8/10/2019 MicrobiologiaManual de Practicas De
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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
manual de prcticas
laboratorioMICROBIOLOGA
GENERAL
Mara de los Angeles Aquiahuatl Ram
Mara de Lourdes Prez Chab
Casa abierta al tiempo UNIDAD IZTAPALAPA
HOS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia Bibliome
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Rector General
Dr. Luis Mie r y Tetn Casanueva
Secretario General
Dr. Ricardo Sols Rosales
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA - Iztapalapa
Rector
Dr. Jos Lema Labadie
Secretario
Mtro . Luis Javier M elgo za Valdiv ia
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Director
Dr. J. Gerardo Saucedo Castaeda
Secretario Acadmico
M. en C. Arturo L. Preciado Lpez
Departamento de Biotecnologa
jefe del Departamento
Dr. J. Ma rian o Garca Garibay
ISBN 970-31-0141-0
Primera Edicin: 2004
Univers idad Autnom a Me tropol i tana, Unidad Iztapalapa
Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina.
Del.
Iztapalapa, C.P. 09340 Mxico, D.F.
Impreso y hecho en Mxico
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delos Ange les AquiahuatlRamos
Mara
de
Lourdes PrezChabela
laboratorio
MICROBIOLOGA
GENERAL
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Agradecemos al Director de la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la
Salud Dr. Gerardo Saucedo Castaeda por todo el apoyo para la publica-
cin de este manual de prcticas del laboratorio de *: :: ^
GENERAL
Al Sr. Jorge Lodigliani por su apoyo e n el procesado de las fotografas.
Al Dr. Alfonso Totosaus y al Sr. Wilfrido Rodrguez por su ayuda en el
diseo de las figuras.
A toda la gente que revis este manual, que con sus aportaciones
enri-
quecieron este trabajo.
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ndice
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PRESENTACIN
RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE
PRCTICA# 1
Preparacinyesterilizacindematerialesymediosdecultivo
Preparacin del material de vid rioymedios de cultivo
Esterilizacindem aterialesymedios de cultivo
Preparacin de las cajas de Petriytubos con medios de cultivo
Prueba de esterilidad de materiales
PRCTICA
# 2
Preparacin, fijacin
y
coloracin simple
de
frotis
Preparacin de frotis
Fijacin del frotis
Tincin simple
Observacin
al
microscopio
PRCTICA# 3
Tincin diferencialdeGramytincion es selectivas
Tincin diferencial de Gram
Tincin se lectiva de endosporas
Tincin negativa para observacin de cpsulas
Observaciones
al
microscopio
PRCTICA
# 4
Mtodos de cultivo
y
aislamiento de bacterias
Tcnica de estra cruzada
Siembra en tubos con caldoyagar nutritivo
Siembra de cajas de Petri con medios d iferencialesyselectivos
Condiciones de incubacin
PRCTICA# 5
Mtodos de cultivo
y
descripcin morfolgica de hongos
Siembra de hongos
Descripcin macroscpica de levadurasymohos
Descripcin microscpica de levaduras
Descripcin microscpica de mohos en montaje con cinta adhesiva
PRCTICA
# 6
Pruebas de diferenciacin bioqumica
Tcnica de Inoculacin en cajas de Petri
Tcnicas de Inoculacin en tubos
Evaluacin de actividades metablicas
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PRCTICA # 7
Mtodos de cuantificacin de microorganismos
Tcnica turbidimtr ica
Tcnica de cuenta directa en cmara de N eubaue r
Tcnica de di luci n y siembra en placa
PRCTICA # 8
Efecto del pH y la temp eratura e n el crecimiento microbiano
Efecto de la Temperatura
Efecto del pH
PRCTICA # 9
Efecto de la actividad de ag ua en el crecimiento microbiano
Efecto de la presin osm tica y act iv idad d e agua (aw) en hon gos y bacterias
Efecto de la desecacin
PRCTICA # 10
Curva de crecimiento bacteriano
Inoculacin e incubacin del cult ivo
Tratamiento de las muestras
BIBLIOGRAFA GENERAL
Anexo 1
PREPARACIN DE SOLUCIONES Y COLORANTES
105
Anexo 2
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
115
Anexo 3
ATLAS DE PRUEBAS BIOQUMICAS
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Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de la
UAM en el curso de M icrobiologa General, est elaborado de acuerdo a la infraestructu-
ra de los laboratorios y a la programacin trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/
semana.
Dra. Ma. de Los Angeles Aqulahuat
Dra. Ma. de Lourdes Prez Chabela
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RE COME NDACIONE S P ARA ELESTUDIA *
Reglas de laboratorio
1.
Durante las sesiones, siempre deber usar una bata
de
laboratorio bien a botonada , que deber quitarse
antes de abandonar el laboratorio.
2. No deber sacar del laboratorio ningn equipo , mediosocultivos microbianos.
3. Evitarlaacumulacin sobrelamesa de trabajo d e objetos no relacionados conlaprcticadeaboratorio.
Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor.
4. Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimentoobebida dentro del laboratorio.
5. Se prohibe fum ar, aplicarse cosmticos
o
tocarse la cara con las m anos
o
algn otro objeto. Se deber lavar
meticulosam ente las manos con jab n y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves
periodos.
6. Por seguridadnodebe i pipetear oralmen te ningn tipodecultivos m icrobianos, esta actividad deber
realizarse con pipetas accionadasdeforma mecnicaoautomtica, tratandodeevitarlaformacinde
aerosoles.
7. No se adm itirn visitas personales que distraigan la atenc inypongan en riesgo la seguridad e n el trabajo
que se realiza.
Procedimientos de laboratorio
1.
Antesydespus de cada sesin pictica los alumnos debern limpiar las mesas d e trabajo coneldesinfec-
tante que seleproporcionar para es te fin .
2. Cuando se utiliceelmec hero, este deber colocarse alejado del microscopioyotros equipos as comode
sus cuadernos
o
prendas de vestir.
3. Al concluir cada sesin el estudiante deber asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contami-
nados sean colocados en recipientes especficos para ello, colocados en lugares apropiados, q ue les indicar
el profesor.
4. Siempre deber dejar pe rfectame nte limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analticas,
autoclave, potencimetros, etc.)
y
reportar al maestro cualquier irregularidad en
el
funcionamiento.
5. En casodeproducirseunncendioouna herida personal,elalumn o deber notificarlodeinmediatoal
profesor. Enelcaso d e derrame de cultivosorotura de recipientes con cultivos activos, debe r conservarla
calmayadem s de informar al profesor, seguir inm ediatam ente el proced imiento:
a. Colocar toallas de papel sobreelmaterial derrama do para evitar su dispersin
b. Poner abundante solucin desinfectante sobre las toallas
manual de prcticas del LABORATORIO PE NIICROBlOLOGt**
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c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptculo destinado a la
eliminacin de materiales contaminados.
M ateria les indispensables en cada sesin de laboratorio
1.
Bata de laboratorio limpia y con botones
2. El protocolo de la prctica y bitcora de laboratorio
3. Un peda zo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar, marcador indeleble o etiquetas pequeas .
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Preparacin y esterilizacin de materiales
y medios de cultivo
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Objetivos introduccin
Qu e el alum no conozca los principios Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cam -
generales de las tcnicas de estril - bios de condiciones am bientale s y en la me dida en que se han podido
zacin de materiales de vidrio y me- adaptar a estos cambios, se han distribuido en u na gran diversidad de
dios de cultivo de uso comn en M i- hbitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo
fsi-
crobiologa. Observar el efecto de co y qumico . o
trol de la contaminacin microbiana Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfeccin y este-
en el laborato rio. rilizacin para limitar su presencia o eliminarlos . La esterilizacin es
un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo y que
asegura la ausencia absoluta de cualquier form a viviente, mientras
que la desinfeccin es un proceso que solamente elimina formas
vegetativas de los microorganismos.
