UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA ... · À Profa. Dra. Maria Cláudia Dantas...
83
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL CARACTERÍSTICAS FENOTIPICAS E MOLECULARES DE ISOLADOS DE Listeria monocytogenes ORIUNDOS DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL DE ARAGUAÍNA - TOCANTINS Lilyan Rosmery Luizaga de Monteiro Orientador: Prof. Dr. Albenones José de Mesquita GOIÂNIA 2009
Transcript of UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA ... · À Profa. Dra. Maria Cláudia Dantas...
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
CARACTERÍSTICAS FENOTIPICAS E MOLECULARES DE
ISOLADOS DE Listeria monocytogenes ORIUNDOS DE
PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL DE ARAGUAÍNA - TOCANTINS
Lilyan Rosmery Luizaga de Monteiro
Orientador: Prof. Dr. Albenones José de Mesquita
GOIÂNIA
2009
2
ii
LILYAN ROSMERY LUIZAGA DE MONTEIRO
CARACTERÍSTICAS FENOTIPICAS E MOLECULARES DE
ISOLADOS DE Listeria monocytogenes ORIUNDOS DE
PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL DE ARAGUAÍNA - TOCANTINS
Tese apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária da
Universidade Federal de Goiás
Área de concentração:
Sanidade Animal
Orientador
Prof. Dr. Albenones José de Mesquita
Comitê de Orientação
Eurione Antônio Garcia da Veiga Jardim
Rolando Alfredo Mazzoni Romero
GOIÂNIA
2009
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
GPT/BC/UFG
Luizaga de Monteiro, Lilyan Rosmery
L952c Características fenotipicas e moleculares de isolados de
Listeria monocytogenes oriundos de produtos de origem
animal de Araguaína - Tocantins [manuscrito] / Lilyan
Rosmery Luizaga de Monteiro.- 2009.
72 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Albenones José de Mesquita; Co-
Orientadores: Prof. Dr. Eurione Antônio Garcia da Veiga
Jardim, Prof. Dr. Rolando Alfredo Mazzoni Romero.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás.
Escola de Veterinária, 2009.
Bibliografia.
1. Contaminação de alimentos 2. Listeria
monocytogenes. 3. Ensaio imunoenzimático 4.
Antimicrobianos 5. Eletroforese em gel em campo pulsado.
I. Título
CDU: 664.8/.9
iii
iv
DEDICATORIA DE HONRA:
Dedico esta tesis a mis padres Eddye Luizaga Melean y Nancy Aranibar de
Luizaga, siempre y para siempre em mi corazón. A mis queridos hermanos
Humberto (in memorian) y Jhonny Javier. A mi querida suegra, Doña Sebastiana
(in memorian).
DEDICATORIA DE AMOR:
A mi querido esposo Kleber y a mis adorados hijos Camila y Matheus, son parte
de mi.
v
AGRADECIMENTOS
Este trabalho deve muito a pessoas e instituições a quem eu gostaria de
agradecer, especialmente:
Ao meu orientador Prof. Dr. Albenones José de Mesquita, pela confiança
depositada em meu trabalho e auxílio prestado nas questões, dúvidas e
problemas durante a presente tese.
À Dra. Sandra Queiroz Porto de Mesquita, pelo desprendimento de
extrema relevância na colaboração do trabalho experimental.
À Profa. Dra. Ana Flavia Santos Coelho, pelas informações e pela sua
disponibilidade em trocar informações.
À banca de qualificação, pelas importantes sugestões que enriqueceram
esta tese.
À Profa. Dra. Cintia Silva Minafra e Rezende, pelo apoio prestado em
momentos de saudade da família.
À Profa. Dra. Maria Cláudia Dantas Porfirio Borges André, pelas
importantes sugestões e auxilio experiente prestado durante a realização deste
trabalho.
Ao Prof. Dr Antônio Nonato Oliveira, Coordenador do Centro de Pesquisa
em Alimentos –CPA- da Universidade Federal de Goiás, estendendo minha
gratidão a todos meus amigos do laboratório, pelo companheirismo e colaboração
prestados.
Agradeço também à Universidade Federal do Tocantins, por possibilitar
esta pós-graduação, aproveito de enviar a minha gratidão ao Prof. Dr. José
Expedito Cavalcante, Vice-Reitor da UFT, que acreditou no meu potencial.
Á minha estagiaria Nadiely Xavier Medeiros, pela companhia e auxilio
durante o trabalho experimental e participações de eventos científicos.
Aos colegas de faculdade, Luiza Helena, Raimundo, Jamur, Norma, Aurilio
pelas sugestões recebidas durante a elaboração desta tese.
À Profa. Dra. Maria Clorinda Soares Fioravanti, pelo apoio constantemente
oferecido, muito obrigado.
À Profa. Dra. Claudia Peixoto, que presenteou-me com sua bela amizade.
vi
SUMÁRIO
1.
2.
2.1.
3.
3.1.
3.1.1.
4.
4.1.
4.2
5.
6.
7.
CAPÍTULO I - CONSIDERAÇÕES GERAIS.....................................
INTRODUÇÃO ..................................................................................
DESCRIÇÃO TAXONÔMICA E CARACTERÍSTICAS DE Listeria
monocytogenes .................................................................................
Condições de crescimento.................................................................
MÉTODOS DE DETECÇÃO DE Listeria monocytogenes...,.............
Subtipagem de Listeria monocytogenes............................................
Divisão filogenética em linhagens de Listeria monocytogenes..........
LISTERIOSE .....................................................................................
Epidemiologia ....................................................................................
Listeriose em animais.........................................................................
VEICULAÇÃO DE Listeria monocytogenes ......................................
PREVENÇÃO DE LISTERIOSE.........................................................
REFERÊNCIAS .................................................................................
1
1
3
4
6
7
8
9
11
14
15
16
18
1.
2.
2.1.
2.2.
3.
4.
5.
CAPÍTULO II - CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE Listeria
monocytogenes ISOLADA EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL
COMERCIALIZADOS EM ARAGUAÍNA – TO. ...................................
RESUMO...............................................................................................
ABSTRACT...........................................................................................
INTRODUÇÃO .....................................................................................
MATERIAL E MÉTODOS....................................................................
Amostragem .........................................................................................
Procedimento de isolamento ................................................................
RESULTADOS E DISCUSSÃO ...........................................................
CONCLUSÕES ....................................................................................
REFERÊNCIAS ....................................................................................
27
27
28
29
30
30
31
33
37
37
vii
1.
2.
3.
4.
5.
CAPÍTULO CAPÍTULO III - SUSCETIBILIDADE ANTIMICROBIANA
QUANTITATIVA DE ISOLADOS DE Listeria monocytogenes
ORIUNDOS DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL
COMERCIALIZADOS EM ARAGUAÍNA-TO......................................
RESUMO.............................................................................................
ABSTRACT..........................................................................................
INTRODUÇÃO ....................................................................................
MATERIAL E MÉTODOS....................................................................
RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................
CONCLUSÕES ...................................................................................
REFERÊNCIAS ..................................................................................
43
43
44
45
48
49
52
53
1.
2.
2.1.
2.2.
3.
4.
5.
