Einzelthemen der Vorlesung „Gentechnik und Biologische Sicherheit“

1. Gefährdung durch Biologische Arbeitsstoffe (1.h.)

2. Klonierung (2.h.); Transgene (3.h.)

3. Forschung und Produktion (4.h.); Pharma-und Lebensmittelindustrie („Weiße“ Gentechnik)( (5.h.)

4. Grüne Gentechnik (6.h.), „Rote“ Gentechnik: Medizin (7.h.)

4. Stunde: Gentechnik in der Pharma-und Lebensmittelindustrie

Gentechnik in der Pharma-und LebensmittelindustrieGeschichte

Seit tausenden von JahrenEinsatz von Mikroben zurProduktion vonalkoholischen Getränken,zum haltbar machen vonLebensmitteln (Joghurt,Käse, Salami, Sauerkrautetc.)

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Bierproduktion

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

• IndustrielleKultivierung von MOs

erfolgt meist in Fermentern,die optimale Kultur-bedingungen gewährendurch die Kontrolle von O2,pH, T und Substrat-verfügbarkeit

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

Industrielle Kultivierung von MOs

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

Seit Pasteur (1865 – 1940)• Industrielle Fermentation (Ethanol,

Butanol, Aceton, Glycerin)• Produktion organischer Säuren

(Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure)

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie:Industrielle Fermentation (Ethanol)

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie:Industrielle Fermentation (Ethanol)

Fermentation

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Produktion organischer Säuren

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Produktion organischer Säuren

Fumaric acid is a naturally occurring four carbon dicarboxylic acid that is used to produce valuablecompounds for different application areas as pharmaceutical, food, agricultural, chemical industry.Traditionally fumaric acid has been produced from maleic anhydride, a petroleum derivative. Thefilamentous fungus Rhizopus delemar formerly known as Rhizopus oryzae is able to accumulate highlevels of this organic compound.

Aim: re-design A. niger strains for the production of fumaric acid.

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Produktion organischer Säuren

Itaconic acid is an important building block for the chemical industry. It is used for the production of plastics. Aspergillus terreus is the natural producer of itaconic acid. The precursor for itaconic acid is citric acid, which is produced in high amounts by Aspergillus niger. The aim of this research is to use metabolic engineering for the construction of A. niger cell factories that produce itaconic acid in high levels and to gain a better understanding of the metabolic mechanisms controlling the accumulation of carboxylic acids in A. niger.

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

Produktion von Antibiotika seit 1940

Antibiotika: Sekundärmetaboliten, produziert von MOs, mit antibiotischer Wirkung

• Im industriellen Maßstab (siehe Tabelle)

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittel-

industrie

Einige kommerziell produzierte AntibiotikaAntibiotikum Produzierender MOBacitracin Bacillus licheniformisCephalosporin Cephalosporium sp (P)Chloramphenicol Streptomyces

venzuelae (syn.)Cycloheximid Str. griseusErythromycin Str. erythreusGriseofulvin Penicillium griseofulvin

(P)Kanamycin Str. kanamyceticusLincomycin Str. lincolnensisNeomycin Str. fradiaeNystatin Str. nourseiPenicillin Penicillium

chrysogenum (P)Polymyxin B Bacillus polymyxaStreptomycin Str. griseusTetracyclin Str. rimosus

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Antibiotika

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

Wichtige Antibiotika (AB), ihre Produzenten und Wirkung.__________________________________________________________________________________________

Antibiotikum Produzent Wirkungsbereich bzw. Einsatz__________________________________________________________________________________________Chinone und VerwandteChlortetracyclin Streptomyces aureofaciens Gram-positive u. –negative BakterienOxytetracyclin Streptomyces rimosus Gram-positive u. –negative BakterienAdriamycin Streptomyces peuceticus tumorhemmend

Makrolytische LactoneErythromycin Streptomyces erythreus Gram-positive, Legionella,

Mycobakterien

Aromatische VerbindungenGriseofulvin Penicillium griseofulvum Hautpilze

Polyen-ABNystatin Streptomyces noursei PilzeAmphotericin B Streptomyces nodosus Pilze

Nucleosid-ABPolyoxin B Streptomyces cacaoi phytopathogene PilzeNikkomycine Streptomyces tendae Pilze und Insekten__________________________________________________________________________________________

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

Adriamycin along with therelated daunomycin areanthracyclines possessinganti-Gram-positive activity.They also have anticancerproperties towards soft-tissuesarcomas and leukaemias.This is probably due to theirintercalating behaviortowards DNA which results inthe inhibition of RNA andultimately protein synthesis.L-duanosamine is thesaccharide unit found ineach.

