UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (https://dare.uva.nl)

UvA-DARE (Digital Academic Repository)

HIV-1 in the RNA world: Transcription regulation, miRNAs and antiviral RNAs

Harwig, A.

Publication date2015Document VersionFinal published version

Link to publication

Citation for published version (APA):Harwig, A. (2015). HIV-1 in the RNA world: Transcription regulation, miRNAs and antiviralRNAs.

General rightsIt is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s)and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an opencontent license (like Creative Commons).

Disclaimer/Complaints regulationsIf you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, pleaselet the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the materialinaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letterto: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. Youwill be contacted as soon as possible.

Download date:01 Sep 2021

171

Chapter Eleven 11Addendum:

- Summary - Samenvatting - List of Publications - Author Affiliations - PhD Portfolio - Curriculum Vitae - Dankwoord

172

173

Summary

This thesis consists of three parts that deal with (small) RNAs that are either derived fromviruses, in particular human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), or that can be used totarget viruses. First, we investigated the mechanism of HIV-1 transcription, with specialattention for the role of the TAR hairpin (chapter 2-4). Then we focus on the biosynthesis ofthe TAR-derived microRNAs (miRNAs) (chapter 5-6). Finally, we describe different attemptsto optimize a promising new therapeutic molecule named AgoshRNA, e.g. for anti-HIVtherapy.

Chapter 1 provides an overview of HIV-1 transcription and the RNA interference (RNAi)pathway. This chapter is an introduction on the topics addressed in this thesis. In chapter 2,we review recent findings related to HIV-1 RNA biosynthesis, with a focus on regulatorymechanisms that control initiation of transcription, capping and polyadenylation.Furthermore, we discuss the diversity of HIV-1 derived RNA transcripts, their biosynthesisand proposed functions. Special attention is paid to the viral TAR RNA hairpin motif and wediscuss whether it could encode for a miRNA. Chapter 3 focusses on the viral Tat proteinpartner of TAR. Tat binding to TAR is vital for HIV-1 replication as it enhances transcription,but many additional functions have been attributed to Tat. In this chapter we used a virus inwhich the Tat-TAR transcription mechanism is functionally replaced by the Tet-On gene-expression system (HIV-rtTA). In this HIV-rtTA context, the Tat-TAR axis no longer controlsHIV-1 transcription and we had expected that Tat and TAR could be deleted. Surprisingly, wereport that HIV-rtTA is severely replication-impaired upon inactivation of Tat. Intriguingly,the virus can repair its replication potential by increasing the strength of the viral promoter,which indicates that Tat was still needed for transcriptional activation. We demonstrate thatTat activates HIV-1 transcription not only via TAR binding but also through an interaction withthe Sp1 elements present in the U3 promoter. In chapter 4, we show that microprocessor,which is a component of the RNAi pathway, controls HIV-1 gene expression in an RNAi-independent manner. Using chromatin immunoprecipitation coupled to high-throughputsequencing (ChIP-seq), we describe that microprocessor is recruited to the HIV-1 promoter,whereas Dicer, another important component of the RNAi pathway, is not. Microprocessoris not recruited upon deletion of the TAR element. Knock down of microprocessor enhanced(processive) transcription, resulting in more full-length viral RNAs. These and otherexperiments allowed us to propose a model in which microprocessor-mediated cleavage ofthe nascent TAR RNA leads to recruitment of diverse factors that can trigger RNA polymeraseII pausing and premature termination at the HIV-1 promoter.

The next part of the thesis focuses on retrovirus-encoded miRNAs. Chapter 5 reviews adecade-long discussion whether retroviruses are able to produce miRNAs. This topic has beencontroversial because production of such miRNAs in the canonical miRNA/RNAi pathwaywould lead to cleavage and destruction of the retroviral RNA genome. With the descriptionof non-canonical RNAi pathways, new options became apparent to produce miRNAs withoutdestruction of the viral RNA genome. In this review we discuss recently identified retroviralmiRNAs and their biogenesis route. In chapter 6, we confirm the presence of an HIV-1 TARencoded miRNA and examine its biogenesis in detail. We demonstrate that the miRNAs are

174

derived from short TAR-encoding transcripts that are produced by non-processivetranscription from the HIV-1 promoter. We demonstrate that Dicer is responsible for thecleavage of these short TAR RNAs into miRNAs. Interestingly, Tat has to bind the shorttranscripts to enable Dicer cleavage, which suggests a new regulatory function for Tat. HIV-1thus developed a complex Tat-TAR dependent pathway to synthesize a miRNA using RNApolymerase II mediated transcription initiation and termination coupled to Dicer processing.

The last chapters of this thesis concern the Ago2-mediated short hairpin RNA (AgoshRNA)pathway. In this recently described non-canonical RNAi pathway, relatively short RNA hairpinsare processed into a single guide strand, whereas in the canonical RNAi pathway regularshRNAs are processed into a guide and passenger strand. The guide strand determines thetarget site for RNAi-mediated silencing of gene expression, while a passenger strand maycause undesired side effects in this process. The AgoshRNA pathway does not require Dicercleavage, which means that the AgoshRNAs may remain functional in cell types that do notexpress Dicer. AgoshRNAs could therefore be a promising therapeutic and anti-HIV reagent.Chapter 7 investigates the role of the stem-length of hairpin RNAs and the identity of the topbase pair (bp) in relation to Dicer or Ago2 cleavage. The stem-length of a shRNA/AgoshRNAturns out to be a major determinant for Dicer versus Ago2 processing. Ago2 favors a smallwindow between 17 and 19 bp, whereas larger stems are recognized by Dicer. Substitutionof a regular top bp by a weak G-U wobble bp increases Ago2 processing of some RNAmolecules. This may be caused by partial opening the top of the RNA hairpin, thus affectingthe actual duplex length. Chapter 8 describes a deep sequencing study to analyze theprocessing of these shRNA/AgoshRNA variants. We report that a short 3’ A-tail is added tothe AgoshRNA guide upon Ago2 cleavage. This tail could be a signal for poly(A)-specificribonuclease (PARN) to trim the molecule, and such shortened products were indeed found.In chapter 9, we tried to improve Ago2 processing of AgoshRNA hairpins by mutating the topand bottom bps. In particular the introduction of an A.C mismatch at the bottom improvesthe production of Ago2-cleavage products. In chapter 10, we characterize other requirementsfor Ago2-mediated cleavage of AgoshRNAs. This was done by introduction of mutations thatopen the stem around the Ago2-cleavage site, which effectively reduces AgoshRNA processingand consequently silencing activity. Furthermore, we show that Ago2-mediated cleavage ismore precise then Dicer-mediated processing and we test the hypothesis that Ago2-mediatedAgoshRNA are active in a Dicer-minus cell line.

