Masarykova univerzita

Prırodovedecka fakulta

Zadanı 4. serie

5. rocnık (2014/2015)

Korespondencnı seminar ViBuCh probıha pod zastitou Ustavu chemie Prırodovedecke fakultyMasarykovy univerzity a Narodnıho centra pro vyzkum biomolekul.

ViBuCh probıha v ramci projektu”Popularizace vedy a vyzkumu v prırodnıch vedach a matem-

atice s vyuzitım potencialu MU“, reg. c. CZ.1.07/2.3.00/45.0018. Projekt je spolufinancovanEvropskym socialnım fondem a statnım rozpoctem Ceske republiky.

Recenze uloh:

Lukas Daniel (A3), Karel Kubıcek (D3), Petr Stadlbauer (Z4) a Jakub Svenda (C3)

c© 2015 Tomas Buryska, Radovan Fiala, Tomas Fiala, Roman Kucera, Lukas Mikulu a PetrStadlbauer

c© 2015 Masarykova univerzita

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Uvodnık

Cus lakmus,

je tu poslednı brozurka ViBuChu v tomto skolnım roce a stejne tak ctvrty letosnı uvodnık.Vyjımecne opustıme vselijake upravy uvodnıku, protoze cıslo ctyri ma jako jedine tu vyjımecnouvlastnost, ze se jedna o vysledek operace umocnenı jedineho sudeho prvocısla na sebe samo. Dalsıfascinujıcı vlastnostı je to, ze se rovnez jedna o vysledek nasobenı jedineho sudeho prvocısla sebousamym, a proto si neudelame nostalgicky vylet do minulosti (viz Clanky – Archiv) ani nebudemetuto skutecnost rusit bonusovou ulohou (cımz se tento uvodnık, jak je zvykem, lisı od predchozıchuvodnıku stejneho rocnıku). Jen proste zkonstatujme, ze vyroby prıstroje z predchozı serie senikdo nezhostil, lec neprijde tato uloha nazmar, budete konstruovat a dokazovat (cti vymysletsi vysledky) v prubehu zaverecneho soustredenı. To probehne v termınu od 2. do 8. srpna 2015v Brne a bude na nej pozvano X resitelu, kde X je prirozene cıslo v intervalu 10 az 20. Zaveremmala reklama; kdo by mel zajem, muze se zucastnit souteze InterSob. Vıce informacı je v letackuna konci brozury.

Hodne zdaru pri resenı a v lete na videnou!

Petr Stadlbauer (za vsechny organizatory)

3

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

A3 – Proteinove inzenyrstvı a biokatalyza

Autor: Tomas Buryska (e-mail: buryska.tomas@gmail.com) 12 bodu

Milı resitele,dostali jsme se tak nejak na konec. V teto poslednı casti bych vam chtel zbezne nastınit, jak sirokemoznosti enzymy skytajı. Snad jste se neco zajımaveho dozvedeli a s nekterymi z vas se potkamena letnım soustredenı, kde se budeme venovat mikrofluidice, kterou si i prakticky vyzkousıte.

Vibuchu nazdar!

Biokatalyza spocıva ve vyuzitı enzymu a mikrobu k chemicke synteze, a to jak k procesum,ktere jsou znamy, tak v aplikacıch, pro ktere puvodnı funkce enzymu nebyla vyvinuta. Behemvyvoje biokatalyzy, o ktere se da hovorit poslednıch 150 let, vedci postupne rozpoznali funkcezivych bunek, ktere mohou byt uzitecne v transformacıch chemickych latek (zdaleka prvnımtakovym procesem byly fermentacnı procesy, ktere lide pouzıvajı uz po staletı). Nejdrıve to bylyjednodussı syntezy jako hydroxylace steroidu, pozdeji se objevily proteazy v pracıch prascıch,glukoza izomeraza zacala byt vyuzıvana pri tvorbe fruktosy jako sladidla nebo penicilin Gcyklaza pro prıpravu semisyntetickych antibiotik. Zasadnı limitacı biokatalyzatoru pro jejichopravdu masivnı rozsırenı je jejich omezena stabilita a casto nızka aktivita. Enzymy se drıvepouzıvaly ve forme, v jake byly dostupne v prırode (naprıklad izolacı z jater nebo listu). Abybylo mozne rozsırit jejich pole pusobnosti na nove substraty, zvysit jejich stabilitu a celkovou ak-tivitu, bylo potreba vyvinout a aplikovat nove nastroje molekularnı biologie, ktere by simulovalydarwinistickou evoluci. Tato tak zvana rızena evoluce in vitro byla poprve pouzita v roce 1972a od te doby se hodne rozsırila. Spocıva v iterativnıch cyklech s ruznou mırou nahodne zmenygeneticke informace, kdy do dalsıho kroku pouzijeme vzdy jen vybrane vylepsene mutanty.

