Valeria Losasso

German Research School for Simulation Sciences GmbHJuumllich Germany

Parkinsonrsquos disease (PD)Parkinsonrsquos disease (PD)bull Fatal neurodegenerative movement disorder affecting an estimated four million people worldwide bull Loss of the neuromelanine expressing dopamine (DOP) neurons in the substantia nigra pars compacta

Polymeropoulos MK et al Science (1997)

Diagnostic features

bull Tremorbull Rigiditybull Akinesia and bradykinesiabull Postural instability

bull Deposition of Lewy bodies

Spillantini MG et al Nature 1997

bull Major components aggregates of alpha-synuclein (-syn) protein

Cookson MR Annu Rev Biochem 2005

Parkinsonrsquos disease (PD)Parkinsonrsquos disease (PD)

N-terminal NAC C-terminal

Alpha synucleinAlpha synucleinbull Unstructured protein

Uversky VN et al Annu Rev Biophys 2008

Soto C et al Nat Rev Neurosci 2003

Partially folded intermediates

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

PD pathogenesisPD pathogenesis

Soto C et al Nat Rev Neurosci 2003

x

x

Bisaglia M et al J Biol Chem 2007

Structural basis of the inhibitionStructural basis of the inhibition

Herrera FE et al Plos ONE 2008

Molecular dynamics (MD) simulations based on α-synrsquos nuclear magnetic resonance (NMR) structural ensemble

bull nonspecific hydrophobic contacts between dopamine (DOP) and its oxidation derivatives with the C-terminal (125YEMPS129 region)

bull long-range electrostatic interactions with residues in the NAC region which are involved in the fibrillization process (E83)

Conway KA et al Science 2001Norris EH et al J Biol Chem

2005

Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structureactivity relationships

Bostrom J et al J Med Chem 2006

Screening of ligands structurally and electrostatically

similar to DOP

Study of their binding to a-synuclein through MD simulations

Aim of the workAim of the work

NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE)Vendruscolo M personal communicationDedmon MM et al J Am Chem Soc 2005

-Cluster analysis (Micheletti C et al Proteins 2000) 6 representative structures

Ligandinfo database (von Grotthuss et al Comb Chem High Throughput Screen 2004)

60 molecules selected(10 for DOP and each derivative)

Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T IBM Internal Report 1957)

5 commercially available ligands

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

6 representative structures

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

Docking30 adducts with new ligands

+

36 adducts with DOP and its oxidizedproducts(Morris et al J Comp Chem 1998)

Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Parkinsonrsquos disease (PD)
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• Alpha synuclein
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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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Parkinsonrsquos disease (PD)Parkinsonrsquos disease (PD)bull Fatal neurodegenerative movement disorder affecting an estimated four million people worldwide bull Loss of the neuromelanine expressing dopamine (DOP) neurons in the substantia nigra pars compacta

Polymeropoulos MK et al Science (1997)

Diagnostic features

bull Tremorbull Rigiditybull Akinesia and bradykinesiabull Postural instability

bull Deposition of Lewy bodies

Spillantini MG et al Nature 1997

bull Major components aggregates of alpha-synuclein (-syn) protein

Cookson MR Annu Rev Biochem 2005

Parkinsonrsquos disease (PD)Parkinsonrsquos disease (PD)

N-terminal NAC C-terminal

Alpha synucleinAlpha synucleinbull Unstructured protein

Uversky VN et al Annu Rev Biophys 2008

Soto C et al Nat Rev Neurosci 2003

Partially folded intermediates

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

PD pathogenesisPD pathogenesis

Soto C et al Nat Rev Neurosci 2003

x

x

Bisaglia M et al J Biol Chem 2007

Structural basis of the inhibitionStructural basis of the inhibition

Herrera FE et al Plos ONE 2008

Molecular dynamics (MD) simulations based on α-synrsquos nuclear magnetic resonance (NMR) structural ensemble

bull nonspecific hydrophobic contacts between dopamine (DOP) and its oxidation derivatives with the C-terminal (125YEMPS129 region)

bull long-range electrostatic interactions with residues in the NAC region which are involved in the fibrillization process (E83)