The research described in this thesis revealed some surprising connections between themechanisms of RNA transcription and RNAi. This work tells us that even the well-studiedprocess of HIV-1 transcription still holds many surprises. Tat plays various roles in HIV-1transcription. By controlling RNA polymerase pausing (which is followed by prematuretermination) and elongation, Tat regulates the production of the TAR-encoded miRNA andthe full-length RNA genome. For the first time, we describe that processing of a pre-miRNAcan be controlled by binding of a protein (Tat). It would be of interest to test if this is alsoapplicable to other non-HIV systems. The novel AgoshRNA molecules show promise as futuretherapeutic agent, but need to be improved further.

175

Samenvatting

In dit proefschrift staan (kleine) RNA moleculen welke geproduceerd worden door virussen,in het bijzonder humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1), of welke gebruikt kunnenworden om virussen te remmen, centraal. Als eerste bestuderen we het transcriptiemechanisme van HIV-1, met daarbij speciale aandacht voor de rol van de TAR haarspeldstructuur in het RNA (hoofdstuk 2-4). Hierna wordt er ingezoomd op de biosynthese vanmicroRNAs (miRNAs) afkomstig van de HIV-1 TAR structuur (hoofdstuk 5-6). Als laatstebeschrijven we diverse pogingen om een nieuw therapeutisch molecuul genaamd AgoshRNAte optimaliseren voor een innovatieve anti-HIV therapie.

In de voorgaande alinea worden verscheidene termen genoemd die enige uitleg behoeven.HIV-1 is het virus dat de immuunziekte ‘acquired immunodeficiency syndrome’ (AIDS)veroorzaakt. Dit virus wordt voornamelijk verspreid via seksuele overdracht. Over de gehelewereld zijn miljoenen mensen besmet met AIDS. Het virus behoort tot de familie van deretrovirussen. Het genetisch materiaal van deze virussen bestaat uit RNA dat tijdens deinfectie van een cel wordt omgezet in DNA. Dit DNA nestelt zich vervolgens in het genetischmateriaal van de mens. Hier zal het virus vervolgens beginnen met het afschrijven van hetgeïntegreerde DNA in een proces dat transcriptie heet, het onderwerp in het eerste deel vanmijn proefschrift. Transcriptie van het HIV-1 genoom gebeurt door het RNA polymeraseenzym. Transcriptie begint op een DNA element welke promoter wordt genoemd en resulteertin de productie van een RNA. Dit RNA kan vervolgens gebruikt worden om virale eiwitten temaken of het dient als het erfelijk materiaal van nieuwe virus deeltjes. Het lichaam probeerthet virus te bevechten, maar doordat HIV-1 de immuun-cellen infecteert en doodt faaltuiteindelijk het immuunsysteem. In de afgelopen jaren zijn er diverse medicijnen op de marktgekomen die HIV-1 vermenigvuldiging remmen. Echter, omdat het virus zich permanent inhet genetisch materiaal van de geïnfecteerde persoon heeft genesteld, kan HIV-1 niet volledigopgeruimd (geklaard) worden. Het risico is aanwezig dat het virus op den duur resistent wordttegen de beschikbare anti-HIV middelen en het is daarom noodzakelijk nieuwe virus remmersof anti-virale strategieën te ontwikkelen. Diverse initiatieven om nieuwe therapieën wordenthans onderzocht, waaronder een therapie gebaseerd op het RNA interferentie (RNAi)mechanisme. Dit mechanisme komt uitgebreid aan de orde in dit proefschrift. Bij RNAi wordteen RNA haarspeld structuur omgezet in een klein RNA fragment dat een “complementair”RNA kan binden (passend als een sleutel op een slot) en neutraliseren. Het idee van degenoemde therapie is om cellen uit te rusten met een nieuwe RNA haarspeld welke resulteertin een RNA fragment dat complementair is aan het HIV-1 genoom, zodat het virusgeneutraliseerd wordt. HIV-1 kan echter ook zelf gebruik maken van het RNAi systeem en wijbeschrijven een klein RNA (microRNA) dat geproduceerd wordt van het HIV-1 RNA genoom.

Hoofdstuk 1 verschaft een overzicht van HIV-1 transcriptie en het RNAi systeem. Dit hoofdstukkan gezien worden als introductie voor de diverse onderwerpen die in dit proefschriftbehandeld worden. In hoofdstuk 2 zetten we recente bevindingen die gerelateerd zijn aanHIV-1 RNA biosynthese op een rijtje. We focussen op de processen van initiatie vantranscriptie, het aanbrengen van de cap structuur aan het begin van het RNA en hetaanbrengen van de polyA staart aan het einde van het RNA. Verder behandelen we ook degrote diversiteit aan HIV-1 RNA transcripten, hun productie en gesuggereerde functies.