La esterilizacin con calor seco y hmedo son los procedimientos de
mayor utilizacin en Microbiologa. El calor seco desnaturaliza las
enzimas y destruye a los microorganismos por oxidacin, por ejem -
plo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno
a 150-180C durante 2 horas. Estos mtodos se aplican principal-
mente en la esterilizacin de asas de inoculacin y todo tipo de
material d e vidrio y quirrgico.
Los procesos con calor hmedo se aplican para esterilizar medios de cul-
tivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el ms
recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a
presin para alcanzar temp eraturas de 121 C. El ma terial se d eja a
esta temperatura d urante 15 minutos para asegurarse de la destruc-
cin de endosporas, que son las estructuras bacterianas ms resis-
tentes al calor.
Cuando se requiere esterilizar diferentes m ateriales sensibles al calor como
las soluciones de vitaminas, aminocidos, etc. se esterilizan por
filtracin en mem branas estriles de 0,2 m ieras de dim etro y para
el caso de materiales plsticos es recomendable el uso de gases
como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies
generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos
qumicos en forma l quida como: los fenoles, compuestos
cuaternarios de am onio (alquildimetil be ncilamonio), form aldehdo,
alcoholes, halgenos y detergen tes.
Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas d e uso,
los sistemas de filtracin son muy eficientes y rpidos para la este-
rilizacin pero slo se aplican en peque os vo lme nes. Los fenoles
y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para la
desinfeccin de superficies pero son muy corrosivos. Los
detergentes y los alcoholes tien en actividad limitada contra espo-
ras bacterianas y algunos virus por lo que slo son desinfectantes.
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m a n u a l d e p r c t i c a s d e l - * . . ' . ; . , - . * . , : ; . . . ? . ::* , < ; > < * . , - r - r . r - - "*
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(O
a 1 potencimetro
1 horno de calor seco
Materiales
7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapn de baquelita
3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapn de baquelita
9 cajas de Petri de vidr io
3 pipetas de 1 o 2 mL
3 pipetas de 10 mL
1 pipeta Pasteur
3 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 parrilla de calentamiento con agitacin
1 autoclave
1 mechero Fisher
1 ncubadora a 35C
1 hisopo estril, algodn y gasa
papel m anila o estraza para envolver
Caldo nutritivo (Anexo 2.1)
Medio de agar nutritivo (Anexo 2.2)
Medio de agar papa dextrosa PDA (Anexo 2. 6)
Medio mnimo de sales (Anexo 2.3 )
Soluciones am ortiguadoras pH 4 y 7
Procedimiento
El profesor explicar los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiologa, enfatizando en la
desinfeccin de reas as como en la preparacin y esterilizacin de los med ios de cu ltivo y m ateriales necesarios
para el trabajo cotidiano con m icroorganismos. Tambin har las demostraciones necesarias para que e l estudian-
te aprenda a envolver los materiales, as como su manejo en condiciones aspticas.
Preparacin de l m aterial de vidrio y me dios de cultivo
1. Lavar perfectame nte las cajas de Petri y pipetas con escobilln y detergen te. Enjuagar con abundante agua
corriente.
2.
Escurrir el exceso de agua y enjuagar e l material con agua destilada con una piceta, por las paredes interio-
res.Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningn
otro medio.
3. Una vez seco el ma terial, se proceder a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los
tubos y matraces se elaborarn tapones de algodn y gasa, procurando que ajusten con h olgura, sobre los
que finalmente se les colocar un capuchn de papel.
4. Preparar 20 mL de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y ajustar e l pH a 6.5-7.0 en un
potencimetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solucin de HCI0.1M o solucin de NaOH
0.1M, en caso de q ue el pH sea ms alcalino o cido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo
con tapn de baquelita que debern cerrar sin llegar al tope.
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5. Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN ), calentarlamezcla en una parrilla con agitacin constante hasta
ebullicin, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte)yvaciar enseguida5mL de me dio en tres tubos
con tapn de rosca. Enjuagar inmediatamentelapipeta para evitar que se s olidifiqueelagar. El resto se
esteriliza enelautoclave.
6. Preparar 120 mL de m edio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer d e 250 mL, ajustar
el pH del medio
a
5.0-5.6. Colocar un magn eto d e agitacin
y
calentar hasta ebullicin durante 1 minuto;
cuidando de que no se proyecteoderram e. Posteriormente vaciar7mL de m edio e n tres tubos q uese
taparn con tapn de algodnygasa. El resto se es teriliza en el au toclave.
7. Preparar 120 mL de med io de cultivo Mnimo de sales (M M ) en un matraz Erlenmeyer de 250 m L
Esterilizacin de materiales
y
m edios de cultivo
1. Las cajas de Petriypipetas envueltas se colocaran en hornoa150 C durante2horas. D espus de sacarlas,
dejarlas enfriaryabrir los paquetes nicame nte en rea asptica.
2.
Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de acuerdo
a
las siguientes instrucciones:
a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario aadir agua
destilada.
b. C onectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materia-
les en la canasta del autoclaveycolocarla den tro.
c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y esperaraque salga el vapor
de a gua por el orificio d e purgado. Despus cerrar este orificio con la vlvula de seguridad.
d .D ejar qu e e l equ ipo se ca liente h asta alcanzar los 121 Co15 Ibs de presin revisando continua men tela
escala del manmetro. Una vez alcanzada esta temperatura deber bajarseelnivel de ca lentamiento mo-
viendo la perilla de control al nivel medioobajo.
e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos
f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presin al valor de "0" . Quitar la vlvula d e se guridad y con la ayuda
de guantes de asbesto
o
una jerga hmeda abrir cuidadosamente
la
puerta, de adelan te hacia atrs para
evitar que madu ras por la salida del vapor.
Preparacin de las cajas de Petri
y
tubos con m edios de cultivo
1.
Los tubos con medios de cultivo con agar, se debern colocar en una superficie inclinada de tal forma qu e el
medio se solidifiqueauna distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.
2.
Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfrenauna temperatura
aproximada de 4 0-50 C, que coincide con la posibilidad de sostener el m atraz en la palma d e la ma no sin
sentir un calor excesivo.
3. Cerca del mech ero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con M M . Los medios de cultivo se vacan en las
cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona asptica cerca del mechero o en campan a de flujo laminar.
4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos)
y
posteriormente envolver las cajas cuidado-
samente con papel estrazaoacomodarlas en forma invertida e n bolsa de plstico limpias.
5. Guardarlas en refrigeracin hasta 24 horas antes de utilizarlas.
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manual de prcticas del LABORATORIO PE ICIlCIBiOLCIGJI SEIAL
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Prueba de esterilidad de materiales
1.
Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una e stufa de incubacin
ajustada a 30 C durante 24-48 horas.
2.
Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contam inantes , por la aparicin d e turbidez ,
nata superficial y/o depsito de material en el fondo d e los tubos con medio lquido; as como la formacin
de colonias microbianas e n la superficie d e medios slidos.
3. Si no hay contaminacin de los medios, se abrir una de las cajas de Petri de cada m edio du rante 1 m inuto
en el laboratorio o zonas accesorias al m ismo y se etiquetar com o"al aire".
(0
CQ
0
4. La otra caja de cada med io de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetar "en
rea asptica".
5. La tercer caja se conservar sin abrir y se etiqu eta como "control".
Resultados
A. Hacer la descripcin morfolg ica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes m edios de cultivo
(AN, PDA y M M ) y con los distintos tratamientos en relacin a la caja control.
B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento
regular y (+++) crecimiento abundante.
C. Discuta los resultados y dete rmine si la esterilizacin en el autoclave y horno fue adec uada , as como el
manejo de los materiales.
