006 Metodos de Transferencia de Proteinas a Filtros Western Blot

IPLT – Carrera de Técnico en Laboratorio – Material para cursado de Técnicas de Laboratorio I

006 MÉTODOS DETRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS A FILTROS

Introducción: aplicación directa vs. Transferencia electroforética

La transferencia de proteínas o 'blotting' supone la inmovilización de las proteínas sobre membranas sintéticas, seguido de la detección empleando sistemas especialmente diseñados para la tinción de 'blots'. El método más potente es el denominado 'Western blot' en el que las proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel a una membrana. El procedimiento es análogo al desarrollado por el Prof. E. Southern ('Southern blotting') y por ello se le denominó 'Western'. Hay sin embargo otros métodos de transferir o aplicar proteínas sobre una membrana. El más sencillo es aplicarlas directamente en forma de una pequeña gota de una solución concentrada sobre la membrana. La absorción de la gota provoca la adhesión de la proteína a la membrana, quedando en forma de una mancha o 'dot' (es el caso del 'dot blot'. Existen dispositivos que facilitan la aplicación de las proteínas directamente a la membrana, aplicando una succión que facilita la penetración de la solución, y reciben los nombres de 'dot blot' o 'slot blot' en función de que la proteína quede aplicada en forma de una gota circular o de una línea. En la imagen puedes ver dos de estos dispositivos.

Trabajar con las proteínas fijadas sobre una membrana tiene ventajas sobre el emplearlas dentro del propio gel:

• son más rápidas de teñir y desteñir • no se produce tinción de los anfolitos en los geles de isoelectroenfoque. se

detectan cantidades menores de proteínas pues se concentran en la superficie y no se diluyen en todo el espesor del gel

• el 'blot' es un registro conveniente y cómodo de manipular del gel • las membranas son mucho más fáciles de manipular que el propio gel

Todo procedimiento de 'blotting' consta de 5 etapas:

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• Inmovilización de proteínas sobre la membrana ya sea mediante transferencia (electroforética, aspiración, presión) o mediante aplicación directa.

• Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos, que son proteínas.

• Incubación del 'blot' con anticuerpo primarios contra la/s proteína/s de interés. • Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o reactivos que actúan de

ligando del anticuerpo primario unidos a enzimas u otros marcadores. • Las bandas de proteínas marcadas con enzimas se hacen visibles por

incubación con los sustratos apropiados para formar productos coloreados insolubles en el lugar donde se encuentran las bandas de proteína.

Hay tres métodos para transferir proteínas a las membranas:

1. Transferencia capilar 2. Transferencia por difusión 3. Transferencia electroforética

('electroblotting')

En el caso de los geles de poliacrilamida el método de elección es la transferencia electroforética. La transferencia es mucho más efectiva si se realiza aplicando una diferencia de potencial entre el gel y la membrana.

Electroblotting

En este método, descrito por Towbin, las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana electroforéticamente. La ventaja de este proceso es su corta duración (de 30 min a pocas horas), lo que reduce notablemente el efecto de difusión de las bandas. El procedimiento se inicia apilando sucesivamente sobre una esponja plana papel de filtro empapado en tampón de transferencia, el gel, la membrana en contacto directo con el gel, más papel de filtro y finalmente una esponja plana. Este conjunto se recoge entre dos capas de plástico perforado y se introduce en un tanque en el que se encuentra una solución salina (tampón de transferencia) y dos electrodos planos (diseñados para conseguir un campo uniforme en toda la superficie del gel). Se

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dispone de forma que el gel quede hacia el ánodo (-) y la membrana hacia el cátodo (+). La carga neta de las proteínas en el caso de los geles de SDS-PAGE es positiva debida a la carga del SDS.

La electroforesis se realiza a 8-10 V/cm (de separación entre electrodos), que suele corresponder a 0.3 a 2. Amp de 1 a 4 h. La velocidad de transferencia es inversamente proporcional al tamaño de la proteína.

El proceso provoca un fuerte calentamiento de la solución por lo que se recomienda refrigerar el sistema y recircular el tampón. Una vez realizada la transferencia la membrana se puede analizar inmediatamente o bien conservarla en frío (2 a 8ºC) durante meses.

Existen diferentes combinaciones de soluciones de transferencia y de membranas para cada aplicación. En la tabla siguiente se incluyen algunas de las más características.

