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Fortgeschrittenen Kurs Gentechnik und Molekularbiologie, WS 2008/2009

Die Technik der Phagenpräsentation

1. Woche: Mo- Do: Phage Display

2. Woche: Mo: Phagen SDS Gel; Di: Sequenzierung; Do: Proteinstruktur; Fr: Sequenzauswertung

Leitung: Kristian Müller, Institut für Biologie III; Schänzlestr. 1, 79104 Freiburg

Tel. 203-2748; e-mail [email protected]

Technische Assistentin: Susanne Knall, Karin Schmidtkunz

Kursassistenz: Janina Speck, Christina Räuber, Katharina Timm

Skriptversion 11.2/09

Ziel des Kurses

In dem Kurs soll die Technik der Phagenpräsentation (Phage Display) anhand eines

anwendungsorientierten Beispiels erlernt werden. Der Trick des Phage Display besteht darin, daß

ein Protein und das dazugehörige kodierende Gen durch den Phagen in einer sehr gut handhabbaren

Form, d.h. dem Phagen, zusammengehalten werden. Erzeugt man beispielsweise durch verzufallte

Gensynthese hundert Millionen bis eine Milliarde verschiedene Gene, lassen sich mit Hilfe des

Phage Display hundert Millionen bis eine Milliarde verschiedener Phagen erzeugen, in denen

jeweils das präsentierte Peptid mit dem Gen verbunden ist. Aus diesem hoch komplexen Gemisch

lassen sich dann Phagen anreichern, die beispielsweise ein bestimmtes Protein binden.

In dem Kurs wird mit einer vorgefertigten Phagenbibliothek (New England Biolabs Ph.D-7 Phage

Display Peptide Library Kit) gearbeitet, aus der Streptavidin bindende Peptide gewonnen werden

sollen. Hierzu werden insgesamt drei Anreicherungsrunden (Panning-Runden) durchgeführt, zwei

davon im Praktikum. Hierbei wird die Technik des “Panning” erlernt. Die Phagen werden hierfür

amplifiziert und durch Fällung gereinigt. Die Anreicherung bindender Phagen soll durch Titer-

Bestimmung mit Plaques, photometrische Phagenbestimmung und Phagen-ELISA verfolgt werden.

In einem Nebenexperiment werden besonders reine Phagen durch eine Ultrazentrifugation im CsCl-

Gradienten gewonnen. Am Ende wird durch DNA-Sequenzierung die Aminosäure Sequenz eines

binden Peptids abgeleitet, das von jeder Gruppe im Praktikum gefunden werden soll.

Ergänzt werden die experimentellen Arbeiten durch Computer-gestützte Auswertungen. An einem

halben Tag sollen vorhandene Strukturdaten eines Peptids im Komplex mit Streptavidin am

Rechner dargestellt werden. An einem weiteren Tag wird eine Rechner-gestützte Klonierung

durchgeführt, wobei der Phagen Vektor mit Bibliothek am Rechner zusammengesetzt wird. Die am

Computer erzeugte Sequenz dient dann dazu, die Sequenzierung des gefundenen Klons

auszuwerten.

Streptavidin bindende Peptide, die über Phage Display gewonnen wurden, werden in der Praxis für

die Proteinreinigung und -detektion genutzt.

Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation - 2 -

Hinweis zum Ablauf

Das Praktikum besteht aus einem einzigen Versuch mit mehreren Teilen, der so wie im richtigen

Labor durchgeführt wird. Auch Profis benötigen vom Start bis zur DNA Sequenz ca. sieben Tage.

Um diesen Versuch in einem einwöchigen Praktikum durchzuführen, wurde die erste von drei

Panning-Runden bereits durchgeführt. Das Praktikum beginnt also mit Panning-Runde zwei (P2).

Während des Praktikums muß jeder Teilnehmer ein “Labor-Buch” führen. Hierzu wird ein Heft

ausgegeben, in dem jeder Versuch und das Ergebnis mit Datum und Uhrzeit einzutragen ist. Das

Heft wird während des Kurses von den Assistenten eingesehen, und die Hefte einer Gruppe müssen

mit dem Protokoll abgegeben werden.

Hinweis zur Einteilung

Das Praktikum wird aus didaktischen und finanziellen Gründen in zweier Gruppen absolviert.

Damit jedoch jeder Teilnehmer ausreichend experimentelle Erfahrung sammelt, werden Teile der

Versuche von jedem Teilnehmer durchgeführt. D.h. jeder führt zwei “Panning-Runden” durch,

gerätetechnisch oder finanziell limitierte Schritte wie die Phagenbestimmung auf Platten, die

Ultrazentrifugation oder die Sequenzierung werden jedoch nur mit einer Probe pro Gruppe

durchgeführt. Um den Fortschritt der Phagenpräsentation von Runde zu Runde zu beobachten,

sollte sich jede Gruppe von Anfang an auf eine Probe als die “Hauptprobe” festlegen.

Übersicht Methode

Phagenselektion

Immunoröhrchenbelegen

Phagenbinden

Phagenwaschen

Phageneluieren

Phagenproduktion

Plaques / infizier te Zellenauf Agar-Platte

Zellen inFlüssigkultur

PEG/NaCl-Fällung

Titerbestimmung

Zelleninfizieren

Phagenselektion

Immunoröhrchenbelegen

Phagenbinden

Phagenwaschen

Phageneluieren

Phagenproduktion

Plaques / infizier te Zellenauf Agar-Platte

Zellen inFlüssigkultur

PEG/NaCl-Fällung

Titerbestimmung

Zelleninfizieren

Abb. 1 Übersicht Phagenpräsentation


Übersicht Versuch

Phage Display Versuch Zusätzliche Arbeiten

Mo Bindung der ausgegebenen Phagen an das

ausgegebene Röhrchen, d.h. Panning Runde P2

Neutralisationstest; Belegen eines

Immunoröhrchens und der ELISA

Platten; X-Gal-Platten gießen

(pro Gruppe) Elution der Phagen

Amplifikation der Phagen mit ausgegebener Kultur

Fällung der amplifizierten Phagen

Über-Nacht Kultur von ER2738 Zellen (pro Gruppe)

Di Aufarbeitung der Phagenfällung P2 Blocken der Immunoröhrchen

und Platten Panning Runde P3 mit selbst belegtem Röhrchen

Titerbestimmung durch Plattieren (pro Gruppe) und

Absorptionsmessung von Eluat P2, Amplifikation P2

und Eluat P3

Phagenamplifikation P3 mit eigener Kultur

Phagenfällung P3

Mi Aufarbeitung der Phagenfällung P3

Phagenkultur eines Klons von der Platte der

Titerbestimmung P3

Präparation einzelsträngiger DNA

Do Berechnung eines Phagen ELISA Ansatzes

Fr Phagen ELISA Phagenreinigung mit CsCl

Gradient (pro Gruppe)

Doktorandenvorträge

Mo SDS Gel mit Phagen

Western Blot

Di Sequenzierreaktion (pro Gruppe)

Do Proteinstruktur am Computer

Fr Sequenzauswertung des Klons (pro Gruppe) Computer gestütztes Klonieren


Einführung

Selektion und die Kopplung von Genotyp und Phänotyp

Abb. 2 Übersicht über mögliche Kopplungen von Genotyp und Phänotyp auf molekularer Ebene. A) Fusion an das

Phagenprotein VIII, B) Fusion an das Phagenprotein III im Phagensystem, C) Fusion an das Phagenprotein III im

Phagmidsystem, D) Fusion an ein Zelloberflächenprotein, E) Kopplung des Proteins mit der mRNA. Erklärungen zum

Phagendisplay siehe Text.

Die Entstehung der M13 Phagenvektoren

Bakteriophagen, auch bakterielle Viren oder kurz Phagen genannt, infizieren, wie der Name besagt,

Bakterien. Phagen wurden unabhängig voneinander 1915 von Frederick W. Twort und 1917 von

Félix d'Hérelle beschrieben. d'Hérelle prägte dem damaligen Verständnis folgend den Begriff

“Bakteriophage” (Bakterienesser). Für die Phagenpräsentation werden filamentöse, nicht lytische

Bakteriophagen als Vehikel verwendet. Filamentöse Phagen sind zum Verpacken manipulierter

DNA besonders geeignet, da die Phagenlänge automatisch der Genomgröße angepaßt wird. Diese

Phagen wurden ursprünglich aufgrund ihrer auf “männliche” E. coli-Stämme beschränkten

Infektiösität isoliert. Diese Bakteriophagen werden wie folgt klassifiziert: Viren; ssDNA Viren;

Inoviridae; Inovirus. Es gibt drei sehr nah verwandte filamentöse Phage “f1“, “M13“ und “fd” deren

Genome zu etwa 98 % identisch ist. Der Phage M13 (für München 13) wurde 1963 das erste Mal

beschrieben (Hofschneider, 1963). Das Genom dieses wild-Typ Phagen umfaßt 6407 Nukleotide.

