Análisis Elemental de Muestras Clínicas. Introducción al ... · (3 tubos concéntricos) RF...
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Elementos de interés en fluídos biológicos
(orina, sangre, suero, plasma)
ELEMENTOS POTENCIALMENTE TÓXICOS
ELEMENTOS ESENCIALES
METALES PESADOS ALTAMENTE TÓXICOS
• Cd, Pb, Hg (As), etc.
• Al, Sb, Ba, Be, Bi, Li, Ni, Sr, Tl, etc.
• Cr, Co, Cu, Mg, Mn, Se, V, Zn, etc.
ESPECIES QUIMICAS
• MeHg, Metaloproteínas, péptidos y fosfopétidos, metalodrogas, etc
Agilent en Espectroscopía Atómica. Hoy!!.
AA Llama
AA Cámara de Grafito
Espectroscopía Atómica: Técnicas de análisis elemental
MP-AES
ICP-OES
ICP-MS
ICP-MS QQQ
Nuevo!!
Nuevo!!
Necesidades analíticas para la medida de metales
en un laboratorio clínico
Sistema de introducción de muestras robusto
Para todas las matrices manejadas rutinariamente (orina, sangre, etc.)
Medida de muchos elementos en una misma adquisición
Reducción tiempos de análisis
Mejora de la productividad
Reducción de los costes de análisis
Medidas a nivel de trazas y de altas concentraciones en una misma adquisición
Reducción tiempos de análisis
Mejora de la productividad
Reducción de los costes de análisis
Posibilidad de determinación de especies con heteroátomos
Especiación, farmacocinéticas, estudios metabólicos, etc
¿Que es un ICP-MS?
ICP - Inductively Coupled Plasma
• Fuente de iones a alta Tª
• Decompone, atomiza e ioniza la muestra
MS – Espectrómetro de masas
• Diferentes tipos de analizadores de
masas (Qpole, TOF, DF)
• Intervalo de masas de 7 a 250 amu
(Li a U.)
• Detector de modo dual (ppt a ppm)
• Proporciona información isotópica
Técnica de análisis elemental inorgánico
Page 6
El plasma ICP como fuente de ionización
RF coil
Canal central (Carrier Gas+ muestra)
Gas Plasmógeno
Gas Auxiliar
Antorcha Cuarzo (3 tubos concéntricos)
RF induce la rápida oscilación de Ar+ y e- (>1% Ar+, Tª~10000 K)
Muestra (aerosol) es transportada al centro del plasma (Tª~6500 K
Presión atmosférica Alta eficacia de ionización
d.e. (1015 e cm-3)
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Procesos que ocurren en el plasma
Aerosol con la muestra
Desolvatación
H2O(l) H2O(g)
Vaporización
MX(s) MX(g)
Atomización
MX(g) M + X
Ionización M M+
Recombinación M+ + e- M
M+ + O MO+
Analito presente como M+
Analizador de masas
¿Qué elementos pueden ser medidos mediante
ICP-MS?
TODOS a excepción de:
• Presentes en el plasma
• Elementos <5 amu o >260 amu
• No ionizables
Evolución de Agilent en ICP-MS
1987 2000 2009 1994
First computer-controlled ICP-MS
PMS 100
4500 Series
7500 Series
7700 Series
Enabling high
sensitivity
metal analysis
Enabling routine
robust ICP-MS
analysis
Enabling a new level
of interference
management
World's first benchtop system. Hyperbolic profile quad, motorized torch XYZ, cool plasma
Enabling a new level of
ease of use in ICP-MS
9 orders detector range Octopole Reaction System
HMI, ISIS-DS, 3rd Generation ORS Masshunter SW
Enabling a new era in
ICP-MS analysis
8800 ICP-QQQ
World’s first ICP-QQQ for unparalleled interference removal and sensitivity
2012
Agilent 7700x ICP-MS con Octopole Reaction System (ORS3)
Entrada de gas de dilución del kit HMI
Cámara de nebulización refrigerada por Peltier
Lentes iónicas Off-axis
Sistema de introducción de muestra de bajo flujo
Generador de RF de 27MHz de frecuencia variable
Sistema de vacío de alto rendimiento
Entrada del gas de celda
Cuadrupolo hiperbólico de alta frecuencia (3MHz)
Detector simultáneo dual rápido (109 intervalo dinámico lineal)
Interfase de extracción (alta transmisión, tolerancia a matriz)
3º generación Octopole Reaction System (ORS3)
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“Autosampler” integrado ultra-inerte
Diseñado especialmente para aplicaciones que requieran alta
pureza donde la prevención de la contaminación es clave
Tapa para proteger las muestras de la contaminación ambiental (e.g. polvo).