ClO

O O

ClO

OH O

NCO

OH O

NC CO2- NH4

+

OH

NC CN

OH

NC CO2 t-Bu

OH O

NC CO2 t-Bu

O O

O

O-

OHOH

N

F

NH

OCa2+

lipitor 2

CO2 t-Bu

O O

H2N

Cl

O O+ 2

aldolaza

KRED HHDHnitrilaza

Epichlorhydrin

O OH

OH

Cl

NC CO2 t-Bu

OH OH

NC

O O+ 2

aldolaza O OH

OH

CN

O O+ 2

aldolaza O OH

OH

N3

N3

acetonMeOH

HCN H+ Cl-

NADPH NADP

GDHglukozaNa+-glukonat

t-Bu-AcLDA THF

KRED

NADPH

NADP

Na+-glukonat

glukoza

GDH

Obr. 1: Zjednodusene schema syntezy Lipitoru tremi ruznymi cestami. Jedna cesta pouzıvaKRED v kombinaci s halohydrin dehalogenasami (HHDH), druha nitrilasu a tretı kombinujeruzne aldolasy. Lipitor se pouzıva ke snizovanı hladiny cholesterolu a mezi lety 1996 az 2012presahly jeho trzby neuveritelnych 125 miliard dolaru.

4

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Proces rızene evoluce by se dal popsat i z hlediska zmeny volne Gibbsovy energie. Ostatnejsou snahy vylepsovat proteiny za pouzitı pocıtacoveho modelovanı a bioinformatickych nastroju.Nicmene uspesnost takovych predikcı je zatım velmi mala, protoze pro zjednodusenı zatım nenımozne modelovat kompletnı system se vsemi promennymi.

Jsou znamy prıpady, kdy bodova mutace vedla ke mnohonasobnemu (radove stovky) zvysenıkatalyticke aktivity. Jenze najıt tu spravnou mutaci v knihovnach, ktere mohou obsahovat pres100 tisıc variant da opravdu hodne prace. Proto se v nekterych prıpadech zkoumajı jen casti kni-hoven, tak, aby bylo dosazeno alespon nejakeho pokrytı. Zejmena, musıme-li vse delat manualnebez pomoci automatizace.

Ukol 1: Najdete nejaky prıklad z biotechnologicke oblasti, kdy bodova mutace v proteinuvedla ke zvysenı katalyticke ucinnosti, alespon padesatinasobne. Napiste reakcnı schema.

NH2

F

F F

N

NN

N

F FF

O

Sitagliptin

O

F

F F

N

NN

N

F FF

O

Prositagliptin

chemická katalýza

1. NH4OAc2. H2 (17 atm) [Rh(COD)Cl2] + (R,S)-t-Bu-Josiphos MeOH, 50°C3. Uhlíková úprava4. Bezbazická krystalizace

enzymatická katalýza

(R)-amino transferaza

isopropylamin

Obr. 2: Ukazka jednoduche zameny keto za amino skupinu. Jednoduche z pohledu enzymu,ale synteticka cesta je komplikovanejsı co se podmınek tyce. Aminotransferaza je navıc vysoceenantioselektivnı, takze vznika pouze jeden enantiomer.

Ukol 2: Mame protein s 200 aminokyselinami, kdybychom jej chteli kompletne promutovat,tj. nahradit kazdou aminokyselinu zbyvajıcımi, kolik bychom meli variant proteinu? Kdybychomchteli provest jen dve nahrady kdekoli na retezci, kolik bude moznostı tentokrat? Za predpokladu,ze mame robotickou platformu, ktera analyzuje 100 mutantu za sekundu, jak dlouho bude trvatprozkoumat obe vznikle knihovny (uved’ cas pro kazdou zvlast’)?

OO

O

O

O

H

HH

artemisinin

Obr. 3: Artemisinin jeden ze znamych leku proti malarii se dnes mimo jine take vyrabı dıkyproteinovemu inzenyrstvı. V tomto prıpade byla do bunek E. coli vnesena cela metabolickadraha, ktera produkuje vyslednou molekulu.

V praktickych aplikacıch se enzymy casto pouzıvajı v imobilizovane forme. Prıkladem mo-hou byt velke bioreaktory pouzıvane v syntezach organickych late o vysoke cistote nebo cistickyodpadnıch vod. I kdyz by bylo casto mnohem lepsı vyuzıvat celobunecne technologie s up-ravenymi enzymy (nebo celymi metabolickymi drahami), legislativa toto v soucasne dobe neumoznuje,protoze by se geneticky modifikovane organismy nemely dostat do volne prırody, tak aby mohlypredat svoji dedicnou informaci dale.

5

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Ukol 3: Strucne vysvetli princip imobilizace enzymu (jsou ctyri zakladnı principy, muzes sipomoci ilustracı). Popis, jakym zpusobem se projevı imobilizace na samotnem enzymu a jehovlastnostech.

6

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

C3 – Organicka synteza

Autor: Roman Kucera (e-mail: 408476@mail.muni.cz) 14 bodu

V teto serii se budeme venovat prıprave latky 28, ktera predstavuje biosynteticky a syntetickyprekurzor slouceniny 30. Sloucenina 30 slouzı jako lecivo, ktere je natolik dulezite, ze bylazarazena do Seznamu zakladnıch leciv svetove zdravotnı organizace (World Health Organization’sList of Essential Medicines).

