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Epstein-Barrウイルス関連癌に
特異的な抗腫瘍剤

島根大学　医学部　微生物学講座　　　　　　

教授　吉山 裕規

4.新技術説明会について（実施後フォローアップ、来年度の実施）　【産連展開部（産学連携支援Ｇ）】

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l Epstein-Barrウイルス（EBV）はヘルペスウイルスに属し、潜伏持続感染した細胞の増殖を促進して腫瘍化する。

l EBVに有効な抗ウイルス薬やワクチンの開発は遅れている。

l EBVのBART miRNAsの転写を抑制することで、EBV感染上皮性腫瘍細胞をアポトーシスに導く抗がん剤を発明した。

l 例として、YK-4-279などの化合物は、ETS転写因子に結合し、EBV感染上皮性腫瘍細胞にアポトーシスを誘導した。

要　約

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ヘルペスウイルス科

亜科 種 通称

アルファヘルペスウイルス

HHV1 単純ヘルペスウイルス1型HHV2 単純ヘルペスウイルス2型HHV3 水痘単純疱疹ヘルペスウイルス

ベータヘルペスウイルス

HHV5 ヒトサイトメガロウイルス

HHV6A HHV6AHHV6B HHV6BHHV7 HHV7

ガンマヘルペスウイルスHHV4 エプスタイン・バーウイルス(EBV)HHV8 カポジ肉腫ウイルス

外被糖蛋白

HSV-1

ヌクレオカプシド

　　　カプシド

　コア　　ゲノム

　　　

EEBBVV

4

ヘルペスウイルスは二つの感染様式をとる

溶解感染(水痘)

潜伏感染　→

　→

潜伏持続感染

溶解感染
(帯状疱疹)

免疫の勝利利 免疫の敗北北

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EBV

EBウイルスも二つの感染様式をとる

BZLF1 BRLF1

溶解感染

再活性化

潜伏持続感染

EBNA1 EBERs BARTs LMP2A

など

潜伏感染遺伝子細胞はアポトーシスにより死滅

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細菌•ウイルス 患者数 ピロリ菌 770,000 パピローマウイルス 640,000 B及びC型肝炎ウイルス 590,000 EBウイルス 120,000 カポジ肉腫ウイルス 44,000 成人T細胞白血病 ウイルス 3,000 ビルハルツ住血吸虫、肝吸虫など 2,000

総ての感染症 2,200,000

Lancet Glob Health 9: e609-16 (2016)

世界の感染症に起因するがん患者数(2012年)

非感染者　5%

感染者　95％

全人口の95%がEBウイルスに感染

EBウイルスは腫瘍ウイルスである

一億人以上の日本人

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免疫機能がEBV感染細胞の増殖を抑制している

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

1 2 0 0

date

EB

V

cop

ies/

1000

00ce

lls

⽣生体肝移植リンパ節腫脹

免疫抑制剤減量量

EBVゲノムコピー/10,000細胞

105

106

107

108

0 15 10 5 (日)

(総細胞数)

⽣生体外でのEBV感染Bリンパ球の増殖

EBウイルス 抗原陽性細胞

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EBウイルス関連癌

上咽頭がんホジキンリンパ腫

鼻腔Tリンパ腫

移植後リンパ腫

EBV関連胃がん バーキットリンパ腫

9

潜伏持続感染細胞から癌が生じる

EBV関連がんEBV 潜伏持続感染細胞

胃癌 食道

十二指腸 幽門部 胃底部

噴門部 上咽頭癌

下咽頭

口腔咽頭 鼻咽頭

鼻腔

舌

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EBV感染症は予防・治療法がない

• 抗ウイルス剤：核酸誘導体アシクロビル　　バラシクロビル

ガンシクロビル

　　 バルガンシクロビルフォスカルネット

• 抗水痘ガンマグロブリン剤• 水痘ワクチン

単純ヘルペスウイルス水痘帯状疱疹ウイルス

サイトメガロウイルス

水痘帯状疱疹ウイルス

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EBウイルス感染細胞が産生するmiRNAs

BHRF1 miRNAs 1, 3, 4, 15,5,16,17,6 21,18, 7, 8, 9, 22,10,11,12,19,20,13,14 2

EBNA1

クラスター1 クラスター2

1-1 1-2, 1-3

EBNA2

EBVゲノム

oriP LMP2

Pre-miRNA

miRNA5' 3'

RISC

mRNA5'

3'3’UTR

RISC

LMP1

BART miRNAs (BARTs)

抑制

Dicerリボソーム

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miRNAの作用機序mRNA

3‘ UTR AAAAAAAA Cap

5‘ UTR

AA Cap

PolyAの分解抑制RNA-induced

silencing complex

miRNAは、mRNAの3’UTRに結合し、タンパク質翻訳過程を阻害

タンパク質コード領域

タンパク質コード領域

miRNA

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BART miRNAs(BARTs)が抑制する遺伝子miRNA Target

