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Parte C- setembro 2012
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DISCIPLINA:CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTAEFICINCIA - CLAE (IC -1339)
Profa. Rosane Nora Castronora@ufrrj.br
COLUNAS
CROMATOGRFICAS
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semi-preparativas
d.i. =10-20mmL =50-250 mm
preparativasd.i. =20-50 mmL =250-300 mmanalticas
d.i.= 2.0-4.6mmL =15-250 mm
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Alargamento dos picos emfuno da vazo da FM e do dimetro das partculasda FE.
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,
Diferentes d.i. das colunas e as respectivas vazes da FM utilizadasnas diferentes escalas de trabalho da CLAE
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Espessura do Filme (df) Temperatura Dimetro Interno Seletividade da Fase Estacionria
CAPACIDADE DA COLUNA
FORMA ANORMAL DO PICO NA ANLISE CROMATOGRFICA
Excesso deamostra
origina um picocom um aumento
gradual tromba eaps um mximo
ocorre uma quedarpida
Uma cauda longa ocorre quando em algumas zonasos compostos so mais retidos do que noutras
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Mais comum: partculas esfricas de slica. Polmero compostopor tomos tetradricos de silcio conectados entre si por tomosde oxignio, por meio de ligaes siloxanos (Si-O-Si).
Fases Estacionrias
Si
OH
Si
HO OH
Si
OH
Si
OH
LIVRES GEMINAL
influenciam no grau de acidez da slica
VICINAIS
Modificao superficial:- QUIMICAMENTE LIGADAS- HBRIDAS- RECOBERTAS COM POLMEROS ORGNICOS
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Fase Quimicamente LigadaFASE ESTACIONRIA REVERSA-os grupos funcionais ligados base deslica so apolares. As substncias so atradas para a superfcie pelos seusgrupos funcionais no polares.A substnciamais polar eluiprimeiro, seguidos pelos outros em ordem decrescente de polaridade. Os gruposbutil, octil, octadecil e fenila so os mais utilizados. O grupo octadecil responsvel pela maioria das separaes em fase reversa.
Grupos silanis so responsveis por retenes noespecficas que provocam alargamento dos picos
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Pr-hidrlise do agente silanizante
FASES ESTACIONRIAS POLIMRICAS
Colunas com maior estabilidade
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Composta de Matriz orgnica-inorgnica
-Mais estveis do que as quimicamente ligadas convencionais- Menor quantidade de grupos de silanis
- CromatografiaUltra-fast.- O teor de carbono cerca de 7%, antes de modificaes da superfcie.Colunas Xterra (Waters) so produzidas com essas partculas.- Permitem uso na faixa de pH 1 a 12, sem perda de eficincia oucapacidade, devido ao teor reduzido de grupos silanol, fornecemexcepcional forma de picos para analitos bsicos.
Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano
(RO)4Si + n(RO)3SiR + (1,5n+2)H2O SiO2(R SiO1,5)0,5+ (3n+4)ROH
FASES ESTACIONRIAS HBRIDAS
Contm ambos slica e organosiloxane
Aumento do carregamento decarbono sobre as partculas,
AUMENTA RETENO
Influncia da % de CARBON LOAD
Colunas com formasgeomtricas similares
Carbon load 5% 7% 9% 12% 15% 17%
Tempo de reteno
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Grupo FuncionalDIOL partculas esfricas de slica - CH2-CH2-CHOH-CH2-CH2-CH2OH
com funo diol na cadeia-C
NH2 partculas esfricas de slica - CH2-CH2-CH2-NH2
com funo -aminopropil
CN partculas esfricas de slica - CH2-CH2-CH2-CN
com funo -Cianopropil
RP-Select B partculas esfricas de slica - CH2-(CH2)6 -CH3com derivado Octil
Fases Estacionrias de Polaridades Mdias
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PRINCPIOS DE SEPARAO
Interao do soluto nas fases estacionria e mvel(equilbrio)
-Interaes de van der valls
- Ligaes de hidrognio
- Interaes dipolo-dipolo
- Atrao eletrosttica
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Fases estacionrias Interaes
C8
Fenil
C2
van der Waals
van der Waals
van der Waals
Si
Si
Si
Fase Estacionria
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Fase Estacionria
Fases estacionrias Interaes
CN
NH2
DIOL
Dipolo/Dipolo
OH
Si NH
H
OSi
OH
OOH
H
SiN
OH
C
Ligao de
hidrognio
Ligao dehidrognio
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Modos SeparaoModos Separao
I. Cromatografia em Fase Normal
O
O
SiO
H
O
SiO
O
O
O
2CH
SiO
O
OO
H
H
H
O
Mecanismo:
Reteno pela interao da superfcie polarda FE com partes polares das molculasdas amostras.