28

N

N

CH3O

CH3 CO2CH3

OAc

EtOH

H

NH

N

CH3

CH3OOC

29 30

N

N

CH3O

CH3 CO2CH3

OAc

EtOH

H

N CH3

OH

CH3OOC

HN

16` 14`

To, co cinı latku 30 tak dulezitou je, ze pusobı proti mnoha typum rakoviny, jako je naprıkladrakovina plic, mocoveho mechyre, mozku, varlat. . .

Obr. 1: Vizualizace bunky v metafazi po-mocı fluorescence. Kinetochory jsou videtjako male ruzove tecky ve strednı casti,vazane na modre oznacene chromozomy azelene delıcı vretenko

Obr. 2: Caj vyrobeny z teto rostliny sepouzıva v tradicnı cınske medicıne jako lekna cukrovku

Latka 30 ma schopnost vazat se na tubulin,cımz inhibuje jeho polymeraci a tvorbu mikro-tubulu, ktere jsou z tubulinu slozeny. Zpusobujetak zastavenı bunecneho cyklu v M fazi, protozenarusuje tvorbu mikrotubulu a vlastnı sestavenımitotickeho vretenka a kinetochoru, z nichz kazdyje nevyhnutelne potrebny pro separaci chromo-zomu v anafazi mitozy.

Latka 30 byla izolovana spolu s dalsımi alka-loidy (latky 28 a 29), ktere mohou slouzit jakojejı biosynteticke a synteticke prekurzory, z ros-tliny, ktera je zobrazena na obrazku 2. Exk-trakce latky z prırodnıch zdroju je vsak drahaa vytezek latky 30 i jejich prekurzoru je maly.Navıc latka 30 je zıskavana jako smes pros-torovych izomeru (stereoizomeru), pricemz pouzeC16’S a C14’R izomer je biologicky aktivnı. Z to-hoto duvodu se enantioselektivnı synteza teto latkystala v poslednıch letech stredem pozornosti. Ne-jefektivnejsı syntezy latky 30 poskytujı az 22%vytezek, coz je cinı atraktivnejsımi nez izolacez prırodnıch zdroju.

Latka 28 byla pripravena zajımavou kaskadou.Jejı prıpravu muzeme rozdelit na tri casti: prıpravulatky vstupujıcı do kaskadove reakce, samotnoukaskadovou reakci a nasledujıcı upravy skeletu,jako je expanze kruhu a modifikace funkcnıchskupin.

7

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Predtım, nez se pustıme do syntezy, bylo by vhodne obeznamit se s nekolika chranicımiskupinami, ktere se v teto synteze vyuzıvajı (7 z 27 kroku je jen manipulace s chranicımiskupinami), znat zpusob jejich zavedenı, odstranenı a podmınky, ktere tolerujı.

Ukol 1: Vyplnte nasledujıcı tabulku:

ZkratkaStrukturnı Chranicı Podmınky Podmınky Stabilnı

vzorec skupina pro pro zavedenı pro odstranenı vuci

Bn

MOM

Ac

Teoc

Studijnım materialem muze byt:http://www.vanderbilt.edu/AnS/Chemistry/Rizzo/chem223/protect.pdf

Ukol 2: Jake vlastnosti by mela mıt idealnı chranicı skupina?

Synteza latky 28 vychazı z ochranene kyseliny asparagove (1) (vyhodou pouzitı teto latkyje, ze je dostupna jako cisty enantiomer ve velkem mnozstvı), ktera byla pusobenım N -[2--(trimethylsilyl)ethoxykarbonyloxy]sukcinimidu (TeocOSu) ochranena na atomu dusıku za vznikulatky 2. Ta reagovala s i -BuOCOCl za vzniku smıseneho anhydridu, ktery byl nasledujıcı reakcıs NaBH4 preveden na alkohol 3, jehoz ochranenı poskytlo slouceninu 4.

N

O

O

O O

O

Si(CH3)3

TeocOSu

Sloucenina 4 byla ve dvou krocıch konvertovana na Wein-rebuv amid: prvnım krokem byla reakce slouceniny 4 s vodıkemza katalyzy palladiem na uhlıku, druhym krokem byla ami-dace vznikle latky 5 za vzniku produktu 6. Ten po reakcis ethylmagnesiumbromidem poskytl latku 7 pro naslednouWittigovu reakci. Vystavenı produktu Wittigovy reakce (8)tetrabutylamonium-fluoridu poskytlo latku 9.

O

OH

O

OBn

H2N

1

12

2

OMOM

H2N

Et

OBn

9

33

44

55

66

77

88

C11H13NO4 C16H25NO3

C17H27NO5Si C14H29NO5Si

1) Teoc-OSu, kvantitativne; 2) i -BuOCOCl, NMM, −15 ◦C potom NaBH4, 91 %; 3) MOMCl,i -Pr2NEt, 84 %; 4) H2, Pd/C; 5) MeONHMe, EDCI, DMAP, i -Pr2NEt, 94 %; 6) 3 ekv. EtMgBr,3 ekv. CeCl3, 0 ◦C, kvantitativne; 7) Ph3P=CHOBn, −40 ◦C, 90 % (smes E a Z isomeru); 8)Bu4NF.

Ukol 3: Smısenı aminu a karboxylove kyseliny za laboratornı teploty by nevedlo ke vznikupozadovaneho amidu, avsak Weinrebuv amid za podmınek reakce 5) vznika az ve 94% vytezku.Jak muzeme vysvetlit takto vysoky vytezek?