Um diesen Phagen als Klonierungsvektor zur Produktion einzelsträngiger DNA, die ursprünglich

zur Sanger Sequenzierung und später für die Mutagenese benötigt wurde, einsetzen zu können,

wurde ein 789 Bp großes Fragment in das Genom eingesetzt, das das lac Operon und die ersten 146

Aminosäuren der ß-Galactosidase enthielt. Dies führte zu dem Klon M13mp1, dem ersten Klon der

sehr erfolgreichen Serie der M13mp Phagenvektoren (mp für Max-Planck-Institut) (Messing et al.

1977). Durch chemische Mutagenese mit Nitrosomethylharnstoff und Selektion und später durch

Klonierungen wurden zusätzliche Restriktionsschnittstellen vor allem als multiple Klonierungsstelle

in das Phagengenom eingeführt. Aus diesen Phagenvektoren leitet sich die ebenfalls sehr weit

verbreitete pUC-Phagmidserie ab (Vieira & Messing 1982).

Das in den M13 Phagen kodierte ß-Galactosidase Fragment, das historisch bedingt auch α-Fragment

genannt wird, ermöglicht die sogenannte α-Komplementation im Zusammenspiel mit einem E. coli-

Stamm, der eine Galactosidase ohne die N-terminalen Aminosäuren (auch ω-Akzeptor genannt)

exprimiert (Ullmann et al. 1967). In der Praxis wird häufig die lacZ∆M15 Deletion verwendet, bei

der die Aminosäuren 11-41 der Galactosidase fehlen. Die α-Komplementation läßt sich durch die


Zugabe des Farbstoffs X-Gal sichtbar machen, wodurch die sogenannte blau-weiß Selektion

ermöglicht wird.

Literatur:

Hofschneider HP, 1963, “Untersuchung über kleine E. coli K-12 Bacteriophagen M12, M13 und

M20“ Z. Naturforsch. 18, 203-205.

Messing J, Gronenborn B, Müller-Hill B, Hofschneider PH, 1977, “Filamentous coliphage M13 as a

cloning vehicle: Insertion of a HindII fragment of the lac regulatory region in M13 replicative

form in vitro”, PNAS 74, 3642-6.

Vieira J, Messing J, 1982, “The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion

mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers”, Gene, 19, 259-68.

Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J., 1985, “Improved M13 phage cloning vectors and host

strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors”, Gene, 33, 103-19.

Ullmann A, Jacob F, Monod J., 1967, “Characterization by in vitro complementation of a peptide

corresponding to an operator-proximal segment of the beta-galactosidase structural gene of

Escherichia coli”, J Mol Biol., 24(2):339-43.

Die Erfindung der Phagenpräsentation

Georg Smith publizierte die Idee der Phagenpräsentation 1985 in einer wegweisenden Publikation

mit dem Titel: “Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on

the virion surface.” Science 1985 228(4705):1315-7. In seiner Zusammenfassung beschreibt er

diese Entwicklung wie folgt: “Foreign DNA fragments can be inserted into filamentous phage gene

III to create a fusion protein with the foreign sequence in the middle. The fusion protein is

incorporated into the virion, which retains infectivity and displays the foreign amino acids in

immunologically accessible form. These "fusion phage" can be enriched more than 1000-fold over

ordinary phage by affinity for antibody directed against the foreign sequence. Fusion phage may

provide a simple way of cloning a gene when an antibody against the product of that gene is

available.” Diese Technik findet seit Anfang der 90er Jahre weite Verbreitung vor allem seit man

merkte, daß sich so sehr einfach aus verzufallten Sequenzbibliotheken Peptide aber auch Proteine

mit bestimmten Bindungseigenschaften isolieren lassen. Hierin begründet sich auch die große

kommerzielle Bedeutung, da sich so einfach Antikörperfragment-Bibliotheken auf spezifische

Bindung oder Peptide auf Bindung oder Inhibition selektionieren lassen. Die Idee der

Phagenpräsentation legte auch den Grundstein für zahlreiche weitere Präsentationstechniken, wie

zelluläre Präsentation, Viren-Präsentation und Ribosomen-Präsentation.


Abb. 3 Vermehrung eines M13 Phagen. 1) Infektion; 2) Herstellung der doppelsträngigen Form = relikative Form (RF)

der DNA und Vermehrung zu ca. 100 Kopien; 3) Herstellung der einzelsträngigen Form; 4) Herstellung der

Phagenproteine; 5) nicht lytische Ausschleusung von ca. 200 Phagenpartikeln.

Prinzip und Varianten der Phagenpräsentation

Abstrakt betrachtet ermöglicht die Phagenpräsentation die Kopplung eines Phänotyps mit einem

stabil verpackten Genotyp, da die Proteine, die den Phagen bilden, in seinem Genom kodiert

werden. Bei einer Transformation mit einem Phagemid oder einem Phagengenom oder bei einer

Phageninfektion gelangt in der Regel jeweils nur ein Genom in die Zelle und es werden in dieser

Zelle nur zusammengehörige Protein-Genom Einheiten verpackt. Das zu selektionierende Protein

kann zur Präsentation mit verschiedenen Hüllproteinen des Phagen fusioniert werden. Das GenIII

Protein bietet sich hierzu besonders an, da es nur in 3 bis 5 Kopien an der Spitze des Phagen

vorkommt und gut zugänglich ist. Das GenIII-Protein gliedert sich in drei Domänen, wobei die zwei

N-terminalen Domänen nach außen weisen und für die Bindung des Phagen an Zellen und somit für

die Infektiösität des Phagen wichtig sind. Die C-terminale Domäne verankert das Protein in der

Phagenhülle. Kurze Peptide bis zu 20 Aminosäuren interferieren nur wenig mit der Zellbindung und

können genetisch direkt an das 5'-Ende des genIII fusioniert werden. Durch die mehrfache

Präsentation solcher Fusionen an der Oberfläche erhält man einen Aviditätseffekt, d.h. die

beobachtete Affinität eines Phagenpartikels ist deutlich höher als die intrinsische Affinität eines

einzelnen Peptids. Diese Art der Phagenpräsentation wird im Praktikum angewendet.

Ist kein Aviditätseffekt erwünscht oder sollen Proteine präsentiert werden, die aufgrund ihrer Größe

mit der Infektiösität interferieren, greift man auf ein sogenanntes Phagmid (engl. Phagemid) zurück.

Phagmide sind Plasmide, die einen Plasmid Replikationsursprung enthalten und daher wie Plasmide


propagiert werden können. Zudem enthalten sie einen Phagen Replikationsursprung, der in

Gegenwart entsprechender Proteine die Verpackung einzelsträngiger DNA in Phagen ermöglicht.

Um die Verpackung einzelsträngiger DNA zu ermöglichen superinfiziert man Phagmid tragende

Zellen mit einem Helfer-Phagen. Dieser Helfer-Phage enthält alle Gene, die benötigt werden, um

Phagenpartikel zu produzieren. In seinem Genom ist jedoch eine Mutation, die dazu führt, daß sein

eigenes Genom nur sehr schlecht verpackt wird. Daher wird nach einer Superinfektion mit Helfer-

Phagen fast ausschließlich das Phagmid in Phagenpartikel verpackt. Phagmide für die genIII

Phagenpräsentation enthalten eine genetische Fusion mit dem vollständigen genIII oder nur mit dem

für die C-terminal kodierenden Bereich. Die Expression dieser Fusion erfolgt durch einen

schwachen Promotor, so daß weniger Fusionsproteine gebildet werden als vollständiges GenIII-

Proteine durch den Helfer-Phagen. Im Mittel werden daher nur ein Fusionsprotein und zwei bis vier

Wild-Typ GenIII-Proteine auf dem Phagen präsentiert, der so seine Infektiösität erhält.

