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Epstein-Barrウイルス関連癌に 特異的な抗腫瘍剤
島根大学 医学部 微生物学講座
教授 吉山 裕規
4.新技術説明会について(実施後フォローアップ、来年度の実施) 【産連展開部(産学連携支援G)】
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l Epstein-Barrウイルス(EBV)はヘルペスウイルスに属し、潜伏持続感染した細胞の増殖を促進して腫瘍化する。
l EBVに有効な抗ウイルス薬やワクチンの開発は遅れている。
l EBVのBART miRNAsの転写を抑制することで、EBV感染上皮性腫瘍細胞をアポトーシスに導く抗がん剤を発明した。
l 例として、YK-4-279などの化合物は、ETS転写因子に結合し、EBV感染上皮性腫瘍細胞にアポトーシスを誘導した。
要 約
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ヘルペスウイルス科
亜科 種 通称
アルファヘルペスウイルス
HHV1 単純ヘルペスウイルス1型HHV2 単純ヘルペスウイルス2型HHV3 水痘単純疱疹ヘルペスウイルス
ベータヘルペスウイルス
HHV5 ヒトサイトメガロウイルス
HHV6A HHV6AHHV6B HHV6BHHV7 HHV7
ガンマヘルペスウイルスHHV4 エプスタイン・バーウイルス(EBV)HHV8 カポジ肉腫ウイルス
外被糖蛋白
HSV-1
ヌクレオカプシド
カプシド
コア ゲノム
EEBBVV
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ヘルペスウイルスは二つの感染様式をとる
溶解感染(水痘)
潜伏感染 →
→
潜伏持続感染
溶解感染 (帯状疱疹)
免疫の勝利利 免疫の敗北北
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EBV
EBウイルスも二つの感染様式をとる
BZLF1 BRLF1
溶解感染
再活性化
潜伏持続感染
EBNA1 EBERs BARTs LMP2A
など
潜伏感染遺伝子細胞はアポトーシスにより死滅
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細菌•ウイルス 患者数 ピロリ菌 770,000 パピローマウイルス 640,000 B及びC型肝炎ウイルス 590,000 EBウイルス 120,000 カポジ肉腫ウイルス 44,000 成人T細胞白血病 ウイルス 3,000 ビルハルツ住血吸虫、肝吸虫など 2,000
総ての感染症 2,200,000
Lancet Glob Health 9: e609-16 (2016)
世界の感染症に起因するがん患者数(2012年)
非感染者 5%
感染者 95%
全人口の95%がEBウイルスに感染
EBウイルスは腫瘍ウイルスである
一億人以上の日本人
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免疫機能がEBV感染細胞の増殖を抑制している
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
date
EB
V
cop
ies/
1000
00ce
lls
⽣生体肝移植リンパ節腫脹
免疫抑制剤減量量
EBVゲノムコピー/10,000細胞
105
106
107
108
0 15 10 5 (日)
(総細胞数)
⽣生体外でのEBV感染Bリンパ球の増殖
EBウイルス 抗原陽性細胞
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EBウイルス関連癌
上咽頭がんホジキンリンパ腫
鼻腔Tリンパ腫
移植後リンパ腫
EBV関連胃がん バーキットリンパ腫
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潜伏持続感染細胞から癌が生じる
EBV関連がんEBV 潜伏持続感染細胞
胃癌 食道
十二指腸 幽門部 胃底部
噴門部 上咽頭癌
下咽頭
口腔咽頭 鼻咽頭
鼻腔
舌
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EBV感染症は予防・治療法がない
• 抗ウイルス剤:核酸誘導体アシクロビル バラシクロビル
ガンシクロビル
バルガンシクロビルフォスカルネット
• 抗水痘ガンマグロブリン剤• 水痘ワクチン
単純ヘルペスウイルス水痘帯状疱疹ウイルス
サイトメガロウイルス
水痘帯状疱疹ウイルス
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EBウイルス感染細胞が産生するmiRNAs
BHRF1 miRNAs 1, 3, 4, 15,5,16,17,6 21,18, 7, 8, 9, 22,10,11,12,19,20,13,14 2
EBNA1
クラスター1 クラスター2
1-1 1-2, 1-3
EBNA2
EBVゲノム
oriP LMP2
Pre-miRNA
miRNA5' 3'
RISC
mRNA5'
3'3’UTR
RISC
LMP1
BART miRNAs (BARTs)
抑制
Dicerリボソーム
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miRNAの作用機序mRNA
3‘ UTR AAAAAAAA Cap
5‘ UTR
AA Cap
PolyAの分解抑制RNA-induced
silencing complex
miRNAは、mRNAの3’UTRに結合し、タンパク質翻訳過程を阻害
タンパク質コード領域
タンパク質コード領域
miRNA
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BART miRNAs(BARTs)が抑制する遺伝子miRNA Target
アポトーシス
miR-BART3 DICE1 FEM1B CASZ1a
