufheizkurve, weist darauf hin, dass nur ein Typ von
Aggregat gebildet wird (im Gegensatz zu den Untersuchungen von
allo(G8)/allo(I8) Systemen (vgl. Kapitel C.5.3)).
-137- allgemeiner Teil
allo(G4l4) Heizen-Kühlen-Heizen% Hyperchromizität
50-i
40
30-
20-
"^Hjn
1. Schmelzen 40°C
Hybridisieren 28°C
2. Schmelzen 40°C
—r——i——i—<—i
50 60 70 80 °C
Abb. C5.25: Das Abkühlen von allo(G4I4) ergab im Vergleich zum
Aufheizen eine starke Hysterese. Nochmaliges Erwärmen der gleichen
Schmelzprobe ergab aber wieder dieselbe Schmelzkurve. allo(G4I4) (10.1
pM): 1. Schmelzen: 40.3 °C (48% Hyp.); Hybridisieren: 28.2°C (46% Hyp.);
2. Schmelzen: 39.9 (44% Hyp.), Heiz- resp. Kühlrate 0.5°C/min.).
Die Differenz der Tm-Werte der Aufheiz- resp. Kühlkurve ist deutlich abhängig
von der Aufheiz- resp. Kühlrate, wie aus Abbildung C5.26 hervorgeht und
bestätigt somit die Vorstellung,wonach Denaturierung und Renaturierung in
diesem System langsam erfolgen. Dies gilt als weiterer Hinweis zur Existenz
höherer Assoziate.
allo(G4l4) 8.86 pJvl Heiz- resp. Kühlrate 1.0°C/min.
% Hyperchromizität70-
60-
50
40-
30-
20-
10
0
-10
"-.« »+"*•
10
**'
-1—
20 30
""WMNMIOimi
— Schmelzen 41.3 °C
-*—Hybridisieren 28.3°C
40
—r—
50
—I
60 "C
-138- allgemeiner Teil
alle
% Hyperc70-
60-
50-
40-
30-
20-
10-
0-
)(G4I4) 8.86 p:M Heiz- resp. Kühlrate 0.5°C/min.
hromizität
/"""»tmiiii .
.** •
•— Schmelzen 40.3 °C*
^**
MyDriuisieren ^y.u o
*
* •
y
;-—-,. -*** /
C 10 20 30 40 50 60°C
allo(G4l4) 8.86 ^iM Heiz- resp. Kühlrate 0.1°C/min.
% Hyperchromizität
70-i
60-
50-
40-
30-
20-
/£?«*»••«.
10-"*—-.»,% „* /
Schmelzen 36 2 °C
Hybridisieren 34 0°C
—i 1—i—i 1 i—i—i—i—
10 20 30 40 50
—I
60 °C
Abb C5 26 Aufheizen und Abkühlen von allo(G4I4) mit verschiedenen Heiz-
resp Kuhlraten Je kleiner die Heiz- resp Kuhlraten waren, desto mehr
näherten sich die Schmelz- und die Hybndisierungstemperaturen einander an
allo(G4l4) Schmelz¬
temp
Hybridisie-
rungstemp.
Differenz zwischen
Schmelz- und
Hybridisierungstemp.
AT
1.0°C/min. (8.8 uM) 41.3 28.3 13.0
0.5°C/min. (8.8 uM) 40.3 29.6 10.7
0.1°C/min. (10.1 uM) 362 34.0 22
-139- allgemeiner Teil
Zur Untersuchung der pH-Abhängigkeit im alMCjU) Paarungssystem wurden
CD-Spektren bei pH 3.8 und verschiedenen Temperaturen aufgenommen. Aus
der Aehnlichkeit des CD-Spektrums bei pH 3.8 mit demjenigen bei pH 7.0 kann
geschlossen werden, dass keine strukturellen Aenderungen eingetreten sind (vgl.
Abb.C5.27undC5.37).
Der Vergleich der Schmelzkurven bei pH 7.0 mit derjenigen bei pH 3.8 ergab
eine Differenz der Schmelztemperatur von etwa 7°C, mit dem höheren Wert für
pH 3.8. Die Schmelzkurve mit nur einem Uebergang sieht dabei immer noch
ähnlich aus wie diejenige bei pH 7.0.
Die Frage nach der Erhöhung des Tm-Wertes in der Schmelzkurve bei tiefem
pH gegenüber derjenigen bei pH 7.0 bleibt offen. Das Absinken der
Hyperchromizität in diesem Zusammenhang könnte mit Phänomenen der
Basenprotonierung und -tautomerisierung zu tun haben.
allo(G4I4) pH 3.8
0 0
md«t
•50 0
W 70/60°C
«°c
30°C
15/5°C
210 250 300 nm
Abb. C5.27: Das CD-Spektrum bei pH 3.82 zeigt keinen Unterschied zum
CD-Spektrum bei pH 7.0 (vgl. Abb. C5.35).
-140- allgemeiner Teil
Abb. C5.28: Schmelzkurven von allo(G4I4) bei pH 7.0 und 3.8. Die Schmelzkurven
bei pH 7.0 wurde mit Tris HCl und diejenige bei pH 3.8 mit NaCitrat als
Puffersalz bei 250 nm gemessen. allo(G4I4): pH 7.0:40°C (8.86 pM, 56% Hyp.); pH
3.8: 47°C (9.05 pM, 26% Hyp.).
allo(G4I4) 8.86 uM pH 7.0 allo(G4l4) 9.05 uM pH 3.8
40°C (55% Hyp.) 47°C (26% Hyp.)
Allo(G4l4) scheint schon in niedrigen Konzentrationen bei tiefen Temperaturennicht mehr löslich zu sein. Denn eine Oligonucleotidlösung absorbiert bei 30°C
Licht mit einer Wellenlänge von 350 nm, was nur durch Streuung des
eingestrahlten Lichts an den in der Lösung schwebenden Festkörpern
(wahrscheinlich ein höheres Assoziat; von blossem Auge sichtbar) herrühren
kann, da keine in der Lösung Vorhände Substanz bei 350 nm Licht absorbiert
(Abb. C5.29).
-141- allgemeiner Teil
allo(G4l4) 8.9 uM mit Absorption bei 350 nm
% HyperchromizitätBu-
50-
/""\40- 1 \
*
*
30-*
20- *
.
10-
0-
^.Schmelzkurve(250 nm)
10 20
.rel. Absorption
*•"», .J. (350 nm)-i |*Wii|iiiiiyiTii|'lriii|» ,_;—| , f
80 °C40 50 60 70
Abb. C5.29: Neben der Schmelzkurve von allo(G4I4) ist auch die Absorption dieser
Lösung bei 350 nm als Mass, ob schon alles Oligonucleotid gelöst ist, aufgetragen
(für diese Kurve gilt die Hyperchromizitätsskala selbstverständlich nicht). Wie
man leicht erkennt, ist erst ab 40°C alles allo(G4I() in Lösung.
Eine auf 5°C gekühlte Allopyranose-NA Lösung zeigt deutlich feine, weisse,
schwebende Flocken. Genau dasselbe Phänomen stellten schon Fischer [50] und
Helg [51] bei anderen Allopyranose-NA Oligonucleotiden fest. Sowohl bei Homo-
DNA als auch bei natürlichen DNA Oligonucleotiden wurde nie ein solches
Phänomen beobachtet.
Es bleibt ungeklärt, weshalb allo(G4l4) eine Schmelztemperatur besitzt, die um
etwa 40°C tiefer liegt als diejenige des [allo(G8)}2-allo(I8) Triplex.
Die UV-Schmelzkurve der alternierenden Sequenz allo(GI)4 zeigte gegenüberseinen monobasigen Aequivalenten allo(G8)/allo(I8) sowie der blockweisen
Sequenz allo(G4I4) ein deutlich verschiedenes Schmelzverhalten. So betrug die
Schmelztemperatur von allo(GI)4 nur 17°C (9.6 uM, 19% Hyp.). Die
Schmelzkurve war deutlich weniger kooperativ als diejenige von allo(G4I4) oder
diejenige des zweiten Uebergangs eines allo(G8), allo(I8) Gemisches. Was
ebenfalls sofort auffällt, ist, dass die Schmelzkurve bei einer Aufheiz- und
Abkühlrate von 0.5°C/min vollständig reversibel ist. Wie die Abbildung C5.30
zeigt, entspricht die Hybridisierungstemperatur genau der Schmelztemperatur.
-142- allgemeiner Teil
allo(GI)4 9.6 \iM% Hyperchromizität
20-
4tr"* ""^-ÄT Seh"1012611 17°c
15-f
^*"
Hybridisieren 17°C
•
0
10-
5-
•
•
*•
/
C
r i i i i i i i i ' i i
) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C5.30: Schmelzkurve von allo(GI)4. Die Schmelzkurve ist auch bei
einer Heiz- resp. Kühlrate von 0.5°C/min. vollständig reversibel, ganz im
Gegensatz zu allo(G4I4) oder allo(G,) + allo(I8), die jeweils grosse
Hysteresen aufweisen. allo((GI)4: Schmelzen: 17°C (9.6 pM, 19% Hyp.);
Hybridisieren: 17°C (19% Hyp.).
Auch das CD-Spektrum von allo(GI)4 zeigte deutliche Unterschiede zu den CD-
Spektren von allo(G4I4) und zum Gemisch von allo(Gg) und allo(I8), man
vergleiche dazu die Abbildung C5.37.
Diese gravierenden Unterschiede zu den anderen beiden Oligonucleotidtypenlassen sich nur durch sehr unterschiedliche Paarungsstrukturen (beispielsweisekeine Bildung eines höheren Assoziat, z.B. Triplex, Tetraplex) oder durch eine
andere Art der Basenpaarung (z.B. einem Wechsel von reverse-Hoogsteen-
artigen zu einer reinen Watson-Crick-artigen Paarung) erklären.
C.5.5 Untersuchungen zur Frage nach der
Strangorientierung in Allopyranose-NAOligonucleotidduplexen
Zur Beantwortung der Titelfrage wurden die beiden Sequenzen allo(GGIGII)
und allodIGIGG) hergestellt und deren Paarungsverhalten mit sich selbst, sowie
im 1:1 Gemisch untersucht. Eine schematische Darstellung der verschiedenen
-143- allgemeiner Teil
möglichen Paarungen, sowohl bei paralleler als auch bei antiparalleler
Strangorientierung, werden in Abbildung C.5.34 gegeben.Die Resultate der vorangegangenen Experimente zeigten, dass eine
alternierende Gl-Paarung in der Allopyranosyl-NA Reihe etwa vergleichbar mit
einer GG- aber deutlich schwächer als eine II-Paarung ist. Oligonucleotide mit
einer blockweisen oder monobasigen Gl-Sequenz besitzen aber deutlich höhere
Schmelztemperaturen (man vergleiche dazu die Schmelztemperaturen der G-, L-
und Gl-Octamersequenzen in der nachfolgenden Tabelle).
Oligonucleotid Schmelztemperatur
allo(Gs) 13°C (9.8 uM)
allo(I8) 29°C (8.7 uM)
allo(G8) + allods) 37/82°C (je 2.3 uM)
allo(G4I4) 40°C (10.0 uM)
allo(GI)4 17°C (9.6 uM)
Das CD-Spektrum der beiden Oligonucleotide allo(GGIGII) und allo(IIGIGG)
und dem 1 : 1 Gemisch davon zeigten sowohl untereinander (vgl. Abb. C5.31) als
auch mit den CD-Spektren von allo(G4I4) und demjenigen von allo(Gg): allods)
= 1:1 grosse Uebereinstimmung.
Abb. C5.31: Bei allo(GGIGn), allodIGIGG) und dem 1:1 Gemisch dieser
beiden Oligonucleotide liegt, wie das CD-Spektrum dieser drei
Oligonucleotidlösungen bei 5°C zeigt, die gleiche Basenpaarungsart vor.
-144- allgememer Teil
Ein weiterer Hinweis auf die Gl-Paarung ergibt sich auch aus der
Unterschiedlichkeit der CD-Spektren von allo(GGIGII) und allo(IIGIGG) zu der
mathematischen Summe von allo(G8) und allo(Ig) in Abbildung C5 32
50 0 -i 1
Abb. C5.32: Der Vergleich der Summe der GG- resp. ü-gepaarten allo(Gs)
resp aIlo(Ia) Duplexe und den allo(GGIGII) zeigt durch die starke
Verschiebung der Bandenlage des charaktensischen Peaks von 292 auf 303
nm an, dass ein Wechsel in der Basenpaarung stattgefunden haben muss
Die Schmelzkurven der einzelnen reinen Oligonucleotidsequenzen sowie vom
1 : 1 Gemisch zeigten keinen grossen Unterschied zueinander Die
Schmelztemperaturen, die aus der ersten Ableitung der Schmelzkurve bestimmt
wurden, lagen bei Konzentrationen um 9 pM bei 8°C im Falle von allo(GGIGII)
und dem 1:1 Gemisch sowie 5°C im Falle von allo(IIGIGG)
Abb. C5 33. Die Schmelzkurven von allo(GGIGU), allodIGIGG) und dem 1
1 Gemisch davon Es zeigt sich im 1 : 1 Gemisch bei vergleichbaren
-145- allgemeiner Teil
Konzentrationen keine Schmelzpunktserhöhung gegenüber den einzelnen
Oligonudeotiden. allofGGIGII): 8°C (955 pM - % Hyp.); allodIGIGG) 5°C
(9.41 pM, - % Hyp.); 1 : 1 Gemisch: 8°C (je 4.04 pM, - % Hyp.). Die
Schmelzkurven wurden im StandardpufferpH 7.0 bei 248 nm bestimmt.
Gemisch aus alMGCIGIRnur alWGGICII) und allo(IICIGG) nur allo(GGIGII)
3 x n-Paarung3 x CG-Paarung
i i i i i
allo-GGIGII
IIIIII
allo-GGIGIII I I I I I
undi i i i i i
allo-IIGIGG
ihm i
allo-IIGIGGparallelePaarung
allo-GGIGII
IIIIIIallo-GGIGII
3 x D-Paarung3xGG-Paarung
allo-GGIGII
IIIIIIallo-IIGIGG
allo--IIGIGG
II I III
allo-IIGIGG'''
3 x Il-Paarung3 x CG-Paarung
6 x Gl-Paarung
3 x Il-Paarung
i i i t i i
antiparallele «Ho-GGIGII
Paarung Ui.J.J.1*
IIGIGG-allo
6 x Cl-Paarung
allo-GGIGII
um i
GGIGII-allo
und
l i i i i l
allo-IIGIGG
IIIIIIIIGIGG-allo
allo-GGIGII
IIIIIIIIGIGG-allo
und
I I I I I 'I
allo-IIGIGGIIIIIIGGIGII-allo
6 x Gl-Paarung
l l i i i l
allo-IIGIGG
IIIIII
GGIGII-alloI I I I I I
6 x Gl-Paarung
Abb. C5.34: Die verschiedenen Möglichkeiten der Paarung von allo(GGIGII) (links),
allodIGIGG) (rechts) und dem 1:1 Gemisch (mitte). Im oberen Teil der parallelen oder
der antiparallelen Paarungsmöglichkeiten stehen jeweils die Möglichkeiten bei GG-
und Il-Paarung, im unteren Teil diejenigen mit einer Gl-Paarung. Das CD-Experiment
-146- allgemeiner Teil
zeigt, dass wir es wohl mit einer Gl-Paarung zu tun haben, und weil keine
Schmelztemperaturzunahme beim 1 : 1 Gemisch gegenüber den einzelnen
Oligonucleotidsträngen festzustellen war, müssen beim 1 : 1 Gemisch noch dieselben
(allo(GGIGn))2 und {allo(nGIGG))2 Duplexe vorliegen.
Es zeigte sich, dass für das 1 : 1 Gemisch keine Schmelzpunktserhöhung
gegenüber den beiden einzelnen Oligonucleotiden erhalten werden konnten
(Abb. C5.33). Das bedeutet, dass vermutlich kgin allo(GGIGII) allo(IIGIGG)-
Mischkomplex entsteht.
Unter der Annahme, dass der Unterschied der CD-Spektren von allo(IIGIGG),
allo(GGIGII) und dem 1 : 1 Gemisch einerseits und der mathematischen Summe
der CD-Spektren von allo(G8) + alIo(I8) anderseits (Abb. C5.32) als Kriterium für
die Existenz einer Gl-Paarung in den erstgenannten drei Systemen herangezogen
werden darf, würde eine antiparallele Strangorientierung in diesen Systemen
resultieren1.
C.5.6 Zusammenfassung der Eigenschaften von
Allopyranose-NA Oligonucleotiden, die
Isoguanin enthalten
C.5.6.1 Gedanken zur Basenpaarung in den hypothetischen G2I- und
l^G-Triplexen
Die Voraussetzungen für die in Abbildung C5.36 dargestellten möglichen
Basenpaarungen in den beiden Triplexen G2I- und I2G:
- anti-Orientierung der glycosidischen Bindung (wie sie bisher auch immer
beobachtet wurde)
- Isoguanin liegt in der Form des H-N(l) Tautomeren vor.
Aus den Betrachtungen der verschiedenen möglichen Basenstrukturen, die sich
aus der Permutation der Basen ergab und mit dem Wissen, dass eine dritte
1 Eine Aehnlichkeit der Summe der CD-Spektren von allo(Ga) + allod«) und den CD-Spektren von
allo(GGIGII), allodIGIGG) sowie deren 1 :1 Gemisch wäre ein Hinweis gewesen, dass in diesen
Oligonucleotiden resp. -gemisch, GG- und II- aber nicht Gl-Paarungen vorgelegen hätten.
-147- allgemeiner Teil
Paarung eine besondere, zusätzliche Stabilisierung ergibt, kristallisierten sich
anhand von Modellbetrachtungen1 die zwei Basenpaarungsmuster für die
Triplexe heraus. Bei diesen Strukturen wird jeweils jede Base durch die Paarung
mit den anderen beiden, den Triplex aufbauenden Basen zusätzlich stabilisiert,
was die grosse Stabilität besonders des G2l-Triplex erklären könnte.
I2G-Triplex j_/N
Tm = 37°C /%(2.3 uM)
R©'
G2I-TriplexT„ = 82°C
(2.3 uM)
Abb. C5.36: Eine mögliche Basenpaarung des G2I und des I2G Triplex mit dem Allopyranosyl-
isoguanin in seiner H-N(l) tautomeren Form. Die Strangorientierung wird durch die Symbole + und -
angegeben ('+' bedeutet, dass das 6'-Ende ist gegen den Betrachter,'-' bedeutet, dass das 6'-Ende vom
Betrachter weg hinter die Zeichenebene zeigt).
Dieses Modell stimmt sehr gut mit der Beobachtung überein, dass im
Schmelzexperiment ein Triplex-zu-Einzelstrang Uebergang festgestellt wird. Ein
Zerfall einer Paarung führt deshalb sofort zum Zerfall des gesammten Triplex.
Die Bildung eines allo(G8)-allo(I8) Duplex könnte die in Kapitel C.5.3 gefundene
Hysterese gegenüber der Schmelztemperatur des G2I Triplexes erklären. Ein
solcher Gl-gepaarter Duplex könnte einen generellen Rezeptor sowohl eines
Allopyranosyl-isoguanin Oligonucleotidstrangs, als auch eines Allopyranosyl-
guanin Oligonucleotidstranges darstellen und so sowohl den G2I als auch den I2G
Triplex ausbilden.
1 'HGS Biochemistry Molecular Models', Maruzen Co. Ltd., Tokyo.
-148- allgemeiner Teil
C.5.6.2 Zusammenfassung der UV-Schmelzkurven und CD-Spektren
*o
a
+l SSS«s
o
o
4I
:! TbÜ
•a.
'S
o
"i3
CS
CO
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£ &K K
s£ ^CS o
in CS
§ Io\ \0
CO C\*w
U U
§ii II
HE ?O
r °HE
k.
88S88
JU8 S S 8 8 S °
>in o in
Olig
onuc
leot
ide
AUose-NA
angegebenen
der
CD-Spektren
und
Schmelzkurven
der
Vergleich
C5.37:
Abb.
9s
\s^7
i-c
/\
we
/\
U-C
St
w_
*°mc
allo(U
^c^^^i
f"
illo(G.)
iy^
allo(A.)
allo(U
allo
(G„)
allo
(A„)
100'C
80
i-1
60
40
20
Hyp.
)27%
nM,
(8.7
29°C
=Tm
)-K-^—I—
%H
100-C
80
60
40
20
Hyp.)
14%
nM,
(9.8
13°C
=Tm
0'
5-
10-
15-
20-1.
100°C
80
60
40
20
Hyp.)
48%
nM,
(11.
016°C
=Tm
- 150 - allgemeiner Teil
C.5.7Ein Vergleich der GI-Basenparung von
Homo-DNA vs. Allopyranose-NA
Guanin- und Isoguanin-haltige Homo-DNA bildet, wie anhand von
Gelexpenmenten und UV-Schmelzkurven durch Hunziker [22], Fräser [47], Peng[48] und Zimmermann [81] gezeigt werden konnte, nur Duplexe mit jeweils nur
einem, relativ flachen Schmelzubergang, der in den verschieden geordneten
Oligonucleotidsequenzen nur geringe Unterschiede der Schmelztemperaturenaufweist (Abb C5 38 und Tabelle) Die Form der Schmelzkurven und sogar die
Hypochromizität der Schmelzkurven zeigt nur eine geringe Abhängigkeit von
der BasensequenzGuanin- und Isoguanin-haltige Allopyranosyl-NA Oligonucleotide zeigen ein
grundsatzlich verschiedenes Schmelzverhalten (Abb C5 39 und Tabelle)
- allo(GI)4 besitzt emen monophasischen Uebergang bei 17°C
- das blockweise Oligonucleotid allo(G4I4) besitzt ebenfalls einen
monophasischen, allerdings viel schärferen Uebergang bei 41°C
- Am ekklatantesten ist der Unterschied bei dem System aus allo(G8)/allods)
Diese Schmelzkurve besitzt zwei Uebergänge Aus der Diskussion dieser Kurve
müssen nicht nur Duplex-, sondern auch Triplexstrukturen in Betracht gezogen
werden
Homo-DNA (Hexamere)% Hypochromizität
20
15
10-
5
0
0 20 40 60 80 100°C
Abb C5 38 Schmelzkurven von Homo-DNA Oligonucleotiden, die ddG und
ddl enthalten Alle Schmelzkurven wurden von Fräser [47] und Peng[48] im
Standardspuffer pH 7 0 bei 265 nm gemessen
dd(l3G3)da(ü6) + aa(i6)
. +
-151- allgemeiner Teil
Allose-NA (Octamere)% Hyperchromizität
6O-1
50- /*• allo(G8) + allo(l8)•
40 -
* •
30-
20 -
*
•
10- jF _^
0- "^^zzais"IUI | i | | | 1 • | | | | i |
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C5.39: Schmelzkurven von Allopyranose-NA Oligonucleotiden, die allo(G)
und allo(I) enthalten. Alle Schmelzkurven wurden im Standardpuffer pH 7.0 bei
250 nm gemessen.
Sequenz Schmelztemperatur
dd(G6) + dd(l6)1 61°C (18.0 uM, -14% Hyp.)
dd(I3G3)2 57°C (16.8 pM, -16% Hyp.)
dd(GI)3i 49°C (17.0 uM, -16% Hyp.)
allo(Gg) + allo(Ig) 40/82°C (10.3 pM, 13/37% Hyp.)
allo(G4l4) 41°C (10.1 uM, 47% Hyp.)
allo(GI)4 17°C (9.6 \>M, 19% Hyp.)
Die Konsequenz dieser Unterschiede ist, dass also die Gl-Paarungsstruktur in
der Homo-DNA Reihe verschieden von derjenigen in Allopyranose-NA sein
muss.
Diese Schmelztemperatur wurde von Fräser [47] bestimmt.
Diese Schmelztemperatur wurde von Peng [48] bestimmt.
-152- allgemeiner Teil
Ein Vergleich zwischen dem Homo-DNA Triplex (ddlGfiMda^dd^CHA^-A))
(Kapitel C.4.7.6) und dem vermuteten Triplexgemisch. das von allo(Ga) und
allo(Ia) gebildet wird (Kapitel C5.3)
Der Homo-DNA Triplex zeigt sowohl beim Schmelzen wie auch beim
reversiblen Hybridisieren zwei Uebergänge. Beim Uebergang bei 21°C (bei je 6.08
pM) handelt es sich zweifelsfrei um die Abspaltung des dritten
Oligonucleotidstranges (dd(7CHA5-A)) und beim oberen um das
Auseinanderbrechen des verbliebenen dd(G6) • dd(I6) Doppelstranges, da der
obere Schmelzpunkt bei 63 °C genau mit demjenigen eines 1 : 1 Gemischs von
dd(G6> und dd(I6) übereinstimmt.
Ganz anders liegt der Fall bei den zwei durch Mischen von allo(Gs)- und
allo(I8)-Einzelsträngen (d.h. bei Temperaturen über 30°C) in Betracht zu
ziehenden G2I resp. I2G Triplexen. Hier ist anzunehmen, dass die Tripelstränge
in einer Schmelzstufe in die Einzelstränge zerfallen.
Tm = 82°C
{allo(G8)}2•
allo(I8) » 2 allo(G8) + allo(I8)
Dies ist dann der Fall, wenn der nach Abspaltung des einen
Oligonucleotidstranges entstehende Duplex weniger stabil als der Triplex ist.
Diese grössere Stabilisierung des Triplexes kann durch eine zusätzliche
Wasserstoffbrücke entstehen, z.B. so, dass jede der drei Nucleobasen mit den
anderen beiden Nucleobasen Wasserstoffbrücken ausbilden, wie das im
Strukturvorschlag für den G2I Triplex angegeben wurde (Abb. C5.42).
Ein Triplex, der in einem Schritt in die Einzelstränge zerfällt, kann nicht auf
demselben Weg wieder den Tripelstrang ausbilden. Es muss erst einmal ein
thermodynamisch instabilerer Duplex (der in Abb. C5.36 markierte Gl-gepaarte
Duplex) ausgebildet werden, an den sich dann entweder ein allo(G8) oder allods)
Oligonucleotidstrang anlagert und somit einen G2I resp. I2G Triplex bildet. Die
dem Triplex vorgelagerte Bildung eines Gl-gepaarten Duplex, von dem
anzunehmen ist, dass er instabiler ist als der G2I Triplex, erklärt die grosse
Hysterese von 40°C der Schmelzkurve zur Hybridisierungskurve (Abb. C5.40).
-153- allgemeiner Teil
% Hyperchromizität40 1 Bildung des allo(G8)allo(Ig)Duplexes
und daraus sofort des Gjl-30
20
10
0
-10
und des IjG-Triplexes •iplexes i
V
Schmelzen des G2I-Triplexes
Schmelzen des IjG-Triplexes
i—i——i—i—i—i—i—i—i—i—i——i—i—i——t——|
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C
Abb. C5.40 Eine mögliche Erklärung für die beiden Uebergänge im
Schmelzexperiment resp. dem Uebergang im Hybridisierungsexperiment in
einem System, das aus allo(Gs) und allods) besteht.
-154-
P Experimenteller Teil
D.l Allgemeine Bemerkungen
Für die Aufnahme der Spektren danke ich den Herren R. Häfliger und O. Greter
(Massenspektren), H. Hediger und R. Dohner (IR-Spektren), D. Manser und Frau
B. Suter (Elementaranalysen) und dem gesamten NMR-Team, das sich aus Frau
B. Brandenburger, Frau V. Eggli und Herrn Dr. B. Jaun konstituiert.
Herrn P. Kälin danke ich für die unermüdliche Herstellung von verschiedenen
Zuckerbausteinen.