175

Samenvatting

In dit proefschrift staan (kleine) RNA moleculen welke geproduceerd worden door virussen,in het bijzonder humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1), of welke gebruikt kunnenworden om virussen te remmen, centraal. Als eerste bestuderen we het transcriptiemechanisme van HIV-1, met daarbij speciale aandacht voor de rol van de TAR haarspeldstructuur in het RNA (hoofdstuk 2-4). Hierna wordt er ingezoomd op de biosynthese vanmicroRNAs (miRNAs) afkomstig van de HIV-1 TAR structuur (hoofdstuk 5-6). Als laatstebeschrijven we diverse pogingen om een nieuw therapeutisch molecuul genaamd AgoshRNAte optimaliseren voor een innovatieve anti-HIV therapie.

In de voorgaande alinea worden verscheidene termen genoemd die enige uitleg behoeven.HIV-1 is het virus dat de immuunziekte ‘acquired immunodeficiency syndrome’ (AIDS)veroorzaakt. Dit virus wordt voornamelijk verspreid via seksuele overdracht. Over de gehelewereld zijn miljoenen mensen besmet met AIDS. Het virus behoort tot de familie van deretrovirussen. Het genetisch materiaal van deze virussen bestaat uit RNA dat tijdens deinfectie van een cel wordt omgezet in DNA. Dit DNA nestelt zich vervolgens in het genetischmateriaal van de mens. Hier zal het virus vervolgens beginnen met het afschrijven van hetgeïntegreerde DNA in een proces dat transcriptie heet, het onderwerp in het eerste deel vanmijn proefschrift. Transcriptie van het HIV-1 genoom gebeurt door het RNA polymeraseenzym. Transcriptie begint op een DNA element welke promoter wordt genoemd en resulteertin de productie van een RNA. Dit RNA kan vervolgens gebruikt worden om virale eiwitten temaken of het dient als het erfelijk materiaal van nieuwe virus deeltjes. Het lichaam probeerthet virus te bevechten, maar doordat HIV-1 de immuun-cellen infecteert en doodt faaltuiteindelijk het immuunsysteem. In de afgelopen jaren zijn er diverse medicijnen op de marktgekomen die HIV-1 vermenigvuldiging remmen. Echter, omdat het virus zich permanent inhet genetisch materiaal van de geïnfecteerde persoon heeft genesteld, kan HIV-1 niet volledigopgeruimd (geklaard) worden. Het risico is aanwezig dat het virus op den duur resistent wordttegen de beschikbare anti-HIV middelen en het is daarom noodzakelijk nieuwe virus remmersof anti-virale strategieën te ontwikkelen. Diverse initiatieven om nieuwe therapieën wordenthans onderzocht, waaronder een therapie gebaseerd op het RNA interferentie (RNAi)mechanisme. Dit mechanisme komt uitgebreid aan de orde in dit proefschrift. Bij RNAi wordteen RNA haarspeld structuur omgezet in een klein RNA fragment dat een “complementair”RNA kan binden (passend als een sleutel op een slot) en neutraliseren. Het idee van degenoemde therapie is om cellen uit te rusten met een nieuwe RNA haarspeld welke resulteertin een RNA fragment dat complementair is aan het HIV-1 genoom, zodat het virusgeneutraliseerd wordt. HIV-1 kan echter ook zelf gebruik maken van het RNAi systeem en wijbeschrijven een klein RNA (microRNA) dat geproduceerd wordt van het HIV-1 RNA genoom.

Hoofdstuk 1 verschaft een overzicht van HIV-1 transcriptie en het RNAi systeem. Dit hoofdstukkan gezien worden als introductie voor de diverse onderwerpen die in dit proefschriftbehandeld worden. In hoofdstuk 2 zetten we recente bevindingen die gerelateerd zijn aanHIV-1 RNA biosynthese op een rijtje. We focussen op de processen van initiatie vantranscriptie, het aanbrengen van de cap structuur aan het begin van het RNA en hetaanbrengen van de polyA staart aan het einde van het RNA. Verder behandelen we ook degrote diversiteit aan HIV-1 RNA transcripten, hun productie en gesuggereerde functies.

176

Speciale aandacht is er voor de TAR RNA structuur en we bediscussiëren hoe deze haarspeldvoor een miRNA kan coderen. Hoofdstuk 3 richt zich op het Tat eiwit dat kan binden aan deTAR RNA structuur. Deze binding is noodzakelijk voor HIV-1 transcriptie omdat het deefficiëntie van transcriptie sterk verhoogt. Er worden echter ook veel andere functies aan Tattoegedeeld. In dit hoofdstuk onderzoeken we deze alternatieve mogelijkheden door gebruikte maken van een unieke variant van HIV welke geen Tat-TAR interactie meer nodig heeftvoor transcriptie activatie. In dit virus is het Tat-TAR mechanisme vervangen door hetniet-virale Tet-On transcriptie mechanisme. Omdat in deze HIV-rtTA variant de Tat-TARinteractie niet meer de transcriptie activeert, hadden we verwacht de Tat en TAR onderdelente kunnen verwijderen. Tot onze verrassing zien we echter dat volledige Tat inactivatieresulteert in een mank virus. Uit hierop volgende proeven blijkt dat het virus Tat toch nognodig had, omdat Tat de transcriptie niet alleen activeert via TAR maar ook onafhankelijk vanTAR, via DNA elementen in de transcriptie promoter. In hoofdstuk 4 laten we vervolgens ziendat de HIV-1 transcriptie wordt gecontroleerd door microprocessor, een van de onderdelenvan het RNAi mechanisme. Dit doet microprocessor echter onafhankelijk van zijn normaleRNAi functie. Microprocessor wordt via de TAR haarspeld op de HIV-1 promoter gerekruteerden blokkeert de transcriptie. Een model wordt gepostuleerd waarin het knippen van de TARhaarspeld door microprocessor leidt tot het pauzeren en vroegtijdig beëindigen van detranscriptie.