CAPÍTULO IV CAPÍTULO IV - CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Listeria
monocytogenes ISOLADAS EM PRODUTOS DE ORIGEM
ANIMAL DE ARAGUAÍNA - TO..........................................................
RESUMO.............................................................................................
ABSTRACT..........................................................................................
INTRODUÇÃO ....................................................................................
MATERIAL E MÉTODOS..................................................................
Cepas bacterianas ............................................................................
Eletroforese em Campo Pulsado.........................................................
RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................
CONCLUSÕES....................................................................................
REFERÊNCIAS...................................................................................
56
56
57
58
59
59
60
61
65
66
CAPITULO V – CONSIDERAÇÕES FINAIS 71
viii
CARACTERÍSTICAS FENOTIPICAS E MOLECULARES DE ISOLADOS DE
Listeria monocytogenes ORIUNDOS DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL
DE ARAGUAÍNA - TOCANTINS
RESUMO. A listeriose, infecção de origem alimentar, é causada pela Listeria
monocytogenes, bactéria ubiquitaria patogênica capaz de ser transmitida aos
humanos por alimentos contaminados. Esta doença é particularmente importante
pelo alto índice de mortalidade, aproximadamente 30% dos casos, afeta
principalmente pessoas imunocomprometidas. O objetivo desta pesquisa foi
determinar as características fenotípicas e moleculares de isolados de L.
monocytogenes provenientes de produtos de origem animal no município de
Araguaina, Tocantins. Para isso, Foram coletadas 120 amostras entre agosto de
2008 e março de 2009, sendo 30 de carne moída bovina, 30 de lingüiça mista, 30
de leite in natura e 30 de queijo frescal. Após enriquecimento, as amostras foram
analisadas pelo mini-VIDAS® L. monocytogenes (LMO) e posteriormente isoladas
pelo método bacteriológico tradicional. Os isolados foram enviados para
sorotipagem no Laboratório de Zoonoses Bacterianas (FIOCRUZ, RJ), Os
isolados de L. monocytogenes foram submetidos a avaliação da susceptibilidade
antimicrobiana pelo método do E-test E-test® , utilizando-se os seguintes
antimicrobianos: Ampicilina, Oxacilina, Levofloxacina, Gentamicina, Vancomicina,
Sulfametoxazol/Trimetoprima, para determinação da concentração inibitória
mínima (CIM). Finalmente, na determinação da similaridade entre os isolados,
foram submetidos à tipagem molecular pela técnica de PFGE, utilizando-se para a
digestão as enzimas de restrição ApaI e SmaI. Foi encontrado que 6 (20%) das
amostras de carne moída e 6 (20%) das amostras de linguiça mista foram
positivas para L. monocytogenes, e não se detectou a presença desta bactéria
nas amostras de leite in natura e queijo frescal. Quando testados frente aos
antimicrobianos, observou-se que os isolados que apresentaram maior resistência
foram provenientes de amostras de carne moída, no entanto, o mais suscetível foi
aquele isolado de linguiça mista frescal. Maior resistência foi observada para
gentamicina, oxacilina e trimetoprim/sulfametoxazol (85,7%). Verificaram-se
também que a levofloxacina (fluoroquinolona), vancomicina (glicopeptideo) e
ampicilina (beta-Lactâmico) são os antimicrobianos mais indicados contra os
isolados de L. monocytogenes encontrados na presente pesquisa. A análise do
perfil de macrorrestrição obtido pela PFGE e a combinação de resultados obtidos
com a enzima SmaI permitiu a distribuição dos sete isolados em dois clusters,
dois pulsotipos e dois subtipos. Nestas condições, pode-se concluir que tanto a
ix
carne moída crua quanto a lingüiça mista, comercializada em açougues de
Araguaína,TO, representam importante veículo de L monocytogenes.
Palavras-chave: Contaminação de alimentos, ensaio imunoenzimático, Listeria
monocytogenes, antimicrobianos, eletroforese em gel em campo pulsado
CAPÍTULO I: CONSIDERAÇÕES GERAIS
1. INTRODUÇÃO
O presente trabalho visa apresentar a caracterização fenotípica e
molecular de isolados de Listeria monocytogenes de produtos de origem animal
obtidos em Araguaína, cidade ao norte do Estado do Tocantins.
A pesquisa se justifica pela potencialidade letal da infecção invasiva que
esse patógeno apresenta. Apesar de se tratar de uma doença com baixa
morbidade, a taxa de mortalidade neste grupo pode alcançar 30% (MARZOCCA et
al., 2004; LÓPEZ et al., 2006), apresentando septicemia como manifestação mais
frequente da listeriose. Porém, quando o sistema nervoso central é envolvido, a
manifestação mais comum é a meningite, com índices de mortalidade que podem
chegar a 70% (USDA/FSRIO, 2005).
Pelos riscos envolvidos, a legislação internacional emitida por agências
de regulação de saúde pública, como USDA (US Department of Agriculture), FSIS
(Food Safety and Inspection Service), FDA (Food and drug administration) exigem
tolerância zero para a presença de L. monocytogenes em alimentos (SHANK et al.,
1996). Já no Brasil, a legislação especifica o monitoramento de apenas alguns tipos
de alimentos, como o queijo frescal (BRASIL, 2001). Os últimos avanços na
legislação prevêem, contudo, procedimentos de controle de L. monocytogenes em
produtos de origem animal prontos para o consumo, mas sem especificar o grau de
tolerância do patógeno nesses alimentos.
No Brasil faltam informações sobre surtos de listeriose, resistência
antimicrobiana dos isolados clínicos, além da caracterização fenotípica e
genotípica dos mesmos. Entre as dificuldades no controle e no estudo da
listeriose no Brasil, incluem-se: a falta de estatísticas oficiais sobre casos de
listeriose, pois sua notificação não é obrigatória, a recuperação de organismos
envolvidos nos surtos, e a demora na realização de análises clínicas
convencionais (LEMES-MARQUES et al., 2007; CRUZ et al., 2008). A isso são
acrescidas as dificuldades dos métodos de análise referentes aos custos,
principalmente com fins de rotina. Embora o miniVIDAS® não seja ainda acessível
2
para exames dessa natureza, esse método tem se mostrado importante
principalmente quando é analisado um grande número de amostras.
A necessidade de investigar a presença dessa bactéria patogênica em
alimentos comercializados na cidade de Araguaína se justifica por alguns aspectos.
Primeiramente, foi considerado o papel da produção e comércio de carne e seus
derivados nessa localidade. A região de Araguaína, por sua localização
geográfica, é considerada zona de influência econômica no Estado do Tocantins,
e se concentra fundamentalmente na pecuária, segundo LARANJEIRA & MENTA
(2008). Detém o segundo maior rebanho do Tocantins, com 1.012.363 bovídeos
de corte, os quais são destinados ao consumo interno e externo. O Estado por
sua vez é o 11º maior mercado produtor de carne bovina do Brasil, contando com
um rebanho de aproximadamente 8 milhões de animais, e 15 frigoríficos com
capacidade de abater mensalmente mais de 165 mil animais (FIGUEIREDO,
2007).