8

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Ukol 4: Proc je EtMgBr adovan na Weinrebuv amid 6 a ne napr. uz na ester 4 pripravenydrıve v teto sekvenci?

Ukol 5: Ethery (C-O-C), na rozdıl od silyletheru (C-O-Si), jsou stabilnı v prıtomnosti fluoridu.Vysvetlete pozorovanou selektivitu reakce s tetrabutylamonium-fluoridem v poslednım krokuprvnıho schematu (zamyslete se nad umıstenım prvku v periodicke tabulce).

Sloucenina 9 byla pusobenım karbonyldiimidazolu (CDI) konvertovana na karbamat 10,ktery po reakci s methyl-oxalylhydrazidem v prostredı kyseliny octove poskytl prekurzor pro1,3,4-oxadiazol, latku 11. Vystavenı latky 11 tosylchloridu v prostredı triethylaminu poskytlozadany oxadiazol 12. Ten byl preveden na amid 13, cımz byla zavrsena prıprava latky vstupujıcıdo kaskadove reakce.

N

Et

OBn

OMOM

O N

N

CO2CH3

O

NCH3O

CH3

13

OMOM

H2N

Et

OBn

9

910

10 1112

12

OMOMHN

Et

OBn

OO

NH

NHCH3O2C

11

9) CDI, DMAP, 86 % po dvu krocıch; 10) NH2HNCOCO2Me, AcOH, 78 %; 11) TsCl, Et3N,94 %; 12) (viz ukol 8).

Ukol 6: Pokuste se navrhnout mechanismus premeny latky 11 na oxadiazol 12.

Ukol 7: Jaka je struktura latky skryvajıcı se pod zkratkou CDI a jake je jejı obecne syntetickepouzitı?

Ukol 8: Navrhnete reakcnı podmınky a potrebny indolovy fragment pro tvorbu amidu 13z oxadiazolu 12.

Sloucenina 13 po zahratı na 150 ◦C podlehla kaskadove reakci, ktera zahrnovala Dielsovu--Alderovu reakci, fragmentaci za uvolnenı molekularnıho dusıku a vzniku dipolu a [2+3] dipolarnıcykloadici. Produkt 14 vznikl prevazne jako jediny diastereomer.

N

Et

OBn

OMOM

O N

N

CO2CH3

O

NCH3O

CH3

13

N

N

CH3O

CH3 CO2CH3

OBn

Et

OMOMO

O

H

14

[4+2]Diels-Alder

fragmentaceB C

[2+3]– N2

dipolárnícykloadice

13

13) xylen, 150 ◦C, 10 h, 72 %.

Ukol 9: Napiste jednotlive meziprodukty (B a C) transformace latky 13 na latku 14.

Vznikly cyklicky ether byl reduktivne otevren v kyselem prostredı pomocı NaBH3CN zavzniku produktu 15, pricemz hydridovy anion pristupoval ze stericky mene narocne strany.Latka 15 byla vystavena pusobenı vodıku v prıtomnosti hydroxidu palladnateho jako kat-alyzatoru za vzniku latky 16. Nasledne byla zmenena konfigurace na stereogennım centru ne-soucım sekundarnı OH skupinu. Sloucenina 16 byla pomocı Dessova-Martinova cinidla (DMP)

9

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

konvertovana na latku 17 a ta nasledne pomocı LiAlH(OtBu)3 na slouceninu 18. Ta po reakcis anhydridem kyseliny octove poskytla slouceninu 19.

N

N

CH3O

CH3 CO2CH3

OBn

Et

OMOMO

O

H

14

N

N

CH3O

CH3 CO2CH3

OAc

Et

OMOMO

OH

H

19

1415 15

1616

1717

1818

C27H36N2O9C32H38N2O8

Mr = 490,55 Mr = 490,55

14) 2 ekv. NaBH3CN, 10 % AcOH-iPrOH, 55 % po dvou krocıch; 15) H2, Pd(OH)2, 91 %; 16)DMP, pyridin,CH2Cl2, 0 ◦C, 76 %; 17) LiAlH(OtBu)3, 0 ◦C, 87 %; 18) Ac2O, DMAP, pyridin.95 %.

Ukol 10: Napiste mechanismus redukce latky 14, inspirovat by vas mohla Borchova reduktivnıaminace.

Ukol 11: Pokuste se vysvetlit, proc doslo pri transformaci latky 16 na 18 ke zmene konfiguracestereogennıho centra.

Vystavenı slouceniny 19 MeOTf a nasledne NaBH4 melo za nasledek redukci amidu na amin21. Ten byl pusobenım kyseliny chlorovodıkove premenen na latku 22, ktera po Parikhove--Doeringove oxidaci poskytla nestabilnı latku 23, ktera podleha pri styku se silikagelem (SiO2)a Et3N (pokus o purifikaci pomocı sloupcove chromatografie) cyklizaci na latku 24.