Absorptionskoeffizienten von OligonucleotidenDer Absorptionskoeffizient eines beliebigen Oligonucleotids der allgemeinen
Form (AxByCz) bei einer bestimmten Wellenlänge X wurde als
Linearkombination der einzelnen, das Oligomere aufbauenden
Nucleosideinheiten berechnet:
e(AxByCz, X.) = x• e(A, X.) + y
• e(B, X) + z• e(C, X)
Nucleosid e (260 nm) e (280 nm) e (292 nm)
ddA 14700 2100
ddC 7800 6000
ddG 11100
ddl 2900 8500
ddT 9500 7400
ddU 10200
dd7CHA 8900 9000
alloG 11500
allol 4200 7700 11600
-155- experimenteller Teil
Die Extinktionskoeffizienten e der einzelnen Mononucleosideinheiten wurden
dabei in Wasser (dd A, dd U) bzw. einem 150 mM NaCl, 10 mM Tris • HCl - Puffer
pH 7 bestimmt (dd C, dd G, dd T, dd I, dd (7CHA) allo I). Die
Extinktionskoeffizienten der natürlichen DNA-Oligomere wurden nach
Angaben aus der Literatur [90] und [91] auf ähnliche Weise berechnet. Für den
Extinktionskoeffizient von allo G wurde, da andere Angaben fehlten, der Wert
des natürlichen Guanosin aus [90] verwendet.
Ausbeuten
Die Ausbeuten und Molangaben sind nach den im 1H-NMR gefunden
Lösungsmittelanteil korrigiert. Kopplungsausbeuten von Synthesizeransätzenwurden VIS-spektroskopisch anhand der Absorption bei 498 nm der
Dertitylierungslösung, bezogen auf den vorangegangenen Kopplungsschritt,bestimmt.
Beladungsdichte
Etwa 10 mg mit 4,4'-Dimethoxytrityl-geschütztem Nucleosid als Starteinheit
beladenen CPG-Träger wurden in 25 ml 0.1 M p-Toluolsulfonsäure in CH3CN
suspendiert und die Absorption der Lösung bei 498 nm in einer 10 mm Küvette
bestimmt. Nach Einsetzen in folgende Gleichung erhält man die
Beladungsdichte in pxnol/g.
abs (498 nm) 357.5
Einwaage [mg]= Bdadungsdkhte [pmol/g]
Circulardichroismus (CD)
Jasco J-600 Spektropolarimeter; IBM AT Personalcomputer.
Messparameter:
Data mode CD
Band width 1.0 nm
Slit width auto
Senitivity 20 mdeg
Time constant 2.0 sec
Step resolution 0.1 nm
Scan speed 5 nm/min
-156- experimenteller Teil
Küvettenlänge: 1 cm. In der Zusammenfassung im Kapitel D.ll sind jeweils die
Oligonucleotidkonzentration, Lösungsmittel (falls verschieden von 150 mM
NaCl, 10 mM Tris • HCl, pH 7.0, H2O), relativen Elliptizitätsmaxima resp -minima
© sowie die dazugehörenden, berechneten molaren Elliptizitäten (0) in 103°M-
^m"1 angegeben. Die Temperatur wurde direkt in der Probelösung mit einem
Thermoelement gemessen. Die Oligonucleotidkonzentration der Messlösung
wurde vorgängig aus der UV-Absorption im dehybridisierten Zustand berechnet
[55], [56].
Chromatographie
Dünnschichtchromatographie (DO
Es wurden DC-Fertigplatten, Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.25 mm Merck
verwendet. Die jeweils verwendeten Laufmittel und damit erhaltenen Rf-Werte
wurden angegeben. Die UV-aktiven Substanzen wurden unter einer UV-Lampe
(254 nm) detektiert. Verbindungen, die oxidierbare funktionelle Gruppen tragen,
wurden entweder in Cer(IV)sulfat- oder Anisaldehydlösung kurz eingetauchtund dann mit einem Föhn erhitzt.
- Cersulfatlösung: 2.1 g Cer(JV)sulfat, 4.2 g Phosphormolybdänsäure, 12 ml konz.
H2SO4,180 ml H20
- Anisaldehydlösung: 180 ml EtOH, 10 ml Anisaldehyd, 10 ml H2SO4, 2 ml
HOAc
Säulenchromatographie
In den Synthesevorschriften wurden die Menge Kieselgel und das Eluens
angegeben. Im allgemeinen wird der Durchmesser der Säule so gewählt, dass das
Kieselgel etwa 30 cm hoch ist. Bei sehr einfachen Trennproblemen, z.B. wenn
nur ein Salz abgetrennt werden muss, betrug die Säulenhöhe nur etwa 13 cm. Es
wurde jeweils Kieselgel 60, Korngrösse 40-63 um 230-400 mesh ASTM von Merck
verwendet und die Flash-Technik nach Still [92] angewandt.
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
Die Apparatur ist aus folgenden Komponenten zusammengesetzt:
LKB-Bromma 2249 (Pumpe), Kratos Spektroflow 757 (TJV-Detektor), HP-3396 A
(Integrator), oder Tarkan W+W Recorder 600, sowie den später aufgeführten
Säulen und Eluiersystemen. Die Detektion erfolgte bei 260 nm, einzig bei
Oligonucleotiden, die allo-iso-Guanosin enthalten, wurde bei 290 nm detektiert.
-157- experimenteller Teil
-Nucleogen-DEAE (Macherey & Nagel):
präparativ: Vorsäule Nucleogen Guard Column, 30 x 4.0 mm, ID; Säule:
Nucleogen-DEAE 60-7, 125 x 10.0 mm. Mobile Phase: Eluens A: 20 mM
K2HPO4/KH2PO4, pH 6.0, 20% CH3CN, 80% H20; Eluens B: 1 M KCl, 20 mM
K2HPO4/KH2PO4, pH 6.0,20% CH3CN, 80 % H20; Fluss 3.0 ml/min; Druck: 20 - 35
bar.
analytisch: Vorsäule Nucleogen Guard Column, 30 x 4.0 mm, ID; Säule:
Nucleogen-DEAE 60-7, 125 x 4.0 mm. Mobile Phase: Eluens A: 20 mM
K2HPO4/KH2PO4, pH 6.0, 20% CH3CN, 80% H20; Eluens B: 1 M KCl, 20 mM
K2HPO4/KH2PO4, pH 6.0,20% CH3CN, 80 % H20; Fluss 3.0 ml/min; Druck: 40 - 70
bar.
Aquapore RP-300 (Brownlee Labs):
präparativ: Aquapore Octyl Prep-10 Cartridge, 250 x 10.0 mm. Mobile Phase:
Eluens A: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0, H20; Eluens B: 0.1 M
Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0 20% H20, 80% CH3CN; Fluss: 4.0 ml/min.;
Druck: 45 - 55 bar.
analytisch: Vorsäule: RP-8 Newguard, 15 x 3.2 mm, 7 um; Säule: Aquapore RP-
300, 220 x 4.6 mm, 7 uM. Mobile Phase: Eluens A: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M
HOAc, pH 7.0, H20; Eluens B: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0 20% H20,
80% CH3CN; Fluss: 1.0 ml/min.; Druck: 60 - 85 bar.
Spherisorb 300Ä C-18 (Phase Sep):
präparativ und analytisch: Spherisorb 300Ä, C-18, 10 um 250 x 9.0 mm
(Festphase von Phase Sep, gepackt von Dr. J. Schreiber (ETH Zürich) nach der
'slurry'-Methode gepackt [93]). Mobile Phase: Eluens A: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M
HOAc, pH 7.0, H20; Eluens B: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0 20% H20,
80% CH3CN; Fluss: 3.0 ml/min.; Druck: 28 - 38 bar.
MonoO (Pharmacia LKB):
Mit einer Mono Q-Säule ist es möglich, bei pH 12 zu arbeiten. Dabei muss
allerdings auch ein gegen basisches Medium stabiles Pumpensystem verwendet
werden. Diese setzte sich zusammen aus: P-500 (Pumpe, Pharmacia), mit
Gradient Programmer GP-250 (Pharmacia). Der Detektor und der Recorder sind
identisch mit den oben zitierten Geräten.
präparativ und analytisch: Mono Q®, HR5/5 (Pharmacia LKB). Mobile Phase:
Eluens A: 0.01 M NaOH, H20; Eluens B: 1 M NaCl, 0.01 NaOH, H20; Fluss: 1.0
ml/min; Druck: 40 - 50 bar.
-158- experimenteller Teil
In der Tabelle der Reinigung der Oligonucleotide (Kapitel D.10) sind die
Retentionszeit (tu), die Halbwertsbreite o (was der halben Peakbreite bei 60% der
Peakhöhe entspricht) und die Bodenzahl N (N={tR/a)2) aufgelistet.
DNA-Synthesizer
Es wurden zwei verschiedene Modelle von DNA-Synthesizern verwendet:
- 380 B DNA Synthesizer (ABI):
Alle zur Synthese benötigten Reagenzien, ausser den Phosphoramiditen,wurden von ABI gekauft. Die Phosphoramiditlösungen wurden nach folgender
Formel zubereitet:
f • x • (n + 3) 1.5 MG = ug (Phosphoramidit)
f = Anzahl Equivalente Phosphoramidit je Kopplung (man verwendete jeweils10 Eq)
x = Beladungsdichte [umol/g] • Menge Träger [g]n = Anzahl Kopplungen für das jeweilige Nucleotid total
MG = Molekulargewicht des Phosphoramidits
Die Phosphoramidite wurden in (n + 3) • 0.15 ml CH3CN gelöst.
- Gene Assembler Plus (Pharmacia LKB), gesteuert durch einen PC M-300
(Olivetti):
Alle Reagenzien wurden gemäss den Angaben in [52] selbst hergestellt. Die
Phosphoramiditlösungen wurden als 0.1 M Lösungen in CH3CN hergestellt. Es
wurde jeweils je Kopplung 0.16 ml Lösung verbraucht und für jedes Nucleotid
zwei Sicherheitskopplungen einberechnet. Die Tetrazol-Lösung war 0.5 M in
CH3CN. Man gab sowohl zur Phosphoramidit-, wie auch zur TetrazoUösungfrisch aktiviertes 4 A Molsieb.
a) Homo-DNA OligonucleotideDie Festphase, an welche Oligonucleotide der Homo-Reihe (vornehmlich
Homo-7-carbaadenosin enthaltende Oligonucleotid-Sequenzen) gebunden
waren, wurde in ein Gewindefläschchen gegeben, mit 4 ml 25 %
Ammoniaklösung überschichtet und für 14 Stunden bei 55°C belassen. Man
engte auf 0.5 ml ein und entfernte durch Mikrofiltration die Festphase, wusch
-159- experimenteller Teil
diese mit 4 ml H2O nach, engte diese Lösung auf 2 ml ein und trennte das
gewünschte Oligonucleotid HPL-chromatographisch ab (Bedingungen vgl Tabelle
Kapitel D.IO). Anschliessend wurden die Oligonucleotide noch über SEP-PAK
entsalzt.
b) Allopyranosyl-isoguanin enthaltende Oligonucleotideenthalten noch Allylschutzgruppen, die in Anlehnung an Noyori et al. [53]
noch am Träger entschützt wurden1. Dabei wurde wie folgt vorgegangen:
Zum CPG-Träger wurde eine Suspension von 3.6 ml THF, 240 ul n-Butylamin,90 ul Ameisensäure, 122 mg Triphenylphosphin und 42.0 mg Tris-
(dibenzylidenaceton)-dipalladium(O) zugegeben. Die Suspension wurde für 20
Std. unter gelegentlichem kräftigen Durchmischen bei 55°C geheizt. Diese
Suspension wurde mit Hilfe einer Pipette vorsichtig von der Festphase abgesaugt
und zur Abtrennung von eventuell mitgeschlepptem Träger durch eine
Glasfilternutsche abfiltriert. Die Festphase wird sodann zwei Mal mit THF und
zwei Mal mit je 4 ml Aceton gewaschen. Dabei wurden die Lösungsmittel
wiederum durch die Nutsche abfiltriert. Der in der Nutsche zurückgehaltene
Träger wurde nun in die Gewindeflasche zurückgegeben und der Träger für 15
Min. in 0.1 M Natriumdiethyldithiocarbamat pH 9.7 suspendiert. Die Lösung
wurde analog der oben beschriebenen Vorgehensweise abpipettiert. Der Träger
wurde drei Mal mit Aceton, einmal mit H2O gewaschen und noch einmal für 15
Min. in 0.1 M Natriumdiethyldithiocarbamat suspendiert, drei Mal mit Aceton
und einmal mit H2O gewaschen. Darauf wurde das Trägermaterial in 4 ml 25 %
Ammoniaklösung suspendiert und für 14 Stunden bei 55°C im Heizblock
belassen. Dabei wurde das Oligonucleotid vom Träger abgespalten und die
Amidschutzgruppen der Basen abgespalten. Die ammoniakalische Lösung wurde
auf etwa 0.5 ml am RV eingeengt, das CPG durch Mikrofiltration abgetrennt und
mit 5 ml H2O nachgewaschen. Diese Lösung wurde auf = 2 ml eingeengt und
HPL-chromatographisch aufgetrennt (vgl. Tabelle zur Reinigung der
Oligonucleotide Kapitel D.10). Die vereinigten Produktfraktionen wurden so weit
wie möglich am RV eingeengt, mit 0.01 M HCl - Lösung in eine Gewindeflasche
ißei Allose-NA Oligonucleotiden hat es sich als sehr vorteilhaft erwiesen, die DMT-Schutzgruppedes zuletzt an das Oligonucleotid gekoppelten Nucleotids noch nicht abzuspalten, was die
Abtrennung der kürzeren Oligonucleotide stark vereinfachte. Bei Allopyranosyl-isoguaninenthaltenden Oligonucleotiden war es jedoch nicht möglich diese DMT-Gruppe am Oligonucleotidzu belassen, da sie, wie in einem kleinen Vorversuch unter Allylentschützungsbedingungen gezeigtwerden konnte, nicht stabil war.
-160- experimenteller Teil
gespült und dann mit 1.00 M und 0.10 M HCl - Lösung auf pH 2.0 eingestellt und
bei 55°C im Heizblock, um die Ketalschutzgruppen abzuspalten, so lange
gehalten, bis ein Optimum zwischen Zersetzungsprodukt und noch nicht
vollständig entschütztem Oligonucleotid eingetreten ist, was bei jedem
Oligonucleotid unterschiedlich lange dauert. Die Kontrolle, wie weit die
Entschützung der 2',3'-Hydroxygruppen bereits fortgeschritten war, erfolgte
durch analytische Injektion am HPLC. Um die Ketalspaltung zu beenden,
wurden 30 mg (360 umol, => 10 Eq. bez. H30+) NaHC03 zugegeben. Man engte
diese Lösung auf etwa 2 ml ein und trennte sie HPL-chromatographisch
(Bedingungen vgl. Tabelle Kapitel D.IO, Fussnote2 gibt jeweils die Bedingungen
für die Trennung der Oligonucleotide nach der Ketalabspaltung an, während die
Bedingungen für die Trennung vor der Ketalspaltung unter der Fussnote1 in
derselben Tabelle angegeben sind).
Elementaranalysenwurden im mikroanalytischen Laboratorium des Instituts für organischeChemie der ETH durchgeführt.
Entsalzen von Oligonucleotiden
Nach der HPL-chromatographischen Auftrennung von Oligonucleotidenmussten die produkthaltigen Fraktionen von überschüssigem KCl (DEAE-
Nucleogen-Chromatographie), Triethylammoniumacetat (RP-Chromatographie)oder NaCl (Mono Q) abgetrennt werden.
Dazu wurden die produkthaltigen Fraktionen auf 1.5 ml eingeengt. Diese
Lösung wurde sodann auf eine mit 5 ml MeOH und 20 ml H2O gespülte SEP-
PAK, 10 x 9 mm (Waters) RP-Säule, die auf eine 5 ml Hamilton Spritze
aufgesteckt wurde, gegeben und drückte sie mit Druckluft tropfenweise durch die
Säule, spülte mit 5 ml H2O nach, um das Salz vollständig zu eluieren und
eluierte das Oligonucleotid mit 10 ml MeOH : H2O = 3:7 von der Säule. Das
Eluens wurde in jeweils 1.5 ml Fraktionen gesammelt und nur die UV-aktiven
MeOH/H20 Fraktionen gesammelt und eingeengt. Vor allem Allose-NA
Oligonucleotide, die sehr polar sind, wurden schon teilweise mit Wasser eluiert.
Auch hier wurden nur die UV-aktiven MeOH/H20 Fraktionen gesammelt. Die
wassrigen Fraktionen wurden nochmals auf » 1 ml eingeengt und damit die
gesamte Entsalzungsprozedur noch zwei weitere Male wiederholt.
-161- experimenteller Teil
Fällen
Als Reinigungsmethode der Wahl bei den äusserst labilen, schon Flash-
chromatographierten Phosphoramiditen erwies sich das Fällen. Man löste dazu
die zu reinigende Verbindung in wenig Lösungsmittel (in dem diese Verbindung
gut löslich ist) und tropfte sie langsam zu einem intensiv gerührten, auf 0°C
gekühlten Lösungsmittel, in dem die Verbindung unlöslich ist. Darauf filtrierte
man das Präzipitat ab.
Gelelektrophorese
Die Apparatur für die Polyacrylamidgelelektrophorese besteht aus:
Model 3000/300 Power Supply (BIO-RAD); sowie den Gelhaltern von Biotec für
kleine Gels (145 x 120 x 0.8 mm) und Model S2 (Bethesda, Resarch Laboratories;
300 x 380 x 0.8 mm).
Die Angaben über die Gelzusammensetzung und die Temperatur, bei der das
Gel laufengelassen wurde, steht jeweils direkt bei den abgebildeten Gels. Die
übliche Menge Oligonucleotid wurde jeweils so gewählt, dass total ein Aliquot
von 40 nmol Base auf das Gel aufgetragen werden konnte. Es wurden
grundsätzlich zwei verschiedene Arten von PAGE (Polyacrylamidgel¬
elektrophorese) durchgeführt, nämlich denaturierende und nicht denaturie¬
rende Gels [64]. Die an einem Speedvac Concentrator SVC 100 H (Savant) in
Eppendorfröhrchen lyophilisierten Oligonucleotide wurden in 10 pl 10%
Saccharose-Lösung gelöst und auf das Gel aufgetragen. Ein denaturierendes
PAGE wurde durch Zusatz von Harnstoff (das Gel war 7 M an Harnstoff) erhalten
und das lyophilisierte Oligonucleotid wurde in Formamid gelöst und auf das Gel
aufgetragen. Die Gels wurden üblicherweise so lange laufen gelassen, dass ein
Marker (Bromphenolblau), ebenfalls in loading buffer aufgetragen, 2/3 des Gels
durchflössen hatte. Die Herstellung der Gels erfolgte nach [64]. Die
Oligonucleotide wurden durch Eintauchen des Gels für etwa 2 Stunden in einer
Anfärbelösung aus 50 mg Stains all, 200 ml (mit Ionentauscher MB-3 5 g/100 ml
für 1/2 Std. deionisiertem) Formamid und 200 ml deionisiertem Wasser [94] für
etwa eine Stunde und anschliessendes Waschen des Gels für eine weitere Stunde
auf dem Gel sichtbar gemacht und das Gel darauf fotografiert.
-162- experimenteller Teil
Hyperchromizität (% H)
Die prozentuale Hyperchromizität % H bei einer Temperatur T ist definiert als
{D(T)-D0}% H(T) = 100% •
—^5—L
Dabei ist D° der kleinste Absorptionswert im Laufe eines Schmelz- oder
Hybridisierungsexperiments [61, Seite 22], [62, Seit 409].
IR-Spektren
Perkin-Elmer Gitterspektrograph PE 983 (KBr-Spektren) und PE 781 (CHC13-
Spektren). Die Bandenlagen wurden in cm-1 und die relativen Peakintensitäten
und -formen mit folgenden Abkürzungen charakterisiert: vs = sehr stark, s =
stark, m = mittel, w = schwach, sh = Schulter, br. = breit.
Massenspektren
EI-Spektren: Tribrid (Ionisationsenergie 70 eV).
Pos-FAB-Spektren: ZAB-2 SEQ. Angabe von m/z, sowie in Klammern die
relative Intensität in % des Basispeaks. Mit M+ wird der Molpeak bezeichnet.
Mikrofiltration
Die Mikrofiltration diente dazu, Suspensionen, die das gewünschte
Oligonucleotid enthalten, vor der HPL-chromatographischen Reinigung vom
unlöslichen Anteil abzutrennen, um die Säule nicht zu zerstören.
Dazu wurde die Suspension in eine 5 ml Hamiltonspritze mit TLL-Anschluss,
an dem man ein Micropore braun: Spartan 13/20, 0.45um,Braunrand H
(Schleicher & Schuell) Filter angeschlossen hatte, gegeben. Man presste die
Lösung durch den Mikrofilter und wusch den unlöslichen Anteil nochmals mit
4 ml H2O nach.
lH-NMR-SpektrenDie Spektren wurden entweder auf einem Bruker WM-300, einem Varian XL-
300 oder einem Bruker AMX-400 gemessen. Chemische Verschiebungen sind in
ppm bezogen auf TMS = 0.0 oder CHCI3 = 7.26 ppm als internen Standard,
Kopplungskonstanten J in Hertz angegeben. Spinmultiplizitäten werden mit s =
Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett und m = Multiple«, breite Signale
-163- experimenteller Teil
mit br. abgekürzt. Die Signalzuordnung erfolgte vor allem anhand [95]. Die
Lösungsmittel, mit denen die Substanz noch vermischt ist werden im IH-NMR
nicht extra erwähnt.
13C-NMR-SpektrenDie 13C-NMR Spektren wurden entweder auf einem Varian XL-300 (75 MHz)
oder einem Bruker AMX-400 (100 MHz) Gerät aufgezeichnet. Als interner
Standard diente TMS = 0.0. Es wurden ausschliesslich 'H-breitbandentkoppelteund DEPT-Spektren aufgenommen.
31P-NMR-SpektrenSie wurden auf einem Bruker AMX-400 (162 MHz) breitbandentkoppelt
aufgezeichnet.
Optische Drehungen
Polarimeter Perkin-Elmer PE-241; d = 10 cm, c in g/100 ml, bei 25°C bei der
Natrium-D Linie gemessen.
Schmelzkurven
Die UV-Apparatur, um Schmelzkurven aufzunehmen war aus folgenden
Geräten zusammengesetzt:- Perkin-Elmer Lambda 2 (UV-Spektrometer)- Perkin-Elmer Digital Controller No. 570-0701
- Perkin-Elmer Temperatur Programmer C 570-710 (Temperaturgradienten¬
steuerung).
Der Probenraum wurde mit N2 gespült, um die Kondensation von Wasser an
der Küvette bei tiefen Temperaturen zu verhindern. Die Messlösungen wurden
vor der Messung am Hausvakuum (» 50 Torr) entgast, um die Entstehung von
C02-Blasen an der Wand der Küvette bei steigender Temperatur zu verhindern.
Die Temperaturen wurden im Heizblock direkt neben der Küvette gemessen.
Schmelz- resp. Hybridisierungsexperimente wurden bei einem
Temperaturgradienten von + resp. - 0.5°C/min. durchgeführt und alle 2.3 min.
ein Messpunkt aufgezeichnet. Die beobachtete Wellenlänge, die
Oligonucleotidkonzentration, die Schmelztemperatur, die prozentuale
Hyperchromizität und das Lösungsmittel, falls verschieden von 150 mM NaCl,
10 mM Tris • HCl, pH 7.0, H2O, sind angegeben. Die Oligonucleotidkonzentration
-164- experimenteller Teil
wurde aus der Absorption der Lösung bei der Temperatur, bei der das Oligomere
vollständig dehybidisiert vorliegt, und dem berechneten Absorptionskoeffizient
bestimmt.
Schmelzpunktewurden in einem offenen Röhrchen auf einem SMP-20 (Büchi) bestimmt und
sind nicht korrigiert.
Schmelztemperaturen (Tm) von Oligonucleotiden
Die Schmelztemperaturen von Oligonucleotiden (Tm) wurden rechnerisch
ermittelt - als diejenige Temperatur, bei der 50% der maximalen
Hyperchromizität erreicht ist. Falls im Temperatur vs. % Hyperchromizität -
Graphen die Bereiche der hybridisierten und der geschmolzenen Spezies beide
horizontal verlaufen. In anderen Fällen erfolgte die Bestimmung graphisch, als
Schnittpunkt der Schmelzkurve mit der Winkelhalbierenden von zwei
Tangenten an die Schmelzkurven.
UV/VIS-Spektren
UV-Spektren zur Charakterisierung wurden auf einem UVDCON 860 (Kontron)
durchgeführt. Es wurden die Absorptionsmaxima in nm und in Klammern die
molaren Extinktionskoeffizienten ([M"1]) angegeben.
D.2 Abkürzungen
Chemikalien, die mit der Molekularformel (z.B. CH2CI2 für Methylenchlorid)im Text zitiert werden, werden hier nicht mehr aufgeführt. Ebenso sind offizielle
Abkürzungen von Einheiten nicht aufgelistet.
abs absolutiert
AcOH EssigsäureAr Argon
aq. aquatisiertber. berechnet
BSA N,0-Bis-trimethylsilyl-acetamid
-165- experimenteller Teil
BuOH Butanol
CD Circulardichroismus
CPG Long Chain Alkylamin auf ControUed Pore Glass
DC Dünnschichtchromatographie
DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
dest. destilliert
DMAP 4-Dimethylamino-pyridinDMF N,N-DimethylformamidDMTC1 4,4'-Dimethoxy-triphenylchlormethan
EDTA EthylendiamintetraacetatEI Elektronenstoss-Ionisation
Eq Aequivalent
EtOAc Essigsäureethylester
FAB Fast Atomic Bombardement
ges. gesättigte wässrige Lösung des angegebenen
Salzes
%H relative, prozentuale Hyperchromizität
HMDS HexamethyldisilazanHPLC HochdruckflüssigchromatographieHV Hochvakuum (<0.05 Torr)
IR Infrarotspektroskopiekonz. konzentriert
Lsg. Lösung
M Molar oder Molekülpeak im MS
MeOH Methanol
MS MassenspektrumN Normalität einer wassrigen Lösung oder
Bodenzahl, N = [tR/a]2
NMR Kernmagnetresonanzspektroskopie
3-NOBA 3-Nitro-benzylalkohol
PAGE PolyacrylamidgelelektrophoresePTS Pyridin-(toluol-4-sulfonat)RP Umkehrphase
RT Raumtemperatur
RV Rotationsverdampfer
Sdp./Smp. Siede-/Schmelzpunkt
-166- experimenteller Teil
TBAF
TMS-Triflat
tR
techn.
TEMED
THF
TIPDSKCy
Tm
TMSiCl
Tris
UV/VIS
zers.
e
o
0
(0)
Tetrabutylammoniumfluorid
Trifluormethansulfonsäuretrimethylsilylester
Retentionszeit
technische Qualität
N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin
Tetrahydrofuran
(l,3-Dichlor-)l,l,3,3-tetraisopropyl-disiloxan
Schmelztemperatur von Oligonucleotiden
Trimethylchlorsilan
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Ultraviolett-/Visiblespektroskopie
Zersetzung
Extinktionskoeffizient [M"1cm_1]
Halbwertsbreite (Halbe Peakbreite auf 60% der
Höhe eines Peaks)
Elliptizität [mgrad]molare Elliptizität [103 gradM^cm-H
D.3 Lösungsmittel und Reagenzien
AcetanhydridAceton
Acetonitril
AcrylamidAdipinsäure-bis-(4-nitro-phenyl)-esterAUylalkoholAlox B
Ameisensäure
Ammoniak
AmmoniumperoxydisulfatArgonBenzoylchloridBernsteinsäureanhydridBorsäure
Merck, puriss. p.a.techn., dest. Sikkon/N2Für UV: Merck, für die Spektroskopiefür HPLC: Merck, für die ChromatographieFür Reaktionen: Fluka, puriss. p.a. dest.
CaH2/N2Fluka, puriss., vier Mal umkristallisiert
hergestellt von R. Fischer analog [96]
Fluka, purum >98%, dest. Natrium/Ar
Alumina Woelm® B, Akt. 1
Fluka, puriss. p.a.
Multigas, 99.9%
Fluka, puriss. p.a.Pan Gas, 4.8
Fluka, puriss.Fluka, puriss.Fluka, puriss. p.a.