Outro aspecto relevante é a inexistência de trabalhos sobre a Listeria
monocytogenes no Norte do país. As pesquisas existentes limitam-se às regiões
Sul, Sudeste e Centro-Oeste, o que não significa que a bactéria não esteja presente
na região Norte. O próprio fato da não obrigatoriedade de notificação de listeriose
pelos hospitais minimiza a consciência sobre os riscos da infecção, sobretudo se for
considerada a grande possibilidade de surto tal como verificamos nos sorotipos
encontrados.
Os alimentos analisados por esta pesquisa – lingüiça mista, queijo frescal,
carne moída e leite in natura – foram selecionados em função de dois critérios.
Inicialmente, considerou-se o consumo: trata-se de alimentos acessíveis a um
grande número de pessoas, abrangendo o consumo de distintas classes sociais.
Posteriormente, levou-se em conta o processamento e condições de
armazenamento, principalmente de lingüiça e carne moída, que seriam favoráveis
ao crescimento da Listeria, tendo em vista as características intrínsecas e
extrínsecas envolvidas na sua multiplicação. Nesse sentido, pesquisas como a aqui
realizada podem contribuir com elementos para revisão de normas já existentes,
como a alteração do prazo de validade de produtos refrigerados, e para a criação de
normas mais criteriosas quanto à segurança alimentar.
3
2. DESCRIÇÃO TAXONÔMICA E CARACTERÍSTICAS DE Listeria
monocytogenes
A primeira referência publicada sobre L. monocytogenes foi realizada
por Murray e colaboradores, que em 1926 observaram uma epizootia entre
coelhos do biotério do Departamento de Patologia da Universidade de Cambridge,
em Londres, descrevendo as características peculiares da doença e a elevada
mortalidade. Devido à característica de causar intensa leucocitose mononuclear,
foi nomeada como Bacterium monocytogenes (ROCOURT, 1999).
Por outro lado em 1927, Pirie descobriu um novo microrganismo na
África do Sul, sendo descrito como bacilo gram positivo, propondo o nome de
“Listerella hepatolytica”, pelo seu efeito patogênico e em homenagem a Lorde
Lister. Ambos descobridores, Murray e Pirie, enviaram suas cepas ao Instituto
Lister, em Londres, cujo diretor percebeu as similaridades entre os dois
microrganismos e colocou em contato os cientistas. Finalmente, tendo sido
esclarecida sua identidade, o organismo foi denominado como Listerella
monocytogenes (ROCOURT, 1999).
Porém, em 1939, o nome genérico foi rejeitado pelo Comitê
Internacional em Sistemática Bacteriológica, por ter sido utilizado para nomear
anteriormente outros organismos, ficando finalmente designado em 1940 como
Listeria monocytogenes e definitivamente incluída no Manual Bacteriológico
Determinativo de Bergey em 1948 (ROCOURT, 1999; CRUZ et al., 2008).
O gênero Listeria consta de seis espécies, L. monocytogenes, L.
ivanovii, L. innocua, L. welshmeri, L. seeligeri, e L. grayi. Foi determinado que
Listeria murrayi e L. grayi seriam espécies proximamente relacionadas
(ROCOURT, 1999). Uma atualização taxonômica reconheceu Listeria
monocytogenes e L. ivanovii, sendo a primeira patogênica tanto para o homem
quanto para animais, e a segunda predominantemente para animais (HITCHINS,
2003; ROBERTS & WIEDMANN, 2003).
Os sorotipos de Listeria monocytogenes mencionados por LEMES-
MARQUES et al. (2007) são 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7.
Estes 13 sorotipos são classificados por variações nos antígenos
8
1
9
1
4
somáticos (O) e flagelares (H), enquanto os métodos genéticos diferenciam mais
de 100 subtipos desta espécie (SCARCELLI & PIATTI, 2002; GORSKI et al.,
2006; LÓPEZ et al., 2006). Existem, porém, autores como BOU-M`HANDI et al.
(2007) que consideram somente 12 sorotipos.
2.1. Condições de crescimento
Listeria monocytogenes é um microrganismo Gram positivo, anaeróbio
facultativo, e psicrotrófico, amplamente distribuído no meio ambiente e
frequentemente encontrado em alimentos, que se multiplica em temperaturas
entre 1 e 45ºC e causa listeriose, doença invasiva com elevada taxa de letalidade
entre indivíduos contaminados (entre 20 e 30%), afeta geralmente a mulheres
grávidas, recém nascidos e adultos com sistema imunológico comprometido
(LEMES-MARQUES et al., 2007; RAMASWAMY et al., 2007).
Segundo USDA/FSRIO (2005), L. monocytogenes tem capacidade de
crescer em ambientes refrigerados ou no piso de locais de abate, por isso a
remoção incompleta de carne e gordura do equipamento pode impedir uma
apropriada sanitização, principalmente quando se trata de L. monocytogenes,
devido a sua capacidade de formar biofilmes.
L. monocytogenes cresce e se reproduz em temperaturas de
refrigeração, na faixa de 1°C (33°F) a 50°C (122°F), sendo a ótima entre 30°C
(86°F) e 37°C (98.6°F) (AZNAR & ALARCÓN, 2003; RADOSTITS et al., 2004;
USDA/FSRIO, 2005). Sobre isto TODAR (2008) afirma que ela é capaz de
sobreviver a temperaturas de 20 graus negativos. USDA/FSRIO (2005)
esclarecem que somente a pasteurização e temperaturas de ebulição são
suficientes para matar esta bactéria.
O pH de crescimento de L. monocytogenes varia de 4,4 a 9,4; sendo o
7,0 o pH ótimo. Este microrganismo não só é capaz de crescer em concentrações
até 10% de salinidade (NZFSA, 2002; SHIN & RASCO, 2007; CRUZ et al., 2008)
como pode ainda sobreviver por um ano em concentrações de sal acima de 16%
(USDA/FSRIO, 2005). Este fato é importante, pois durante a preparação de
alimentos, muitas vezes não é possível utilizar-se pH e concentrações de sal
5
adequados para prevenir o crescimento de L. monocytogenes
Segundo o USDA/FSRIO (2005) L. monocytogenes cresce em
condições aeróbicas, e pode ainda ser estimulada em condições de baixa
concentração de oxigênio e presença de CO2. Esse crescimento é sinergizado
quando a atividade de água é em torno de 0,90 a 0,97.
Quanto à persistência de L. monocytogenes no ambiente, LUNGU et al.
(2009) afirmaram que devem ser levadas em conta (i) as condições anaeróbicas
encontradas em microambientes do solo e (ii) o adubo orgânico, em lodos de
tratamento de lixo e em silagem, pois estes são barreiras adicionais que o
patógeno precisa enfrentar.
A capacidade de sobrevivência que L. monocytogenes apresenta em
condições adversas, maior do que qualquer outra bactéria não esporulada de
importância como patógeno de origem alimentar, assim como sua habilidade de
colonizar, fazem deste organismo, uma ameaça para a indústria de alimentos
(FENLON, 1999). A este respeito, NICHOLSON, et al. (2004) detectaram uma
sobrevivência no solo acima de 2 anos, e que segundo aqueles autores, foi
originada principalmente pelo uso de adubação orgânica com fezes de animais
que poderiam estar infectados.