アポトーシス

miR-BART3 DICE1 FEM1B CASZ1a

miR-BART4-5p BID OCT1

miR-BART16 CREBBP SH2B3

miR-BART22 PPP3R1 PAK2 TP53INP1

miR-BART20-5p BAD

miRNA Target

溶解感染 miR-BART20-5p BZLF1/BRLF1 miR-BART6-5p DICER1

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EBV  miRNA(BARTs)の 　 　 　新しい転写調節機構を明らかにした

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プロモーター活性の測定法

ルシフェラーゼ プロモーター

リポーターベクター

転写因子の結合

ルシフェラーゼ酵素

細胞抽出液 発光

基質添加

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P2 P1

P2 P1 BART miRNAs (BARTs)

調節領領域

Regulation of BART promoter region

P1

Enhancer

pGL4

pGL4

pGL4

pGL4

pGL4

pGL4

Relative Luciferase ActivityRepressor

EBV (-) AGS cellsEBV (+) AGS cells

*

†

†

*

AGS (-)細胞

AGS EBV(+)細胞

BARTsの新しい転写調節領域を同定

　　　ルシフェラーゼ活性　エンハンサー リプレッサー

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BARTsの新しい転写因子も同定ETS A, B, and C siRNAs suppress

BART promoter activity and transcription

Relative Luciferase Activity

pGL4 P1

pGL4

pGL4

† † † Relative BART transcript level

siCont. siETS A siETS B siETS C siETS D

ETS A, B, and C siRNAs suppress BART promoter activity and transcription

Relative Luciferase Activity

pGL4 P1

pGL4

pGL4

† † † Relative BART transcript level

siCont. siETS A siETS B siETS C siETS D

Regulation of BART promoter region

P1

Enhancer

pGL4

pGL4

pGL4

pGL4

pGL4

pGL4

Relative Luciferase ActivityRepressor

EBV (-) AGS cellsEBV (+) AGS cells

*

†

†

*

siCont.

siETS A

siETS BsiETS C

siETS D

Epithelial cell lines B cell lines EBV - + - +

上皮細胞　　　　　　　　Bリンパ球高発現

低発現

中度発現

ETS A

ETS B

ETS C

ETS D

　　　ルシフェラーゼ活性　

新規転写因子が新規転写調節領域に結合する BARTs

P1

転写調節領域

Ets A

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ETS A欠損細胞ではBARTsの発現が低下

miR-BART-1-5p miR-BART-7-3p

相対

的な

発現

**

BARTs    クラスター1 　              クラスター2 A

BARTs

P1

EBVゲノム

BARTs

P1

クラスター1 クラスター2

宿主ゲノム

ETS  A⽋欠損

野⽣生型

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AGS(-)細胞 AGS EBV (+)細胞

ETS A 相対

的な

発現

LMP2A (ng)

相対

的な

発現

ETS A BARTs

0 1 10 100 10000 1 10 100 1000

BARTs

EBV野生型

EBER欠損LMP2A欠損

LMP2A (ng)

x

ETS A

BARTs

P1

EBV genome

LMP2A

miRNA

ノックアウト

ノックイン

EBVの潜伏感染遺伝子が転写因子を正に制御

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溶解感染が進行すると感染細胞はアポトーシスに陥る

潜伏持続感染

アポトーシスで細胞死

BZLF1BRLF1

腫瘍細胞増殖

EBNA1

溶解感染LMP2A

BARTs

EBERs

https://oncolo.jp/ct/ad/ad0038より

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LMP2A 欠損またはETS A破壊は溶解感染を進行させる

相対

的な

発現

Control TPA+SB

BZLF112

8

4

0

Control TPA+SB

10

相対

的な

発現

2345

AGS細胞 野生型 野生型 ETS A破壊

EBV 野生型 LMP2A破壊 野生型

溶解感染遺伝子発現

BARTs

x

ETS A

BARTs

P1

EBV genome

LMP2A

miRNA

22

7AA

D

Annexin V

2.02

16.26

8.52

24.22

10.46

23.22

AGS細胞 野生型 野生型 ETS A破壊

EBV 野生型 LMP2A欠損 野生型

LMP2A欠損またはETS A破壊でアポトーシスが進行する

23

x

A

BARTs

P1

EBV genome

LMP2A

アポトーシス

溶解感染 腫瘍形成促進

EBV感染上皮細胞ではLMP2AがETS Aの発現を促進する

ETS AがBARTsの発現を促進する

BARTsの発現は溶解感染とアポトーシスの進行を抑制する

発見：miRNAの発現を介したEBVの腫瘍化機構

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EBV  miRNA(BARTs)の 　 　 　発現抑制に働く抗腫瘍薬の開発

25

相対

的な

発現

* P

26

Annexin V

YK-4-279

DMSO

AGS(-) AGS(+) AGS(+)