Het volgende deel van het proefschrift richt zich op retrovirale microRNAs (miRNAs).Hoofdstuk 5 beschrijft de langlopende discussie over de vraag of retrovirussen wel of geenmiRNAs kunnen produceren. Dit lijkt onmogelijk omdat de productie van een miRNA via debekende route zou leiden tot het knippen en inactiveren van het virale RNA genoom. Echter,uit recent onderzoek blijkt dat zo’n miRNA via alternatieve methodes geproduceerd kanworden, waarbij het virale genoom niet wordt vernietigd. Dit hoofdstuk beschrijft de recentgevonden retrovirale miRNAs en de wijze waarop ze geproduceerd worden. In hoofdstuk 6laten we zien dat HIV-1 een miRNA produceert welke afkomstig is van de TAR RNA structuur.We tonen aan dat alleen de korte, TAR-bevattende RNA transcripten die geproduceerdworden als de transcriptie niet gestimuleerd wordt door Tat, kunnen worden gebruikt voorde productie van de miRNA. De langere HIV-1 RNAs kunnen hier niet voor gebruikt worden,zodat virus replicatie niet geblokkeerd wordt door miRNA productie. Interessant is dat hetTat eiwit eerst aan deze korte transcripten moet binden voordat het miRNA gemaakt kanworden. HIV-1 heeft dus een complexe Tat-TAR afhankelijke methode ontwikkeld om eenmiRNA te kunnen produceren waarbij het gebruik maakt van een combinatie van unieketranscriptie en RNAi mechanismen.

Het laatste deel van mijn proefschrift beschrijft de zogenaamde AgoshRNAs. Dit zijn kleineRNA haarspeld structuren die op een aparte wijze in de cel geknipt worden tot één actiefklein RNA molecuul dat vervolgens complementaire RNAs kan remmen. Reguliere RNAhaarspelden produceren twee actieve RNA strengen: naast de gewenste RNA streng die eenspecifieke RNA remt, wordt er nog een streng gemaakt die - als ongewenst neveneffect - eenandere RNA kan remmen. Omdat AgoshRNAs slechts één RNA streng produceren, lijken dezebeter toepasbaar dan normale RNA haarspelden. Helaas zijn AgoshRNAs maar zijn veelalminder actief. We proberen daarom de AgoshRNAs te optimaliseren. In hoofdstuk 7

176

Speciale aandacht is er voor de TAR RNA structuur en we bediscussiëren hoe deze haarspeldvoor een miRNA kan coderen. Hoofdstuk 3 richt zich op het Tat eiwit dat kan binden aan deTAR RNA structuur. Deze binding is noodzakelijk voor HIV-1 transcriptie omdat het deefficiëntie van transcriptie sterk verhoogt. Er worden echter ook veel andere functies aan Tattoegedeeld. In dit hoofdstuk onderzoeken we deze alternatieve mogelijkheden door gebruikte maken van een unieke variant van HIV welke geen Tat-TAR interactie meer nodig heeftvoor transcriptie activatie. In dit virus is het Tat-TAR mechanisme vervangen door hetniet-virale Tet-On transcriptie mechanisme. Omdat in deze HIV-rtTA variant de Tat-TARinteractie niet meer de transcriptie activeert, hadden we verwacht de Tat en TAR onderdelente kunnen verwijderen. Tot onze verrassing zien we echter dat volledige Tat inactivatieresulteert in een mank virus. Uit hierop volgende proeven blijkt dat het virus Tat toch nognodig had, omdat Tat de transcriptie niet alleen activeert via TAR maar ook onafhankelijk vanTAR, via DNA elementen in de transcriptie promoter. In hoofdstuk 4 laten we vervolgens ziendat de HIV-1 transcriptie wordt gecontroleerd door microprocessor, een van de onderdelenvan het RNAi mechanisme. Dit doet microprocessor echter onafhankelijk van zijn normaleRNAi functie. Microprocessor wordt via de TAR haarspeld op de HIV-1 promoter gerekruteerden blokkeert de transcriptie. Een model wordt gepostuleerd waarin het knippen van de TARhaarspeld door microprocessor leidt tot het pauzeren en vroegtijdig beëindigen van detranscriptie.

Het volgende deel van het proefschrift richt zich op retrovirale microRNAs (miRNAs).Hoofdstuk 5 beschrijft de langlopende discussie over de vraag of retrovirussen wel of geenmiRNAs kunnen produceren. Dit lijkt onmogelijk omdat de productie van een miRNA via debekende route zou leiden tot het knippen en inactiveren van het virale RNA genoom. Echter,uit recent onderzoek blijkt dat zo’n miRNA via alternatieve methodes geproduceerd kanworden, waarbij het virale genoom niet wordt vernietigd. Dit hoofdstuk beschrijft de recentgevonden retrovirale miRNAs en de wijze waarop ze geproduceerd worden. In hoofdstuk 6laten we zien dat HIV-1 een miRNA produceert welke afkomstig is van de TAR RNA structuur.We tonen aan dat alleen de korte, TAR-bevattende RNA transcripten die geproduceerdworden als de transcriptie niet gestimuleerd wordt door Tat, kunnen worden gebruikt voorde productie van de miRNA. De langere HIV-1 RNAs kunnen hier niet voor gebruikt worden,zodat virus replicatie niet geblokkeerd wordt door miRNA productie. Interessant is dat hetTat eiwit eerst aan deze korte transcripten moet binden voordat het miRNA gemaakt kanworden. HIV-1 heeft dus een complexe Tat-TAR afhankelijke methode ontwikkeld om eenmiRNA te kunnen produceren waarbij het gebruik maakt van een combinatie van unieketranscriptie en RNAi mechanismen.