HOFER & REIS (2005) encontraram elevada freqüência de L.
monocytogenes em fezes de ruminantes aparentemente saudáveis, sendo estes
animais portadores mais comuns de L. monocytogenes entre animais herbívoros.
O ambiente natural alberga esporadicamente uma diversidade de cepas
de L. monocytogenes, o descaso nas boas práticas de higiene e fabricação pode
transformar o meio ambiente em fonte de cepas virulentas capazes de colonizar
equipamentos e contaminar alimentos (FENLON, 1999).
L. monocytogenes é uma bactéria amplamente distribuída na natureza,
frequentemente isolada do solo, água, detritos vegetais, fezes e alimentos
(GIANFRANCESCHI et al., 2003). Além disso, pelo menos 42 espécies de
mamíferos silvestres e domésticos e 17 espécies de aves podem albergar Listeria
e sabe-se que entre 5 e 10% da população humana é portadora inaparente deste
patógeno (TODAR, 2008).
Quando presente junto à microbiota autóctone, como no leite cru e
6
alguns derivados, a L. monocytogenes pode decrescer em número na medida em
que a microbiota aumenta. Nesta inibição podem estar principalmente envolvidos
fatores como a diminuição de pH e a produção de bacteriocinas (DURMAZ, 2009).
Destacam-se ainda trabalhos realizados por COLEMAN et al. (2003) e GUERRA
& BERNARDO (2005) mostrando o antagonismo existente entre bactérias
endógenas de um alimento e patógenos, onde são consideradas geralmente a
concentração ou carga inicial e os fatores tempo e temperatura para a
sobrevivência de um ou outro grupo bacteriano.
3. MÉTODOS DE DETECÇÃO DE Listeria monocytogenes
A dificuldade de isolamento e distinção de Listeria monocytogenes das
outras espécies do mesmo gênero impulsionou o desenvolvimento de novas
técnicas com variações de agentes seletivos e eletivos (DONNELLY, 1999).
Atualmente, o método padrão utilizado no Brasil, pelo Sistema de
Laboratório Animal do Departamento de Defesa Animal, baseado na Instrução
normativa nº 62/2003 do MAPA no capítulo XIV (BRASIL, 2003). Esse documento
recomenda um enriquecimento seletivo realizado em duas etapas, para inibir a
flora acompanhante e para permitir a multiplicação de pequenas concentrações
de L. monocytogenes.
As provas convencionais para identificação de L. monocytogenes são a
coloração de Gram (+), reação da catalase (+), oxidase (-), hidrólise da
esculina(+), fermentação da glucose e maltose, motilidade (+) a 25ºC em meio
semisólido (em forma de guarda-chuvas), prova CAMP (+) (BENADOF, 2008).
A adição de 0,5% de estrato de levedura ao meio de cultura, ou 0,6%
como utilizado por SCHULZ & BATISTA (2006), facilitaria a reparação de células
injuriadas de L. monocytogenes, que atuam como fonte de vitaminas do complexo
B, necessários para essa bactéria (BESSE, 2002).
Segundo KABUKI, et al. (2004), a detecção e identificação desse
patógeno pode consumir muito tempo, transformando-se num desafio,
principalmente quando L. monocytogenes está presente junto a outras espécies
do mesmo gênero que podem crescer durante o enriquecimento. Os autores
7
ainda explicam que os métodos seletivos não diferenciam L. monocytogenes -
único patógeno humano do gênero - das espécies não patogênicas.
Isoladamente as técnicas tradicionais podem não detectar as fontes de
surtos de listeriose; nesse sentido os métodos de subtipagem molecular
apresentam-se como ferramentas úteis. Entre esses métodos, a eletroforese em
gel de campo pulsado (PFGE- Pulsed Field Gel Electrophoresis) tem grande
sensibilidade e alto poder discriminatório, sendo considerado o gold standard para
a subtipagem de L. monocytogenes (FUGETT et al., 2007; LEMES-MARQUES et
al., 2007).
O PFGE também pode ser usado, em estudos de longo prazo, para
determinar a persistência de uma cepa num ambiente, ou na determinação da
fonte de contaminação externa de um ambiente (SENCZEK et al., 2000;
MORETRO & LANGSRUD, 2004; GARRIDO et al., 2008).
O PFGE utilizado na presente pesquisa, além de ser considerado gold
standard, altamente sensível para determinar o grau de similaridade entre os
isolados encontrados, permite a rastreabilidade do patógeno. Para isso, são
recomendáveis novas pesquisas complementares para estabelecer de maneira
mais precisa a origem de contaminação por Listeria monocytogenes que
considerem amostras também ambientais, tendo em vista suas características
ubiquitárias de crescimento e capacidade de formação de biofilme em superfícies.
3.1. Subtipagem de Listeria monocytogenes
Os métodos de subtipagem são divididos em fenotípicos e genotípicos.
Os métodos fenotípicos detectam características expressas pelos microrganismos
como a sorotipagem, fagotipagem, susceptibilidade antimicrobiana, biotipagem
manual e automatizado, e eletroforese de enzimas (BELKUM et al., 2001).
Dificuldades encontradas na aplicação desses métodos, como respostas
fenotípicas diferenciadas em relação a estímulos ambientais, ou mutações
pontuais onde um simples nucleiotideo pode determinar o funcionamento anormal
de um gene responsável por um fenótipo, estimularam o desenvolvimento de
técnicas baseadas em tipagem molecular do DNA (ARBEIT, 1999).
8
GRAVES et al. (1999) e BELKUM et al. (2001) listam alguns métodos
genotípicos, como a análises de restrição do DNA cromossômico e plasmidial
(restriction endonucleases analysis - REA), ribotipagem, eletroforese em gel de
campo pulsado (pulsed-field gel eletrophoresis - PFGE), DNA polimórfico
amplificado aleatoriamente (randomly amplified polymorphic DNA - RAPD), PCR –
polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (PCR – restriction
fragment lenght polymorphism - PCR-RFLP), entre outros.
A utilização desses métodos em estudos epidemiológicos tem possibilitado
identificar surtos e fontes de infecção, bem como determinar a forma de
transmissão dos microrganismos patogênicos (GRAVES et al., 1999)
Como tentativa de mostrar a necessidade de padronização nos diferentes
métodos de tipagem utilizados para Listeria monocytogenes, BILLE & ROCOURT
(1996) tem realizado levantamento sobre os diferentes métodos utilizados
atualmente. Indicam que os métodos de serotipagem são úteis para estudos
preliminares, devido à utilização de reagentes padronizados que permite uma boa
reprodutibilidade, mais foram observados problemas particularmente relacionados
aos antígenos flagelares de alguns serotipos. Dentre as técnicas genotípicas, são
mencionados como métodos promissores a Análise de Micro-restrição do DNA
(REA- Microrestriction Analysis) e Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE-
Pulsed Field Gel Electrophoresis) pela discriminação e reprodutibilidade, e
sugerem padronizar o protocolo e o sistema computacional de análise dos
resultados.