Ist ein besonders hoher Aviditätseffekt erwünscht, kann auch das GenVIII-Protein, das in mehreren

tausend Kopien die Phagenhülle bildet, als Fusionspartner verwendet werden. Hierbei kann

wiederum auf Phagen oder Phagemid zurückgegriffen werden. Da Fusionen mit dem genVIII den

Phagenaufbau beeinflussen können, sind Phagen mit mutiertem genVIII entwickelt worden. Weitere

Hüllproteine des Phagen sind für Fusionen getestet worden, diese Konstrukte finden jedoch keine

weite Verbreitung.

Der Praktikumsversuch

Für das Praktikum wird eine kommerziell erhältliche Phagenbibliothek eingesetzt, bei der sieben

vollständig verzufallte Kodone (nnk) zwischen die Signalsequenz und das GenIII-Protein fusioniert

wurden. Um dies zu erreichen wurde zuerst aus dem Phagen M13mp18 eine Kpn I Schnittstelle

durch eine Deletion aus der multiplen Klonierungstelle entfernt und dann die Bibliothek über KpnI

und EagI kloniert. Hieraus resultiert die unten ausschnittsweise gezeigte Genstruktur. Im Praktikum

sollen aus dieser Phagenbibliothek, die ca. 1,2×109 verschiedene Phagen enthält, Sequenzen

gefischt werden, die Streptavidin binden. Hierzu werden insgesamt 3 Panning-Runden benötigt.


Genstruktur der Bibliothek |-> genIIIp Signal Sequenz

ATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAA

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

TAAGTGGAGCTTTCGTTCGACTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCTCTAAAAGTTGCACTTTTTTAATAATAAGCGTT

a V K K L L F A I -

|->reifes genIIIp

KpnI/Acc65I |-> Bibliothek <-| EagI

| | |

TTCCTTTAGTGGTACCtttctattctcactctnnknnknnknnknnknnknnkggtggaggttCGGCCGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAATCCCA

1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700

AAGGAAATCACCATGGaaagataagagtgagannmnnmnnmnnmnnmnnmnnmccacctccaaGCCGGCTTTGACAACTTTCAACAAATCGTTTTAGGGT

a P L V V P F Y S H S ? ? ? ? ? ? ? G G G S A E T V E S C L A K S H -

TACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGTTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTT

1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

ATGTCTTTTAAGTAAATGATTGCAGACCTTTCTGCTGTTTTGAAATCTAGCAATGCGATTGATACTCCCAACAGACACCTTACGATGTCCGCAACATCAA

|- -96 primer ------|

Abb. 4 Elektronenmikroskopische Aufnahme eines

filamentösen Phagen. Diese Phagen messen 6-8 nm im

Durchmesser und können zwischen 760 und 1900 nm

lang sein.

Abb. 5 Schema der Phagenbindung und-

präsentation


Technische Information

Phagengenom in der Datenbank

Die Phagengenome sind beispielsweise in der EMBL Gendatenbank abgelegt und können mit den

Identifikationsnummer V00604 für M13 (6407 Bp) und X02513 für M13mp18 (7249 Bp) abgerufen

werden.

Der Genetische Code mit JCBN / IUBMB Abkürzungen

Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). The JCBN is jointly responsible to the

International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) and the International Union of

Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB).

Symbol Bedeutung Begründung der Namensgebung

G G Guanine

A A Adenine

T T Thymine

C C Cytosine

R G or A puRine

Y T or C pYrimidine

M A or C aMino

K G or T Keto

S G or C Strong interaction (3 H bonds)

W A or T Weak interaction (2 H bonds)

H A or C or T not-G, H follows G in the alphabet

B G or T or C not-A, B follows A

V G or C or A not-T (not-U), V follows U

D G or A or T not-C, D follows C

N G or A or T or C aNy

Definition der komplementären Symbole

Symbol A B C D G H K M S T V W N

Complement T V G H C D M K S* A B W* N*

* In certain cases the symbol and its complement are identical.


Der bakterielle Übersetzungsschlüssel: AAs = FFLLSSSSYY**CC*WLLLLPPPPHHQQRRRRIIIMTTTTNNKKSSRRVVVVAAAADDEEGGGG

Starts = ---M---------------M------------MMMM---------------M------------

Base1 = TTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGGGGGGGGGGGGG

Base2 = TTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGG

Base3 = TCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAG

Der Einbuchstabenschlüssel für Aminosäuren: (http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/AA1n2.html)

Trivial name SymbolsSystematic name Formula

Alanine Ala A 2-Aminopropanoic acid CH3-CH(NH2)-COOH

Arginine Arg R 2-Amino-5-guanidinopentanoic acid H2N-C(=NH)-NH-[CH2]3-CH(NH2)-COOH

Asparagine Asnd N d 2-Amino-3-carbamoylpropanoic acid H2N-CO-CH2-CH(NH2)-COOH

Aspartic acid Aspd D d 2-Aminobutanedioic acid HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH

Cysteine Cys C 2-Amino-3-mercaptopropanoic acid HS-CH2-CH(NH2)-COOH

Glutamine Glnd Qd 2-Amino-4-carbamoylbutanoic acid H2N-CO-[CH2]2-CH(NH2)-COOH

Glutamic acid Glud E d 2-Aminopentanedioic acid HOOC-[CH2]2-CH(NH2)-COOH

Glycine Gly G Aminoethanoic acid CH2(NH2)-COOH

Histidine His H 2-Amino-3-(1H-imidazol-4-yl)- propanoic acid

Isoleucine Ile I 2-Amino-3-methylpentanoic acide C2H5-CH(CH3)-CH(NH2)-COOH

Leucine Leu L 2-Amino-4-methylpentanoic acid (CH3)2CH-CH2-CH(NH2)-COOH

Lysine Lys K 2,6-Diaminohexanoic acid H2N-[CH2]4-CH(NH2)-COOH

Methionine Met M 2-Amino-4-(methylthio)butanoic acid CH3-S-[CH2]2-CH(NH2)-COOH

Phenylalanine Phe F 2-Amino-3-phenylpropanoic acid C6H5-CH2-CH(NH2)-COOH

Proline Pro P Pyrrolidine-2-carboxylic acid

Serine Ser S 2-Amino-3-hydroxypropanoic acid HO-CH2-CH(NH2)-COOH

Threonine Thr T 2-Amino-3-hydroxybutanoic acid e CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH

Tryptophan Trp W 2-Amino-3-(lH-indol-3-yl)- propanoic acid

Tyrosine Tyr Y 2-Amino-3-(4-hydroxyphenyl)-

propanoic acid

Valine Val V 2-Amino-3-methylbutanoic acid

(CH3)2CH-CH(NH2)-COOH

Unspecified amino acid

Xaa Xf


Montag

Das Praktikum beginnt aus Zeitgründen mit der zweiten Runde (P2)

Materialien

• Phagen Stock amplifiziert nach der ersten Runde (P1-Ampl)

• 2 Immunoröhrchen belegt mit Streptavidin

• 2 neue Immunoröhrchen

• 2 96-well Flachboden ELISA Platten

• ca. 6.5 ml Streptavidin 30 µg/ml in 0.1 M NaHCO3-Puffer pH 9.0

• 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween 20, pH 7,5 (TBST Puffer)

• Abgeschnitte Spitzen für Tween

• 0.2 M Glycin/HCl Puffer pH 2,2

• Rollentaumelmischer / Radmischer

• Zentrifuge für 50 ml Gefäße

• Photometer bei 600 nm

• Über-Nacht Kultur von ER2738 Zellen ( F́proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 zzf:: Tn(TetR)/ fhuA2

glnV ∆(lac-proAB) thi-1∆(hsdS-mcrB)5 )

• 1 l Kolben

• LB Medium

• Tetrazyklin Stammlösung 20 mg/ml

• BSA Stammlösung 100 mg/ml

• 1 M Tris-Stammlösung pH 9.1

• Stift, Klebeetiketten, Klebepunkte, Heft

• 1.5 % Agar 150 ml

• IPTG/ X-gal 150 µl (50 mg/ml Isopropyl-β-D-thiogalactosid, 40 mg/ml 5-Bromo-4-chloro-3-

indolyl-β-D-galactosid in Dimethylformamid)

• pH Stäbchen

• 20% PEG 6000 / 2.5 M NaCl Lösung

• Feuerzeug

• 50 ml Plastikgefäße

• Plastikküvetten

• P20, P200, P1000, Eppiständer, Spitzenboxen, Eiskübel (aus Praktikumsbestand)

• Eis, Eispott

Kultur für die Phagenamplifikation

Nach der Selektion auf Bindung müssen die bindenden Phagen wieder vermehrt werden.