Fase estacionria:
SiO2, Al2O3, -NH2, -CN, -Diol, -NO2
Fase Mvel:Heptano, hexano, cicloexano,CHCl3, CH2Cl2, dioxano, AcOEt, IPA
Mtodo:
Separao de substncias no-inicas, no-polares a mdia polaridade (cidoscarboxlicos hidrocarbnicos)
amostra
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II. Cromatografia em Fase Reserva
amostra
Mecanismo:Reteno pela interao da cadeiahidrocarbnica no-polar da FE com aspartes no-polares na amostra.
Fase Estacionria:Octadecil (RP-18), octil(RP-8), etill (RP-2), fenil, -CN.
Fase Mvel:
-Tipo de modificador:Metanol ou acetonitrila
-gua (pode ter adio de THF ou dioxano).
-Tampo: fosfato, acetato
-Fora inica: sais, conc. de tampo
Mtodo:Separao de substncias no-inicas,polares a de polaridade mdia (cidoscarboxlicos hidrocarbnicos). Se substnciasque se ionizam (cidos carboxlicos) soseparadas, o controle de pH necessrio.
2CH OH
O
O
SiO HO
SiO
O
O
O Si
3CH
3CH
SiO
O
O
O Si
3CH
3
CH
H2O
H2O
CH3OH
CH3OH
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III. Cromatografia de Troca inica
- Reteno se d por atraoeletrosttica entre ons na FM eos ons de carga oposta na FE.
Trocadores aninicos (+)e catinicos (-)
PrincipaisTrocadores de ons:
-Fraco R-CO2- Na+ (Catinico) / R-N+R2H Cl-(aninica)- Forte R-SO3- Na+ (Catinico) / R-N+R3 Cl-(aninica)
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IV. Cromatografia de Excluso
A separao se d peladiferena de tamanho ,
onde as molculaspequenas penetram nosporos, e as maiores soexcludas dos poros da FE.
Usado na separao dePTN, polmeros, peptdeos,etc.
Volume/forma
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Contedo de Metal em ppmContedo de Metal em ppm
Sdio Clcio Magnsio Ferro Alumnio
LiChrosorb 340-400 1300 160-220 20-25 15-20
LiChrospher 150-250 6-10 4-6 20-40 75-140
Purospher 1 1 1 3 1
PurospherSTAR
29
1.
400 20
RP-18 silica convencional
2
0 20 40
1
Purospher RP-18 eCondies cromatogrficas:
Fase mvel: Metanol / gua ( 55:45)Fluxo: 1.0 ml/minDetector: UV 254 nmTemperatura: 35 C
Influncia da superfcie Derivatizada
N N CH 3
Piridina (1 ) 2-metil-piridina(2)
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Cetoprofeno
Fenoprofeno
Fluor-
biprofeno
Ibuprofeno
3.300 injeces depois de 1600 hours
1.650 injees depois de 800 hours
1. injeo
Estabilidade tempo - condies cidas pH < 2
Coluna: Purospher STARRP-18e (150 x4.6 mm x 5 m)
Eluente: acetonitrila/ gua (0,1 % TFA;50:50)
Fluxo: 1,0 ml / minDeteco: UV 254 nmInj. Volume: 10 lTemperatura: T.A.
