Bioethanol et alternativt brændstof -...

1 Signe Klinting, Frederiksborg Gymnasium, 3x

Bioethanol – et alternativt brændstof SRP i Kemi og Matematik

Af Signe Klinting Frederiksborg Gymnasium og HF, 3x

Den 17. December 2009


Abstract

The paper looks at the production of bioethanol and the problematics with cellosic bioethanol.

The paper investigates how the choice of enzymes, the temperature for the enzymatic hydrolysis

and the pre-treatment of the biomass affect the profit of glucose. A big profit is important because

the glucose is fermented to ethanol.

These parameters were experimentally tested on the Faculty of Life Science, University of

Copenhagen, on November the 24th and 25th. The choice of enzymes and pre-treatment were

tested by using three different biomasses with three types of enzymes and different ways of

treatment. The concentration of glucose was measured with UV/VIS-spectroscopy. In the

experiment testing the optimum temperature for the enzyme, cellulase, this measuring method

was used as well. The last experiment tested how the pre-treatment affected the fermentation.

On background of the results from the experiments it is possible to conclude that it’s easier to

extract glucose from carbohydrates like starch and sucrose than from cellulose. Cellulose demands

a more powerful pre-treatment and a motley combination of enzymes, which cost resources and

energy and makes it hard to produce cellulosic bioethanol profitable. The results also indicated

that it is possible to make a too powerful pre-treatment that gives a negative effect on the

fermentation and that the temperature for the enzymatic hydrolysis has a big impact on the

activity of the enzymes.


Indholdsfortegnelse

Abstract ................................................................................................................................................ 2

Indholdsfortegnelse ............................................................................................................................. 3

Indledning ............................................................................................................................................ 5

Bioethanol ............................................................................................................................................ 5

1. og 2. generations bioethanol ....................................................................................................... 6

Fremstilling af bioethanol ................................................................................................................ 6

Udfordringen ved 2. generations bioethanol .................................................................................. 8

Enzymer ................................................................................................................................................ 9

Begrebet Q10 .................................................................................................................................. 11

Sakkarider........................................................................................................................................... 12

Monosakkerider ............................................................................................................................. 12

Oligosakkarider .............................................................................................................................. 14

Polysakkarider ................................................................................................................................ 14

Biomasser ........................................................................................................................................... 14

Sukkeroer ....................................................................................................................................... 15

Hvedemel ....................................................................................................................................... 15

Halm ............................................................................................................................................... 16

Mindste kvadraters metode .............................................................................................................. 18

Bestemmelse af standardkurve ..................................................................................................... 19

Forsøg udført på Det Biovidenskabelige Fakultet, KU ....................................................................... 23

Enzymatisk nedbrydning, samt bestemmelse af glukoseindhold i hydrolyseprøver .................... 24

Teori ........................................................................................................................................... 24

Fremgang ................................................................................................................................... 25

Observationer ............................................................................................................................ 26

Resultater og beregninger ......................................................................................................... 26

Fejlkilder ..................................................................................................................................... 29

Reaktionshastighed af cellulaser ved forskellige temperaturer .................................................... 29

Teori ........................................................................................................................................... 30

Fremgang ................................................................................................................................... 30


Diskussion................................................................................................................................... 34


Gæring af hydrolysater .................................................................................................................. 34

Teori ........................................................................................................................................... 34

Fremgangsmetode ..................................................................................................................... 37


Fejlkilder ..................................................................................................................................... 38

Opsummering og konklusion ............................................................................................................. 39

Litteraturliste ..................................................................................................................................... 41

Bøger .............................................................................................................................................. 41

Artikler ............................................................................................................................................ 42

Hjemmesider .................................................................................................................................. 43

Papirer ............................................................................................................................................ 43

Vejledere i forbindelse med forsøg på Det Biovidenskablige Fakultet på KU ............................... 43

Figuroversigt .................................................................................................................................. 44

Bilag 1 – Forsøgsvejledning ”Enzymatisk hydrolyse af forskellige biomasser” ............................. 46

Bilag 2 – Forsøgsvejledning ”Bestemmelse af glukose i hydrolyseprøver” ................................... 49

Bilag 3 – Forsøgsvejledning ”Reaktionshastighed af cellulaser ved forskellige temperaturer” .... 53

Bilag 4 – Forsøgsvejledning ”Gæring af hydrolysater” .................................................................. 57

Bilag 5 – PowerPoint ”Enzymer – Hvad rager det mig?” ............................................................... 60

Bilag – 6 – PowerPoint ”Potentiale for bioethanol I Danmark” ..................................................... 68

Bilag 7 – Artikel “Fra Halm til alkolhol” .......................................................................................... 72

Bilag 8 – Artikel ”Fremstilling af bioethanol” ................................................................................. 76

Bilag 9 – Skema for fortynding af standardprøver ......................................................................... 80

Bilag 10 – Skema for fortynding af hydrolyseprøver ..................................................................... 81

Bilag 11 – Oversigt iver mikrotiterplade for hydrolyse .................................................................. 82

Bilag 12 – Excelformel i forbindelse med udvælgelse af resultat .................................................. 83

Bilag 13 – Holdresultater for hydrolyse prøver ............................................................................. 84

Bilag 14 – Samlede resultater for hydrolyseprøver ....................................................................... 84

Bilag 15 – Data for forsøget med reaktionshastighed ................................................................... 84

Bilag 16 – Data fra gæringsforsøg .................................................................................................. 84

Bilag 17 – Papirer fra matematik undervisning til gennemgang af ”Mindste kvadraters metode” ........................................................................................................................................................ 84

Bilag 18 – Artikel ”Fra Halm og Affald til morgendagens brændstoffer til biler” .......................... 84


Indledning

Nutidens diskussion omkring olieforsyninger og CO2-udslip har øget interessen i produktion af

bioethanol. Produktion af bioethanol vil højst sandsynlig blive nødvendig inde for den nærmere

fremtid, og det er derfor interessant at se på nutidens produktion af bioethanol samt

udfordringerne ved fremstilling af bioethanol.

Jeg vil i denne opgave behandle emnet bioethanol med udgangspunkt i forsøgene fortaget på Det

Biovidenskablige Fakultet den 24. og 25. november. Forsøgene undersøgte betydningen af

forbehandlingen af forskellige biomasser ved enzymatisk nedbrydning, optimaltemperaturen for

enzymerne cellulaser samt betydning af forbehandling af sukkerroer ved gæringen. Jeg vil i

opgaven først redegøre for hvad bioethanol er og fremstillingen i dag, samt problemerne ved

produktion af bioethanol på fiberholdige biomasser. Dernæst vil jeg i et teoriafsnit fortæller om

enzymer og faktorer, der påvirker enzymaktiviteten, sakkarider samt de biomasser, der arbejdes

med i forsøgene. Derudover vil jeg i teoriafsnittet redegøre for ”Mindste kvadraters metode” samt

lave en matematisk udregning af en lineær regression med brugen af ”Mindste kvadraters

metode”. Til sidst vil jeg gennemgå de udførte forsøg og på grundlag af teori og forsøgenes udfald

konkludere på udfordringerne ved produktion af bioethanol.

Bioethanol

Bioethanol er ethanol gæret ud fra biomasser med henblik på brug som brændstof. Brændstoffer

dannet fra biomasser, dvs. plantemateriale, kaldes for biobrændstoffer.

Stigende fokus på CO2-udslip, som har resulteret i en række aftaler, hvor verdens lande forpligter

sig til reducering af CO2-udslippet, samt usikkerheden om forsyningssituationen af olie, har øget

interessen for fremstilling af bioethanol til brug som brændstof.

Udslippet af CO2 ved afbrænding af bioethanol, vil svarer til mængden af CO2 planterne forbruger

ved fotosyntese, hvor glukosen dannes. Bioethanol vil derfor være stort set CO2-neutralt1.

Alle almindelige biler kan køre på benzin tilsæt 5% ethanol. Specielle FFV-biler (Flexibel Fuel

Vehichles) kan køre på benzin iblandet op til 85% ethanol. Bioethanol har en oktantal2 på 111 og

1 Forbehandling, transport og andre ressourcer til produktionen vil kræve energi, dvs. CO2-udslip


kan derfor ved 5% iblandinger erstatte oktanforhøjer som MTBE og MTBE-alternativer. Tilsætning

af bioethanol vil desuden give en renere forbrænding og nedsætte udslippet af fx CO, som en er

giftgas3. Energiindholdet i en liter ethanol er lavere end for en liter benzin, hvilket betyder at man

ikke kan køre lige så langt på en liter ethanol som på en liter benzin. Kørsel på benzin med 5%

ethanol vil for bilerne i dag betyde 1-2% kortere kørsel pr. liter4.

1. og 2. generations bioethanol

Bioethanol deles op i to kategorier: 1. generations bioethanol og 2. generations bioethanol.

1. generations bioethanol produceres i en gæring på sukkerholdige eller stivelseholdige biomasser,

fx sukkerroer, hvede. Dette er nemme kulhydrater at nedbryde ved tilsætning af enzym, hvilket

gør dem nemme at gære på. Dog anvendes biomaterialer som sukkerroer og hvede til andre ting

end produktion af ethanol, fx fødevarer, og en øget efterspørgsel på biomaterialerne kan derfor

øge priserne på pågældende fødevarer og prisen på ethanol, hvilket man ikke interesseret i.

Derfor er der interesse i at gære ethanol ud fra fiberholdige materiale, som fx halm, træ, stængler

fra majsplanter og haveaffald, som findes i store mængder og ikke anvendes til andet. Bioethanol

fra gæring på sådanne biomasser kaldes 2. generations bioethanol. Problemet ved 2. generations

bioethanol ligger i tilgængeligheden af cellulosen, som er det kulhydrat der nedbrydes til glukose,

der skal gæres til ethanol. Cellulosen er pakket ind i en struktur af lignocellulose5, som bl.a. består

af stoffet lignin og gør planten stærk og modstandsdygtig. Lignin er ikke nemt nedbrydeligt og

forhindrer enzymatisk nedbrydning af cellulosen, som danner glukose til gæringen. Udfordringen i

2. generations bioethanol ligger i forbehandling, enzymatisk nedbrydning og gæringen.

Fremstilling af bioethanol

Uanset typen af biomasse består produktionen af bioethanol af nogle fast trin.

Første trin er forbehandling af biomassen. Dette trin varierer afhængig af den valgte biomasse.

Det er også i dette trin den største forskel mellem 1. og 2. generation bioethanol ligger.

