William Ritchie, TAGC INSERM, Marseille

The ATD project is funded by the European Commission within its FP6 Programme, under the thematic area"Life sciences, genomics and biotechnology for health", contract number LHSG-CT-2003-503329

SIXTH FRAMEWORK PROGRAMMESIXTH FRAMEWORK PROGRAMME

William Ritchie, TAGC INSERM, Marseille

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

• Courts ARNnc (20-25 nt) qui servent de régulateurs post-transcriptionnels

•Issus de mRNAs de plus grande taille (60-90) : qui forment des tiges boucles: pre-miRNA


• Plant miRNA: clivage des mRNA

•Animal miRNAs: repression de la traduction

• Lim et al. (2005): dans le model animal les miRNAs peuvent abaisser le niveau des messagers

Mir-124 Mir-1


• Se fixent sur la région non traduite du 3’ (UTR)

• Comment sont affectés les niveaux d’expression si une forme est ciblée et une autre ne l’est pas ?

• Trouver des gènes qui possèdent au moins deux isoformes dont une (la plus longue) a une cible de miRNA (dans l’UTR 3’) et l’autre n’en a pas.

CDS

CDS


• la reconaissance de la cible par le miRNA implique souvent une courte séquence 6-8 nt hautement conservée apellé « seed »

HumanMouse

RatDog

Chicken

• En utilisant les données d’Ensembl un assemblage de 3495 UTRs conservés (human, mouse, dog, rat) est crée

• Recherche de toutes les sequences de 7nt sequences parfaitement conservés: cibles potentielles de miRNA


• En utilisant des comptages d’EST on compare le niveau d’expression des isoformes ciblées et des isoformes non ciblées

Non-targetedisoforms

targetedisoforms

% o

f to

tal E

ST

s

« Non-targeted »isoforms

« targeted » isoforms

Control

P=0.38 P=7e-5

• Les isoformes ciblées ont un niveau d’expression plus élevé !!!


a

Non Cardiovascular BrainNon BrainCardiovascular

MiR-124a MiR-1

nt t t ttnt nt nt

Rel

ativ

e is

ofor

m e

xpre

ssio

n (%

)

• Mais n’y a-t-il pas un effet tissu spécifique ?

•evoc ontology (v26)

lym-pho-reti-

brain res-pira-tory

uro-geni-tal

muscu-los-

Ali-men-tary

car-dio-vas-

En-do-crine

dermal

0

5

10

15

20

25

30

1/p.

valu

e

1925 35 42

29

26

10

<10 <10

MiR-124a

lym-pho-reti-

brain res-pira-tory

uro-geni-tal

muscu-los-

ali-men-tary

car-dio-vas-

en-do-crine

dermal

0

5

10

15

20

25

1/p.

valu

e

31

15

6184 39

43

16 <1011

MiR-1


Disrep

• 10 genes

• 3 types tissulaires differents

Cible potentiel de miRNA

Tous tissus Tissu 1 Tissu 2 Tissu 3

P>0.05 P>0.05 P<0.05


14640 distinct motifs(373,948 sites)

Motif present downtream of 1st polyA site + Differential Isoform Repression test (p<0.05)

9334 motifs

DISREP:312 motifs

7-mers in 10 mRNAs and 3 tissues

Four-way Conserved 7-mers in 3’ UTRs

6.4 e -31.2 e -41.0 e -8p-value enrichment

2829312After Disrep

44626093347-mers conserved in 4 species (>10 genes, >

3 tissues)

PUF protein fixation siteAREMiRNA

targets

Total motif

s

Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargetsP

ropo

rtio

n of

targ

ets

for

Kno

wn

miR

NA

s in

mot

ifs

(%)

p-value for differential repression of targeted isoforms

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

< 0.01 < 0.05 < 0.1 < 0.5

Disrep

Shuffle45

312

760

3810

29.6 2

61.2710.

1 3832.1


Trouver les 7-mers complementaires dans le genome

Extraire +/- 80 nt

Energie de repliement < -45Kcal

Four-way multi alignment + RNAZ p-value > 0.99 +

Criteres de structure et séquence

213 miRNA precursors (211 miRNAs)

Motif present downtream of 1st polyA site + Differential Isoform Repression test (p<0.05)

9334 motifs

DISREP:312 motifs

Hits de Megablast dans souris+rat+chien, avec la seed 100% conservée

Clustering des precurseurs chevauchants et elimination de ceux qui touchent au codant

456 miRNA precursors

7-mers dans 10 mRNAs et3 tissus

45 in miRNA registry

38 predicted by recent studies

128 novel precursors

Et les cibles qui ne correspondent pas a des precurseurs de miRNA

• Certaines cibles ne correspondent pas a des precurseurs potentiels

• Peut etre des sites de fixation d’un autre type d’ARNnc

• Longueur inconnue, structure inconnue

• Rechercher des motifs conservés et strusturéc

Et les cibles qui ne correspondent pas a des precurseurs de miRNA

● Alignements tout génome l'UCSC en utilisant des chaines de Markov et un filtre synthenie (homme,souris,chien,rat + zebrafish ou fugu) ● 5' UTR, 3' UTR, Intron, Intergenique

● Recherche de regions conservées

● Conservation d'une structure (RNAz p>0,9)

● Clustering hierarchique des differentes structures

● RNAforester

● Trop de branches tue la branche !!

William Ritchie, TAGC INSERM, Marseille

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