-167- experimenteller Teil
Bromacetaldehyddiethyl-acetal
Bromphenolblaun-Butanol
BSA
CCI4CDCI3
CH2CI2
CHCI3
CPG
CyanessigsäureethylesterChloro(2-cyanoethoxy)-(N,N-diisopropylamino)phos-phinDCC
Dichloressigsäure2,6-DichloropurinDiethylether4,4'-Dimethoxy-triphenyl-chlormethan
4-Dimethylamino-pyridinDioxan
DMAP
DMF
DMSO-d6
EDTA, Dinatriumsalz,
DihydratEtOAc
EtOH
Ethyl-diisopropylaminFormamid
Harnstoff
HexamethyldisilazanHexan
HCl konz.
HCl 1.0 M, 0.1 M
Fluka, pract. dest./N2
Fluka, Standard Indikator
Fluka, puriss.Fluka, purumFluka puriss. p.a. dest. über CaH2/ArgonDr. Glaser, Basel, Isotopic purity >99.95% atom
%D
techn., dest. K2C03/N2für Chromatographie noch filtriert durch Alox B
(lOOg/1)Für Reaktionen: Fluka puriss. p.a., filtriert durch
Alox B
techn., dest. P4O10/N2, und filtriert durch Alox B
(100g/l)Für Reaktionen: Fluka puriss. p.a., filtriert durch
Alox B
Sigma, No L-8638
Fluka, purum
hergestellt nach [34]
Fluka, puriss.Fluka, puriss.Janssen, 97%techn. dest. NaH/N2Fluka, purum >97%
Fluka, purum >98%
Fluka, puriss. p.a., filtriert über Alox B (200 g/1)Fluka, purumFluka, puriss. p.a., dest. Molsieb 4Ä/N2Dr. Glaser, Basel, Isotopic purity >99.96% atom
%D
Siegfried
techn., dest. über Sikkon/N2
Fluka, puriss. p.a.
Fluka, puriss. p.a., dest. CaH2/N2Merck, pro analysisFluka, puriss. p.a.Fluka, purumtechn., dest. K2CO3/N2Fluka, puriss. p.a. >36.5%
Merck, Titrisol (0.01 M HCl aus 0.1 M
durch Verdünnung erhalten)
-168- experimenteller Teil
H20
HOAc
h
K2C03KCl
KH2PO4
K2HPO4
Kieselgel
MB-3 - Ionentauscher
MgCl2, HexahydratMgS04MetachlorperbenzoesäureMethanol
2-Methoxy-propenMolekularsieb
Natrium
NaCl
NaHC03NaI
NaOH
Na2S04
NH3aq.NH4CI
4-NitrophenolN,N'-Methylen-bis-acrylamidPd/Aktivkohle
Penta-O-acetyl-ß-D-allosePyridinPyridin-hydrochloridPyridin-(toluol-4-sulfonat)Raney - Nickel
SnCl4Stains all
TBAF.H2OTEMED
Tetrazol
THF
Thioharnstoff
TTPDSiCl2
Für HPLC, Gelelektrophorese und
Oligonucleotiduntersuchungen: ultrafiltriert
(Gerät, Sybron, Barnstead, Leitfähigkeit 186
Mu/cm) Für Extraktionen: deionisiertes Wasser
Fluka, puriss.p.a.Fluka, puriss. p.a., Kügelchentechn., wasserfrei
Merck, p.a.
Fluka, puriss. p.a.Merck, pro analysiMerck, Kieselgel 60, Korngrösse 0.040-0.063 mm,
230-400 Mesh ASTM für SäulenchromatographieFluka, Chemika, 20-50 mesh
Fluka, purum, p.a.techn. wasserfrei
Fluka, purum 90%
Fluka, puriss. p.a.
Fluka, pract. - 98%
Fluka, Union Carbide, Typ 4 A, aktiviert für 8
Std. am HV
Fluka, pract. in grossen Stücken
Fluka, puriss.Merck, p.a.
Fluka, puriss. p.a.
Siegfried, PhHVItechn., wasserfrei
Fluka, puriss. p.a. « 25%
Merck, puriss. p.a.Fluka, puriss. p.a.
Fluka, puriss.Fluka, puriss. 10%
Hergestellt im Kilolabor nach [97]
Fluka, puriss. p.a., dest. CaH2/ArgonFluka, purum >98%
Fluka, puriss. >99%
Fluka, (Nickel - Aluminium Legierung), purum50% Ni + 50%A1 aktiviert nach einer Vorschrift
aus dem Organikum [98]
Fluka, purumFluka, BioChemika >95%
Fluka, purum
Fluka, purumFluka, purum, sublimiert 110°C/0.05 Torr
Fluka, puriss. p.a., dest. Natrium/N2Fluka, puriss. p.a.
Fluka, purum >98%
-169- experimenteller Teil
Toluol
4-Toluolsulfonsäure
Monohydrat
Fluka, puriss. p.a.
Fluka, puriss.
Trifluormethansulfonsäure- Fluka, purum >98%
trimethylsilylesterTriethylamin
TrimethylsilylchloridTriphenylphosphinTris
Tris-(dibenzylidenaceton)-dipalladium(O)
Tris-(dimethylamino)-phos-phinUracil
Zitronensäure Monohydrat Fluka, puriss. p.a.
Fluka, puriss. p.a.für HPLC: ohne weiter Behandlung verwendet
für Reaktionen: dest. CaH2/ArgonFluka, puriss.Fluka, puriss.Fluka, BioChemika
Aldrich
Fluka prakt. >97%
Fluka, puriss.
-170- experimenteller Teil
D.4 ß-Homo-deoxyuridin
D.4.1 l-(4',6,-Di-0-acetyl-2',3,-dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)uracil
AcO i ACO ^^ß\,K + IT WYJ«
AcO^C^-^OCH3 kN^O AcO^^^ YH
°
3 6 7 oc/ß
Eine Suspension von 2 83 g (9 75 mmol) 3 und 1 33 g (10 88 mmol) Uracil in 120
ml abs CH3CN wurde unter Ar bei RT mit 2 45 ml (12 2 mmol) HMDS und 1 64
ml (12 9 mmol) TMSC1 versetzt Nach 30 min Ruhren wurden 1 60 ml (13 61
mmol) SnCU zugegeben und die nun homogene, farblose Reaktionslosung
wahrend 16 Std auf 44°C erwärmt Anschliessend wurde auf RT abgekühlt, am
RV bis auf 30 ml eingeengt, mit 200 ml EtOAc versetzt und zwei Mal mit je 100
ml H2O und einmal mit 100 ml ges NaHC03 gewaschen Die wassrigen Phasen
wurden zweimal mit je 150 ml EtOAc ruckextrahiert Die vereinigten org Phasen
wurden mit 250 ml ges NaCl gewaschen, über Na2S04 getrocknet und am RV
eingeengt Das so erhaltene Rohgemisch wurde mit Hexan EtOAc = 3 1 an 450 g
Kieselgel Chromatographien Die reinen, produkthaltigen Fraktionen der
einzelnen Komponenten wurden vereinigt und am RV vom Losungsmittel
befreit Auf diese Weise erhielt man nach Trocknen am HV bei RT für 16 Std
2 24 g (60%) Homo-deoxy-ß-undm (apolareres Nucleosid) 7 und 0 69 g (18%)
Homo-deoxy-cc-undin 7a je in Form eines farblosen Schaumes
Analytische Daten (ß-Anomer)
DC Rf = 0 53, (Kieselgel/EtOAc)
[ojcr^0 =-121(c = 187,CHCl3)
UV (EtOH) 206 (6610), 258 (9284)
IR (KBr) 3420w br, 3200w br, 3100w, 2980w, 2890w, 1745vs br, 1690vs br,
1630m, 1455m, 1380m, 1320w, 1280s, 1250s, 1195w, 1150w, 1130w,
1120w, 1090m, 1070m, 1045m, lOOOw, 930w, 820w
-171- experimenteller Teil
'H-NMR (300 MHz, CDCI3): 1.70-1.80 (m, 2H, H-C(3')), 2.00-2.14 (m, 7H, H-C(2'),
darunter auch 2.07,2.08 (2s, je 3H, CH3CO)), 2.33-2.38 (m, 1H, H-C(2')),
3.83 (ddd, J=2.2 5.4 10.0,1H, H-C(5')), 4.15 (dd, J=2.2 12.2 1H, H-C(6')),
4.24 (dd, J=5.412.2,1H, H-C(6')), 4.73 (ddd, J=4.8 10.2 10.2,1H, H-C(4')),
5.73 (dd, J=2.4 7.7,1H, H-C(l')), 5.79 (d, J=8.2,1H, H-C(5)), 7.39 (d, J=8.2,
1H, H-C(6)), 8.71 (s br., 1H, NH)
Abb. D4.1: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 7.
Differenz-NOE: 3.83 (H-C(5')) «" 4.15 (H-C(6')), 4.24 (H-C(6')), 4.73 (H-C(4')), 5.73
(H-C(D)
(75 MHz, CDCb): 21.7, 22.2 (2q, CH3CO), 23.9,24.5 (2t, C(2'/3')), 62.1 (t,
C(6')), 66.1 (d, C(4')), 75.9 (d, C(175')), 77.5 (d, CU75')), 102.7 (d, C(5)),
139.7 (d, C(6)), 150.2 (s, C(4)), 163.6 (s, C(2)), 170.2,170.5 (2s, C=0)
(EI): 327 «M + H)+, 1.5), 216 (20.9), 215 (98.3), 155 (76.6), 138 (13.0), 113
(100.0), 112 (11.0), 96 (16.2), 95 (100.0), 94 (23.0), 83 (13.0), 81 (24.0), 71
(15.4), 70 (15.5), 69 (29.7), 68 (12.3), 67 (64.0), 55 (15.7), 44 (12.9), 43 (98.0),
42 (10.7), 41 (24.6), 28 (10.0)
13C-NMR
MS
-172- experimenteller Teil
Analytische Daten (g-Anomer):
DC Rf = 0.42, (Kieselgel/EtOAc)
MrjZS0 = +10.1 (c = 1.49, CHCI3)
UV (EtOH): 207 (7183), 259 (10109)
IR (KBr): 3390w, 3020m, 2980w, 1740s br., 1715s, 1690s br., 1630m, 1455m,
1370m br., 1325w, 1265m, 1220s br., 1140m, 1080m, 1040m, 1020m,
970m, 935w, 810m
tl, \. jI.
..
,^M
L<LLjl^_
—1—-i 1 1 1 1 1 1 1 r 1 1 1 1 1—
90 80 70 60 SO 40 30 20
l l I
10 0 0 ppm
Abb. D4.2: ^-NMR (400 MHz, CDCI3) von 7a (verunreinigt mit ca. 20% 7ß).
JH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.63-1.73, 1.86-1.95, 2.08 (3m, 4H, H-C(2',3'), 2.10,
2.14 (2s, 6H, CH3CO), 4.22-4.30 (m, 2H, H-C(6')), 4.41 (m, IH, H-C(5)),
4.87 (ddd, J=1.6 3.0 3.0, IH, H-C(4')), 5.77 (d, J=8.2, IH, H-C(5')), 5.94
(dd, J=4.1 9.4, H-CÜ')), 7.47 (d, J=8.2, IH, H-C(6)), 8.68 (s br., IH, NH)
«C-NMR (100 MHz, CDCI3): 21.1 (q, CH3CO), 23.9 (t, C(3')), 25.0 (t, C(2')), 61.6 (t,
C(6')), 65.7 (d, C(5')), 75.7 (d, C(4')), 77.5 (d, C(l')), 102.7 (d, C(5)), 139 7
(d, C(6)), 150.2 (s, C(4)), 163.5 (s, C(2)), 170.2,170.5 (2s, C=0)
MS (EI): 327((M + H)+, 0.5), 215 (73.9), 155 (29.1), 113 (33.6), 95 (37.8), 94
(13.1), 81 (24.8), 69 (14.0), 67 (19.0), 43 (100.0), 41 (10.5).
-173- experimenteller Teil
D.4.2 l-UVS'-Dideoxy-ß-D-glucopyranosyDuracil
ACQ ^P HO ^yßA^^NH *- X^X^H^<'m
AcO-V^^ Y HO''X>^ YO 0
7 8
Eine Lsg. von 2.24 g (6.85 mmol) 7 in 20 ml mit NH3 gesättigtem Methanol
wurde bei RT 12 Std. gerührt. Nach Einengen und Trocknen am HV wurde der
feste Rückstand in siedendem Aceton gelöst und mittels isothermer Destillation
[99], [100] gegen Pentan kristallisiert. Nach 5 Tagen wurde die Mutterlauge
dekantiert, die Kristalle mit 2 x 10 ml eisgekühltem Aceton gewaschen und am
HV bei RT für 16 Std. getrocknet. Die Mutterlauge wurde in Aceton gelöst, über
Kieselgel filtriert, eingeengt und der Rückstand noch einmal in analoger Weise
zur Kristallisation gebracht. Insgesamt wurden aus beiden Kristallisationen 1.46 g
(88%) l-(2',3'-Dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)-uracil 8 in Form farbloser Nadeln
isoliert.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.30, (Kieselgel/EtOAc: EtOH = 5:1)
[alr^S" = +11.6 (c = 0.97/H2O)
UV (H20): 205 (11360), 260(10263)
IR (KBr): 3520m ,3380s
,3220m
,3100m
,3070m
,2960m
, 2870m, 1680vs
br., 1620m ,1470m
,1440m
,1415m
,1385s
,1350m
,1335m
,1320m
,
1300m,1275s
,1265s
,1240s
,1220m
,1190m
,1125m
, 1095s, 1060s,
1040m,1010m
,990m
,955m
,925m
,880m
,835m
,825m
,775m
,
730m
iH-NMR (300 MHz, DMSO-d<>): 1.46-1.60 (m, IH, H-C(3')), 1.71-1.79 (m, 2H, H-
C(2')), 1.97-2.09 (m, IH, H-C(3')), 3.16-3.38 (m, 2H, H-C(6')), 3.48 (m,
IH, H-C(4')), 3.67 (ddd, J=1.7 5.2 11.8, IH, H-C(5')), 4.48 (t, J=5.7, IH,
HO-C(6')), 4.85 (d, J=5.2, IH, HO-C(4')), 5.51 (dd, J=5.2 7.9, IH, H-C(l')),
5.61 (d, J=8.1, IH, H-C(5)), 7.69 (d, J=8.1, IH, H-C(6)), 11.32 (s, IH, NH)
-174- experimenteller Teil
"C-NMR (75 MHz, DMSO-d6): 28.7, 31.2 (2t, C(273')), 61.0 (t, C(6')), 63.9 (d,
C(4')), 80.8 (d, C(175')), 83.3 (d, C(175')), 101.5 (d, C(5)), 140.8 (d, C(6)),
149.7 (s,C(4)), 162.8 (s,C(2))
MS (EI): 243 (M+H+, 1), 131 (36), 113 (18), 69 (19), 58 (11), 57(10), 43 (100), 42
(12), 41 (11), 32 (22), 31 (26)
Abb. D43: 'H-NMR (400 MHz, DMSCM') von 8.
CioH14N205: ber.: C 49.58, H 5.83, N 11.56, gef.: C 49.70, H 5.93, N 11.49
Schmelzpunkt: 191°C.
D.4.3 l-{2',3,-Dideoxy-6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)methyl]-ß-D-glucopyranosyl}uracil
HO
HO'
O
DMTO f^N^C
rx>Vo
8 9
-175- experimenteller Teil
In 25 ml Pyridin wurden 2.824 g (11.1 mmol) 8 und 101 mg (0.80 mmol) DMAP
unter Argon gelöst. Man gab 2.50 ml (1.82 g, 17.9 mmol) Triethylamin und 4.50 g
(13.2 mmol, 1.1 Eq.) 4,4'-Dimethoxy-triphenylchlormethan zu. Die sich schwarz
verfärbende Lösung wurde für 4 Std. unter Ar bei RT gerührt. Man gab 100 ml
H2O zu und extrahierte zwei Mal mit je 500 ml CH2CI2. Man trocknete die org.
Phasen über Na2S04, engte am RV ein und koevaporierte zwei Mal mit je 30 ml
Toluol. Chromatographie an 150 g Kieselgel mit 2 1 EtOAc und anschliessende
Umkristallisation aus CH2C12 lieferte 7.10 g (93%) 9.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.71, (Kieselgel/EtOAc)
[alrj25" =+46.2 (c = 1.43, CHCI3)
UV (EtOH): 234 (24072), 257 (12430)
IR (CHCI3): 3500w br., 3390w, 3010m, 2800w br., 1695s br., 1635w, 1610m,
1585w, 1510m, 1455m, 1390m br., 1330m, 1300m, 1250m, 1180m,
1095m br., 1035m, 830m
uu :LV_
0x^rT
1 1 1 1 1 1—
10.0 9.0 8.0
1 1 i~
6.0
—1 1 1 1 1 1 1 1 1 r
4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm5.0
Abb. D4.4: 'H-NMR (300 MHz, DMSO-d«) von 9.
-176- experimenteller Teil
iH-NMR (300 MHz, DMSO-d*): 1.52-1.60 (m, 1H, H-C(2',3')),1.75-1.88 (m, 2H, H-
C(273')), 1.99-2.08 (m, IH, H-C(273')) 3.08 (dd, J=6.3 10.1, IH, H-C(6')),
3.22-3.25 (m, 2H, H-C(476')), 3.57 (m, IH, H-C(5')), 3.72 (s, 6H, H3C-O),
4.81 (d, J=5.7, IH, HO-C(4')), 5.62 (dd, J=2.2 4.3, IH, H-C(l')), 5.71 (d,
J=8.1, IH, H-C(5)), 6.82 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.16-7.27 (m, 7H, H-
C(arom.)), 7.40 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.68 (d, J=8.1, IH, H-C(6)), 11.30 (s
br.,lH,NH)
«C-NMR (75 MHz, DMSO-d*): 28.6, 31.4 (2t, C(273')), 54.9 (q, CH3-O), 63.9 (t,
C(6')), 64.2 (d, C(4')), 80.8, 81.6 (2d, C(175')), 85.0 (s, O-C(DMT), 101.6
(d, C(5)), 112.9,126.4,127.5,127.8,129.7, (5d, C(arom.)), 135.7,135.8 (2s,
C(arom.)), 140.5 (d, C(6)), 145.0 (s, C(4)), 150.0 (s, C(2)), 157.9,162.9 (2s,
C(arom.))
MS (EI): 544 (M+, 0.9), 304 (42), 303 (100), 215 (10), 213 (10), 195 (10), 165
(15), 154 (28), 152 (15), 137 (15), 136 (32), 135 (40), 113 (30), 107 (13), 105
(25), 89 (19), 77 (33).
D.4.4 l-{4'-0-[(2-Cyanoethoxy)(N,N-diisopropylamino)phosphino]-2',3'-dideoxy-6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)methyl]-ß-D-
glucopyranosyljuradl
DMTO
^Y° JX^±J*DMTO
,N^,NHO
NH
H0 ^ T X-u'^o'^'0"Y
V^CN
A13
Unter Ar wurden bei RT 3.50 g (6.46 mmol) 9 in 30 ml abs. CH2CI2 gelöst und
mit 4.42 ml (25.8 mmol) N-Ethyldiisopropylamin und 2.34 g (9.75 mmol) ß-
Cyanoethoxy-(N,N-diisopropylamino)-chlorophosphin versetzt. Nach 1 Std.
wurde die nunmehr weisse Suspension in 400 ml EtOAc aufgenommen, zwei
Mal mit je 300 ml ges. Na2C03 und einmal mit 300 ml ges. NaCl gewaschen. Die
wassrigen Phasen wurden noch zwei Mal mit 200 ml EtOAc rückextrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden am RV vom Lösungsmittel befreit. Es
-177- experimenteller Teil
verblieben 5.76 g eines farblosen Schaums, welcher nun an 350 g Kieselgel mit
EtOAc : Hexan = 2:1 chromatographiert wurde. Die Fraktionen, welche die
beiden diastereomeren Phosphoramidite enthielten, wurden vereinigt, eingeengtund am HV bei RT (üi 18 Std. getrocknet. Man erhielt 4.36 g (91%) 13 (1 : 1
Diastereomerengemisch am Phosphor) als weissen Schaum.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.71, 0.66, (Kieselgel/EtOAc: Hexan = 2:1)
UV (EtOH): 234(17521), 259 (9321)
IR (KBr): 3420m br., 3200m br., 3060m, 2960m, 2940m, 2880m, 2840w,
2240w, 1700vs, 1630m, 1610m, 1580w, 1510s, 1455m, 1395w, 1380m,
1365w, 1330w, 1300m, 1270m, 1250s, 1220m, 1200m, 1180s, 1150m,
1130m, 1080m, 1040s, 1000m, 980s, 900w, 880w, 780m
X-
4TO t^tOX^"rm
t tXk I 1 J M J—I—
SO90 70 50 40 30—I—
20 1.0 0 0 ppm
Abb. D45: JH-NMR (400 MHz, CDCI3) von 13.
iH-NMR (400 MHz, CDCI3): 0.88 (m (dublettoid), 3H, H3C-(i-Pr)), 1.07,1.09,1.13
(3d, J=6.7, 9H, H3C-(i-Pr)), 1.62-1.80 (m, 2H, H-C(273')), 2.04-2.09 (m,
IH, H-C(273')), 2.30 (dd, J=6.2 11.5 IH, H2C-CN), 2.33-2.39 (m, IH, H-
C(273')), 2.58 (t, J=4.5, IH, H2C-CN), 3 27-3.58 (m, 2H, HC(CH3)2-(i-Pr),
-178- experimenteller Teil
3.43-3.49 (m, 3H, H-C(576')), 3.58-3.71 (m, IH, H2C-OP), 3.72-3.75 (m,
IH, H-C(4')), 3.76, 3.77, 3.78, 3.79 (4s, 6H, H3C-O), 3.91-3.93 (m, IH,
H2C-OP), 5.72-5.75 (m, IH, H-C(l')), 5.79, 5.81 (2d, J=4.1, IH, H-C(5)),
6.59-6.81 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.12-7.29, 7.32-7.34, 7.44-7.47, 7.51-7.57
(4m, 9H, H-C(arom.))
Abb. D45:3,P-NMR (1215 MHz, CDCI3) von 13.
"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 20.2, 20.5 (2dt, JCp=7.3, CH2CN)), 22.7 (t, C(273')),
24.27,24.35,24.45,24.53,24.57,24.62,24.7 (7q, CH3(i-Pr)), 30.2,30.7,32.0
(3t, C(273')), 43.07 (dt, Jcp=8.4, CH-(i-Pr)), 43.20 (dt, JCp=8.3, CH-i-(Pr)),
57.5 (dt, JCp=21.0, CH2-OP), 58.2 (dt, JCp=19.2, CH2-OP), 63.1, 63.3 (2t,
C(6')), 67.0 (dd, JCp=16.7, C(4')), 67.5 (dd, Jcp=12.1, C(4')), 81.4, 81.5 (2d,
C(5')), 81.6, 81.8 (2d, C(l')), 85.8 (s, O-C(DMD), 102.4,102.5 (2d, C(5)),
112.97, 112.99 (2d, C(arom.)), 117.6, 117.7 (2s, CN), 126.7, 126.8, 127.7,
128.4, 128.5, 130.25, 130.27, 130.33, 130.35, 136.07, 136.14, 136.18 (12d,
C(arom.)), 139.7,139.9 (2d, C(6)), 144.8,145.0 (2s, C(4)), 149.9 (s, C(2)),
158.45,158.51,163.1 (3s, C(arom.))
3'P-NMR (162 MHz, CDCI3): 148.3,149.1
-179- experimenteller Teil
MS (FAB+, 3-NOBA): 877 ((M + 131Xe)+, 0.3), 767 ((M + Na)+, 0.3), 305
(10.7), 304 (48.2), 303 (100.0), 223 (34.0), 201 (22.7).
D.4.5 l-{2,,3'-Dideoxy-6'-[(4,4l-dimethoxytriphenyl)methyl]-4l-0-[3-(4-nitro-phenoxycarbonyl)-propionyl]-ß-D-glucopyranosyl}-uracil (Aktivester von ddU)
DMTO
mX^N NH
Y0
DMTO
NH
10
DMTO
NH
0,NA^ °
11
Eine Lösung von 0.530 g (0.973 mmol) 9, 120 mg (0.97 mmol) DMAP und 89 mg
(0.868 mmol, 0.9 Eq.) Bernsteinsäureanhydrid in 2.0 ml Pyridin wurde bei RT
unter Ar für 18 Std. gerührt. Man engte am RV ein und koevaporierte den
Rückstand noch zwei Mal mit je 1 ml Toluol. Der Rückstand wurde in 12 ml
Methylenchlorid gelöst und bei 0°C einmal mit 10%-iger Zitronensäure und zwei
Mal mit je 6 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über NaSÜ4
getrocknet, auf 2 ml eingeengt und aus 200 ml einer auf 0°C gekühlten Hexan :
Ether = 1:1 Lösung gefällt. Das Präzipitat wurde abfiltriert und am HV bei RT für
2 Std. getrocknet, was 350 mg (0.54 mmol) Rohprodukt 10 ergab, das ohne weitere
Reinigung zusammen mit 75 mg (0.54 mmol) 4-Nitrophenol und 200 ul Pyridin
in 3 ml frisch über basisch Alox filtriertem Dioxan gelöst wurde. Zu dieser
Lösung gab man 278 mg (1.35 mmol) DCC. Nach 3.5 Std. wurde vom
-180- experimenteller Teil
ausgefallenen Harnstoff abfiltriert, eingeengt und einmal mit 5 ml Toluol
koevaporiert. Chromatographie an 40 g Kieselgel mit EtOAc : Hexan = 7:3
lieferte nach Trocknen am HV für 30 min. bei 45°C 295 mg (40% über beide
Stufen) 11 als leicht gelblichen, festen Schaum, der allerdings aus einem Gemisch
von 11 und einem als Bernsteinsäurediester verbrückten Dinucleosid im
Verhältnis von etwa 6 : 1 besteht. Dieses Dinucleosid ist besonders leicht am
Signal bei 8.20 und am aufgespaltenen OCH3-Signal bei 3.72 ppm zu erkennen.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.70,(Kiesegel/EtOAc:Hexan = 7:3)
JH-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 0.98-2.32 (m, 4H, H-C(273')), 2.35-2.66 (m, 3H,
H2C-C(Bernsteinsäure, 2M/3")), 2.74-2.78 (m, IH, H2C-
C(Bernsteinsäure, 2"/3")), 2.95 (dd, J=4.1 10.4, IH, H-C(6')), 3.05-3.17
(m, IH, H-C(6')), 3.72 (s, 6H, OCH3), 3.84-3.88 (m, IH, H-C(5')), 4.87-
4.94 (m, IH, H-C(4')), 5.71-5.75 (m, 2H, H-CU75)), 6.81-6.85, 7.16-7.32,
7.32-7.41 (3m, 15H, H-C(arom.)), 7.79 (d, J=8.1, IH, H-C(6)), 8.27 (d,
J=9.1,2H, H-C(arom.)), 11.4 (s br., IH, H-N(3)).
Jb—1—1—1—r-
120 110
jCforA0aX^n*
Y
Ja ..^LAAOvaAnv^A^
"1 1 1 1 1 1 1 1 I 1 T
10 0 90 80 70 60 50 40 30 20 10 00 ppm
Abb. D4.6: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 11 (verunreinigt mit -15% Dinudeosid).
-181- experimenteller Teil
"C-NMR (75 MHz, DMSO-d6): 24.2,24.9, 25.3,27.2 (4t, C(2'^'), CH2-C(Bernstein-
säure, 2",3"), 54.8(q, CH3-O), 62.2 (t, C(6*)), 66.8 (d, C(5')), 77.5 (d,
C(4')), 80.3 (d, C(l')), 84.9 (s, O-C(DMT)), 101.7 (d, C(5)), 112.7, 122.7,
124.9, 126.5, 127.4, 129.3, 129.4 (7d, C(arom.)), 135.0, 135.3 (2s,
C(arom.)), 140.3 (d, C(6)), 144.4 (s, C(4)), 144.6 (s, C(arom.)), 149.7 (s,
C(2)), 152.9, 154.8, 157.6, 162.6 (4s, C(arom.)), 169.5, 170.4 (2s, C=0
(Bernsteinsäure)).