Tabla : Condiciones de electroblotting más comunes.Gel Tampón de transferencia Membrana

SDS-PAGE (Lammli)

O'Farrell 2D

25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% v/v metanol, pH 8.3

Nitrocelulosa

Papel de intercambio iónico

PVDF

25 mM Tris, 192 mM glicina, pH 8.3

Nitrocelulosa, Nylon, Papel de intercambio iónico, PVDF, papel diazo-modificado

25 mM fosfato sódico, pH 6.5 papel diazo-modificado

SDS-PAGE

O'Farrell 2D

Native PAGE (proteínas acídicas o básicas) 15 mM borato sódico, pH 9.2 papel diazo-modificado

IEF, Native-PAGE (proteínas básicas), geles de urea ácidos

0,7% ácido acético Nitrocelulosa, Nylon, papel diazo-modificad

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El grosor del gel es un factor que influye notablemente en la transferencia, siendo muy ineficiente a partir de geles de 2 mm de espesor, y tanto más eficiente cuanto más fino es el gel, con un límite debido a los problemas de manipulación en torno a los 0.4 mm.

La membrana que se emplea más frecuentemente es la nitrocelulosa, aunque cuando se requieren soportes más robustos, por ejemplo cuando la membrana ha de ser reutilizada diversas veces se recurre al Nylon. Sin embargo, las membranas de Nylon se bloquean con más dificultad que las de nitrocelulosa y suelen presentar mayor 'background'. Las membranas de PVDF tienen gran capacidad de unión a proteínas y gran resistencia mecánica pero se humedecen con más dificultad.

Todas las membranas son hidrofóbicas y requieren un tratamiento previo con metanol antes de sumergirlas en soluciones acuosas.

Es importante incorporar en el gel a transferir un control de la transferencia que habitualmente es el propio carril donde se han cargado los marcadores de peso molecular que al transferirlos se tiñen sobre el filtro para ver si la transferencia de toda la gama de pesos moleculares ha sido correcta.

Existen algunas variantes a la transferencia electroforética descrita previamente. El sistema más extendido es el 'Semi-Dry blotting' en el que los geles son sometidos a una intensidad de corriente elevada entre dos electrodos planos entre los que se coloca una pila formada por papel, el gel, la membrana y más papel, empapados en tampón de transferencia. El único líquido que hay es el que empapan los papeles. La ventaja de este sistema es su rapidez, consiguiendo transferencias en pocos minutos.

Tinción de proteínas en el filtro

Habitualmente se emplean técnicas de tinción de proteínas sobre el filtro como control de la transferencia. Existen diferentes métodos para teñir todas las proteínas presentes en el filtro, pero los que más interés despiertan son los métodos de tinción de proteínas específicas a partir de mezclas complejas separadas en geles y

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transferidos a filtros, son los métodos de tinción específicos, usualmente basados en métodos inmunoquímicos.

Proteína total - Colorantes

Los colorantes que permiten teñir las proteínas en los geles de poliacrilamida no son utilizables en los filtros pues se unen inespecíficamente a éstos. Para teñir las proteínas en los filtros se emplean: Ponceau S, Tinta china o Negro Amido.

Ponceau S se emplea en forma de solución acuosa. La tinción es rápida pero no es permanente y puede desaparecer en el procesamiento posterior. Como la tinción desaparece es compatible con casi todos los procedimientos de detección con anticuerpos.

El método de tinción de filtros con tinta china es reproducible, sensible y permanente, y no interfiere con los procedimientos de inmuno detección, pero puede tapar la tinción calorimétrica del proceso inmunoquímico. La tinción se basa en la adherencia preferente de las partículas coloidales de carbón de la tinta sobre las proteínas inmovilizadas. La distinción se hace en PBS.

El negro amido es menos sensible que la tinta china. Las bandas aparecen negras sobre un fondo azul claro. Después de la tinción se destiñe con una solución de metanol/ácido acético. Este método de tinción es incompatible con la inmuno detección posterior.

Tinción mediante biotina-estreptavidina

Este método de tinción se basa en la afinidad de la estreptavidina por la biotina. Los grupos amino primarios y secundarios de las proteínas unidas a la nitrocelulosa se pueden biotinilar empleando un derivado N-hidróxido succinimida de la biotina que contiene un brazo espaciador hidrofóbico. Un lavado posterior elimina el exceso de biotina y después se bloquea la membrana con una solución de leche en polvo. Las proteínas biotiniladas pueden ser detectadas empleando un complejo preformado de estreptavidina-enzima y el sistema de detección de la actividad enzimática.