Viales PFA ultra-inertes.
Sonda y tubos de muestra ultra-inertes.
Puerto para lavado continuo, más tres viales de lavado adicionales (e.g. lavado alcalino,
lavado ácido, etc.) para máxima flexibilidad.
Bandejas de muestras configurables.
Más pequeño volumen de muestra (<0.5mL).
Diseñado, construido y soportado por Agilent.
Análisis de Orinas
Análisis directo de la muestra tras una dilución 1/5 ó 1/10 (v/v) en 1 %
HNO3/0,5 % HCl y adición de patrones internos
• SIN obturación del nebulizador
• SIN formación de depósitos en el tubo del inyector (10 h análisis)
69 ± 14 68 ± 5 14.3 ± 2.9 13.5±1.1 Pb
198 ± 40 185 ± 17 9.7 ± 2.0 9.6 ± 0.8 Tl
36.9 ± 7 34.8 ± 4.4 9 ± 1.8 6.9 ± 1.1 Sb
15.6 ± 3.1 14.9 ± 1.9 8.6 ± 1.7 8.4 ± 1.1 Cd
163 ± 33 162 ± 15 67 ± 14 65 ± 6 As
187 ± 37 192 ± 17 49 ± 10 56 ± 5.3 Se
50 ± 10 45 ± 5.5 26.7 ± 5.4 24 ± 2.1 Cu
19.1 ± 4.2 18.9 ± 1.4 6.9 ± 1.4 6.6 ± 0.7 Co
20.2 ± 4.1 18.6 ± 2.6 1.2 ± 0.3 1.7 ± 0.3 Cr
certificado medido certificado medido
Lyphochek, level 2 Lyphochek, level 1
Concentración (µg/L) Elemento
Características analíticas para el análisis de orina por ICP-MS
Isótopo LOD (ng/L)
Orina sin diluir
RSD (%)
2 min, n = 10 20 min, n = 20 5 horas, n = 60
7Li 6 0.8 2.7 4.5 9Be 4 1.5 4.2 3.9 52Cr 16 1.7 3.1 4.6 51V 16 2.4 3.4 4.1
55Mn 21 3.0 3.1 3.6 59Co 5 1.8 2.6 4.9 60Ni 9 2.9 3.4 5.1 63Cu 121 0.9 3.1 4.4 66Zn 92 0.8 3.0 5.1 75As 73 2.1 2.8 5.6 78Se 143 2.4 3.7 6.2
LOD= 3 RSDb c/SBR
RSDb: Desviación estandar relativa de la intensidad del fondo (10 medidas), c: concentración el elemento en la disolución;
SBR: relación señal/ruido
Isótopo LOD (ng/L)
Orina sin diluir
RSD (%)
2 min, n = 10 20 min, n = 20 5 hours, n = 60
98Mo 27 1.8 2.8 5.4 103Rh 0.6 1.2 3.3 4.8 111Cd 8 2.4 3.2 3.9 115In 4 0.5 3.0 3.7
118Sn 19 1.6 3.2 5.8 121Sb 6 1.1 2.6 5.3 138Ba 8 1.5 2.8 4.1 184W 7 0.9 2.2 4.6 195Pt 3 0.7 1.9 3.8 205Tl 3 0.6 2.1 2.3
208Pb 2 0.7 2.3 2.5 238U 0.4 1.2 2.2 3.2
Características analíticas para el análisis de orina por ICP-
MS (continuación)
LOD= 3 RSDb c/SBR
RSDb: Desviación estandar relativa de la intensidad del fondo (10 medidas), c: concentración el elemento en la disolución;
SBR: relación señal/ruido
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220230240250260
5.0E4
1.0E5
[1] Spectrum No.1 [ 181.525 sec]:002SMPL.D# / Tune #1 [CPS] [Linear]