• Die optische Dichte bei 600 nm der Über-Nacht-Kultur (OD 600) wird mit einem Photometer

gegen das reine Medium als Referenz bestimmt.

• Von der Über-Nacht-Kultur wird eine 100 ml Hauptkultur angesetzt. Hierzu wird mit einem 50

ml PP Gefäß das Volumen an LB Medium abgemessen, in ein 1 l Kolben gegeben, mit Tet (20

µg/ml final) versetzt und Start OD von 0,1 angesetzt und bei 37 °C geschüttelt. Da sich der

Schüttler im 4. Stock befindet, bitte die Probe auf den bereitgestellten Wagen stellen.


• Im weiteren Verlauf werden Zellen bei einer OD von ca. 0.5 für die Phageninfektion benötigt.

Das Hochwachsen der Zellen dauert in Abhängigkeit der Vitalität der Zellen 1 bis 3 Stunden.

Die optische Dichte der Zellen wird daher mindestens stündlich kontrolliert.

• Sollten die Zellen zu schnell wachsen, können sie bis zur weiteren Anwendung bei 4°C gelagert

werden.

Anmerkung: Phagen infizieren über Pili, die sich am besten in der frühen log-Phase und unter

günstigen Wachstumsbedingungen (ausreichend Sauerstoffzufuhr, reiches Medium) ausbilden; zu

heftiges Schütteln von Schikanekolben sollte vermieden werden. Die für die Bildung der Pili

erforderliche Information befindet sich auf dem F Episom, das eine Tet Resistenz trägt.

Selektion bindender Phagen

Dieser Schritt ist das Kernstück der Phagenpräsentation.

• 200 ml TBST-Puffer mit TBS (Tris Buffered Saline) und 0,1% (v/v) Tween 20 in einer kleinen

Flasche ansetzen.

• Zum Waschen Immunoröhrchen 2 mal mit TBST füllen und in Abfallgefäß entleeren.

• Immunoröhrchen mit 1 ml TBST füllen, BSA Stammlösung auf final 1 mg/ml zusetzen und 30

µl Phagen Stock von einer ersten Panning-Runde “P1” zugeben.

• Röhrchen 1 h auf einem Rollentaumelmischer inkubieren.

• Anmerkung: Häufig wird zum Blockieren unspezifischer Bindung fettarmes Trockenmilchpulver

verwendet, dieses ist billiger als BSA und blockiert in der Regel besser. Milch enthält jedoch

Spuren von Biotin, das das Streptavidin blockieren würde.

Mikro-Titration der Neutralisation

Die Bindung der Peptide an Streptavidin wird durch Absenkung des pH-Wertes gebrochen. Da die

Phagen bei niedrigem pH schneller denaturieren, wird nach der Elution neutralisiert und diese

Neutralisation wird vorab einmal pro Gruppe getestet.

• 1 ml Gly/HCl pH 2,2 mit 100 µl 1M Tris pH >= 9 versetzen und 10 µl auf ein pH Stäbchen

geben. Wenn der pH Wert unter 7 liegt, nochmals 50 µl zugeben und nochmals auf einem neuen

pH-Stäbchen testen. Wenn sich der pH in etwa einstellt, in 10 µl Schritten weiterarbeiten.

Abschließend wird empfohlen, das getestete Volumen nochmals mit 1 ml der Gly/HCl-Lsg zu

testen.

Anmerkung: Diese Art der Mikrotitration soll hier exemplarisch gezeigt werden, sie eignet sich zur

schnellen Bestimmung sehr kleiner Probenvolumen, auch mit 5 µl Tropfen kann der pH Wert in

vielen Fällen noch genau genug bestimmt werden.

Gegen Ende der Phagen-Inkubation sollte die optische Dichte der Zellen kontrolliert werden.

Phagen Waschen, Elution und Neutralisation

• Nach der Inkubation wird die Phagenlösung in den biologischen Abfall gegeben.

• Das Röhrchen wird 6 mal mit TBST bis zum Rand gefüllt und ausgeleert und ausgeklopft.

• Zur Elution wird 1 ml Glycin/HCl pH 2.2 mit final 1mg/ml BSA versetzt und in das Röhrchen

gegeben und 10 min auf dem Taumelrollenmischer gedreht.

• Ein 1,5 ml Eppi wird mit einem kleinen Haftetikett markiert. Hierauf wird der Name, das Datum

und der einzufüllende Inhalt festgehalten (Phagen Eluat 2. Panning Runde anti Streptavidin, z.B.


kurz ΦP2EL Strept). Zusätzlich kommt ein Aufkleber auf den Deckel, der nur die Abkürzung

trägt. Mit einem rundherum geklebten Tesafilm wird das Etikett geschützt.

• Die Phagenelution wird in das beschriftete 1,5 ml Eppi überführt und mit der in der

Mikrotitration bestimmten Menge an Tris-Puffer (ca. 150 µl) neutralisiert.

Phagen Amplifikation

1 ml des Phageneluats wird zu 40 ml ER 2738 Zellen in der frühen log Phase bei einer OD600 von

ca. 0,5 gegeben. 20 ml der 100 ml Kultur werden verworfen und zum Autoklavieren gegeben.

Nach der Zugabe der Phagen die Kultur schwenken und 10 min auf dem Tisch stehen lassen, dann 4

(- 5 h) bei 37 °C schütteln.

Belegen eines Immunoröhrchens und einer Mikrotiterplatte

Für eine weitere Panning-Runde müssen ein Immunoröhrchen und für den Test der Phagenbindung

eine Mikrotiterplatte mit Streptavidin belegt werden (siehe Schema vom Donnerstag).

• Jeweils 1,5 ml der bereits angesetzten Beleglösung (30 µg/ml Streptavidin in NaHCO3-Puffer) in

ein Immunoröhrchen geben.

• Auf zwei Mikrotiterplatten in der Mitte ein Raster von 3 × 5 markieren und jeweils 75 µl der

Beleglösung hineinpipettieren.

• Zwei Vertiefungen werden zusätzlich mit 75 µl als Referenz befüllt und der Rest auf die zwei

bereits befüllten Immunoröhrchen verteilen.

• Die Röhrchen und Platten werden im Kühlraum über Nacht bei 4 °C gedreht bzw. geschüttelt.

Mittagspause

Herstellung von Platten für die Phagentiter Bestimmung

• 150 ml 1.5 % Agar in LB werden im Wasserbad flüssig gehalten.

• Eine 1:1000 Verdünnung der IPTG / X-Gal Stammlösung zugeben.

• 10 dünne Platten gießen, bei denen der Boden gerade eben bedeckt ist. Während des Gießens die

Platte bewegen, so daß sich die Flüssigkeit trotz der Oberflächenspannung verteilt. Nach dem

Abkühlen werden die Platten lichtgeschützt (z.B. in Aluminiumfolie eingeschlagen) und bei 4 °C

gelagert.

Phagen Fällung

Die Phagen werden durch Zentrifugation und anschließende Fällung aus dem Kulturmedium

gereinigt und angereichert.

• 40 ml Zellsuspension werden in ein 50 ml Schraubdeckel Plastikgefäß gegeben; bei 5000 × g, 4

°C, 10 min werden die Zellen in der Heraeus Variofuge abzentrifugiert.

Achtung: Die gewünschten Phagen befinden sich im Überstand.

• Anmerkung: Zum Abzentrifugieren von Zellen wäre eine höhere g-Zahl besser, die Variofuge

leistet jedoch nicht mehr und die Rotoren anderer Zentrifugen fassen nicht genug Proben für den

gesamten Kurs. Im Labor verwenden wir 9000 × g.

• Der Überstand wird in ein neues Gefäß überführt und es wird 1/6 Volumen der

Phagensuspension an PEG/NaCl-Lösung zugegeben.


• Die Phagen fallen bei einer Inkubation bei 4°C aus; diese erfolgt über Nacht. Hierzu werden die

Proben in den Kühlraum gebracht. (Anmerkung: wenn man es eilig hat und eine schlechtere

Fällung in Kauf nimmt reichen zwei Stunden.)

• Die Phagen werden am nächsten Tag aufgearbeitet.

