Biologia Molecular de La Piel

MODULO I Ao 2010

Biologa Molecular de la PielCarrera de Especializacin en Dermatologa Autor: Dr. Ramiro E. LorenteDirectora: Prof. Dra. Ana Mara Lorenz

FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN

Admin Carrera de Especializacin en Dermatologa MODULO I Ao 2010

the minute you let her underyour skin then you begin to make it better Paul McCartney

Ilustracin de tapa: Microfotografa electrnica de una Clula de Langerhans en migracin.

Biologa Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGA MOLECULAR

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MODELOS DE ANIMALES TRANSGNICOS.....36 RATONES TRANSGNICOS...................37

CONTENIDOTHE MINUTE YOU LET HER UNDER YOUR SKIN....................2 THEN YOU BEGIN TO MAKE IT BETTER................................2 PAUL MCCARTNEY.....................2 CONTENIDO..............................3 INTRODUCCION.........................4 HISTORIA DE LA BIOLOGIA MOLECULAR.............................5 LA PIEL: BIOLOGA MOLECULAR. 9 EPIDERMIS....................................9 LA MEMBRANA BASAL.......................16 UNIONES INTERCELULARES..................18 CLULAS NO KERATINOCTICAS DE LA EPIDERMIS...................................20 DERMIS.....................................23 PROTENAS DE LA MATRIZ EXTRACELULAR...23 COMPONENTES CELULARES DE LA DERMIS. .25 HIPODERMIS.................................26 TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR UTILIZADAS EN DERMATOLOGA......................28 PROCESAMIENTO DEL TEJIDO................28 REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA. 29 SECUENCIAMIENTO DE ADN................30 TRANSCRIPCIN - REVERSA PCR (RT-PCR) ..............................................31 WESTERN BLOT.............................32 MICROARRAY................................33 PROTEMICA CON ESPECTROMETRA DE MASA ..............................................35

CONCLUSIONES.......................39 AGRADECIMIENTOS.................40 BIBLIOGRAFA.........................41 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 42


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comenz a llamarse a s mismo bilogo molecular:

INTRODUCCIONEl trmino Biologa Molecular fue introducido por Warren Weaver que se desempeaba como Director de la Seccin de Ciencias Naturales de la Fundacin Rockefeller en un reporte de 1938: ...y gradualmente est llegando una nueva rama de la ciencia Biologa Molecular que est comenzando a dejar al descubierto muchos secretos concernientes a la unidad fundamental de la clula viviente.donde tcnicas modernas estn siendo usadas para investigar cada vez mas detalles minsculos de ciertos procesos vivientes1; Tambin podemos citar la opinin que W. Astbury tiene sobre biologa molecular: "...no tanto una tcnica como un enfoque, un enfoque desde el punto de vista de las llamadas ciencias bsica con la idea principal de la bsqueda por debajo de las manifestaciones a gran escala de la biologa clsica para el plan molecular correspondiente. Le preocupan particularmente las formas de las molculas biolgicas y es predominantemente tridimensional y estructural - lo que no significa, sin embargo, que no es ms que un refinamiento de la morfologa - debe indagar al mismo tiempo en la gnesis y funcin2; Una mejor explicacin acerca del origen del trmino, viene de lo que dice Francis Crick sobre porque

me vi forzado a mi mismo a llamarme bilogo molecular porque cuando un clrigo inquisidor me pregunt acerca de lo que haba hecho, me cans de explicarle que era una mezcla de cristalgrafo, biofsico, bioqumico y genetista, una explicacin que en cada caso encontraba muy difcil de entender3. El Human Genome Project da la siguiente definicin de biologa molecular: Es el estudio de la estructura, funcin y composicin de molculas biolgicamente 4 importantes . Este trabajo se ocupar primero del desarrollo de la biologa molecular, y luego en describir la estructura de la piel haciendo nfasis en los componentes moleculares de importancia.