miR-BART4-5p BID OCT1
miR-BART16 CREBBP SH2B3
miR-BART22 PPP3R1 PAK2 TP53INP1
miR-BART20-5p BAD
miRNA Target
溶解感染 miR-BART20-5p BZLF1/BRLF1 miR-BART6-5p DICER1
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EBV miRNA(BARTs)の 新しい転写調節機構を明らかにした
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プロモーター活性の測定法
ルシフェラーゼ プロモーター
リポーターベクター
転写因子の結合
ルシフェラーゼ酵素
細胞抽出液 発光
基質添加
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P2 P1
P2 P1 BART miRNAs (BARTs)
調節領領域
Regulation of BART promoter region
P1
Enhancer
pGL4
pGL4
pGL4
pGL4
pGL4
pGL4
Relative Luciferase ActivityRepressor
EBV (-) AGS cellsEBV (+) AGS cells
*
†
†
*
AGS (-)細胞
AGS EBV(+)細胞
BARTsの新しい転写調節領域を同定
ルシフェラーゼ活性 エンハンサー リプレッサー
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BARTsの新しい転写因子も同定ETS A, B, and C siRNAs suppress
BART promoter activity and transcription
Relative Luciferase Activity
pGL4 P1
pGL4
pGL4
† † † Relative BART transcript level
siCont. siETS A siETS B siETS C siETS D
ETS A, B, and C siRNAs suppress BART promoter activity and transcription
Relative Luciferase Activity
pGL4 P1
pGL4
pGL4
† † † Relative BART transcript level
siCont. siETS A siETS B siETS C siETS D
Regulation of BART promoter region
P1
Enhancer
pGL4
pGL4
pGL4
pGL4
pGL4
pGL4
Relative Luciferase ActivityRepressor
EBV (-) AGS cellsEBV (+) AGS cells
*
†
†
*
siCont.
siETS A
siETS BsiETS C
siETS D
Epithelial cell lines B cell lines EBV - + - +
上皮細胞 Bリンパ球高発現
低発現
中度発現
ETS A
ETS B
ETS C
ETS D
ルシフェラーゼ活性
新規転写因子が新規転写調節領域に結合する BARTs
P1
転写調節領域
Ets A
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ETS A欠損細胞ではBARTsの発現が低下
miR-BART-1-5p miR-BART-7-3p
相対
的な
発現
**
BARTs クラスター1 クラスター2 A
BARTs
P1
EBVゲノム
BARTs
P1
クラスター1 クラスター2
宿主ゲノム
ETS A⽋欠損
野⽣生型
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AGS(-)細胞 AGS EBV (+)細胞
ETS A 相対
的な
発現
LMP2A (ng)
相対
的な
発現
ETS A BARTs
0 1 10 100 10000 1 10 100 1000
BARTs
EBV野生型
EBER欠損LMP2A欠損
LMP2A (ng)
x
ETS A
BARTs
P1
EBV genome
LMP2A
miRNA
ノックアウト
ノックイン
EBVの潜伏感染遺伝子が転写因子を正に制御
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溶解感染が進行すると感染細胞はアポトーシスに陥る
潜伏持続感染
アポトーシスで細胞死
BZLF1BRLF1
腫瘍細胞増殖
EBNA1
溶解感染LMP2A
BARTs
EBERs
https://oncolo.jp/ct/ad/ad0038より
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LMP2A 欠損またはETS A破壊は溶解感染を進行させる
相対
的な
発現
Control TPA+SB
BZLF112
8
4
0
Control TPA+SB
10
相対
的な
発現
2345
AGS細胞 野生型 野生型 ETS A破壊
EBV 野生型 LMP2A破壊 野生型
溶解感染遺伝子発現
BARTs
x
ETS A
BARTs
P1
EBV genome
LMP2A
miRNA
22
7AA
D
Annexin V
2.02
16.26
8.52
24.22
10.46
23.22
AGS細胞 野生型 野生型 ETS A破壊
EBV 野生型 LMP2A欠損 野生型
LMP2A欠損またはETS A破壊でアポトーシスが進行する
23
x
A
BARTs
P1
EBV genome
LMP2A
アポトーシス
溶解感染 腫瘍形成促進
EBV感染上皮細胞ではLMP2AがETS Aの発現を促進する
ETS AがBARTsの発現を促進する
BARTsの発現は溶解感染とアポトーシスの進行を抑制する