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Cuadro
1
Descripcin morfolgica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo.
M E D I O
DE CULTIVO
AGAR
NUTRIT IVO
M N I M O
DE SALES
PAPA DEXTROSA
AGAR
Abierta a l aire
Abierta en rea
asptica Control
a
t
A
a
1)
Cuestionario
Cules son los mtodos
de
esterilizacin ms utilizados
en
Microbiologa? En qu e tipo
de
materiales
se
aplica cada uno?
2) Explique cules son las diferencias entre los procesos
de
esterilizacin, desinfeccin
y
asep sia. Cmo
se
relacionan estos procedimientos conlapasteurizacin?
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manual de prcticas del
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Preparacin, f i jacin y
coloracin simple de frot is
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Objetivos
Que
el
alumno aprend a las tcnicas
de preparacindefrotis,defijacin
y coloracin ms utilizadasen eles-
tud io microscpico
de
cultivos
bacterianos, obtenidosdemedios
slidosyquidos. Que identifique las
principales formas bacterianasy la
importancia de las tinciones simples
en
la
caracterizacin morfolgica
de
estos microorganismos.
Introduccin
Debidoal pequeo tamaode lamayo rade losm icroorganismos,se
requierede unmicroscopio ptico,yaseadecampo claroo decampo
oscuro para hacer
la
descripcin morfolg ica de stos. El microscopio
de
uso ms comn es
el
de campo claro, en
el
qu e
la
observacin de clulas
vivas es limitada d ebidoaque las clulas son incolorasypermitenelpaso
de una gran cantidaddeuz .
La observacin de frotis teidos es ms recom enda ble. El frotis se p repara
haciendo una extensin de los microorganismos sobre una supe rfi-
cie transparente,
en la
cul
se
fijan
y
tien
los
m icroorganismos.
De acuerdo al n mero de soluciones colorantesy alos objetivos de
estudio se puede n realizar diferentes tipos de tinciones como son:
simple, diferencial, negativayselectiva.
Los frotis de cultivos lquidos se deb ern fijar con alcohol para ev itar resi-
duos del me dio, que al quemarse darn interferencias en las obser-
vacionesylos de colonias de medios slidos se fijan gene ralmen te
con calor. Despus de
la
fijacin, los frotis son teidos con diferen-
tes colorantes sintticos derivados de anilina.
Los colorantes m s utilizados son sales formad as por ione s coloridos car-
gados conocidos como cromforos. Por ejemplo:
Cloruro
de
Azul
de
metileno Azuldemetileno*+
(Cromoforo)
ci-
Si
el
cromoforo es un ion positivo
el
colorante es de tipo bsico, pero si
a
carga es nega tiva ser de tipo cido . La mayora de las bacterias son
teidas por colorantes bsicos, que permean
la
pared celular
y se
adhieren por enlaces inicos dbilesamolculas con cargas neg a-
tivas de
la
clula bacte riana. La tincin
de
as bacterias con a zul
de
metileno,es unejemplodetincin simple que facilitalaobserva-
cin
de
forma, tamao
y
arreglo
de
las clulas.
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manual de prcticas del
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Materiales
1 Probetade 100 mL
1 Vasod eprecipitadosde 100 mL
1 mechero
1asa desiembra
5 Portaobjetos
Picetaco nagua destilada
Microscopio compuestodecampo claro
Azuld emetileno alcalino (Anexo1.2)
Alcohol etlicoal70% (Anexo1.7)
Fenolal 2%(Anexo1.9)
(0
C Q Aceited einmersin
o
Procedimiento
El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de:Escherichla col, S treptococ cussp.,
Staphylococcussp.,
Badllus
subtilis, Klebsi'ellasp.y
Pseudom onas fluorescens.
Elestudiante preparar frotisde
cada cepa obtenidadecultivo slidoyotrosdecultivo lquido,loscuales fijaryteircon azuld emetileno.
El profesor explicarlosprincipiosd emanejodelmicroscopioy la formad eajustar lailuminacin.
Preparacin de frotis
1 . Lavar perfectamente losportaobjetos, secarlosco npapelyetiquetarlos (Figura1).
2.
Prenderelmecheroyesterilizarel asa en laflamad elmechero hastaque sepongaa lrojo vivo.
3. Dejar enfriar
el asa
para evitar
que al
tomar
la
muestra
los
microorganismos sean destruidos. Despus
acercara lmecheroe ltubod ecultivo, quitarlee ltapnyflamear rpidamente labocadelmismo. Introducir
el
asa en el
tubo
de
cultivo
y
tomar cuidadosamente
la
muestra.
4. Para
el
caso
de
cultivos lquidos, colocar
la
muestra
en el
centro
del
portaobjetos, extenderla suavemente
en
un rea circularde 2 cm. dedimetro aproximadamenteyesterilizar nuevamenteelasa. Dejar secare lfrotis
al aireyrepetir losprocedimientos3 y 4 por 2-3vecesms.
5. Si elcultivoes de medio slido, previamente secolocaren elcentrodelportaobjetos unagotadeagua
destilada
en la que se
mezcla
u na
pequea muestra
del
cultivo
que se
toma siguiendo
las
indicaciones
del
paso3 .Extenderla suavementey dejar secara laire.
Fijacin del frotis
1 . Fijar los frotis
de
cultivos lquidos con dos gotas
de
metanol
o
etanol absoluto
y
dejar secar
al
aire (hacer esto
en zonas alejadasa lmechero).
2 2
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2. Los frotisdecultivos slidos, com pletam ente secos se fijarn con calor. Para estosepasaielfrotis rpida-
mente 2-3 vecesen elinteriorde laparte ama rillade laflama del m echero.
3. Palparlaparte inferior del portaobjetos coneldorso delamano izquierda para enfriarycomprobar queno
hubo sobrecalentamiento.
Tincin simple
1. Cubrirelfrotis con2gotasdeazuldemetileno durante 30 segundosa1 minuto.
2. Eliminarelexcesodecolorante con lavado suavealagua corrienteoconlaayudade lapiceta con agua
destilada.
3. Dejar sec aral aire
Marcarelrea por debajo del portaobjeto
CULTIVO SLIDO CULTIVO LIQUIDO
|
i
a
o
o
Coloque1 o 2gotasdeagua
Colocar
1 o 2
asadas
de
med io
de
cultivo con asa estril
Con asa estril tomar una
muestra
de la
co lonia
y
mezclarla conelagua
Distribuir enlazona marcada
Dejar secaralaire
Dejar secaralaire. R epetirlos
procedimientos anteriores dos veces
Pasar rpidamente sobrela
flama del mechero
Fijar con2gotasdealcohol,y
dejar secaralaire
Figura 1 . Preparacin
y
ijacin de frotis bacterianos a pa rtir de cultivos slidos y lquidos
manual de prcticas del
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Observacin al microscopio
1. Limpiar cuid ado sam ente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda .
2.
Ajustar el haz de luz en el centro del camp o de observacin, siguiend o las indicacion es del profesor.
3. Colocar los portaob jetos en la platina y em pezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posterior-
me nte pasar al de 40X. Para la observacin con el objetivo d e 100X, colocar previam ente una p equ ea gota
de aceite de inmersin sobre la preparacin.
4. Al finalizar las obse rvac iones , limpiar cuidad osam ente el objetivo con papel sed a para eliminar el ex ce so d e
aceite y evitar incrustaciones que daan esto s sistemas.
Resultados
A. Reportar las obs erv acion es de forma, agrupacin y tama o relativo de cada uno de los microorganismos e n
el cuadro de resultados.
B. Comparar su s observ acio nes con las reportadas en la literatura.
2 4
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Cuadro2
Observaciones microscpicas de frotis de cultivos bacterianos
Cultivo: Lquido
Aumento total:
Forma: (cocos, bacilos, etc.)