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Tinción mediante oro coloidal

Existen productos comerciales como AuroDye-R de Amersham que actúa como colorante para proteínas sobre filtros. Se trata de una solución coloidal estabilizada de oro a pH 3. A este pH las partículas de oro están cargadas negativamente y se unen específicamente a las proteínas. No se puede usar sobre membranas de Nylon pues se une no específicamente a las cargas de la membrana. El color obtenido es rojo oscuro. Existen sistemas de amplificación de señal. Este método tiene una sensibilidad similar al de la tinción con plata de los geles.

Detección específica de proteínas en filtros

Introducción

Una proteína específica puede ser identificada y visualizada en un 'Western blot' empleando técnicas de inmuno detección. Estas técnicas emplean la capacidad de reconocimiento de los anticuerpos a sus antígenos. En 'Western blot' se emplea comúnmente el sistema de inmuno detección indirecta que se representa en la figura. En este método se emplea un anticuerpo primario para localizar la proteína de interés. Un segundo anticuerpo, marcado con un enzima, y contra la especie en la que se ha producido el primero, se emplea para localizar donde se formaron los complejos antígeno-anticuerpo. Este anticuerpo secundario se puede marcar de formas muy diversas con el fin de producir una señal detectable (por ejemplo una señal sobre una película radiográfica o una mancha de color en el filtro). En ocasiones se emplean en lugar del anticuerpo secundario proteína A o proteína G.

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Bloqueo de la membrana

Una etapa común a todos los procedimientos de inmuno detección es el bloqueo, para prevenir la unión no específica del sistema de detección a la membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado 'background' o falsos positivos.

Se han descrito numerosas soluciones bloqueantes, y todas ellas son efectivas. El factor esencial a tener en cuenta es elegir un sistema de bloqueo compatible con el sistema de detección empleado. Por ejemplo, las soluciones de bloqueo que contienen leche desnatada contienen una gran cantidad de carbohidratos complejos, y por ello deben descartarse cuando se van a emplear anticuerpos que reconocen determinantes en carbohidratos, o por ejemplo se ha de evitar el uso de suero completo si en la detección se emplea proteína A o proteína G.

Las dos soluciones de bloqueo que son compatibles con casi cualquier sistema de detección son las soluciones de leche desnatada y las soluciones de albúmina sérica bovina (BSA). También se recomienda el bloqueo en Tween-20 si hay demasiado 'background'. Sin embargo es conveniente usar con cuidado los detergentes no iónicos como Tween-20 pues pueden solubilizar las proteínas transferidas al filtro.

En la tabla siguiente se recogen algunas de las soluciones de bloqueo más comúnmente empleadas:

Tabla : Soluciones de bloqueo más comunes en 'Western blotting'Agente bloqueante Características

Leche en polvo 5% de leche desnatada en PBS /TBS. Muy económico. Con poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos antígenos.

Leche / Tween-20 Económico. 5% de leche desnatada en PBS/TBS - 01% Tween-20.

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Con poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos antígenos.

Tween-20 0.1% Tween-20, 0.02% azida sódica en PBS/TBS. Económico. Permite la tinción después de la inmuno detección. Puede quedar un 'background' residual.

BSA 3% BSA, 0,02% azida sódica en PBS. Bueno. Relativamente económico.

Suero de caballo 10% suero de caballo, 0,02% azida sódica en PBS. Sin 'background'. Moderadamente caro. Incompatible con algunos anticuerpos anti-inmunoglobulinas.

Elección del sistema de anticuerpos.

El tipo de anticuerpos empleado en la detección de las proteínas transferidas a filtro no es determinante. Existen tanto excelentes anticuerpos policlonales con alta especificidad y sensibilidad como monoclonales. Sin embargo los monoclonales se pueden obtener en mayor cantidad y mantienen siempre sus propiedades de reconocimiento independientemente del lote.

Una vez elegido el anticuerpo a emplear se deben realizar controles en el experimento, como por ejemplo la inclusión de un experimento completo idéntico con suero pre-inmune, y con el secundario empleado en la detección.