2 Oktantal er et udtryk for stoffets tilbøjelighed til selvantændelse ved sammenpresning (tændingsbankning). Jo højere tallet er, des mindre er risikoen er der for tændingsbankning. 3 ”Fremstilling af bioethanol – nutidens teknologi og frentudebs udfordringer” s. 26 4 ”Morgendagens Brændstoffer – danske perspektiver” s. 24 5 Se afsnittet ”Halm” under ”Biomasser”


Forbehandling af biomassen fortages for at gøre

kulhydraterne (di- eller polysakkerider) tilgængelige for

enzymerne, som skal nedbryde dem til glukose.

Dernæst tilsættes biomassen enzymer, som

hydrolyserer (spalter) di-eller polysakkeriderne til

glukose. Dette trin kræver enzymer, som passer til

kulhydraterne i den valgte biomasse. Efter den

enzymatiske nedbrydning (hydrolysen) kommer gæringen (fermentering), hvor glukosen gæres til

ethanol. Dette kræver tilsætning af gær. Ved dette trin bliver der dannet kuldioxid som

restprodukt.

Når gæringen kommer op på en vis volumenprocent ethanol, dør gærcellerne og gæringen

stopper. Som sidste trin i produktionen af ethanol fortages derfor en destillation, så ethanolen fås

på ren form.

I Brasilien bliver bioethanol i dag produceret på sukkerrør, mens man i USA hovedsagligt benytter

majs. Ved brugen af majs som biomasser benyttes ofte tørformalingsproces, hvor majsen formales

til små partikler som oplæmmes i vand. Først opvarmes opslæmningen til 65-90°C, hvor stivelse vil

suge vand og folde sig ud (forklistrer/gelatinieres), hvilket gør stivelsen tilgængelig. I dette trin

tilsættes varmetolerante enzymer som nedbryder stivelse til mindre kæder (oligosakkarider). For

at frigøre resten af stivelsen fra fibre og protein, så det bliver mere tilgængelig for enzymerne, jet-

koges blandingen ved 105-120°C. Varmen får enzymerne til at denaturere og der tilsættes derfor

igen en omgang enzymer, som nedbryder den nye tilgængelige stivelse til oligosakkarider.

Dernæst startes en forsukring samtidig med gæring. Ved en forsukring nedbrydes oligosakkarider

af glucoamylase til glukose, som derefter kan gæres på. Glucoamylaserne hæmmes af øget

glukoseindhold. Derfor kan kombinationen af forsukring og glukose optimerer glucoamylasernes

arbejde, da gæren løbende vil omsætte glukosen til ethanol. Efter gæring destilleres ethanolen.

Uopløselige rester fra destillationen fjernes ved centrifugering og sælges som foder6.

6 ”Fremstilling af bioethanol – nutidens teknologi og fremtidens udfordringer” s. 26

Figur 1 Oversigt over trin i produktionen


Udfordringen ved 2. generations bioethanol

Forbehandlingen skal gøre cellulosen i biomassen tilgængelig for enzymerne. Lignocellulosen er et

stræk materialer, som kræver en hård forbehandling, som fx behandling med fortyndet syre ved

høj temperatur (180-230°C), koncentreret syre med stuetemperatur, dampeksplosion,

vådoxidation eller ammoniak-fryseeksplosion. Disse forbehandlinger kræver enten en stor

mængde energi og/eller forårsager dannelse af restprodukter og stoffer, som hæmmer enzymer

og gær, som skal benyttes senere i processen. Ved valget af forbehandling skal der tages højde for

omkostninger og energiforbrug i forhold til størrelsen af udbyttet.

Ved enzymatisk nedbrydning (hydrolysen) af cellulose skal der bruges en kombination af

cellulaser7. Prisen på enzymer er høje og er et problem i forhold til at gøre produktionen af 2.

generations bioethanol rentabel.

Den almindelig gær, Saccharomyces cerevisiaem, kan ved anaerobe forhold omsætte hexoser som

glukose til ethanol. Ved hydrolyse af hemicellulose bliver der dannet pentoser, som gæren ikke

kan omsætte til ethanol. Der forskes derfor i gær-typer, som kan omdanne pentoser til ethanol.

Derudover arbejder gær bedst omkring 32°C, mens den enzymatiske nedbrydning foregår bedst

ved en temperatur omkring 45-55°C. Der arbejdes på at udvikle gær, der kan tåle højere

temperaturer, så hydrolysen og gæringen kan foregå i samme trin og man på denne måde kan

spare ressourcer og penge.

Kunsten ved fremstilling af bioethanol er at minimere energiforbrugt til produktionen i forhold til

den energi der bliver produceret, dvs. et mindre input end output, således at produktionen er

rentabel. Inbicon8, ejet af DONG Energy, er et demonstrations anlæg, som udvikler og

demonstrerer, hvorledes hele bioethanol-processen kan integreres i samme anlæg, og hvordan

man kan udnytte hvert trin i proces bedst mulig. Inbicon arbejder hovedsagligt med halm, som

biomasse, da dette findes i store mængde i Danmark. Restprodukter brændes til produktion af

damp. Dampen konverteres til elektricitet der forsyner hele anlægget samt naboerne. Kuldioxiden

7 Se afsnittet ”Halm” under ”Biomasser” 8 Navnet Inbicon er skabt af Integrated Biomass Conversion


fra gæringen opfanges og benyttes til bl.a. brus i drikkevarer9. På denne måde bliver alt fra

biomassen udnyttet til produktionen af bioethanol og mindst muligt går til spilde.

Enzymer

Enzymer er katalysatorer, hvilket betyder at de

øger reaktionshastigheden i en reaktion uden

selv at blive forbrugt. De nedsætter

aktivitetsenergien, der skal til for at få

reaktionen til at forløbe10.

Enzymer virker specifikt på én bestemt reaktion

eller én specifik reaktionstype. De er opbygget

af protein, som består af aminosyrer.

Aminosyresekvensen bestemmer strukturen i det aktive område på et enzym, som optræder som

en fordybning i enzymets overflade. Ændres bare én af disse aminosyre, ændres det aktive center

hos enzymet og det vil miste sin virkning (eller virkningen vil blive nedsat).

Når enzymer katalyserer en reaktion, bindes et substrat til det aktive center,

hvorved der dannes et enzym-substratkompleks. Enzymet katalyserer reaktionen,

så substratet omdannes til produkter, hvorefter enzymet frigiver dem.

Reaktionerne er ofte reversible, hvilket betyder at enzymet kan få reaktionen til

at forløbe begge veje.

Enzymer skal nogle gange have hjælp fra co-faktorer. Co-faktorer kan være

coenzymer eller enzymaktivatorer. Coenzymer er organiske stoffer, der indgår i

det aktive center og hjælper enzymet med at få reaktionen til at forløbe – de

fungerer som enzymets assistent. De kan fx overføre funktionelle grupper til

substratet eller lave elektronoverførsler. Enzymaktivatorer er ofte uorganiske

ioner fx Zn2+, Fe2+, Mn2+, som gør det aktive center tilgængeligt for substratet,

dvs. enzymaktivatoren hjælper enzymet med at binde substratet.

9 ”Biomass Refinery – How it works” på Inbicons hjemmeside 10 ”Biokemibogen – liv, funktion, molekyle” s. 79

Figur 2 Grafen viser energiniveaut for en reaktion. Den lysegrønne graf er hvor reaktionen er enzymkatalyseret.

Figur 3 Enzyms virkning


Enzymer inddeles i grupper efter deres virkemåde. Nogle enzymer står fx for at transportere

funktionellegrupper fra det ene molekyle til det andet og kaldes transferaser. Den type enzymer,

som er relevante i forbindelse med nedbrydning af biomasse til ethanol, hedder hydrolaser. Disse

enzymer bryder kovalente bindinger11 ved optagelse af vand. Dette betyder at enzymerne

spalterne større molekyler til mindre molekyler ved en hydrolyse12.

Enzymers struktur er essentiel for dens funktion og evne til at katalysere den specifikke reaktion.

Ændres eller påvirkes strukturen, kan enzymets evne ødelægges eller nedsættes.

Forskellige paramenter, så som pH, produktkoncentrationen og temperatur kan derfor påvirke

enzymaktiviteten. Enzymaktiviteten kan måles som reaktionshastigheden, som er omsat mængde

substrat pr liter opløsning pr tidsenhed pr mængde enzym tilstede.

pH-værdien påvirker enzymet struktur, idet

aminosyrernes ladninger ændres, hvis pH ændres.

Ændres aminosyrerne, vil det aktive center blive

påvirket og substratet vil have svært ved at binde

sig. Da enzymers aktive centre er forskellige, vil alle

enzymer have et individuelt pH-optimum, hvor

enzymaktiviteten vil være størst og derved

reaktionshastigheden højest. Frem mod pH-optimum vil aktiviteten være stigende og efter pH-

optimum, vil den være aftagende.

Når et enzym har omsat en vis mængde substrat til produkt, vil der indstille sig en ligevægt mellem

substratkoncentrationen og produktkoncentrationen, hvorved enzymaktiviteten vil falde13. En

øget produktkoncentration hæmmer enzymet.

11 Elektronparbindinger 12 Hydrolyse betyder ”spaltning vha. vand” 13 Information fået af Mads A. T. Hansen ved foredrag ”Enzymer – hvad rager det mig?”

Figur 4 Reaktionshastighed som funktion af pH. Optimum er individuelt for hvert enzym


Stigende temperatur vil øge

reaktionshastigheden. Når temperaturen

stiger, bevæger molekylerne sig hurtigere og

de vil støder oftere sammen. Muligheden for

at enzym-substratkomplekset dannes, øges

derfor. På et tidspunkt vil temperaturen dog

blive for høj og enzymet vil denaturere14,

hvilket er en irreversibel15 proces.

Der tales derfor om en optimal-temperatur. Aktiviteten vil være stigende frem til

optimaltemperaturen, hvor efter aktiviteten vil falde forholdsvis brat pga. denaturering. Den

optimale temperatur individuel for hvert enzym. De enzymer, der benyttes til enzymatisk

nedbrydning i forbindelse produktion af bioethanol, har en optimal hastighed ved en temperatur

på 45-55°C16.

Begrebet Q10

I forbindelse med enzymaktivitet og temperatur arbejdes der ofte med begrebet Q10. Q10

beskriver, hvor meget reaktionshastigheden stiger med for hver 10 graders temperatur øgning.