Agolpamiento de las clulas
(solos, pares, cadenas , etc.)
Tamao:
Cultivo: Slido
Aumento total:
Forma: (cocos, bacilos, etc.
Agrupamiento de las clulas
(solos, pares, cadenas, etc.)
Tamao:
Escherichla col l
Streptoco ccus sp.
0 )
(0
(0
a
Cuestionario
1. Investigue cules son las estruauras celularesomolculas responsables de la tinci n simple realizada. De
ejemplos de otros colorantes que podran utilizarse.
2.
Por qu se recomienda fijar los frotis de cultivos lquidos con alcoholyno con calor? Por qu se deben
poner varias veces muestras d el cultivo lquido
y
slo una muestra de cu ltivos slidos al preparar los frotis?
25
manual de prcticas del
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3. Cules son las principales precauciones de m anejo de l microscopio y por qu se deb e utilizar el aceite de
inmersin al hacer el estudio microscpico de bacterias?
4. Cules son las desven tajas o limitaciones de la tincin simple?
a
o
5. Cules son las fuen tes de error ms frecuen tes en la preparacin de frotis?
6. Bibliografa consultada
Referencias bibliogrficas
Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Practicas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3
a
- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
Practical Han dbo oko f Microbiology. William MO 'Leary , Cornell Medical College, Ne w York, New York, USA
CRC Press, 1989.
Holt, J. G., N.R. Krieg.P.H.A.Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
HOS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia Bibliome
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z
-
s
, - -
Tincin diferencial de Gram y
tinciones selectivas
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Objetivos
Queelestudiante clasifique algunas
especies bacterianas en Gram positi-
vas
o
Gram negativas d e acu erdo
a la
tincin de Gram. Que observe estruc-
turas bacterianas especiales, como las
endosporasycpsulas con tinciones
selectivas. Que comprendalaimpor-
tancia que tien en estas tinciones para
la caracterizacineidentificacinde
las bacterias.
introduccin
La tincin propuesta porelmd ico dan s C hristian Gramen1884, es una
de las tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifi-
caloscultivos bacterianosdemenosde 24horasenGram positivasy
Gram negativas. El mtodo se fundam enta en
el
hecho de que
el
coloran-
te primario (cristal violeta) tie
por
igual
a
todas
las
bacterias, pero
la
combinacin conelcolorante es ms pe rman ente en los gram positivos.
Para es tablecerladiferenciacinenestos dos grupos, se ap lica un disol-
vente del colorante primario que no tiene efecto sobre
el
grupo
de
microorganismos queloretienen firmem ente, peroloeliminade
aquellos quenoson capacesderetenerlo, quedandopor lotanto
comp letamente decolorados. En estas circunstancias, sera muy di-
fcil su observacin por lo que es preciso tratarlos con o tro colorante
llamado secundario, como
la
safranina . Este colorante
no
mod ifica
el color de los microorganismos que haban retenido el color prima-
rio,
pero tie
a
los microorganismos decolorados.
Estas diferencias d e tincin de las bacterias se explican por cambios enla
composicin qumica y estructura de las paredes ce lulares, que faci-
litan
la
retencin
o
eliminacin de l colorante primario despus del
proceso de decoloracin.
Otras tinciones que p ermiten obtener mayor informacin sonlanegativa
ylaselectiva.La tincin negativa facilitalasobservacionesde la
morfologa
y
tamao
de
las bacterias sin alterac in por e fecto
del
calor as com odeestructuras especiales, com olacpsula de algu-
nas especies bacterianas. La cpsula tambin llamada glicoclix
es
una estructura externa
a la
clula, formada
de
polisacridos
o
polipptidos, que confiere proteccinalas bacterias contraladese-
cacin
y la
fagocitosis.
La extensin sobre un portaobjetos en form a de c apa fina de una mezcla
de las bacterias con tinta china
o
nigrosina, pe rmite observar en
el
microscopio estructuras especiales com o son las cpsulas, que apa -
recen como una zona clara que rodea
la
clula bacteriana
en un
fondo obscuro.
Las tinciones selectivas perm iten observar estructuras especializadas como
las endosporasdeBacillusyClostridium ,bacteriasen lasquesu
presencia, forma
y
localizacin son importantes criterios
de
clasifi-
cacin taxonm ica.
Adems, debido
a la
resistencia a l calor de las endosporas
y a
que algunas
especies son microorganismos patgenosdegran toxicidad,su de-
teccin en m icrobiologa alimen taria y mdica adqu iere gran inters.
manual de prcticas del
r iom:
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Materiales
1 Probetade 100 mL
1 Vaso
d e
precipitados
de 100 mL
1 Parrillad ecalentamiento
1 Mechero
5 Portaobjetos
1 Piceta
con
agua destilada
Cristal violeta (Anexo1.3)
Safranina (Anexo
1.8)
Lugol (Anexo1.5)
Solucindealcohol-acetona (Anexo1.6)
e n
Verde
de
malaquita (Anexo
1.4)
Tinta china
Fenol 2%(Anexo1.9)
Aceitedeinmersin
Microscopio compuestodecampo claro
Procedimiento
El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de: Escherichia
coll,
Streptococcussp.,
Staphylococcus
sp.,
Badllus subtills
y
Klebsiella
sp.
El estudiante preparar frotisd ecultivo slidoy d ecultivo lquidod ecada microorganismoyaplicar latincin
de Gram.
Tambin realizar la tincin seieaiva deendosporasen unfrotis fijado alcalor de
Badllus subtilis
y latincin
negativaencultivosd e
K /ebsfef/a sp.
Tincin diferencial de Gram
a) Cubrir
el
frotis
con 2
gotas
de
cristal violeta durante
30
segundos
a 1
minuto
b) Lavar cuidadosamente elfrotiscon aguad e lallaveo destilada para eliminar elexcesod ecolorante
c) Sacudirunpocoy sindejar secar cubrirelfrotiscon 2gotasd elugolpor 30segundos.
d) Lavar cuidadosamente elfrotiscon agua.
e) Inclinar elportaobjetosyaplicar gotaagotael decolorante dejando queescurra hastaque nofluyams
tintura.
f) Inmediatamente lavarconagua.
g) Aplicar
2
gotas
d e
safranina durante
30
segundos.
h) Lavar nuevamente conagua, eliminar cuidadosamente elexcesodeaguacon unatoalladepapelydejar
secar
a l
aire.
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Tincin selectiva de endosporas
a) Colocar un pequ eo trozodepape l filtro sobreelfrotisde
Bacillus
subtilk(Figura2).
b) Agregar verdedemalaquita sobreelpapel filtro de tal man era q ue cubra todalapreparacin.
c) Colocarelportaobjetos sobre un vasodeprecipitados con ag ua en ebullicin.
d) Dejar durante
5
minutos evitando q ue se seque e l colorante (agregar un poco ms s es necesario)
y
eliminar
el colorante con agu a destilada.
e) Cubrir con safranina durante 30 segundos.
f) Lavar nue vam enteydejar secaralaire.
t
a
"
a)
b)
e)
Figura 2 .
Tincin selectiva de endosporas bacterianas
Tincin negativa para obs ervacin
de
cpsulas
a) Colocar una peq ue a gotadetinta chinaen elextremode unportaobjetos; colocar junto una gotadel
cultivo lquidode
K lebsiella
sp. (Figura 3).Sise tratadeun cultivo slido, hacer una suspensin del m icro-
organismoenuna gota de a gua destiladaymezclar cuidadosame nte con la tinta china.
b) Distribuir
la
mezcla
a lo
ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular
en
ngulo
de
45 sobrelamuestra.
manual de prcticas del
I
3
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10
a
o
c) Desplazar poco
a
poco el segundo portaobjetos a lo largo del pr imero para hacer una capa f ina de la mezcla.
d) Dejar secar al aire .
a)
d)
Figura 3.Tcnica de tinc in negativa
Observaciones al microscopio
1.