Secundarios / proteína A/ proteína G

Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos obtenidos inoculando en la especie productoras inmunoglobulinas de la especie a detectar (anticuerpos anti-especie). También se emplean los fragmentos Fab2, producidos mediante digestión con pepsina de los anticuerpos puros, y que, al carecer de región Fc no interfieren con algunos componentes de los tejidos que pueden estar presentes en las muestras biológicas complejas, reduciendo el 'background'.

Tanto la proteína A como la proteína G son proteínas que se aíslan de la pared celular de bacterias y que tienen la capacidad de unirse a la región Fc de los anticuerpos. Ambas pueden ser marcadas con facilidad con enzimas y otros marcadores. La proteína G tiene una capacidad de reconocimiento más amplia que la proteína A.

Elección del sistema de revelado

Existen tres grandes grupos de marcadores o sistemas de revelado empleados en 'Western blotting’:

• enzimas, que catalizan una reacción en la que se forma un precipitado coloreado, o en la que se emite luz.

• radioquímicos, que emiten radiaciones ionizantes • oro coloidal, que acumulado localmente produce un color rojizo, y que puede

Enzimas

Los dos enzimas más empleados para marcar proteína A o G o anticuerpos son la peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina.

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Peroxidasa de rábano (HRP)

La peroxidasa de rábano (HRP) se emplea con gran frecuencia. Se dispone de sustratos que forman un precipitado coloreado así como de sustratos quimioluminiscentes.

• sustratos calorimétricos. Se basan en la formación de un producto coloreado insoluble que precipita sobre la membrana en el lugar de acción del enzima. Se han descrito tres sustratos para la HRP.

3,3' diaminobenzidina (DAB).

En presencia de peróxido de oxígeno la polimerización oxidativa y el ciclado de la DAB por acción de la HRP producen la aparición de un precipitado marrón. Se puede intensificar la reacción añadiendo iones de Cobalto o de Níquel, que provocan un cambio de color del precipitado de marrón a gris-negro. La reacción es muy rápida y es fácil que se desarrolle en exceso provocando un elevado 'background' en el filtro. DAB es una molécula de acción carcinogénica y es necesario tomar precauciones para su manipulación.

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3',5,5' tetrametilbenzidina (TMB)

Es un sustrato alternativo para la DAB, más sensible antes de la amplificación con metales. Se forma un precipitado azul. Sin embargo su uso es reducido pues el precipitado es semisoluble en agua y desaparece con facilidad en algunas condiciones. Actualmente se dispone de nuevas formulaciones del sustrato que producen productos más estables.

4-cloro-1-naftol

En presencia de HRP y de peróxido de hidrógeno el cloronaftol produce un precipitado azul-negro. La reacción es fácilmente controlable, aunque es relativamente insensible cuando se compara con DAB o TMB.

• sustratos quimioluminiscentes. La reacción quimioluminiscente ocurre cuando la energía de una reacción química se emite en forma de luz. Se emplea la peroxidasa de rábano (HRP) para catalizar la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno. Inmediatamente después de la oxidación el luminol se encuentra en un estado excitado del que pasa a la situación basal, reducida, más estable, emitiendo luz. La luz emitida tiene una longitud de onda de 428 nm, con un máximo de emisión entre 15 y 20 minutos después de iniciada la reacción y una emisión que se puede prolongar de 2 a 3 horas. Si esta reacción se produce sobre una membrana en contacto con una película de autorradiografía ésta queda impresionada. Este sistema tiene la ventaja de que permite eliminar el sistema de anticuerpos secundarios ('striping') y volver a analizar la membrana con otros anticuerpos ('reprobing').

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Fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina tiene una acción similar a la peroxidasa de rábano. Se han descrito asimismo sustratos calorimétricos y sustratos quimioluminiscentes.

Los sustratos calorimétricos de la fosfatasa alcalina son:

• bromocloroindolil fosfato / nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT). Forma un precipitado azul-púrpura- Es el resultado de la desfosforilación y posterior oxidación de BCIP a índigo, acoplada a la reacción de NBT a diformazon. La reacción es progresiva lo que facilita el control de la misma ajustando el tiempo de desarrollo.

