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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI
Materia de Articulación CEBI-E5
BIOCATÁLISIS APLICADA
Docente a cargo: Dra. Cristina dos Santos [email protected]
CEBI- E5-2 : Cinética de los biocatalizadores/Estabilidad Enzimas/Inactivación enzimas/Métodos de estabilización
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macromoléculas multifuncionales.
proteínas formadas por los 21 aa(raramente AA como la selenocisteínaformada por reacción enzimática de deshidrogenasas o la glutation peroxidasa)
forman cadenas lineales de AA unidas porpuentes S-S de las cisteínas
se estabilizan con los sustratos porinteracciones no covalentes o covalentestransitorias que actuan sinérgicamente(solo se desestabiliza el complejo E-S porfuerzas coulómbicas de igual signo)
- La energía libre de Gibbs formación de los complejos es levemente negativa (ΔG).
ENZIMAS
Otras proteínas que no son enzimaspueden catalizar reacciones: anticuerpos catalíticos o las ribozimas
Existen muchas proteínas sin funcionescatalíticas:
Ej.Transporte de oxígeno (hemoglobin y mioglobina)
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CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES
Clase 1….Estabilidad de enzimas
Un biocatalizador puede ser caracterizado por:
1. Actividad: productividad
2. Estabilidad: condiciones de operación, vida útil
3. Selectividad: frente a reacciones no deseadas
La estabilidad de la enzima afecta la velocidad de la reacción.
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CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
Velocidad dela reacción catalizada depende de…
TEMPERATURA
pH
INHIBIDORES
Competitivos
No competitivos
Acompetitivos
SUSTRATO
AGENTES DESNATURALIZANTES
ALMACENAMIENTO
COFACTORES
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ENZIMAS: ESTRUCTURA QUÍMICA
TIPOS ENZIMAS
PROTEÍNAS SIMPLES
Solo aminoácidos
PROTEÍNAS CONJUGADAS
Heterogéneas
APOENZIMA`
(parte proteíca)
COFACTOR
(COMPONENTE NO PROTEÍCO)
ORGÁNICOS
COENZIMAS
Unión no covalenteGRUPO PROSTÉTICO
Unión covalente
INORGÁNICOS
Cationes Metálicos Zn2+ Cu2+Ca2+ Fe2+ Mg2+
INACTIVA SIN
COFACTOR
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ENZIMAS: ESTRUCTURA QUÍMICA
GRUPO PROSTÉTICO
Es un grupo unido covalentemente unido a la proteína y coordinado a algún ión metálico.
Metal-enzimas.
carboxipeptidasa
Nitratoreductasa
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TIPOS DE ENZIMASEjemplos de enzimas que requieren
Iones metálicos como cofactores Coenzimas
Coenzimas Enzima
Pirofosfato de tiamina Piruvato deshidrogenasa
Flavin adenin nucléotido Monoaminooxidasa
Nicotiadenin nucleótido NAD
Lactato deshidrogenasa
Coenzima A AcetilCodescarboxilasa
Biotina Piruvatodescarboxilasa
Cofactor Enzima
Fe(II) o Fe(III) Citocromo oxidasaCatalasaPeroxidasa
Zn(II) Anhidrasa carbónicaCarboxipeptidasas
Ni(II) Ureasa
Mn(II) Superoxidodismutasa
Mg(II) HexoquinasasGlucosa-6-fosfatasa
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CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES
Estabilidad térmica caracterizada por Tm
Temperatura del equilibrio entre 50%proteína nativa y 50% desnaturalizada
Depende de -AA de la proteína-puentes S-S-Solvente-presencia de sales (Tm= To+K.[S])
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: TEMPERATURA
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CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: TEMPERATURA
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Grupos químicos ionizables presentes en las proteínas (-COOH;-NH2; -SH ) Estabilidad al pH depende de la composición de AA de la proteína.
CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS : pH
No polares
Polares
BásicosÁcidos
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CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS : pH
• pH óptimo= pH en el cual la actividad catalítica es máxima depende depende de las interacciones entre sustrato y enzima necesarias para dar el producto.
• Depende de cada enzima y reacción catalizada
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CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: Agentes desnaturalizantes
AGENTES DESNATURALIZANTES
Ácidos y bases fuertes (ΔpH)
Solventes orgánicos
Agente reductores urea y beta-mercaptoetanol.
Sales
Iones metálicos (Hg(II); Pb(II)
Agresión mecánica
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CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES
pHOP
Temperatura TOP
Concentración cofactoresEstabilidad en el tiempo durante el almacenamiento puede expresarse como un decaimiento de 1ªorden
[E]t = [E]0 exp(–kd · t)
[E]t y [E]0 son la concentración de enzima en el tiempo t e inicial y kd es la constante de velocidad de desactivación
Kd determinada a partir de factores estadístico
Boltzmann
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: Tiempo almacenamiento
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: Tiempo almacenamiento
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: Tiempo almacenamiento
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CINÉTICA DE REACCIÓN
MM supone que existen 3 pasos elementales1ª formación del complejo E-S y esto se plantea como un equilibrio2ª disociación del complejo3ª formación irreversible del P (paso limitante)
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: SUSTRATO
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CINÉTICA DE REACCIÓN
MM supone que existen 3 pasos elementales1ª formación del complejo E-S y esto se plantea como un equilibrio2ª disociación del complejo3ª formación irreversible del P (paso limitante)
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: SUSTRATO
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Una solución contiene una solution contiene inicialmente unacantidad de enzima (KM = 1.5 mM). La concentración de sustratoincial es 0.25 M y no hay product. Después de 45 s, la solucióntiene una concentración de product de 25 µM.Hallar Vmax y laconcentración de producto después de 2,0 minutos.Considerar condición de sustrato saturante.¿Cuál es el grado de conversión del sustrato después de 2 minutos?
Ejemplo cálculos…
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Suponer que como S es mayor que Km sigue condición sustrato saturante
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No cumplen MyMENZIMAS ALOSTÉRICAS O COOPERATIVAS
• Tienen más de un sitio de unión para el substrato y la unión de una molécula facilita la de las posteriores.
n: coeficiente de
cooperación; n > 1
indica cooperación
positiva
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• REVERSIBLES: la enzima recupera su actividad al eliminarlos.
• IRREVERSIBLES: la enzima continúa inhibida
• REVERSIBLESCompetitivos
No-competitivos
Acompetitivos
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES
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• Interactúa con algún grupo esencial de la enzima, formando un complejo E-I.
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES COMPETITIVOS
INHIBIDOR COMPETITIVO reacciona en el sitio activo del sustrato.Afecta Km no la Vmax
INHIBIDOR COMPETITIVO reacciona en el sitio activo del sustrato.Afecta Km no la Vmax
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En este tipo de
inhibidores, se incluyen
sustancias
estructuralmente muy
parecidas al substrato
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES COMPETITIVOS
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FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES NO COMPETITIVOS
• El inhibidor se une en otro sitio. El substrato aún puede unirse a la enzima y formarse un complejo E-S-I, catalíticamente inactivo y el complejo E-I.
Se definen dos constantes:
• Si KI1= KI2inhibición no-competitiva pura.
• Si KI1≠ KI2inhibición parcialmente competitiva o mixta
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FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES NO COMPETITIVOS PUROS
INHIBIDOR COMPETITIVO reacciona en el sitio activo del sustrato.Afecta Km no la Vmax
INHIBIDOR NO COMPETITIVONo afecta Km si afecta la Vmax
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• El inhibidor se une al complejo E-S para dar un complejo E-S-I incapaz de transformarse en productos.