3.1.1. Divisão filogenética em linhagens de Listeria monocytogenes
Existe ainda discussão sobre a relação da origem de duas linhagens
encontradas em Listeria monocytogenes, relacionadas à listeriose humana, a
linhagem I (cluster I), representada pelo sorovar 1/2b e 4b, e a linhagem II (cluster
II), representada por 1/2a e 1/2c (PARIHAR et al., 2008), sendo que
NIGHTINGALE et al. (2004) defenderam a hipótese de que a linhagem I tem
cepas adaptadas a hospedeiro humano, enquanto a linhagem II contaria com
cepas ambientalmente adaptadas. LÓPEZ et al. (2006) sugeriram que essas duas
9
linhagens formariam duas sub espécies.
FUGETT et al. (2007) ainda lembram a existência de uma terceira
linhagem, representada principalmente por isolados de listeriose animal, que inclui
os sorotipos 4a, 4c e algumas cepas da 4b. LÓPEZ et al. (2006) indicaram que
essa linhagem representa uma unidade taxonômica mais distante, por isso tem
sugerido como uma nova espécie.
A linhagem II de L. monocytogenes está mais adaptada às condições
ambientais. Por outro lado, o sorotipo 4b foi isolado em surtos acontecidos em
tempo e espaço diferentes, pelo que é denominado de “clone epidêmico” (LÓPEZ
et al., 2006; RAMASWAMY et al., 2007).
4. LISTERIOSE
L. monocytogenes produz enfermidade no homem em uma fase inicial
conhecida como forma não invasiva, caracterizada por um quadro semelhante ao
estado gripal e acompanhada de diarréia e febre branda. Esta fase pode passar
despercebida, e transformar o indivíduo em portador. Nesse caso, em media, 5%
eliminam L. monocytogenes nas fezes (GUERRA & BERNARDO, 2004; WALLS &
BUCHANAN, 2005).
LÓPEZ et al (2006) lembraram que, para causar listeriose, são
necessárias no mínimo 102 células viáveis, no caso de grupos de risco, e 104, no
caso de população saudável, apesar disso, explicaram que ainda não se tem
certeza sobre a relação dose-resposta e a virulência de um determinado sorotipo
envolvido num surto. Por isso, todos os sorotipos de L. monocytogenes são
considerados patogênicos. Nesse sentido, MARZOCCA et al. (2004) explicaram
que devido à capacidade que L. monocytogenes tem de se multiplicar quando
armazenados em refrigeração, sem ter inibição por competição com outros
microrganismos, facilmente pode chegar ao número mínimo necessário para
causar listeriose, por isso esses autores tem um critério microbiológico mais
estrito, zero de tolerância. Por outro lado, em estudos de modelagem
epidemiológica da predição dose-resposta, LINDQVIST & WESTÖÖ (2000)
determinaram que a concentração do microrganismo no momento da ingestão foi
10
o fator mais importante na determinação do risco de listeriose.
Sobre a variabilidade de virulência deste patógeno, foi observado que
somente um pequeno número de sorotipos e pulsotipos estão envolvidos nos
surtos epidêmicos de listeriose. Segundo LÓPEZ et al. (2006), somente três
sorotipos (4b, 1/2a e 1/2b) respondem por 89-90% dos casos de listeriose em
nível mundial. Por outro lado, entre 8 e 21% dos isolados de alimentos e
ambientes naturais tem sua virulência atenuada ou são não virulentos.
Até o momento, não está clara a relação da presença de genes de
virulência e a virulência funcional, pois esses genes estão presentes em
praticamente todas as cepas (LÓPEZ et al., 2006). Porém KUN & GOEBEL
(1999) lembraram, porém, que existe uma série de sinais ambientais que essa
bactéria patogênica intracelular detecta para se adaptar no seu meio e expressar
seus genes de virulência. Estes sinais podem ser classificados como
fisioquímicos (temperatura, ferro, glucose, sais, pH, etc.) ou como condições de
estresse (calor, estresse oxidativo, estresse nutricional, crescimento intracelular),
porém os mecanismos de expressão não são bem conhecidos ainda.
Especial cuidado deve ser tomado quando se considera a temperatura
de armazenamento de alimentos que potencialmente podem constituir veículo de
Listeria monocytogenes, como o caso de alimentos consumidos crus ou semi-
crus. Nesse sentido MIETTINEN et al. (1999) relataram que temperaturas de
estocagem inadequadas permitem a multiplicação elevada desta bactéria,
produzindo gastroenteritis febrís não invasivas inclusive em pessoas saudáveis.
Apesar de ter sido descrito um surto de listeriose em coelhos, em 1924,
por MURRAY como indicado por ROCOURT (1999), ocorreu na Dinamarca o
registro do primeiro caso em humanos (GUERRA & BERNARDO, 2004). Estudos
epidemiológicos, nos últimos anos, apontaram L. monocytogenes como causa da
doença humana conhecida como listeriose, associada somente em 1981 ao
consumo de alimentos contaminados com essa bactéria (ROCOURT, 1999;
SLUTSKER & SCHUCHAT, 1999).
De acordo com GUERRA & BERNARDO (2004) e SCARCELLI &
PIATTI (2002), a listeriose humana é uma infecção oportunista, com
manifestações clínicas severas, principalmente em grupos de risco, como
11
gestantes e seus fetos, os recém-nascidos, idosos e os adultos com sistema
imunitário deprimido. Assim, CHARPENTIER & COURVALIN (1999) qualificaram
a listeriose como doença emergente transmitida por alimentos.
Para SCARCELLI & PIATTI (2002), a listeriose grave pode se
manifestar em duas formas: a neurológica e a abortiva. Quando neurológica,
observam-se as encefalites, meningites e abscessos cerebrais, enquanto na
forma abortiva pode acontecer placentite ou septicemia em fetos, assim como
nascimento prematuro. Clinicamente, a listeriose pode ter uma variedade de
manifestações, desde a óculoglandular (conjuntivite), cervicoglandular (associado
à faringe), pneumônica (geralmente com sintomas parecidos à febre tifóide) ou
cutânea (VARGAS et al., 2006). Porém, só recentemente foi reconhecido o
quadro clínico gastrentérico causado por L. monocytogenes, designada como
gastrenterite listérica ou listeriose não invasiva, com manifestações de diarréia,
cefaléias e dores abdominais, vômitos e fadiga (GUERRA & BERNARDO, 2004).
Em relação às formas de contágio, este patógeno pode ter uma porta
de entrada oral, ocular, respiratória e urogenital, muitas vezes por contato direto
com animais infectados ou por contaminação cruzada (GUERRA & BERNARDO,
2004). Assim, RADOSTITS et al. (2002) admitiram que pessoas relacionadas com
a agricultura sejam as mais suscetíveis à contaminação por listeria, podendo
ocorrer dermatite com pústulas e pápulas nos braços de veterinários após
manuseio em partos distócicos e fetos abortados.
De acordo com dados já mencionados antes, o número de células
presentes em alimentos contaminados que causaram listeriose é sempre superior
a 100 UFC/g. Porém, devido aos procedimentos de contagem, muitas vezes não
padronizados, e ao tempo transcorrido entre o consumo e a análise do alimento,
existe possibilidade de crescimento ou inativação de Listeria. Assim, os resultados
nem sempre são indicativos do número de organismos realmente ingeridos
(ROCOURT, 1999; KELLS & GILMOUR, 2004).