Conway KA et al Science 2001Norris EH et al J Biol Chem

2005

Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structureactivity relationships

Bostrom J et al J Med Chem 2006

Screening of ligands structurally and electrostatically

similar to DOP

Study of their binding to a-synuclein through MD simulations

Aim of the workAim of the work

NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE)Vendruscolo M personal communicationDedmon MM et al J Am Chem Soc 2005

-Cluster analysis (Micheletti C et al Proteins 2000) 6 representative structures

Ligandinfo database (von Grotthuss et al Comb Chem High Throughput Screen 2004)

60 molecules selected(10 for DOP and each derivative)

Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T IBM Internal Report 1957)

5 commercially available ligands

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

6 representative structures

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

Docking30 adducts with new ligands

+

36 adducts with DOP and its oxidizedproducts(Morris et al J Comp Chem 1998)

Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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bull Deposition of Lewy bodies

Spillantini MG et al Nature 1997

bull Major components aggregates of alpha-synuclein (-syn) protein

Cookson MR Annu Rev Biochem 2005

Parkinsonrsquos disease (PD)Parkinsonrsquos disease (PD)

N-terminal NAC C-terminal

Alpha synucleinAlpha synucleinbull Unstructured protein

Uversky VN et al Annu Rev Biophys 2008

Soto C et al Nat Rev Neurosci 2003

Partially folded intermediates

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

PD pathogenesisPD pathogenesis

Soto C et al Nat Rev Neurosci 2003

x

x

Bisaglia M et al J Biol Chem 2007

Structural basis of the inhibitionStructural basis of the inhibition

Herrera FE et al Plos ONE 2008

Molecular dynamics (MD) simulations based on α-synrsquos nuclear magnetic resonance (NMR) structural ensemble

bull nonspecific hydrophobic contacts between dopamine (DOP) and its oxidation derivatives with the C-terminal (125YEMPS129 region)

bull long-range electrostatic interactions with residues in the NAC region which are involved in the fibrillization process (E83)

Conway KA et al Science 2001Norris EH et al J Biol Chem

2005

Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structureactivity relationships

Bostrom J et al J Med Chem 2006

Screening of ligands structurally and electrostatically

similar to DOP

Study of their binding to a-synuclein through MD simulations

Aim of the workAim of the work

NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE)Vendruscolo M personal communicationDedmon MM et al J Am Chem Soc 2005

-Cluster analysis (Micheletti C et al Proteins 2000) 6 representative structures

Ligandinfo database (von Grotthuss et al Comb Chem High Throughput Screen 2004)

60 molecules selected(10 for DOP and each derivative)

Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T IBM Internal Report 1957)

5 commercially available ligands

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

6 representative structures

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

Docking30 adducts with new ligands

+

36 adducts with DOP and its oxidizedproducts(Morris et al J Comp Chem 1998)

Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Parkinsonrsquos disease (PD)
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• Alpha synuclein
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Alpha synucleinAlpha synucleinbull Unstructured protein

Uversky VN et al Annu Rev Biophys 2008

Soto C et al Nat Rev Neurosci 2003

Partially folded intermediates

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

PD pathogenesisPD pathogenesis

Soto C et al Nat Rev Neurosci 2003

x

x

Bisaglia M et al J Biol Chem 2007

Structural basis of the inhibitionStructural basis of the inhibition

Herrera FE et al Plos ONE 2008

Molecular dynamics (MD) simulations based on α-synrsquos nuclear magnetic resonance (NMR) structural ensemble

bull nonspecific hydrophobic contacts between dopamine (DOP) and its oxidation derivatives with the C-terminal (125YEMPS129 region)

bull long-range electrostatic interactions with residues in the NAC region which are involved in the fibrillization process (E83)

Conway KA et al Science 2001Norris EH et al J Biol Chem

2005

Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structureactivity relationships

Bostrom J et al J Med Chem 2006

Screening of ligands structurally and electrostatically

similar to DOP

Study of their binding to a-synuclein through MD simulations

Aim of the workAim of the work

NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE)Vendruscolo M personal communicationDedmon MM et al J Am Chem Soc 2005