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HISTORIA DE LA BIOLOGIA MOLECULARAl principio del siglo XX el campo de la gentica estaba regulado por las leyes Mendelianas de Segregacin y de Segregacin Independiente5, pero los procesos de reproduccin gnica, mutacin y expresin eran desconocidos. Thomas H. Morgan crea un equipo de investigacin que toma a la mosca de la fruta (Drosophila) como modelo para estudiar la relacin entre los genes y los cromosomas en el proceso hereditario6,7. Un estudiante de Morgan, Hermann J. Mller, reconoce en los genes las bases para la vida, y direcciona su trabajo para investigar su estructura, descubre que los rayos x tenan efectos mutagnicos en la mosca Drosophila y utiliza este fenmeno para estudiar el tamao y naturaleza de los genes. A pesar de los grandes avances de Mller, este reconoce que no puede extender su investigacin al nivel de explicar las propiedades fundamentales de los genes y sus acciones. En un ensayo publicado 1936 dice: El genetista por s mismo es intil para analizar nuevas propiedades (en los genes). Aqu los fsicos, as como los qumicos deben dar un paso adentro. Quin ser voluntario para hacerlo?.8. En la siguiente dcada mucho fsicos famosos mostraron atencin por la biologa, ms especficamente por la herencia biolgica, en 1944 el fsico Erwin Schrdinger publico What

is life? (Qu es la vida?)9, proponiendo de una manera entusiasta como la fsica cuntica podra explicar la estabilidad, incluso la mutabilidad de los genes10, reduca los genes a la fsica especulando con cristales aperidicos involucrados en la codificacin de la herencia. Muchos cientficos jvenes fsicos y bilogos se vieron fuertemente influenciados por este libro, llevndolos a considerar nuevas direcciones en la investigacin, lo que aos ms tarde tendra gran influencia en la Biologa Molecular.


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Otro fsico famoso interesado por la biologa era Max Delbrueck discpulo del fsico cuntico Neil Brh, quien como su maestro buscaban en contraparte con Schdinger no buscaban explicar los procesos biolgicos reducindolos a fenmenos fsicos sino entendiendo como cada disciplina poda complementar a la otra.

Salvador Luria The Phage Group marcando un punto muy importante en el desarrollo de la biologa molecular. En un famoso experimento llevado a cabo por Hershey, A.D. y Marta Chase prueban que los genes no estaban compuestos por protenas sino por cido desoxirribonucleico11. Delbrueck facilitaba la colaboracin entre bilogos y fsicos pero era esquivo a los detalles qumicos que tendan puentes entre las dos disciplinas. Fue Linus Pauling un colega de Delbrueck del Cal Tech quien al contrario de este utiliz sus conocimientos en qumica estructural para estudiar la estructura de las macromolculas. Su trabajo en la terica de los enlaces qumico facilit el entendimiento sobre la estabilidad de grandes macromolculas. Este concepto abarca tanto a las protenas como a los cidos nucleicos y era un requisito para poder estudiar su estructura. Pauling utilizo cristalografa por rayos x y sumado a la construccin de modelos a escala, descubre la estructura alfa helicoidal de las protenas y eventualmente propone un modelo para la estructura del ADN12. James Watson era un estudiante de Luria del Phage Group que reconoci la necesidad de utilizar cristalografa para poder llegar a la estructura del ADN, y Francis Crick un fsico que inspirado por Erwin Schrdinger se volvo hacia la biologa y contribuyo en la teora de la cristalografa por rayos x. Estos dos cientficos coincidieron en el Laboratorio Cavendish de la Universidad de Cambridge y trabajaron en conjunto utilizando datos de cristalografa de rayos x de ADN6

Figura 1 Max Delbrueck y Salvador Luria

Delbrueck visit el laboratorio de moscas de Mller, pero considero que la Drosophila era demasiado compleja para descifrar los mecanismos de auto reproduccin (caracterstica nica de los seres vivos) y prefiri utilizar a los bacterifagos (bacteriophages) como objeto de investigacin, creando al inicio de la dcada de 1940 junto con


aportados por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin del King's College de Londres para crear un modelo de la estructura helicoidal doble del ADN que fue finalmente publicada en 195313, lo que trajo aparejado el comienzo del periodo clsico de la Biologa Molecular.

desarrollo de nuevas tcnicas de biologa molecular.