D.4.6 l-{2,,3'-Dideoxy-6,-[(4/4'-dimethoxytriphenyl)methyl]-4,-0-[3-(CPG-amido)-propionyl]-ß-D-glucopyranosyl}uracil
(ddU-CPG-Träger)
DMTO
0,N
In 8 ml DMF wurden 2.00 g CPG-NH2 suspendiert und 500 ul (380 mg,
3.77 mmol) Triethylamin und 50 ul (49 mg, 0.62 umol) Pyridin zugegeben. Zu
dieser Suspension spritzte man unter Ar eine Lösung von 480 mg (0.62 mmol) 11
in 4 ml THF. Man liess sie für 48 Std. bei RT unter Ar bei gelegentlichemSchwenken stehen. Es wurde abfiltriert und mit je etwa 20 ml DMF, MeOH und
Ether gewaschen. Erneut wurde in 10 ml Pyridin suspendiert, 40 mg (0.33 mmol)
DMAP und 500 ul (0.54 g, 5.29 mmol) Essigsaureanhydrid zugegeben und 1 Std.
stehen gelassen. Nach Waschen mit je 20 ml MeOH und Ether verblieben noch
1.83 g CPG 12 mit einer Beladungsdichte von 31.0 umol/g.
-182- experimenteller Teil
D.5 cc-Homo-deoxyadenosin
D.5.1 N6-Benzoyl-9-(2V3'-dideoxy-a-D-glucopyranosyl)adenin
HOBzO
BzO'\>—^-N'"1? »-
"
N^^N^
rVNHBz 4nV/^N HO
^.N
14
NHBz
15
Man löste 9.0 g (15.6 mmol) 14 mit einem Anomerenverhältnis et: ß = 5 :1 bei
0°C in 90 ml THF : MeOH : H20 = 5 : 4 : 1 und gab rasch 90 ml 2N NaOH (180
mmol, 11.5 Eq) zu. Nach 30 min. Rühren bei 0°C wurde die Reaktion durch
Zugabe von 11.6 g (0.22 mmol, 1.2 Eq bezogen auf NaOH) beendet. Nach
Erwärmen auf RT wurde die Reaktionslösung am RV zur Trockene eingeengt.
Der Festkörper wurde in 200 ml MeOH suspendiert und abfiltriert. Der
Filterrückstand wurde noch einmal mit 50 ml MeOH gewaschen. Die vereinigten
Filtrate wurden zur Trockene eingeengt und in 300 ml siedendem CH3CN
suspendiert, abfiltriert und über Nacht bei RT stehengelassen. Die Suspension
wurde abfiltriert, was 2.65 g weisse Kristalle mit einem a : ß Verhältnis von 7 : 1
ergab. Weitere Kristallisation der eingeengten Mutterlauge ergaben jeweils
ungünstigere a : ß Verhältnisse und wurden deshalb verworfen. Die Kristalle
wurden in heissem Methanol gelöst und CH3CN bis zur einsetzenden Trübung
zugegeben und über Nacht bei 0°C stehen gelassen. Die nach Filtration
zurückbleibenden Kristalle wiesen ein Anomerenverhältnis von a : ß = 11 :1
auf. Das Filtrat wurde wieder eingeengt und in gleicher Weise noch zwei Mal
kristallisiert. Die zwei daraus gewonnenen Kristallisate wiesen
Anomerenverhältnisse a : ß = 1 : 3.2 (0.17 g) und a : ß > 20 : 1 (0.46 g, 1.25 mmol,
9.6%) auf. Diese letzte Fraktion wurde zur Charakterisierung und zur
Weiterarbeit verwendet.
-183- experimenteller Teil
Analytische Daten:
DC
[ab20
UV
IR(KBr):
'H-NMR
Rf = 0.41, (Kieselgel/CHC13 : CH3OH = 9:1)
=+38.1 (c = 0.94, DMSO)
(CH3OH): 280 (12200)
3410s br., 3130m sh, 3060 m sh, 2955m, 2910m, 2880m, 1709s, 1616s,
1575s, 1524m, 1481m, 1458s, 1398m, 1355m, 1320m, 1304m, 1252s,
1210m, 1190m, 1160m, 1121m, 1075m, 1052m, 1028m, 1009m, 988w,
973w, 921m, 887w, 867w, 799m, 765m, 706s, 670m, 642m, 605m, 553m
(400 MHz, DMSO-d6): 1.67-1.78 (m, IH, H-C(273')), 1.99-2.15 (m, 2H,
H-C(273')), 2.85-2.94 (m, IH, H-C(273')), 3.32-3.43 (m, IH, H-C(5')),
3.52-3.62 (m, 2H, H-C(6')), 3.65-3.72 (m, IH, H-C(4')), 4.66* (t, J=5.3, IH,
HO-C(6')), 4.90* (d, J=5.7, IH, HO-C(4')), 6.16 (dd (tripletoid), J=4.6 Hz,
IH, H-C(l')), 7.52-7.58 (m, 3H, H-C(arom.)), 7.62-7.64 (m, IH, H-
C(arom.)), 8.04-8.07 (m, 2H, Bz), 8.64 (s, IH, H-C(2)), 8.76 (s, IH, H-
C(8)), 11.2* (s br., IH, NH)
*: Signal tauscht mit D2O aus.
J
0X^<v
^jlJLAa.1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1
9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm
Abbildung D5.1: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«) von IS
-184- experimenteller Teil
"C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 25.1, 27.5 (2t, C(273')), 60.6 (t, C(6')), 63.5 (d,
C(4')), 78.2, 78.9 (2d, C(175')), 125.6 (s, C(5)), 128.3, 128.4, 132.3 (3d,
C(arom.)), 133.3 (s, C(arom.), 143.2 (d, C(8)), 150.2 (s, C(4)), 151.4 (d,
C(2)), 152.0 (s, C(6)), 165.6 (s, C=0)
MS (FAB+, 3-NOBA)): 371.1 ((M + 2H)+, 18.2), 370.1 ((M + H)+, 66.6), 307.1
(16.5), 241.1 (20.5), 240.1 (100.0), 154.1 (60.4), 138.1 (22.0), 137.0 (40.4),
136.0 (49.9), 105.0 (35.3)
C18H19N504: ber.: C, 58.53, H, 5.18, N: 18.96, gef.: C: 58.24, H: 5.21, N: 18.87
Schmelzpunkt 145-147°C
D.5.2 N«-Benzoyl-9-{2,/3'-dideoxy-6'-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)-
methyl]-a-D-glucopyranosyl}adenin
HO DMTO
HO
NHBz NHBz
15 16
Man löste 100 mg (0.33 mmol) 15, 130 mg (0.39 mmol, 1.2 Eq) 4,4'-Dimethoxy-
triphenylchlormethan und 4.0 mg (33 nmol, 0.1 Eq) DMAP, das alles zuvor für 4
Std. am HV bei RT getrocknet wurde, in 1.0 ml Pyridin und 170 ul (0.98 umol, 3
Eq) Ethyl-diisopropylamin. Nach 4 Std. Rühren bei RT unter Argon wurde die
Reaktion durch Zugabe von 0.2 ml MeOH gestoppt. Die Reaktionslösung wurde
am RV eingeengt und an 50 g Kieselgel mit 100 ml ETOAc und dann 200 ml
EtOAc : Aceton = 4:1 flash - chromatographiert. Nach Einengen der
produkthaltigen Fraktionen erhielt man 153 mg (70 %) 16.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.34, (Kieselgel/EtOAc: Aceton = 4:1)
-185- experimenteller Teil
IR (KBr): 3420m (br), 3260w (sh), 3059w, 2950m, 2938m, 2837w, 1702m,
1610s, 1582s, 1510s, 1487m, 1455s, 1402w, 1320m, 1298m, 1250s, 1220m,
1178s, 1158m, 1119m, 1033s, 987w, 912w, 903w, 830m, 795m, 753m,
707s, 669m, 644m, 585m
IH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.68-1.80 (m, IH, H-C(273')), 1.93-2.05 (m, IH,
H-C(273')), 2.11-2.24 (m, IH, H-C(273')), 2.84-2.95 (m, IH, H-C(273')),
3.10 (dd, J=7.3 9.7, IH, H-C(6')), 3.24 (dd, J=2.0 9.7, IH, H-C(6')), 3.52-
3.56 (m, 2H, H-C(475')), 3.72, 3.73 (2s, 6H, OCH3), 4.85* (d, J=6.1, IH,
HO-C(4')), 6.26 (dd (tripletoid), J=4.7, IH, H-C(l')), 7.81-7.89 (m, 4H, H-
C(arom.)), 7.14-7.22 (m, 5H, H-C(arom.)), 7.22-7.33 (m, 4H, H-
C(arom.)), 7.53-7.59 (m, 2H, H-C(arom.)),7.62-7.67 (m, IH, H-
C(arom.)), 8.05-8.09 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.69 (s, IH, H-C(2)), 8.77 (s,
IH, H-C(8)), 11.25* (s br., IH, NH)
*: Signal tauscht mit D2O aus.
Abbildung D5.2: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) von 16
«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 24.7, 28.2 (2t, C(273')), 54.9 (q, OCH3), 63.0 (t,
C(6')), 64.2 (d, C(4')), 76.0, 79.0, (2d, C(175')), 85.0 (s, O-C(DMT)), 113.0
(d, C(arom.)), 125.7 (s, C(5)), 126.4,127.59,127.63,128.36,128.37,129.5,
-186- experimenteller Teil
MS
129.6,132.3 (8d, C(arom.)), 133.4,135.5,135.7 (3s, C(arom.)), 143.0 (d,
C(8)), 144.9 (s, C(arom.)), 150.3 (s, C(4)), 151.5 (d, C(2)), 152.3 (s, C(6)),
157.8 (s, C(arom.)), 165.6 (s, C=0)
(FAB+, 3-NOBA)): 694.2 ((M + Na)+, 4.6), 672.2 ((M + H)+, 7.8), 594.2
(1.6), 564.1 (1.6), 319.1 (4.2), 304.1 (37.3), 303.1 (100.0), 241.1 (15.2), 240.1
(64.9), 154.1 (17.1), 136.0 (18.4), 105.0 (37.9)
D.5.3 N6-Benzoyl-9-{4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopropyl-amino)phosphino]-6,-0-[(4/4'-dimethoxytriphenyl)methyl]-2',3,-dideoxy-a-D-glucopyranosyl}adenin
DMTO
HO-^V^IN-r-N*,
NHBz
16
DMTO
JLIM"
Aa<vÖ-CN T
NHBz
17
Man trocknete 200 mg (0.30 mmol) 16 für 16 Std. bei RT am HV, gab 25.0 mg
(0.15 mmol, 0.5 Eq) Diisopropylammoniumtetrazolid zu, löste in 1.5 ml CH2CI2
und gab dann 130 ul (0.45 mmol, 1.5 Eq) Bis-(diisopropylamino)-2-cyano-
ethoxyphosphin2 unter Argon zu. Nach 4 Std. wurde die Reaktionlösung in 10
ml CH2CI2 aufgenommen, zwei Mal mit je 10 ml ges. NaHC03 und zwei Mal mit
10 ml ges. NaCl gewaschen. Die vereinigten wassrigen Phasen wurden mit 10 ml
CH2CI2 rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSÜ4
getrocknet, eingeengt und gelöst in 1 ml EtOAc aus 20 ml Hexan gefällt, was 190
mg (73%) 17 als weisses Pulver ergab. Diese Substanz enthält gemäss 'H-NMR
noch hydrolysiertes Phosphitylierungsreagens als Verunreinigung (Signale bei
1.27 und kleines Triplet bei 2.70 ppm).
Hergestellt nach einer Vorschrift in [34].
-187- experimenteller Teil
Analytische Daten:
DC Rf = 0.32, (Kieselgel/EtOAc)
IR (KBr): 3417m (br), 3058w, 3031w, 2964m, 2931m, 2875m, 2834w, 2251w,
1703m, 1608s, 1580m, 1508s, 1488m, 1453s, 1395m, 1381m, 1363m,
1324m, 1297m, 1250s, 1219m, 1201m, 1179s, 1156m, 1116m, 1100m,
1074m, 1058m, 1033s, 976s, 900w, 878m, 829m, 815m, 798m, 792m,
755m, 727m, 707s, 669w, 644m, 584m, 526w
!H-NMR (400 MHz, CDC13): 1.02 (d, J=6.8, 2.5H, H3C-(i-Pr)), 1.10-1.18 (m, 8H,
H3C-(i-Pr)), 1.34 (d, J=6.5, 1.5H, H3C-(i-Pr)), 1.77-1.93 (m, IH, H-
C(273')), 2.05-2.22 (m, 2H, H-C(273')), 2.42 (dt, JPH=3.7, Jhh=6.4, IH,
CH2CN), 2.59 (t, J=6.3, IH, CH2CN), 2.90-3.07 (m,lH, H-C(273')), 3.27-
3.61 (m, 5H, HC(i-Pr), H-C(5'), HrC(6')), 3.63-3.80 (m, IH, CH2OP), 3.78
(s, 3H, H3C-O), 3.79 (s, 3H, H3C-O, 3.83-4.09 (m, 2H, H-C(4'), CH2OP),
6.09-6.16 (m, IH, H-C(l')), 6.78-6.90 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.19-7.38 (m,
7H, H-C(arom.)), 7.41-7.47 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.50-7.56 (m, 2H, H-
C(arom.)), 7.59-7.61 (m, IH, H-C(arom.)), 8.01-8.07 (m, 2H, H-
C(arom.)), 8.42, 8.43 (s, IH, H-C(2)), 8.80 (s, IH, H-C(8)), 9.10 (s br., IH,
NH)
70
UMIU
oX^JL
i> . CG
A^JüIa^_JJ—1—1—1—
60 SO
-i 1 1 r
40 30 20
-| 1 1 1 1
10 00 ppm
Abbildung D53: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 17
-188- experimenteller Teil
^C-NMR (100 MHz, CDCI3): 19.4 (q, CHrö-Pr)), 20.3 (dt, JCp=7.1, C-CN), 20.4 (dt,
JCp=6.8, C-CN), 24.4, 24.5, 24.6, 24.7 (4q, CH3-(i-Pr)), 26.0, 26.1, 26.5 (3t,
C(273')), 43.18 (dt, JCp=3.1, CH-(i-Pr)), 43.30 (dt, Jcp=3.1, CH-(i-Pr)),
55.23,55.26 (2q, CH3-O), 57.9 (dt, Jrc = 19.2, CH2OP), 58.3 (dt, Jpc=18.6,
CH2OP), 62.9 (t, C(6')), 67.1 (dd, Jcp=16.9, C(4')), 67.8 (dd, Jcp=15.9,
C(4')), 76.8,77.0,80.0,80.2 (4d, C(175')), 86.4,86.5 (2s, O-C(DMD), 113.2
(d, C(arom.)), 117.5 (s, CN), 123.4 (s, C(5)), 126.9, 127.9, 128.2, 128.3,
128.9, 130.1, 130.2, 132.7 (8d, C(arom.)), 133.8, 135.88, 135.94 (3s,
C(arom.)), 141.9 (d, C(8)), 144.7 (s, C(arom.)), 149.5 (s, C(4)), 151.5 (s,
C(2)), 152.6 (d, C(6)), 158.6 (s, C(arom.)), 164.6 (s, C=0)
31P-NMR (162 MHz, CDCI3): 148.6,148.2
MS (FAB+, 3-NOBA)): 873.3 «M + 2H)+, 2.7), 872.3 «M + H)+, 5.0), 568.2
(3.1), 303.1 (100.0), 240.1 (25.3), 201.1 (19.7), 154.0 (13.5), 136.0 (11.1),
105.0 (12.0)
Abbildung D5.4:3,P-NMR (162 MHz, CDdj) von 17
-189- experimenteller Teil
D.5.4 N6-Benzoyl-9-{2',3*-dideoxy-6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)-methyl]-4'-0-[3-(4-nitro-phenoxycarbonyl)propionyl]-a-D-glucopyranosyl}adenin und N6-Benzoyl-9-{2,,3,-dideoxy-6'-
0-[(4,4*-dimethoxytriphenyl)methyl]-4'-0-[3-(CPG-amido)-propyl]-a-D-glucopyranosyl}adenin
DMTO
HO-^V^I
16
*N^yNHBz
DMTO
0,N
N-r-%
NHBz
DMTO
•Nr^° CO19
NHBz
Man rührte eine Lösung von 45 mg (67 nmol) 16, 7.4 mg (74 nmol, 1.1 Eq)
Bernsteinsäureanhydrid und 9.8 mg (81 nmol) DMAP in 0.6 ml Pyridin unter
Argon bei RT für 16 Std. Danach wurde die Reaktionslösung eingeengt, zwei Mal
in je 2 ml Toluol gelöst und wiederum eingeengt. Das zurückbleibende Oel
wurde in 5 ml CH2CI2 aufgenommen, je zwei Mal mit 5 ml 10 % Zitronensäure
und Wasser gewaschen. Nach Rückextraktion der vereinigten wassrigen Phasen
mit 5 ml CH2CI2 wurden die vereinigten org. Phasen über Na2S04 getrocknet und
eingeengt. Das Rohprodukt (60 mg) und 9.3 mg (67 mmol, 1.1 Eq) 4-Nitrophenol
wurden in 0.6 ml trockenem Dioxan gelöst und 60 ul Pyridin und 36 mg (0.17
mmol) DCC zugegeben. Nach 4 Std. filtrierte man den entstandenen
Dicyclohexylharnstoff ab und engte zur Trockene ein. Chromatographie an 20 g
Kieselgel mit 100 ml EtOAc : Hexan = 3:1 und 100 ml EtOAc : Hexan = 9:1
lieferte 25 mg (42 %) 18.
-190- experimenteller Teil
Analytische Daten:
DC Rf = 0.45, (Kieselgel/EtOAc)
!H-NMR (200 MHz, CDCI3): 1.88-2.03 (m, IH, H-C(273')), 2.08-2.25 (m, 2H, H-
C(273')), 2.57-2.94 (m, 5H, H-C(2737H2C-C(Bernsteinsäure), 3.40 (m
(dublettoid), J=5.1 Hz, 2H, H-C(6')), 3.78 (s, 6H, H3C-O), 4.01-4.08 (m,
IH, H-C(5')), 5.00-5.09 (m, IH, H-C(4')), 6.16 (dd, J=7.5 3.3, IH, H-C(l')),
6.79-6.89 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.20-7.65 (m, 14H, H-C(arom.)), 8.02-
8.08 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.20-8.26 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.28 (s, IH, H-
C(8)), 8.79 (s, IH, H-C(2)), 9.03 (s br., IH, NH)
Man suspendierte 200 mg CPG-NH2 in 0.4 ml DMF : Triethylamin = 10 : 1 und
gab 25 mg (28 nmol) 18 zu. Diese Suspension wurde über Nacht stehen gelassen.
Darauf wurde die Festphase drei Mal mit je 3 ml DMF gewaschen. Man
suspendierte den Träger in 1 ml Essigsaureanhydrid : Pyridin = 1 : 10 und 4.5 mg
DMAP und liess die Suspension für 16 Std. stehen. Der Träger wurde mit DMF
und Ether gewaschen und am HV bei RT getrocknet. Man erhielt mit o-Homo-
Adenosin derivatisierten Träger 19 mit einer Beladungsdichte von 20.0 umol/g.
D.6 a-Homo-thymidin
D.6.1 l-(4,,6'-Di-0-acetyl-2,/3'-dideoxy-a-D-glucopyranosyl)-
thymin
ACO j/ MS
MX^-\^°—- pr-5-vO AcO cr^M^o
20 20aH
Die Verbindung 20a wurde als Nebenprodukt einer Synthese des ß-Anomeren
durch H.-J. Roth synthetisiert und vom ß-Anomeren durch Flash
Chromatograpie mit EtOAc : Hexan = 3:1, gefolgt von EtOAc, abgetrennt. Die
analytischen Daten sind bei Roth nachzulesen [21].
-191- experimenteller Teil
D.6.2 l-(2',3'-Dideoxy-a-D-glucopyranosyl)thymin
AcOv HO^
AcO
°7^n^y' *- p°7^N^v^>u^n HO nXuXrO^ N o
nuCT N ^o
20aH
21H
3.0 g (8.8 mmol) 20a wurde in 200 ml mit NH3 gesättigtem Methanol gelöst und
für 24 Std. bei RT stehen gelassen. Darauf wurde die Lösung am RV zu einem
farblosen Oel eingeengt. Zugabe von Aceton Hess 1.68 g (75%) 21 als weissen
Niederschlag ausfallen. Für analytische Zwecke wurde eine kleine Menge 21 aus
siedendem Ethanol umkristallisiert.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.15 (Kieselgel/CHC13: CH3OH = 9:1)
[a]D20 = +23.6° (c = 1.0, CH3OH).
UV (H20): 265 (9880)
IR (KBr): 3440s br., 3142m, 3029m, 2964m, 2940m, 2891m, 2819m, 1704s,
1675s, 1528w, 1473m, 1451m, 1420m, 1365m, 1283s, 1271s, 1218m,
1114m, 1103m, 1068m, 1058m, 1031m, 986m, 978m, 943m, 921m,
908w, 876w, 852m, 783w, 765m, 709m, 562m, 487m
*H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.51-1.55 (m, IH, H-C(273')), 1.70-1.74 (m, IH,
H-C(273')), 1.80 (d, J=l.l, 3H, H3C-C(5)), 1.90-2.06 (m, 2H, H-C(273')),
3.58-3.61 (m, 3H, H-C(6'), H-C(4')), 3.77-3.79 (m, IH, H-C(5')), 4.73* (br.,
IH, HO-C(6')), 4.90* (br., IH, HO-C(4')), 5.73 (dd, J=10.4 2.9, IH, H-
C(l')), 7.60 (d, J=l.l, IH, H-C(6)), 11.25* (s br., IH, NH)
*: Signal tauscht mit D2O aus.
"C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 12.0 (q, CH3-C(5)), 23.6,26.3 (2t, C(273')), 59.9 (t,
C(6')), 62.0 (d, C(4')), 76.8, 80.9 (2d, C(175')), 109.0 (s, C(5)), 136.3 (d,
C(6)), 150.1 (s, C(2)), 163.7 (s, C(4)).
MS (FAB+, 3-NOBA)): 514.2 ((M + 2H)+, 7.7), 513.2 ((M + H)+, 27.6), 257.1
(52.5), 155.1 (23.2), 154.1 (77.5), 138.1 (29.4), 137.1 (55.1), 136.0 (61.6),
131.1 (42.3), 127.1 (100.0), 107.0 (22.3), 89.0 (25.0), 77.0 (25.6)
-192- experimenteller Teil
C11H16N2O5 ber: C: 51.56, H: 6.29, N: 10.93, gef.: C: 51.36, H: 6.02, N: 10.71
Schmelzpunkt 178-179°C
x^< i-V^
1 1 1 1 r-
ML~1 1 1 1 1 1 1 1 1—1—1—1—1—1
9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm
Abbildung D6.1: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 21
D.6.3 l-{2,,3,-Dideoxy-6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)methyl]-a-D-glucopyranosyljthymin
HO,
HO
DMTO
°7^n-^nXKXn
21
0"^N O
H
3„XKIXr
22
O^ N O
H
Man trocknete 1.0 g (3.9 mmol) 21 und 2.0 g (5.9 mmol, 1.5 Eq) DMTC1 bei RT für
16 Std. am HV. Es wurden 5 ml Pyridin unter Argon zugegeben und für 30 min.
bei RT gerührt. Durch Zugabe von 5 ml MeOH wurde die Reaktion gestoppt. Die
Lösung wurde nach weiteren 30 min. am RV eingeengt, erneut in 5 ml Toluol
-193- experimenteller Teil
gelöst und erneut eingeengt. Das verbliebene Oel wurde in 50 ml EtOAc
aufgenommen, zwei Mal mit jeweils 20 ml NaHC03 und einmal mit NaCl
gewaschen. Die vereinigten wassrigen Phasen wurden mit 20 ml EtOAc
rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO,j
getrocknet und eingeengt. Anschliessende Chromatographie an 120 g Kieselgelmit 600 ml EtOAc : Hexan = 3 :1 und dann 300 ml EtOAc lieferte 1.11 g (51%) 22.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.14 (Kieselgel/EtOAc: Hexan = 4:1)
IR (KBr): 3417m br., 3194w br, 3055w, 2930m, 2834w, 1689vs, 1606m,
1582w, 1508s, 1464m, 1445m, 1413w, 1371w, 1322w, 1300m, 1251s,
1176s, 1154w, 1116m, 1034s, 984m, 903w, 876w, 829m, 791m, 755w,
727w, 703m, 583m
r
_zü .M i«
S7^n^*^H
l."I I I I 1 I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 190 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm
Abbildung D6.2: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 22
!H-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.72-1.77 (m, IH, H-C(273')), 1.81-1.87 (m, 2H, H-
C(273')), 1-92 (d, J=1.2, 3H, CH3-C(5)), 1.95-2.09 (m, IH, H-C(273')),
2.16* (br., IH, HO-C(4')), 3.32 (dd, J=7.0 9.8, IH, H-C(6')), 3.44 (dd, J=5.6
9.8, IH, H-C(6')), 3.79 (s, 6H, H3C-O, 3.88 (m (tripletoid), IH, H-C(4)),
-194- experimenteller Teil
4.07-4.12 (m, IH, H-C(5')), 5.77 (dd, J=3.2 10.3, IH, H-C(l')), 6.81-6.85
(m, 4H, H-C(arom.)), 7.18-7.23 (m, IH, H-C(arom.)), 7.27-7.33 (m, 6H,
H-C(arom.)), 7.36-7.41 (m, 3H, H-C(6)/H-C(arom.)), 7.42 (d, J=1.4, H-
C(6)),8.6»(sbr.,lH,NH)
*: Signal tauscht mit D2O aus.
«C-NMR (100 MHz, CDCI3): 12.5 (q, CH3-C(5)), 24.4, 26.1 (2t, C(273')), 55.3 (q,
OCH3), 62.4 (t, C(6')), 64.5 (d, C(4')), 78.3, 79.4 (2d, C(175')), 86.8 (s, O-
C(DMT)), 110.8 (d, C(5)), 113.3,127.0,128.0,128.1 (4d, C(arom.)), 135.5,
135.6 (2s, C(arom.)), 135.8 (d, C(arom.)), 144.5,149.9 (s, C(arom.), C(2)),
158.6 (s, C(arom.)), 163.6 (s, C(4))
MS (FAB+, 3-NOBA)): 558.0 ((M + H)+, 1.0), 304.0 (32.7), 303.0 (100.0)
D.6.4 l-{4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-düsopropylamino)phosphino]-6,-0-[(4,4'-dimethoxytriphenylmethyl]-2,,3,-dideoxy-a-D-glucopyranosyl}thymin
DMTO.DMTO.
HO Xx° X<° Xx°X±22
\23
CN
Man trocknete 200 mg (0.36 mmol) 22 für 16 Std. bei RT am HV, gab 31.0 mg
(0.18 mmol, 0.5 Eq) Diisopropylammoniumtetrazolid zu, löste in 1.5 ml CH2CI2
und gab dann 160 ul (0.54 mmol, 1.5 Eq) Bis-(diisopropylamino)-2-cyano-
ethoxyphosphin unter Argon zu. Nach 3 Std. wurde die Reaktionlösung in 10 ml
CH2CI2 aufgenommen, zwei Mal mit je 10 ml NaHC03 und zwei Mal mit 10 ml
NaCl gewaschen. Die vereinigten wassrigen Phasen wurden mit 10 ml CH2CI2
rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSÜ4
getrocknet und eingeengt. Das resultierende Oel wurde drei Mal als Lösung in 2
ml EtOAc aus 60 ml Hexan gefällt. Man erhielt 200 mg (74%) 23 als weisses,
-195- experimenteller Teil
flockiges Pulver, das noch mit H-Phosphonat (hydrolysiertes
Phosphitylierungsreagens) verunreinigt war.