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

Erythromycin inhibiert die Peptidyltransferase

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

Griseofulvin (Penicilliumgriseofulvum ) bindet anTubulin (aber an eineandere Stelle alsColchizin) und verändertdadurch die Konformationvon Tubulin. Diesinterferiert mit dem Gleitender und dem Transportentlang von Mikrotubuli(Langcake et al., 1983/Chaudhuri and Ludunea,1996).

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

• Polyoxin B

gehört zur Familie der Peptid-Nukleoside und interferiert mitder Chitinsynthese, wobei dieMitglieder dieser Familie alskompetitive Inhibitoren wirk-sam sind.

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

• Nikkomycine sind Peptid-Nukleosid-Antibiotika, die von Streptomyces tendae produziert werden.

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

Postantibiotika-Ära (seit 1960)• Mikrobielle Produktion von Aminosäuren und

Vitaminen (z.B. L-Glutaminsäure, L-Lysin, Vitamin B12 und C)

• Entwicklung der „Single-Cell-Protein“(SCP)-Produktion mit z.B. Methanol als Substrat

• Produktion von industriell genutzten Enzymen (z.B. Proteasen, Amylasen, Glucoseisomerasen)

• Produktion von bakteriellen Polysacchariden (z.B. Xanthan)

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Produktion von Aminosäuren

J Biotechnol. 2003 Sep 4;104(1-3):5-25. The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and vitamins.

Kalinowski J, Bathe B, Bartels D, Bischoff N, Bott M, Burkovski A, Dusch N, Eggeling L, Eikmanns BJ, Gaigalat L, Goesmann A, Hartmann M, Huthmacher K, Kramer R, Linke B, McHardy AC, Meyer F, Mockel B, Pfefferle W, Puhler A, Rey DA, Ruckert C, Rupp O, Sahm H, Wendisch VF, Wiegrabe I, Tauch A.

Institut fur Genomforschung, Universitat Bielefeld, Universitatsstrasse 25, D-33615 Bielefeld, Germany. joern.kalinowski@genetik.uni-bielefeld.de

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Produktion von Aminosäuren

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Produktion von Aminosäuren

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Produktion von Aminosäuren

• Einsatz von mikrobiell produzierten Aminosäuren:

• Glutaminsäure – Geschmacksverstärker• Asparaginsäure und Phenylalanin bilden die Zutaten des

Süßstoffes Aspartam• Lysin (essentielle AS) dient als Lebensmittelzusatz

(produziert auch von Brevibacterium flavum; bis 60 g/l)

Meist auch chemische Synthese der AS möglich, aber:erhalten werden D,L-Mischungenreine L-Formen nur mittels enzymatischeroder mikrobiologischer Produktion

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Produktion von Vitaminen

Vitamin B12 kann nicht von Eukaryoten synthetisiert werden, ist aber ein wichtiges Coenzym. Starker Mangel an Vitamin B12 (Cobalamin) führt zu perniziöser Anämie mit Störungen des Nervensystems. Pseudomonasdenitrificans produziert 60 mg/l Vitamin B12.

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

Ära der synthetischen Biotechnologie (seit 1975)

• Rekombinante DNA-Technologie (seit 1974)

• Erste Produkte auf dem Markt seit 1982 (z.B. Vakzine gegen Durchfälle bei Nutztieren, menschliches Insulin)

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

• Area 3.3• QLK3-2001-00149Combinatorial engineering of glycoside hydrolases from the alpha-amylase superfamily (CEGLYC)• QLK3-2001-00278Sensing and controlling single molecules by novel electrical, mechanical and optical methods with applications to

nanobiotechnology (NANOCELL)• QLK3-2001-00435Solvent tolerant bacteria allowing a broader performance of biotransformations of organic compounds in two phases

(BARTOLO)• QLK3-2001-00448Development of highly specific enzymes for genome manipulation (EnGeM)• QLK3-2001-00519Directed evolution of enantioselective biocatalysts (EvoCatal)• QLK3-2001-00533Engineering yeast for efficient expression of heterologous membrane transporters (EFFEXPORT)• QLK3-2002-01930Investigation of biochemical and genetical diversity of terpenoid biosynthesis for the production of high value-added

compounds (INTESY)• QLK3-2002-01940Eukaryotic polyketides in surrogate hosts (EUKETIDES)• QLK3-2002-01945Improving arable production systems by expressing marine algal rubisco in crop plants (MARISCO)• QLK3-2002-01967Silicon biotechnology: Biofabrication of nanostructured silica and use of enzymes involved in metabolism of biogenic silica

in industry and medicine (SILIBIOTEC)• QLK3-2002-01972Multigenome access technology for industrial catalysts (MGAtech)• QLK3-2002-02032Functional genomics and proteomics of Trichoderma antagonist strains for industry and agriculture (TRICHOEST)• QLK3-2002-02035Compendium of Arabidopsis gene expression (CAGE)• QLK3-2002-02038Demonstration of increased yield and productivity in selected commercial organisms by strategic transformation of key

genes from Aspergillus niger (ANTICO)• QLK3-2002-02056Gene mining of metagenomes for novel enzymes and therapeutics (Gemini)• QLK3-2002-02071DNA replication and biotechnological applications (REPBIOTECH)• QLK3-2002-02086Exploiting the secretion machinery of Pseudomonas for the nanotechnological production of pharmaceuticals