Dienstag

Materialien

• siehe auch erster Kurstag

• Zellen, Phagen, Platten und Immunoröhrchen aus erstem Kurstag

• Photometer, das Spektren aufzeichnen kann

• Einwegküvetten, Quarzküvette

• Wasserbad 45 °C

• Reagenzgläser, Ständer

• Brutschrank

• Kultur für Phagenamplifikation

• Kultur für Phagentiter

• Wischtücher

• Spritzflasche

Kultur für die Phagenamplifikation

Wie am ersten Kurstag. Die Zellen werden während der 2. Phagenfällung ausgegeben.

Immunoröhrchen und Platten blocken

• Die Streptavidin-Lösung in den belegten Immunoröhrchen und in den Platten wird verworfen.

• Die belegten Immunoröhrchen (ca. 4 ml) und Mikrotiterplatten Vertiefungen (ca. 400 µl) werden

randvoll mit 5 mg/ml BSA in NaHCO3-Puffer gefüllt. Das benötigte Volumen abschätzen und

ausreichend Blocklösung mit der BSA Stammlösung und dem NaHCO3 Puffer in einem 50 ml

Plastikschraubgefäß ansetzen.

• Mindestens 1 h durch Schwenken bzw. Rollen bei Raumtemperatur die Oberflächen blockieren.

• Die Blocklösung durch Ausgießen bzw. Abschlagen verwerfen und die Platten bzw. Röhrechen

bei 4 °C verschlossen bzw. abgedeckt lagern.

• Die Oberflächen vor Gebrauch 3 mal mit TBST-Puffer waschen.

Phagenfällung aufarbeiten

• Gefällte Phagensuspension 15 min bei 5000 × g, 4 °C zentrifugieren.

• Achtung: die gewünschten Phagen befinden sich im Zentrifugat (=Pellet).

• Überstand vorsichtig dekantieren und verwerfen, restliche Flüssigkeit vorsichtig mir einer

Pipette abnehmen. (Anmerkung: man kann das Plastikgefäß zum Auslaufen auch auf einem

Papier auf den Kopf stellen, dies kann jedoch eher zu Kontaminationen führen)

• Zentrifugat in 1 ml TBS aufnehmen und in ein 1.5 ml Eppi überführen.


• 5 min bei 13000 ×g zentrifugieren

• Überstand mit den gelösten Phagen in eine neues Eppi geben.

• Für eine zweite Fällung 1/6 Volumen PEG/NaCl zugeben (ca. 167 µl).

• 20 min - 60 min auf Eis inkubieren. (Anmerkung: Eine längere Lagerung der zweiten PEG/NaCl

Fällung verbessert die Ausbeute; 20 min passen jedoch besser zum Praktikum). In der Wartezeit

werden die Zellen ausgegeben.

• 8 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.

• Überstand vorsichtig mit einer Pipette abnehmen und verwerfen.

• Zentrifugat in 300 µl TBS aufnehmen.

• 1 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.

• Überstand in ein neues Eppi geben.

• Die durch PEG-Fällung gereinigten Phagen auf Eis lagern.

Anmerkung: Für eine längere Lagerung der gereinigten Phagen können diese aufgrund ihrer

geringen Größe noch sterilfiltriert werden.

Panning Runde P3

wie am ersten Kurstag

Titerbestimmung Amplifikation P2 durch Absorptionsmessung

Filamentöse Phagen besitzen bezogen auf die Masse ca. sechsmal mehr Protein als DNA. Das

Absorptionsspektrum der Phagen ist daher durch ein breites Plateau von 260 - 280 nm

gekennzeichnet mit einem flachen Maximum bei 269 nm. (Andere Phagen wie λ oder T4 besitzen

etwa gleiche Massen an Protein und DNA). Nach Day und Wiseman kann die Phagenkonzentration

aus der Differenz der Absorption bei 269 und 320 nm berechnet werden.

sfaktorVerdünnungmPhagengenoBasenderAnzahl

AAmlPhagen ×

××−=

___

106)(/

16320269

Gemessen wird gegen eine Referenz mit reinem TBS Puffer. Der Abzug der Absorption bei 320

nm, einer Wellenlänge bei der Proteine und DNA fast nicht absorbieren, dient der Korrektur des

Streulichtes durch Phagenpartikel und partikuläre Verunreinigungen. Noch genauer kann das

Streulicht durch eine lineare Extrapolation der Absorption zwischen 350 und 320 nm auf 269 nm

approximiert werden. Der verwendete Phage M13kelib besitzt 7265 Basen. Zur Messung wird ein

Spektrum von 350 bis 220 nm aufgenommen. Um das eingesetzte Volumen klein zu halten, wird in

einer geschwärzten und gesockelten Quarzmikroküvette gemessen. Hierzu werden 10 µl der

Phagenamplifikation in 290 µl TBS aufgenommen.

Sollte bei der Titerbestimmung ein ungewöhnlich niedriger Wert bestimt werden, sollte der Ansatz

zur Panning Runde P3 nachgebessert werden.


Phagenamplifikation P3

wie am ersten Kurstag (eine frische Kultur zur Infektion wird ausgegeben).

Mittagspause

Titerbestimmung Eluat P2, Amplifikation P2 und Eluat P3 durch Plattieren

• 9 LB X-gal/IPTG Platten im Brutschrank auf 37 °C aufwärmen.

• 9 sterile Reagenzgläser in einem Wasserbad auf 45 °C vorwärmen.

• Top-Agar (LB + 0,7% Agar) in der Mikrowelle im 4. Stock aufkochen, jeweils 3 ml in die

erwärmten Reagenzgläser geben und weiterhin bei 45 °C flüssig halten.

• Durch serielles Verdünnen eine 1:102, 1:103 und eine 1:104 Verdünnung des Phageneluats der

Runde P2 und P3 herstellen (z.B. 10 µl zu 990 µl LB Medium ergibt eine 1:102 Verdünnung,

hiervon 100 µl zu 900 µl LB Medium ergibt eine 1:103 Verdünnung usw., die Pipettenspitze

dabei mehrmals füllen und leeren, für jede Verdünnung eine neue Pipettenspitze verwenden,

nach jeder Verdünnung gut mischen).

• Durch serielles Verdünnen eine 1:108, 1:109 und 1:1010 Verdünnung des Phagenamplifikats der

Runde P2 herstellen (z.B. 10 µl zu 990 µl ergibt eine 1:102 Verdünnung, hiervon 10 µl zu 990 µl

eine 1:104 Verdünnung, usw. ergibt 1:106 und 1:108, hiervon 100 µl zu 900 µl eine 1:109

Verdünnung. Bei serieller Verdünnung ergeben sich größere Pipettierfehler und die Adsorption

der Phagen an die Gefäßwände kann sich bemerkbar machen. Wieviel Liter würde man

benötigen, wenn man 10 µl direkt 1:1010 verdünnen wollte?).

• Für jede Verdünnung 190 µl der Zellen der Infektionskultur bei OD 0,5 in ein Eppi geben.

• 10 µl der jeweiligen Phagenverdünnung zu den vorbereiteten Zellen geben, mischen und 5 min

für die Infektion bei Raumtemperatur stehen lassen.

• Top-Agar aus dem Wasserbad nehmen, kurz auf ca. 42 °C abkühlen lassen, die infizierten Zellen

zugeben, durch mehrmaliges Schwenken gut durchmischen, auf die warmen LB-Platten gießen

und durch Schwenken und Kippen gleichmäßig verteilen.

• Nach dem Härten die Platten über Nacht im Dunkeln bei 37 °C bebrüten.

• Anmerkung: vor dem Bebrüten können die Platten einige Zeit im Dunkeln bei Raumtemperatur

gelagert werden. (Die Platten können auch ohne Lichtschutz gehandhabt werden, die

Farbintensität nimmt jedoch im Laufe der Zeit erheblich ab. Um den Luftzutritt zu den Platten zu

erhalten, dürfen die Platten nicht eingewickelt, sondern nur abgedeckt werden)


Mittwoch

Materialien

• Zahnstocher

• DNAprep-Säulchen

• Heizblock 50°C

Aufarbeitung der Phagenfällung

wie bereits beschrieben

Titerbestimmung Amplifikation P3

wie bereits beschrieben durch Absortionsmessung

Präparation Einzelsträngiger DNA (wird zuert angesetzt)

• Jeder Kursteilnehmer pickt mit Hilfe eines Zahnstochers einen Klon der Titerbestimmung seiner

3. panning Runde und infiziert eine 4 ml Kultur von ER2738 in der frühen log-Phase. Danach

wachsen die Zellen ca. 4 h bei 37 °C. Die DNA Präparation erfolgt mit Hilfe einer

Silicamembran-Chromatographie. Im Folgenden ist die Anleitung des Herstellers für die

Verwendung dieses “Kits” wiedergegeben. Während des Zellwachstums werden die anderen

Versuche des Tages angesetzt.