Analytische Daten:
DC Rf= 0.40 (Kieselgel/EtOAc: Hexan = 4:1)
IR (KBr): 3429m br., 3191m br. sh, 3053m, 3035m, 2964s, 2931m, 2874m,
2835m, 2757w, 2752w, 2487w, 2428w, 1690vs, 1607m, 1583w, 1509s,
1464s, 1445m, 1396m, 1364m, 1325w, 1301m, 1252s, 1217m, 1179s,
1155m, 1130m, 1076m, 1053s, 1034s, 972s, 900m, 877m, 829m, 791m,
727m, 707m, 582m
IH-NMR (400 MHz, CDC13): 1.19-1.23 (m, 9H, H3C-(i-Pr)), 1.44 (d, J=6.5,3H, H3C-
(i-Pr)), 1.63-2.02 (m, 7H, H-C(273') darunter auch 1.91,1.92 (je d, J=l.l,
1.5H, CH3-C(5)), 2.58 (t, J=6.0, IH, CH2CN), 2.63 (t, J=6.3, IH, CH2CN),
Xr*-»
V
J
I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1—
9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0
—I 1 1 1 1 1 1 1
3.0 2.0 1.0 0.0 ppm
Abbildung D63: 'H-NMR (400 MHz, CDClj) von 23
3.26-3.35 (m, IH, H-C(6')), 3.37-3.44 (m, IH, H-C(6')), 3.62-3.71 (m, 2H,
CH(i-Pr)), 3.75-3.98 (m, 9H, CH2OP, H-C(5'), darunter auch 3.79 (s,
OCH3)) 4.24-4.29 (m, IH, H-C(4')), 5.74-5.80 (m, IH, H-C(l')), 6.80-6.86
-196- experimenteller Teil
(m, 4H, H-C(arom.)), 7.19-7.43 (m, 10H, H-C(arom.), H-C(6)), 7.9 - 8.8
(IH, H-N(3)).
13C-NMR (100 MHz, CDC13): 12.48,12.51 (q, CH3-C(5)), 19.4 (q, CH3(i-Pr)), 20.40,
20.47 (2dt, Jcp=17.7CH2CN), 24.6,24.7 (2q, CH3(i-Pr)), 24.8,25.0,25.3 (3t,
C(273')), 43.3 (dd, Jcp=12.3, CH(i-Pr)), 55.2 (q, OCH3), 58.2 (dt, Jo>=14.3,
CH2OP), 58.3 (dt, Jcp=14.4, CH2OP), 61.78, 61.83, (2t, C(6')), 66.1 (dd,
JCp=16.5, C(4')), 66.5 (dd, Jcp=17.6, C(4')), 77.8, 77.9, 78.9, 79.0 (4d,
C(175')), 86.7 (s, O-C(DMD), 110.8,110.9 (2s, C(5)), 113.25,113.28 (2d,
C(arom.)), 117.5 (s, CN), 126.92, 126.95, 127.9, 128.1, 130.0 (5d,
C(arom.)), 135.50,135.54,135.67,135.74 (2d, 2s, C(6), C(arom.)), 144.51,
144.54,149.8 (3s, C(arom.), C(2)), 158.6 (s, C(arom.)), 163.5 (s, C(4))
31P-NMR (162 MHz, CDCI3): -8.5,1.3,2.5,7.2,7.5,12.6,13.3,14.6,148.34,148.5
MS (FAB+, 3-NOBA)): 759.1 ((M + H)+, 0.7), 633.1 (0.5), 455.0 (3.4), 384.0
(1.3), 304.1 (30.5), 303.0 (100.0), 201.1 (18.7)
-197- experimenteller Teil
D.6.5 l-{2l/3l-Dideoxy-6,-0-[(4/4,-dimethoxytriphenyl)methyl]-4'-
0-[3-(4-nitro-phenoxycarbonyl)propionyl]-a-D-gluco-pyranosyl}thymin und l-{2,,3'-Dideoxy-6'-0-[(4,4,-dime-
thoxytriphenyl)methyl]-4'-0-[3-(CPG-amido)propyl]-a-D-glucopyranosyljthymin
DMTO
HO
£T"n^v'
DMTO
O J
22 Xj Ö 24
etO^NH^'O
02N
DMTO.
10
H P O^NH^ON^r^*k...L
|ö^j'Nr^°
25
Man rührte eine Lösung von 100 mg (179 nmol) 22, 20 mg (197 nmol, 1.1 Eq)
Bernsteinsäureanhydrid und 9.8 mg (81 nmol) DMAP in 1.0 ml Pyridin unter
Argon bei RT für 16 Std. Danach wurde die Reaktionslösung eingeengt und zwei
Mal in je 4 ml Toluol gelöst und wiederum eingeengt. Das zurückbleibende Oel
wurde in 10 ml CH2CI2 aufgenommen, je zwei Mal mit 10 ml 10 % Zitronensäure
und Wasser gewaschen. Nach Rückextraktion der vereinigten wassrigen Phasen
mit 10 ml CH2CI2 wurden die vereinigten org. Phasen über Na2S04 getrocknetund eingeengt. Das Rohprodukt (106 mg) und 25 mg (180 nmol, 1.1 Eq) 4-
Nitrophenol wurden in 1.0 ml trockenem Dioxan gelöst und 100 ul Pyridin und
96 mg (0.47 mmol) DCC zugegeben. Nach 4 Std. filtrierte man den entstandenen
Dicyclohexylharnstoff ab und engte das Filtrat zur Trockene ein. Nach
Chromatographie an 30 g Kieselgel mit 100 ml EtOAc : Hexan = 3:1 erhielt man
100 mg (72 %) 24.
-198- experimenteller Teil
Analytische Daten:
DC Rf = 0.60 (Kieselgel/EtOAc)
*H-NMR (200 MHz, CDC13): 1.50-2.00 (m, 7H, H-C(273'), darunter auchl.89 (s
br., 3H, CH3-C(5)), 2.79-2.90 (m, 2H, Bernsteinsäure), 2.92-3.01 (m, 2H,
Bernsteinsäure), 3.32-3.51 (m, 2H, H-C(6')), 3.78 (s, 6H, OCH3), 4.18-
4.26 (m, IH, H-C(5')), 5.02 (br s, IH, H-C(4')), 5.82-5.91 (m, IH, HC(l')),
6.79-6.88 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.21-7.45 (m, 12H, H-C(arom.), H-C(6)),
8.24-8.28 (m, 2H, H-C(arom.))
Man suspendierte 200 mg CPG-NH2 in 0.4 ml DMF : Triethylamin = 10 : 1 und
gab 28 mg (36 nmol) 24 zu. Diese Suspension wurde über Nacht stehen gelassen.Darauf wurde die Festphase drei Mal mit je 3 ml DMF gewaschen. Man
suspendierte den Träger in 1 ml Essigsaureanhydrid : Pyridin = 1 : 10 und 4.5 mg
DMAP und liess die Suspension für 16 Std. stehen. Der Träger wurde mit DMF
und Ether gewaschen und am HV bei RT getrocknet. Man erhielt mit a-Homo-
Thymidin derivatisierten Träger 25 mit einer Beladungsdichte von 21.0 umol/g.
D.7 6-Chlor-7-carbapurin
(Die Synthese dieser Bausteine wurde nach Davoll [37] durchgeführt, da aber
nirgends eine Zusammenstellung der analytischen Daten vorhanden ist wurden
alle Stufen hier angegeben)
D.7.1 2-Cyano-4,4-diethoxy-ethylbutanoat
N
'^O C
O
28
Analytische Daten:
DC Rf = 0.73, (Kieselgel/Hexan: EtOAc = 2:1)
-199- experimenteller Teil
UV (CHCI3): 209 (110.1), 273 (18.2)
IR (Film): 2979s, 2899m, 2251vw, 1749vs, 1445w, 1373m, 1262s, 1217m,
1128s, 1062vs, 855w
'H-NMR (400 MHz, CDC13): 1.21,1.22 (2t, J=7.1, je 3H, H3C-(Acetal)), 1.33 (t,
J=7.1,3H, H3C-(Ester)), 2.20 (ddd, J=5.1 8.113.9, IH, H-C(3)), 2.29 (ddd,
J=6.2 6.2 14.0, IH, H-C(3)), 3.54 (ddq, J=3.5 9.4 7.0, 2H, H2C-(Acetal)),
3.66 (t, J=6.4, IH, H-C(2)), 3.70 (ddq, J=9.4 10.8 7.1, 2H, H2C-(Acetal)),
4.26 (q, J=7.1,2H, H2C-(Ester)), 4.69 (dd, J=5.1 6.3, IH, H-(Acetal))
13C-NMR (100 MHz, CDCI3): 14.0 (q, C(2)-Ester), 15.20,15.22 (2q, C(2)-Acetal), 33.6
(d, C(2)), 33.7 (t, C(3)), 62.65, 62.67, 63.0 (3t, CH2-(Ester/Acetal)), 100.0
(d, C(4)), 116.4 (s, CN), 165.9 (s, CO)
MS (ED: 230.1 ((M + H)+, 26.2), 184.0 (100.0), 156.0 (47.9), 128.0 (30.7), 110.0
(26.5), 103.1 (74.5), 75.0 (27.0), 47.0 (32.9), 29.0 (42.7)
Siedepunkt: 60-62°C/0.03 Torr
D.7.2 4-Amino-5-(2',2,-diethoxy-ethyl)-6-hydroxy-2-mercapto-
pyrimidin
DC Rf = 0.57, (Kieselgel/EtOAc)
UV (MeOH): 203 (14280), 287 (13190)
IR (KBr): 3430m, 3340m, 2980m, 2900m, 1645vs, 1575vs, 1460s, 1300vw,
1220s, 1180m, 1130m, 1055s, 650vw, 610w, 545w
'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.08 (t, J=7.0,6H, H3C(Acetal)), 2.43 (d, J=5.6, 2H,
H2C(1')), 3.40 (dq, J=9.5, 7.1, 2H, H2C(Acetal)), 3.59 (dq, J=9.5, 7.1, 2H,
H2C(Acetal)), 4.47 (t, J=5.5, IH, H-C(2')). 6.24 (s br., 2H, H2N), 6.5-11.5
(br.,2H,OH,SH)
-200- experimenteller Teil
«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 15.3 (q, C(2)-Acetal), 28.2 (t, C(l')), 61.4 (t, C(D-
Acetal), 85.3 (s, C(5)), 102.3 (d, C(2')), 162.7 (s, C(2)), 173.7 (s, C(4/6)),
174.1 (s,C(4/6))
Schmelzpunkt: Zersetzung ab 171°C
D.7.3 4-Amino-5-(2',2'-diethoxy-ethyl)-6-hydroxypyrimidin
fViOH
39
DC Rf = 0.36, (Kieselgel/EtOAc: Methanol = 20 :1)
UV (MeOH): 215 (29470), 262 (10330)
IR (KBr): 3390m, 3150m, 2970m, 1660s, 1630vs, 1620vs, 1480m, 1455s,
1120s, 1050s, 910w,810w
JH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.07 (t, J=10.0, 6H, H3C(Acetal)), 2.53 (d, J=5.6,
2H, H2C(1')), 3.40 (dq, J=9.5, 7.0, 2H, H2C(Acetal)), 3.60 (dq, J=9.5, 7.0,
2H, H2C(Acetal)), 4.56 (t, J=5.6, IH, H-C(2')), 6.08 (s, 2H, H2N), 7.70 (s,
IH, H-C(2)), 11.5 (s br., IH, HO)
«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 15.2 (q, CHj(Acetal)), 28.7 (t, CH2(1')), 61.3 (t,
CH2(Acetal)), 93.2 (s, C(5)), 101.8 (d, C(2')), 146.9 (d, C(2)), 161.4 (s,
C(4/6)), 161.7 (s,C(4/6))
MS (EI): 227.1 (M+, 12.7), 182.1 (65.3), 124.0 (71.4), 103.1 (99.1), 75.0 (88.2),
47.0 (100.0), 45.1 (59.1), 43.1 (47.1), 29.1 (88.3), 28.1 (83.7), 27.1 (50.4)
Schmelzpunkt: 190-191°C
-201- experimenteller Teil
D.7.4 7-Carbahypoxanthin
o
N-^N^H
40
DC Rf = 0.50, (Kieselgel/EtOAc: MeOH = 10:1)
UV (MeOH): 203 (16720), 259 (11480)
IR (KBr): 3650-3300w br., 3100s, 2860s, 1675vs, 1575s, 1515m, 1430w,
1375m, 1230s, 1120m, 995m, 735w, 615m
IH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6.47 (dd, J=2.1, 3.3, IH, H-C(7)), 7.06 (dd, J=2.5,
3.2, IH, H-C(8)), 7.87 (s, IH, H-C(2)), 11.8 (br., IH, H-N(l/9)), 11.9 (br.,
lH,H-N(l/9))
«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 101.9 (d, C(7)), 107.6 (s, C(5)), 120.3 (d, C(8)),
143.2 (d, C(2)), 148.0 (s, C(4)), 158.4 (s, C(6))
D.7.5 6-Chlor-7-carbapurin
ci
H
41
Rf = 0.49, (Kieselgel/Hexan: EtOAc = 1:1)
(MeOH): 221 (27270), 275 (4929)
(KBr): 3600-3320w, 3200m, 3120s, 2970m, 2830m, 1605s, 1570s, 1555vs,
1435m, 1350vs, 1260vs, 1210s, 960s, 845vs, 730s, 590m
(400 MHz, DMSO-d6): 6.62 (d, J=3.5, IH, H-C(7)), 7.71 (d, J=3.5, IH, H-
C(8)), 8.61 (s, IH, H-C(2)), 12.6 (br., IH, H-N(9))
DC
UV
IR
'H-NMR
-202- experimenteller Teil
«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 98.7 (d, C(7)), 116.5 (s, C(5)), 128.3 (d, C(8)), 150.2
(d, (C(2)), 150.4 (s, C(6)), 151.7 (s, C(4))
MS (EI): 155.0 ((M + 2H)+, 37.2), 154.0 ((M + H)+, 10.5), 153.0 (M+, 100.0),
118.0 (83.3), 91.0 (13.5), 64.0 (27.2), 28.0 (21.7), 18.0 (63.6), 17.0 (15.0)
D.8 ß-Homo-deoxy-7-carbaadenosin
D.8.1 4,6-Di-0-benzoyl-2,3-dideoxy-D-glucose
BzO BzO
>X^O.
BzO \S | BzO X* ^"OH
OMe
5 44
Eine Lösung von 10.0 g (27 mmol) Pyranosid 5 in 300 ml CH3CN und 200 ml
H2O wurde bei RT mit 17 ml konz. Salzsäure versetzt und anschliessend
während 1.5 Std. auf Rückflusstemperatur erhitzt. Danach liess man auf RT
abkühlen, neutralisierte mit 103 ml 2N Natronlauge und dampfte am RV zur
Trockene ein. Das Rohprodukt wurde in wenig Essigester gelöst, mit 40 g
Kieselgel versetzt und abermals zur Trockene eingeengt. Chromatographie
erfolgte an 320 g Kieselgel mit Hexan : Essigester = 2:1 (2.0 lt), gefolgt von
Hexan: Essigester = 1:1 (1.5 lt). Die reinen produkthaltigen Fraktionen wurden
vereinigt und vom Lösungsmittel befreit. Es resultierten nach Trocknen am HV
bei RT während 60 Std. 7.61 g 44 (ungefähr 60% a- und 40% ß-Anomer) in Form
eines hochviskosen Oels, welches nach ^H-NMR noch 1.16 g Essigester enthielt
(67% korr.).
Analytische. Daten:
DC Rf = 0.55, (Kieselgel/Hexan : EtOAc = 1:1)
UV (CHCI3): 240 (8700), 274 (1400)
IR (CHCI3): 3590w, 2970w, 1720vs, 1600w, 1450m, 1340s, 1270vs, 1130s,
1070s, 1030s, 1000m
-203- experimenteller Teil
BzO
Xj^
J
•
...L.M » __jj1jl
1 1 1 —1-
1
90 80
1 1 1 1 1 1 1
70 60 50 40 30 20 10 0 0 ppm
Abbildung D8.1: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 44
IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.66-1.77 (m, IH, H-C(2/3)), 1.86-2.00 (m, IH, H-
C(2/3)), 2.01-2.21 (m, 1.6H, H-C(2/3)), 2.37-2.43 (m, 0.4H, H-C(2/3)),
4.01-4.07 (m, 0.4H, H-C(5)), 4.37-4.51 (m, 1.6H, H-C(5,6)), 4.57-4.64 (m,
IH, H-C(6)), 4.95 (dd, J=2.3 8.3,0.4H, H-C(D), 5.05-5.17 (m, IH, H-C(4)),
5.36 (t, J=2.1,0.6H, H-C(D), 7.37-7.45 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.50-7.58 (m,
2H, H-C(arom.)), 7.98-8.08 (m, 4H, H-C(arom.))
»C-NMR (100 MHz, CDCI3): 23.4, 27.0, 28.9, 31.0 (4t, C(2/3)), 64.1,64.3 (2t, C(6)),
68.4, 68.9, 69.0, 75.3 (4d, C(4/5)), 91.0, 95.9 (2d, C(D), 128.32, 128 42,
128.44 (3d, C(arom.)), 129.68, 129.69, 129.74, 129.77 (4d, C(arom.)),
129.83, 129.91, 129.94 (3s, C(arom.)), 133.00, 133.05, 133.19, 133 27 (4d,
C(arom.)), 165.56,166.46 (2s, C=0)
MS (EI): 339.1 ((M - OH)+, 8.2), 227.1 (4.6), 191.0 (4.2), 165.0 (12.6), 123.0 (5.0),
105.0 (100), 77.0 (36.1).
-204- experimenteller Teil
D.8.2 6-Chlor-7-carba-9-(4,,6,-di-0-benzoyl-2,/3'-dideoxy-ß-D-glucopyranosyDpurin
BzO
BzO^Sy~^"OH
44
BzO
BzO^^^^CI
36
BzO
BzO
<\ N^k/ClU
N*. N
Cl
//
H
41
^
Cl
//^X\ >
K+
43
J
42
Zu 2.37 g (15.4 mmol) 6-Chlor-7-carbapurin 41, welches nach Davoll [37]
hergestellt wurde, gab man 12,5 ml einer aus Kalium und Methanol frisch
zubereiteten und titrierten 1.236 M Lösung von Kaliummethoxid in MeOH (15.4
mmol) und rührte 30 min. bei RT unter Argon. Darauf wurde bei 25°C am RV
eingeengt, der feste Rückstand in 20 ml abs. CH3CN suspendiert, abermals
eingeengt und das entstandene Kaliumsalz für 52 Std. am HV bei RT getrocknet.
Separat dazu wurden 5.50 g (15.4 mmol) 4,6-Di-0-benzoyl-2,3-dideoxy-D-glucose44 während 52 Std. am HV bei RT getrocknet und anschliessend unter Ar in 70
ml abs. THF gelöst, auf -78°C abgekühlt und der Reihe nach mit 3.08 ml (16.9
mmol) Tris-(dimethylamino)-phosphin und mit 1.98 ml (20.3 mmol) CCI4
versetzt. Die Reaktionslösung wurde nun 1 Std. bei -78°C gerührt, 1 Std. auf RT
erwärmt und anschliessend am RV bei 25°C eingeengt. Der ölige Rückstand
205 - experimenteller Teil
wurde in 20 ml abs. CH3CN gelöst und die Lösung unter Argonüberdruck bei RT
durch einen Teflonschlauch zur Suspension des oben hergestellten Kaliumsalzes
von 6-Chlor-7-carbapurin in 20 ml abs. CH3CN gepresst. Nach 45 min. Rühren bei
RT wurde die Reaktionslösung bei 25°C am RV zu einem dunkelbraunen Oel
eingeengt, welches anschliessend an 450 g Kieselgel mit Hexan : EtOAc = 2:1 (4.0
lt) gefolgt von Hexan : EtOAc = 1:1 (2.0 lt), chromatographiert wurde. Die reinen
produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt und am RV eingedampft. Auf
diese Weise erhielt man 3.9 g eines Gemisches bestehend aus dem Nukleosid 42
und dessen a-Isomeren im Verhältnis von ß : a = 2 :1 (gemäss !H-NMR). Dieses
Nukleosidgemisch wurde nun in 20 ml Aceton gelöst und durch Diffusion gegen
Pentan (analog der Vorgehensweise nach [99], [100]) zur Kristallisation gebracht.Das Kristallisat, welches gemäss JH-NMR die beiden Nukleoside in einem
Anomerenverhältnis von ß : a = 9 : 1 aufwies, wurde nochmals aus 0.7 1 Et2Ü
umkristallisiert. Man erhielt so 2.1 g (28%) ß-anomerenreines 42 in Form von
weissen Nadeln.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.42, (Kieselgel/Hexan : EtOAc = 2 :1)
[a]D25° = -4.3 (c = 0.89, CHCI3)
UV (CHCI3): 240 (19900), 274 (8600)
IR (CHCI3): 2999w, 1720vs, 1587m, 1550m, 1510w, 1450m, 1316s, 1267vs,
1115s, 1071s, 1028m, lOOOw, 944w, 918w, 854w
!H-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.95-2.06 (m, IH, H-C(3')), 2.21-2.37 (m, 2H, H-
C(2')), 2.60-2.67 (m, IH, H-C(3')), 4.31 (ddd J=2.6, 5.4, 9.6, IH, H-C(5')),
4.44 (dd, J=12.1,5.5, IH, H-C(6'),), 4.63 (dd, J=12.1 2.5, IH, H-C(6'), IH),
5.22 (dt, Jt=10.6 Jd=4.8 IH, H-C(4')), 6.23 (dd, J=10.4 2.8, IH, H-C(l')),
6.67 (d, J=3.8, IH, H-C(7)), 7.48 (d, J=3.8, IH, H-C(8)), 7.35-7.60 (m, 6H,
H-C(arom.)), 7.96-8.05 (m, 4H, H-C(arom.)), 8.65 (s, IH, H-C(2))
Differenz-NOE (300 MHz, CDCI3): 6.21 (H-C(l') « 8.65 (H-C(2)), 7.48 (H-C(8)), 4.31
(H-C(5')), 2.29 (H-C(2')), 2.00 (H-C(3")
"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 28.5,30.3 (2t, C(273')), 63.7 (t, C(6')), 67.9 (d, C(4')),
77.7 (d, C(5*)), 81.1 (d, C(l')), 100.8 (d, C(7)), 118.0 (s, C(5)), 125.8 (d,
C(8)), 128.3,128.5 (2d, C(arom.)), 129.5 (s,C(arom.)), 129.70,129.73 (2d,
C(arom.)), 133.1,133.5 (2d, C(arom.)), 150.8 (s, C(6), 150.9 (d, C(2)), 152.4
(s, C(4), 165.5,166.2 (2s, CO)
-206- experimenteller Teil
MS (EI): 491.KM+, 0.9), 339.1 (32.2), 217.1 (5.2), 153.0 (6.2), 105.1 (100.0),
94.1(24.5), 77.1 (26.3)
C26H22CIN3O5: ber.: C: 63.48, H: 4.51, N: 8.54, gef.: C: 63.44, H: 4.54, N: 8.39
Schmelzpunkt: 152°C.
o^VV
r
Li—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—\—1—1—1—1 1—1—1
90 80 70 60 50 40 30 20 10 00 ppm
Abbildung D8.2: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 42
D.8.3 e-Ammo-T-carba-S-ßVS'-dideoxy-ß-D-glucopyranosyUpurin
HOBZ°
f=\
42
HO
O. Nv> .NH,
IIN- N
37
Im Autoklaven wurden in zwei separaten Chargen je 2.08 g (4.21 mmol) 42 in
200ml Methanol suspendiert. Die Autoklaven wurden jeweils geschlossen und
bei 0°C mit 21 g gasförmigem NH3 gefüllt. Nach 20 Std. bei 130°C wurde die
Reaktionslösung am RV eingeengt. Die vereinigten Rohprodukte beider Chargen
-207- experimenteller Teil
wurden, in wenig Methanol gelöst, an 30 g Kieselgel adsorbiert und
anschliessend an 450 g Kieselgel zuerst mit EtOAc : Methanol = 20 : 1 (4.0 lt)
gefolgt von EtOAc : Methanol = 4:1 (3.5 lt) chromatographiert. Die reinen,
produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt, der Rückstand in
Aceton gelöst und durch Diffusion gegen Pentan kristallisiert. Es verblieben nach
Trocknen am HV bei RT während 10 Std. 1.90 g (83%) ß-Homo-Carbaadenosin 37
in Form von feinen weissen Kristallen.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.10, (Kieselgel/EtOAc: MeOH = 10:1)
[alo25" = -13.0 (c = 0.55, MeOH)
UV (150 mM NaCl, 10 mM Tris • HCl, pH 7): 270 (10900)
IR (KBr): 3350vs br. sh, 3190vs br. sh, 1670s, 1640s, 1600vs, 1560vs, 1485m,
1275m, 1095m, 1060s, 995m, 915m, 745m, 720m
MS (FAB+, 3-NOBA): 265.1 (82.1, (M+H)+), 157.0 (34.4), 155.0 (11.7), 137.0
(41.7), 136.0 (49.6), 135.0 (58.0), 134.0 (33.2)
Ci2H16N4Q3-0.4 MeOH ber.: C: 54.14, H: 5.72, N: 20.36, gef.: C: 53.59, H: 6.11, N: 20.18
Schmelzpunkt: 189-192°C
Abbildung D83: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«) von 37
-208- experimenteller Teil
JH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.58-1.69, 1.82-1.87 (2m, 2H, H-C(273')), 2.08-
2.33 (m, 2H, H-C(273')), 3.34-3.48 (m, 3H, H-C(476')), 3.65-3.70 (m, IH,
H-C(5')), 4.48* (t, J=5.8, IH, HO-C(6')), 4.89* (d, J=5.2, IH, HO-C(4')),
5.82 (dd, J=2.0 11.0, IH, H-C(l')), 6.57 (d, J=3.6, IH, H-C(7)), 7.00* (s br.,
2H, NH), 7.31 (d, J=3.7, IH, H-C(8)), 8.06 (s, IH, H-C(2))
*: Signal tauscht mit D2O aus.
"C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 29.7, 31.9 (2t, C(273')), 61.1 (t, C(6')), 64.4 (d,
C(4')), 79.8 (d, C(5')), 83.1 (d, C(l')), 99.4 (d, C(7)), 102.3 (s, C(5)), 121.0
(d, C(8)), 149.5 (s, C(4)), 151.7 (d, C(2)), 157.4 (s, C(6))
D.8.4 6-Benzamido-7-carba-9-(2',3'-dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)-purin
X^»7r J^-Ty-HO^\>~^^ TU ^
N^ N
N^ N ^
37 38
Zu einer Lösung von 1.85 g (7.00 mmol) 37 in 72 ml abs. Pyridin wurden unter
Ar bei 0°C innerhalb von 15 min. 4.7 ml (37 mmol) Trimethylchlorsilan
zugegeben, gefolgt von 4.3 ml (37 mmol) Benzoylchlorid in einem zeitlichen
Abstand von 30 min. Nach weiteren 5 min. wurde das Eisbad entfernt, die
Reaktionslösung 2 Std. bei RT gerührt, danach wieder auf 0°C gekühlt und mit
14.4 ml Wasser innerhalb von 5 min. und 15 min. später mit 14.4 ml 25 %
Ammoniaklösung versetzt. Nach 5 min. wurde das Eisbad entfernt und noch für
45 min. bei RT gerührt. Die Reaktionslösung wurde am RV eingeengt in 150 ml
Wasser aufgenommen und einmal mit 150 ml Ether extrahiert. Die Wasserphasewurde am RV eingeengt. Es resultierten 8.1 g Rohprodukt welches, in MeOH
gelöst, an 30 g Kieselgel adsorbiert und an 300 g Kieselgel mit Hexan : EtOAc = 2 :
1 (2.0 lt), gefolgt von EtOAc : Methanol = 4:1 (4.5 lt) chromatographiert wurde.
Einengen der produkthaltigen Fraktionen bis zur einsetzenden Trübung und
Auskristallisieren lassen bei 4°C lieferte nach Trocknen am HV bei RT während
20 Std. 1.90 g (73%) 38 in Form von feinen weissen Kristallen.
-209- experimenteller Teil
Analytische Daten:
DC Rf = 0.75, (Kieselgel/EtOAc: MeOH = 4:1)
[dlrp5" =+12.7 (c = 0.59, MeOH)
UV (MeOH): 223 (30800), 302 (10300)
IR (KBr): 3460m br. sh, 3360s, 1695vs, 1560m, 1525vs, 1495vs, 1430m,
1345m, 1260vs, 1090vs, 1070s, 1050s, 940m, 710s
!H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.65-1.74,1.93-1.97 (2m, je IH, H-C(273')), 2.11-
2.15, 2.23-2.33 (2m, je IH, H-C(273')), 3.39-3.51 (m, 3H, H-C(47576')),
3.70 (dd, J=5.5 10.8, IH, H-C(6')), 4.54* (t, J=6.0, IH, HO-C(6')), 4.94* (d,
J=4.9, IH, HO-C(4')), 6.03 (dd, J=1.911.0, IH, H-C(l')), 6.68 (d, J=3.8, IH,
H-C(7)), 7.52-7.66 (m, 3H, H-C(arom.)), 7.69 (d, J=3.8, IH, H-C(8)), 8.06-
8.09 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.63 (s, IH, H-C(2)), 11.00* (s br., IH, NH)
*: Signal tauscht mit D2O aus.