Limpiar cuidad osam ente los objet ivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Colocar los portaob jetos en la platina y em peza r a localizar la prepa racin con el ob jetivo de 10X, posterior-
mente pasar al de 40X. Para observar con el objet ivo de 100X colocar previamente una pequea gota de
aceite de inmersin sobre la preparacin.
3. Al f inal izar las observaciones, l impiar cuidado same nte el objet ivo con pape l seda para el imina r el exceso
de ace ite y evitar incrustaciones qu e da an a estos sistemas.
Resultados
A. Reportar las observaciones de form a, agrup acin, color y tama o relat ivo tal com o se indica en el Cuadro 3
de resultados. Hacer los dibujos de la mo rfologa d e cada uno de los microorganismos y colorearlos.
B. Comp arar las obse rvacione s realizadas con las reportadas en la l iteratura .
3 2
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Cuadro3
Descripcin microscpica
de
cultivos baaerianos
Descripcin del cultivo:(lquido
o slido, edad del cultivo, etc.)
Aumento total:
o
I
o
cu
t
ti
a
o
Forma:cocos, bacilos
Agolpamiento de las clulas
Tamao:
Reaccin de Gram
TINCIN DE ENDOSPORAS
Descripcin del cultivo:(lquido
o slido, edad del cultivo, etc.)
Aumento total:
Badllus subtills
Streptoco ccus sp
Forma:cocos, bacilos
Agrupamiento de las clulas
Tamao:
TIN CI N DE CPSULA
Descripcin del cultivo:
(lquido
o slido, edad del cultivo, etc.)
Aumento total:
Klebsiellasp.
Streptoco ccus sp
Cuestionario
1. Expliqueenforma completalateora que explicalatincindeGram. Investigue otros dos ejem plosde
tincin diferencial.
3 3
manual de prcticas del
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2. Cules son las fuen tes de error ms comu nes en la tincin de Gram?
3. Explique que reaccin de Gram darn los cultivos de levaduras? Estos resultados tendrn la mism a impor
tancia que para las bacterias? Por qu?
4. Explique el fun dam en to de la tincin de endosporas. Por qu se debe calentar la preparacin? Que dificul
tades se tendran si no se adiciona la safranina al final de la tincin?
5. Explique el fundam ento de la tincin negativa realizada en la prctica.Qu tipo de informacin se obtiene?
Investigue otra tcnica de tincin selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas.
6. Bibliografa consultada
Referencias bibliogrficas
Johnson T.R. and C L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3
a
- Ed. Cummings Publishin
Company, Inc. EEUUA.
Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin. McGraw Hill Interamericana
Mxico.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francs
Pouch Downes and Keith Ito, 2001.
Practical Hahdt^ic of Microbiology. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York
USA. CRC Press, 1989.
j
Holt, J. G., N.R. Krieg.P.H.A.Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinativ
Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
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^
w'V
^
Mtodos de cultivo y
aislamiento de bacterias
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Objetivos Introduccin
Queelalumn o conozca las diferen- Las bacterias deben ser cultivadas en me diosdecultivodelaboratorio
tes tcnicasdeaislamientoenme - para caracterizar su crecim iento, hacer su identificacinydeterminar sus
dios de cultivo slido paralaobten- actividades metablicas. Un med io de cultivo es una solucin acuosa de
cin
de
cultivos puros
de
bacterias, diferentes compuestos que contiene todos los eleme ntos indispensables
Que el estudiante prepare medios de que requieren los microorganismos para crecer,
cultivo de uso general, diferenciales
y selectivos paraelcultivodedife - Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios lquidos
rentes espec ies bacte rianas. (caldos)o solidificados con agar para su propagacin y/o conserva-
cin,as como para estudiar sus caractersticas de crecimiento. Es m-
portante recordar quelainoculacin de los microorganismos en los
medios de cultivo, siempre debe lan realizarse en zo na asptica (cerca
del mechero o en campana d e flujo laminar), condiciones que limitan
la presencia de microorganismos indeseablesocontaminantes.
Las tcnicas de aislamiento, perm iten la obtencin de microorganismosa
partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las
que hay una gran diversidad microbiana, as como para comprobar
la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros estn forma-
dos por un solo tipo de microorganismo;yson indispensables para
conocer las caractersticas morfolgicas, propiedadesde tincin,
actividad bioqumica, patogeniddad, sensibilidadaantibiticose
identificacin de las especies microbianas.
El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por mtodosde
dilucin, en medios slidos por estra en placaoen medios lqui-
dos.
En el primer caso se considera que cada clula bacteriana que
se separa dai origenauna poblacin q ue formar una colonia ca-
racterstica, visible
a
simple vista.
La limitacin principal de estas tcnicas de dilucin , es que no es prctica
para el aislamientoapartir de mezclas dond e e l microorganismo de
inters se encuentra en pequeas cantidades, donde solamente se
obtendrn las bacterias dom inantes.
Para favorecer e l aislamiento de cultivos de baja den sidad, se aplican m -
todos de cultivo especiales, en los que se u tilizan medios que con-
tiene n nutrientes especiales, antibiticos, altas concentraciones de
sales y/o condiciones de pH, luzo temperatura para favorecerel
crecimiento del m icroorganismo de inters
y
se conocen como se-
lectivos
o
de enriquecimiento.
En ocasiones se p uede n agregar
a
los me dios d e cultivo otros com ponen-
tes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. para distinguir espe-
cies bacterianas diferentes porlaformaenque metabolizanlos
sustratos que se m anifiesta por cambios en la aparienciaomod ifi-
cacin del pH del m edio de cultivo. Estos medios se conocen como
medios d iferenciales y son de gran utilidad para la caracterizacine
identificacin d e especies b acterianas.
o
i
i
8 .
o
manual de prcticas del LABORATORIO MICROBIOLOGA GENERAL
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Materiales
3 cajas de Petri con Agar nutritivo (Anexo 2.2)
2 cajas de Petri con Agar de eosina a zul de me tileno EMB
(Anexo 2.3)
2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 110 (Anexo
2.5)
2 cajas de Petri con Medio Mnimo de sales (Anexo 2.3)
1 tubo con agua destilada estril
2 tubos con Caldo Nutritivo (Ver Anexo 2.1)
4 tubos con Agar Nutritivo (Ver Anexo 2.2)
1 Mechero
t
1
A s a
d e
i n o c u l a c i n
0
1 P a r r i l la d e a g i t a c i n
1 A u t o c l a v e
Procedimiento
El profesor proporcionar cultivos puros d eBacillussubtilis,Escherichia
col,
S taphyloco ccusaureus,
Pseudom o
fluorescens, K lebslella
sp. yStreptococcussp.
Tambin les proporcionar una muestra problema por equipo (con dos microorganismos diferentes) en la que
practicarn la tcnica de aislamiento por estra cruzada.
Tcnica de estra cruzada
a) En la parte pos terior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadran tes. Tomar una m uestra con el asa
previamente flameada y fra, inocular la muestra haciendo 4-5 estras simples muy juntas de lado a lado
sobre el primer c uadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4).
b) Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nue vam ente la caja y
enfriar el asa de siemb ra tocando la superficie del m edio lejos de la zona de estras recin hechas.
c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estras y hacer un segundo grupo de estras
en el segundo cuadrante como en el caso anterior.
d) Repetir el procedim iento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el ltimo cu adrante, no se
deber flame ar el asa de siembra y se har una estra ms abierta (simple).
Siembra e n tubos con caldo y agar nutritivo
1 .
