附 录 XI E 细菌内毒素检查法

附录XI E 细菌内毒素检查法

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细

菌 内 毒 素 ，以 判 断 供 试 品 中 细 菌 内毒素的限量是否符合规定

的 一 种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，

后者包括 浊 度 法 和 显 色 基 质 法 。供 试 品 检 测 时 ，可使用其中

任何一种方法进行试验。当 测 定 结 果 有 争 议 时 ，除另有规定

外 ，以凝胶法结果为准。

本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。

细 菌 内 毒 素 的 量 用 内 毒 素 单 位 （E U )表 示 ，1 E U 与 1 个

内毒素国际单位（IU )相 当 。

细 菌 内 毒 素 国 家 标 准 品 系 自 大 肠 埃 希 菌 提 取 精 制 而 成 ，

用 于 标 定 、复 核 、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标

准 品 的 效 价 。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基

准 标 定 其 效 价 ，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及

各 种 阳 性 对 照 。

细 菌 内 毒 素 检 查 用 水 系 指 内 毒 素 含 量 小 于 0.015EU/m l

( 用于凝胶法）或 0. 005EU/mK用 于 光 度 测 定 法 ）且对内毒素

试验无干扰作用的灭菌注射用水。

试 验 所 用 的 器 皿 需 经 处 理 ，以 去 除 可 能 存在的外源性内

毒 素 。耐 热 器 皿 常 用干热灭菌法（250°C、30 分 钟 以 上 ）去 除 ，

也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使

用 塑 料 器 械 ，如 微 孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用

标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

供 试 品 溶 液 的 制 备 某 些 供 试 品 需 进 行 复 溶 、稀释或在

水 性 溶 液 中 浸 提 制 成 供 试 品 溶 液 。一 般 要 求 供 试 品 溶 液 的

p H 值 在 6 .0〜8 .0 的 范 围 内 。对 于 过 酸 、过 碱 或 本身有缓冲

能 力 的 供 试 品 ，需 调 节被测溶液（或其稀释液）的 p H 值 ，可使

用 酸 、碱 溶 液 或 适 宜 的 缓 冲 液 调 节 p H 值 。酸 或 碱 溶液须用

细菌内毒素检査用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液

必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

内 毒 素 限 值 的 确 定 药 品 、生 物 制 品 的 细 菌 内 毒 素 限 值

(X )— 般 按 以 下 公 式 确 定 ：

L = K / M

式 中 L 为供试品的细菌内毒素限值，一 般 以 E U /m l、EU/mg

或 E U /U ( 活性单 位 ）表 示 ；

K 为 人 每 千 克 体 重 每 小 时 最 大 可 接 受 的 内 毒 素 剂 量 ，

以 EU /(kg . h )表 示 ，注 射 剂 K -5 E U /(k g • h) ，放射

性 药 品 注 射 剂 K = 2.5EU /(kg • h ) ，鞘 内 用 注 射 剂

体 重 按 60kg计 算 ，人 体 表 面 积 按 1.62m2 计算。注

射 时 间 若 不 足 1 小 时 ，按 1 小 时 计 算 。供试品每平

方 米 体 表 面 积 剂 量 乘 以 0 .0 2 7 即可转换为每千克

体 重 剂 量 (M ) 。

按人用 剂 量 计 算 限 值 时 ，如遇特殊 情 况 ，可根据生产和临

床用药 实 际 情 况 做 必 要 调 整 ，但 需 说 明 理 由 。

确 定 最 大 有 效 稀 释 倍 数 （M V D ) 最大有效稀释倍数是

指 在 试 验 中 供 试 品 溶 液 被 允 许 达 到 稀 释 的 最 大 倍 数 （1 —

M VD ) ，在 不 超 过 此 稀 释 倍 数 的 浓 度 下 进 行 内 毒 素 限 值 的 检

测 。用 以 下 公 式 来 确 定 M VD:

M V D =cL/A

式 中 L 为 供试品 的 细 菌 内 毒 素 限 值 ；

c 为 供 试 品 溶 液 的 浓 度 ，当 L 以 E U /m l表 示时，则 c 等

于 1. 0 m l/m h当 L 以 E U /m g 或 E U /U 表 示 时 ，c 的

单 位 需 为 m g /m l或 U /m l。如供试品为注射用无菌

粉 末 或 原 料 药 ，则 M V D 取 1 , 可计算供试品的最小

有效稀释浓度

A 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/m l) ，或是在光

度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

方 法 1 凝胶法

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检

测 或半 定 量 内 毒 素 的 方 法 。

鲎 试 剂 灵 敏 度 复 核 试 验 在 本 检 查 法 规 定 的 条 件 下 ，使

鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为當试剂的标示灵敏

度 ，用 E U /m l表 示 。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生

了 任 何 可 能 影 响 检 验 结 果 的 改 变 时 ，应进行鲎试剂灵敏度复

核 试 验 。

根据鲎试剂灵敏度的标示值 (A) ，将细菌内毒素国家标准

品 或 细 菌 内 毒 素 工 作 标 准 品 用 细 菌 内 毒 素 检 查 用 水 溶 解 ，在

旋 涡 混 合 器 上 混 匀 15分 钟 ，然 后 制 成 2A、A、0. 5A和 0. 25A四

个 浓 度 的 内 毒 素 标 准 溶 液 ，每稀释一步均应在旋涡混合器上

混 匀 3 0 秒 钟 。取 分 装 有 0. lm l當 试 剂 溶 液 的 10mmX75mm

试 管 或 复 溶 后 的 0. lm l /支 规 格 的 鲎 试 剂 原 安 瓿 1 8 支 ，其中

16管 分 别 加 入 0. l m l不 同 浓 度 的 内 毒 素 标 准 溶 液 ，每一个内

毒 素 浓 度 平 行 做 4 管 ；另 外 2 管 加 入 0. l m l 细菌内毒素检查

用 水 作 为 阴 性 对 照 。将试管 中 溶 液 轻 轻 混 匀 后 ，封闭管口，垂

直 放 人 37°C±rC的 恒 温 器 中 ，保 温 60分 钟 ±2分 钟 。将 试 管 从 恒 温 器 中 轻 轻 取 出 ，缓 缓 倒 转 180°，若管内形成

凝 胶 ，并 且 凝 胶 不 变 形 、不 从 管 壁 滑 脱 者 为 阳 性 ；未形成凝胶

或 形 成 的 凝 胶 不 坚 实 、变 形 并 从 管 壁 滑 脱 者 为 阴 性 。保温和

拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

当 最 大 浓 度 2A管 均 为 阳 性 ，最 低 浓 度 0.25A管均为阴

性 ，阴 性 对 照 管 为 阴 性 ，试 验 方 为 有 效 。按下式计算反应终点

浓 度 的 几 何 平 均 值 ，即为鲎试剂灵敏度的测定值 (A。）。

K = 0 . 2 E U / ( k g « h) ； Ac = antilg( 2 X / 4)

M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以 式 中 X 为反应终点浓度的对数值（lg)。反应终点浓度是指

m l/(kg • h )、m g/(kg • h )或 U /(k g • h )表示，人均 系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的

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