BZLF1 KO

9.6

5.0

9.38

5.88

3.82

7.16

10.0

6.64

10.78

18.92

6.40

7.68

対照

YK-4-279

9.6

5.0

10.0

6.6

9.4

5.9

10.8

18.9

3.9

7.2

6.4

7.7

Annexin V

7AA

D

非感染 野生型EBV BZLF1欠損EBV

YK-4-279はEBVの溶解感染を誘導し、感染細胞をアポトーシスに導く

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YK-4-279の作用機序 EBV感染

ETS A

BART miRNAs

BZLF1

アポトーシス

YK-4-279

EBV感染

ETS A

BART miRNAs

BZLF1

アポトーシス

腫瘍細胞増殖 腫瘍細胞死

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EBV感染による宿主細胞の転写調節変化を正常化することによる、Epstein-Barrウイルス関連癌に特異的な抗腫瘍剤の開発

発明

Ewing 肉腫に有効な抗腫瘍剤として開発された YK-4-279が有効であることの一例

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類似特許との相違

類似特許(United  States  Patent  20150329865)は、多数あるEBウイルスmiRNAのうちmiR-‐‑‒BART20-‐‑‒5pの活性を核酸薬により阻害し、ウイルス溶解感染を誘導することでウイルス感染細胞を破壊させる。それに対して、我々の提案は、1)  １つのmiRNAだけに着⽬目せず、30個以上のEBV  miRNAの発現を同時に抑制する。

2)  特定のETSファミリー遺伝⼦子を対象とし、化合物を⽤用いてウイルス感染細胞にアポトーシスを誘導することで、抗腫瘍作⽤用を発揮する。

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新技術の特徴

l ETSファミリー遺伝子の阻害はEBV潜伏感染細胞に特異的にアポトーシスを引き起こした。

l US 20050221490 A：「核酸誘導体を用いたDNAウイルス由来miRNA阻害剤」は、転写を抑制でき

ない。（転写抑制の方が効果的）

l ユーイング肉腫の治療薬として前臨床試験が終了したYK-4-279が、EBV感染細胞にアポトーシ

スを誘導できた。

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想定される用途

l Epstein-Barrウイルス関連胃癌や上咽頭癌、口腔がんなどのEBV関連上皮性腫瘍の治療薬。

l 腫瘍以外に、慢性活動性EBウイルス増殖症などの重篤感染症の治療への応用も期待される。

l YK-4-279がユーイング肉腫以外に前立腺癌にも有効である（リポジショニング）ことから、新規

化合物は、EBV関連腫瘍以外にも適応拡大でき

る可能性がある。

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実用化に向けた課題

l YK-4-279は、転写活性化因子EWS-FLI1とRNAヘリカーゼの結合の阻害薬である。EtsAの活性も抑

制するが、さらなる至適化が可能だと考えられる。

l 現在、効果確認が試験管レベルに留まっている。

l 今後、SCIDマウス移植モデルを用いて有効性を確認し、臨床試験に適用するための条件設定を行う

必要がある。

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企業への期待

l 創薬候補となるライブラリーの提供。

l 実験モデルマウスを用いた薬効の評価と毒性試験の共同研究を希望。

l miRNAの標的薬剤開発にご興味がある場合は、核酸薬と、本発明との組み合わせを希望。

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本技術に関する知的財産権

•  発明の名称 ：Epstein-Barr ウイルス関連癌に 　特異的な抗腫瘍剤

•  出願番号 ：特願2017-160164(2017年8月23日)•  出願人 ：島根大学•  発明者 ：吉山　裕規、飯笹　久、キム　ヒョジ

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産学連携の経歴

•  1998年 「ピロリ菌に特異的な抗菌治療薬の開発」 代表 ：吉山　裕規(山口大学微生物) ：加守田　修(帝国化学産業→ナガセケムテックス)

•  2002年6月 日経バイオビジネス「EBウイルスベクター 」•  2003年1月10日　大学発ベンチャー「イーベック」設立に参加•  2003年-2004年　平成15-16年度経済産業省：

地域新生コンソーシアム研究開発事業 「医薬素材としての完全ヒト抗体の作製と大量産生システムの確立 」 研究開発委員会委員 分担研究開発項目： 「完全ヒト抗体作製法の開発 」 平成15年度(総額5,500万円中配分額157万6,550円) 平成16年度(総額966,3千円中配分額210万円)

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お問い合わせ先

島根⼤大学産学連携コーディネーター

中村  守彦ＴＥＬ 0853－20－2912ＦＡＸ 0853－20－2913e-‐‑‒mail nkmr0515＠med.shimane-‐‑‒u.ac.jp

松下  幸之助ＴＥＬ 0852－60－2292ＦＡＸ 0852－60－2395e-‐‑‒mail matsushita＠riko.shimane-‐‑‒u.ac.jp