Som tommelfingerregel er Q10 = 2, dvs. at reaktionshastigheden fordobles for hver 10graders

temperaturøgning. Dette gælder dog kun til et vist punkt, hvorefter enzymet begynder at

denaturere. Til et vist punkt kan reaktionshastigheden som funktion af temperaturen udtrykkes

som en eksponentielt stigende funktion, f (x) bax , a 1. Kender man to punkter på grafen for en

eksponentielt stigende funktion, kan raten, a, beregnes ved ay2

y1

x2 x1y2

y1

1

x2 x1

. Når man taler

om eksponentielt stigende funktionen, tales også ofte om en fordoblingskonstant, som fortæller

hvor mange ”skridt” man skal tage hen ad x-aksen, for at fordoble y-værdien.

Fordoblingskonstanten, T2, kan beregnes vedT2 x2 x1log( 2)

log( a). Ifølge Q10 fordobles

14 Denaturere = ødelægges 15 Irreversibel = kan ikke gøre om igen 16 Mads A.T. Hansen, ”Enzymer – hvad rager det mig?”

Figur 5 Reaktionshastighed som funktion af tempreaturen. Grafen falder brat efter optimaltemperatur.


reaktionshastigheden, når temperaturen øges med 10,. T2 må derfor være lig 10. Jeg udleder en

formel for Q10:

Når x 10 og Q10 2 :

T2 10log(2)

log(a)

10 log(a) log(2)

log(a10) log(2)

a10 2

y2y1

1

x2 x1

10

2

y2y1

10

x2 x1

2 Q10

x-værdierne svarer til to temperaturer og y-værdierne svarer til reaktionshastighederne ved de to

temperaturer. Q10 kan derfor skrives som:

Q10R2

R1

10

T2 T1

Sakkarider

Sakkarider kaldes i dagligtale kulhydrater. Alle kulhydrater indeholder carbon, hydrogen og ilt. De

deles op i 3 grupper: monosakkarider, oligosakkarider og polysakkarider.

Monosakkerider

Monosakkerider er de simpleste kulhydrater. De består kun af én enhed og kan ikke spaltes til

mindre molekyler. Bruttoformlen for monosakkerider er oftest (CH2O)n, hvor n er mellem 3 og 7.

Der er 2 typer af funktionelle grupper i et monosakkarid: én carbonylgruppe17 samt mindst 2

hydroxygrupper18. De fleste monosakkarider vil pga. de polære hydroxygrupper være letopløselige

i vand.

17 Enten en aldehyd eller keton 18 Primære og sekundære


Monosakkarider inddeles efter typen af

carbonylgruppen og antallet af carbonatomer. Fx

indeholder glukose seks carbonatomer og er en

aldehyd. Derfor er glukose en aldohexose.

Monosakkarider findes i kædeform19 og ringform20.

Grundet asymmetriske carbonatomer21

optræder monosakkarider i to stereoisomere, D- og L-

form22. Monosakkarider forekommer kun naturligt på D-formen. Ved dannelse af ringstruktur

forekommer der ligeledes to stereoisomere, α- og β-form23. Størstedelen af et monosakkarid24 i

naturen vil forekomme på ringform. Der vil dog stadig være en lille del på kædeform.

Figur 7 D-glukose, der går på ringform

Glukose er et af de vigtigste monosakkarider. Det er et af produkterne ved fotosyntese og er en

vigtig energikilde til vores celler. Glukose har bruttoformlen C6H12O6 og kan ved anaerobe forhold

gæres til ethanol af gærceller.

19 Opstilles med Fischers projektionsfomel som lineære molekyler (kædeform) med carbonylgruppen øverst (næst øverst hvis det er en keton). Nummereringen af carbonatomerne sker oppe og ned. 20Gælder kun for pentoser og hexoser. Bindingsvinklen mellem carbonatomerne bøjer kæden således at carbonylgruppen støder op til hydroxygruppen og danner en ringstruktur. 21 Et asymmetrisk carbonatom har bundet 4 forskellige radikaler, som enten er funktionelle grupper (fx –OH), grundstoffer (fx -H) eller radikaler. 22 Afhænger af placeringen af hydroxygruppne på den nederste asymmetiske carbonatom i Fischers projektionsformel. D = Dexter = højre, L= Laevus = venstre 23 Carbonatomet fra carbonylgruppen er ved ringdannelse blevet et asymmetrisk carbonatom med en nydannet hydroxygruppen. Sidder -OH under for ringen, kaldes det for en α-form og sidder den over, kaldes det for en β-form 24 Indeholdende fem carbonatomer eller derover

Figur 6 Fra venstre: D-glukose og L-glukose


Fruktose er et andet vigtigt monosakkarid. Det findes i

søde frugter og kaldes derfor også frugtsukker. Fruktose

er en ketohexose, hvilket betyder at den indeholder seks

carbonatomer, og carbonylgruppen er en keton. Fruktose

har derfor bruttoformlen C6H12O6 ligesom glukose og er

derfor en isomer til glukose. Fruktose danner ved

ringdannelse en femkantet ring25.

Fruktose kan ligeledes gæres til ethanol.

Oligosakkarider

Oligosakkerider består af 2-10 monosakkarier bundet sammen ved fraspaltning af vand (en

kondensation). I levende organismer er det altid hexoser, som er byggestene i oligosakkarider. De

vigtigste oligosakkarider er disakkarider, som af navnet fortæller, at de består af netop to

monosakkarider. Disakkarider har bruttoformlen C12H22O11.

Polysakkarider

Ploysakkarider består af mange monosakkarider bundet sammen på samme måde som

oligosakkariderne – ved kondensation. Der kan være flere tusinde monosakkarid-enheder i et

polysakkarid.

Bruttoformlen for et polysakkarid er tilnærmelsesvist (C6H10O5)n, hvor n er antallet af

monosakkarider. Teoretisk set er polysakkarider opløseligt i vand, da de indeholder en masse

polære hydroxygrupper, men da molekylerne er så store, er de meget tungt opløselige i vand.

Biomasser

I forsøgene benyttes 3 forskellige typer af sakkarider, som alle er kilde til glukose, der kan gæres til

bioethanol. I sukkerroen udnyttes sukrose. Hvedekernerne, som fås i form af hvedemel, udnyttes

stivelse, og i halmen bruges cellulosen. I dette afsnit vil jeg kort gennemgå sakkariderne samt valg

af forbehandling og enzym for biomasserne.

25 Hydrogenatomet fra hydroxygruppen på carbon nr. 5 binder sig til oxygenatomet i ketonen på carbon nr. 2. Oxygenatomet fra hydroxygruppen på carbon nr. 5 binder sig til carbon nr. 2 og danner en femkantet ring.

Figur 8 D-Fruktose og Alfa-D-Fruktose


Sukkeroer

Sukkerroer består af disakkaridet, sukrose. Sukrose, også kaldes sakkarose, består af ét α-D-

glukose-molekyle og ét β-D-fruktose-molekyle. Bindingen mellem glukose-molekylet og fruktose-

molekylet sker ved en kondensationsreaktion og kaldes for en

α-1-glukosid-β-2-frukosidbinding26.

Sukrosen er meget let tilgængelig i sukkerroen og kræver

derfor ikke nogen særlig forbehandling. Sukrose nedbrydes til

glukose og fruktose af enzymet invertase. Gærceller kan

danne ethanol ved gæring på både fruktose og glukose, derfor

kan begge produkter ved enzymatisk nedbrydning af sukrose

benyttes til gæring af ethanol.

Ved behandling af sukkerroe ved høje temperaturer, så som 190°C, er der risiko for at sukrosen

karamelliserer eller at glukose blive nedbrudt til giftstoffer, så som 5-hydroxymethylfurfural, som

hæmmer gær.

Hvedemel

Hvedemel er fint malede hvedekerner, som består af stivelse. Stivelse er et polysakkarid, som er

opbygget af glukose-molekyler. Stivelse består af to molekylestrukturer, amylose og amylopektin.

Amylose er en uforgrenet kæde af α-D-glukose-molekyler, der danner en spiral.

Glukosemolekylerne er bundet sammen ved en α-1,4-glukosidbinding27. Der er mellem 25-6000

glukose-enheder i amylose28.

Amylopektin er ligesom amylose opbygget af glukosemolekyler bundet ved α-1,4-

glukosidbindinger og har en grundstruktur som en spiral, men amylopektin har for ca. hver 20.

glukose-enhed i spiralen en sidekæde, som er bundet ved α-1,6-glukosidbindinger. Disse bindinger

26 Bindingen sker mellem de to hydroxygrupper på henholdsvis carbon nr. 1 hos glukose og nr. 2. Hydroxygruppen på hos glukose er på α-form og hos fruktose er den på β-form. Her af navnet på bindingen. 27 Bindingen sidder mellem carbon nr. 1 på det ene molekyle og carbon nr. 4 på det andet 28 ”Biologiens ABc - Biokemi” s. 15

Figur 9 Dannelse af sukrose


snor sig ikke i en spiral som α-1,4-glukosid

og bryder derfor spiral-strukturen.

Amylopektin består af op til 40.000

glukose-enheder og er derfor et væsentlig

større molekyle end amylose.

Stivelse findes i mange planter, som en

oplagring af glukose. Forholdet mellem

amylose og amylopektin er forskelligt fra plante til plante.

Stivelse nedbrydes af α-amylase, der tilfældigt spalter den lange kæde til mindre kæder, β-

amylase, som spalter kæderne til disakkeridet maltose, og glucoamylase, som spalter maltose til

glukose. β-amylase kan kun ”angribe” stivelse fra enderne, derfor gør α-amylase flere ender

tilgængeligt for β-amylase. Stivelse i vand ved 60-70°C vil suge vandet og folde sig ud, så

enzymerne får bedre afgang til stivelsen.

Halm

Halm indeholder polysakkaridet cellulose. Cellulose forekommer i plantecellernes cellevæg for at

gøre denne stiv og modstandsdygtig, og er ikke opløseligt i vand. Cellulose består af β-D-

glukosemolekyler bundet sammen i β-1,4-glukosidbindinger i lange uforgrenede kæder. Disse

bindinger gør cellulosemolekylet langt og trådformet.

Den enzymatiske nedbrydning af cellulose sker vha. cellulaser, som er en blanding af

cellobiohydrolaser, endoglukanaser og β-glukosidaser. Disse tre enzymer komplementerer

hinanden. Cellobiohydrolase nedbryder cellulose til cellobiose, som er et disakkarid.