Figura 2 James Watson y Francis Crick

Figura 3 - Csar Milstein

Ya con la estructura del ADN en la mano, los bilogos moleculares centraron su atencin en dilucidar los mecanismos de la funcin y reproduccin gentica. Se puso nfasis en tratar de secuenciar el cdigo gentico. Los primeros pasos fueron secuenciando protenas la primera fue la de Insulina a final de los aos 50, y durante las dos dcadas siguientes se fueron desarrollando y mejorando tcnicas de secuenciacin. Adems de las tcnicas de secuenciacin, hubo aportes importantsimos desde la inmunologa con el desarrollo de anticuerpos monoclonales, (trabajo que le vali el premio Nobel a Csar Milstein en 1984), de inestimable valor para el

Con el desarrollo de la tcnica de la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa en Ingls) hacia 1985 por Kary Mullis14, se dio impulso a un programa desarrollado por el Departamento de Energa y el Instituto Nacional de Salud de los EEUU para secuenciar el genoma humano y estudiar el impacto de la radiacin de las bombas de Hiroshima y Nagasaki sobre el genoma humano. De ste proyecto derivo el ms conocido como El Proyecto Genoma Humano, que se vio envuelto en muchas controversias entre el consorcio internacional de centros de secuenciacin y las compaas privadas avocadas a la misma tarea en una especie de carrera gentica. La secuencia del genoma en bruto fue7


publicada hacia 200115, marcando un antes y un despus en la biologa molecular.


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LA

PIEL: MOLECULAR

BIOLOGA

La piel humana est dividida en dos capas primarias, la epidermis o capa externa y la dermis o capa interna. Estas dos capas estn separadas por una estructura llamada membrana basal. Debajo de la dermis hay una capa de tejido conectivo laxo, llamada hipodermis o tejido celular subcutneo, que se contina en profundidad con la capa de tejido graso. La piel de un adulto promedio cubre aproximadamente un rea de 2 m2. Desde el nacimiento a la madurez, el rea de la piel se extender siete veces. Puede llegar a pesar hasta el 15% del peso total del cuerpo adulto16, es el rgano ms grande, y recibe hasta un tercio de la volemia. La piel constituye una barrera contra el medio ambiente al mismo tiempo contribuye a mantener la homeostasis del medio interno. Es un rgano capaz de autoregenerarse, y puede soportar agresiones mecnicas y qumicas, hasta un cierto lmite. Su espesor puede variar desde 0,5 mm en la membrana timpnica a 0,6 mm en la planta de los pies.

renovacin en un ciclo que dura entre 26 y 45 das, se produce una renovacin total de la epidermis cada aproximadamente 2 meses. La Figura 4 - Corte Histolgico de piel humana de la zona interescapular Figura 5- Corte Histolgico de piel humana de la Palma de la mano, (seobserva capa crnea ms gruesa y compactada)

epidermis constituye un epitelio escamoso estratificado compuesto por keratinocitos y la dividimos en 5 capas: estrato crneo, lcido, granuloso, espinoso y capa basal o stratum germinatuvm. El estrato crneo El estrato crneo, es la capa superficial y est compuesta de clulas muertas keratinizadas llamadas corneocitos. Est compuesto por clulas muertas dispuestas en capas finas apiladas y estn llenas en un 80% de keratina de ah el nombre de keratinocitos, rodeadas de una matriz extracelular lipdica, y tienen la funcin9