-Cluster analysis (Micheletti C et al Proteins 2000) 6 representative structures

Ligandinfo database (von Grotthuss et al Comb Chem High Throughput Screen 2004)

60 molecules selected(10 for DOP and each derivative)

Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T IBM Internal Report 1957)

5 commercially available ligands

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

6 representative structures

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

Docking30 adducts with new ligands

+

36 adducts with DOP and its oxidizedproducts(Morris et al J Comp Chem 1998)

Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

PD pathogenesisPD pathogenesis

Soto C et al Nat Rev Neurosci 2003

x

x

Bisaglia M et al J Biol Chem 2007

Structural basis of the inhibitionStructural basis of the inhibition

Herrera FE et al Plos ONE 2008

Molecular dynamics (MD) simulations based on α-synrsquos nuclear magnetic resonance (NMR) structural ensemble

bull nonspecific hydrophobic contacts between dopamine (DOP) and its oxidation derivatives with the C-terminal (125YEMPS129 region)

bull long-range electrostatic interactions with residues in the NAC region which are involved in the fibrillization process (E83)

Conway KA et al Science 2001Norris EH et al J Biol Chem

2005

Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structureactivity relationships

Bostrom J et al J Med Chem 2006

Screening of ligands structurally and electrostatically

similar to DOP

Study of their binding to a-synuclein through MD simulations

Aim of the workAim of the work

NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE)Vendruscolo M personal communicationDedmon MM et al J Am Chem Soc 2005

-Cluster analysis (Micheletti C et al Proteins 2000) 6 representative structures

Ligandinfo database (von Grotthuss et al Comb Chem High Throughput Screen 2004)

60 molecules selected(10 for DOP and each derivative)

Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T IBM Internal Report 1957)

5 commercially available ligands

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

6 representative structures

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

Docking30 adducts with new ligands

+

36 adducts with DOP and its oxidizedproducts(Morris et al J Comp Chem 1998)

Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Parkinsonrsquos disease (PD)
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• Alpha synuclein
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PD pathogenesisPD pathogenesis

Soto C et al Nat Rev Neurosci 2003

x

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Bisaglia M et al J Biol Chem 2007

Structural basis of the inhibitionStructural basis of the inhibition

Herrera FE et al Plos ONE 2008

Molecular dynamics (MD) simulations based on α-synrsquos nuclear magnetic resonance (NMR) structural ensemble

bull nonspecific hydrophobic contacts between dopamine (DOP) and its oxidation derivatives with the C-terminal (125YEMPS129 region)

bull long-range electrostatic interactions with residues in the NAC region which are involved in the fibrillization process (E83)

Conway KA et al Science 2001Norris EH et al J Biol Chem

2005

Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structureactivity relationships

Bostrom J et al J Med Chem 2006

Screening of ligands structurally and electrostatically

similar to DOP

Study of their binding to a-synuclein through MD simulations

Aim of the workAim of the work

NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE)Vendruscolo M personal communicationDedmon MM et al J Am Chem Soc 2005

-Cluster analysis (Micheletti C et al Proteins 2000) 6 representative structures

Ligandinfo database (von Grotthuss et al Comb Chem High Throughput Screen 2004)

60 molecules selected(10 for DOP and each derivative)

Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T IBM Internal Report 1957)

5 commercially available ligands

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

6 representative structures

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

Docking30 adducts with new ligands

+

36 adducts with DOP and its oxidizedproducts(Morris et al J Comp Chem 1998)

Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

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NG

AY

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Polymeropoulos MH et al Science 1997

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3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

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Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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Molecular dynamics (MD) simulations based on α-synrsquos nuclear magnetic resonance (NMR) structural ensemble

bull nonspecific hydrophobic contacts between dopamine (DOP) and its oxidation derivatives with the C-terminal (125YEMPS129 region)

bull long-range electrostatic interactions with residues in the NAC region which are involved in the fibrillization process (E83)

Conway KA et al Science 2001Norris EH et al J Biol Chem

2005

Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structureactivity relationships