Cellobiohydrolase kan kun ”angribe” cellulose fra enderne. Endoglukanase spalter cellulose til

kortere cellulosekæde. Dette sker tilfældigt på den lange cellulosekæde. På denne måde bliver der

skabt flere ender på cellulosen, som cellobiohydrolase kan angribe. β-glukosidase nedbryder

cellobiose til glukose. β-glukosidase nedbryder cellobiohydrolases produkt til glukose, som er det

endelig produkt, der skal komme ud af en enzymatisk nedbrydning af cellulose.

Cellulaserne, der arbejdes med i forsøgene, har et pH-optimum på omkring pH 529

29 Forsøgsvejledning ”Reaktionshastighed af cellulaser ved forskellige temperaturer”

Figur 10 Amylopektin


Figur 11 Cellulasernes nedbrydning af cellulose

Cellulose i planter er bundet i et netværk af hemicellulose og lignin. Cellulose, hemicellulose og

lignin kaldes tilsammen lignocellulose. Hemicellulose ligner cellulose, men er mere forgrenet og

består ud over glukose også af andre monosakkarider bl.a.

xylose og arabinose, som ikke umiddelbart kan gæres til

ethanol. Lignin dannes ud fra aminosyren fenylalanin og er

opbygget af en netværk af phenoler, dvs. aromatiske

alkoholer. Phenylgrupperne, dvs. de aromatiske ringe, er

hydrofobe. Fordelingen af de tre stoffer varierer efter

hvilken plante, der arbejdes med.

Halmstrå består af ca. 35-40% cellulose, 20-30%

hemicellulose og 20-25% lignin30.

Indholdet af lignocellulose nedsætter tilgængeligheden af cellulose for enzymer og derfor er en

vigtig faktor at have med, når man vil udnytte cellulose fra planterester som biomasse til gæring af

bioethanol.

Ved fx opvarmning til 180-200°C kan netværket af lignin delvisbrydes, så det bliver muligt at skille

hemicellulose fra cellulose. Ligninen vil trods behandlingen forblive bundet til cellulose og gøre det

svært for enzymerne at arbejde31.

30”Lignocellulose”, Biotech Akadameys hjemmeside

Figur 12 Opbygning af lignocellulose


Mindste kvadraters metode

Ved data fra et eksperiment eller resultater fra en undersøgelse, kan det være praktisk at beskrive

sammenhængen og på denne måde lave en generalisering for resultaterne. Jeg vil beskrive teorien

bag en lineær regression, f (x) ax b , da jeg benytter netop denne type regression i forsøget

”Bestemmelse af glukoseindhold i hydrolyseprøver”.

For at få et overblik over data og den lineære regression, kan det være en god ide at tegne dataen

ind som punkter i et koordinatsystem. Punkterne for sig selv kan beskrives ved ”den tilfældig

model”, som i princippet ikke beskriver sammenhængen, men kun de enkelte data. Den lineære

regression beskriver en lineær sammenhæng for datapunkterne.

Når man vil beskrive en række data ved hjælp af en lineær regression, skal regressionen helst falde

så tæt på de data, man har med at gøre. Der findes derfor nogle tal, som fortæller hvor godt en

regression beskrive den række data, der er tale om.

Hvert datapunkt har en vis afvigelse, dn, fra regressionen. Denne afvigelse bestemmes ved

afstanden fra punktet, (xn,yn), til regressionen. Matematisk beregnes afvigelsen som differensen

mellem datapunktets y-værdien og regressionens y-værdi ved sammen x-værdi:

dn yn (a xn b)

Kvadratsum-afvigelsen, R, er summen af den kvadrerede afvigelsen for hvert datapunkt:

R (d1)2 (d2)

2 (d3)2 (d4)

2 . . .(dn)2

Kvadratsumafvigelsen, R, kaldes også for den resterende variation, da denne beskriver variationen

mellem den tilfældige model og den lineære model32.

Jo mindre R er, des bedre beskriver regressionen datapunkterne. Det gælder derfor om at finde en

værdi for a og b i forskriften for regressionen, som giver den mindst mulige R-værdi.

31 ”Fra halm til alkohol” s. 13 32 ”Tænk med en graf”, s. 65


Den totale variation, T, beskriver variationen i den tilfældige model. T beregnes ved summen af

kvadraterne på forskellen mellem datapunkternes y-værdi og den gennemsnitlige y-værdi for

datapunkterne33:T (y1 ymi dde l)2 (y2 ymi dde l)

2 (y3 ymi dde l)2 (y4 ymi dde l)

2 . . .(yn ymi dde l)2

Den gennemsnitlige y-værdi beregnes ganske enkelt ved summen af y-værdierne delt med antallet

af y-værdier.

Den totale variation, T, og den resterende variation, R, benyttes til at beregne forklaringsgraden,

R2, som fortæller hvor stor en del af datapunkterne, der bliver beskrevet ved regressionen:

R2T R

T

Hvis den resterende variation, R, er lav, vil forklaringsgraden være tæt på 1. Er den resterende

variation derimod tæt på at være lig T, vil forklaringsgraden være tæt på 0. Forklaringsgraden vil

aldrig kunne blive et negativt tal, da både T og R er summen af kvadrater. R vil aldrig blive større

end T, derfor vil forklaringsgraden altid ligge mellem 0 og 1. Jo tættere forklaringsgraden ligger på

1, des bedre passer den lineære regression. En lineær regression regnes for acceptabel med en

forklaringsværdi på over 0.95 og glimrende hvis forklaringsværdien er over 0.99.

Benyttelse af de resterende variation og forklaringsgraden kaldes ”Mindste kvadraters metode”,

da man benytter sig af afgivelserne kvadreret og det gælder om at få den mindst mulige

kvadratsum-afgivelse34.

Bestemmelse af standardkurve

I forsøget ”Bestemmelse af glukose i hydrolyseprøver” laves en standardkurve, som benyttes til

bestemmelse af glukoseindhold i ukendte prøver. Jeg vil i dette afsnit forklare den matematiske

teori bag standardkurven og vise benyttelsen af ”Mindste kvadraters metode”35.

Målingerne af glukoseprøverne:

33 ”Tænk med en graf”, s. 64 34 ”Tænk med en graf” s. 69 35 Forklaring af forsøg samt benyttelse af standardkurven kommer i gennemgang af forsøget ”Enzymatisk hydrolyse samt bestemmelse af glukoseindhold i hydrolyseprøver”


Gukose Konc. (g/L) Absorbans

0 0

0,005 0,029

0,01 0,054

0,05 0,248

0,1 0,493

0,2 1,009

For at få overblik over resultaterne, plottes de ind i et koordinatsystem. Det ses tydeligt i

koordinatsystemet, at punkterne har en lineær sammenhæng.

Jeg vil nu beregne den optimale a- og b-værdi for den lineære regression, som beskriver

standardmålingerne bedst.

Først beregner jeg hvert punkts afvigelse fra den lineære regression. Værdierne for a og b er stadig

ukendte.


Med disse afvigelse kan jeg udtrykke den resterende variation R ved a og b:

Hvis værdien for b fastholdes, kan R udtrykkes som et andengradspolynomium, R(a):

Ligeledes kan R udtrykkes som andengradspolynomium, R(b), hvis a-værdien holdes fast:

Et andengradspolynomium har den generelle formel: y(x) ax2 bx c. I begge ovenstående

polynomier er a-værdien positiv, hvilket betyder, at parablen for polynomierne vil have ”benene”

vendende opad. X-værdien i toppunktet på parablerne vil derfor være den x-værdi, som giver den

mindst mulige y-værdi. Y-værdien svarer i begge polynomier til den resterende variation, R. For

den bedste rette linje gælder det, at R-værdien er mindst mulig. Toppunkterne for de to

polynomier skal derfor findes.

Et andengradspolynomiums toppunkt har koordinaterne Tb

2a,b2 4ac

4a.

Jeg definerer a-, b- og c-værdien for R(a):


Jeg definerer a-, b- og c-værdierne for R(b):

Toppunktets x-værdi for R(a), at:

Toppunktets x-værdi for R(b), bt:

Når R-værdien er mindst mulig, så er a og b i den lineære regression lige at og bt. Jeg benytter

solve-funktionen:

For at få den mindste resterende variation, skal den lineære regression have forskriften


Forklaringsgraden for denne regression36:

Forklaringsværdien er tæt på 1, hvilket betyder at regressionen passer glimrende. Excel giver

sammen regression, som jeg kom frem til ud fra mindste kvadraters metode.

Forsøg udført på Det Biovidenskabelige Fakultet, KU

Formålet med forsøgene var at illustrere biomassers forskellighed i forhold af enzymatisk

nedbrydning og forbehandling. Optimaltemperaturen for cellulaser blev også testet samt

forbehandlingens betydning for gæringen.

I de næste afsnit vil jeg kort tilføje enkelte detaljer omkring teorien, som indtil nu ikke er

gennemgået, en kort beskrivelse af fremgangsmetode, en behandling og fremstilling af data samt

en kort kommentering på resultaterne, eventuelle fejlkilder og diskussion. En fælles opsummering

og konklusion på resultaterne vil komme efter gennemgang af alle tre forsøg.

36 ”Glukose” er en liste med glukoseindholdet, ”absorbans” er en liste med tilsvarende absorbans og ”ymiddel” er den gennemsnitlige y-værdi for målingerne, dvs. den gennemsnitlige absorbans.


Enzymatisk nedbrydning, samt bestemmelse af glukoseindhold i

hydrolyseprøver

Formålet med dette forsøg er at undersøge hvilken forbehandling og hvilket enzym, der for tre

forskellige biomasser, giver det største udbytte af glukose. Jo større udbytte af glukose, jo større

udbytte af ethanol, kan der opnås ved gæring. Nedbrydningen af biomassen til glukose er et

essentielt skridt i produktion af bioethanol. Her skal man overveje, hvilke biomasse, der arbejdes

med og hvilken type enzym samt forbehandling, der vil være fornuft at benytte. Det er derfor i

dette skridt, omkostningerne kan variere alt efter hvilken løsning, man vælger.

Teori

Der anvendes tre biomasser, som alle findes i typisk dansk landbrug: hvedekerner (i form af

hvedemel), sukkerroer og halm. Biomasserne testes uden forbehandling og efter kogning ved

100°C. Halm kogt under tryk ved 190°C bliver ligeledes testet. Der anvendes en

stivelsesnedbrydende enzymblanding (amylaser) og en cellulosenedbrydende enzymblanding

(cellulaser). Der fortages også prøver, hvor der intet enzym blev tilsat. I alt 21 kombination. Der

laves duplikater af alle prøverne.