EpidermisLa epidermis es la capa mas externa de la piel, es avascular y deriva del ectodermo embrionario. Es una capa relativamente uniforme en espesor y tiene entre 75 y 150m, excepto en palmas y plantas donde tiene entre 0,4 y 0,6 mm. La capa epidrmica se encuentra en constante


de barrera de la epidermis. La regulacin de la permeabilidad, descamacin, actividad antimicrobial, exclusin de toxinas y absorcin selectiva, estn a cargo de la matriz extracelular. La resistencia mecnica, hidratacin, promotores de inflamacin mediados por citokinas, y proteccin del dao por radiacin UV, son provistas por los corneocitos. En condiciones normales el estrato crneo est compuesto de keratinocitos completamente diferenciados. Las clulas ms superficiales son descamadas por los traumas mecnicos y qumicos de la vida diaria y en parte debido a la degradacin proteoltica de los desmosomas. La keratina es una fibra dura, insoluble, resistente a cambios de pH y a la digestin enzimtica de tripsina y pepsina. Se han identificado 54 genes funcionales de keratina, que codifican para 34 tipos de keratina epiteliales y 17 pilosas. Mutaciones a nivel de estos genes se traducen en mltiples enfermedades.

El estrato lcido El estrato lcido se encuentra directamente por debajo del estrato crneo. Esta capa puede encontrarse en reas donde la piel es gruesa como en palmas y plantas, y puede estar ausente en piel fina como la de los prpados. Puede tener entre una y cinco clulas de espesor, los lmites celulares son difciles de distinguir en el microscopio de luz. Es una capa transicional donde hay enzimas lisosomales activas que degradan el ncleo y las organellas antes de que las clulas pasen al estrato crneo. El estrato granuloso El estrato granuloso se encuentra por debajo del estrato crneo o del estrato lcido cuando este est presente. Las clulas en sta capa tienen ncleo activo. El nombre deriva de los grnulos de keratohialina contenidos en las clulas de esta capa compuestos principalmente de profilaggrina, filamentos intermedios de keratina, y loricrina. En sta capa comienza a formarse la envoltura de las clulas cornificadas. La

Tabla 1 - Expresin de genes de keratina y enfermedades asociadas


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profilaggrina polimrica se convierte en filaggrina en un proceso dependiente de Ca. Los monmeros de filaggrina agregan keratina para formar macrofilamentos, la filaggrina luego es degradada, quedando macrofilamentos de keratina. La loricrina es una protena rica en cistena que constituye el principal componente de la envoltura cornificada que se une a estructuras desmosomales. Esta protena junto con involucrina, cystatina A, protenas pequeas ricas en prolina (SRP1, SRP2, y cornifina), elafina, envoplakina son subsecuentemente cruzadas en la membrana plasmtica por las transglutaminasas tisulares (TGM1 y TGM3 principalmente) formando la envoltura de los corneocitos. Figura 6 - Ictiosis Laminar

Mutaciones en los genes que codifican para las diferentes protenas mencionadas producen trastornos en la normal queratinizacin por ejemplo: mutaciones en el gen que codifica TGM1 estn involucradas en casos de Ictiosis Laminar; mutaciones en el gen que codifica filaggrina estn involucradas en casos de Ictiosis Vulgar; mutaciones en el gen que codifica loricrina estn involucradas en casos de Sndrome de Vohwinkel con Ictiosis y pseudoainhum. Figura 7 - Pseudoainhum

Tambin hay situaciones donde la alteracin no est en la formacin sino en la produccin de autoanticuerpos por ejemplo en la dermatitis herpetiforme existen anticuerpos contra la TGM3. ( Figura 8) .


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Figur a 8 -

Tabla 2 - Enfermedades resultantes de la alteracin de los desmosomas

Dermatitis Herpetiforme

Las clulas de esta capa tambin contienen grnulos pequeos llamados cuerpos de Odland. En realidad ya son numerosos en las clulas de la parte superior del estrado espinoso, y se ubican en la periferia celular a medida que pasan el estrato granuloso. Vierten su contenido lipdico en el medio extracelular, contribuyendo a la funcin de barrera y cohesin celular en la capa crnea.