Bostrom J et al J Med Chem 2006

Screening of ligands structurally and electrostatically

similar to DOP

Study of their binding to a-synuclein through MD simulations

Aim of the workAim of the work

NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE)Vendruscolo M personal communicationDedmon MM et al J Am Chem Soc 2005

-Cluster analysis (Micheletti C et al Proteins 2000) 6 representative structures

Ligandinfo database (von Grotthuss et al Comb Chem High Throughput Screen 2004)

60 molecules selected(10 for DOP and each derivative)

Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T IBM Internal Report 1957)

5 commercially available ligands

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

6 representative structures

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

Docking30 adducts with new ligands

+

36 adducts with DOP and its oxidizedproducts(Morris et al J Comp Chem 1998)

Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

• Slide 1
• Parkinsonrsquos disease (PD)
• Slide 3
• Alpha synuclein
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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structureactivity relationships

Bostrom J et al J Med Chem 2006

Screening of ligands structurally and electrostatically

similar to DOP

Study of their binding to a-synuclein through MD simulations

Aim of the workAim of the work

NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE)Vendruscolo M personal communicationDedmon MM et al J Am Chem Soc 2005

-Cluster analysis (Micheletti C et al Proteins 2000) 6 representative structures

Ligandinfo database (von Grotthuss et al Comb Chem High Throughput Screen 2004)

60 molecules selected(10 for DOP and each derivative)

Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T IBM Internal Report 1957)

5 commercially available ligands

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

6 representative structures

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

Docking30 adducts with new ligands

+

36 adducts with DOP and its oxidizedproducts(Morris et al J Comp Chem 1998)

Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

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AY

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Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Parkinsonrsquos disease (PD)
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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE)Vendruscolo M personal communicationDedmon MM et al J Am Chem Soc 2005

-Cluster analysis (Micheletti C et al Proteins 2000) 6 representative structures

Ligandinfo database (von Grotthuss et al Comb Chem High Throughput Screen 2004)

60 molecules selected(10 for DOP and each derivative)

Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T IBM Internal Report 1957)

5 commercially available ligands

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

6 representative structures

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

Docking30 adducts with new ligands

+

36 adducts with DOP and its oxidizedproducts(Morris et al J Comp Chem 1998)

Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

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bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

• Slide 1
• Parkinsonrsquos disease (PD)
• Slide 3
• Alpha synuclein
• Slide 5
• Slide 6
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• Slide 19
• Alpha synuclein ndash isoform D2
• Slide 21
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• Slide 38

6 representative structures

bull Initial protein structures

bull Ligand selection

MethodsMethods

Docking30 adducts with new ligands

+

36 adducts with DOP and its oxidizedproducts(Morris et al J Comp Chem 1998)

Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

• Slide 1
• Parkinsonrsquos disease (PD)
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• Alpha synuclein
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Standard MD setup

bullNAMD codebullAmber force field (parm99dat)bullResp parametrization of ligandsbullTimestep 2 fsbullTIP3P water model with PBCbullNPT ensemble 300 K (1 bar)bullSHAKE algorithmbullParticle Mesh Ewald (10 Aring)bull Atoms ~ 50000

MethodsMethodsbull Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD)

bull Experimental studies ndash in vitro fibrillization essays (G Legname and S Gustincich SISSAISAS Italy)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

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DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

• Slide 1
• Parkinsonrsquos disease (PD)
• Slide 3
• Alpha synuclein
• Slide 5
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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

(Kcalmol)

Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

• Slide 1
• Parkinsonrsquos disease (PD)
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• Alpha synuclein
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Results ndash Molecular DynamicsResults ndash Molecular Dynamics

(Kcalmol)

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Strongest effect on fibrillization Test

in vitro

Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

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Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

• Slide 1
• Parkinsonrsquos disease (PD)
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• Alpha synuclein
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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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Results ndash In vitro fibrillization essayResults ndash In vitro fibrillization essay

No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Parkinsonrsquos disease (PD)
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• Alpha synuclein
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No fibrils only spherical structures

-syn only -syn + DOP

hydroxyindole

4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole

2-amino-4-tertbutylphenol

tyramine -syn only

hydroxyindole

6-aminoindole

bull mature fibrils gt075 m bull intermediate fibrils 05-075 mbull short fibrils (or protofibrils) lt05

m

Results ndash AFM analysis of aggregationResults ndash AFM analysis of aggregation