Glukose-indholdet i prøverne bestemmes ved en to-trins enzymatisk metode, hvor ”Glukose Assay

Reagens” (GAR) tilsættes. GAR er tilsat enzymet invertase, så det bliver muligt at måle på glukosen

fra sukrose i sukkerroen.

Når GAR tilsættes, bliver glukose først til glukose-6-fosfat, som er en reaktion, der katalyseres af

enzymet hexokinase og hjulpet af coenzymet ATP. Fosfat-gruppen fra ATP overføres til glukose, og

ATP bliver til ADP. Dernæst bliver glukose-6-fosfat til 6-fosforglukonat, som katalyseres af glukose-

6-fosfat-dehydrogenase med coenzymet NAD. NAD optager et hydrogenatom fra glukose-6-fosfat

og bliver til NADH.

1. C6H1 2O6 ATP C6H1 1O6P ADP

2. C6H1 1O6P NAD C6H1 0O6P NADH

Reduktionen af NAD til NADH giver en øget absorbans ved λ=340nm, som er proportional med

glukoseindholdet i opløsningen. Der laves en standardkurve, hvor absorbansen måles på kendte


glukose-koncentrationen. Da absorbansen er proportional med glukose-indholdet, får

standardkurven forskriften: A a [glukose] b 37.

Da glukoseindholdet i hydrolyseprøverne er ukendt, måles absorbansen for hver prøve ved tre

fortyndinger, 25x, 100x og 500x. På denne måde sikres det, at en af målingerne vil falde inden for

standardkurvens måleområde, hvilket vil gøre bestemmelsen af glukose-indholdet mest præcis.

Ved denne måde at bestemme glukoseindholdet i prøverne bliver indholdet af fruktose i

sukkerroeprøverne ikke målt. Ved gæring vil fruktose dog blive gæret til ethanol på samme måde

som glukose. Ved sammenligning af glukoseindholdene fordobles derfor det målte

glukoseindholdet i sukkerroeprøver.

Fremgang

De forskellige biomasser samt forbehandling fordeles mellem holdene, der hver laver 6 prøver.

Vejlederne har udregnet en masse for hver biomasse, som svarer til 1.5 g ovntørt materiale. På

denne måde sikres det at der er lige meget materiale ved hver prøve uanset hvilke type biomasse,

der arbejdes med. Biomassen afvejes og tilsættes 20mL demineraliseret vand. Flaskerne rystes så

alt materiale fugtes og kommer ned i opløsningen38. De prøver, som skal forbehandles ved 100°C,

koges i vandbad i 10min39. Efter forbehandling og afkøling noteres evt. ændringer i udseende samt

forskelle ved de forskellige prøve40. Alle prøverne tilsættes 3mL 0,5 natriumcitratbuffer, som sikrer

en fast pH på 4.8 og ens forhold i alle prøver. Volumen justeres til ca. 30 mL og der tilsættes 1 mL

enzym41. Låget skrues på hver flaske, og prøverne sættes i rysteinkubator ved 50°C42 i et døgn.

Efter 24 timer tages prøver ud af rysteinkubatoren. Forandringer ved prøverne noteres43. Og

forberedelsen af hydrolyseprøverne til bestemmelse af glukoseindhold kan begyndes.

37 ΔA betyder, at der for hver absorbans-måling bliver fratrukket en baggrunds-absorbans, som måles ved en prøve indeholdende GAR og 0 g/L glukose. 38 Det undgås så vidt muligt at noget af biomassen sidder på flaskernes sidde. 39 Lågene på flaskerne sættes ikke helt fast pga. tryk ved kogning 40 Opløseligheden af materialer samt forskelle af opløselig ved forbehandlet materiale 41 Amylase, cellulase eller vand 42 Temperatur-optimum for enzymerne, der arbejdes med 43 Farve og opløselighed ved brug af de forskellige enzymer


Prøver til standardkurve laves ud fra fortynding af en standardglukoseopløsning (0.5 g/L)44.

Hydrolyseprøverne laves i tre fortyndinger, 25x, 100x og 500x fortyndet45. 0.050 mL af hver prøver

overføres til en mikrotiterplade to gange, således at der i hver kolonne er to prøver af 25x-

fortynding, to prøver af 100x-fortynding og 2 prøver af 500x-fortynding. Alle standardprøverne

samt halvdelen af hydrolyseprøverne tilsættes 0.20mL GAR. Resten af hydrolyseprøverne tilsættes

0.20mL vand46. Pladen står i 15 min, hvor efter absorbansen kan måles på en

mikrotiterpladelæser.

Observationer

Efter forbehandling er den generelle observation at sukkerroe og halm behandlet ved 100°C og

190°C virkede mere opløst i væsken end de uforbehandlede. Forbehandlet mel lå som en

géléklump i bunden af flaksen.

Efter 24 timers hydrolyse er næsten al halm forbehandlet ved 190°C og tilsat cellulase opløst.

Prøverne for mel og sukkerroe tilsat cellulase havde alle fået en gullig farve. I melprøven med

amylase havde opløst en smule af klumpen mens klumpen i melprøven med cellulase var i mindre

stykker. Ved prøverne med sukkerroe var der ingen markant forskel mellem enzymtyperne.

Resultater og beregninger47

Ud fra hvert holds standardprøver laves en standardkurve48 (lineær regression) med forskriften

. Absorbansen for prøverne med ukendt glukoseindhold bliver målt og er derfor en

kendt værdi. Med a- og b-værdien for standardkurvens forskrift kan glukoseindholdet i prøverne

beregnes ved:

A a Glukose b

GlukoseA b

a

44 Se skema for fortynding på bilag 9 45 Se skema for fortynding på bilag 10 46 Se oversigt mikrotiterpladen på bilag 11 47 Se resultaterne for hvert hold på bilag 13 48 Dette er også gjort manuelt i afsnittet ”Mindste kvadraters metode”

f (x) ax b


Enheden på glukoseindholdet er g/L. Da prøverne er fortyndede, beregnes glukoseindholdet i

fortyndingen og ikke i selve prøven. For at finde glukoseindholdet i den oprindelige, ufortyndede

prøve, skal der ganges med fortyndingsfaktoren:

GlukoseprøveA b

afortynding

Hvis man beregner glukoseindholdet for en prøve, som er fortyndet 25gange, så er

fortyndingsfaktoren 25.

Ved hydrolyseprøverne fratrækkes, som ved standardkurven, også en baggrundsabsorbans. Dette

er absorbansen for prøve tilsat vand i stedet for GAR. Et eksempel49:

A(P12 5x) A(P12 5x (GAR) ) A(P12 5x (v a n d) ) 0.1 3 60.0 9 30.0 4 3

Glukoseindholdet beregnes for hver absorbansmåling, dvs. tre mulige glukoseindhold pr prøve.

Det beregnede glukoseindhold varierer meget efter hvilke fortynding, der regnes på.

Standardkurven er bedst omkring midten. Ligger en målingen længere ud af y-aksen end det sidste

punkt på standardkurven, kan man ikke være sikker på, at standardkurve vil fortsætte lineært og

derved regne med, at kurven passer til målingen. Ligger et punkt helt nede i begyndelsen af

standardkurven, er det for små tal, der arbejdes med til, at det kan stoles på.

Vejlederne50 har vedtaget af standardkurven passer bedst fra en absorbans på over 0.2. Hvis

absorbansen for 500x-fortyndingen er over 0.2, benyttes denne måling til beregning af

glukoseindhold. Er den derimod under 0.2, mens fortyndingen 100x har en absorbans på over 0.2,

benyttes denne måling i stedet. Er ingen af fortyndingernes absorbans på over 0.2, benyttes

målingen for 25x, da denne i så fald vil være mindst fortyndet og derved passer bedst. I Excel er

der benyttet en formel, således at denne sortering finder sted automatisk51.

Vejlederne udleverede nogle procenter for, hvor stort et teoretisk udbytte glukose, man kan få ud

af de tre forskellige biomasser. Alle udvalgte glukoseindhold sammenlignes ved udregning af

udbytteprocent af praktisk udbytte i forhold til teoretisk 52. Procenterne er baseret på vejledernes

49 Data benyttet er for prøven nr. 1 for halm, 100°C, ingen enzym 50 På Det Biovidenskablige Fakultet, KU 51 Billede af denne formel ses på bilag 12 52 Se sammenlignede glukoseindhold på bilag 14


egen erfaring og er en kraftig generalisering. Det er derfor muligt at få over 100% praktisk udbytte

i forhold til det teoretiske.

Prøverne bestod af 1.5 g biomateriale i 30mL volumen. Hvis alt biomaterialet bliver omdannet til

glukose, vil det svare til et glukoseindhold på 50 g/L.

1.5g

30 10 3L50

g

L

Da der bliver tilføjet vand for at bryde bindingerne mellem glukoseenhederne, ganges der med en

faktor på 1.1153. Det maximale udbytte af glukose er derfor 55.5 g/L. Da der ved hydrolyse af

sukrose kun vil blive tilsæt et vandmolekyle for 2 glukosemolekyler54, er faktoren for sukrose

1.053.

I cellulose er ca. 35% af glukosen tilgængelig. Det samme tal for stivelse er 80% og for sukrose

65%. Det teoretiske glukoseudbytte af cellulose er således 35% af 55.5 g/L.

Udbytteprocenten for hver prøve beregnes ved Glukoseprøve

Glukoseteori100%. Det målte glukoseindhold for

prøverne med sukkerroe fordobles, da fruktose kan gæres til ethanol på lige fod med glukose og

derfor bør tælles med i udbyttet. Det er netop mængden af mulig bioethanol, der er interessant.

53 Udleveret af vejlederne 54 Et fruktose-molekyle og et glukose-molekyle, men da de har samme effekt i gæringen, ses og omtales fruktose i denne forbindelse som et glukose-molekyle.

Materiale Enzym Behandling Glukose, g/L Glukose+fruktose Udbytte%

Halm cellulase 190 26,82996512 26,82996512 138,12

Halm cellulase 190 27,95080935 27,95080935 143,89

Mel amylase 100 34,66045907 34,66045907 78,06

Mel amylase 100 41,10284272 41,10284272 92,57

Mel cellulase 100 47,13618614 47,13618614 106,16

Mel cellulase 100 41,20510278 41,20510278 92,80

Sukkerroe cellulase 100 20,98758257 41,97516514 122,65

Sukkerroe cellulase 100 19,78559809 39,57119618 115,63


Ved udbytteberegningerne ses det, at halmprøverne gav største udbytte i kombination med

cellulase og en forbehandling på 190°C. Melprøverne gav størst udbytte med tilsat cellulase og

100°C forbehandling. Melprøverne tilsat amylase har dog et stort udbytte, som ikke er meget

lavere end udbyttet ved cellulaseprøverne. Sukkerroeprøverne giver meget stort udbytte med

tilsat cellulase og 100°C forbehandling. Sammenlignes udbytteprocenterne for halm, mel og

sukkerroe uden tilsætning af enzym og forbehandling, giver sukkerroe klart det største udbytte.