QIAprep Spin M13 Protocol, QIAprep M13 Handbook 02/99

This protocol is designed for preparation of single-stranded M13 DNA from 1– 3 ml E. coli culture

grown in 2x YT or LB medium, using spin columns in a microcentrifuge. Up to 3 µg of ssDNA can

be expected per 1 ml phage supernatant depending on the particular phage clone. E. coli strains used

for infection must contain the F’episome that drives pilus biosynthesis (e.g., JM101, JM109, TG1).

• 1. Grow an infected M13 culture.

Cultivation of M13 infected cultures should be performed at 37°C with constant agitation. Do

not grow cultures infected with recombinant M13 bacteriophages for longer than 5–6 hours.

Longer growth results in selection of deletion mutants and contamination of cultures with M13

RF, chromosomal DNA, and nucleases from lysed cells. For general information about M13

propagation, refer to the Appendix on page 28 or to molecular biology manuals such as “Current

Protocols in Molecular Biology”, Ausubel, F.M. et al., eds (1991), Chapter 1.14.

Mittagspause

• 2. Spin down bacterial cells at 5000 rpm for 15 min at room temperature.

• 3. Transfer supernatant containing M13 bacteriophage to a fresh reaction tube. Be careful not to

disturb the bacterial pellet. Any carryover of bacterial cells will result in contamination of the

M13 precipitation with bacterial chromosomal DNA or double-stranded bacteriophage RF DNA.

• 4. Optional: Repeat the centrifugation step. A second centrifugation step may be necessary to

ensure a clean supernatant fraction, and no bacterial cell carryover.


• 5. Add 1/100 volume of Buffer MP for M13 precipitation. (i.e., 10 µl per 1 ml of phage

supernatant.) Mix by vortexing and incubate at room temperature for at least 2 min. During this

step, bacteriophage particles are precipitated from the culture medium.

• 6. Place a QIAprep spin column in a 2-ml microcentrifuge tube and apply 0.7 ml of the sample to

the QIAprep spin column. The bacteriophage supernatant must be loaded in successive 0.7 ml

fractions due to the capacity of the QIAprep spin column.

• 7. Centrifuge for 15 sec at 8000 rpm and discard flow-through from collection tube. During this

step intact bacteriophage are retained on the QIAprep silica-gel membrane.

• 8. Repeat the loading and centrifugation (steps 6 and 7) until all of the sample has been loaded

onto the QIAprep spin column.

• 9. Add 0.7 ml Buffer MLB, for M13 lysis and binding, to the QIAprep spin column and

centrifuge for 15 sec at 8000 rpm. This step creates appropriate conditions for binding of the

M13 DNA to the QIAprep silica-gel membrane. Bacteriophage lysis begins.

• 10. Add another 0.7 ml Buffer MLB to the QIAprep spin column, and incubate for 1 min at room

temperature to lyse bacteriophages completely. Centrifuge for 15 sec at 8000 rpm. M13 single-

stranded DNA is released from bacteriophage particles and adsorbed to the QIAprep silica-gel

membrane.

• 11. Add 0.7 ml Wash Buffer PE and centrifuge for 15 sec at 8000 rpm. Residual salt is removed

in this step.

• 12. Discard Wash Buffer PE from collection tube. Centrifuge QIAprep spin column for 15 sec at

8000 rpm to remove residual Buffer PE. It is important to dry the QIAprep membrane with a

quick microcentrifugation step. This prevents residual ethanol from being carried over into

subsequent reactions.

• 13. Place QIAprep spin column in a clean 1.5-ml microcentrifuge tube. To elute DNA add 100 µl

of Buffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) to the center of the column membrane, incubate for 10

min, and centrifuge for 30 sec at 8000 rpm. Incubation of elution buffer in the QIAprep spin

column significantly increases the recovery of single-stranded M13 DNA molecules, which

adsorb tightly to the silica membrane. If yields are low or variable, recovery may be enhanced by

preheating the elution buffer to 50°C. The DNA can also be eluted with H2O. When using water

for elution, make sure that the pH is in the range 7.0–8.5. Elution efficiency is dependent on pH

and the maximum elution efficiency is achieved within this range.

Konzentrationsbestimmung der DNA

20 µl der DNA-Lösung werden mit 280 µl EB-Puffer gemischt und das Absorptionsspektrum von

340 bis 220 nm aufgenommen. Als Referenz wird das Spektrum von reinem EB-Puffer verwendet

bzw. abgezogen. Die DNA Konzentration wird aus der Absorption bei 260 nm abzüglich des

Streulichtes bei 320 nm berechnet.

Kursteil 2: gerichtete Evolution

(siehe Skript)


Donnerstag

Kursteil 2

Berechnung eines Phagen ELISA Ansatzes

Am Freitag soll ein Phagen ELISA durchgeführt werden. Bitte lesen Sie hierzu die

Versuchsvorschrift durch und berechnen Sie entsprechend Verdünnungen für Ihre

Phagenkonzentrationen. Entwickeln sie hierzu eine Formel mit der serielle Verdünnungsreihen

berechnet werden können. Beachten Sie, dass in der Tabelle für den ELISA absolute

Phagenanzahlen angegeben sind und das Volumen im Begleittext steht. Sollte Ihre Phagenmenge

eines Versuchsteils (z.B. P2 Phagen) nicht ausreichen, setzen Sie die maximal mögliche Menge ein,

und passen Sie die anderen Verdünnungen dementsprechend an. Die Konzentration von P0 wird im

Kurs bekanntgegeben.

Freitag

Materialien

• Ultrazentrifuge, Schweißgerät, Waage, Pinzette, Bechergläser

• CsCl Lsg 0,4 g/ml

• Quickseal Röhrchen, Kanülen, 5ml Spritzen

• Stativ, Hintergrund, Taschenlampe

• Photometer

• Aliquotiertes ABTS

• ELISA Reader

Kursteil 2

Phagenreinigung in einem Cäsium Chlorid Gradienten und Ultrazentrifugation

• Etwa 80% des Volumens der PEG-Fällung der 3. Runde (Achtung: es werden noch Phagen für

den Phagen ELISA benötigt) werden zu 5 ml einer CsCl/TBS-Lösung gegeben, die 2 g CsCl

enthält. Durch mehrmaliges Umdrehen des Plastikgefäßes wird gemischt.

• Mit Hilfe einer Spritze und Kanüle werden 5 ml in ein beschriftetes 13 × 38 mm Polyallomer

Quick-Seal Zentrifugenröhrchen geben.

• Nach dem Einfüllen durch Absaugen sicherstellen, daß der Hals des Röhrchens trocken ist. An

einer elektronischen Waage werden die Röhrchen mit Hilfe der Platzhalter und Deckel paarweise

auf 10 mg genau tariert. Mit einem speziellen Schweißgerät werden die Röhrchen verschlossen

und durch Drücken auf Dichtigkeit geprüft.

• Die Zentrifugation erfolgt in einer Ultrazentrifuge bei 60 000 rpm (ca. 400 000 × g) für 4 h in

einem Beckman VTi 65.2 Rotor, die Beschleunigung wird “schnell” und die Bremse auf

“langsam” eingestellt.

Anmerkung: Die Zentrifuge darf nur nach Einweisung bedient werden. Bei dem Rotor handelt es

sich um einen Vertikalrotor bei dem sich die Schichten im Gleichgewicht vertikal ausbilden.


Während des langsamen Abbremsens (15 bis 20 min) lagern sich die Schichten in eine

horizontale Lage um. Ein Vertikalrotor wird verwendet, da sich bei diesem aufgrund der kurzen

Strecke der Dichtegradient schnell ausbildet. Nach Beendigung der Zentrifugation die Röhrchen

sehr vorsichtig herausnehmen um eine Durchmischung der Schichten zu vermeiden.

• Gewinnung der Phagen:

Das Zentrifugenröhrchen wird mit einer Stativklemme an einem Stativ befestigt und vor einem

schwarzen Hintergrund von oben mit einer ebenfalls am Stativ befestigten Taschenlampe

durchleuchtet. Aufgrund des Streulichts erscheint die Phagenbande milchig weiß. Zur Belüftung

des Röhrchens eine Kanüle an der Spitze des Röhrchens einstechen. Eine zweite Kanüle

unterhalb der Phagenbande einstechen und nach schräg oben führen bis die Öffnung an der

Phagenbande anliegt. Bei der Verwendung der Kanülen nicht auf die eigene Hand zielen!! Die

Phagenbande von etwa 400 bis 500 µl vorsichtig absaugen.