Het laatste deel van mijn proefschrift beschrijft de zogenaamde AgoshRNAs. Dit zijn kleineRNA haarspeld structuren die op een aparte wijze in de cel geknipt worden tot één actiefklein RNA molecuul dat vervolgens complementaire RNAs kan remmen. Reguliere RNAhaarspelden produceren twee actieve RNA strengen: naast de gewenste RNA streng die eenspecifieke RNA remt, wordt er nog een streng gemaakt die - als ongewenst neveneffect - eenandere RNA kan remmen. Omdat AgoshRNAs slechts één RNA streng produceren, lijken dezebeter toepasbaar dan normale RNA haarspelden. Helaas zijn AgoshRNAs maar zijn veelalminder actief. We proberen daarom de AgoshRNAs te optimaliseren. In hoofdstuk 7

177

onderzoeken we hoe de lengte van de RNA haarspeld en de basenparing in de top van dehaarspeld de kwaliteit van AgoshRNA beïnvloeden. Uit dit onderzoek blijkt dat voornamelijkde lengte van de haarspeld bepaalt hoe goed een molecuul als AgoshRNA kan functioneren..In hoofdstuk 8 kijken we gedetailleerd naar hoe AgoshRNA moleculen worden verwerkt. Uitde data blijkt dat er na het knippen van de AgoshRNA haarspeld, een extra nucleotide aanhet molecuul gezet wordt. Deze extra nucleotide is vervolgens een signaal voor verdereverwerking. In hoofdstuk 9 is de effectiviteit van twee verschillende AgoshRNA haarspeldenverbeterd door het veranderen van de boven- en onderkant. Tot slot, hebben we in hoofdstuk10 de vereisten voor het knippen van een AgoshRNA haarspeld gekarakteriseerd.

Het onderzoek beschreven in dit proefschrift onthult verrassende connecties tussen de RNAien transcriptie mechanismen. Dit proefschrift toont ook aan dat zelfs het grondig bestudeerdeproces van HIV-1 transcriptie nog verrassingen biedt. Zo is gebleken dat het virale Tat eiwitmeerdere rollen vervult tijdens de transcriptie. Naast het activeren van de productie van decomplete virale RNAs, welke nodig zijn voor de productie van virus eiwitten en als erfelijkmateriaal, beschrijven we hier een nieuwe functie, namelijk het controleren van de productievan een door TAR-gecodeerde miRNA. Voor het eerst laten we zien dat een eiwit (in dit gevalTat) de productie van een miRNA kan beïnvloeden. Het zou interessant zijn om te onderzoekenof zo’n regulatie mechanisme ook toepasbaar is op andere (niet-HIV) haarspelden. De nieuwetherapeutische AgoshRNA haarspelden zijn veelbelovend, maar moeten nog verdergeoptimaliseerd worden voordat ze toepasbaar zijn voor research of klinische toepassingen.

178

List of Publications1. Das AT, Klaver B, Harwig A, Vink M, Ooms M, Centlivre M, Berkhout B. 2007. Construction of a doxycycline-dependent simian immunodeficiency virus reveals a nontranscriptional function of tat in viral replication. J. Virol. 81:11159-11169.2. Das AT, Harwig A, Vrolijk MM, Berkhout B. 2007. The TAR hairpin of human immunodeficiency virus type 1 can be deleted when not required for Tat-mediated activation of transcription. J. Virol. 81:7742-7748.3. Vrolijk MM, Ooms M, Harwig A, Das AT, Berkhout B. 2008. Destabilization of the TAR hairpin affects the structure and function of the HIV-1 leader RNA. Nucleic Acids Res. 36:4352-4363.4. Das AT, Klaver B, Centlivre M, Harwig A, Ooms M, Page M, Almond N, Yuan F, Piatak M, Jr., Lifson JD, Berkhout B. 2008. Optimization of the doxycycline- dependent simian immunodeficiency virus through in vitro evolution. Retrovirology 5:44.5. Vrolijk MM, Harwig A, Berkhout B, Das AT. 2009. Destabilization of the TAR h a i r p i n leads to extension of the polyA hairpin and inhibition of HIV-1 polyadenylation. Retrovirology 6:13.6. Das AT, Harwig A, Berkhout B. 2011. The HIV-1 Tat protein has a versatile role in activating viral transcription. J. Virol. 85:9506-9516.7. Wagschal A, Rousset E, Basavarajaiah P, Contreras X, Harwig A, Laurent- Chabalier S, Nakamura M, Chen X, Zhang K, Meziane O, Boyer F, Parrinello H, Berkhout B, Terzian C, Benkirane M, Kiernan R. 2012. Microprocessor, Setx, Xrn2, and Rrp6 co-operate to induce premature termination of transcription by RNAPII. Cell 150:1147-1157.8. Das AT, Vrolijk MM, Harwig A, Berkhout B. 2012. Opening of the TAR hairpin in the HIV- 1 genome causes aberrant RNA dimerization and packaging. Retrovirology 9:59.9. Herrera-Carrillo E*, Harwig A*, Liu YP, Berkhout B. 2014. Probing the shRNA characteristics that hinder Dicer recognition and consequently allow Ago-mediated processing and AgoshRNA activity. RNA 20:1410-1418. (* Shared author)10. Harwig A, Das AT, Berkhout B. 2014. Retroviral microRNAs. Curr. Opin. Virol. 7:47-54.11. Harwig A, Dat AT, Berkhout B. 2015 HIV-1 RNAs: sense and antisense, large mRNAs and small siRNAs and miRNAs. Curr. Opin. HIV12 Liu YP, Karg M*, Harwig A*, Herrera-Carrillo E*, Jongejan A, van Kampen A, Berkhout B. Mechanistic insights on the Dicer-independent AGO2-mediated processing of AgoshRNAs. Accepted in RNA biol. (* shared author)13 Harwig A, Jongejan A, van Kampen AH, Berkhout B, Das AT. Tat-dependent production of an HIV-1 TAR-encoded miRNA by a non-canonical miRNA pathway. Submitted14. Harwig A, Jongejan, A, Herrera-Carrillo E, van Kampen AH, Berkhout B. Deep sequence analysis of AgoshRNA processing reveals 3’ A addition and trimming. Submitted15. Herrera-Carrillo E, Harwig A, Berkhout B. Towards optimization of AgoshRNA molecules that use a non-canonical RNAi pathway: variations in the top and bottom base pairs. Submitted