Fejlkilder

Udbytteprocenterne er udregnet for en kraftig generalisering, hvilket betyder at man ikke bør

fokuserer for meget på selve tallene. Det giver dog et billede af prøvernes resultat i forhold til

hinanden.

Enzymer stammer fra enzymblandinger, som ikke er af den dyreste slags. Det er dyrt at oprense

enzymer, hvilket kan betyde, at de mindre dyre enzymblandinger ikke er helt rene. Der kan være

andre herlige enzymer i, som forsøget og teorien ikke tager højde for. Dette kan forklare den

mystiske gullige farve, der opstod i cellulase-prøver, samt det store udbytte i alle cellulase-prøver

uafhængigt af den benyttede biomasse.

Reaktionshastighed af cellulaser ved forskellige temperaturer

Formål med denne øvelse er at bestemme reaktionshastigheden af cellulasers nedbrydning af

glukose ved forskellige temperaturer. Reaktionshastigheden fortæller, hvor effektivt enzymerne

arbejder.

Materiale Enzym Behandling Glukose, g/L Glukose+fruktose Udbytte%

Sukkerroe ingen Ingen 2,454287558 4,908575116 14,34

Sukkerroe ingen Ingen 7,666784479 15,33356896 44,81

Mel ingen Ingen 1,084970759 1,084970759 2,44

Mel ingen Ingen 1,059531309 1,059531309 2,39

Halm Ingen Ingen 0,343946888 0,343946888 1,77

Halm Ingen Ingen 0,220654023 0,220654023 1,14


Teori

Filterpapir, der benyttes som substrat i forsøget, består af cellulose. Der benyttes derfor cellulaser

i forsøget.

Hastigheden bliver målt ved stuetemperatur, 32°C, 50°C og 80°C. Den enzymatiske nedbrydning vil

blive fulgt løbende ved målinger efter 10, 20, 30, 45 og 60 min (efter tilsætning af enzym).

Alle prøverne i forsøg tilsættes 0,5 M natriumcitrat-buffer, som giver en fast pH på 4.8. Dette

gøres for at skabe et ens miljø for alle prøver samt en god pH-værdi for enzymerne.

I forsøget benyttes DNS, som standser den enzymatiske nedbrydning af filterpapiret. På denne

måde kan man, efter alle prøver er stoppet, måle mængde af dannet glukose løbende over en

periode. Forsøget kører i en time.

DNS er 3,5-dinitrosalisylsyre og har en pH på 11. En pH på 11 vil få cellulaserne til at ændre

struktur og dermed virkeevne. Derfor vil den enzymatiske nedbrydelse stoppe. Samtidig vil DNS

går i forbindelse med glukose og danne 3-amino-5-nitrosalisylsyre, som ved opvarmning til 100°C,

vil blive orangerødt. Mængde af 3-amino-5-nitrosalisylsyre er ækvivalent med mængden af dannet

glukose. Måling af absorbans i prøver vil derfor fortæller, hvor meget glukose, der er dannet i

prøven. Absorbansen måles ved en bølgelængde på 540nm, som er en lysegrøn farve. Denne

bølgelængde er valgt, da der måles på rødorange væske. Rød er komplementærfarve til grøn.

Grønt lys vil derfor blive absorberet af en rød væske. Jo rødere væsken er, des mere af det grønne

lys vil blive absorberet. Jo rødere væsken er, des mere 3-amino-5-nitrosalisylsyre findes i væsken.

Der laves måling af baggrundsabsorbans, kaldet Ablank. Ablank bliver målt på en opløsning af buffer

og DNS.

Fremgang

Hvert hold får tildelt en temperatur. Der skal udtages prøver ved 5 tidspunkter, og der laves

duplikater, dvs. 10 prøver for hver gruppe. Prøverne mærkes, så det er tydeligt, hvilken

temperatur de har stået ved samt hvor længe de har stået. De to prøver tilsættes 1,0 mL buffer og

0,5 mL enzymblanding (Cellulast). Prøverne sættes ved den ønskede temperatur i 2-3 min, således

at enzymvæsken er på den ønskede temperatur ved forsøgets start. Substratet i form af filterpapir


foldet 3 gange kommes i prøverne og stopuret startes. Der sættes låg på prøverne. Efter

henholdsvis 10, 20, 30, 45 og 60 min, udtages to af prøverne55. De udtaget prøver tilsættes 3mL

DNS. Når alle prøver er taget ud og tilsat DNS, koges de i 10 min56. Alle prøver tilsættes 20 mL vand

og vandes nogle gange for at prøverne bliver blandet. De står i 10mins tid så papiret kan

bundfalde, inden 250 μl af hver prøve overføres til en mikrotiterplade. Absorbansen måles i en

mikrotiterplade ved λ=540nm.

Resultater og beregninger57

Ved hver temperatur og tidspunkt beregnes en gennemsnitlig absorbans58. Glukoseindholdet for

hver gennemsnitlige absorbans beregnes vha. standardkurven59.

Figur 13 Taget fra bilag 15

Grafen viser, hvorledes glukoseindholdet i prøverne stiger over tid. Det ses tydeligt, at prøverne

ved en temperatur på 50°C giver bedste udbytte. 80°C ligger lavest, hvilket betyder, at disse

prøver gav mindst glukose.

55 Efter 10 min udtages de to prøver som er mærket ”10min”, så man til sidst ved præcis hvor længe hver prøve har fået lov til at reagere. 56 For at frembringe den røde farve i 3-amino-5-nitrosalisylsyre 57 Se bilag 15 for oversigt over målinger og beregnede data 58 Der er fire absorbansmålinger pr. tidspunkt og temperatur, undtagen for stuetemperatur, hvor kun en gruppe tog målinger, dvs. 2 målinger pr. tidspunkt. Absorbanserne fratrækkes Ablank 59 Udleveret af vejlederne


Som det ses på grafen er dannelsen af glukose over en time tilnærmelsesvis en lineært funktion.

Hældningen på grafen for en sådan lineær funktion har enheden mg glukose/min. Dette er et

udtryk for hvor meget glukose der omsættes i minuttet, dvs. en hastighed. Hældning fortæller om

enzymaktiviteten, dvs. reaktionshastigheden60.

I teoriafsnittet ”Enzymer” redegjorde jeg for begrebet Q10.

R2

R1

10

t2 t1

2 Q10

R1 og R2 er reaktionshastigheder og t1 og t2 er tilhørende temperatur. Ved at lave en lineær

regression for målingerne for hver temperatur, får jeg 4 hældninger, dvs. reaktionshastigheder.

Temperatur Reaktionshastighed

25 0,003223089

30 0,006764535

50 0,020002601

80 0,000825956

Reaktionshastigheden er stigende fra 25°C til 50°C, hvorefter den falder fra 50°C til 80°C. Dette

tyder på at temperaturen har passeret enzymerne deres optimaltemperatur, og de ved 80°C er

begyndt at denaturere, hvilket bekræfter teorien om optimaltemperatur.

Jeg benytter reaktionshastigheder til at beregne Q10 ud fra udledte formel:

Temperaturer Q10

25 og 30 4,404852776

25 og 50 2,075514065

25 og 80 0,780707078

For hver 10grader temperaturstigning bliver Q10 fordoblet. Måles der på to temperaturer med en

forskel på mindre end 10, kan disse ikke give et korrekt billede af hvor meget

60 Volumen og mængde af enzym er den samme i hver prøve, derfor er enheden på hastigheden ”kun” mg/min.


reaktionshastigheden er vokset efter 10graders stigning, hvilket er præcis hvad Q10 fortæller. Når

forskellen er større end 10grader, er det mere præcist at fortælle hvorledes reaktionshastigheden

vokser for hver 10graders stigning. Derfor bliver Q10 mellem 25°C og 30°C for stor, mens Q10

mellem 25°C og 50°C bliver utrolig tæt på 2. Q10 mellem 25°C og 80°C bliver meget lav, da

enzymerne efter 50°C er begyndt at denaturere, og reaktionshastigheden fra 50°C til 80°C er

faldet kraftigt. Efter 50°C vil Q10 ikke længere gælde.

Jeg laver en eksponentiel regression, f(x)=bax, for reaktionshastighed som funktion af

temperatur61.


Som det ses på forklaringsværdien, R2, passer regression ikke helt perfekt, men er dog acceptabel

idet R2 er lige over 0.9562. Dette skyldes formentlig, at der kun er tale om 3 punkter, som med det

blotte øje ser ud til at have en lineær sammenhæng. En lineær sammenhæng er ikke interessant,

da teorien siger, at reaktionshastigheden som funktion af temperaturen til en vis grad er en

eksponentielt stigende graf. For en eksponentielt stigende funktion gælder følgende63:

f (x) b ax b ek x

k ln( a) a ek

Regressionen har forskriften R(t) 0.0007e0.0 6 7 6x

. Værdien for a er derfor:

61 Jeg fravælger 80°C, da denne temperatur ikke gælder i begrebet Q10 62 Uddybelse findes i afsnittet ”Mindste kvadraters metode” 63 ”Matematisk Formelsamling – stx A” s. 20


k 0.0 6 7 6 a e 0.0 6 7 61.0 6 9 9 4.

Ved den matematiske udledning af Q10 er et af trinene a10 264. Hvis den eksponentielle

regression skal opfylde reglen om Q10, så skal a10 være lig 2.

a10 1.0699410 1.966 2

Den eksponentielt stigende regression opfylder så godt som reglen om Q10, hvilket betyder at

hydrolysen af cellulose bekræfter tommelfingerreglen om stigning i reaktionshastighed for

enzymkatalyserede reaktioner.

Diskussion

Forsøget foregår kun over en time. Det kan tænkes, at optimaltemperaturen er en anden, hvis

forsøget kører over længere tid. Det kunne også være interessant at kigge på maksimal udbyttet

ved de 4 temperaturer, for derefter at regne på det energimæssige udbytte i forhold til den energi

der kræves ved hydrolyse på den givne temperatur. Dette vil kræve, at hydrolysen kører så længe,

at al substratet er omdannet. Når enzymet har omsat al substrat, vil koncentrationen af glukose

være det samme lige meget, hvor længe man lader hydrolysen køre og grafen vil derfor falde ud.