N

N

CH3O

CH3 CO2CH3

OAc

Et

OMOMO

OH

H

19

N

N

CH3O

CH3 CO2CH3

OAc

EtO

H

OH

24

19 20 2021

2122

2223

23

C27H36N2O9C25H32N2O7

C25H32N2O7

19) MeOTf, 2,6-di-terc-butylpyridin, 25 ◦C; 20) NaBH4, 96 % po dvou krocıch; 21) HCl, 25 ◦C,85 %; 22) 3 ekv. SO3-py, 3 ekv. Et3N, CH2Cl2/DMSO; 23) SiO2, Et3N, 85 %.

Ukol 12: Pokuste se navrhnout mechanismus transformace latky 23 na latku 24. Transformacezahrnuje dve tautomerizace. Ktere?

Tosylace latky 24 a jejı vystavenı octanu sodnemu ve smesi dioxan-voda melo za nasledekexpanzi peticlenneho kruhu za vzniku ketonu 26. Synteza byla zavrsena redukcı karbonylu,cehoz bylo dosazeno jeho reakcı s l-selectridem za vzniku slouceniny 27, ktera po Mitsunobuoveaktivaci za absence pridaneho nukleofilu poskytla finalnı latku 28.

N

N

CH3O

CH3 CO2CH3

OAc

EtOH

H

28

N

N

CH3O

CH3 CO2CH3

OAc

EtO

H

OH

24

2425

2526

2627

27

C25H32N2O7

C25H32N2O7

C25H32N2O6

10

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

24) TsCl, DMAP, Et3N, 93 %; 25) NaOAc, dioxan-H2O, 70 ◦C, 61 %; 26) l-selectride, THF,−78 ◦C, 91 %; 27) Ph3P-DEAD, 75 %.

Ukol 13: Doplnte strukturnı vzorce latek 1 az 28.

11

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

D3 – NMR spektroskopie biomolekul

Autor: Radovan Fiala (e-mail: fiala@chemi.muni.cz) 14 bodu

V teto uloze se podıvame, jak se NMR spektroskopie vyuzıva pri studiu proteinu a nukleovychkyselin. NMR spektroskopie je velmi vhodna metoda pro studium biomolekul, protoze dovolujezkoumat jejich strukturu, dynamiku a interakce v jejich prirozenem prostredı – vodnem roztoku.Zpravidla se zde nejedna o analyzu nezname latky, nybrz o zkoumanı 3D struktury (prostorovehorozlozenı atomu) v oligonukleotidu, proteinu nebo jeho funkcnı casti o znamem slozenı. Vetsinouse jedna o konstrukty pripravene v laboratori chemickymi ci biochemickymi metodami, castoobohacene izotopy 13C a 15N, ktere majı z hlediska NMR spektroskopie vyhodne vlastnosti. Kom-pletnı resenı struktury proteinu pomocı NMR je pomerne zdlouhavy a narocny proces vyzadujıcıprıpravu vzorku, nalezenı vhodnych experimentalnıch podmınek, merenı a vyhodnocenı nekolikatypu spekter a vypocet struktury pomocı metod molekulovy dynamiky s vyuzitım experimentalnıchdat. Takove studie casto byvajı naplnı doktorskych disertacnıch pracı. My si zde budeme klastskromnejsı cıle. Podıvame se na spektra, pomocı nichz se kontroluje, zda je vzorek ke studiustruktury vubec vhodny, tedy zejmena zda je prıslusny protein nebo nukleova kyselina do nejakejasne definovane struktury vubec poskladan(a).

Nez se do toho pustıme, zopakujte si zakladnı principy stavby molekul proteinu a nukleovychkyselin. Zejmena si ujasnete vzorce jednotlivych aminokyselin a nukleotidu, rozdıly v chemickemslozenı mezi DNA a RNA, cıslovanı ci znacenı jednotlivych atomu v cukrech a bazıch nukleotidu aaminokyselinach, parovanı bazı v nukleovych kyselinach a vytvarejı peptidicke vazby v proteinech.

Spektra nukleovych kyselin

Kvalitu vzorku oligonukleotidu muzeme posoudit z jednoducheho jednodimenzionalnıho spek-tra 1H mereneho ve vodnem roztoku.Poznamka: Vzhledem k tomu, ze koncentrace oligonukleotidu je zpravidla radove na urovni 1 mMa koncentrace vodıku ve vode je vıce nez 100 M, signaly z nukleove kyseliny by vedle signalu vodynebyly ve spektru merenem standardnım zpusobem vubec videt. Je proto nutne pouzıt nekterouz metod potlacenı signalu rozpoustedla. V prıpade zde uvadenych spekter to byla metoda selektivnıexcitace, pri ktere se oblast blızko rezonancnı frekvence vody kolem 4,7 ppm neozaruje. V taktomerenych spektrech je potom oblast signalu vody jakoby vymazana.

Ruzne skupiny atomu v molekule majı svoje charakteristicke chemicke posuny, naprıkladvodıky iminove skupiny vazane ve vodıkovych vazbach v parech Watson-Crickova typu majıchemicky posun mezi 12 a 14 ppm (podrobneji viz Tabulka 1 ve studijnıch materialech). Pouhymspocıtanım signalu v charakteristickych oblastech tedy muzeme zjistit, zda slozenı nami prip-raveneho oligonukeotidu odpovıda nasemu zameru a zda se v roztoku nachazı v jedne dobredefinovane forme.