発見:miRNAの発現を介したEBVの腫瘍化機構
24
EBV miRNA(BARTs)の 発現抑制に働く抗腫瘍薬の開発
25
相対
的な
発現
* P
26
Annexin V
YK-4-279
DMSO
AGS(-) AGS(+) AGS(+)
BZLF1 KO
9.6
5.0
9.38
5.88
3.82
7.16
10.0
6.64
10.78
18.92
6.40
7.68
対照
YK-4-279
9.6
5.0
10.0
6.6
9.4
5.9
10.8
18.9
3.9
7.2
6.4
7.7
Annexin V
7AA
D
非感染 野生型EBV BZLF1欠損EBV
YK-4-279はEBVの溶解感染を誘導し、感染細胞をアポトーシスに導く
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YK-4-279の作用機序 EBV感染
ETS A
BART miRNAs
BZLF1
アポトーシス
YK-4-279
EBV感染
ETS A
BART miRNAs
BZLF1
アポトーシス
腫瘍細胞増殖 腫瘍細胞死
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EBV感染による宿主細胞の転写調節変化を正常化することによる、Epstein-Barrウイルス関連癌に特異的な抗腫瘍剤の開発
発明
Ewing 肉腫に有効な抗腫瘍剤として開発された YK-4-279が有効であることの一例
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類似特許との相違
類似特許(United States Patent 20150329865)は、多数あるEBウイルスmiRNAのうちmiR-‐‑‒BART20-‐‑‒5pの活性を核酸薬により阻害し、ウイルス溶解感染を誘導することでウイルス感染細胞を破壊させる。それに対して、我々の提案は、1) 1つのmiRNAだけに着⽬目せず、30個以上のEBV miRNAの発現を同時に抑制する。
2) 特定のETSファミリー遺伝⼦子を対象とし、化合物を⽤用いてウイルス感染細胞にアポトーシスを誘導することで、抗腫瘍作⽤用を発揮する。
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新技術の特徴
l ETSファミリー遺伝子の阻害はEBV潜伏感染細胞に特異的にアポトーシスを引き起こした。
l US 20050221490 A:「核酸誘導体を用いたDNAウイルス由来miRNA阻害剤」は、転写を抑制でき
ない。(転写抑制の方が効果的)
l ユーイング肉腫の治療薬として前臨床試験が終了したYK-4-279が、EBV感染細胞にアポトーシ
スを誘導できた。
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想定される用途
l Epstein-Barrウイルス関連胃癌や上咽頭癌、口腔がんなどのEBV関連上皮性腫瘍の治療薬。
l 腫瘍以外に、慢性活動性EBウイルス増殖症などの重篤感染症の治療への応用も期待される。
l YK-4-279がユーイング肉腫以外に前立腺癌にも有効である(リポジショニング)ことから、新規
化合物は、EBV関連腫瘍以外にも適応拡大でき
る可能性がある。
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実用化に向けた課題
l YK-4-279は、転写活性化因子EWS-FLI1とRNAヘリカーゼの結合の阻害薬である。EtsAの活性も抑
制するが、さらなる至適化が可能だと考えられる。
l 現在、効果確認が試験管レベルに留まっている。
l 今後、SCIDマウス移植モデルを用いて有効性を確認し、臨床試験に適用するための条件設定を行う
必要がある。
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企業への期待
l 創薬候補となるライブラリーの提供。
l 実験モデルマウスを用いた薬効の評価と毒性試験の共同研究を希望。
l miRNAの標的薬剤開発にご興味がある場合は、核酸薬と、本発明との組み合わせを希望。
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 :Epstein-Barr ウイルス関連癌に 特異的な抗腫瘍剤
• 出願番号 :特願2017-160164(2017年8月23日)• 出願人 :島根大学• 発明者 :吉山 裕規、飯笹 久、キム ヒョジ
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産学連携の経歴
• 1998年 「ピロリ菌に特異的な抗菌治療薬の開発」 代表 :吉山 裕規(山口大学微生物) :加守田 修(帝国化学産業→ナガセケムテックス)
• 2002年6月 日経バイオビジネス「EBウイルスベクター 」• 2003年1月10日 大学発ベンチャー「イーベック」設立に参加• 2003年-2004年 平成15-16年度経済産業省:
地域新生コンソーシアム研究開発事業 「医薬素材としての完全ヒト抗体の作製と大量産生システムの確立 」 研究開発委員会委員 分担研究開発項目: 「完全ヒト抗体作製法の開発 」 平成15年度(総額5,500万円中配分額157万6,550円) 平成16年度(総額966,3千円中配分額210万円)
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お問い合わせ先
島根⼤大学産学連携コーディネーター
中村 守彦TEL 0853-20-2912FAX 0853-20-2913e-‐‑‒mail nkmr0515@med.shimane-‐‑‒u.ac.jp
松下 幸之助TEL 0852-60-2292FAX 0852-60-2395e-‐‑‒mail matsushita@riko.shimane-‐‑‒u.ac.jp
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