Forskellen mellem temperaturerne vil ligge i tidspunktet, at grafen for glukose over tid flader ud.

Jo længere tid hydrolysen ved en given temperatur skal køre, jo mere energi skal der benyttes.

Gæring af hydrolysater

Formålet med dette forsøg er at måle produktionen af ethanol i en gæring over et døgn. Det

undersøges om forbehandlingen af biomassen har en betydning for gærens effektivitet, dvs.

produktionen af ethanol.

Teori

Biomassen, der gæres på er sukkerroe. Der gæres på fire forskellige kombinationer.

Forbehandling af sukkerroe Hydrolyse

Ingen Uden enzym

Med enzym

64 Hvis man tænker på det som en rentetilskrivning, så er a fremskrivningsfaktoren for hver rentetilskrivning og potensen er antallet af rentetilskrivning. Denne regnemåde tager højde for rentes rente.


120°C, 10 min Uden enzym

Med enzym

Den ønskede forbehandling af sukkerroe var oprindeligt 190°C i 10min, men grundet manglende

ressourcer er forbehandlingen af sukkerroe kun mulig på 120°C.

Sukkerroe består som nævnt tidligere af sukrose, som er et disakkarid af fruktose og glukose.

Ganske almindeligt bagegær (Saccharomyces cerevisiae), som der benyttes i forsøget, kan under

anaerobe forhold gære glukose og fruktose til ethanol.

Når levende organismer skal have frigivet energi fra kulhydrat foregår det ved en stofnedbrydende

proces – dissimilation. Den stofnedbrydende proces begynder med glykolysen, hvor glukose

omdannes til pyruvat, hvorefter det omdannes videre afhængig af hvilke forhold, der er tilstede

(aerob eller anaerob). I en organisme som gær, omdannes pyruvat under anaerobe forhold først til

ethanal og dernæst til ethanol. Glykolysen består af 10 reaktionstrin, som jeg ikke vil komme

nærmere ind på.

Glykolysen:

C6H12O6 2 ADP 2 P 2 NAD 2 CH3COCOOpyruvat

2 ATP 2 NADH 4 H

ADP, P, NAD+, ATP og NADH2 er alle coenzymer. NAD+ overfører hydrogenatomer og ATP overfører

fosfatgruppe og bliver til ADP og P. I glykolysen går fosfastgruppen dog den anden vej og optages

af ADP, der bliver til ATP.

Dernæst bliver pyruvat omdannet til ethanal vha. af enzymet puryvat-decarboxylase, som er en

lyase. Lyaser kan fraspalte CO2.

CO2. 2CH3COCOO 2 Hpyruvat decarboxylase

2CH3CHOethanal

2CO2

Der benyttes en dobbeltpil, da denne reaktion kan forløbe begge veje. Det er det samme enzym,

som katalyserer reaktionen uanset retning.

Ethanal er ustabilt og omdannes hurtigt videre til ethanol vha. enzymet ethanol-dehydrogenase,

som er en oxido-reduktase. Ethanal reduceres til ethanol og NADH oxideres til NAD+.

2CH3CHO 2 NADH 2 Hethanol dehydrogenase

2CH3CH2OHethanol

2 NAD


Bruttoligningen for dannelse af ethanol ved gæring bliver derfor

C6H12O6 2 ADP 2 Pgæ ring

2 CH3CH2OH 2 CO2 2 ATP

Ud fra bruttoligningen ses det, at for hver glukose-molekyle (og fruktose) der bliver omdannet,

bliver der produceret 2 ethanol-molekyler og 2 kuldioxidmolekyler.

Forsøget er opstillet således, at kuldioxiden kan ”løbe” ud af flasken, men ilt kan ikke komme ind.

Dette er vigtigt, fordi gæringen kun kan finde sted under anaerobe forhold. Er der ilt tilstede, vil

gæren i stedet for gæring, omsætte glukose til kuldioxid og vand, som ved ganske almindelig

respiration. Da kuldioxiden forsvinder fra flasken, vil flasken falde i vægt efterhånden som, der

bliver produceret ethanol.

De molare masse for glukose, ethanol og kuldioxid:

M(C6H12O6) MC 6 MH 12 MO 6 12,011g

mol6 1,0079

g

mol12 15,999

g

mol6 180,155

g

mol

M C2H5OH MC 2 MH 6 MO 12,011g

mol2 1,0079

g

mol6 15,999

g

mol46,0684

g

mol

M CO2 MC MO 2 12,011g

mol15,999

g

mol2 44,009

g

mol

Forholdet mellem glukose og produkterne, ethanol og kuldioxid:

Forhold glukose og CO2M CO2

M C6H12O6

2 44,009g

mol

180,155g

mol

0,489

Forhold glukose og ethanolM CO2

M C2H5OH

2 46,0684g

mol

180,155g

mol

0,511

Disse tal fortæller, at for hvert gram omdannet glukose, bliver der dannet 0,49 g kuldioxid og 0,51

g ethanol. Da vægttabet måler den dannede kuldioxid, er det interessant at finde forholdet

mellem kuldioxid og ethanol, således at vægttabet kan omregnes til dannet ethanol:

Forhold CO2 og ethanolM C2H5OH

M CO2

46,0684g

mol

44,009g

mol

1,0468

For hvert gram dannet kuldioxid, dvs. tab i vægt, bliver der dannet 1.0468 g ethanol65.

Gæren er selv i stand til at hydrolysere sukrose til glukose og fruktose. Der bør derfor ikke være en

markant forskel i glukoseproduktionen af ethanol ved tilsætning af enzym.

65 Vejlederne har benytte afrundet tal til beregning af denne faktor. Derfor benyttes faktoren 1.04 i databehandlingen


Fremgangsmetode

Holdene deles i to, så den ene halvdel laver prøver for uforbehandlet sukkerroe og den anden

laver prøver for forbehandlet sukkerroe. Der laves duplikater af alle prøver, dvs. hvert hold laver 4

prøver.

Begge materialer er væske af ekstraheret sukkerroe, forbehandlet og uforbehandlet, som er blevet

hydrolyseret ved rystebord i 50°C i 24 timer – både med og uden tilsat enzym.

50 mL flakser tilsættes 25 mL sukkerroe-væske. Flaskerne tilsættes 2mL gæropløsning, som

ligeledes var forbedret. Proppen med kanyle monteres og flaskerne vejes66. Alle flaskerne sættes i

rysteinkubator ved 32°C. Flaskerne vejes 4 gange i løbet et døgn og vægten noteres.

Resultater og beregninger

Ifølge målingerne har nogle af flaskerne i løbet af forsøget taget på i vægt, hvilket er umuligt og

højst sandsynlig skyldes en fejl i vejningen. En vægtforøgelse vil give et negativt vægttab. Disse

målinger bliver valgt fra, da de tydeligt er ukorrekte67. Der beregnes et gennemsnitlig vægttab for

alle prøverne af samme type, så der fås et gennemsnitlig vægttab over tid for hver kombination af

enzym og forbehandling. I alt 4 sæt data68.

Ud fra vægttabet beregnes mængden af dannet ethanol over tid. Volumen af prøverne var på 27

mL. Enheden på mængde dannet ethanol laves til mg/mL. Udregningen for dannet ethanol ser

således ud:

Ethanolvægttab

271000 1.04

[Ethanol]g

27mL

271000 1.04

mg

mL1.04

66 Der benyttes det samme vægt for alle prøve og alle vejninger for at minimere fejlkilde ved vejning. 67 Disse målinger er markeret med gult i tabellen på bilag 16 68 Se alle målinger og udregnede data på bilag 16



Grafen viser produktion af ethanol over tid for de fire kombinationer af forbehandling og enzym.

Kun kombinationen forbehandlet med enzym synes at falde uden for. De tre andre kombinationer

ligger tæt og forholdsvis samlet. Det ser derfor ud til at betydningen af forbehandling ikke har gjort

en markant forskel ved udbyttet af gæringen.

Fejlkilder

Hvis proppen ikke slutter tæt, eller der af en anden grund kommer ilt ned til gæren, vil gæren lave

respiration i stedet for gæring. Ved respiration bliver glukose omsat til 6 kuldioxidmolekyler og 6

vand molekyler. Omdannelsen af et glukosemolekyle vil resulterer i et større vægttab. Noteres

vægttabet som et resultat af gæring, vil udbyttet af ethanol være større end det i praksis er og

målingerne vil være forkerte.

Vægten er utrolig følsom, og der ligger derfor en vis usikkerhed i vejningen af prøver. Dette

kommer også til udtryk i de målte data, hvor nogle af prøverne tager på i løbet af gæringen.

Forbehandlingen på 120°C er ikke kraftig nok til at danne giftstoffer, som er den ønskede effekt.

Dette ses i resultaterne, idet der ingen markant forskel er på gæringerne. Havde forbehandlingen

haft sin effekt ville gæringen for disse prøver give et lavere glukoseindhold.


Opsummering og konklusion

Forsøgene har illustreret forskelligheden i forbehandling afhængig af biomasse samt betydningen

af temperaturen ved hydrolyse. Forsøget med gæring viste grundet den utilstrækkelige

forbehandling ikke den store forskel i forbehandling af sukkerroer ved gæring, dog viste teorien

bag dette forsøg, at der også findes forbehandling med negativ effekt.

Efter teorien og forsøget med hydrolyse af biomasser, er det tydeligt at biomasser fra

planterester, såsom halm, kræver en kraftigere forbehandling og en større blanding af enzymer

end biomasser som sukkerroer og mel. En kraftig forbehandling og en stor mængde enzymer har

store omkostninger. Vælges en billigere og mindre kraftig forbehandling eller en billigere og

mindre broget enzymblanding, vil udbyttet af ethanol også blive mindre. Dette udgør et af de

største problemer ved 2. generations bioethanol, da en produktion af bioethanol gerne skal kræve

så lidt energi og ressourcer som muligt, samtidig med at give så stort et udbytte som muligt. Ser

man desuden på den procentvise tilgængelighed af glukose, er den væsentlig lavere for cellulose

end den er for sukrose og stivelse. Så selvom udnyttelsen af biomassen er bedst muligt, vil glukose

udbyttet fra biomasser som halm giver en mindre udbytte i forhold til mængden af biomasse.