HO
I I I I I
12.0 11.0 10.0
r
~1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1
9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm
Abbildung D8.4: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«) von 38
«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 29.4, 31.7 (2t, C(273')), 61.0 (t, C(6')), 64.3 (d,
C(4')), 80.0 (d, C(5')), 83.3 (d, C(l')), 102.9 (d, C(7)), 109.2 (s, C(5)), 124.4
(d, C(8)), 128.33,128.36,132.3 (3d, C(arom.)), 133.4 (s, C(arom.)), 150.2
(d, C(2)), 151.0,151.8 (2s, C(4/6)), 165.7 (s, C=0)
-210- experimenteller Teil
MS (EI): 368.2 (M+, 4.6), 341.1 (17.1), 91.0 (67.1), 69.0 (32.9), 57.0 (32.9), 55.0
(44.3), 43.0 (60.6), 41.0 (39.1), 27.0 (100.0), 18.0 (72.5)
Schmelzpunkt: 216-217°C.
D.8.5 6-Benzamido-7-carba-9-{2,,3'-dideoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxy-triphenyl)methyl]-ß-D-glucopyranosyl}purin
HO DMTO
.0. nXNHBz *- k^ A^NHBzHO'\>~^ T H HO*^s>~^ T II
N^N N^N
38 39
Zur Entfernung von Spuren von H2O wurden 1.76 g (4.79 mmol) 38 in 25 ml abs.
Pyridin gelöst, am RV eingedampft und am HV für 16 Std. getrocknet. Der
Rückstand wurde erneut unter N2 in 23 ml abs. Pyridin gelöst und mit 2.46 ml
(14.36 mmol) Ethyl-diisopropylamin versetzt. Zu dieser Lösung gab man bei RT
1.78 g (5.27 mmol, 1.1 Eq) 4,4'-Dimethoxy-triphenylchlormethan in kleinen
Portionen innerhalb von 5 min.. Nach 30 min. wurden weitere 300 mg (0.9
mmol, 0.2 Eq) Dimethoxy-triphenylchlormethan zugefügt. Die Reaktionslösungwurde anschliessend eingeengt und der Rückstand zur Entfernung von Spurenvon Pyridin noch zweimal mit je 30 ml Toluol koevaporiert. Anschliessende
Chromatographie an 200 g Kieselgel mit Hexan: EtOAc = 1:2 (3.3 lt) und EtOAc :
MeOH = 9:1 (2.0 lt) lieferte nach Trocknen am HV bei RT während 20 Std. 2.47 g
(77%) 39 in Form eines leicht gelblichen Schaumes.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.46, (Kieselgel/EtOAc)UV (CH3CN): 224 (43200), 281 (10400)
IR (CHCI3): 3006w, 1730w, 1700m, 1607m, 1560w, 1510s, 1481vs, 1340w,
1302m, 1087s, 1037s, 830m
IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.72-1.88 (m, IH, H-C(273')), 2.05-2.18 (m, 2H, H-
C(273')), 2.27-2.32 (m, IH, H-CG73')), 3.28 (dd, J=6.5 9.5, IH, H-C(6')),
3.34* (s, br., IH, HO-C(4')), 3.50 (dd, J=3.7 9.5, IH, H-C(6')), 3.79-3.84
-211- experimenteller Teil
(m, 8H, H3C-O, H-C(4^')), 6.12 (dd, J=5.3 7.3, IH, H-C(l')), 6.79-6.83
(m, 4H, H-C(arom.)), 7.09 (d, J=3.8, IH, H-C(7)), 7.12-7.33 (m, 7H, H-
C(arom.)), 7.34 (d, IH, J=3.8, H-C(8)), 7.39 - 7.62 (m, 5H, H-C(arom.)),
7.98 (d, J=7.5, 2H, H-C(arom.)), 8.53 (s, IH, H-C(2)), 8.80* (s, br., IH,
NH)
*: Signal tauscht mit D2O aus.
JL .Ja. jj
0X^»iX;
—1 1—1—1—1—1—1—1—1—1' 1—1—1—1—1
90 80 70 60 50 40 30 20 10 00 ppm
Abbildung D85: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 39
"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 30.4, 30.9 (2t, C(2730), 55.2 (q, CH3-O), 65.8 (d,
C(4')), 69.1 (t, C(6')), 79.1, 80.7 (2d, C(175')), 87.1 (s, O-C(DMT)), 104.7
(d, C(7)), 108.6 (s, C(5)), 123.2 (d, C(8)), 113.1,113.3,127.0,127.7,127.9,
128.0,128.9,129.2,130.0,132.7 (lOd, C(arom.)),133.6,135.3,135.5,144.3
(4s, C(arom.)), 150.5 (d, C(2)), 150.2, 152.5 (2s, C(4,6)), 158.7 (s,
C(arom.)), 165.2 (s,C=0)
MS (FAB+, 3-NOBA): 672.2 ((M + 2H)+, 2.7), 671.3 ((M + H)+, 6.2), 351.1
(3.4), 303.1 (100.0), 239.1 (28.4), 136.0 (5.6), 135.0 (6.4), 105.0 (34.0), 76.9
(12.5)
-212- experimenteller Teil
D.8.6 6-Benzamido-9-{4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopropyl-amino)phosphino]-2',3,-dideoxy-6'-0-[(4/4l-dimethoxytri-phenyl)methyl]-ß-D-glucopyrano8yl}-7-carbapurin
DMTO
DMTO J^°v^NsA^NHBZ^—
_
v^ t 11"*" I N^ N
"^ N O ^^N*. N
1
39"^
40
Zu einer Lösung von 0.887 g (1.32 mmol) 39 in 5.4 ml abs. THF wurden unter Ar
bei RT 294 ul (1.58 mmol) Ethyl-diisopropylamin und 354 ul (1.58 mmol) ß-
Cyanoethoxy-(N,N-diisopropylamino)-chlorphosphin gegeben. Nach 1 Std.
Rühren bei RT wurde die Reaktionslösung in 100 ml EtOAc aufgenommen,zweimal mit je 50 ml ges. NaHC03 Lsg. gewaschen, über Na2S04 getrocknet und
am RV eingeengt. Der Rückstand wurde an 68 g Kieselgel in einer auf 0°C
gekühlten Säule mit CH2C12: EtOAc = 2:1+ 0.3% NEt3 (0.75 lt), CH2C12: EtOAc =
1:1 + 0.3% NEt3 (0.5 lt) und EtOAc + 0.3% NEt3 (1.0 lt) chromatographiert. Die
reinen, produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und der
Rückstand, gelöst in ca. 3 ml EtOAc, aus 100 ml eisgekühltem Hexan gefällt.
Zweimaliges analoges Umfallen lieferte nach Trocknen am HV bei RT während
20 Std. 648 mg (59%) Phosphoramidit 40 (1 : 1 Diastereomerengemisch am
Phosphor) in Form eines weissen Pulvers.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.78, (Kieselgel/CH2C12: EtOAc = 2:1)
UV (CH3CN): 224 (41700), 282 (10000)
IR (CHCI3): 2968m, 1699m, 1509s, 1481vs, 1301m, 1081m, 1036s, 978m,
829w
JH-NMR (400 MHz, CDCI3): 0.88-1.17 (m, 12H, H3C-(i-Pr)), 1.82-1.92 (m, IH, H-
C(273')), 2.03-2.18 (m, 2H, H-C(273')), 2.30 (dd, J=6.1 11.1, IH, H2C-
CN), 2.36-2.46 (m, IH, H-C(273')), 2.59 (t, J=6.3, IH, H2C-CN), 3.23-3.70
(m, 6H, H2C-OP, H-(6'), HC(CH3)2-(i-Pr)), 3.74 (s, 1.5 H, H3C-O), 3.75 (s,
1.5H, H3C-O), 3.76 (s, 1.5H, H3C-O, 3.77 (s, 1.5H, H3C-O, 3.78-4.09 (m,
-213- experimenteller Teil
2H, H-C(475')), 6.18-6.23 (m, IH, H-C(l')), 6.71-6.78 (m, 4H, H-
C(arom.)), 7.12-7.24 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.31-7.35 (m, 4H, H-
C(arom.)), 7.44-7.47 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.51-7.54 (m, 3H, H-
C(arom.), 7.58-7.60 (m, IH, H-C(arom.)), 8.00 (d, J=7.5, 2H, H-
C(arom.)), 8.56 (s, br., H-C(2), IH), 8.81 (s, br., IH, NH)
J
X*A
OMTO
90 80—l 1 1 1 1 1 1 l 1 1 1 1 1 1 1 1
70 60 50 40 30 20 10 00 ppm
Abbildung D8.6: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 40
13C-NMR (100 MHz, CDCI3): 20.2, (dt, Jcp=7.2, CH2-CN) 20.5 (dt, JCp=7.4 CH2-
CN), 24.26, 24.33, 24.45, 24.53, 24.58, 24.64, 24.73 (7q, (CH3)2CH-(i-Pr)),
30.9,31.0,31.2,31.6 (4t, C(273')), 43.06,43.18 (2dd, Jcp=12.1, CH(CH3)2-
(i-Pr)), 55.1, 55.2 (2q, CH3-O, 57.7 (dt, JCp=20.4, CH2-OP), 58.3 (dt,
JCP=19.0, CH2-OP), 63.4, 63.7 (2t, C(6')), 67.3 (dd, JCp=17.8, C(4')), 68.1,
(dd, JCp=13.1, C(4')), 80.9, 81.0, 81.1, 81.2 (4d, C(175')), 85.7 (s, O-
C(DMT)), 104.4,104.5 (2d, C(7)), 108.6 (s, CN), 112.9 (d, C(arom.)), 117.6
(s, C(arom.)), 123.4,123.5 (2d, C(8)), 126.6,126.7,127.61,127.63,127.68,
128.4, 128.5, 129.0, 130.3, 132.7 (lOd, C(arom.)), 133.7, 136.16, 136.23,
136.27,136.32,144.9,145.1 (7s, C(arom.)), 150.1 (d, C(2)), 150.4,152.5 (2s,
C(4,6)), 158.3,158.4 (2s, C(arom.)), 165.2 (s, CO)
31P-NMR (162 MHz, CDCI3): 148.7
-214-experimenteller Teil
MS (FAB+, 3-NOBA): 871.3 ((M + H)+, 2.0), 466.0 (1.6), 303.1 (100.0), 239.1
(25.4), 201.1 (10.1), 105.0 (27.8).
Abbildung D8.7:3IP-NMR (162 MHz, CDCy von 40
-215- experimenteller Teil
D.9 ß-Allopyranosyl-isoguanin
D.9.1 2,6-Dichlor-9-(2'/3,,4,,6'-tetra-0-acetyl-ß-D-allopyranosyl)-purin
AcO
48 49 50
Man suspendierte 2.50 g (13.0 mmol) 2,6-Dichlorpurin 49, das zuvor 18 Std. am
HV bei RT getrocknet wurde, in 140 ml abs. CH3CN unter Ar. Darauf spritzte
man 5.75 ml (4.77 g, 23.5 mmol, 1.8 Eq) N,0-Bis-(trimethylsilyl)-acetamid zu,
erwärmte auf 65°C, bis sich die Suspension gelöst hatte und gab 7.50 g (19.3 mmol,
1.5 Eq) 1,2,3,4,6-Penta-O-acetyl-ß-D-allose 48 und 4.60 ml (25.3 mmol, 1.95 Eq)
Trifluor-methansulfonsäure-trimethylsilylester zu und rührte bei 65°C für 9 Std.
unter Ar. Man liess weitere 14 Std. bei RT stehen und nahm in 500 ml EtOAc auf.
Es wurde einmal mit 150 ml ges. NaHC03 gewaschen. Die wässrige Phase wurde
zwei Mal mit je 100 ml EtOAc rückextrahiert. Die vereinigten org. Phasen
wurden noch einmal mit 200 ml ges. NaCl gewaschen, über MgS04 getrocknet, an
40 g Kieselgel adsorbiert und anschliessend an 450 g Kieselgel zuerst mit Hexan :
EtOAc = 2 :1 (1.51) gefolgt von Hexan : EtOAc = 1:1 (2.01) und Hexan : EtOAc = 1 :
2 (2.0 1) chromatographiert. Einengen der produkthaltigen Fraktionen lieferte
4.617 g (68%) 2,6-Dichlor-9-(2,,3',4,,6'-tetra-0-acetyl-ß-D-allopyranosyl)-purin 50
als weissen, festen Schaum.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.48, (Kieselgel/Hexan: EtOAc = 1:1)
UV (CHCI3): 250 (5300), 272 (8570)
IR (CHCI3): 3000w, 1755vs, 1595m, 1560s, 1495w, 1370s, 1150m, 1100m,
1045s, 980w, 885m
IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.84, 2.07, 2.08, 2.28 (4s, je 3H, H3C), 4.11-4.17 (m,
2H, H-C(6')), 4.39 (ddd, J=2.7 4.1 10.4, IH, H-C(5')), 5.17 (dd, J=2.8 10.4,
-216- experimenteller Teil
IH, H-C(4')), 5.61 (dd, J=3.0 9.7, IH, H-C(2')), 5.85 (dd, J=2.9 2.9, IH, H-
C(3')), 6.15 (d, J=9.8, H-C(l')), 8.28 (s, IH, H-C(8))
"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 20.2,20.5,20.7,20.8 (4q, CH3), 61.7(t, C(6')), 65.7 (d,
C(4'), 67.6 (d, C(20,67.8 (d, C(3'), 72.9 (d, C(5')), 78.7 (d, C(l')), 130.9 (s,
C(5)), 143.5 (d, C(8)), 152.2 (s, C(4)), 153.2 (s, C(6)), 153.6 (s, C(2)), 168.7,
169.1,169.7,170.5 (4s, CO)
Zuordnung der 13C-Signale durch ein Hetcor - Experiment
MS (FAB+, 3-NOBA): 521.1 ((M + 3H)+, 17.7), 519.1 ((M + H)+, 26.0), 331.1
(100.0), 241.1 (36.6), 199.1 (42.7), 169.1 (66.9), 127.0 (34.0), 109.0 (57.5),
72.9 (63.1)
Abbildung D9.1: 'H-NMR (400 MHz, CDOj) von 50
217 - experimenteller Teil
D.9.2 6-Amino-2-chlor-9-(ß-D-allopyranosyl)purin
AC0/=N
HO/=N
| OAc Ns N I OH N^.xNAcO 7 HO 7
Cl Cl
50 51
In 13 verschiedenen Chargen wurden jeweils etwa 500 mg total 6.38 g
(11.77 mmol) 50 in 75 ml frisch mit NH3 bei 0°C gesättigtem Methanol in einem
Stahlautoklaven bei 100°C Badtemperatur für 11 Std. gerührt. Die Ansätze
wurden eingeengt und vereinigt. Umkristallisation aus Methanol : Aceton 1 : 1
nach der Methode der isothermen Destillation gegen Pentan analog [99], [100]
erhielt man 2.09 g 51. Adsorbtion der Mutterlauge an 10 g Kieselgel und
Chromatographie an 40 g Kieselgel mit CHCI3: MeOH = 4:1 (2.0 1) lieferte weitere
893 mg 51, was eine totale Ausbeute von 2.98 g (76%) ergab.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.60, (Kieselgel/n-BuOH : H20: AcOH = 5:3:2)
UV (MeOH): 263 (10600)
IR (KBr): 3500s, 3470s, 3330s, 3260s, 3210s, 3110s, 2910m, 1655vs, 1600vs,
1575s, 1345m, 1305s, 1250s, 1170m, HlOvs, 1045vs
IH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 3.41-3.50 (m, 2H, H-C(6')), 3.68 (ddd, J=1.9 7.3
10.1, IH, H-C(4')), 3.75 (ddd, J=1.8 4.1 9.6, IH, H-C(5')), 4.02 (dd, J=2.8
5.8, IH, H-C(3')), 4.11 (ddd, J=2.5 7.2 9.6, IH, H-C(2')), 4.52 (t, J=5.8, IH,
HO-C(6')), 4.83* (d, J= 7.4, IH, HO-C(4')), 5.11* (d, J=7.2, IH, HO-C(2')),
5.18* (d, J=3.6, IH, HO-C(3')), 5.64 (d, J=9.4, IH, H-C(D), 7.78* (s, br.,
2H, H2N), 8.36 (s, IH, H-C(8))
*: Signal tauscht mit D2O aus.
Differenz-NOE (300 MHz, DMSO-d6): 6.21 (H-C(l')) » 3.75 (H-C(5')), 5.11 (HO-
C(2')),8.36(H-C(8))
"C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 60.9 (t, C(6')), 67.0, 68.6, 71.3, 76.5, 79.4 (5d,
CU72737475'), 117.6 (s, C(5)), 140.1 (d, C(8)), 151.0 (s, C(4)), 153.0 (s,
C(2)), 156.6 (s,C(6))
-218- experimenteller Teil
MS (FAB+, 3-NOBA): 334.0 «M + 3H)+, 9.3), 332.0 ((M + H)+, 26.3)), 307.1
(41.7), 289.1 (19.6), 155.1 (41.8), 154.0 (100.0), 139.0 (25.9), 138.0 (50.5),
137.0 (77.8), 136.0 (72.5), 107.0 (30.8), 88.9 (25.9), 76.9 (24.1)
80
1 1—
70
T OH N^N
-I 1
20
—1 1 1 1
10 0 0 ppm
Abbildung D92: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) von 51
-219- experimenteller Teil
D.9.3 2-Allyloxy-6-[(N,N-dibenzoyl)amino]-9-(2,,3,,4,,6,-tetra-0-benzoyl-ß-D-allopyranosyl)purin
I OH N^ N
HO T
NHj
T
Cl
51
HO,= N
I OH N^NHO T
52
BZt <=\Bz0xt^"^r
I OBz N. N
N(Bz)2
BzO
53
T°^^
Zu 45.0 ml (29.8 g, 0.51 mol) AUylalkohol gab man 1.72 g (75 mmol, 10 Eq bez. 51)
Natrium und rührte bei 80°C, bis die AUylatbildung abgeschlossen war. Darauf
gab man 2.48 g (7.48 mmol) 51 zu und rührte für 7 Std. unter Ar bei 80°C
Badtemperatur. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10.40 g (90.0 mmol, 1.2 Eq
bez. Natrium) Pyridin-hydrochlorid in 40 ml AUylalkohol gestoppt. Es wurde
weitere 12 Std. bei RT gerührt. Die braune Suspension wurde abfiltriert und der
Filterkuchen zwei Mal mit je 20 ml Pyridin und 20 ml AUylalkohol
nachgewaschen. Einengen der Lösung ergab als Zwischenprodukt 52, mit einem
RrWert von 0.14 (Kieselgel/CH2Cl2: MeOH = 4:1).
Das Rohzwischenprodukt wurde noch einmal aus Pyridin eingeengt, für 4 Std.
am HV getrocknet und wieder in 77 ml Pyridin gelöst. Man kühlte auf 0°C ab
und spritzte innert 20 min. 14.7 ml (17.8 g, 127 mmol, 17 Eq bezüglich
Anfangsedukt 51) Benzoylchlorid unter Ar zu. Nach beendeter Zugabe wurde bei
RT noch weitere 16 Std. gerührt. Darauf wurde in 300 ml EtOAc aufgenommenund zwei Mal mit je 150 ml ges. NaHC03 gewaschen. Die wassrigen Phasen
wurden zwei Mal mit je 100 ml EtOAc rückextrahiert. Man trocknete die
vereinigten org. Phasen über Na2S04, engte am RV ein und chromatographiertedas braune hochviskose Oel an 400 g Kieselgel mit Hexan : EtOAc : EtOH = 16 : 4 :
-220- experimenteller Teil
0.5 (1.01), Hexan: EtOAc: EtOH = 16:4:1 (1.01) und Hexan : EtOAc: EtOH = 8:4:
2 (1.0 1). Einengen der produkthaltigen Fraktionen lieferte nach Trocknen am HV
für 16 Std. 5.26 g (72% über diese zwei Stufen) 53 als hellbräunlichen, festen
Schaum.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.37, (Kieselgel/Hexan: EtOAc = 3:2)
UV (CH3CN): 269 (12400), 280 (13600)
FR (CHCI3): 1733vs, 1601m, 1584s, 1508w, 1452s, 1394m 1336s, 1316m,
1267vs, 1091s, 1069s, 1027m
*H-NMR (400 MHz, CDCI3): 4.46-4.51 (m, 3H, H-C(6'), H-allyl-C(l")), 4.72 (dd,
J=2.5 12.5, IH, H-aUyl-C(l")), 4.84 (ddd, J=2.5 5.0 10.4, IH, H-C(5')), 5.10
(dd, J=0.9 10.4, IH, H-aUyl-C(3")), 5.20 (dd, J=1.5 7.2, IH, H-allyl-C(3")),
5.73-5.82 (m, 2H, H-allyl-C(2"), darunter auch 5.73 (dd, 1=2.9 10.3, IH,
H-C(4'))), 5.98 (dd, J=3.0 9.7, IH, H-C(2')), 6.41 (dd (tripletoid), J=2.9,
IH, H-C(3')), 6.51 (d, J=9.7, IH, H-C(l')), 7.22-8.10 (m, 30H, H-
C(arom.)), 8.16 (s, IH, H-C(D)
*: Signal tauscht mit D2O aus.
BaO T
III \
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9.0 8.0 7.0 (.0 5.0 4.0 3.0 2
i i i i i
.0 1.0 0.0 ppm
Abbildung D93: 'H-NMR (400 MHz,CDCy von 53
-221- experimenteller Teil
"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 62.7 (t, C(allyl-C(2")/6')), 66.8, 68.86, 68.91 (3d,
C(172737475')), 69.0 (t, C(allyl-C(2")/6')), 73.4, 77.2 (2d,
C(172737475')), 118.5 (t, allyl-C(3")), 122.8 (s, C(5)), 128.1, 128.4,
128.5,128.6,128.7,128.8,129.1,129.3,129.4,129.8,129.86,129.87,129.89,
130.1,132.3,132.9,133.3,133.5,133.7,133.8,134.0 (21d, C(arom.), allyl-
C(l")), 141.0 (d, C(8)), 152,5, 155.3 (2s, C(2/4)), 160.8 (s, C(6)), 164.4,
164.7,165.2,166.1,170.0,172.0 (6s, CO)
MS (FAB+, 3-NOBA): 979.1 ((M + 2H)+, 6.3), 978.1 ((M + H)+, 9.6), 856.1
(5.4), 579.1 (7.9), 106.0 (26.3), 104.9 (100.0), 76.9 (37.5)
D.9.4 2-AUyloxy-6-(benzamido)-9-(ß-D-allopyranosyl)purin
NHBz
T OBz N^Nnu
J NOH N^ N
BzO T HO T
53°^>
54°^>
In 29 ml THF : MeOH : H20 = 5:4:1 wurden 925 mg (0.94 mmol) 53 gelöst und
bei 0°C mit 3.76 ml 2N NaOH (7.52 mmol, 8 Eq) versetzt und für 40 min. bei 0°C
gerührt. Darauf wurde 1 Std. bei RT gerührt, wieder auf 0°C abgekühlt und nach
einer weiteren Stunde bei 0°C mit 806 mg (15.1 mmol, 2 Eq bez. NaOH) NH4CI
zugegeben. Nach 5 min. bei 0°C wurde noch 15 min. bei RT gerührt. Darauf engte
man auf = 8 ml ein. Die gelbe, zähflüssige Suspension wurde mit 5 ml H2O
verdünnt, 15 ml Ether überschichtet und bei 2°C für 17 Std. auskristallisieren
gelassen, was nach Trocknen für 1 Std. am HV 448 mg (99% korr.) 54,das noch
4.2 Gew.% Ether enthielt, als weisse KristaUe ergab.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.40, (Kieselgel/CH2C12: MeOH = 4:1)
UV (MeOH): 295 (14400)
IR (KBr): 3600-2800vs, 1680m, 1620vs, 1590vs, 1520s, 1490s, 1450s, 1400vs,
1335vs, 1245vs, 1110s, 1050s, 1030s, 975w, 930m, 790m, 710s
-222- experimenteller Teil
JH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 3.43-3.53 (m, 2H, H-C(6')), 3.68 (ddd, J=1.8 7.1
10.0, IH, H-C(4')), 3.78 (ddd, J=1.9 6.0 9.7, IH, H-C(5')), 4.07 (d, J=2.2,
IH, H-C(3')), 4.23-4.26 (m, IH, H-C(2')), 4.58* (t, J=4.0, IH, HO-C(6')),
4.86 (d, J=4.9,2H, H-allyl-C(l")), 4.91* (d, J=7.3, IH, HO-C(4')), 5.19* (d,
J=7.3, IH, HO-C(2')), 5.25-5.28 (m, 2H, HO-C(3')*, H-allyl-C(3")), 5.43
(ddd, J=1.6 3.3 17.3, IH, H-aUyl-C(3")), 5.75 (d, J=9.4, IH, H-C(l')), 6.11
(ddt, Jd=10.5 17.3 Jt=5.4, IH, H-allyl-C(2")), 7.48-7.57 (m, 3H, H-
C(arom.)), 8.01-8.03 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.46 (s, IH, H-C(8)), 7.0-11.5*
(IH, H-N(6))
*: Signal tauscht mit D2O aus.
«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 60.9 (t, C(allyl-C(2")/6')), 67.0 (d,
C(172737475')), 67.6 (t, C(allyl-C(2")/6')), 68.3, 71.3, 76.5, 79.7 (4d,
C(172737475')), 117.7 (t, allyl-C(3")), 121.2 (s, C(5)), 128.28, 128.35,
128.43,128.7,129.0,129.1,132.3,133.2,133.3 (9d, C(arom.), allyl-C(2")),133.4 (s, C(arom.)), 142.1 (d, C(8)), 151.0, (s, C(4)), 154.6 (s, C(2)), 160.1 (s,
C(6)), 165.7 (s,C=0)
u Jdf"
JJÜÜjIw
HON
aX^HXI OH N^. N
ho y
-| 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm
Abbildung D9.4: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d») von 54
-223- experimenteller Teil
MS (FAB+, 3-NOBA): 480.9 ((M + Na)+, 21.9), 479.9 ((M + Na - H)+, 81.7),
458.9 «M + 2H)+, 27.4), 457.9 ((M + H)+, 100.0), 295.9 (65.0), 155.0 (22.6),
154.0 (74.7), 138.0 (26.5), 137.0 (48.5), 135.9 (56.8), 104.9 (45.8), 76.9 (24.5)
D.9.5 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{(4,/6,-0-tetraisopropyldisiloxan-l,3-diyl)-ß-D-allopyranosyl}purin
HO=N
/=N
H0T^ v —-^KX^-WO ^
I OH NvN
Uv^% ho y54 55 °v^%
Man suspendierte 2.85 g (6.24 mmol) 54 in 75 ml Pyridin, engte am RV ein und
trocknete am HV für 16 Std. bei RT. Man suspendierte nochmals in 45.7 ml
Pyridin und spritzte unter starkem Rühren unter Ar 2.15 ml (2.16 g, 6.86 mmol
,1.1 Eq bez. 54) TXPDSCl rasch zu und rührte für 4.5 Std. bei RT. Die gelbliche
Reaktionslösung wurde zu 400 ml ges. NaHC03 gegeben und vier Mal mit je 200
ml CH2CI2 extrahiert. Die vereinigten org. Phasen wurden einmal mit 100 ml ges.