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES ACOMPETITIVOS
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Varía tanto Vmax (↓) como Km
(↓) aumenta la afinidad por estabilización del complejo al formarse [E-S-I] según:
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES ACOMPETITIVOS
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• Altas [S] pueden causar inhibición de algunas reacciones enzimáticas.
La [S] que hace máxima la velocidad
de reacción se determina evaluando
dr/d[S] = 0, con lo cual:
Cte de inhibición
que depende del
sustrato.
FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBICIÓN POR SUSTRATO
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RESUMEN
• Las reacciones catalizadas por enzimas tienen una cinética de acuerdo al modelo de M-M.
• Algunas sustancias presentes en el medio de reacción, pueden tener un efecto inhibitorio del tipo:
• Competitivo
• No Competitivo
• Acompetitiva.
• A veces es el propio sustrato de la reacción el que inhibe.
• Algunas enzimas no siguen M-M y deben ajustarse a otros modelos empíricos. Uno de los más habituales es el comportamiento alostérico.
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MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
El proceso de catálisis tiene lugar al exponerse residuos de aaespecíficos de la enzima al sustrato. La alta especificidad depende de la forma, tamaño de la región de la enzima llamada sitio activo y de las propiedades de los aa en la misma.
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MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
-interacciones no covalentes -reacciones ácido base -uniones covalentes transitorias-reacciones nucleofílicas-reacciones electrofílicas-reacciones de oxidoreduccionde cofactores
MECANISMOS DE CATÁLISIS
1. Catálisis ácido base2. Catálisis covalente3. Catálisis íón metálica4. Catálisis por efectos de proximidad5. Catálisis por efectos deorientación6. Catálisis por unión preferencial en el
estado de transición
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MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
1.CATÁLISIS ÁCIDO BASE
Las enzimas trasfieren un protón desde o hacia el sustrato,
provocando ruptura de un enlace covalente
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MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
2. CATÁLISIS COVALENTEC
OV
ALE
NTE
Ataque Nucleofílico(dador de electrones) o electrofílico(aceptor electrones) del centro activo de la enzima sobre el sustrato
Estado transitorio por enlace covalente inestable
Ruptura enlace covalente liberación del
producto
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MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
Ejemplo: Hidrólisis de proteínasQuimotripsina (proteasa)
MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
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MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
2. CATÁLISIS COVALENTE
CO
VA
LEN
TE Enzimas denominadas SERINA proteasas
Utilizan el grupo CH2OH de la serinacomo nucleófilo para hidrolizar enlaces peptídicotris.
Ej. enzimas tripsina y quimiotripsina
Grupo HO de la Serina
Grupo imidazol de la Histidina
Grupo SH de la Cisteína
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Paso 1: Sustrato (PP ) se introduce en sitioactivo (SA) de la quimotripsina (QT).Se traslada H+de Ser-195 a His-57 y se forma C=O
Paso 2: q+ de His-57 se neutraliza con la q- del áciaspártico (Asp-102). CuandoC=O se forma en el PP, se rompe la C-N. El grupo con N se estabiliza unido a H de His-57.
Paso 3:la porción de PP con el N se mueve fuera del SA.
MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS2. CATÁLISIS COVALENTEEjemplo Quimotripsina
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.
Paso 4: H2O ingresaSA.O del agua cede H+ al N de His-57 y se une al C del PP. Se rompe C=O
Paso 5: se rompe C-O con Ser-195y se restablece elO-H de la serina.Ser-195 y His-57 vuelven a su conformación original.
Paso 6: la porción de PP con El O-H sale del SA.La QT está lista para recibirotra molécula de sustrato
MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS2. CATÁLISIS COVALENTEEjemplo Quimotripsina
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MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS2. CATÁLISIS COVALENTE
• Tripsina- Quimiotripsina
• ElastanaSERINA
• PapaínaCISTEÍNA
• Glucosa -6-fosfatasaHISTIDINA
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Evaluación del rendimiento en procesos BIO
CONVERSIÓN DE REACTIVOS