-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

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Human -syn 140

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Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

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100-140116-140127-140

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Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

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DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Parkinsonrsquos disease (PD)
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-syn alone fibrils in cluster and longer than 075 m

6-aminoindole individual stuctures early stage of fibrillization

5-hydroxyindole cluster of shorter fibrils

Results ndash TEM analysis of aggregationResults ndash TEM analysis of aggregation

5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

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Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

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3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

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MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

• Slide 1
• Parkinsonrsquos disease (PD)
• Slide 3
• Alpha synuclein
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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization

Experimental tests

- Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases

- 6-aminoindole = strongest inhibitory effect

- 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect

- Morfology analysis by AFM different length and distribution

- Ultra-structural analysis for 6-aminoindole

- fibrils more isolated

- after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al 2008)

consistently with MD predictions

ConclusionsConclusions

bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

• Slide 1
• Parkinsonrsquos disease (PD)
• Slide 3
• Alpha synuclein
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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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bull Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs

OverviewOverview

bull Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

(Latawiec D et al PLoS ONE 2010)

Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

• Slide 1
• Parkinsonrsquos disease (PD)
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• Alpha synuclein
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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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Adapted from MacLean PJ et al Neurosci Lett 2002

Known isoformsKnown isoforms

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Mouse -syn

Rat -syn 1

Rat -syn 2

Rat -syn 3

Human -syn 140

Human -syn 126

Human -syn 112

Human -syn 98

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

Polymeropoulos MH et al Science 1997

Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

3 possible peptides

3 possible peptides

100-140116-140127-140

-syn N-term -syn C-term

Empty

Full-length

Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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Alpha synuclein ndash isoform Alpha synuclein ndash isoform 22Lab Prof S Gustincich SISSA

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Structural correlation with full-length alpha-synuclein

Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Parkinsonrsquos disease (PD)
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Chirality index (G)Chirality index (G)Pietropaolo A et al Proteins 2008

dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms

Istantaneous values along MD trajectoriesFlexibility

Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

• Slide 1
• Parkinsonrsquos disease (PD)
• Slide 3
• Alpha synuclein
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Coil states have a chiral natureCoil states have a chiral naturePietropaolo A et al submitted

Coil states absence of correlation among consecutive and dihedralsSmith L et al Fold Des 1996

Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a randomorientation

Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

DNGS

6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Alpha synuclein ndash isoform D2
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Computational procedureComputational procedure

AT

SN

LM

NG

AY

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6 mouse alpha-synuclein conformations

MD 30 nsconformation 180 ns

Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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Results ndash Molecular dynamics (full-length)Results ndash Molecular dynamics (full-length)

RMSD Cluster analysis (10 Aring cutoff)

Chirality index and standard deviation

Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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• Parkinsonrsquos disease (PD)
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• Alpha synuclein
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Results ndash PeptidesResults ndash Peptides

G ndash 60 ns G ndash 120 ns

G ndash 180 ns SD ndash 180 ns

Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

G ndash 180 ns

Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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Discussion Discussion

bull carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A et al Biochemistry 2003)

Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production

bull homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K Acta Neuropathol 2006)

bullRegulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W et al Biochemistry 2004)

Binding to other proteins or cationic compounds

Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility having a protecting role

In progress influence of mutations In progress influence of mutations

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Study of combined mutants A53T +

S87NL100MN103GA107YD121GN122S

In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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In progress ldquoFold factorrdquo In progress ldquoFold factorrdquo Pietropaolo A et al submitted

Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations

Conditional probability

All correlation maps

NGF-TrkA NGF-TrkA

ThanksThanksLab Prof Legname (SISSA)Lab Prof Gustincich (SISSA)

APietropaolo (UniCT)