• Anmerkung: Üblicherweise wird das CsCl durch Verdünnung (z.B. 2,5 ml TBS) und nochmalige

pelletierende Zentrifugation (z.B. 50 000 rpm / 135 000 × g) oder Dialyse entfernt.

• Von den gereinigten Phagen wird ein Spektrum gegen CsCl/TBS-Puffer aufgenommen.

Phagen ELISA

• Die belegte und geblockte Mikrotiter-Platte wird 5 x mit TBST gewaschen.

• Für den Phagen ELISA werden die Phagenamplifikate eingesetzt. Für jede Panning-Runde

werden drei serielle Verdünnungen angesetzt, wobei die erste und zweite Verdünnung als

Doppelbestimmung durchgeführt werden. Die Vertiefungen werden mit jeweils 75 µl gefüllt. Die

Phagenkonzentration sollte dabei anhand der Absorptionsspektren so gut wie möglich bestimmt

werden. Bei der geringsten Verdünnung, also der höchsten Phagenkonzentration, sollen 1×1012

Phagen in jede Vertiefung pipettiert werden. Hierzu werden die Phagen mit TBST / 3 mg/ml

BSA verdünnt. Bei sehr geringen Ausbeuten werden die Phagen unverdünnt eingesetzt. Die

Phagen der Runde P0 werden mit Konzentrationsangabe ausgegeben. Das folgende

Pipettierschema sollte angewendet werden:

Spalte

Zeile

3

P0

4

P2

5

P3

6

Kontrollen

B P0 1*10^12 P2 1*10^12 P3 1*10^12 1. Ak

C P0 1*10^12 P2 1*10^12 P3 1*10^12 1. Ak

D P0 1*10^11 P2 1*10^11 P3 1*10^11 nur ABTS

E P0 1*10^11 P2 1*10^11 P3 1*10^11

F P0 1*10^10 P2 1*10^10 P3 1*10^10

• Die Phagen werden 45 - 60 min bei RT auf einer Plattform geschüttelt.

• Die Platten werden abgeschlagen und 5 mal mit TBST gewaschen. Der Flüssigabfall wird in ein

Becherglas gegeben.


• Jeweils 75 µl eines murinen monoklonalen anti-M13genVIII Antikörpers, der mit Peroxidase

gekoppelt ist, werden in einer Verdünnung von etwa 1:3000 zugesetzt.

Anmerkung: Häufig verwendet man einen primären monoklonalen Antikörper und einen

generell einsetzbaren sekundären Antikörper der mit einem Enzym gekoppelt ist. Dies ist in der

Regel sensitiver und billiger, erfordert jedoch einen weiteren Arbeitsschritt und das Signal ist

weniger linear zur Antigendichte.

• 45 - 60 min schütteln.

• 5 mal waschen.

• Jeweils 75 µl einer ABTS Substratlösung zusetzen, die aliquotiert ausgegeben wird (1 g/l ABTS,

3.25 mM Na-Perborat, 40 mM Zitronensäure, 60 mM Di-Na-Hydrogenphosphat, pH 4,5).

• Über ca. 5-20 min Farbveränderung beobachten und qualitativ festhalten. Die Platten werden

genauer mit einem Mikrotiterplattenlesegerät bei 405 nm ausgewertet (im Labor 4. OG Ost).

Erfolgt die Reaktion zu schnell (Präzipitieren des Farbstoffs) muss sie mit 100 µl 0,1 M NaSO4

abgestoppt werden. Die Lösung hierzu und eine Schutzbrille (!) befinden sich im Kursraum.

PC-/Programm-Einführung


Montag (zweite Woche)

Materialien

• Sequenzier Pre-Mix

• PCR-Maschine

• Sequenziergerät / Sequenzierservice

Sequenzierreaktion

Protokoll für Applied Biosystems Gerät

• Reaktionsansatz: Für die Sequenzierreaktion werden die folgenden Reagenzien in ein

dünnwandiges 500 µl PCR Gefäß pipettiert.

Premix+Primer 2.0 µl (wird im Eppi ausgegeben)

ssDNA-Template ca. 0.1 µg (typisch 2-3 µl, die DNA-Konzentration wurde durch

Absorptionsmessung bestimmt)

H2O auf 10 µl

Anmerkungen: Das “Premix” enthält Taq Polymerase, Puffer, dNTP und fluoreszenzmarkierte

ddNTP in jeweils 4 unterschiedlichen Fluoreszenzfarben. Es werden 10 pmol Primer mit dem

“Premix” ausgegeben. Größere DNA Mengen liefern in der Regel stärkere Signale.

• Thermocycler Protokoll ( Eppendorf Mastercycler PCR Maschine): Bei diesem Schritt erfolgt

die eigentliche Sequenzierreaktion.

Gerätegrundeinstellung:

Standardgeschwindigkeit 3 °C/s (gilt, wenn nicht im Programm anders definiert)

500 µl Gefäß (wird vor dem Start des Programms abgefragt)

10 µl Füllvolumen (wird vor dem Start des Programms abgefragt)

105 °C geheizter Deckel

Auto-Abkühlung des Deckels nach Ende des Programs

Programm:

Schritt 1) 96 °C bis Eingabe (dient dem Aufheizen der Maschine und des Deckels; hier

erfolgt die Zugabe der vorbereiteten Probengefäße und Bestätigung der Fortführung des

Programms)

Schritt 2) 96 °C für 30 s (dient der Denaturierung der DNA)

Schritt 3) 50 °C für 15 s (diese Temperatur soll knapp unterhalb der Schmelztemperatur des

Primers liegen)

Schritt 4) 60 °C für 4 min (bei diesem Schritt werden die Primer verlängert bis zu einem

Abbruch mit ddNTP)

Schritt 5) Wiederholung ab einschließlich Schritt 2) 14 mal

Schritt 5) 4 °C halten, bis Eingabe

Schritt 6) Ende

Nach Beendigung des Programms kurz zentrifugieren, um die Probe am Gefäßboden zu

sammeln. Hierzu wird das kleine Gefäß in ein 1.5 ml Eppdorfgefäß gestellt.

• Probenreinigung: Die Sequenzierreaktion enthält nicht inkorporierte fluoreszenzmarkierte

ddNTP, die mit dem Auslesen von bis zu 40 Basenpaaren interferieren würden. Diese müssen


daher durch z.B. Größenausschlußchromatographie abgetrennt werden. Hierzu werden

Zentrifugiersäulchen gepackt und eingesetzt. Das Säulenmaterial darf während der einzelnen

Arbeitsschritte nicht austrocknen. Das Sephadex G50 Material für die

Größenausschlußchromatographie ist mindestens 30 min vorgequollen und wird gebrauchsfertig

ausgegeben, eventuell überschüssiges Wasser vor Gebrauch dekantieren.

o Die Vorratsflasche wird durch zweimaliges Schwenken durchmischt. Mit einer

abgeschnittenen 1 ml Spitze werden 700 µl auf eine Spin-Säule mit Fritte geben und diese

in ein 2 ml Zentrifugiergefäß geben.

o 2 × 2 min bei 1000 ×g zentrifugieren (es bleibt genau so viel H2O zurück wie das

Säulenmaterial aufnehmen kann), das Zentrifugat verwerfen, Zentrifugiergefäß aufheben.

Bei der Zentrifugation auf die Orientierung des Eppi achten.

o Den Sequenzieransatz mit H2O auf 20 µl auffüllen.

o Säule in ein beschriftetes 1.5 ml Reaktionsgefäß geben und den 20 µl Reaktionsansatz

mittig auf das schräg liegende Säulenmaterial geben

o 2 min bei 1000 × g zentrifugieren (falls weniger als 12 µl eluieren, nochmals

zentrifugieren)

o Das Eluat in ein 200 µl Eppi überführen und auf Eis aufbewahren.

• Probenauftrag: Die Proben werden gesammelt und von der Arbeitsgruppe Igloi in die

Sequenziermaschiene geladen. Die Sequenzprofile werden am nächsten Tag verteilt.

• Bei der Abgabe der Proben wird das Sequenziergerät vorgestellt.