• Naftol-AS-MX fosfato / Fast red (NAMP/FR) y naftol-AS-BI-fosfato / Fast Red TR (NABP/FR) Las dos parejas de productos conforman dos sustratos que se transforman en un precipitado insoluble de color rojo. Este sistema es menos sensible que el anterior (BCIP/NBT) pero el color obtenido tiene un mejor contraste con la membrana.

• AP mistly purple / AP liquid purple. Son productos comerciales (Amersahm, composición exacta no conocida) con propiedades de sustrato específicas para la fosfatasa alcalina. Se forma un precipitado intensamente púrpura que no desaparece con el tiempo.

El sustrato quimioluminiscente de la fosfatasa alcalina es el 3-(2'spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3'phosporyloxy)-phenyl-1,2-dioxetane. Después de la desfosforilación el producto se acumula como un intermediario inestable que se descompone en adamantane y methymetha-oxybenzoato que pasa de un estado inestable, excitado, a otro estable, relajado, emitiendo luz.

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En la figura adjunta se muestran filtros de 'western blot' que han sido revelados con algunos de los sustratos calorimétricos antes citados para la peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina.

Sistemas radioquímicos de revelado

Para poder detectar las proteínas mediante el uso de isótopos radiactivos es necesario que éstas incorporen este tipo de isótopos. Existen diferentes estrategias para conseguirlo. La elección de una u otra dependerá del objetivo perseguido. Veamos algunos ejemplos:

• si el objetivo es detectar las proteínas sintetizadas en un período de tiempo en un sistema celular, el método de elección es el denominado marcaje metabólico, que consiste en la adición al medio de cultivo de las células de aminoácidos marcados (en general se emplean los aminoácidos azufrados cisteína y metionina con el isótopo S35, emisor de radiación beta débil). Las células incorporarán este aminoácido a todas las proteínas que sinteticen durante el período de exposición al trazador.

• • si el objetivo es detectar una proteína en concreto, el método de elección será

inmunoquímico con un sistema de revelado que emplee reactivos radiactivos: anticuerpos secundarios unidos a I-125 o proteína A o G -I125. El proceso de marcaje de una proteína con I-125 se basa en la reacción de Bolton y Hunter que

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tienes en la figura. De una manera similar se pueden incorporar otros marcajes como el S35.

El revelado se realiza mediante exposición de la membrana ante película autorradiográfica. En este caso, a diferencia de la autorradiografía y fluorografía de los geles de acrilamida no es necesario tratar la membrana con fluoróforos pues la totalidad del marcaje se localiza en la cara más externa de la membrana. Si se emplean las pantallas amplificadoras para incrementar la señal.

La ventaja de disponer de copias duraderas (película) del experimento es además de la conservación, la posibilidad de realizar densitometrados que permiten obtener valores cuantitativos de la señal obtenida. Para ello es ideal el sistema de 'slot blot'. En la figura se han recogido algunos ejemplos.

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Tinción mediante oro coloidal

Es posible detectar las proteínas fijadas sobre un filtro empleando anticuerpos que directamente o indirectamente (anticuerpos secundarios o proteína A o G) estén unidos a oro coloidal.

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Debido a las características del oro coloidal la interacción antígeno anticuerpo se observa como una señal rosácea de intensidad proporcional a la cantidad de antígeno presente. La señal es tenue y tiende a desaparecer. Por ello se han diseñado sistemas de intensificación de señal que en general se basan en la precipitación de plata metálica en torno al oro coloidal. La reacción de amplificación con plata se basa en la reducción de iones de plata a plata metálica por acción del oro, que actúa como catalizador. Se forma un precipitado marrón oscuro, estable, que incrementa la sensibilidad 10 veces.

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La tinción que se obtiene es permanente y casi sin 'background'. El proceso de intensificación de la señal del oro con plata es progresivo y puede ser monitorizado hasta obtener la señal deseada. En las imágenes se muestra, en la primera, una comparación entre un filtro de 'western blot' revelado con oro coloidal o amplificado posteriormente con plata. El aumento de sensibilidad es importante. En la segunda se muestra el efecto del tamaño de la partícula de oro coloidal sobre la sensibilidad de la detección.