Ukol 1: Na Obrazku 1 jsou dve spektra. S pomocı charakteristickych chemickych posunuv Tabulce 1 rozhodnete, ktere z nich je spektrum DNA a ktere RNA. Odpoved’ zduvodnete.Upozornenı: ve spektru B jsou v oblasti priblizne 1 az 3,5 ppm signaly od necistot a nızkomole-kularnıch zbytku po synteze, oznacene X nebo *. Tyto signaly ignorujte.

12

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Obr. 1: 1H NMR spektra DNA a RNA.

Na Obrazku 2 jsou spektra imino oblastı dvou oligonukleotidu DNA tvorıcıch duplexy. Jedenz nich je tzv. Dickerson-Drew dodekamer

CGCGAATTCGCG

GCGCTTAAGCGC

a druhy ma sekvenci

TCTTGTGTTCT

AGAACACAAGA

Ukol 2: Rozhodnete, ktere spektrum prıslusı ktere sekvenci, a vysledek zduvodnete. Ruznypomer signal/sum ve spektrech je dan koncentracı vzorku prıpadne delkou merenı a nema provase rozhodovanı zadny vyznam.

Pri rozhodovanı vezmete v uvahu, ze

• V prıpade selfkomplementarnı sekvence (tj. oba retezce jsou stejne a bezı v opacnem smeru)jsou spektra obou retezcu z duvodu symetrie stejna a ve spektru vidıme pocet signaluodpovıdajıcı jednomu retezci.

13

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

• Koncove pary se mohou otvırat a jejich imino vodıky mohou podlehat vymenne reakcis vodou, takze jejich signaly nemusı byt pozorovatelne. Signaly vodıku iminove skupinyv guaninu se zpravidla nachazejı v oblasti 12 az 13 ppm a imino vodıku thyminu v oblasti13 az 14 pm.

Obr. 2: 1H NMR spektra oligonukleotidu DNA, ukazujıcı oblast atomu vodıku v iminovychskupinach ucastnıcıch se parovanı bazı

Spektra proteinu

Vzhledem k mnozstvı signalu ve spektrech proteinu a relativnı snadnosti prıpravy vzorkuobohacenych isotopem 15N se zpravidla i bezna kontrola vzorku proteinu provadı na zakladedvojdimenzionalnıch spekter, nejcasteji 1H-15N HSQC (heteronuklearnı jednokvantova korelace1H-15N). Oblast amidu peptidicke patere, typicky mezi 6 az 11 ppm pro 1H a 100 az 133 ppmpro 15N, je natolik charakteristicka, ze se povazuje za jakysi

”otisk prstu“ prıslusneho proteinu.

Dvoudimenzionalnı NMR spektra jsou zalozena na prenosu polarizace, pri kterem je energieprenesena ze spinu jednoho jadra na jine jadro. Ve spektru se pak objevı signal, ktery machemicky posun prvnıho jadra v jedne dimenzi a druheho jadra v druhe dimenzi. Mechanismusprenosu polarizace zalezı na usporadanı merenı, nejcasteji se prenos provadı prostrednictvımchemicke vazby mezi atomy nebo na zaklade vzajemne prostorove blızkosti jader. V obou typechspekter, ktere zde pouzijeme, se vyuzıva prenos polarizace prostrednictvım chemicke vazby.

14

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Naprıklad, jestlize ve zmınenem 1H-15N HSQC bude signal pri 8,0 ppm na ose 1H a 120,0 ppm naose 15N, znamena to, ze atom vodıku jiste aminokyseliny s chemickym posunem 8 ppm je vazanna atom dusıku teze aminokyseliny s chemickym posunem 120 ppm. Spektra se zobrazujı pomocıvrstevnicoveho zobrazenı, tedy signaly ve spektru jsou vykresleny podobne jako kopce na mape.I kdyz 1H-15N HSQC spektrum zdaleka nestacı ke zjistenı 3D struktury proteinu, je dobrymindikatorem, zda protein jednoznacne definovanou strukturu vytvarı. Srovnejte spektrum dobrestrukturovaneho proteinu na Obrazku 3A se spektrem proteinu, jehoz vetsı cast je neusporadanana Obrazku 4.

Ukol 3: Ubiquitin je prıkladem proteinu, ktery lze snadno studovat pomocı NMR spek-troskopie. V literature nebo na internetu vyhledejte sekvenci aminokyselin lidskeho ubiquit-inu (human ubiquitin). Spoctete zastoupenı jednotlivych aminokyselin v sekvenci. Vysledekusporadejte do tabulky, v ktere uvedete jak jednopısmenove tak trıpısmenove kody aminoky-selin.Tip: Praci si muzete ulehcit vyuzitım webove aplikace ExPASy na adrese:http://web.expasy.org/protparam/