Sembrar un cultivo puro diferente e n cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y en tubos con agar
nutritivo inclinado.
2 . Sembrar con el asa extend ida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado en
forma recta (Figura 5).
.
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Figura 4 .Aislamiento de bacterias por estra cruzada en placa
a)
b)
Figura5. Siembra de m edios con agar por estra simple (a) en tubos inclinadosypor picadura
(b) en tubos so lidificados en form a recta.
Siemb ra de cajas de Petri con medios diferen ciales
y
selectivos
1. Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110yuna de MM . Sembrar en cada parte
un cultivo puro diferente por estra simple.
2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estra cruzada la muestra
problema.
manual de prcticas del
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Con diciones d e incubacin
1. Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24 horas. De las cajas inoculad as por estra cruzada,
seleccion ar la colonia m s aislada gene ralm ente d el cuarto cuadrante). Transferir una peq ue a muestra de
esta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo.
2.
Incubar los tub os a 35C durante 24-48 horas. Observar la aparicin de colo nias y reportar la forma en qu e
se distribuyen a lo largo del tubo.
Resultados
A. Recopilar la informacin d e la caracterizacin colonial de cada cep a en los cuadros 4 y 5.
ce
0
B. De acuerdo a sus observaciones identifique las esp ecie s presentes en la muestra problema.
4 0
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Cuadro
4
Morfologa colonialdecult ivos bacterianos
Aislamiento por Estra
cruzada
Forma:
Color:
Tamao (mm):
Borde-.
Superficie:
Aspecto:
Elevacin:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Siembra en m edios
selectivosydiferenciales:
Microorganismo 1:
Forma:
Color:
Tamao (mm):
Elevacin:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Esc herichla co l i
MEDKDEMB
Streptoco ccus sp
MED
(j
0 1 1 0
MUESTRA PROBLEMA
MEDIOfMNIMO
o
(0
a
o
Nota:La descripcin colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios
Forma:
circular, irregular, filamentosaorizoide
Borde:entero , lobulado, aserrado
Superficie: lisaorugosa
Aspecto de la colonia: hmeda, seca, butirosa
Elevacin:
convexa, plana, hun dida
Luz transmitida: translcida, opaca
Luz reflejada: brillante, mate
Consistencia: dura, blanda, mucoide
4
manual de prcticas del
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Cuadro 5
Descripcin morfolgica de cultivos puros en tubos de cultivo
Tubos inclinados d e
Agar Nutritivo
w
\y
w
w
Crecimiento:arborescente,
filiforme , rizoide, disperso,
puntiforme
Color:
ultivo en tub o de
Caldo Nutritivo
Crecimiento:su perficie
como pelcula, como
sedi-
mento, turbidez en todo
el tubo
Color:
Tubos rectos de
Agar Nutritivo
r~\
Crecimiento:en forma de
pelcula supe rficial, a lo
largo d e la picadura,
solo en el fondo
Color:
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Cuestionario
1. Que es el agaryde don de se o btiene? Cules son los nutrimen tos q ue proporcionaalos m icroorganismos?
2.
Cul es la comp osicin qumica de los med ios EMB, 110yMM? Cules son los co mpon entesopropiedades
responsables de su funcin com o medios selectivos
o
diferencales?
O
|
o
3. Porque el agar nutritivo es un medio d e uso gen eral para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustan-
cias que seleagreg aran para hacerlo selectivo para bac terias Gram negativas?
4. Cul es
la
nformacin que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos en tubos con agar inclinado
y en tubos con agar solidificado e n form a recta?
5. Bibliografa consu ltada
manual de prcticas del LABORATORIO PE MlCRClBiCiLClGJA GEliERAL
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Referencias bibliogrficas
Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by Francs
Pouch Downes and Keith Ito, 200.
Practical Handbook of Microbilogo CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College, New
York, New York, USA.
Bergey's Ma nua l of Determinative Barteriology. 9th ed ition, The Williams an d Wiikins Co., Baltimore, USA
Standard Meth ods for the Examination of W ater and Wastewater. American Public H ealth Associated (APHA)
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of W ater and Wastewater
Ed. (1991).
HOS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia Bibliome
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Mtodos de cul t ivo y
descr ipcin morfolgica de hongos
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5
(0
a
o
"O
Objetivos introduccin
Que el alumno aprend a las tcnicas Los hongos son organismos eucariticos y de mayor tam ao q ue las bac-
de cultivo y manipulacin de diferen- terias, se distinguen de otros eucariotes como los anima les por ser inm-
tes tipos de hongos. Qu e el estudian- viles y de las algas y plantas por carecer de p igmentos fotosintticos.
te conozca las principales caracters-
ticas m orfolgicas (macroscpica y Son de nutricin hetertrofa, es decir dep end en de nutrientes orgnicos
microscpicas) de los hongo s. que son solubilizados por sistemas enzim ticos espec ficos y son
absorbidos a travs de su pared celular y membrana plasmtica.
Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multice-
lulares (fi lamentosos), sin embargo, tambin existen hongos
dimrficos principalmente patgenos que se presentan en las dos
formas alternativamente, depen diendo de condiciones ambienta-
les como la temperatura.
Las levaduras son clulas de forma esfrica u oval, am pliam ente distribui-
das en la naturaleza; frecuentem ente se encuentran formando una
cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reprodu -
cen asexualmente por gemacin, un proceso por el cul brota una
protuberancia o yema de la clula madre que posteriormente se
separa como clula individual.
El cuerpo o estructura vege tativa caracterstica d e los hongos filamentoso s
(mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas
ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos
presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los
Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conoce
como hifas cenocticas.
El principal mecanismo de reproduccin de los hongos es asexual, por
fragmentacin de hifas vegetativas o por la produccin de abun-
dantes esporas en conidiforos y esporangiforos forma dos e n hifas
areas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripcin
de las estructuras de reproduccin sexual es el principal criterio de
clasificacin, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones
o phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota.
Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las
cules se han descrito ms de 250 000 y d e stas solo se conocen
150 especies patgenas para el hombre y otras tantas para plantas y
animales. Es de gran importancia conocerlos, por los beneficios
que proporcionan al hom bre, ya que como se me ncion la mayora
son saprobios (utilizan m ateria orgnica mu erta), por lo que t iene n
una gran capacidad de reciclar materiales orgnicos de diferentes
tipos,
de tal forma que se pueden uti l izar como agentes de
biodegradacin de compuestos recalcitrantes en procesos de
biorremediacin.
4
m a n u a l d e p r c t i c a s d e l
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Desde la antiged ad, estos microorganismos se ha n utilizado e n procesos de produccin de diferentes alimentos
como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. Tambin se ha reportado que en la naturaleza hay diversas
especies que funcionan como importantes agentes d e control biolgico de insectos (bioinsecticidas) y que
pued en mejorar la nutricin y perm anencia de la mayora de las plantas (micorrizas).
Materiales
4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA (Anexo 2.6 )
4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox (Anexo
2.8)
3 Tubos de cu ltivo inclinados con 7 mL de PDA
2 m atraces Erlenmeyer de 250 mL
m
1 Probeta de 100 mL
0
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 M echero Fisher
5 Portaobjetos y cubreobjetos
1 Agu ja de diseccin
1 Asa de siembra
Cinta adhesiva transparente
Microscopio ptico de campo claro
Aceite de inmersin
Autoclave
Incubadora a 30 C
Azul de lactofenol (Anexo 1.1 )
Procedimiento
El profesor proporcionar a los alumno s tubos d e cultivo conAspergillusniger,PenicHHum
chrysogenum , Rhizo
oliQosp orus, Trlcho derma virideyde la levaduraSacc harom ycescerevis lae.
El estudiante inocular cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, a
base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un med io c omp lejo.