Bioethanol gæret på sukkerroer eller hvedekerner vil kræve mindre forbehandling og enzym end

fx halm og derved kræve mindre energi og penge at producere. Til gengæld har disse biomasser

andre anvendelser, som vil øge efterspørgslen og derved også prisen på biomassen.

Ved valg af enzym skal der også tænkes på de bedste forhold for enzymerne. Med en temperatur

på 50°C vil enzymerne måske være mest effektive, men brugen af energi vil også være tilsvarende

større. Vælges fx stuetemperatur, som ikke vil kræve meget energi at opretholde, vil enzymernes

aktivitet falde og udbyttet af hydrolysen være derefter.

Gær arbejder bedst ved 32°C. Det kunne derfor være en mulighed at slå hydrolysen og gæringen

sammen til et trin. Ved en sådan løsning skal man tage stilling til, om temperaturen skal være til

fordel for enzymerne, gæren eller om der findes en middelvej, hvor ingen af dem arbejder

optimalt, men måske giver det bedste udbytte ved en sammenkobling af disse to trin.


For at gøre produktion af 2. generations bioethanol rentabel, skal der ske fremskridt inden for

udviklingen og optimering af enzymer, optimering af gær samt forbehandling af planterester, som

ikke kræver for meget energi og skaber restprodukter, der kan hæmme resten af produktionen af

bioethanol. Der er derfor et stykke vej endnu før produktionen af 2. generations bioethanol bliver

rentabel.


Litteraturliste

Bøger

Abildgaard, Kristen; Larsen, Vagn Juhl; Selchau Kirsten; Skadhede, Thomas Larsen:

”Biologiens Abc – Biokemi”; kap. 1, 3 og 4 samt 5.2, 5.4 og 5.7.4.

Forlaget NICHE, 2007

Abildgaard, Kristen; Larsen, Vagn Juhl; Selchau Kirsten; Skadhede, Thomas Larsen:

”Biologiens Abc – Økologi og økotoksikologi”; s. 35

Forlaget NICHE, 2007

Cederberg, Gunnar; Kristiansen, Kim Rongsted:

”Alkoholer – kemi, teknologi, miljø”

L&R Uddannelse A/S, 2003

Cederberg, Gunnar; Kristiansen, Kim Rongsted:

”Aurum – Kemi fir gymnasiet 1”; kap. 9

Forlag Maling Beck, 2006

Christensen, Ditte Vesterager; Glejtrup, Eva; Larsen, Gy; Vedelsby, Jakob:

”Morgendagens Transportbrændstoffer – danske perspektiver”; s. 24-28

Teknologirådet, 2006

Dejgaard, Jørgen; Schomacker, Gert:

”Matematisk formelsamling stx A”; s. 12+20

Matematiklærerforeningen, 2007

Felsager, Bjørn; Schomacker, Gert:

”Tænk med en graf – matematik med grafregneren TI-83/82”; s. 60-69

Munksgaards Forlag, 1997


Mygind, Helge:

”Kemi 3”, kap. 7.8, 7.9, 7.12

P. Haase & Søns Forlag, 1996

Nielsen, Oluf; Springborg, Anni:

”Biokemi”; s. 57-66 samt s. 128

3. udgave

Nyt nordisk forlag Arnold Busck, 2002

Shou, Benthe:

”Kost og ernæring – kemi”; s. 11-31

Kemiforlaget

Torp, Kresten Cæsar:

”Biokemibogen – liv, funktion, molekyle”; kap. 4 + s. 144-146

Nucleus Forlag ApS, 2007

Artikler

Meyer, Anne; Rosgaars, Lisa:

”Fra halm til alkohol”

Aktuelt Naturvidenskab, nr. 3, 2005

Vedlagt, bilag 7

Devantier, Rasmus; Olsson, Lisbeth; Pedersen, Sven:

”Fremstilling af bioethanol – nutidens teknologi og fremtidens udfordringer”

Procesteknik, nr. 2, 2005

Vedlagt, bilag 8

Felby, Claus; Jørgensen, Henning; Larsen, Jan;Thomsen, Anne Belinda; Thomsen, Mette

Hedegaard;

”Fra halm og affald til morgendagens brændstof til biler”


Procesteknik, nr. 2, 2006

Vedlagt bilag 18

Hjemmesider

Inbicon A/S

”Biomass refinery” og ”The ethanol solution”

http://www.inbicon.com/pages/index.aspx

Besøgt d. 9.12.2009.

Kristiansen, Luise C.;

”Biologiske katalysatorer forbedrer brødet”; ”Stivelse og amylaser”

http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/enzymer/teori/amylase.aspx

Besøgt d. 15.12.2009

Poulsen, Simon Guldberg:

”Fra Halm til bioethanol, en bioteknologisk udfordring”

http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/bioethanol.aspx

Besøgt d. 9.12.2009.

Papirer

Jakobsen, Kurt:

”Lineær regression” + opgaver besvarelser (Udarbejdet af Signe Klinting)

Udleveret til matematik undervisning, 2.g

Vedlagt, bilag 17

Vejledere i forbindelse med forsøg på Det Biovidenskablige Fakultet på KU

Bruun, Sander

Lektor ved Institut for Jordbrug og Økologi/Plante- og Jordvidenskad

Lindedam, Jane

PhD studerende ved Institut for Jordbrug og Økologi/Plante- og Jordvidenskab


PowerPoint ”Potentiale for bioethanol i Danmark”

Vedlagt, bilag 6

Hansen, Mads A. T

PhD studerende ved Skov & Landskab

PowerPoint ”Enzymer – Hvad rager det mig?”

Vedlagt, bilag 5

Nord-Larsen, Pia

Post Doc ved Institut for Jordbrug og Økologi/Plante- og Jordvidenskab

Skovgaard, Pernille Anastasia

Forskerassistens på Skov & Landskab

Figuroversigt

Figur 1 Oversigt over trin i produktionen "Enzymer - Hvad rager det mig?" Figur 2 Grafen viser energiniveaut for en reaktion. Den lysegrønne graf er hvor reaktionen er enzymkatalyseret. Biokemibogen, s. 81 Figur 3 Enzyms virkning Aurum 2, s. 294 Figur 4 Reaktionshastighed som funktion af pH. Optimum er individuelt for hvert enzym Biokemibogen, s. 87 Figur 5 Reaktionshastighed som funktion af tempreaturen. Grafen falder brat efter optimaltemperatur. Biokemibogen, s. 86 Figur 6 Fra venstre: D-glukose og L-glukose Tegnet i Chemsketch Figur 7 D-glukose, der går på ringform "Enzymer - Hvad rager det mig?"


Figur 8 D-Fruktose og Alfa-D-Fruktose Biologiens ABC - biokemi, s. 13 Figur 9 Dannelse af sukrose Kost og Ernæring - kemi, s.20 Figur 10 Amylopektin Kost og Ernæring - kemi, s. 27 Figur 11 Cellulasernes nedbrydning af cellulose "Enzymer - Hvad rager det mig?" Figur 12 Opbygning af lignocellulose "Fra Halm til alkohol" Figur 13 Taget fra bilag 15 Figur 14 Taget fra bilag 15 Figur 15 Taget fra bilag 16


Bilag 1 – Forsøgsvejledning ”Enzymatisk hydrolyse af forskellige biomasser”


Bilag 2 – Forsøgsvejledning ”Bestemmelse af glukose i hydrolyseprøver”


Bilag 3 – Forsøgsvejledning ”Reaktionshastighed af cellulaser ved

forskellige temperaturer”


Bilag 4 – Forsøgsvejledning ”Gæring af hydrolysater”


Bilag 5 – PowerPoint ”Enzymer – Hvad rager det mig?”


Bilag – 6 – PowerPoint ”Potentiale for bioethanol I Danmark”


Bilag 7 – Artikel “Fra Halm til alkolhol”


Bilag 8 – Artikel ”Fremstilling af bioethanol”


Bilag 9 – Skema for fortynding af standardprøver


Bilag 10 – Skema for fortynding af hydrolyseprøver


Bilag 11 – Oversigt iver mikrotiterplade for hydrolyse

1 2 3 4 5 6 7

A S 0

(GAR)

P1-25x

(GAR)

P2-25x

(GAR)

P3-25x

(GAR)

P4-25x

(GAR)

P5-25x

(GAR)

P6-25x

(GAR)

B S 0,005

(GAR)

P1 -100x

(GAR)

P2 -100x

(GAR)

P3 -100x

(GAR)

P4 -100x

(GAR)

P5 -100x

(GAR)

P6 -100x

(GAR)

C S 0,01

(GAR)

P1-500x

(GAR)

P2-500x

(GAR)

P3-500x

(GAR)

P4-500x

(GAR)

P5-500x

(GAR)

P6-500x

(GAR)

D S 0,5

(GAR)

P1-25x

(vand)

P2-25x

(vand)

P3-25x

(vand)

P4-25x

(vand)

P5-25x

(vand)

P6-25x

(vand)

E S 0,1

(GAR)

P1 -100x

(vand)

P2 -100x

(vand)

P3 -100x

(vand)

P4 -100x

(vand)

P5 -100x

(vand)

P6 -100x

(vand)

F S 0,02

(GAR)

P1-500x

(vand)

P2-500x

(vand)

P3-500x

(vand)

P4-500x

(vand)

P5-500x

(vand)

P6-500x

(vand)

Standardprøverne i kolonne 1, række A-F

Prøver tilsæt GAR i kolonne 2-7, række A-C

Prøver tilsat vand i kolonne 2-7, række D-F

Prøve Forkortelse

Halm, 100°C, Ingen enzym, nr. 1 P1

Halm, 100°C, Ingen enzym, nr. 2 P2

Halm, 100°C, amylase, nr. 1 P3

Halm, 100°C, amylase, nr. 2 P4

Halm, 100°C, cellulase, nr. 1 P5

Halm, 100°C, cellulase, nr. 2 P6


Bilag 12 – Excelformel i forbindelse med udvælgelse af resultat


Bilag 13 – Holdresultater for hydrolyse prøver Hold 1


Hold 2


Hold 3


Hold 4


Hold 5


Hold 6


Hold 7


Bilag 14 – Samlede resultater for hydrolyseprøver


Bilag 15 – Data for forsøget med reaktionshastighed


Bilag 16 – Data fra gæringsforsøg


Bilag 17 – Papirer fra matematik undervisning til gennemgang af ”Mindste kvadraters metode”


Bilag 18 – Artikel ”Fra Halm og Affald til morgendagens brændstoffer til biler”

Bioethanol et alternativt brændstof -...

Documents

Transcript of Bioethanol et alternativt brændstof -...