Ukol 4: Na Obr. 3A a 3B jsou 1H-15N HSQC a 13C-15N CON spektra ubiquitinu. Spektrum 1H-15N HSQC jsme popsali vyse, spektrum 13C-15N CON predstavuje korelaci chemickeho posunukarbonyloveho uhlıku jedne aminokyseliny s chemickym posunem dusıku nasledujıcı aminoky-seliny v retezci, tedy dvou atomu, spojenych peptidickou vazbou. S pomocı tabulky charakteri-stickych chemickych posunu v proteinech (Tabulka 2, kterou naleznete ve studijnıch materialech)spoctete, kolik signalu teoreticky ocekavate ve zobrazenych spektrech. Nezapomente, ze nektereaminokyseliny majı atomy dusıku i v postrannıch retezcıch a pokud se zde vyskytnou skupinyN-H a C-N ve vhodnem rozsahu chemickych posunu, ve spektrech se jejich signaly rovnez objevı.Vypocet doplnte komentarem objasnujıcım vas postup. Pri porovnanı spekter 1H-15N HSQC a13C-15N CON je napadne, ze ve spektru CON jsou tri signaly pri chemickych posunech 15N mezi132 a 136 ppm, zatımco ve spektru HSQC v teto oblasti zadne signaly nejsou. Vysvetlete, proctomu tak je.

Rozsahy chemickych posunu zobrazenych spekter jsou 6 az 10 ppm pro 1H, 168 az 182 ppmpro 13C a 100 az 136 ppm pro 15N.

Poznamky: Spektra na Obrazcıch 3 majı spıse ilustrativnı charakter. Bez moznosti pracovat prımos namerenymi daty a interaktivne menit prah zobrazenı se vam nepodarı dohledat vsechny teo-reticky predpovezene signaly.Podrobnejsı tabulky chemickych posunu lze najıt na strankach Biological Magnetic ResonanceData Bank:http://www.bmrb.wisc.edu/ref info/statful.htm#15.

15

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Obr. 3A: Dvoudimenzionalnı 1H-15N HSQC spektrum ubiquitinu

Obr. 3B: Dvoudimenzionalnı 13C-15N CON spektrum ubiquitinu

16

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Obr. 4: Prıklad 1H-15N HSQC spektra proteinu, jehoz prevazna cast je neusporadana

Ukol 5: V ukolu 2 ulohy D1 (druha serie) jsme si na vlastnostech Fourierovy transformaceukazali, jak se nam zobrazı signaly vne mereneho rozsahu frekvencı. V ubiquitinu ma jedenze signalu z bocnıho retezce argininu chemicky posun dusıku 76,7 ppm. Pri kterem chemickemposunu dusıku by se nam tento signal zobrazil ve spektru merenem s rozsahem frekvencı dusıku36 ppm a stredem na 118 ppm?

17

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Z4 – Pohadka o jaderne ponorce (ctvrta doplnkova uloha)

Autori: Tomas Fiala (e-mail: tom.fiala90@gmail.com) 10 boduLukas Mikulu (e-mail: lukas.mikulu@seznam.cz)

<vtipny uvod> Bylo, nebylo, v Severnım ledovem oceanu si plaval pod hladinou 7 metru siroky,9 metru vysoky a 114 metru dlouhy doutnık s rudou hvezdou na cele. Nebyl to jen tak obycejnydoutnık. Normalnı doutnık totiz spaluje tabak a muze byt vykouren. Tenhle doutnık ale spalovaluran a nemel byt vykouren, nybrz mel vykourit Americany. Vıtejte na palube sovetske jaderneponorky K-19! O teto ponorce byl natocen hollywoodsky film K-19: Stroj na Smrt. Doporucujemezhlednout jako studijnı material k teto uloze. My jsme ten film sice nevideli, ale pry je dobry,tak nam pak o nem budete vypravet. </vtipny uvod>.

V teto uloze bude spousta aproximacı a z nich vychazejıcıch vypoctu. Mozna nekterı z vasbudou mıt pocit, ze je uloha az moc fyzikalnı. . . Ano, je. Kyskys.

”Desatnıku, probıha spotreba zasob kyslıku podle planu?“

”Bez obav, soudruhu kapitane. Plan plnıme na 125 %!“

1. Cukr zahreje. . .

Predstavte si prumerneho sovetskeho namornıka. Nase prvnı aproximace bude, ze se vsichnisovetstı namornıci jmenujı Ivan. Kazdy takovy Ivan se vyznacuje tım, ze zere a dycha potrebujeke svemu zivotu potravu a kyslık. Posadka nası ponorky K-19 cıta celkem 125 Ivanu (0,125 kilo-Ivan). Jak jiste uznate, uzivit takove mnozstvı lidu uvnitr uzavrene kovove trubky nenı logistickyzanedbatelny problem. Navıc, kdyz hlavnım ucelem ponorky je dorucovanı atomovych hlavic dovlastnıch rukou, a ne lazensky ozdravny pobyt pro posadku.

Nynı zadrzme dech a ponorme se do nekonecnych hlubin aproximativnıch vypoctu.Pro zacatek pojd’me predstırat, ze vsechno, co clovek potrebuje prijımat v potrave, je pouze

energie, a ne zadne vitamıny, mineraly a podobne”zbytecnosti“. Dıky teto aproximaci by stacilo

krmit nase Ivany pouze glukosou.Pravdepodobne je vam znama rovnice popisujıcı dychanı, kdy je glukosa oxidovana kyslıkem

na vodu a oxid uhlicity. My glukosu z chut’ovych duvodu nahradıme sacharosou.