Har la descripcin macroscpica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observacin microscpica la
realizar aplicando la tcnica de cinta Scotch con azul de lactofenol.
Siembra de hongos
1.
Para sembrar los hongos filamentosos, se deber separar una parte de m icelio de los tubos de cultivo con
aguja de diseccin, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada.
2.
Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma man era inocular la caja con medio
de Czapek-Dox.
3. Las levaduras se inocularn por estra cruzada sobre la superficie de las cajas, en form a similar a la inocula
cin de bacterias.
4. Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plstico en forma invertida dentro de una incubadora
28-30 C duran te 3-5 d as.
48
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Descripcin macroscpica de levad uras y mohos
1 . Hacer la descripcin de la form a, tam ao , aspecto, textura y color de las colonias deSaccharomycescerevisiae.
2 . En los cultivos de mohos describir la form a, tam ao y el tipo de colonia, as com o las caractersticas del
micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, areo o pegado al medio) el color del micelio, el color de
esporas, cambios en el m edio de cultivo, etc.
Descripcin microscpica de levaduras
t
1 . De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teirlo con azul de me tileno.
2 .
Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X.
Descripcin microscpica de mohos en montaje con cinta adhesiva
1 .
Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomnd ola nicame nte por los extremos.
2 . Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la
colonia.
3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el
centro de un portaobjetos. La cinta funcionar como cubreobjetos por lo que se deber aplanar lo mejor
posible, evitando la formacin de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.
4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y
40X.
5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidiforos, conidias, esporangiforos,
esporangios y rizoides. Determ ine si las hifas presentan septos o n o.
Resultados
A. Reportar sus observaciones en el Cuadro 6. Hacer los dibujos de las observaciones morfolg icas de cada
uno de los microorganismos y colorearlos.
B. Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la Figura 6.
C. Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la prctica.
i
o
4
m a n u a l d e p r c t i c a s d e l
: -. ,-* : v
:
. ' > : ; -*Z
M ^ ; ; * * ? ; ; < ; * : y
^ v . ; , ? - - , v . : : ' - BIL0CI GENERAL
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Referencias bibliogrficas
M cFad din, J.F., J Ma c Faddin. 200 0. Biochemical Tests for Identification of M edica l Bacteria, 3rd ed.,
Lippicont, Williams & Wilkins.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francs
Pouch Downes and Keith Ito, 2001
Practical Handbook of Microbiology. William O'Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press,
1989.
Bergey's Manual of Determinative Bacterilogo 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA
Standard Me thod s for the Examination o f Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA)
Ame rican W ater Eorks Association (AWW A). Standard Methods for the Examination o f Water and Wastew ater.
Ed.
(1991).
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Mtodos de cuantificacin
de microorganismos
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a
o
introduccin
objetivos
Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero o peso (biomasa)
Que el alumno conozca algunas de de clulas microbianas en un cultivo; los mtodos pueden ser directos e
las tcnicas de cuan tificacin direc- indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determ inacin de
ta e indirecta de microorganismos peso seco y el recuento de clulas en cmara de Neubauer.
ms utilizadas. Que compare las ven-
tajas y desventajas de cada una en La determinac in de peso seco es un mtodo de cuantificacin muy
utili-
funcin de la informacin que se ob- zado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y leva-
tiene,
del tiempo invertido y de los duras. Como los cultivos se some ten a varios procesos (filtracin ,
recursos necesarios. lavado, secado) se pueden causar prdidas importan tes de biomasa
y errores en la cuantificacin.
El mtodo de cuenta d ireaa en cmara tiene la ventaja de ser muy rpido y
econmico, aun que no se pueden d istinguir las clulas viables y no
viables. Se puede calcular el nmero de microorganismos en una mues-
tra a partir del volumen de la cmara y de las diluciones de la muestra
que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la
observacin y cuantificacin se dificultan en clulas muy pequeas (1 -
5/m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeo volumen
de muestra que se utiliza (0.1-0.2 mm
3
).
Entre los mtodo indirectos, uno de los ms utilizados es la medicin de
laturbide z de los cultivos en un e spectrofotmetro, que es relativa-
mente rpida y que se basa en la capacidad de las clulas
microbianas de dispersar la luz que incide sobre stas. Como el
tamao de las clulas en una poblacin es casi constante, el grado
de dispersin es proporcional a la concentracin de clulas pre-
sentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada por clulas
viables o no viables.
La forma de cuan tificar clulas viables ms utilizada en M icrobiolog a, es
la de hacer diluciones y cuenta en placa con m edios de cultivo es-
pecficos para la poblacin de inters. Esta tcnica se basa en la
suposicin de que cada bacteria incluida e n un med io de agar o en
su superficie se m ultiplicar y producir una colon ia visible, en con-
secuencia el nmero de colonias que se observarn a simple vista
ser igual al nmero de bacterias viables o unidades formadoras de
colonias (UFO inoculadas en el agar multiplicadas por la dilucin.
Esta tcnica aplicada en muestras complejas, dar una estimac in aproxi-
mada del nmero total de microorganismos, depen diendo del me-
dio de cultivo utilizado, ya que no hay un med io y condiciones de
incubacin que favorezcan el crecimiento de todos los
microorganismos. Tambin pueden presentarse problemas relacio-
nados con falta de homoge neidad de las diluciones y en la inocula-
cin de las muestras, por lo que se pueden obtene r bajos valores si
es que las clulas no se separan b ien y valores elevados si la toma
de las muestras se hacen del fon do del tubo donde se han concen-
trado por gravedad los microorganismos.
6
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Materiales
6 cajas de Petri con agar nutritivo (Anexo 2.2 )
10 Pipetas de 1-2 ml_ estriles
10 Tubos con 9 mL de ssi (solucin salina isotnica= 0 .89%
NaCI)
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de ssi
Vasos de precipitados
1 Parrilla de agitacin
1 espectrofotmetro
w
1 cmara de Neubauer
g I pipeta Pasteur
Fenol al 2% (Anexo 1.9)
1 Varilla de vidrio doblada en L
1 M icroscopio compuesto
Safranina (Anexo 1.8)
Procedimiento
El profesor proporcionar un cultivo deSaccharomycescerevisiaey Escherichla colL
El alumno medir la turbidez de los cultivos en un espectrofotmetro (Spectronic 20); cuantificarn el nmero de
clulas totales, por cuenta dir ea a en cmara de Neu bauer y determinar el nme ro de un idades formadoras
de colonias (UFO por dilucin y siembra en placa.
Tcnica turbidimtrica
1. Encender el aparato y dejar que el instrumento se caliente por 15 minutos.
2. Ajustar el aparato a la longitud de onda (520 nm)
3. Calibrar el instrum ento a 0% de transm itancia con el botn izquie rdo. Para leer en la escala, observar la
aguja a nivel de los ojos y tomar e l dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el esp ejo.
4. Colocar una celda con med io de cultivo estril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrum ento a 100% de
transmitancia.
5. Para medir la turbidez d e una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfec tamen te con papel suave y
medir el valor d e %T.
6. Calcule la absorbancia de la frmula A= -log (%T/100)
7. En caso de disponer de un aparato digital ajustar la mediciones a absorbancia (D.O.).
6 6
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I
Tcnica de cuenta directa en
cmara de Neubauer
1 . Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentra-
das (D.O > 1.5) ser necesario preparar diluciones de la misma con solucin salina isotnica. Agregar 0.5 mL
de solucin de fenol al 2% y dos gotas de safranina. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 m inutos.
2 . Lavar cuidadosamente la cmara de Neuba uer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar
con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales,
donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista.
3. Homoge neizar perfectamente la muestra en un vrtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta
Pasteur de punta fina y depositar una g ota entre la cmara y el cubreobjetos por el borde de la cmara. Dejar
que la mue stra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso q ue dificultar la evaluacin precisa de la
poblacin microbiana.