(NANOFOLDEX)• QLK3-2002-02097Developing a genomic toolbox for exploring and exploiting bacterial biodiversity (BACDIVERS)• QLK3-2002-02132Microalgae as cell factories for chemical and biochemical products (ALGINET)6

[ Area 3.3 ]New biological and biotechnological products and processes for agro-industry, agri-food and high value added chemicals

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Produktion von rekombinantem humanem Insulin

Gentechnik in der Pharma- und

Lebensmittel-industrie:

Produktion von rekombinantem

humanem Insulin

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Produktion von rekombinantem humanem Insulin

• InsulinThe insulin glucose transport response is a vesicle-mediated event involving homologues of the proteins involved in vesicle trafficking pathways in nerve cells and yeast.

Gentechnik in der Pharma-

und Lebensmittel-

industrie

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

• InterferonInterferon is a class of glycoproteins which interferes with virus replication. There are numerous types of interferon and each is produced by an animal or by cultured animal cells. Interferon synthesis is induced by viruses or by certain biochemicals and can be of three types: IFN- = - Interferon (20 subtypes) - from many different cell types IFN - = - Interferon (2 subtypes) - from fibroblasts, macrophages IFN - = - Interferon (3 subtypes) - from T-lymphocytes

• Characteristicsa. Interferons are cell specific in both their production and their

effects. b. Interferons are virus non-specific. c. Interferons are induced by viruses, chemicals, some species of

bacteria and some extracts of fungi. d. Although all animal cells appear able to produce one or more types

of interferon, cells of the bone marrow, spleen, and macrophages, appear to play a special role, i.e., they produce a larger volume of interferon and a more potent interferon.

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittel-industrie

Natürliches Interferon-alpha enthält mindestens 15 unterschiedliche Subfraktionen mit Molekulargewichten zwischen 16 und 27 kDa (65). Bislang wurden 23 verschiedene Gene für die Kodierung der menschlichen Alpha-Interferone gefunden, die alle auf Chromosom 9 lokalisiert sind (66). Beim klinischen Einsatz stehen rekombinante Alpha-Interferone im Vordergrund.

For a long time about 60,000 liters of human blood were required in order to produce one gram of interferon. In order to increase this low yield, the substance is now produced by recombinant DNA technology. This method utilizes cells that can be cultivated in large amounts and that also produce high concentrations of interferon. In order to achieve this, the DNA sequence that codes for the desired protein is isolated and inserted into the genetic material of a foreign organism. The genetic information that is required to be mass-produced in the case of interferon is a human leukocyte interferon gene. The rapidly replicating microorganism used for production is a nonpathogenic Escherichia coli bacterium. The bacteria that have been rendered "recombinant" by insertion of the human genetic information now produce not only their own proteins, but also human interferon. In this way a purified product containing only the desired interferon subtype alfa-2a can be obtained. With the aid of a number of chromatographic and filtration steps, the purity of the product is brought up to 99 percent. In June 1986 the first recombinant interferon alfa-2a produced by Roche (Roferon A®) was licensed in the USA and in Switzerland for the treatment of hairy cell leukemia. The actual manufacturing process was developed by Sidney Pestka and his coworkers at the Roche Institute for Molecular Biology.

Produktion von humanem Interferon –alpha 2a

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie

Transformation von Steroiden• Umwandlung von z.B. pflanzlichen Steroiden

(aus z.B. Glycine max, Sojabohne)aus Stigmasterol wird chemisch Progesteron. Progesteron wird dann mittels des Pilzes Rhizopus 11-hydoxylisiert und dann weiter chemisch zu den hochwirksamen Cortisonderivaten Prednisolon oder Prednison umgewandelt. Der Einsatz von Rhizopusreduziert die notwendigen chemischen Reaktionsschritte von 37 auf 17 und den Preis für 1 g Cortikosteroide von 200 $ auf 1 $!