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Proteína A y proteína G

La proteína A es un polipéptido de 42000 Daltons constituyente habitual de la pared celular de Staphilococcus aureus. Se ha estudiado con gran detalle la interacción entre la proteína A y los anticuerpos: la proteína A tiene cuatro potenciales lugares de unión

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a los anticuerpos, sin embargo sólo se puede usar uno a la vez. Sin embargo la proteína A es claramente bifuncional permitiendo la formación de complejos multiméricos. En las moléculas de anticuerpo la región de unión a la proteína A se encuentra en las regiones constantes segunda y tercera de la cadena pesada. Por ello, cualquier anticuerpo tiene al menos dos lugares de unión a la proteína A, y esto es una organización ideal apara la formación de complejos multiméricos.

La afinidad de la proteína A depende de las regiones Fc del anticuerpo, dependientes de la subclase. La proteína A tiene alta afinidad por los anticuerpos humanos, de burro, conejo, perro, cerdo y cobaya, menor afinidad pero aún útil por ratón, vaca o caballo, y es baja y por ello poco útil para detectar anticuerpos de oveja, cabra, rata o gallina. En este último caso se suele emplear un anticuerpo puente de una especie por la que tenga alta afinidad. En la tabla puedes encontrar la afinidad relativa de la proteína A y la proteína G por los anticuerpos de varias especies (modificado de "Antibodies")

Especies afinidad por la proteína A

afinidad por la proteína G

Humana (Hu) ++++ ++++ Caballo (Ho) ++ ++++ Vaca (Co) ++ ++++ Cerdo (P) +++ +++ Oveja (Sh) +/- ++ Cabra (G) - ++ Conejo (R) ++++ +++ Gallina (Ch) - + Hamster (Ha) + ++ Cobaya (G) ++++ ++ Rata (Ra) +/- ++ Ratón (Mi) ++ ++

En la tabla siguiente se recogen las afinidades de la proteína A y la proteína G por varias subclases de inmunoglobulinas

Anticuerpo afinidad por la proteína A

afinidad por la proteína G

Human IgG1 ++++ ++++ Human IgG2 ++++ ++++ Human IgG3 - ++++ Human IgG4 ++++ ++++ Rata IgG1 - + Rata IgG2a - ++++ Rata IgG2b - ++ Rata IgG2c -+ ++ Ratón IgG1 ++ ++++ Ratón IgG2a ++++ ++++ Ratón IgG2b +++ +++ Ratón IgG3 ++ +++

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Hay tres propiedades de la proteína A que la hacen muy útil en los estudios inmunocitoquímicos:

1. Debido a que la región de unión con el anticuerpo reside en la región Fc, la unión a proteína A no cambia la capacidad del anticuerpo de unirse a su antígeno.

2. Incluso una proteína A desnaturalizada renaturaliza fácil y rápidamente recuperando su capacidad de unión.

3. Aunque la afinidad de la proteína A por el anticuerpo es elevada la unión antígeno-anticuerpo se puede romper con facilidad reduciendo el pH.

La proteína A se ha empleado en gran cantidad de métodos inmunoquímicos, acoplada a isótopos radiactivos (detección en Western blot), a marcadores fluorescentes, oro coloidal, etc., unida a resinas en la confección de lechos cromatográficos para la purificación de anticuerpos.

En la actualidad la proteína A se purifica tanto de fuentes naturales (S. aureus) como a partir de sistemas de sobre expresión de proteínas recombinantes.

La proteína G es un polipéptido de entre 30000 y 35000 Daltons aislado de la pared celular del estreptococo beta-hemolítico de las cepas C o G. Se conoce mucho menos de la proteína G que de la proteína A. El interés de esta y otras proteínas de pared celular bacteriana son sus características de afinidad que difieren de las de la proteína A, complementándola en muchos casos. Uno de los inconvenientes de la proteína G es que presenta un segundo lugar de unión a la albúmina. Actualmente y mediante métodos recombinantes se ha eliminado ese segundo lugar de unión lo que ha supuesto un incremento de la utilidad de la proteína G.

Bibliografía Universidad de Buenos Aires. Cátedra de inmunoquímica. Introducción a la producción de Anticuerpos. Buenos Aires, 2004. Universidad de Heidelberg. Antibodys in The recombinant antibody page. 2009. Universtitat de Barcelona. Antígenos. Cátedra de Biología Molecular. Textos para expertos. 2008. Kaplan – Pesce. Química Clínica. Teoría, análisis y correlación. Ed. Panamerica. Bs. As. 1988, cap 9, 194-202. Universidad de Maryland. Producción de Anticuerpos. Maryland 2005

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