179

Author Affiliations

All authors that contributed to the papers described in this thesis are affiliated to theLaboratory of Experimental Virology, department of Medical Microbiology, and Center forInfectious Diseases and Immunity Amsterdam (CINIMA) at the Academic Medical Center ofthe University of Amsterdam, Amsterdam, except for the following:

Aldo JongejanBioinformatics Laboratory, Department of Clinical Epidemiology, Biostatistics andBioinformatics, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Meibergdreef 15, 1105AZ, Amsterdam, The Netherlands.

Alexandre WagschalLaboratoires de Virologie Moléculaire Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396Montpellier, France

Antoine H. van KampenBioinformatics Laboratory, Department of Clinical Epidemiology, Biostatistics andBioinformatics, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Meibergdreef 15, 1105AZ, Amsterdam, The Netherlands.Biosystems Data Analysis, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam,Science Park 904, 1098 XH, Amsterdam, The Netherlands.

Christophe TerzianRétrovirus et Pathologie Comparée. Université Lyon 1, INRA, EPHE, ENVL, 69366 Lyon Cedex07, France

Emilie RoussetRégulation des Gènes Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396 Montpellier,France

Frédéric BoyerRétrovirus et Pathologie Comparée. Université Lyon 1, INRA, EPHE, ENVL, 69366 Lyon Cedex07, France

Hugues ParrinelloMGX-Montpellier GenomiX, 34396 Montpellier, France

Ke ZhangLaboratoires de Virologie Moléculaire Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396Montpellier, France

Mirai NakamuraRégulation des Gènes Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396 Montpellier,France

180

Monsef BenkiraneLaboratoires de Virologie Moléculaire Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396Montpellier, France

Oussama MezianeLaboratoires de Virologie Moléculaire Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396Montpellier, France

Poornima BasavarajaiahRégulation des Gènes Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396 Montpellier,France

Rosemary KiernanRégulation des Gènes Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396 Montpellier,France

Sabine Laurent-ChabalierLaboratoires de Virologie Moléculaire Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396Montpellier, France

Xavier ContrerasRégulation des Gènes Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396 Montpellier,France

Xin ChenRégulation des Gènes Institut de Génétique Humaine, CNRS UPR1142, 34396 Montpellier,France

181

PhD Portfolio

AMCGraduateSchoolforMedicalSciences

PhDportfolio 

Name PhD student:   Alex Harwig  

PhD period:     February 2011 ‐ April 2015  

Name PhD supervisor:   Prof. Dr. Ben Berkhout and Dr. Atze T. Das 

 

1. PhD Training  Year  Workload (hours) 

ECTS 

General courses ‐ Infectious diseases ‐ Crash course 

 2011 2011 

 36 10 

 1.3 0.4 

Specific courses ‐ Integrated analysis of tumor genomics data 

with R2 

 2013 

 40 

 1.0 

Seminars, workshops and master classes - Weekly department seminars.- Weekly PhD student meeting

 2011‐2015 2011‐2015 

 160 160 

 4.0 4.0 

(Inter)national conferences ‐ Dutch Annual Virology Symposium. 

Amsterdam, The Netherlands ‐ Frontiers in Retrovirology. 

Amsterdam, The Netherlands, October 3‐5 - Cold Spring Harbor, Retroviruses meeting.

New York, NY, USA, May 21‐26‐ RNA 2013. 

Davos, Switzerland, June 11‐16 - RNA 2014.

Quebec, Canada, June 3‐8

 2011‐2015 

 2011 

 2012 

 2013 

 2014 

 32  

40  

40  

40  

40 

 0.8  

1.0  

1.0  

1.0  

1.0 

Presentations ‐ “Processing of HIV‐1 short transcripts into 

miRNA” - RNA 2014, Quebec, Canada

 2014 

 20 

 0.5 

 

182 183

Curriculum Vitae

Alex Harwig was born on August 15��, 1980 in Apeldoorn. Here he completed both MAVOand HAVO secondary school at Sprengeloo. From 1998 to 2002, he studied Biology andMedical Laboratory Techniques at Saxion College in Deventer. To obtain his BSc degree, heperformed the research project ‘Assessing genetic variability in S. hermonthica and S. asperaby RAPD and SCAR markers’ at the Department of Ecology and Physiology of Plants of theFree University in Amsterdam, which was completed with the highest honors. He subsequentlyworked for several months at this laboratory as research technician. On April 1�� 2003, Alexstarted working as research technician at the Department of Human Retrovirology of theUniversity of Amsterdam. Under supervision of Dr. Atze T. Das and Prof. Dr. Ben Berkhout,he worked on several research projects that aimed to understand the molecular biology ofthe human immunodeficiency virus (HIV-1) and to develop of a safe live-attenuated HIV-1vaccine. In 2011, Alex started as a PhD-student in this laboratory (renamed Laboratory ofExperimental Virology) and performed the research described in this thesis. After hisgraduation, he will work as a postdoctoral researcher at the Laboratory of ExperimentalVirology.