m/z-> 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220230240250260
5.0E4
1.0E5
[1] Spectrum No.1 [ 181.531 sec]:004SMPL.D# / Tune #1 [CPS] [Linear]
m/z->
Pb
Rb
Fe
Br Ba
Ca
Li Mo I
Cs Sr
Zn
Cu
Sb
Sn
C Na
Mg
As
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220230240250260
5.0E4
1.0E5
[1] Spectrum No.1 [ 181.531 sec]:004SMPL.D# / Tune #1 [CPS] [Linear]
m/z-> 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220230240250260
2.5E5
5.0E5
[1] Spectrum No.1 [ 181.531 sec]:004SMPL.D# / Tune #1 [CPS] [Linear]
m/z->
Pb Fe
Br Ba
Li Mo I
Cs Sr
Zn
Cu
Sb
Sn As
Rb C Na
Mg
Ca
Elemento “desconocido” adicionado
a la muestra de orina
Análisis de elementos tóxicos y nocivos en orina (análisis
semicuantitativo o “Screening” elemental)
Barrido cualitativo de orina diluida 1:10 para identificar envenenamientos
194 196 198 200 202 204 206 208 210 212 214 216
5.0E4
1.0E5
[1] Spectrum No.1 [ 175.118 sec]:003SMPL.D / Tune #1 [CPS] [Linear]
m/z->
Pb
194 196 198 200 202 204 206 208 210 212 214 216
2.5E5
5.0E5
[1] Spectrum No.1 [ 175.118 sec]:005SMPL.D# / Tune #1 [CPS] [Linear]
m/z->
Tl
208Pb
205Tl
203Tl
Análisis de elementos tóxicos y nocivos en orina
(análisis semicuantitativo o “Screening” elemental)
Confirmación (por perfil isotópico) de la presencia de Talio (2ppb)
210Po podría ser detectado en esta región de masas
210Po
Caso Alexnder Litvinenko
Espectro de un estándar de
1ppt 237Np
Análisis de elementos radioactivos
Niveles de calibración en ppt
alcanzados con sistema de
introducción de muestra estándar
* Buena ionización en el plasma
* Espectro libre de interferencias
* LOD’s en nivel de pg/L (ppq)
Np
U
Medida de Relaciones Isotópicas
El ICP-MS al proporcionar información
isotópica puede ser utilizado para
estudios con trazadores estables
(metabolismo, marcado isotópico,
análisis por dilución isotópica, etc)
32S16O+
33S16O+
34S16O+
Análisis de muestras alto contenido en sólidos y alta
viscosidad. Clinical Sample Introduction Kit.
Construido en PFA
• Químicamente inerte
• Reduce efectos de memoria (especialmente útil para análisis de yodo)
• Irrompible por golpes e impactos
• Acorta tiempo de limpieza entre muestras
Alta tolerancia a sólidos disueltos
• Permite la introducción directa de sangres y sueros con una mínima preparación de muestra
(dilución). Elimina la necesidad de digestión por microondas.