4. Dejar reposar duran te 5 minutos, colocar la cmara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo
seco dbil (10X) la zon a cuadriculada que se muestra e n la Figura 7.
5. Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5X5
cuadros pequ eos (C2) limitados por triple lnea qu e m iden 0.2m m por lado. Estos cuadros pequ eos a su
vez se encuentran divididos en 16 cuadros mas pequeos (C3) de 0.05 mm de lado.
6. Hacer la cuantificacin de clulas con el objetivo seco fuerte (40X), contando el nmero de clulas que se
localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamao C2 sirven de gua para el cmputo. Se empieza a
contar desde la parte sup erior de los cuadros C2 y se contina hasta la base. Si las clulas tocan los lmites de
los cuadros C2; debern contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del
cuadro. Si las clulas tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este mtodo reduce las
posibilidades de contar la misma clula dos veces.
7. Cuente hasta cerca de 200 a 250 clulas antes de determinar el nmero de clulas por m L En el proceso de
contar se pue den presentar tres situaciones diferentes que a continuacin se explican:
a. Si hay de 200 a 250 clulas por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 10
4
para reportar el
nmero de clulas por mL.
b- Con m enos de 200 clulas por cuadro grande (C1 ), ser necesario contar algunos de los cuadros de las
esquinas (mide n 1x1 mm de lado y divididos en 4X4). De esta m anera se cuantificarn ms d e 20 0 clulas.
Despus dividir el nm ero total de clulas entre el nm ero de cuadros emp leados y sacar el valor promedio
por cuadro grande. Despus multiplicar este valor por X 10
4
para reportar el nmero de clulas por mL.
c. En el caso de q ue se observen ms de 200 clulas por cuadro grande (C1), se debern contar las clulas de
los cuadros de m enor tam ao (C2) hasta contar cerca de 200 clulas. Dividir este valor entre el nm ero de
cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio
por 25 para obtener el nm ero de clulas aproximado en un cuadro grande (C1) y despus m ultiplicar X10
4
para reportar el n me ro d e clulas por mL.
m a n u a l d e p r c t i c a s d e l ' ' - -.*;.:* " < < rr >
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6. Si ainocu lacinfue por duplicadootriplicado ,secalculaelnmero promediodecolonias por diluciny
este nmero se multiplicar porelinverso deladilucin XI0 (por ajuste de volumen inoculado) para obte-
nerlanmero totaldeunidades formadoras de colonias (UFC)/mL enlamuestra original.
1mL
Cultivo bacteriano
1
mL
1mL 1 mL 1 mL 1 mL
1
3
io
4
io
5
io
6
io
7
O . l m L
X O . l m L
Figura 8 .Tcnica de dilucinycuenta en placa
Resultados
A. Reportar los resultados de cuan tificacin
de
os cultivos, aplicando las tcnicas descritas. Indicar los clcu-
los hechos para cada metodologa.
B. Recopilar sus resultados enelCuadro8ncluyendo los de los otros equipos , indicandolamuestra analizada
por cada equipo. Discutirencada caso cules fueron las ventajasydesventajasde asm etodologasde
cuantificacin.
manual de prcticas del
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Cuadro 8
Cuantificacin de microorganismos por tcnicas directas e indirectas
(0
a
o
MICROORGANISMO
Escherichia
col
Saccharomyces
cerevisiae
Turbidez (D.O.) Cuenta en cmara de Neubauer
(# clulas totales/mL)
Cuenta viable en placa
(# UFC/mL)
Cuestionario
1. Compare el mtodo de dilucin en placa con el mtodo de cuenta dire aa en cmara de Neubauer para la
cuan tificacin de microorganism os. En que casos conviene usar cada uno?
2.
Explique cules son las ventajas y desventajas del mtodo turbidimtrico de cuantificacin de clulas.
70
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3. Mencione dos aplicaciones concretasen lasqueseutilicen cada unade lascnicasdecuantificacin
realizadas.
1
(0
ti
a
o
4. Algunos autores sugierenlamedicin de actividad biolgicayla determ inacin de cons tituyentes celulares
para
la
cuantificacin
de
poblaciones microbianas. Comente sus ventajas
y
desventajas.
5. Bibliografa consultada
7
manual de prcticas del
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c
Referencias bibliogrficas
Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3
a
- Ed. Cummings Publ ishing
Company, Inc. USA.
Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biologa de los Microorganismos. Octava Edicin.
Prentice Hall. Espaa.
Prescott L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin. McGraw Hill Interamericana.
Mxico.
7 2
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I " O
ai*
Efeao del pH y la temperatura en
el crecimiento microbiano
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Objetivos
Queelestudiante conozcaelefecto
del pHya temperatura como parme-
tros de control del crecimiento micro-
biano. Queelalumno comprendaa
importancia
de
estos factores fsico-
qumicosen laseleccindepobla-
ciones microbianas en los diferentes
ambientesenqueseencuentrany
los mecanismosdeadaptacinani-
vel celulary metablicosque han
desarrollado.
introduccin
Los microorganismos estn continuam ente afectados por su amb iente, ya
que ste ejerce una influencia profundaen sudesarrolloaligualque
sobre las dems formas de v ida. Los factores del m edio se pueden clasi-
ficar en tres grupos:
a).- Fsicos.- tempe ratura, presiones externas, hum edad.
b).- Qumicos.- pH, dispon ibilidad de nutrimentos, presencia de produc-
tos txicos.
c).- Biolgicos.-lasinteracciones microbianas entre lasespecies
coexistentes.
Algunos microorganismos estn especialmente adaptadosa loshabitat
extremos, donde otrosnopueden sobreviviryque incluso tienen
propiedades fisiolgicas que restringensucrecimientoatalessi-
tios.
En otros habitat menos rigurosos, las fuentes de nu trimentos
y
las interacciones entre poblaciones adquieren mayor importancia
enlaseleccindeas poblaciones que se encontrarn.
Los factores ambientales que se controlan en condiciones de laboratorio
con mayor frecuencia, ademsde losnutrimentales son los
fisicoqumicos como:laemperaturaypH .
Todos los organismos tienen una temperatura ptima de crecimiento que
los caracteriza; enlacual muestran las tasas ms elevadas de creci-
miento. Tambin hay lmites de temperatura,latemperatura mni-
ma
en as
que son m etablicamen te inactivos
y
una temperatura
arriba delaculelcrecimiento yano esposible llamada tempera -
tura mxima.
De acuerdo a su temperatura ptima de crec imiento, los m icroorganismos
se dividen en psicrfilos (
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Otros microorganismos se desarrollan e n los habitat naturalmente alcalinos com o lagos salados y desiertos don-
de los valores de pH 10 son comunes, estos alcalfilos incluyen especies deRhizoblum, Bacillusyalgunas
bacterias en tricas y cianobacterias. En general los hongos son ms tolerantes a la acidez que las bacterias.
Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que al
mod ificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de c recimiento y causar la mue rte de lo mismos,
por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano.
Materiales
2 C a j a s d e P e t r i c o n m e d i o d e P a p a D e x t r o s a A g a r A n e x o
2 . 6 ) a j u s t a d o
a pH 7.0
fi 2 C a j a s d e P e t r i c o n m e d i o d e P a p a D e x t r o s a A g a r a j u s t a -
0
do a pH 5.0
2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajusta-
do a pH 9.0
22 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin (Bioxon) ajus-
tado a pH 7.0 sin amortiguar (Anexo 2.19)
4 Tubos con 7 mL de caldo m icroinoculacin ajustado a pH
5.0 sin amortiguar
4 Tubos con 7 mL de caldo m icroinoculacin ajustado a pH
9.0 sin amortiguador
4 Tu
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