Prof Carloni (GRS)

bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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bull La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche a partire da unrsquoisoforma di splicing alternativo costituirebbe unrsquoeventualitagrave molto interessante Una delle modifiche post-traduzionali a cui lrsquoα- sinucleina egrave soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allrsquoaggregazione ed alla fibrillazione Murray et al 2003] Lo studio di questa modifica post-traduzionale si egrave sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina quella rimanente al N-terminale ma non si egrave mai indagato sul peptide generato dal taglio Se questo peptide fosse prodotto in vivo si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallrsquoα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lrsquoattivitagrave funzionale del trascritto Δ2 Per poter effettuare questa valutazione si egrave reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lrsquoespressione in cellule eucariotiche pcDNA 30 Allrsquointerno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lrsquoesone due sia quella full length dellrsquoα-sinucleina a partire dal primo esone distale

bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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bull 4312 Lrsquoanalisi per immunofluorescenzaLrsquoindagine per immunofluorescenza oltre a consentire una valutazione qualitativa dellrsquoespressione proteica egrave primariamente finalizzata alla stima dellrsquoefficienza di trasfezione la quale risulta essere allrsquoincirca del 70 con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleinaPer eseguire questa analisi le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 16 μg di DNA Al termine delle 24 ore le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono quindi state incubate con due diversi anticorpi i quali pur essendo entrambi capaci di riconoscere lrsquoα-sinucleina differiscono per la regione di legame Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lrsquoultima parte della proteina un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 424) saragrave in grado di riconoscere sia questo peptide sia la forma FL Se si impiega invece un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 424) solo lrsquoisoforma intera dellrsquoα-sinucleina potragrave essere riconosciutaLe immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allrsquoisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate

bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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bull 4313 Lrsquoanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato si prosegue lrsquoindagine dellrsquoespressione proteica in vitro dellrsquoisoforma di splicing Δ2 mediante Western Blotting Per questo studio sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length Dopo 24 ore dalla trasfezione le cellule sono state lisate ed egrave stato raccolto lrsquoestratto proteico totale con cui egrave stata effettuata lrsquoanalisi di Western BlottingPer visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina egrave stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale La differenza di peso molecolare risulta infatti sufficiente a discriminare tra le due che pesano rispettivamente 17 kDa la forma completa e 46 kDa la variante Δ2Come si osserva in figura 425 solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allrsquoaltezza corrispondente allrsquoisoforma di splicing Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare ad esempio utilizzando gel a gradiente membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalitagrave di blotting nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse

bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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bull In considerazione dellrsquoomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006] si puograve ipotizzare che questo peptide possa svolgere unrsquoattivitagrave simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici in virtugrave del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al 2004]

bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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bull Questa seconda eventualitagrave risulterebbe di grande interesse percheacute potrebbe suggerire per questi peptidi unrsquoattivitagrave simile agli chaperoni in considerazione dellrsquoalta omologia strutturale di questa regione dellrsquoα-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni Egrave stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellrsquoα-sinucleina dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina mancanti proprio dellrsquoestremitagrave C-terminale maggiormente prone al processo fibrillogenico Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione si potrebbe immaginare che lrsquoespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson per lrsquoattenuazione del processo aggregativo dellrsquoα-sinucleina

bull In particular Alanine map [a] shows a high correlation with a strong minimum centered at negative values typical of α helix and in lower extent less positive values Proline residue possesses a spread map [b] showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation The map of methionine recently reported to interplay proteinndashprotein interactions20 shows an extrandashdiagonal peak at [+015 +003] values of chirality index as inferred from Figure 2[c] which is absent in the cysteine map of Figure 2[d]

bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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bull Once all the correlation maps of native chirality are obtained we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures as expressed in the followingkT NGdataset Fold factor = NG 1113089i=1 minuslogP(Gi+1GiAA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 06 Kcalmol at 300 K P(Gi+1Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i with Gi+1 and Gi values in the correlation maps of native chirality Since we are summing energy quantity the probability taken into account are not conditional like those reported in Figure 2 [a]-[d] but normalized as conventional joint probability

bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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bull Random structures of lysozyme instead show high values whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values Supporting its effectiveness the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor comparable to that one of SCOP classes Moreover an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies in accordance with the recent contribution of Liu et al21 The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme which indicates a dynamical but not random conformational ensemble

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