Dienstag (zweite Woche)

Materialien

• Fertig gegossene Polyacrylamid-Gele

• 10 ml Spritze mit Kanüle (zum Ausspülen der

Taschen)

• Laufpuffer

• Ladepuffer

• Vertikal Gelelektrophorese Apparaturen

• Blotting-Apparaturen

• Stromnetzgeräte, Anschlusskabel

• Heizblock 95°C; Eis

• Handschuhe, Schutzbrille

• Coomassie Färbe- und Entfärbelösung

• Westernblot Puffer

• PonceauS-Lösung

• TBS

• Anti Gen8protein-Antikörper gekoppelt an Meerettich-Peroxidase

• Westernblot Färbelösung (DAB, Sigma)


Je drei Gruppen lassen zusammen zwei Gele laufen. Jede Person trägt eine Phagenprobe

(Gereinigtes Amplifikat P2 oder P3) auf zwei Gele auf. Insgesamt werden also 6 Proben (plus

Marker) pro Gel aufgetragen. Bei dem einen Gel werden alle Proteine mit Coomassie gefärbt und

das zweite Gel wird auf eine Membran abgeklascht („ge-blottet“). Auf der Membran wird dann

spezifisch ein Phagenprotein mit einem Antikörper detektiert (Immuno-Blot / Western-Blot). Beide

Gele sollten gleich beladen werden und gleich lang laufen, damit man das gefärbte Gel mit dem

Western-Blot vergleichen kann.

SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS PAGE)

• Kamm langsam nach oben aus dem Gel abziehen und Taschen mit Laufpuffer mit Hilfe einer

Spritze und Kanüle vorsichtig ausspülen.

• Gel in Gelkammer mit Klammern einspannen und Laufpuffer in obere und untere Kammer

füllen, so dass der Puffer über den Taschen steht.

Probe vorbereiten und Elektrophorese starten

• 2×1011 Phagen mit dem 5-fachen Volumen an Protein-Auftragspuffer (=Ladepuffer) (250 mM

Tris/HCl pH 8,0, 500 mM DTT, 50% (v/v) Glycerin, 10% SDS (w/v) 0.5% (w/v)

Bromphenolblau Na-Salz) mischen.

• 10 min bei 95°C erhitzen und dann 1 min bei max. Geschwindigkeit abzentrifugieren.

• Mit 20 µl Pipette oder, wenn verfügbar, mit einer „Hamilton“-Pipette ca. je 15 µl Proben und

Molekulargewichtsmarker vorsichtig in jeweils eine Tasche auftragen. Proben am besten links

und rechts des Markers assymetrisch auftragen, z.B. ein und zwei Taschen entfernt.

• Apparatur mit richtiger Polung an Stromversorgung anschließen (SDS ist negativ geladen und

läuft zum Plus-Pol/Anode) und Gel spannungskontrolliert bei 120 V laufen lassen.

• Der Lauf ist beendet, wenn der Farbmarker den unteren Rand des Gels erreicht.

Gel Färben und Auswerten

• Stromversorgung abklemmen und Gel aus der Kammer nehmen.

• Platten mit Hilfe der Abstandshalter langsam und vorsichtig trennen, so dass das Gel auf einer

Platte liegt.

• Gel vorsichtig in eine Dose fallen lassen und mit 0,05% Coomassie R-250 Lösung ca. 30 min

unter Schwenken auf dem Schüttler färben.

• Färbelösung in Sammelgefäß geben und Gel mit 20% Essigsäure unter Schwenken entfärben, bis

Banden gut zu erkennen sind. Ggf. Entfärbelösung 1- 2 mal ersetzen.

• Laufstecke der Banden mit Lineal ausmessen und auf eine Eichgerade des Markers in eine x,y

Grafik mit logarithmischer Molekulargewichtsachse eintragen. Aufgrund der Molekular-

gewichtsbestimmung sollen die Banden den bekannten Phagenproteinen zugeordnet werden.

Western-Blot

Vorbereitung Western Blot

• 6 mal Whatman Filterpapier 3M auf 8x7 cm zuschneiden

• Nitrocellulose Membran 45 µm auf 8x7 cm zuschneiden, Membran möglichst wenig berühren

und wenn nur mit Handschuhen.

• Filterpapier und Membran kurz vor der Verwendung in Western-Blot Puffer einlegen.


Zusammenbau Western Blot

• 3 Lagen Filterpapier auf die Anode (+, rot) der Blotting-Apparatur legen, hierbei Luftblasen

vermeiden. Zum Entfernen von Luftblasen ein Reagenzglas mit sanftem Druck über die

Filterpapiere rollen.

• Membran passgenau auf die Filterpapiere legen und ebenfalls ein Rggl. abrollen.

• Wie oben beschrieben Gel aus der Elektrophorese Apparatur entfernen. Wenn das Gel noch auf

der Glasplatte liegt, die Stege der Taschen mit einem Skalpell abschneiden. Beim Abnehmen des

Gels darauf achten, dass sich Sammel und Trenngel nicht trennen.

• Gel an den zwei unteren Enden halten und beginnend an den oberen zwei Enden schrittweise auf

der Membran ablegen, hierbei auf passgenauen Sitz achten und Luftblasen vermeiden. Ein

Kollege kann ggf. mit einer Pipette etwas Puffer unter das Gel geben. Das Gel möglichst in

einem Zug auflegen, da sich sonst Doppelbanden bilden können.

• Ein Filterpapier auflegen und wieder ein Rggl. abrollen.

• Zwei weitere Filterpapiere auflegegen.

• Aufbau auf unnötige Strombrücken kontrollieren.

• Deckel der Blotting-Apparatur schließen und an das Netzteil mit richtiger Polung anschließen.

• Den Abklatschvorgang stromkontrolliert bei 1,3 mA/cm2 für 30 min laufen lassen. Zwei bis drei

Gele können gleichzeitig auf einer Apparatur abgeklatscht werden. Für die Stromstärke alle Gele

auf einer Apparatur berücksichtigen.

PonceauS Färbung

• Blotting-Apparatur öffnen und Membran entnehmen. Zustand des Aufbaus nochmals auf Luft-

blasen, Temperatur usw. kontrollieren. Lage der Membran zum Gel markieren (z.B. durch

Bleistift Strich an rechter unterer Ecke).

• Membran in eine PonceauS-Lösung geben.

• 3 -5 min unter langsamen Schwenken inkubieren.

• Membran unter Leitungswasser entfärben bis Banden sichtbar sind. Beim Ausgießen die

Membran nur an den Ecken zurückhalten.

• Markerbanden und prominente Banden der Proben mit einem spitzen weichen Bleistift am Rand

durch einen Punkt markieren.

• Membran annähernd vollständig unter Leitungswasser entfärben.


Blocken und Entwickeln der Membran

• Membran 1 h bei RT oder bei 4°C über Nacht in TBS mit 3% (w/v) Milchpulver blocken.

• Membran 3 mal 10 min in TBS/0.05% Tween waschen.

• Anti Gen8protein-Antikörper gekoppelt an Meerettich-Peroxidase (αg8p-HRP Ak) 1:10000 in

TBS/1% Milchpulver verdünnen und mit der Membran unter langsamen Schwenken 45 min

inkubieren.

• Membran 3 mal 10 min in TBS/0.05% Tween waschen.

• Herstellen der Färbelösung DAB (3,3'-Diaminobenzidin, Sigma): 1 Puffertablette und 1

Färbetablette zusammen in 5 ml ddH20 auflösen (evtl. vortexen). WICHTIG: Tabletten nicht mit

den Fingern berühren! Die fertige Färbelösung entspricht: 0,7 mg/ml 3,3'-Diaminobenzidine

(DAB), 2,0 mg/ml Urea Hydrogen Peroxide (H2O2 Äquivalent, 0,7 mg/ml), 60 mM Tris buffer.

• Blot färben bis die Banden gut sichtbar sind. Anschließen Reaktion mit Wasser abstoppen.

Mittwoch (2. Woche)

Fertigstellen Westernblot und Gelfärbung und Entfärbung

Kursteil 2

Doktoranden Vortrag

Donnerstag (2. Woche)

Material

10 Computer mit Internetanschluß, Internet browser, swiss pdb viewer, acrobat reader,

Grafikprogramm, LCD Projektor, Leinwand, Internetanschluss für Laptop

Proteinstruktur Darstellung und Manipulation am Computer, DNA und Proteindatenbanken

Freitag (2. Woche)

Sequenzierauswertung, Klonierung am Computer

Die Technik der Phagenpräsentation - syntbio.net 2009.pdf · Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation...

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