NaCl gewaschen und dieses mit 50 ml CH2CI2 rückextrahiert. Trocknen der
vereinigten org. Phasen über Na2S04, einengen und einmaliges Koevaporieren
mit 40 ml Toluol lieferte nach Chromatographie an 300 g Kieselgel mit CHCI3:
MeOH = 40 : 1 (2 1) gefolgt von CHCI3: MeOH = 10 : 1 (1.5 1) 3.53 g (81%) 55 als
festen, weissen Schaum.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.48, (Kieselgel/CHC13: MeOH = 9:1)
UV (MeOH): 295 (14200)
IR (CHCI3): 2945s, 2870s, 1710m, 1625s, 1590vs, 1465s, 1395s, 1333s, 1130s,
1056vs, 1036vs, 886m
^H-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.01-113 (m, 28H, H3C-(i-Pr)), 1.97* (br, IH, HO-
C(273')), 2.95* (br, IH, HO-C(273')), 3.91-3.98 (m, 2H, H-C(6')), 4.05
-224- experimenteller Teil
(dd, J=2.0 12.8, IH, H-C(5')), 4.14 (dd, J=2.7 9.5, IH, H-C(4')), 4.32-4.36
(m, IH, H-C(2')), 4.43, (m, IH, H-C(3')), 4.84 (m, 2H, H-allyl-C(l")),
5.24 (dd, J=1.3 10.5, IH, H-allyl-C(3")), 5.41 (ddd, J=1.5 3.1 17.1, IH, H-
aUyl-C(3")), 5.85 (d, J=9.3, IH, H-C(l')), 6.07 (ddt, Jd=10.5 17.2 Jt=5.6, IH,
H-allyl-C-(2")), 7.49-7.53 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.57-7.60 (m, IH, H-
C(arom.)), 7.91 (s, IH, H-C(8)), 8.02-8.04 (m, 2H, H-C(arom.)), 9.09* (s
br., IH, H-N(6))
*: Signal tauscht mit D2O aus.
«C-NMR (100 MHz, CDCI3): 12.4, 12.5, 13.1, 13.2, 13.6 (5d, C-Si), 17.08, 17.09,
17.13, 17.17, 17.19, 17.26, 17.31, 17.38 (8q, CH3-(i-Pr)), 60.8 (t, C(allyl-
C(2")/60), 66.4 (d, C(172737475% 68.8 (t, C(allyl-C(2")/6')), 69.6,
71.9,75.7,81.6 (4d, C(l72737475'), 118.1 (t, allyl-C(3")), 118.5 (s, C(5)),
128.1,128.7,132.6,132.8 (4d, C(arom.), aUyl-C(2")), 133.8 (s, C(arom.)),
140.5 (d, C(8)), 150.0 (s, C(4)), 154.0 (s, C(2)), 161.0 (s, C(6)), 164.9 (s, C=0)
MS (FAB+, 3-NOBA): 702.4 ((M + 3H)+, 16.6), 701.4 ((M + 2H)+, 35.2), 700.4
((M + H)+, 58.8), 297.1 (30.3), 296.1 (100.0), 192.1 (24.5), 135.0 (18.4),
105.0 (59.3)
Abbildung D95: 'H-NMR (400 MHz, CDCb) von 55
-225- experimenteller Teil
D.9.6 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{2',3,-0-isopropyliden-(4,,6'-0-
tetraisopropyldisiloxan-l,3-diyl)-ß-D-allopyranosyl}purin
<y'Si—0\ 0 O
,_N
| [ OH N^Nh6 y
55Q
x-
I I P NwN
6i^ T56
Man trocknete 3.53 g (5.04 mmol) 55 und 633 mg (2.52 mmol, 0.5 Eq bez. 55)
Pyridinium-(toluol-4-sulfonat) für 25 Std. am HV. Darauf wurde in 29 ml frisch
über basisch Alox filtriertem Chloroform gelöst. Man gab unter Ar bei RT 1.18 ml
(910 mg, 12.6 mmol, 2.5 Eq) 2-Methoxy-propen zu und rührte für 37 Std. bei RT.
Die Reaktionslösung wurde in 400 ml CH2CI2 aufgenommen und mit 150 ml ges.
NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wurde zwei Mal mit je 100 ml CH2CI2
rückextrahiert. Nach Trocknen der vereinigten org. Phasen über Na2SO,j,
Einengen am RV, einmaligem Einengen aus 60 ml Toluol und Chromatographiean 240 g Kieselgel mit Hexan : EtOAc : MeOH = 60 : 30 :1 (2.7 1) erhielt man 2.85 g
(76%) 56 als festen, weissen Schaum.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.52, (Kieselgel/Hexan: EtOAc = 1:1)
UV (CH3CN): 293 (15500)
IR (CHCI3): 2995m, 2945s, 2870m, 1710m, 1625s, 1590vs, 1465vs, 1410s,
1395s, 1335s, 1135s, 1055vs, 1035s, 1005m, 810m
IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.03-1.16 (m, 28H, H3C-(TrPDSi)/HC-(TrPDSi)), 1.14
(s, 3H, HäC-Ketal), 1.48 (s, 3H, H3C-Ketal), 3.94-4.02 (m, 2H, H-C(6')),
226- experimenteller Teil
4.13 (dd, J=9.8 18.8, IH, H-C(4')), 4.39 (dd, J=3.7,9.8, IH, H-C(4')), 4.67
(dd (tripletoid), J=4.1, IH, H-C(3')), 4.80 (dd, J=8.5 4.5, IH, H-C(2')),
4.83-4.94 (m, 2H, H-allyl-C(l")), 5.25 (ddd, J=1.3 2.7 10.5, IH, H-allyl-
C(3")), 5.42 (ddd, J=1.5 3.117.3, IH, H-allyl-C(3")), 5.69 (d, J=8.5, IH, H-
C(l')), 6.10 (ddt, Jd=10.417.2 J,=5.7, IH, H-allyl-C(2")), 7.48-7.52 (m, 2H,
H-C(arom.)), 7.56-7.61 (m, IH, H-C(arom.)), 7.96 (s, IH, H-C(arom.)),
7.97-7.99 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.89* (s br., IH, H-N(6))
*: Signal tauscht mit D2O aus.
"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 12.1, 12.5, 13.2, 13.8 (4d, C-Si), 17.1, 17.16, 17.22,
17.26, 17.29,17.32 (6q, CH3-(i-Pr)), 26.0, 28.4 (2q, CH3-Ketal), 60.6 (t,
C(allyl-C(2")/6')), 64.1 (d, C(l72737475')), 68.6 (t, C(allyl-C(2")/6')),
75.2, 76.6, 76.7, 82.8 (4d, C(172737475')), 111.6 (s, C(CH3)2-Ketal),
118.0 (t, allyl-C(3")), 119.2 (s, C(5)), 127.9, 128.8, 132.7, 132.9 (d,
C(arom.), allyl-C(2")), 133.7 (s, C(arom.)), 140.0, (d, C(8)), 150.4 (d,
C(4)), 154.3 (s, C(2)), 161.2 (s, C(6)), 164.6 (s, C=0)
MS (FAB+, 3-NOBA): 742.4 ((M + 2H)+, 30.1), 741.5 ((M + H)+, 60.8), 740.5
(M+, 100.0), 297.1 (23.4), 296.1 (89.8), 289.2 (24.4), 261.1 (30.3), 147.0
(24.1), 135.0 (25.3), 119.0 (26.7), 105.0 (81.1)
-(V
JL jO1 1 1 r
.zzfl 1—1—1—1—
30 20
-1 1 1 1
10 00 ppm
Abbildung D9Jk: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 56
-227- experimenteller Teil
D.9.7 2-AUyloxy-6-(benzamido)-9-{2,,3'-0-isopropyliden-ß-D-allo-pyranosyUpurin
X
i P N^N
NHBz
56
I P N^N
°7^ T
57
In 25 ml THF wurden 2.85 g (3.85 mmol) 56 gelöst und 4.37 g (13.9 mmol, 3.6 Eq)
TBAF-Trihydrat zugegeben und für 4 Std. bei RT unter Ar gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde direkt auf 240 g Kieselgel aufgetragen und mit
CH2CI2: MeOH = 20 : 1 (3.0 1) eluiert, was 1.77 g (92%) 57 als amorphen weissen
Festkörper ergab.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.36, (Kieselgel/CH2C12: MeOH = 9:1)
UV (MeOH): 294 (16200)
IR (KBr): 3600-3050m, 2980w, 2940m, 1705s, 1615vs, 1595vs, 1530s, 1460s,
1390s, 1330vs, 1260vs, 1220s, 1030s, 1080vs, 1040s, 930w, 790m, 710m
!H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.33 (s, 3H, H3C-Ketal), 1.58 (s, 3H, H3C-Ketal),
3.47-3.53 (m, IH, H-C(5'/6')), 3.72-3.79 (m, 2H, H-C(5'/6')), 3.85 (ddd,
J=3.9 6.8 10.0, IH, H-C(4')), 4.60 (t, J=4.2, IH, H-C(3')), 4.73* (t, J=6.0, IH,
HO-C(6')), 4.86 (d, J=5.0, 2H, H-allyl-C(l")), 4.97 (dd, J=4.5 8.8, IH, H-
C(2')), 5.26 (ddd, J=1.3 3.0 10.5, IH, H-allyl-C(3")), 5.38* (d, J=6.8, IH,
HO-C(4')), 5.41 (ddd, J=1.7 3.3 17.8, IH, H-allyl-C(3")), 5.67 (d, J=8.2,
IH, H-C(l')), 6.10 (ddt, Jd=10.5 15.3 Jt=5.7, IH, H-allyl-C(2")), 7.53-7.57
(m, 2H, H-C(arom.)), 7.62-7.67 (m, IH, H-C(arom.)), 8.01-8.03 (m, 2H,
H-C(arom.)), 8.57 (s, IH, H-C(8)), 11.17* (s, IH, H-C(8))
*: Signal tauscht mit D2O aus.
"C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 26.1, 27.9 (2q, CH3-Ketal), 60.5 (t, C(allyl-
C(2")/6')), 64.3 (d, C(172'/3'/475')), 67.6 (t, C(allyl-C(2")/6')), 73.6,
76.2, 78.2, 81.2 (4d, C(172'/37475')), 109.8 (s, C(CH3)2-Ketal), 117.8 (t,
-228- expenmenteller Teil
aUyl-C(3")), 121.0 (s, C(5)), 128.3,128.4,132.4,133.2,133.3 (5d, C(arom.),
allyl-C(2")), 141.6 (d, C(8)), 151.6 (s, C(4)), 154.1 (s, C(2)), 160.3 (s, C(6)),
165.7 (s,C=0)
MS (FAB+, 3-NOBA): 499.1 ((M + 2H)+, 18.4), 498.2 ((M + H)+, 45.2), 297.1
(17.1), 296.0 (56.8), 243.3 (31.9), 242.3 (100.0), 142.2 (18.1), 136.0 (16.3),
105.0 (48.9)
MO pH
"°TO N^N
h f"
^
__/
1/
r- 110 J/ ^
I-j
. -r .k -ii I ', ,\
90 80 70 60 50 40 30 2 0 10 00 ppm
Abbildung D9.7: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«) von 57
-229- experimenteller Teil
D.9.8 2-AUyloxy-6-(benzamido)-9-{6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)-methyl]-2V3'-0-isopropyliden-ß-D-allopyranosyl}purin
HON
DMTON
'»...„ I vNHBz
HOX^^X*_
X^"XhI > N^N » T O N«N
57 58
Man engte 600 mg (1.22 mmol) 57 aus 7.0 ml Pyridin ein und trocknete für
18 Std. am HV. Es wurde wieder in 5.8 ml Pyridin gelöst und unter Ar 620 al
(0.470 g, 3.61 mmol, 3 Eq) Ethyl-diisopropylamin und darauf 490 mg (1.45 mmol,
1.2 Eq ) 4,4'-Dimethoxy-triphenylchlormethan zugegeben und für 3.5 Std. bei RT
gerührt. Man entfernte am RV das Pyridin, engte nochmals aus 10 ml Toluol ein
und chromatographierte an 100 g Kieselgel mit Hexan : EtOAc = 2:1 (3.0 1),
gefolgt von Hexan : EtOAc = 1:1 (1.0 1) und EtOAc (1.5 1), was 791 mg (83%) 58 als
gelblichen, festen Schaum ergab.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.47, (Kieselgel/EtOAc)
UV (CHCI3): 292 (15100)
IR (CHCI3): 3005m, 1710m, 1610s, 1590vs, 1510vs, 1485m, 1445s, 1395s,
1335s, 1300m, 1155w, 1120m, 1080s, 1035s, 835m
IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.41 (s, 3H, HsC-Ketal), 1.68 (s, 3H, H3C-Ketal), 3.06*
(d, J=5.0, IH, HO-C(4')), 3.38 (dd, J=4.8 10.1, IH, H-C(6')), 3.46 (dd, J= 4.1
9.9, IH, H-C(6')), 3.77, 3.78 (2s, je 3H, H3C-O), 4.05-4.10 (m, 2H, H-
C(4'/5')), 4.70 (dd, J=3.7 4.9, IH, H-C(3')), 4.74 (dd, J=4.9 8.3, IH, H-
C(2')), 4.85-4.93 (m, 2H, H-allyl-C(l")), 5.24 (ddd, J=1.3 2.7 10.4, IH, H-
allyl-C(3")), 5.41 (ddd, 1=1.5 3.1 17.2, IH, H-allyl-C(3")), 5.74 (d, J=8.4,
IH, H-C(l')), 6.09 (ddt, Jd=10.5 17.2 J,=5.7, IH, H-allyl-C(2")), 6.78-6.83
(m, 4H, H-C(arom.)), 7.18-7.32 (m, 7H, H-C(arom.)), 7.40-7.42 (m, 2H,
H-C(arom.)), 7.48-7.52 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.57-7.61 (m, IH, H-
C(arom.)), 7.98-8.00 (m, 3H, H-C(arom.), H-C(8)), 8.85* (s, IH, H-N(6))
*: Signal tauscht mit D2O aus.
-230- experimenteller Teil
"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 26.0, 28.0 (2q, CH3-Ketal), 55.2 (q, CH3-O), 64.2 ((t,
C(allyl-C(2")/6')), 67.6 (d, C(172'/37475'), 68.8 (t, C(allyl-C(2")/6')),75.1, 75.4, 75.7,82.0 (4d, C(172737475'), 87.0 (s, O-C(DMT)), 111.3 (s,
C(CH3)2), 113.3 (d, C(arom.)), 118.2 (t, allyl-C(3")), 119.2 (s, C(5)), 127.0,
127.9,127.98,128.02,128.8,130.0,132.7,132.8 (8d, C(arom.), allyl-C(2")),
133.6, 135.4,135.5 (3s, C(arom.)), 139.7 (d, (C(8)), 144.3 (s, C(arom.)),
150.4 (s, C(4)), 154.4 (s, C(2)), 158.7 (s, C(arom.)), 161.3 (s, C(6)), 164.6 (s,
CO)
MS (FAB+, 3-NOBA): 801.2 ((M + 2H)+, 15.7), 800.2 ((M + 1)+, 29.4), 304.1
(32.2), 303.1 (100.0), 296.1 (381.2), 154.0 (41.4), 137.0 (29.0), 136.0 (31.4),
105.0 (34.4)
iL
X V
n ii -fl .i 1 -Vi L—1 r
90 80 70
~i 1 1 1 1 1 r
60 50 40
-I 1 1 1 1 1 1
2 0 10 0 0 ppm
Abbildung D9& 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 58
-231- experimenteller Teil
NHBz
HO
Ö
D.9.9 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{4,-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-
diiso-propylamino)phosphino]-6'-0-[(4,4'-dimethoxytri-phenyl)-methyl]-2',3'-0-isopropyliden-ß-D-allopyranosyl}-purin
DMT? /=NDMT0
f=N
ytY —-XaiI v
^ °^> A°"v °^
57 59
Aus 10 ml Chloroform wurden 694 mg (780 nmol) 57 eingeengt. Man fügte 53.0
mg (435 umol) DMAP hinzu und trocknete für 15 Std. bei RT am HV. Man löste
in 7.2 ml CH3CN unter Ar und spritzte bei 0°C 600 ul (450 mg, 3.47 mmol, 4 Eq)
Ethyl-diisopropylamin und dann tropfenweise 230 ul (250 mg, 1.04 mmol, 1.2 Eq)
ß-Cyanoethoxy-(N,N-diisopropylamino)-chlorphosphin zu. Nach 45 min. wurde
in 170 ml EtOAc bei 0°C aufgenommen und einmal mit 15 ml 0.1 M
Kaliumphosphatpuffer (pH 7) und einmal mit 40 ml ges. NaCl bei 0°C
gewaschen, über Na2S04 getrocknet, bei 25°C eingeengt und an 110 g Kieselgel an
einer auf 0°C gekühlten Säule mit Hexan : EtOAc =1:1 + 1% N(Et)3 chromatogra¬
phiert. Man erhielt 785 mg (91%) 59 als leicht gelblichen, festen Schaum.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.64, (Kieselgel/Hexan: EtOAc = 1:2)
UV (CH3CN): 293 (17400)
IR (CHCI3): 2970m, 1710m, 1610s, 1590vs, 1510vs, 1465s, 1395s, 1330s,
1300m, 1155w, 1120m, 1035vs, 980m, 880w, 835w
IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 0.95,1.12 (2d, J=6.8, 3H, CH3-(i-Pr)), 1.20 (d, J=6.8,
6H, CH3-(i-Pr)), 1.38,1.40,1.70, 1.71 (je s, 1.5H, CH3-Ketal), 2.22-2.36
(m, IH, H2C-CN), 2.63 (t, J=6.4, IH, H2C-CN), 3.20-3.38 (m, 2H, H-C(6'),
HC(CH3)2-(i-Pr)), 3.44-3.64 (m, 3H, H-C(6'), HC(CH3)2-(i-Pr), H2C-OP),
3.74-3.89 (m, IH, H2C-OP, und 4s je 1.5H H3C-O bei 3.746, 3.750, 3.76,
3.78), 4.16-4.20 (m, 1.5H, H-C(273'/475')), 4.43-4.49 (m, 0.5H, H-
-232- experimenteller Teil
C(2'/37475')), 4.67-4.71 (m, 1.5H, H-C(2' $ ,4* $)), 4.77-4.79 (m, 0.5H,
H-C(27374'/5')), 4.82-4.95 (m, 2H, H-allyl-C(l")), 5.22-5.27 (m, IH, H-
allyl-C(3")), 5.40 (ddd, J=1.3 3.1 17.2, 0.5H, H-allyl-C(3")), 5.41 (ddd,
J=1.3 3.1 17.2, 0.5H, H-allyl-C(3")) 5.80 (m (dubletoid), J=8.6, IH, H-
C(l')), 6.04-6.16 (m, IH, H-allyl-C(2")), 6.71-6.78 (m, 4H, H-C(arom.)),
7.10-7.23 (m, 3H, H-C(arom.)), 7.28-7.30 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.39-7.42
(m, 2H, H-C(arom.)), 7.49-7.53 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.58-7.62 (m, IH,
H-C(arom.)), 7.99-8.01 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.05, 8.07 (2s, je 0.5H, H-
C(8)), 8.84 (s br., IH, H-N(6))
Abbildung D9.9: 'H-NMR (400 MHz, CDCIj) von 59
«C-NMR (100 MHz, CDC13): 20.2 (dt, Jcp=20.6, CH2-CN), 20.3 (dt, JCp=20.6, CH2-
CN), 20.56, 20.63, 20.7 (3q, CH3-(i-Pr)), 26.1, 26.3, 28.3, 28.4 (4q, CH3-
Ketal), 43.3,43.4 (2d, CH(CH3)2-(i-Pr)), 55.2, 55.3 (2q, CH3-O), 58.3 (dt,
JCp=35.2, CH2-OP), 58.4 (dt, JCp=35.2, CH2-OP), 62.6, 63.2 (2t, C(allyl-
C(2")/6')), 66.9 (dt, JCp=18.9, C(4')), 67.3 (dt, JCp=21.7, C(4')), 68.65,68,67
(2t, C(aUyl-C(2")/6')), 75.48,75.58,75.67, 75.69,75.82,76.49, 76.54, 76.61,
77.24, 82.1 (lOd, C(1727374'/5')), 86.13, 86.15 (2s, O-C(DMD), 110.0,
111.4 (2s, C(CH3)rKetal), 112.98,113,01 (d, C(arom.)), 117.6 (ds, Jcp=9.1,
-233- experimenteller Teil
31P-NMR
MS
CN), 118.0 (t, aUyl-C(3")), 119.2 (s, C(5)), 126.7,127.7,127.9,128.3,128.6,
128.8, 130.18, 130.22,130.38, 130.42, 132.7, 132.9 (12d, C(arom.), allyl-
C(2")), 133.7,135.76,135.82,135.95,135.97 (5s, C(arom.)), 139.53,139.65
(2d, C(8)), 144.5, 144.8 (2s, C(arom.)), 150.5 (s, C(4)), 154.4, 154.5 (2s,
C(2)), 158.45,158.53 (2s, C(arom.)), 161.3 (s, C(6)), 164.5 (s, C=0)
(162 MHz, CDCI3): 150.0,151.7
(FAB+, 3-NOBA): 1002.4 ((M + 2H)+, 5.1), 1001.4 ((M + H)+, 12.8).
1000.4 ((M)+, 18.5), 478.1 (12.3), 304.1 (37.8), 303.1 (100.0), 296.1 (22.1),
201.1 (46.4), 105.0 (38.7)
Jl_-1—1—1—
9.0 80
L_
X_r
UJAa.
X-CZF v
i. 11
f
JuV—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1
50 40 30 2.0 10 00 ppm
Abbildung D9.10:3,P-NMR (162 MHz, CDCI3) von 59
-234- experimenteller Teil
D.9.10 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)-methyl]-2',3,-0-isopropyliden-4,-0-[5-(4-nitro-phenoxy-carbonyl)pentyl]-ß-D-allopyranosyl}purin
DMTON
X P "VN
57
DMT0y=N
1NHBz
0X^"X1 I p N*^N
62
Man trocknete 232 mg (600 nmol, 4 Eq) Adipinsäure-bis-(4-nitrophenyl)-esterund 19.6 mg (150 umol, 1 Eq) DMAP für 24 Std. bei RT am HV. Darauf löste man
bei 40°C in 3.3 ml Pyridin : THF = 1:2 unter Ar. Zu dieser Lösung spritzte man
119.8 mg (150 umol) 57, das zuvor am HV bei RT für 24 Std. getrocknet wurde,
gelöst in 840 ul Pyridin : THF = 1:2 und rührte bei 40°C unter Ar für 48 Std.. Man
engte am RV bei 25°C ein und koevaporierte mit 10 ml Toluol. Man löste in 1.5
ml CH2CI2 und trug auf 15 g Kieselgel, welches mit Hexan : EtOAc = 6:4
aequilibriert wurde auf und eluierte mit Hexan : EtOAc = 6:4 (500 ml), was 91.0
mg (58%) eines hellgelben amorphen Schaumes ergab 62.
Analytische Daten:
DC Rf = 0.15, (Kieselgel/EtOAc)IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.36 (s, 3H, HäC-Ketal), 1.61-1.77 (m, 7H, H3C-Ketal,
H2C(Adipinsäureester, C(2'", 3'"))), 2.21 (dt, Jd=16.2 Jt=7.1, IH,
H2C(Adipinsäure-ester, C(4'"))), 2.34 (dt, Jd=16.3 Jt=7.0, IH,
H 2C(Adipinsäureester, C(4'"))), 2.59 (t, J=7.2, 2H,
H2C(Adipinsäureester, C(5"'))), 3.19 (dd, J=4.1 10.7, IH, H-C(6')), 3.40
(dd,J=2.110.6, IH, H-C(6')), 3.75 (s, 3H, H3C-O), 3.76 (s, 3H, H3C-O), 4.20
-235- experimenteller Teil
(ddd, J=2.3 4.0 10.0, IH, H-C(5')), 4.77 (dd, J=4.7 8.5, IH, H-C(2')), 4.83
(dd (tripletoid), J=4.4, IH, H-C(3')), 4.85-4.95 (m, 2H, H-allyl-C(l")),5.25 (ddd, J=1.2 2.6 10.4, IH, H-aUyl-C(3")), 5.42 (ddd, J=1.5 3.117.2, IH,
H-allyl-C(3")), 5.48 (dd J=4.0 10.0, IH, H-C(4')), 5.79 (d, J=8.5, IH, H-
C(l*)), 6.10 (ddt, Jd=10.417.2 Jt=5.7, IH, H-alIyl-C(2")), 6.75-6.79 (m, 4H,
H-C(arom.), 7.15-7.29 (m, 9H, H-C(arom.)), 7.36-7.39 (m, 2H, H-
C(arom.)), 7.50-7.54 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.58-7.62 (m, IH, H-
C(arom.)), 7.99-8.02 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.07 (s, IH, H-C(8)), 8.24-8.28
(m, 2H, H-C(arom.)), 8.85 (s, IH, H-N(6))
LdQ —U UUL_J L.
r
i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i—i
90 80 70 80 50 40 30 20 10 00 ppm
Abbildung D9.ll: 'H-NMR(400MHz,CDCfe) von 62
«C-NMR (100 MHz, CDCI3): 23.97, 24.01 (2t, C-(Adipinsäure, 3'", 4'")), 26.1, 28.1
(2q, CH3-Ketal), 33.5, 33.8 (2t, Adipinsäure, 2'", 5'")), 55.2 (q, CH3-O),
62.1 (t, C(allyl-C(2")/6')), 66.3 (d, CÜ72737475')), 68.7 (t, C(allyl-
C(2")/6')), 73.4, 74.7, 75.5, 82.1 (4d, C(17273'/475'), 86.1 (s, O-
C(DMT)), 111.6 (s, C(CH3)2), 113.1 (d, C(arom.)), 118.1 (t, allyl-C(3")),119.2 (s, C(5)), 122.4,125.2,126.9,127.8,127.9,128.2,128.9,130.1,132.7,
132.9 (lOd, C(arom.), allyl-C(2")), 133.6, 135.6, 135.7 (3s, C(arom.)),
139.5 (d, C(8)), 144.4,145.4 (2s, C(arom.)), 150.5 (s, (C(4)), 154.4 (s, C(2)),
-236- experimenteller Teil
158.5 (s, C(arom.)), 161.3 (s, C(6)), 164.6 (s, C=0 (Benzoyl)), 170.7,171.9
(2s, C=0 (Adipinsäureester))
D.9.11 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{6,-0-[(4/4,-dimethoxytriphenyl)-
methyl]-2V3*-0-isopropyliden-4M>[5-(CPG-amido)pentyl]-ß-D-allopyranosyl}purin
DMT0/=N
1NHBz
nI I O N^N
I I p N^N
/=N,'
NHBz
I^N^^k.0^ "T^63
In 1.15 ml DMF, 72 ul (52.6 mg, 51.9 umol) N(Et)3 und 7.2 ul (7.1 mg, 89 nmol)
Pyridin wurden 300 mg CPG suspendiert. Dazu spritzt man 91.0 mg (86.6 umol)
62, das zuvor für 14 Std am HV bei RT getrocknet wurde, gelöst in 500 ul THF
und liess unter gelegentlichem Umschwenken 5.5 Tage stehen. Die Suspension
wurde abfiltriert und mit 10 ml DMF, 15 ml MeOH und 15 ml Ether gewaschen.Das CPG wurde in 1.5 ml Pyridin suspendiert und unter Ar mit 6.0 mg DMAP
(49 umol) und 75 ul (81 mg, 790 umol) Essigsaureanhydrid versetzt und für 1 Std.
unter gelegentlichem Schwenken stehen gelassen. Nach Abfiltrieren und
Waschen mit 20 ml MeOH und 15 ml Ether erhielt man 277 mg mit dem
geschützten Allo-iso-Guanosin Nucleosid derivatisiertes CPG 63 mit einer
Beladungsdichte von 25.0 umol/g CPG.