Gentechnik in der Pharma-

und Lebensmittel-

industrie

Transformation von Steroiden mittels Rhizopus

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Polysaccharide

• Molecular Structure of Xanthan Gum

Xanthan gum is a high molecular weight polysaccharide produced by viscous fermentation of Xanthomonascampestris. Its unique functionality compared to other commercial polysaccharides is provided by the actual structure of the xanthan gum molecule. The polymer backbone is made up of (1,4)-linked ß-D-glucose residues and, therefore, is identical to the cellulose molecule. A trisaccharide branch containing one glucuronic acid unit between two mannose units is linked to every other glucose unit at the number 3 position.

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie : Polysaccharide

Xanthomonas campestris

Glucose

Mannose

Mannose

Glucuronsäure

Xanthan

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Polysaccharide

• Xanthan (E 415) ist eine unverdauliche Stärke(Ballaststoff) und wird von der Bakterie Xanthomonascampestris oder gentechnisch veränderten Bakterien gebildet. Da Xanthan in Verbindung mit Wasser hohe Stabilität und Viskosität hat, wird es als Geliermittel und Verdickungsmittel verwendet: in Milchprodukten, Saucen, Tomatenketchup, Majonäsen, Dressings. Zudem wird Xanthan in zahlreichen Produkten der Kosmetikindustrie eingesetzt, zum Beispiel Lotionen, Shampoos, Zahnpasta, flüssige Seifen, Mascara.

• Zusammen mit Johannisbrotkernmehl (E 410) bildet Xanthan ein hitzestabiles Gel.

Johannisbrotkernmehl

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie : Polysaccharide

• Dextran

Leuconostoc mesenteroides

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie : Polysaccharide

Dextrane sind hochmolekulare, verzweigte, neutrale Biopolysaccharide, die Hefen und Bakterien als Reservestoffe dienen. Dextrane sind Homoglykane, die aus einzelnen Glucose-Molekülen bestehen, die 1,6-, 1,4- oder 1,3- verknüpft sind. Sie sind abhängig von ihrer Molekularmasse, welche zwischen 10.000 Da und 50.000.000. Da betragen kann, gut wasserlöslich.

Anwendung Da eine 6%-tige Dextranlösung den gleichen Kolloidosmotischen Druck wie Serum hat, kann sie als Plasmaersatzmittel verwendet werden. In der Mikrochirurgie werden niedrigmolekulare Dextrane eingesetzt, da sie als Thrombozytenaggregationshemmer wirken.

In Gelform werden Dextrane in verschiedenen Chromatografie-Verfahren eingesetzt, da sie dreidimensionale Netze und somit Poren bilden, die für die Auftrennung von Molekülen nach ihrer Größe notwendig sind.

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Enzyme

Abbau von Stärke durch -Amylase (Aspergillus oryzae)

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Enzyme

Abbau von Stärke durch -Amylase

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie:Enzyme

Die neutrale Protease von Bacillus stearothermophilus (65C)

Modell der neutralenProtease aus Bacillusstearothermophilus. DieEntfaltungsregion ist rotgekennzeichnet, dieDisulfidbrücke ist gelbmarkiert, die Calcium-Ionen sind violettdargestellt, das Zink-Ionorange.

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie : Enzyme

• Biotechnol. Appl. Biochem. (2002) 36, (181–186) (Printed in Great Britain) Immobilized lipase-catalysed production of alkyl esters of restaurant grease as biodiesel An-Fei Hsu1, Kerby Jones, Thomas A. Foglia and William N. Marmer Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 600 East Mermaid Lane, Wyndmoor, PA 19038, U.S.A.

Immobilized lipase-catalysed production of alkyl esters of restaurant grease as biodiesel

Z u s a m m e n f a s s u n g des Teils „Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie“

Fermentation: Ethanol (Bier, Wein), Butanol, Aceton, Glycerinorganische Säuren z.B. Milchsäure (Sauerkraut, Joghurt, Käse , Salami)Essigsäure, Zitronensäure

Produktion von Antibiotika seit 1940 (Beispiele für Antibiotika und deren Produzenten)

Produktion von Aminosäuren z.B. durch Corynebacterium glutamicum (Glutaminsäure, Isoleucin, Lysin, Threonin, Valin)

Produktion von Vitaminenz.B. B12 durch Pseudomonas denitrificans

Produktion von rekombinanten Arzneistoffenz.B. Insulin (E. coli), IFN- (E. coli), Antithrombin III (Ziege), (Wachstums)Hormone (E. coli),mAK (CHO Zellen),(Cortiko)Steroide (Rhizopus)

Produktion von Xanthan (Xanthomonas campestris); Dextran (Leuconostoc mesenteroides); Enzyme (z.B. thermostabile Protease von Bacillus stearothermophilus)

Gentechnik in der Pharma- und Lebensmittelindustrie: Bierproduktion