C12H22O11 + O2 −→ H2O + CO2

Ukol 1: Vycıslete rovnici drzıcı Ivany pri zivote.

Dale predpokladejme, ze sluzba na jaderne ponorce nenı sedave zamestnanı. Jak jsme sedozvedeli na strance www.obezita.cz, aktivnı muz spotrebuje denne asi 2800 kcal.

Ukol 2: Kolik tun kuchynskeho cukru by bylo treba pro vyzivovanı teto 125clenne posadky podobu 60 dnı? Bez dalsıch aproximacı jen dodavame, ze spalne teplo sacharozy je 5640 kJ mol−1.

Zatımco kyslık se na ponorce zıskava elektrolyzou vody (a tu si rozhodne ponorka nemusıbrat s sebou), vydechovany oxid uhlicity je treba odstranovat jinym zpusobem. Pro tyto ucelyje vhodne pouzıt latky, ktere reagujı se vzdusnym oxidem uhlicitym. Jako prıklady si uved’meoxid vapenaty, vodny roztok ethanolaminu a peroxid lithny.

Ukol 3: Napiste a vycıslete rovnice uvedenych lapacu s oxidem uhlicitym.

18

Zadanı 4. serie (5. rocnık)

Ukol 4: Ktera ze zmınenych latek ma nejvyhodnejsı pomer hmotnost lapace/hmotnost vychy-taneho CO2?

Ukol 5: Jake mnozstvı teto latky je treba nalozit na ponorku, aby pochytala veskery vydychanyCO2? Pri vypoctu vychazejte z mnozstvı cukernych zasob na palube (Ukol 2). Pokud se vamtento ukol nepodarilo vyresit, uvazujte mnozstvı 2,67 t.

Operator jaderneho reaktoru, porucık Ivan Ponorkovic Podvodenko se zasmusile podıval nastrop a uvedomil si, ze jeho predstava o vodotesne ponorce ma vazne trhliny. . .

2. . . . ale uran je uran

Jaderna ponorka se nazyva jadernou ne snad proto, ze nese na palube jaderne hlavice, aleproto, ze ve svych utrobach skryva atomovy reaktor. Zdrojem energie v tomto reaktoru je stepenıjadra 235U. Z jednoho atomu uranu-235 je mozne stepenım zıskat energii 193,4 MeV.

Ukol 6: Jak je definovan 1 elektronvolt?

Proc je vyhodne pohanet ponorku jadernym reaktorem? Obrovska vyhoda pouzitı uranuspocıva v jeho energeticke hustote. Tato velicina je dulezitym parametrem pro srovnavanı jed-notlivych druhu paliv. Je definovana jako mnozstvı energie vyprodukovatelne jednotkou hmot-nosti (nekdy tez objemu) paliva. Obvykle se udava v jednotkach MJ na kilogram nebo litr. Napr.bezny automobilovy benzın ma energetickou hustotu asi 44,4 MJ kg−1 (32,4 MJ l−1).

Pokud ma ponorka zustat dostatecne ucinnou a neodhalitelnou zbranı, potrebuje byt podlouhou dobu nezavisla na doplnovanı paliva na pevninske zakladne. V prıpade pouzitı kla-sickeho ropneho paliva by potrebovala bud’ neumerne velke palivove nadrze, nebo cerpacı stanicena dne more. A hlavne spoustu kyslıku nutneho pro spalovanı paliva. Oba tyto problemy resıprave reaktor s palivem o velke energeticke hustote, ktery navıc dulezity kyslık klidne prenechaposadce.

Nase K-19 ma na palube dva tlakovodnı jaderne reaktory, kazdy o vykonu 70 MW. Chceme-li,aby ponorka fungovala bez doplnenı paliva 3 roky, musıme nalozit 2,5 t obohaceneho uranu.

Ukol 7: Na jake hmotnostnı procento byl palivovy uran obohacen o izotop 235? Uvazujte, zepalivo je smesı izotopu U-238 a U-235 a ucinnost premeny jaderne energie na praci je 33 %.

Nynı si predstavme, ze bychom mısto uranu chteli pro pohon pouzıt lithiove baterie. No toby dopadlo. . .

Ukol 8: Vezmete nejakou svoji lithiovou baterii a stanovte jejı hmotnost [poslete foto(video)do-kumentaci]. Kolik takovych bateriı byste museli nalozit na ponorku, aby nahradily jadernyreaktor po dobu 3 let? Jakou by mely celkovou hmotnost? Uvazujte, ze energeticka hustotaLi-baterie (vcetne te vası zvazene, i kterekoliv jine) je 1,8 MJ kg−1.

I plavali si Ivanci vesele ve svem plechovem doutnıku. A uran? Ten se stepil dal a dal. A jestlise vsechen nerozstepil, tak se stepı dodnes.

19

. 3.

. 3.

. 3.

. 3.

. 3.

. 3.

. 3.

. 3.

. 3.

soutez InterSoB porádáMasarykova univerzita

Interdisciplinární týmová soutezv centru Brna urcená pro všechny

stredoškoláky, sobota 21. 3. 2015

ˇˇˇ

ˇ

Registruj svuj tým do 16. 3.na intersob.math.muni.cz

InterSoB 2015( 9. rocník INTElektuálne Radostné SOBoty )