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25 mm25 mm25 mm25 mm10 mm10 mm10 mm10 mm
4.6mm4.6mm4.6mm4.6mm
ChromolithChromolithChromolithChromolith
3mm3mm3mm3mm
Colunas de slica monolticas de d.i. diferentes
Formadas cilindricamente em forma de haste
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Chromolith Performance RP-18eChromolith SpeedROD RP-18e
125 - 4 mm
100 - 4.6 mm 50 - 4.6 mm
Anlise de Substncias cidas
Metanol/ Buffer pH 2.0 (30/70,v/v)
Fluxo: 1 ml/min
12
3
1111. cido 2-Nitrobenzico2. c. 2-Hidroxibenzico3. cido Benzico
1
2
3
1
2
3
Purospher RP-18e, 5m
Seletividade da Coluna Chromolith
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Efeito da Fora do solvente
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Otimizando a seletividade do Solvente
Mistura de 2solventes
fortesmelhora a
resoluo eseparao
Mudana dafora dosolvente
geraadequadareteno emelhora
resoluo
FM forte,amostra
fracamenteretida epobre
resoluo
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ANLISE DE COMPOSTOS BSICOS
Problemas com a forma do pico de compostos bsicos so normalmentecomuns.
Mas h vrios passos simples que podem melhorar significativamente aforma do pico de bases:
1- Selecione uma coluna base-slica desativada.
2- Usar fase mvel com baixo pH.
3 Aumento da concentrao de sais na fase mvel.
4 Selecione uma coluna endcapped.
5 Adicione uma base competitiva.
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ANLISE DE COMPOSTOS CIDOS
1 Adicione um cido orgnico competitivo.
Adicionou-se 1% de cido actico fase mvel para minimizar asinteraes soluto-silanol, pela ao de um cido competidor.
2- Substituindo o cido actico por 0.1% de cido trifluoractico -TFA.
A concentrao relativamente alta de cido actico resulta em rudo dalinha de base. Usando TFA 0.1% como modificador aquoso resulta numafase mvel mais transparente, menos rudo.
Em pH 3, a fase mvel est tamponada, porm a capacidade tamponante baixa. aumento da concentrao para 10 20mm melhorar areprodutibilidade cromatogrfica por mais tempo, alm de melhorar aindamais a forma do pico.
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Tempo de reteno no reprodutvel um problema comum quando se usa fasemvel altamente aquosa. Na separao de compostos muitopolares, solveis em gua no incomum usar FM com menos de 10% demodificador orgnico(metanol,acetonitrila, etc.) Para conseguir
reteno suficiente. Entretanto, nestas condies areprodutibilidade ruim. Com o tempo, os picos eluiro comtempo de reteno cada vez menores e aresoluo piora. A figura mostra cromatogramas deanlise de vitaminas em coluna C-18, FM:5 %MeOH 95% 0.1M KH2PO41ml/min Vitamina C vitamina B1 vitamina B6 -Nicotinamida.
CLAE : FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
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A mudana do tempo de reteno causada pelo fenmeno denominadocolapso de fase (fases alqulicas hidrofbicas C18 ou C8 em condies defase mvel altamente aquosas. A medida que o colapso de fase progride, a viabilidade da fase alquilicainteragir com solutos diminui e o tempo de reteno decresce. H tambm evidncia que este colapso de fase pode deslocar a FM aquosados poros da FE, reduzindo a rea superficial acessvel para os solutos eportanto reduzindo os tempos de reteno. Em condies normais a fase alqulica est extendida na FM e solvente emolculasda amostra tem total acesso a FE. Quando se usa FM altamente aquosa a FE tende a colapsar e o tempo dereteno afetado
CLAE : FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
Purgando a coluna com solventeorgnico a fase alquilica novamenteextendida e o tempo de reteno restaurado.