-237- experimenteller Teil
D.9.12 9-(ß-D-AUopyranosyl)isoguanin
HON
I OH N^NHO TT
Cl
51
/=t
I OH N^,N ^^
xX)
HON
H0^YVH!1 OH HN^,N
HO V
O
65
Man rührte 10 ml Benzylalkohol und 231.6 mg (10.1 mmol) Natrium für 45
min. bei 65°C, bis die Benzylatbildung abgeschlossen war. Darauf wurde 504mg
(1.52 mmol) 51 zugegeben und für 3.5 Std. bei 65°C gerührt. Man trug das ganze
Reaktionsgemisch auf 60 g Kieselgel, das zuvor mit CHCI3: MeOH = 9:1
equilibriert worden war, auf und eluierte mit CHCI3: MeOH = 9:1 (300 ml),
CHCI3: MeOH = 4:1 (500 ml), CHCI3: MeOH = 2:1 (250 ml) und MeOH (150 ml),
was nach Trocknen am HV bei RT für 16 Std. 106 mg 64 ergab.
Man suspendierte 66.7 mg Pd/C in 10 ml H2O : EtOH = 1:5, evakuierte am
Hausvakuum und füllte den Kolben mit Argon. Dieses Vorgehen wurde drei
Mal wiederholt. Darauf wurde drei Mal evakuiert und der Kolben mit H2 gefüllt.Zu diesem aktivierten Katalysator gab man 100 mg (255 nmol) 64, gelöst in 2.5 ml
H20 : EtOH = 1:5 und rührte für 3 Std. bei RT unter H2. Man filtrierte durch
Cellite, wusch mit 20 ml H2O : EtOH =1:5 nach und engte am RV ein. Der
Rückstand wurde in 35 ml MeOH gelöst, wieder auf 15 ml eingeengt und bei 2°C
für 16 Std. auskristallisieren gelassen. Abzentrifugieren des Präzipitats lieferte
10.8 mg (2% über beide Stufen) DC und *H-NMR reines 65, das noch 4.5 Eq H20
enthielt.
-238- experimenteller Teil
Anlytische Daten:
DC
UV
IR
IH-NMR
«C-NMR
Rf = 0.42, (Kieselgel/n-BuOH: H20: AcOH = 5:3:1)
(150 mM NaCl, 10 mM TrisHCl, pH 7): 246 (9600), 292 (11600), 230
(4200), 240 (7700), 250 (8900), 260 (4200), 270 (3800), 280 (7700), 290
(11250), 300 (9300), 310 (2500)
(KBr): 3600-2500vs, 1680 vs, 1620vs, 1530s, 1480m, 1400s, 1220m, 1110s,
990vs, 920w, 820w, 770w, 690w
(400 MHz, DMSO-d6): 3.45 (d, J=6.4,2H, H-C(6')), 3.64-3.72 (m, 2H, H-
C(4'/5')), 4.00-4.01 (m, 2H, H-C(2'/3')), 4.54* (br., IH, HO-C(6')), 4.83*
(br. IH, HO-C(4')), 5.08* (br., IH, HO-C(2')), 5.18* (br., IH, HO-C(3')),
5.52 (d, J=9.4, IH, H-C(l')), 7.66 (br., 2H, H-N(6)), 7.92 (s, IH, H-C(8))
(100 MHz, DMSO-d6): 60.9 (t, C(6')), 67.0, 68.5, 71.4 (3d, C(273'/4'))
76.2, 78.5 (d, C(l'/5')), Die 13C-Signale der Base erschienen nur als
sehr bereiter Peak um 137 ppm
i i i i i i
120 110 100
W
i '-".
T HU*"
I I 1 I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I
90 80 70 60 50 40 30 20 10 00 ppm
Abbildung D9.12: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d') von 65
min.
0-30
von
ist,
angegeben
anderes
nicht
wenn
immer,
gelt
enGradienten
angegebenen
Die
1
iOnCL-
3CCTQ
nnXo
n>
N=10900
min.
20.9/0.2B)
(8-26%
B)
(27-45%
DEAE
d(AT)6
1—1
tuer
N=770
min.
13.9/0.5B)
(7-25%
N=830
min.
20.2/0.7
B)
(15-35%
B)
(25-45%
DEAE
d(AT)s
HN=1640
min.
16.2/0.4B)
(7-25%
N=610
min.
19.8/0.8
B)
(15-35%
B)
(20-40%
DEAE
d(AT)4
Qu
o
N=6800
min.
24.8/0.3B)
(5-20%
N=460
min.
17.2/0.8
B)
(10-30%
B)
(15-35%
DEAE
d(AT)j
>—i
C3
5')
für
B95%
1'in
B60-95%
22'
in
B(50-60%
B)
(8-26%
RP-300
Aquapore
d(AC)6
N=480
min.
10.9/0.5B)
(7-25%
N=780
min.
25.1/0.9
B)
(40-60%
B)
(8-26%
RP-300
Aquapore
d(AC)5
N=1120
min.
13.4/0.4B)
(7-24%
N=780
min.
25.1/0.9
B)
(25-45%
B)
(7-25%
RP-300
Aquapore
d(AC)4
N=2500
min.
20.0/0.4B)
(6-24%
N=2680
min.
20.7/0.4
B)
(20-40%
B)
(6-24%
RP-300
Aquapore
d(AC)3
um1
C-18,10
Ä,
300
Sphe
riso
rbKo
ntro
llin
jekt
ion
RP-3001
Aquapore
tion
Kont
roll
inje
k¬Q1
Mono
tion
Kontrollinjek¬
Nucleogen1
DEAE
tion
Kont
roll
inje
k¬
min.)1
30
in
(Gradient
Trennung
präp
.Substanz
N=940
min.
9.2/0.3
B)
(12-20%
N=1070
min.
26.2/0.8
B)(12-32%
B)(12-32%
DEAE
d(AGTATGTD
N=860
min.
17.5/0.6
B)(15-32%
B)
(25-45%
DEAE
d(AACATACT)
N=1050
min.
19.4/0.6
B)
(22-37%
B)
(25-40%Q
Mono
d(CA)s
N=950
min.
21.6/0.7
B)
(17-32%
35')
in
B(17-32%Q
Mono
d(CA)s
N=940
min.
18.4
/0.6
B)
(15-30%
B)
(18-38%
DEAE
d(CA)4
N=3060
min.
16.6/0.3B)
(6-24%
N=2870
min.
21.4/0.4
B)(20-40%
B)
(6-24%
RP-300
Aquapore
d(CA)3
N=5400
min.
29.4/0.4B)
(7-25%
N=770
min.
24.9/0.9
B)(25-45%
B)(25-45%
DEAE
d(AU)6
N=2760
min.
21.0/0.4B)
(7-25%
N=670
min.
20.7/0.8
B)
(25-45%
B)(25-45%
DEAE
d(AU)5
N=720
min.
13.4/0.5B)
(7-25%
N=370
min.
13.4/0.7
B)(25-45%
B)
(25-45%
DEAE
d(AU)4
N=640
min.
15.2/0.6
B)(15-35%
B)(15-35%
DEAE
d(AU)3
N=1430
min.
15.1/0.4
B)
(10-28%
N=80
min.
12.4/1.4
B)(25-45%
B)
(10-28%
RP-300
AquaporeB)
(40-60%
DEAE
dd(AC)5
N=2740
min.
15.7/0.3B)
(8-26%
N=560
min.
9.5/0.4
B)
(20-40%
B)
(33-53%
DEAE
dd(AC)4
N=3890
min.
18.7/0.3
B)
(20-40%
B)
(7-25%
RP-300
Aquapore
dd(AC)3
N=1600
min.
16.0/0.4
B)
(10-28%
min.
26.5/0.9
5')
in
B95-100%
10*
in
B60-95%
20'
in
B(40-60%
5')
in
B95-100%
10'
in
B60-95%
20"
in
B(40-60%
DEAE
B)
(10-28%
RP-300
Aquapore
dd(AsC5)
N=3080
min.
22.2/0.4B)
(8-26%
N=2300
min.
24.0/0.5B)
(8-26%
N=730
min.
24.3/0.9
B)
(28-58%
B)
(8-26%
Spherisorb
ddtAtQ)
N=6030
min.
23.3/0.3B)
(0-20%
N=18500
min.
27.2/0.2B)
(0-20%
B)
(0-20%
Spherisorb
dd(T6)
N=6170
min.
31.3/0.4B)
(0-20%
B)(0-20%
Spherisorb
dd(A«)
N=850
min.
26.2/0.9
B)(12-32%
B)
(12-32%
DEAE
dOTGTATGA)
N=990
min.
37.8/1.2
45')
in
B(10-25%
N=1200
min.
49.0/1.4
30')
in
B15-45%
15'
in
B(0-25%
B)
(40-60%
DEAE
dd(AU)«
N=8600
27.8/0.3
B)
(10-25%
45")
in
B(10-25%
RP-300
dd(AU)5
N=7600
min.
26.2/0.3
B)
(10-20%
B)
(10-20%
RP-300
dd(AU)4
N=8300
min.
27.3/0.3B)
(5-20%
N=4600
min.
20.4/0.3
B)(10-20%
B)
(10-20%
DEAE
dd(AU)3
N=3100
min
16.7/0.3
B)
(12-30%
N=680
min.
18.2/0.7
45')
in
B(35-55%
45')
in
B(30-57%Q
Mono
dd(AT)t
B)
(31-51%
DEAE
dd(AT)5
N=5700
min.
30.2/0.4
B)
(10-28%
B)
(22-42%
DEAE
dd(AT)4
N=6400
min.
32.0/0.4B)
(8-26%
B)
(16-36%
DEAE
dd(AT)3
N=1010
min.
12.7/0.4
B)
(12-30%
N=870
min.
29.5/1.0
5')
für
B95%
1'in
B60-95%
22'
in
B(50-60%
B)
(12-30%
RP-300
AquaporeB)
(50-70%
DEAE
dd(AC)«
N=3200
min.
22.8/0.4
B)
(12-20%
B)
(12-32%
DEAE
dd(AACATACT)
N=740
min.
19.1/0.7B)
(8-26%
N=460
min.
23.6/1.1
5')
in
B95-100%
10'
in
B60-95%
20'
in
B(40-60%
5')
in
B95-100%
10'
in
B60-95%
20'
in
B(40-60%
DEAE
dd(AACCCAAAA)
N=3080
min.
22.2/0.4B)
(8-26%
N=1180
min.
24.0/0.7
5')
in
B95-100%
10'
in
B60-95%
20'
in
B(40-60%
5')
in
B95-100%
10'
in
B60-95%
20'
in
B(40-60%
DEAE
dd(AAAACCCAA)
min.
tR=37
B)
(7-25%
9')
für
B95%
5'in
B60-95%
20'
in
B(50-60%
DEAE
B)
(12-30%
RP-300
Aquapore
dd(CA)6
N=4440
min.
20.0/0.3B)
(8-26%
N=220
min.
29.6/2.0
B)
(15-35%
B)
(30-50%
DEAE
dd(CA)5
N=3760
min.
18.4/0.3B)
(7-25%
N=470
min.
19.6/0.9
B)
(15-35%
B)
(28-48%
DEAE
dd(CA)4
N=2050
min.
18.1/0.4B)
(7-25%
N=1330
min.
21.9/0.6
B)
(20-40%
B)
(20-40%
DEAE
dd(CA)3
N=14600
min.
24.2/0.2B)
(4-32%
N=6830
min.
24.8/0.3
B)
(10-30%
N=3140
min.
16.8/0.3B)
(0-90%
B)
(4-32%
Spherisorb
dd(7CHA3-A3)
N=5700
min.
15.1/0.2B)
(0-20%
N=250
min.
18.9/1.2
B)(14-80%
25')
in
B10-17%
5'in
B(0-10%
RP-300
Aquapore
dd(7CHAj-A)
N=8400
min.
27.5/0.3B)
(0-25%
B)(5-25%
Sphe
riso
rbdd(aT-aA)3
N=7200
min.
25.5/0.3B)
(0-25%
B)
(5-25%
Sphe
riso
rbdd(aTs)
N=4900
min.
35.0/0.5
45')
in
B(0-25%
45')
in
B(5-25%
RP-300
Aquapore
dd(oA6>
N=7500
min.
34.6/0.4
45')
in
B(5-25%
40')
in
B(5-25%
RP-300
Aquapore
dd(oA5)
B)
(20-60%Q
Mono
ddttTGATGA)
B)
(20-60%Q
Mono
dd(AGTAGTD
B)
(20-50%Q
Mono
dd(AACTACD
N=4500
min.
20.2/0.3
B)
(12-20%
N=870
min.
23.6/0.8
B)(12-32%
B)
(12-32%
DEAE
ddOTGTATGA)
N=4800
min.
20.8/0.3
B)
(12-20%
N=650
min.
25.4/1.0
B)(12-32%
B)
(12-32%
DEAE
dd(AGTATGTT)
Keta
lspa
ltun
gNach
2
Ammonolyse
und
Allylentschützung
Nach
1
N=1750
min.
16.7/0.4B)
(0-25%
N=1200
min.
13.9/0.4B)
(0-25%
N=3300
min.
23.0/0.4
B)(15-55%
B)
(0-25%
Spherisorb
2
B)
(0-30%
Spherisorb
1al
lo(G
I)4
N=3140
min.
16.8/0.3B)
(0-25%
N=2180
min.
14.0/0.3B)
(0-25%
N=1470
min.
23.0/0.6
B)
(15-55%
B)
(0-25%
Spherisorb
2
B)
(0-30%
Spherisorb
1allo(G
4l4)
N=590
min.
14.6/0.6B)
(0-25%
Zersetzung
N=390
min.
23.7/1.2
B)
(20-45%
B)
(0-25%
Spherisorb
2
B)
(0-30%
Spherisorb
1al
lo(I
g)
N=1330
min.
14.6/=0.4B)
(0-25%
N=660
min.
12.8/0.5B)
(0-25%
N=1460
min.
15.3/0.4
B)
(15-55%
B)
(0-28%
Spherisorb
2
B)
(0-28%
Spherisorb
1al
lo(I
6)
N=5040
min.
21.3/0.3B)
(4-32%
N=2120
min.
13.8/0.3
B)
(15-30%
N=3250
min.
22.8/0.4B)
(0-90%
B)
(4-32%
Spherisorb
dd(7A-G)3
N=5530
min.
22.3/0.3B)
(8-26%
N=4270
min.
19.6/0.3B)
(0-90%
B)
(8-26%
Sphe
riso
rbdd(7CHA-C)6
N=6120
min.
31.3/0.4B)
(0-20%
B)
(0-20%
Spherisorb
dd(7CHA-A)3
S.H•iff*§E3n>33.
TJxn
I&1
N=6080
min.
15.6/0.2B)
(0-27%
N=3480
min.
12.4/0.2B)
(0-27%
N=5930
min.
15.4/0.2
B)(0-30%
N=4030
min.
12.7/0.2B)
(0-27%
N=540
min.
16.2/0.7
B)
(20-45%
N=710
min.
16.0/0.6
B)
(20-45%
B)
(0-27%
Spherisorb
2
B)
(0-27%
Spherisorb
1
B)
(0-30%
Spherisorb
2
B)
(0-30%
Spherisorb
1
alloÜTGIGG)
aüo(GGIGII)
T3
4.0
pH
AcONa,
mM
10
NaCl,
mM
2150
35
pH
AcONa,
mM
10
NaCl,
mM
!l50
»«
nm)
260
H,
%-
uM,
(73
-
d(CA)5
ög
nm)
260
H,
%-
|iM,
(120
-
d(CA)4
nm)
260
H,
%-
uM,
(100
-
d(CA)3
-5.6
aG°
-46.9,
TaS
AS-158,
AH-52.5,
nm)
260
H,
30%
uM,
(63
24°C
d(AU)6
9*
nm)
260
H,
30%
uM,
(125
16°C
d(AU)5
nm)
260
H,
%-
uM,
(100
<10°C
d(AU)4
n3
sr
önm)
260
H,
%-
uM,
(140
<0°C
d(AU)3
3ff*»
-6.7
AG0
-58.5,
TaS
-200
,AS
-65.2,
AH
nm)
260
H,
35%
uM,
(74
29°C
d(AT)6
nm)
260
H,
30%
uM,
(83
23°C
d(AT)s
nm)
260
H,
25%
uM,
(127
17°C
d(AT)4
nO
nm)
260
H,
%-
uM,
(58
<0°C
d(AT)3
srsRHM•
nm)
260
H,
%-
uM,
(43.3
-PH4.02:
nm)
260
H,
%-
uM,
(6.7
-PH3.51:
nm)
260
H,
%-
uM,
(8.4
-
7.0:
pH
d(AC)6
0nm)
260
H,
%-
uM,
(8.5
-
d(AC)s
nm)
260
H,
-%
uM,
(8.3
-
d(AC)4
nm)
260
H,
-%
uM,
(9.1
-
d(AC)3
Temp
.[°C
]/conc,
(Wel
lenl
änge
)
Molton-1]
[grad
(0)
CD-Daten
[calK-lmol-1]
AS[kca
lmol
"!],aG°(25°C)
TaS,
AH,
Daten
Thermodynamische
Wellenlänge)Hyperchrom.,
%(conc,
Tm
Schmelzdaten
Substanz
nm)
260
H,
14%
uM,
(8.4
20°C
dd(AC)5
nm)
260
H,
%-
üM,
(11.
1<20°C
dd(AC)4
nm)
260
H,
%-
uM,
(6.6
<0°C
dd(AC)3
288(281)
-168(257)/7.8uM,5°C
nm)
260
H,
8%
fiM,
(7.2
35°C
dd(A5C5)
(277
)+152
-127(254)/8.6uM,5°C
nm)
262
H,
5%
uM,
(10.3
16°C
ddtAjC,)
nm)
260
H,
%-
uM,
(12
-
dd(T6)
(276
)+273
-185(252)/13.8uM,5°C
-9.2
AG
-30.2,
TaS
-101
,aS
-39.4,
AH
nm)
260
H,
7%
uM,
(9.5
43°C
dd(A«)
nm)
260
H,
%-
uM,
5.5
(je
-
ddOTGTATGA)+
d(AACATACT)
nm)
260
H,
%-
uM,
4.5
(je
-
dd(AGTATGTD+
d(AACATACT)
nm)
260
H,
%-
uM,
4.6
(je
-
dfTTGTATGA)
+d(AACATACT)
-7.7
AG°
-43.6,
TaS
-146
,AS
-51.3,
AH
nm)
260
H,
25%
uM,
5.0
(je
22°C
d(AGTATGTD
+d(AACATACT)
nm)
260
H,
%-
uM,
(10.2
-dCTTGTATGA)
nm)
260
H,
%-
uM,
(9.2
-
d(AGTATGTT)
nm)
260
H,
%-
UM,
(8.9
-d(AACATACT)
nm)
260
H,
%-
[iM,
(76
-
d(CA)6
9.0
pH
Tris-HCl,
mM
10
NaQ,
mM
6150
8.0
pH
Tris-HCl,
mM
10
NaQ,
mM
5150
6.0
pH
NaCacodylat,
mM
10
NaCl,
mM
4150
5.0
pH
AcONa,
mM
10
NaCl,
mM
3150
4.0
pH
AcONa,
mM
10
NaQ,
mM
2150
35
pH
NaFormiat,
mM
10
NaQ,
mM
H50
-10.1
aG°
-41.
1,TaS
-138,
aS
-51.
2,aH
nm)
260
H,
20%
UM,
(80
54°C
dd(AU)6
nm)
260
H,
20%
uM,
(78
43°C
dd(AU)5
nm)
260
H,
20%
UM,
(97
32°C
dd(AU)4
nm)
260
H,
20%
uM,
(153
20°C
dd(AU)3
-13.0
AG°
-47.
3,TaS
-159,
AS
-60.3,
AH
nm)
260
H,
25%
uM,
(53
67°C
dd(AT)«
nm)
260
H,
24%
uM,
(66
56°C
dd(AT)5
nm)
260
H,
24%
uM,
(100
45°C
dd(AT)4
nm)
260
H,
20%
UM,
(51
26°C
dd(AT)3
(272
)-246(2
53)
-72
-264(228)/7.2uM,5°C
-7.8
AG°
-53.3,
TAS
-180,
AS
-61.
6,AH
nm)
260
H,
11%
uM,
(8.1
31°C
PH9.06:
nm)
260
H,
13%
uM,
(8.1
28°C
pH&O5:
nm)
260
H,
13%
uM,
(8.1
28°C7.
0:pH
nm)
260
H,
12%
UM,
(7.7
28°C
pHÖ.O4:
nm)
260
H,
11%
jiM,
(7.2
23°C
PH5.03:
nm)
260
H',
"19%
uM,
(3.4
-PH4.02:
nm)
260
H",
'50%
uM,
(5.4
-PH3.51:
dd(AC)6
MNaQ)
1.5
nm,
260
H,
%-
uM,
(14.3
-
nm)
260
H,
%-
uM,
(7.3
-
dd(aT-aA)3
nm)
260
H,
%-
uM,
(8.8
-
dd(ccA6)
nm)
260
uM,-%H,
(11.5
-
dd(aAs)
nm)
260
H,
%-
uM,
5.0
(je
-
ddOTGATGA)
+dd(AACTACT)
nm)
260
H,
18%
uM,
5.0
(je
42°C
dd(AGTAGTD
+dd(AACTACD
260nm)
H,
15%
uM,
(9.7
20°C
ddOTGATGA)
nm)
260
H,
6%
uM,
(9.3
17°C
dd(AGTAGTT)
nm)
260
H,
%-
uM,
(10.
1-
dd(AACTACD
nm)
260
H,
18%
uM,
4.8
(je
38°C
ddOTGTATGA)
+dd(AACATACT)
-10.8
AG°
-31.6,
TaS
-106,
AS
-42.4,
AH
nm)
260
H,
19%
uM,
4.8
(je
48°C
dd(AGTATGTT)
+dd(AACATACT)
nm)
260
H,
%-
uM,
(8.9
-ddOTGTATGA)
nm)
260
H,
%-
uM,
(9.2
-dd(AGTATGTT)
-357(274)/12.1uM,5°C
nm)
260
H,
14%
uM,
(8.9
20°C
dd(AACATACT)
+60(277)
-127(255)/je5.3uM,5°C
nm)
260
H,
9%
uM,
5.1
(je
28°C
dd(AACCCAAAA)
+dd(AAAACCCAA)
(279
)+94
-309(255)/6.8uM,5°C
nm)
260
H,
%-
uM,
(9.6
<20°C
dd(AACCCAAAA)
(282
)+92
-184(257)/10.7uM,5°C
nm)
260
H,
%-
uM,
(9.4
<20°C
dd(AAAACCCAA)
-7.9
aG°
-45.1,
TaS
-151,
AS
-53.0,
AH
nm)
260
H,
16%
uM,
(8.3
29°C
dd(CA)6
nm)
260
H,
16%
uM,
(8.1
19°C
dd(CA)5
nm)
260
H,
%-
uM,
(6.4
<20°C
dd(CA)4
nm)
260
H,
%-
uM,
(6.3
<0°C
dd(CA)3
(312
)+90
(292
)-390
5°C
uM,
(258
)/6.
1+49
nm)
292
H,
18%
uM,
(8.7
29°C
allo(Ig)
nm)
292
H,
30%
uM,
(12.7
15°C
allo(I6)
-85(253)/je5.0uM,75°C
-68(283)
(278
)-48
55°C
uM,
5.0
/je
(247
)-116
(298
)+34
(283
)-17
(271
)+24
-174(252)/je5.0uM,3°C
reversibel
nm)
265
H,
7/6%
uM,
6.0
(je
21°/63°C
dd(I
6)+
dd(G6)
+dd(7CHA)s-A
-66(286)
(268
)-10
-71(232)/10.0uM,5°C
nm)
260
H,
%-
uM,
(14.4
<20°C
dd(7^"A-G)3
nm)
260
H,
%-
uM,
(8.0
-
dd(7CHA-C)s
-87(260)/23.3uM,5°C
nm)
260
H,
5%
uM,
(140
18°C
dd(7A-A)3
(208
)+117
(255
)-160
uM
(283)/19.0
62
+nm)
260
H,
3%
uM,
(17
32°C
dd(7tHA3-A3)
(290
)-141(2
44)
-22
5°C
uM,
11.7
(223
)/je
-177
nm)
260
H,
26%
uM,
8.8
(je
23°C
ddOe)
+dd(7A5-A)
(286
)+105
5°C
uM,
12.9
(261
)/je
-158
nm)
260
H,
5%
uM,
7.0
(je
44°C
dd(Aj)
+dd(7A5-A)
(280
)-74
(240
)-13
-61(215)/13.1uM,5°C
nm)
260
H,
%-
uM,
(18.8
-
dd(7CHA5-A)
nm)
260
H,
%-
uM,
5(j
e-
dd(ßT6)
+dd(aA6)
nm)
260
H,
%-
uM,
10
(je
-
dd(aT6)
+dd(oA«)
3.82
pH
NaCitrat,
mM
10
NaQ,
mM
J150
(302
)-175
3°C
uM,
4.6
/je
(264)
+65
nm)
248
H,
%-
uM,
4.1
(je
8°C
allo(IIGIGG)+
allo(GGIGII)
(303
)-199
3°C
uM,
(264
)/9.
1+65
nm)
248
H,
%-
uM,
(9.4
-5°C
alloüTGIGG)
(302)
-174
3°C
uM,
(264)/9.1
+41
nm)
248
H,
%-
UM,
(9.6
8°C
aUo(GGIGID
(304
)-75
(260
)+49
-27(240)/10.0uM,5°C
nm)
270
H,
20%
uM,
(9.6
17°C
allo
(GI)
4
(302
)-411
(268)
+159
-56(248)/9.9uM,5°C
PH3.
821:
(304
)-381
(267)
+110(2
50)
-38
5°C
uM,
(234)/9.8
+34
nm)
250
H.,
26%
uM,
(9.0
547°C
PH3.821:
0.5°C/min.)
nm,
250
H,
-58%
uM,
(10.
129.6°C
Hybridisieren:
nm,0.5°C/min.)
250
H,
58%
uM,
(10.1
40°C
Schmelzen:
allo
(G4I
4)
nm)
250
H,
-35%
uM,
3.64
OTotalkonz.
36°C
Hybr
idis
iere
n:
nm)
250
H,
12/8%
uM,
3.64
(Totalkonz.
39/81°C
Schmelzen:
l:2
=aUo(Ig)
+al
lo(G8)
nm)
250
H,
-23%
uM,
3.64
(Totalkonz.
37°C
Hybr
idis
iere
n:
nm)
250
H,
3/20%
uM,
3.64
(Totalkonz.
-/82°C
Schmelzen:
aüo(I»)=2:l
+allo(G
g)
(291
)-212
+34(265)/jel.3uM,55°C
(290
)-327
5°C
uM,
1.3
(264
)/je
+92
nm)
250
H,
39%
-
uM,
1.94
(je
35°C
Hybr
idis
iere
n:
nm)
250
H,
11/20%
uM,
1.94
(je
36/82°C
Schmelzen:
1:1
=allodg)
+al
lo(G
8)
-253- experimenteller Teil
D.12 Bemerkungen zur Nomenklatur
7-Carbaadenin wird von anderen Autoren (z.B. Seela) als 7-Deazaadenin
bezeichnet. Seela benutzte auch häufig, neben der Purinnomenklatur, die auch
von Davoll verwendete systematische Nomenklatur, die sich neben der
Namensgebung vor allem auch in der Numerierung der Ringatome
unterscheidet:
Purinnomenklatur systematische Nomenklatur
(Pyrrolo[2,3-d]pyrimidin)
Die in dieser Arbeit verwendete Nomenklatur hält sich an die von der RJPAC-
IUB Komission empfohlenen Richtlinien [101], [102], [103].
-254-
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for Carbohydrate Nomenclature, Eur. J. Biochem., 1971,21,455
Curriculum Vitae
1964 Geboren am 17. September 1964 in Zürich als das jüngere von
zwei Kindern des Alfred und der Marie Giger - Bircher
1971 -1977 Besuch der Primarschule in Dietikon
1977 - 1983 Besuch der Kantonsschule Limmattal in Urdorf und Abschluss
mit der Matura Typus B
1984 -1988 Studium an der Abteilung für Chemie an der ETH Zürich,
Diplomabschluss November 1988
seit Nov. 1988 Promotionsarbeit am Laboratorium für org. Chemie an der
ETH Zürich unter der Leitung von Prof. Dr. A. Eschenmoser
seit Okt. 1990 Praktikumsassistent
1991 Heirat mit Andrea Neumann am 10. August 1991
Zürich, im November 1992 Alfred Giger