The ATD project is funded by the European Commission within its FP6 Programme, under the thematic area"Life sciences, genomics and biotechnology for health", contract number LHSG-CT-2003-503329

SIXTH FRAMEWORK PROGRAMMESIXTH FRAMEWORK PROGRAMME

William Ritchie, TAGC INSERM, Marseille

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

• Courts ARNnc (20-25 nt) qui servent de régulateurs post-transcriptionnels

•Issus de mRNAs de plus grande taille (60-90) : qui forment des tiges boucles: pre-miRNA

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

• Plant miRNA: clivage des mRNA

•Animal miRNAs: repression de la traduction

• Lim et al. (2005): dans le model animal les miRNAs peuvent abaisser le niveau des messagers

Mir-124 Mir-1

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

• Se fixent sur la région non traduite du 3’ (UTR)

• Comment sont affectés les niveaux d’expression si une forme est ciblée et une autre ne l’est pas ?

• Trouver des gènes qui possèdent au moins deux isoformes dont une (la plus longue) a une cible de miRNA (dans l’UTR 3’) et l’autre n’en a pas.

CDS

CDS

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

• la reconaissance de la cible par le miRNA implique souvent une courte séquence 6-8 nt hautement conservée apellé « seed »

HumanMouse

RatDog

Chicken

• En utilisant les données d’Ensembl un assemblage de 3495 UTRs conservés (human, mouse, dog, rat) est crée

• Recherche de toutes les sequences de 7nt sequences parfaitement conservés: cibles potentielles de miRNA

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

• En utilisant des comptages d’EST on compare le niveau d’expression des isoformes ciblées et des isoformes non ciblées

Non-targetedisoforms

targetedisoforms

% o

f to

tal E

ST

s

« Non-targeted »isoforms

« targeted » isoforms

Control

P=0.38 P=7e-5

• Les isoformes ciblées ont un niveau d’expression plus élevé !!!

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

a

Non Cardiovascular BrainNon BrainCardiovascular

MiR-124a MiR-1

nt t t ttnt nt nt

Rel

ativ

e is

ofor

m e

xpre

ssio

n (%

)

• Mais n’y a-t-il pas un effet tissu spécifique ?

•evoc ontology (v26)

lym-pho-reti-

brain res-pira-tory

uro-geni-tal

muscu-los-

Ali-men-tary

car-dio-vas-

En-do-crine

dermal

0

5

10

15

20

25

30

1/p.

valu

e

1925 35 42

29

26

10

<10 <10

MiR-124a

lym-pho-reti-

brain res-pira-tory

uro-geni-tal

muscu-los-

ali-men-tary

car-dio-vas-

en-do-crine

dermal

0

5

10

15

20

25

1/p.

valu

e

31

15

6184 39

43

16 <1011

MiR-1

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

Disrep

• 10 genes

• 3 types tissulaires differents

Cible potentiel de miRNA

Tous tissus Tissu 1 Tissu 2 Tissu 3

P>0.05 P>0.05 P<0.05

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

14640 distinct motifs(373,948 sites)

Motif present downtream of 1st polyA site + Differential Isoform Repression test (p<0.05)

9334 motifs

DISREP:312 motifs

7-mers in 10 mRNAs and 3 tissues

Four-way Conserved 7-mers in 3’ UTRs

6.4 e -31.2 e -41.0 e -8p-value enrichment

2829312After Disrep

44626093347-mers conserved in 4 species (>10 genes, >

3 tissues)

PUF protein fixation siteAREMiRNA

targets

Total motif

s

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargetsP

ropo

rtio

n of

targ

ets

for

Kno

wn

miR

NA

s in

mot

ifs

(%)

p-value for differential repression of targeted isoforms

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

< 0.01 < 0.05 < 0.1 < 0.5

Disrep

Shuffle45

312

760

3810

29.6 2

61.2710.

1 3832.1

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

Trouver les 7-mers complementaires dans le genome

Extraire +/- 80 nt

Energie de repliement < -45Kcal

Four-way multi alignment + RNAZ p-value > 0.99 +

Criteres de structure et séquence

213 miRNA precursors (211 miRNAs)

Motif present downtream of 1st polyA site + Differential Isoform Repression test (p<0.05)

9334 motifs

DISREP:312 motifs

Hits de Megablast dans souris+rat+chien, avec la seed 100% conservée

Clustering des precurseurs chevauchants et elimination de ceux qui touchent au codant

456 miRNA precursors

7-mers dans 10 mRNAs et3 tissus

45 in miRNA registry

38 predicted by recent studies

128 novel precursors

Et les cibles qui ne correspondent pas a des precurseurs de miRNA

• Certaines cibles ne correspondent pas a des precurseurs potentiels

• Peut etre des sites de fixation d’un autre type d’ARNnc

• Longueur inconnue, structure inconnue

• Rechercher des motifs conservés et strusturéc

Et les cibles qui ne correspondent pas a des precurseurs de miRNA

● Alignements tout génome l'UCSC en utilisant des chaines de Markov et un filtre synthenie (homme,souris,chien,rat + zebrafish ou fugu) ● 5' UTR, 3' UTR, Intron, Intergenique

● Recherche de regions conservées

● Conservation d'une structure (RNAz p>0,9)

● Clustering hierarchique des differentes structures

● RNAforester

● Trop de branches tue la branche !!

● Trop de branches tue la branche !!