 

2. Teaching  Year  Workload (hours) 

ECTS 

Supervising ‐ Kirsten Verheul, August 2011‐January 2012 

(5 months) “Characterization of mutation in Ubiquitin after long‐term culturing of an HIV‐rtTA‐Ub‐Nef variant.” 

‐ Maarten Janssen, March 2012‐June 2012 (4 months) “Characterization of the promoter region of a novel conditionally replicating HIV‐1 variant.” 

‐ Julia Lederhofer, July 2012‐January 2013 (7 months) “Does the secondary RNA structure of the Tat region influence splicing?” 

 2011‐2012 

    

2012    

2012‐2013  

 40     

40    

40 

 1.0     

1.0    

1.0 

Other ‐ Training new colleagues ML III 

 2011‐2015 

 40 

 1.0 

  

3. Parameters of Esteem  Year 

Grants ‐ Travelgrant RNA 2014, Quebec, Canada  

 2014 

 

183

Curriculum Vitae

Alex Harwig was born on August 15��, 1980 in Apeldoorn. Here he completed both MAVOand HAVO secondary school at Sprengeloo. From 1998 to 2002, he studied Biology andMedical Laboratory Techniques at Saxion College in Deventer. To obtain his BSc degree, heperformed the research project ‘Assessing genetic variability in S. hermonthica and S. asperaby RAPD and SCAR markers’ at the Department of Ecology and Physiology of Plants of theFree University in Amsterdam, which was completed with the highest honors. He subsequentlyworked for several months at this laboratory as research technician. On April 1�� 2003, Alexstarted working as research technician at the Department of Human Retrovirology of theUniversity of Amsterdam. Under supervision of Dr. Atze T. Das and Prof. Dr. Ben Berkhout,he worked on several research projects that aimed to understand the molecular biology ofthe human immunodeficiency virus (HIV-1) and to develop of a safe live-attenuated HIV-1vaccine. In 2011, Alex started as a PhD-student in this laboratory (renamed Laboratory ofExperimental Virology) and performed the research described in this thesis. After hisgraduation, he will work as a postdoctoral researcher at the Laboratory of ExperimentalVirology.

184

Dankwoord

Uiteindelijk is het dan zo ver. Het boekje is af en ligt nu voor je. Hopelijk is dit een waardigeafsluiting van de vier meest tumultueuze jaren van mijn leven. In de loop van de jaren heb ikveel nieuwe gezichten ontmoet en van oude afscheid moeten nemen. Velen hebben megeholpen, bijgestaan, dingen geleerd, me aan het lachen gekregen en het bloed onder mijnnagels vandaan gehaald. Als ik iedereen zou willen beschrijven in dit dankwoord, dan kan iknog wel een boek vullen. Vandaar dat ik het simpel houd en iedereen bij deze bedank vooralles wat ze voor me betekend hebben. Natuurlijk ontkom ik er niet aan om enkele mensener uit te lichten. Deze mensen hebben gedurende mijn promotie periode het meest voor mebetekend.

Als eerste natuurlijk Ben. Bedankt dat je mijn promotor en mentor wilde zijn. Bedankt voorje eerlijke mening over alles wat je goed vond, maar ook over alles wat je slecht vond. Hetmaakt niet uit wanneer ik bij je kwam met weer een stukje of weer een vraag, altijd stond jeklaar en had ik zo snel mogelijk een eerlijk antwoord terug. Ik vrees echter dat ik de afgelopenkerstvakantie iets teveel van je vrije tijd heb ingenomen om dit boekje op tijd af te krijgen,waarvoor mijn welgemeende excuses aan Marianne.

Atze, mijn copromotor. Nu twaalf jaar geleden solliciteerde ik voor de functie vanresearchanalist bij jouw groep en ik ben niet meer weggegaan. Al tijdens het sollicitatiegesprek was er zoveel chemie dat je me per direct aannam en per direct op vakantie ging. Inde loop van de jaren hebben we vele discussies gehad, want we gaan beiden een goedediscussie niet uit de weg. Soms zijn we het roerend eens, andere keren roerend oneens.Gelukkig kwamen we altijd tot een vergelijk en ook al geef ik het niet snel toe, soms had jemisschien wel een beetje gelijk. Bedankt voor je uitstekende oog voor detail. Bedankt dat jeondanks je jarenlange ervaring met mij, me toch aangenomen hebt op dit AIO-project.Bedankt voor alle adviezen, raad en oplossingen die je me gegeven hebt. Ik hoop dat we desamenwerking nog vele jaren door kunnen zetten en ik wens je veel geluk met Pernill!

Mo! Trouwe BK/KFC-partner! Hartstikke bedankt dat je me onder je hoede genomen hebttoen iemand je meldde dat er na het weekend een nieuwe analist komt en vervolgens zelfop vakantie ging. We hebben hierna nog jaren bij elkaar gezeten, zowel in het lab als op dekamer. De tijd vloog om! Ook al waren de tijden soms voor ons beiden niet optimaal, ik konaltijd bij je terecht en je wist me altijd wel weer af te leiden met een smeuïge roddel. Bedanktdat je gouden handjes altijd klaar stonden in het lab. Bedankt voor alle taarten, chocolade,snoepgoed etc. Bedankt voor al het (mede-)organiseren van de borrels en uitjes. Ik heb goedeherinneringen aan al die jaren dat we samen lol hadden, de afschuwelijke kerstversiering, jemortuarium van plant-probeersels, je voorliefde voor bizarre souvenirs en je uitbundigekennis van zaken die op vrijdag besproken moeten worden! Ik hoop dat we het nog jarenvoort kunnen zetten. Het is een eer voor mij dat je naast me wil staan als mijn paranimf.