Separao de substncias quirais. Importante na anlise de produtosfarmacuticos, flavours, produtos naturais,etc.
- A presena de centros assimtricos em algunsfrmacos est relacionada sua atividade farmacolgica. Qualquer alterao na orientao
espacial desses centros pode causar inativaototal do frmaco, diminuio do efeito biolgicoou ento aparecimento de um efeito contrrio,que pode ser extremamentedanoso para a sade
FASE ESTACIONRIA QUIRAL
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EXEMPLOS DE FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS:
A. ChiraDex e ChiraDex-Gamma - processo especial ligandocovalentemente ou - ciclodextrina partcula esfrica da slicavia espaadores.
ChiraDex - caracterizada pelaampla enantiosseletividade e porser usada para separao deenantimeros de classes desubstncias diferentes.
ChiraDex-Gamma deve serempregada com sucesso paraanlisede (D,L)-aa.
Eluente: mistura metanol/ H2O etampo, com aumento da faseorgnica (polaridade) ocorremelhora da separao
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B. Chiracel OD -fases estacionrias quirais de carbamato de celulose tris-3,5-dimetilfenil em partculas de slica de 10 m. A formao estereosseletiva doenantimero acontece na cavidade quiral da camada do polmero por meio deligao H e interao -. Apresentam alta estabilidade qumica e podem serusados com eluente de fase normal e reversa.
Anlise de-bloqueadores: atenolol, betaxolol, metoprolol,nadolol e pindolol
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Anlise por CLAE colunas quirais.CHIRALCEL OD-H, CHIRALCEL OB-H,CHIRALPAK AD e CHIRALPAK foramavaliadas sob condies de FN usandohexano/etanol ou hexano/2-propanolcomo FM. A coluna CHIRALCEL OJ-R foiavaliada sob condies de FR, usandoacetonitrila:H2O. A coluna CHIRAL AGPfoi usada com FM de tampo fosfato eacetonitrila.
Uso de coluna quiral na anlisede Omeprazol
Medicamento antiulceroso(benzimidazlico)
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Colunas: Astec CHIROBIOTICV e V 2 ( 25 c m x 4.6 m m x 5 m)Elue nte: 15mM formiato deamnio em metanolFluxo: 1 mL/ minTemp.: 25 CDetetor:UV a 230nm
Uso de coluna quiral na anlise de sibutramina(agente antiobesidade)
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2. PROCEDIMENTO DE LIMPEZA APS UMA LONGA SEQUNCIA DE
ANLISE:
Colunas RP: Fase mvel - *H2O -> ACN:H2O (10:90) -> ACN:H2O(90:10) mudana c/ gradiente linear (10min.)
*somente se a fase mvel for um tamponado concentrado.
Colunas NP: Fase mvel ->n-Propanol ->n-Heptano
Colunas de 100,125 e 150x4/4,6mm = 30 minutos para cada estgio,vazo de 1ml/min. Colunas de 250, 300 x 4/4,6mm = 60 minutos para cada estgio, vazode 1ml/min.
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3. PROCEDIMENTO DE REGENERAO QUMICA:
Colunas RP:gua -> Metanol -> Clorofrmio -> Metanol -> gua ou0,05M H2SO4.
Colunas NP:Heptano -> Clorofrmio -> Acetato de Etila -> Acetona ->Etanol -> gua.
Colunas de 100,125 e 150x4/4,6mm = 30 minutos para cada estgio,vazo de 1ml/min.
Colunas de 250, 300x4/4,6mm = 60 minutos para cada estgio, vazode 1ml/min.
OBS.: - Caso a presso de trabalho esteja elevada, pode-se inverter osentido da coluna durante todo o processo de regenerao.- Limpeza defritsda coluna.
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