4.1. Epidemiologia
Conforme discorremos anteriormente, desde 1929 Listeria
12
monocytogenes é reconhecida como patógeno humano, que causa a listeriose.
Contudo, não existem dados suficientes para esclarecer o número mínimo de L.
monocytogenes, suficiente para causar infecção. Na tentativa de estabelecer uma
estimativa de risco, LINDQVIST & WESTÖÖ (2000) utilizaram modelagem de
simulação, para caracterização de perigo de consumo de peixe contaminado com
L. monocytogenes em grupos de alto e baixo risco, identificando problemas de
falta de informação sobre a proporção de cepas virulentas e de sua prevalência.
Esse tipo de modelagem também permitiu fazer uma estimativa sobre as
conseqüências econômicas e sociais derivadas da listeriose humana no Canadá,
com risco de custo anual que pode variar entre 111 a 126 milhões de dólares por
ano (FARBER et al., 1996).
O aumento da população suscetível e da população de idosos, junto às
mudanças de produção de alimentos processados prontos para o consumo, são
considerados fatores determinantes para o aumento mundial no número de casos
de listeriose (CRESPO et al., 1999; THOMSON, 2004). A este respeito, a Figura 1
mostra a ampla distribuição de listeriose em nível global.
Figura 1: Distribuição mundial de Listeria monocytogenes
Fonte: http://www.pathogencombat.com/Industry/industry-home-french/Interesting-
Articles.aspx
Uma visão clara dos acontecimentos atuais relacionados à listeriose,
13
diz respeito ao último surto conhecido globalmente, acontecido no Canadá, entre
julho e agosto de 2008, que deixou um saldo de 23 mortos e 57 casos
confirmados, como mostrados no CNN (2008).
A partir de julho, havia sido detectado, pela vigilância sanitária, um
aumento no número de casos notificados de listeriose. No final de agosto, antes
da associação do surto com a empresa de alimentos suspeita, foram recolhidos
os produtos suspeitos -de forma voluntária pela própria empresa- como mostrado
na Figura 4, o que representou um custo de 20 milhões de dólares para a
companhia. Alem disso, as vítimas envolvidas no surto entraram em ação judicial
com pedido de 350 milhões de dólares de indenização (CNN, 2008).
Figura 2: Anúncio em estabelecimento comercial sobre a retirada de produtos
cárneos suspeitos de veicular Listeria monocytogenes no surto de
listeriose de 2008 no Canadá.
Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/2008_Canadian_listeriosis_outbreak
A partir desse fato, foi emitido um documento pelo Ministro da Saúde do
Canadá, em abril de 2009, relativo às medidas tomadas e lições aprendidas com
o surto acontecido em agosto de 2008. Apesar de afirmar que Canadá teria o
14
melhor sistema de segurança alimentar no mundo, o Ministro admitiu que não
foram capazes de prevenir a perda de vidas humanas. Lembrou o trabalho
continuo da equipe laboratorial e o tempo de realização dos testes laboratoriais
durante o surto, às vezes questionados por serem muito demorados, necessário
para se ter resultados científicos confiáveis, o que leva o Canadá, entre outras
medidas, a buscar o desenvolvimento de novas técnicas mais rápidas (HEALT
CANADA, 2009; CFIA- Canadian Food Inspection Agency, 2009).
No Brasil, embora tenha sido isolado L. monocytogenes de vários tipos
de alimentos, não foi relatado ainda surto ou caso esporádico, sendo que existem
poucos estudos sobre a incidência de L. monocytogenes. Soma-se a isso a
informação de SILVA et al. (2007), sobre o número de casos confirmado de
toxinfecções alimentares que chegaria somente a 10% do número real. Segundo
BRASIL (2006), a listeriose não tem notificação compulsória. Por outro lado
contamos com somente algumas normativas como a Resolução nº 12 de janeiro
de 2001 (BRASIL, 2001) que exige o controle de listeria em alimentos
processados é destinada a queijos de elevada umidade, como ricota, meia cura e
minas frescal, também existe a instrução normativa nº 9 de agosto de 2009, que
institui procedimentos de controle da L. monocytogenes em produtos de origem
animal prontos para o consumo, que no futuro auxiliarão a determinar dados da
prevalência deste patógeno nesse grupo de alimentos de risco.
4.2. Listeriose em animais
A listeriose animal compartilha uma variedade de sintomas com a
listeriose humana. Dessa forma, os animais apresentam três tipos de
manifestação da doença causada por L. monocytogenes, septicemia, abortiva e
neurológica, sendo a última mais comum em ovinos, caprinos e bovinos. A forma
abortiva também é causada pela L. ivanovii (RISSI et al., 2006; TODAR, 2008).
O período de incubação de listeriose em animais varia entre 2-3
semanas, derivando em óbito no primeiro ou quarto dia após a incubação. No
caso de listeriose encefalitica, devido à ausência de sintomas clínicos iniciais e à
dificuldade no diagnóstico antes da morte repentina, o tratamento de listeriose
15
não têm sucesso tanto em animais quanto em humanos (ROBERTS &
WIEDMANN, 2003)
Neste fato, é importante tomar em consideração que o ambiente da
fazenda pode ser reservatório em potencia de L. monocytogenes, sendo que
foram relatadas por CRESPO et al. (1999) 37 espécies de mamíferos e 17 de
aves como reservatórios desta bactéria, entre eles animais domésticos e
selvagens.
NIGHTINGALE et al. (2004), no Estado de Nova York, EUA,
confirmaram que a Listeria monocytogenes é depositada no solo por fezes de
animais contaminados o que contribui na amplificação e dispersão do patógeno.
Já no Brasil, HOFER & REIS (2005) também confirmam a presença de Listeria,
principalmente nas fezes de animais muitas vezes normais.
A listeriose em animais é importante não somente pelas perdas
econômicas inerentes, mas também pela possibilidade de relacionar a
contaminação ambiental com a humana (WESLEY, 1999; ROBERTS &
WIEDMANN, 2003).
5. VEICULAÇÃO DE Listeria monocytogenes
Acredita-se que os alimentos contaminados sejam a via principal de
transmissão de L. monocytogenes para o homem (RAMASWAMY et al., 2007).
Assim, GUERRA & BERNARDO (2004) relataram que quase todos os surtos
descritos até agora estão relacionados ao consumo de alimentos processados,
sugerindo a existência de um grupo de alimentos de alto risco na veiculação deste
patógeno, onde se encontram os prontos para consumo que precisam de
refrigeração, peixes defumados, carnes e queijos frescos, uma vez que não são
submetidos a qualquer tratamento térmico imediato antes do consumo.
Em resposta ao problema de contaminação de alimentos, a maioria dos
países vem elaborando medidas de proteção de seus mercados, por meio de
acordos específicos que são a base legal do comercio internacional (KROPF,
2003).
Como observado na Figura 3, os alimentos tem um papel determinante
16
na patogênese de listeriose, por suas características inerentes de pH, atividade
de água, bem como condições de preparação e armazenamento. Adicionalmente,
o patógeno, durante sua propagação, interage com o ambiente, seja natural, do
próprio alimento ou do hospedeiro (ROBERTS & WIEDMANN, 2003).