Beppie! Alwetend orakel van de afdeling. Ook jij was er al vanaf het begin bij, zelfs nog vervoor mijn tijd. Je doet me altijd weer versteld staan met je nuchtere kijk op de wereld en jedroge humor. Bedankt voor de onnoemelijke keren dat je me uit de brand hebt geholpen.Bedankt voor alle adviezen en hulp in het lab. Je bent echt een top-analist. Ik weet zeker dat

185

als je gewild had, dat jij in het midden had kunnen staan met misschien mij als paranimf. Hetis mij een eer dat ook jij naast me wilt staan als paranimf.

Nancy, KletterSchwein, Klimkabouter, Nupsie, gevuld koekje, dancy! Ik kan waarschijnlijk welhet hele dankwoord vullen met bijnamen van je. Bedankt voor alle humor, het luisterendeoor en je enthousiasme. Toen mijn vader overleed heb je me er echt doorheen geholpen,waarvoor ik je altijd dankbaar zal blijven. Samen hebben we het klimmen ontdekt. Voor mijzal je altijd mijn klimpartner blijven, ook al heeft het leven me ingehaald en klim ik nu nietmeer zo veel. Ik hoop echt dat ik je nog vaak ga blijven zien, ook al ga je terug naar de Heimat.Het zal wel eventjes wennen worden…

Carolien, heel erg bedankt bij het last-minute doorworstelen van alle leuke nieuweregelementen.

Aldo, Marcel en Antoine. Dank jullie wel voor alle hulp bij het verwerken van de deepsequence data. Zonder jullie hulp waren verscheidene hoofdstukken van dit boekje er nietgeweest.

Coby, Ferry, Linda, Lydia, Jules en bovenal Ted van de sequence afdeling. Bedankt voor aljullie hulp met het deep sequencen en het doorgronden van alle fancy apparaten bij jullie ophet lab.

Nikki. Dank dat je me op sleeptouw hebt genomen tijdens mijn eerste internationale congres.Zonder jou was ik waarschijnlijk al op Schiphol verdwaald. Ik hoop dat Paris een goed huisjebij jou en Jochem heeft gevonden.

Ying Poi, Marcel, Nick, Truus en Joost. Bedankt voor alles wat jullie me hebben geleerd ophet gebied van RNA. Zonder jullie had dit boekje een heel andere inhoud gekregen.

Elena, I am so happy that you actually don’t like RNA, but are so fond of all the therapeuticalthings that are needed to complete all the AgoshRNA papers. Thank you for all the help! Soonwe go for cerveza!

Ook wil ik graag al mijn studenten bedanken die ik heb mogen begeleiden. Zeker de laatstedrie die ik tijdens mijn AIO-periode begeleid heb. Kirsten, je bent echt een top-analist in dedop! Je toekomstige baas kan in zijn handjes knijpen! Maarten, je bent echt eenwereldverbeteraar. Verstrooide professor in spé. Ik hoop dat het je goed gaat. Julia, jammergenoeg was je mijn student in een zware tijd en heb ik je helaas niet alle aandacht kunnengeven die je verdiende. Toch heb je jezelf er mooi doorheen geslagen en een mooi Shapeexperiment van uit het niks opgezet. Het ga je goed tijdens je eigen AIO periode!

Alle huidige en vorige AIO’s en collega’s, teveel om op te noemen. Bedankt voor alle leukeborrels, uitjes, feesten etc. Succes met jullie eigen promotie en loopbaan. Bedankt voor hetwerkplezier, zodat ik elke dag weer die lange reis richting werk onderneem. Bowser, dankvoor alle whiskey en de kart-whiplash. Albatros (and Charlotte), thanks that you wanted todecorate my wedding with your beautiful piano-play. Hope we will still go many times climbingafter the rest has returned.

186

Mijn vrienden! Bij jullie voel ik me altijd op mijn gemak en kan ik stoom afblazen. Ik hoop datjullie me mijn leven lang blijven achtervolgen met al jullie grappen, grollen, koffie, bier enwat dan ook! Bedankt dat jullie altijd klaar stonden en staan!

Of course also a big thank you for all my international friends. It was really an honor meetingyou all and I really hope that I will continue to see all of you even though we are far apart. Iwish all of you the best in life and I will try to visit you all!

Aura and Andreas, thanks for showing me that even old people can party hard! Aura, ačiū,kad esi mano gera draugė. Aš linkiu tau visa ko geriausio. Greitai mes švęsime Shasupanioj!Αντρέα θα ήθελα να σε ευχαριστήσω που με βοήθησες και που ήσουν καλός φίλος. Μουέμαθες πολλά πράγματα. Σύντομα θα συναντηθούμε ξανά.

Natuurlijk wil ik ook mijn familie bedanken. We zijn niet met veel, maar des te meer waardeerik jullie. Bedankt dat jullie geprobeerd hebben om geduld met me te hebben als ik weer eenof andere deadline had en natuurlijk weer veel te laat hieraan begon. Bedankt dat jullie altijdvoor me klaar stonden. Bedankt voor het mooiste nichtje ter wereld!

En nu als laatste de belangrijkste persoon in mijn leven, Joan. De dag dat ik je ontmoette benik in een droom beland die nooit meer opgehouden is. Als ik alles hier moet opschrijvenwaarvoor ik je dankbaar ben, dan ben ik nog heel lang nog bezig. Daarom dank ik je gewoondat je in mijn leven bent gekomen en er voor gekozen hebt om voor de rest van ons levensamen te reizen.

Alex Harwig

Januari 2015

Deventer