El estrato espinoso El estrato espinoso es la capa debajo del estrato granuloso. El nombre deriva por la configuracin en espculas que tiene las estructuras citoplasmticas de las clulas de esta capa que constituyen los desmosomas caracterstica sobresaliente de esta capa. Los desmosomas ( Figura 9 Figura 10, Figura 11) ests constituidos por una parte intracelular denominada placa y una parte extracelular denominada core. La placa contiene los polipptidos plakoglobina, desmoplakina 1 y 2, keratocalmina, desmoyokina, y plakofilina y el core contienen glicoprotenas transmembrana que son desmoglena 1 y 3, y desmocolinas 1 y 2 que son parte de la familia de cadherinas que se encargan de la adhesin en la porcin extracelular, y son dependientes de Ca. La importancia del calcio como mediador12


de la adhesin queda demostrada en dos condiciones que exhiben discohesin epidrmica caracterstica, la enfermedad de Darier ( Figura 14) o keratosis folicular y Hailey-Hailey ( Figura 12) o pnfigo crnico benigno familiar. Ambas enfermedades son producidas por mutaciones en lo genes que regulan el transporte de calcio, el SERCA2 (sarco++ endoplasmatic reticulum Ca ATPasa type 2 isoform) en la enfermedad de Darier17 y el ATP2C1 (ATPasa, Ca++ transporting type 2C, member 1) regulador de la concentracin citoplasmtica de calcio en la enfermedad de Hailey-Hailey. Figura esquema 9 Desmosoma en

nuevo ARNm para stas keratinas, excepto en alteraciones hiperproliferativas. Figura 10 desmosomales Protenas

Figura 11 - Microfotografa electrnica. Desmosoma

Las clulas en esta capa comienzan a sintetizar grandes cantidades de keratina K1/K10 que se agrega a la K5/K14 que todava est presente de la capa basal, pero no se sintetizaBiologa Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGA MOLECULAR 13

En estados hiperproliferativos como psoriasis, keratosis actnicas, y reparacin de heridas la sntesis de keratina K1/K10 as como el ARNm para stas sufren downregulation, y se favorece la sntesis y traduccin del ARNm para keratina K6/K16. El ARNm para K6/K16 est normalmente presente en la epidermis pero solo es traducido cuando hay una estimulacin de la proliferacin. La alteracin de las protenas que componen los Figura 12 - Hailey-Hailey

enfermedades como se expone en la tabla 2. El estrato basal El estrato basal es la capa interna de la epidermis. Est compuesta de una capa simple de clulas mitticamente activas. Estas clulas responden a varios factores como la matriz extracelular, factores de crecimiento, hormonas, y vitaminas. El metabolismo de la piel est mediado por glucosa, y la utilizacin de esta por parte de la piel es comparable a la del msculo. Una vez q la clula deja la capa basal esta comienza una migracin hacia arriba que dura entre 2 y 3 semanas, le toma aproximadamente 14 das en moverse desde la capa basal al estrato crneo y otros 14 das pasar a la parte superior del estrato crneo y descamar. Figura 14 - Enfermedad de Darier

desmosomas se traducen en varias Figura 13 - Keratodermia estriada


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Las clulas pluripotenciales (stemlike cells) epidrmicas comprenden aproximadamente un 10% del total de clulas basales. Estas clulas tienen un ciclo celular muy lento y cuando se dividen las clulas hijas que se diferenciarn a medida que se mueven hacia la capa crnea son llamadas clulas amplificadoras transitorias ( Figura 16), stas constituyen el 50% de la poblacin de keratinocitos basales. Una parte de la poblacin de clulas madre puede ser encontrada en las criptas epidrmicas de las crestas de la dermis y en el bulbo de los folculos pilosos. Las clulas en divisin pasan por el ciclo celular y la fase G1 es acortada en estados como la reparacin de heridas. El ciclo celular normal de un keratinocito es de alrededor de 300 horas pero puede ser tan corto como 36 horas en ciertos estados patolgicos como la psoriasis

Figura 15 - Psoriasis

Las stem cell y las clulas amplificadoras transitorias, tienen ambas capacidad para divisin celular limitada o contina, y son las que tienen ms probabilidad de residir el tiempo suficiente en la piel para sufrir modificaciones genticas que lleven a desarrollar cncer de piel. El uso de clulas madres provenientes de la capa basal de la piel es un rea de creciente investigacin y desarrollo18.