FIGURA 6. Papel central dos alimentos na transmissão de Listeria
monocytogenes e fatores envolvidos na listeriose
Fonte: Adaptado de ROBERTS & WIEDMANN (2003)
6. PREVENÇÃO DE LISTERIOSE
Existem fatores de risco na dieta alimentar para o aparecimento de
listeriose humana, relacionados a alimentos não processados incluindo o leite
pasteurizado -quando mal pasteurizado ou contaminado após o processamento-
os queijos frescos, vegetais contaminados, além de outros. Para minimizar os
Ambiente
Alimento
Patógeno
Hospedeiro Estado imunológico
Suscetibilidade genética
Genes de Virulência
Manifestação dos genes
Temperatura,
disponibilidade de H2O, pH
17
casos de listeriose humana, SLUTSKER & SCHUCHAT (1999) propõem vigilância
e fiscalização constantes, assim como a implantação do sistema APPCC/HACCP
(Análise dos Perigos e Pontos Críticos de Controle/Hazard Analysis and Critical
Control Points), com auxílio governamental.
Segundo a FAO/WHO (2006) a segurança alimentar é de
responsabilidade dos governos oficiais e nesse sentido a implementação do
sistema APPCC vem ao encontro dessa necessidade, por ser um programa que
visa a qualidade de alimentos, baseada em etapas relacionadas ao
processamento industrial, desde a obtenção da matéria prima até o produto final
(RIBEIRO-FURTINI & ABREU, 2006).
No Brasil, há a Portaria 1.428 de 23 de novembro de 1993 do Ministério
de Saúde, que regulamenta a produção de alimentos baseada no conceito de
Boas Práticas de Fabricação/Good Manufacturing Practices (BPF/GMP) e em
Procedimentos Padrão de Higiene Operacional/ Standard Sanitizing Operating
Procedures (PPHO/SSOP) (BRASIL, 1993).
Na procura de adequação das necessidades da sociedade e a
demanda internacional pelo comércio de produtos seguros, surge a Portaria 46 do
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento-MAPA (BRASIL, 1998), que
estipula a adoção gradativa, por parte da indústria de produtos de origem animal,
do APPCC.
Atualmente, os procedimentos de controle da L. monocytogenes em
produtos de origem animal prontos para o consumo que cumprem certas
características de pH, atividade de água e salinidade, estão instituídos na Portaria
No 09, do MAPA (BRASIL, 2009), que aplica-se a estabelecimentos que fabricam
produtos de origem animal, prontos para o consumo e determina, entre outros, o
cumprimento das seguintes características físico-químicas: pH > 4.4 (superior a
quatro ponto quatro) ou Atividade de Água > 0.92 (superior a zero ponto noventa
e dois) ainda concentração de cloreto de sódio <10 % (inferior a dez por cento),
respeitadas as características de seus processos de produção.
Isto posto e consideranda a relevância do tema, objetivou-se no
presente trabalho identificar L. monocytogenes em produtos de origem animal,
bem como caracterizar geneticamente os isolados com a finalidade de determinar
18
a similaridade entre elas, além de determinar a susceptibilidade dos mesmos a
antimicrobianos.
7 REFERÊNCIAS
1. ARBEIT, R.D. Laboratory procedures for the epidemiologic analysis of
microorganisms. . in: _____.MURRAY, P.R.; BARON, E.J.; PFALLER, M.A.;
TENOVER, F.C.; YOLKEN, R.H. Manual of Clinical Microbiology, 7th ed.,
pp.116-137, Washington, DC: American Society for Microbiology. 1999.
2. AZNAR, R.; ALARCON, B. PCR detection of Listeria monocytogenes: a study
of multiple factors affecting sensitivity. Journal of Applied Microbiology,
UK. v.5, n.95, p.958-966, 2003.
3. BELKUM, A.; STRUELENS, M.; VISSER, A.; VERBRUGIL, H.; TIBAYRENC,
M. Role of genomic typing in taxonomy, evolutionary genetics, and microbial
epidemiology. Clinical Microbiology Reviews, Basel, Switzerland. v.14, n.3,
p. 547-560, 2001.
4. BENADOF, D. Listeria monocytogenes. Revista Chilena de Infectologia,
Santiago. v.25, n.5, p.350, 2008.
5. BESSE, N.G. Influence of various environmental parameters and of detection
procedures on the recovery of stressed L. monocytogenes: a review. Food
Microbiology, Amsterdam. v.19, p.221-234, 2002.
6. BILLE, J; ROCOURT, J. WHO Internation multicenter Listeria
monocytogenes subtyping study-rationale and set-up of the study.
International Journal of Food Microbiology. Amsterdam. v.32, n.3. p.251-
262, 1996.
7. BOU-M´HANDI, N.; JACQUET, C.; EL MARRAKCHI, A.; MARTIN, P.
Phenotypic and Molecular Characterization of Listeria monocytogenes strains
isolated from a marine environment in Morocco. Foodborne Pathogens and
Disease. Delft. v.4, n.4, p.409-417, 2007.
19
8. BRASIL. Ministério de Saúde. Portaria n. 1428, de 26 de novembro de 1993.
Aprova o "Regulamento Técnico para Inspeção Sanitária de Alimentos", as
"Diretrizes para o Estabelecimento de Boas Práticas de Produção e de
Prestação de Serviços na Área de Alimentos" e o "Regulamento Técnico
para o Estabelecimento de Padrão de Identidade e Qualidade (PIQ´s) para
Serviços e Produtos na Área de Alimentos". Diário Oficial da União,
Brasília, DF, de 02 de dezembro de 1993. Seção 1.
9. BRASIL. Ministério da Agricultura e Abastecimento. Portaria n. 46, de 10 de
fevereiro de 1998. Institui o sistema de análise Institui o Sistema de Análise
de Perigos e Pontos Críticos de Controle - APPCC a ser implantado,
gradativamente, nas indústrias de produtos de origem animal sob o regime
do serviço de inspeção federal - SIF, de acordo com o manual genérico de
procedimentos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 10 fev. 1998. Seção 1.
10. BRASIL. Ministerio de Saúde/Secretaría de Vigilância em Saúde. MS/SVS.
Resolução – RDC No 12, de 02 de janeiro de 2001. Aprova regulamento
sobre padrões microbiológicos para alimentos e seus Anexos I e II. Diário
Oficial da União, Brasília, DF. n.7, p.45-53, de 10 de jan. de 2001. Seção 1.
11. BRASIL. Ministerio de Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária/
Secretaría de Defesa Agropecuária. MAPA/DAS. Instrução Normativa No 62,
de 26 de agosto de 2003. Oficializa os Métodos Analíticos Oficiais para
Análises Microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água.
Diário Oficial da União, Brasília, DF, p.14, de 18 de set. de 2003. Seção 1.
12. BRASIL. Ministerio de Saúde/Secretaría de Vigilância em Saúde. MS/SVS.
Portaria No 5, de 21 de fevereiro de 2006. Inclui doenças na relação nacional
de notificação compulsória, define doenças de notificação imediata, relação
dos resultados laboratoriais que devem ser notificados pelos Laboratórios de
Referência Nacional ou Regional e normas para notificação de casos, Diário
Oficial da União, Brasília, DF. n.38, p.34, de 22 de fev. de 2006. Seção 1.