• Ideal para análisis de orinas
• Alta estabilidad de los estándares internos
Análisis de sangre/suero empleando el ICP-MS 7700x
Muestra y patrones son diluídos con una disolución compuesta por:
Más de 100 muestras pueden ser preparadas en menos de 1 h por una sola persona
0.7 mM NH3
0.01 mM AEDT
0.07 % (v/v) Triton X-100
2 % (v/v) 1-Butanol
10 ppb P.I (No “online”)
Dilución final de la muestra de 1/20
(CSF dil. 1/10)
Características Analíticas del análisis de sangre por ICP-MS
Límites de cuantificación
(LOQs) calculados en sangre sin diluir:
De 0.003 µg/L para 238U hasta
0.1 µg/L para 69Ga
Recuperaciones De 1 µg/L a excepción de:
10 µg/L para B, Mn y Sr y de
200 µg/L para Cu y Rb
obteniendo valores entre 94 -108%
Estabilidad de estándares internos (muestras de sangre
y suero diluidas 1:10 en disolución amoniacal)
Muestras de sangre Muestras de Suero Calibracion
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Interfase de muestreo robusta
Imágenes tomadas después del análisis de 90 muestras de sangre
Cono de muestreo o “Sampler “ Cono de extracción o “Skimmer”
Análisis de yodo en el Agilent 7700x ICP-MS
o Estabilización en 0.1M NH4OH/ 0.01M AEDT/ 0.07% Triton X
o Limpieza en disolución básica (NH3/AEDT/Triton X)
o Calibraciones a nivel bajo de concentración
o Empleo de Teluro como patrón interno
Acoplamientos con ICP-MS para especiación metálica
Optional
Conventional
(Organic compound)
Detector(s)
GC-ICP-MS
LC-ICP-MS (IC, RP-LC, SEC, FFF)
CE-ICP-MS
Page 27
Especiación mediante LC-ICP-MS
LC-ICP-MS es la técnica idónea para especies térmicamente inestables siendo el acoplamiento más común
Acoplamiento sencillo mediante un capilar de PFA/PEEK al ICP-MS
Nebulizador y cámara de
nebulización
gas controller
ICP torch
turbo molecular pump
Cuadrupolo
Ar gas
rotary pump
turbo molecular pump
Cromatografo de líquidos
Page 28
Especiación de Hg mediante UHPLC-ICP-MS
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
0 50 100 150 200
CP
S
time (s)
std 8 ppb
Hg201
Hg2+
MeHg+
EtHg+
PhHg+
4 especies separadas en menos de 3 min
Page 29
Condiciones HPLC: Columna: Zorbax SB-C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 µm Mobile phase: A: 0.5 g/L L-Cys, 0.5 g/L L-Cys,HCl, H20 B: Metanol Gradiente: inicio: 2% MeOH hasta: 90% MeOH en 1 min 90% MeOH durante 3 min cond. iniciales: 2% MeOH Volumen de inyección: 50 µL
Separación isocrática de AsB & Cl del As inorgánico usando una nueva columna
*Surface Aminated Polymer Substrate
Agilent Application Note: Routine Analysis of Toxic Arsenic Species in Urine Using HPLC with ICP-MS, 5989-5505EN, by Tetsushi Sakai and Steven Wilbur, Agilent Technologies
Column G3288-80000 (4.6 x 250 mm) Guard Column G3154-65002 Fase móvil (alcalina): 2 mM phosphate buffer solution (PBS) pH 11.0 ajustado con NaOH 0.2 mM EDTA 10 mM, CH3COONa 3.0 mM NaNO3
1% etanol
Especiación de As en orina por LC-ICP-MS
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*Ajustado a pH 11 para separar la AsB. La fuerza iónica de la fase móvil acorta la elución del As V 10ug/L de cada especie de As
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Retention time (min)
Inte
nsit
y (
cp
s) 3
1P
Especies de 31P en Líquido cefalorraquídeo ultrafiltrado
por CapLC-ICP-MS
Daniel Pröfrock, Peter Leonhard
GKSS in Geesthacht, Germany
Aplicaciones clínicas con Agilent ICP-MS
Page 32
Base de datos con notas de
aplicaciones realizadas por
usuarios ICP-MS Agilent y
especialistas de aplicaciones
disponible via Internet
Conclusiones
El ICP-MS ofrece una combinación única
de propiedades como son:
Gran capacidad multielemental (casi toda la Tabla Periódica)
Bajos límites de detección (muy pocas ppt para la gran mayoría de los elementos)
Amplio intervalo dinámico lineal
Análisis muy rápidos (<5 minutos para un barrido multielemental completo)
Espectros libres de interferencias espectrales (celda de colisión/reacción)
Tolerancia a gran variabilidad de matrices
Robustez
Facilidad de acoplamiento de una técnica de separación cromatográfica al ICP-MS
aumentando las aplicaciones de la técnica