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Figura 16 Amplificadoras

Esquema.

Clulas

La membrana basalLa zona de membrana basal o unin dermo-epidrmica, constituye la interface entre dermis y epidermis. Est dividida en dos zonas llamadas lmina lcida y lmina densa, segn su densidad en la microscopa electrnica. La principal funcin reside en servir de anclaje entre la dermis y la

Figura 17 - Esquema de la matriz de la membrana basal

epidermis y proveer resistencia ante fuerzas cizalladoras externas. Sirve como soporte de la epidermis, determina la polaridad de crecimiento, dirige la organizacin del citoesqueleto en las clulas basales, provee seales de desarrollo, y acta como barrera semipermeable. La membrana basal est formada por las interacciones especficas entre las protenas, laminina, colgeno tipo IV, nidogen, y perlecam. TambinBiologa Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGA MOLECULAR 16

encontramos fibronectina, y glicosaminoglicanos. Encontramos una menor cantidad de colgeno tipo VII, pero ste juega un papel importante en el anclaje de clulas a la lmina densa. Puede ser dividida en tres redes supramoleculares: el complejo hemidesmosoma-filamento de anclaje, la membrana basal propiamente dicha, y la fibrillas de anclaje. El rol crtico de sta regin de mantener la integridad estructural de la piel, se pone de manifiesto con el gran nmero de mutaciones en los componentes de la unin dermoepidrmica que causan enfermedades ampollosas como por ejemplo el colgeno tipo VII. Estas son agrupadas de acuerdo al grado de escisin dentro de la unin dermoepidrmica, por ejemplo la ms superficial es la epidermlisis bullosa simple donde hay escisin de los keratinocitos basales; epidermlisis bullosa de la unin escisin entre la lmina lcida y la lmina densa y la epidermlisis bullosa distrficas que es la ms profunda donde existe escisin entre la sublmina densa y los filamentos de anclaje.


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Uniones IntercelularesAdems de los desmosomas ya descriptos, hay otros tipos de uniones intercelulares, que no tan solo contribuyen a la interaccin mecnica, sino que son responsables de la interaccin bioqumica y de seales entre clulas. Estas uniones incluyen Uniones ocluyentes (tight), uniones adherentes (adherens), y uniones GAP. Uniones adherentes Las

clula adyacente. El anclaje principal a citoesqueleto de actina es mediante catenina adems de otros componentes como p120ctn, catenina, plakoglobina, -actinina, vinculina, VASP (vasodilatador stimulated phosphoprotein). No se han identificado dermatosis asociadas a anormalidades primarias en la estructura de los componentes de las uniones adherentes, aunque la plakoglobina, asociada a una mutacin en la enfermedad de Naxos, tambin es componente de los desmosomas. Figura 18 - Microfotografa electrnica. Uniones gap

uniones

adherentes estn constituidas por estructuras transmembrana, que se asocian con el esqueleto de actina, parte de la red de filamentos de los keratinocitos. Los componentes transmembrana estn constitudos por Ecadherina, que formas interacciones adhesivas hemoflicas calcio dependiente con la E-cadherina de la Figura 20 - Esquema. Uniones gap

Figura 19 - Ecadherinas. Unin Ca dependiente

Uniones gap Las uniones gap comprenden grupos de canales intercelulares, conocidos como conexones, que directamente forman conexiones entre


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el citoplasma de keratinocitos adyacentes (tambin presentes en otras clulas). Hay descriptas cerca de trece conexinas diferentes en el humano. Los conexones se originan mediante el ensamblaje de seis conexinas dentro del complejo de Golgi que son transportadas a la membrana plasmtica, donde se asocian con otros conexones para formar la unin gap. Las uniones gap pueden ser homotpicas o heterotpicas dependiendo del tipo de conexinas. La formacin y estabilidad de las uniones gap estn reguladas por la quinasa de protena C, Src quinasa, concentracin de Ca, calmodulin, AMPc, y el pH local. Mediante las uniones gap, clulas vecinas comparten metabolitos de bajo peso molecular (

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