13. BRASIL. Ministério da Agricultura e Abastecimento. Portaria n. 09, de 08 de
abril de 2009. Institui os Procedimentos de Controle da Listeria
monocytogenes em produtos de origem animal prontos para o consumo.
Diário Oficial da União, Brasília, DF, 09 abr. p. 9. 2009. Seção 1.
20
14. CFIA. Canadian Food Inspection Agency. Certain-ready-to-eat deli meat
products produced at establishment 97B may contain Listeria
monocytogenes. [online], 19/08/2008. Disponível em:
http://www.inspection.gc.ca/english/corpaffr/recarapp/2008/20080819e.shtml.
Acesso em: nov. 2009.
15. CHARPENTIER, E.; COURVALIN, P. Antibiotic Resistance in Listeria spp.
Minireview. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, DC.
v.43, n.9, p.2103-2108. 1999.
16. CNN. Cable News Network. Canadian Links Toronto plant to deadly
listeriosis outbreak. [online]CNNHealth.com. 24/08/2008. Disponível em:
http://www.cnn.com/2008/HEALTH/08/24/listeria.outbreak/index.html. Acesso
em: nov. 2008.
17. COLEMAN, M.E.; SANDBERG, S.; ANDERSON, S.A. Impact of microbial
ecology of meat and poultry products on predictions from exposure
assessment scenarios for refrigerated storage. Risk Analysis, New York.
v.23, n.1, p.215-228, 2003.
18. CRESPO, M.P.; VÉLEZ, J.D.; CASTANHEDA, CL.; HOYOS, F.; LÓPEZ,
M.L.; SALAZAR, J.C. Aislamiento de Listeria monocytogenes em um hospital
de tercer nível. Colômbia Médica, Cali. v.30, n.002, p.89-98, 1999.
19. CRUZ, C.D., MARTINEZ, M.B.; DESTRO, M.T. Listeria monocytogenes: Um
agente infeccioso ainda pouco conhecido no Brasil. Alimentos e Nutrição,
Araraquara. v.19, n.2, p.195-206, 2008.
20. DONNELLY, C.W. Conventional methods to detect and isolate Listeria
monocytogenes. in: _____.Listeria, Listeriosis, and food safety, 2nd. ed.
Marcel Dekker, Inc., New York, 1999. chap.7, p. 225-260.
21. DURMAZ, H. Fate of Listeria Monocytogenes in Carra cheese. Journal of
Food Safety. v.29, n.2, p. 253-260, 2009.
22. FAO/WHO – FOOD and AGRICULTURE ORGANIZATION/WORLD HEALTH
ORGANIZATION. Guidance to governments on the application of
HACCP in small and/or less-developed food businesses. FAO Food and
Nutrition Paper. Rome. 86 p. 2006. Disponível em:
21
http://books.google.com.br/books?id=--
J0iHdmPtwC&pg=PA41&lpg=PA41&dq=Guidance+to+governments+on+the+
application+of+HACCP+in+small+and/or+less-
developed+food+businesses%2Bfao&source=bl&ots=CeGEBKCivA&sig=Yg1
vvzQph3OsiQprZ6DwuLnLUW0&hl=pt-
BR&ei=43gBS7_mMYGGuAfZ0NTdDw&sa=X&oi=book_result&ct=result&res
num=1&ved=0CAgQ6AEwAA#v=onepage&q=&f=false. Acesso em: 16 nov.
2009.
23. FARBER, J.M.; ROSS, W.H.; HARWIG, J. Health risk assessment of Listeria
monocytogenes in Canada. International Journal of Food Microbiology.
Amsterdam. v.30, n.1-2, p.145-156, 1996.
24. FENLON, D.R. Listeria monocytogenes in the natural environment.. in:
_____.Listeria, Listeriosis, and food safety, 2nd. ed. Marcel Dekker, Inc.,
New York, 1999. chap.2, p. 21-37.
25. FIGUEIREDO, A. Tocantins comemora 10 anos sem aftosa em grande estilo.
Agência de Defesa Agropecuária – ADAPEC. Governo do Estado do
Tocantins. Leitura 119, 2007. http://adapec.to.gov.br/noticia.php?id=61
26. FUGETT, E.B.; SHOONMARKER-BOPP, D.; DUMAS, N.B.; CORBY, J.;
WIEDMANN, M. Pulsed-Field gel electrophoresis (PFGE) analysis of
temporally matched Listeria monocytogenes isolates from human clinical
cases, foods, ruminant farms, and urban and natural environments reveals
source-associated as well as widely distributed PFGE types. Journal of
Clinical Microbiology, Washington, DC. v.45, n.3, p. 865-873, 2007.
27. GARRIDO, V.; TORROBA, L.; GARCÍA-JALÓN, I.; VITAS, A.I. Surveillance
of listeriosis in Navarre, Spain, 1995-2005 – Epidemiological patterns and
characterization of clinical and food isolates. Eurosurveillance. Stockholm.
v.13, n.49, p.16-35, 2008.
28. GIANFRANCESCHI, M.; GATTUSO, A.; TARTARO, S.; AURELI, P.
Incidence of Listeria Monocytogenes in Food and Environmental Samples in
Italy between 1990 and 1999: Serotype Distribution in Food, Environmental
and Clinical Samples. European Journal Epidemiology, Amsterdam. v.18,
22
N.10, p.1001-1006, 2003.
29. GORSKI, L.; FLAHERTY, D.; MANDRELL, R.E. Competitive fitness of
Listeria monocytogenes serotype 1/2a and 4b strain in mixed cultures with
and without food in the U.S. Food and Drug Administration Enrichment
Protocol. Applied and Environmental Microbiology. Washington, DC. v.72,
n.1, p.776-783, 2006.
30. GRAVES, L.M.; SWAMINATHAN, B.; HUNTER, S.B. Subtyping Listeria
monocytogenes. In: RYSER, E.; MARTH, E.H. (Ed.) Listeria, listeriosis and
food safety. 2nd. Ed. New York: Marcel Dekker. 1999. Chap. 9, p. 279-298.
31. GUERRA, M.M.; BERNARDO, F.A. O risco da listeriose e a identificação do
perigo. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias. Lisboa, v.99, n.550,
p.69-76, 2004.
32. GUERRA, M.M.; BERNARDO, F.A. Influência da microflora de cura na
ocorrência de Listeria spp. em queijos tradicionais. Revista Portuguesa de
Ciências Veterinárias. Lisboa. n.100, p. 185-188. 2005.
33. HEALT CANADA. Lessons learned from listeriosis outbreak: Remarks by
Deputy Minister of Healt Canada, Morris Rosenberg, to the Sub-Committee
on Food Safety of the standing Committee on Agriculture. [online],
22/04/2009. Disponível em: http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/securit/ill-
intox/listeria/listeria_speech-discours-eng.php. Acesso em: nov. 2009.
34. HITCHINS, A.D. Food and Drug Administration (FDA)/Center for Food Safety
& Applied Nutrition (CFSAN). 2003. Detection and enumeration of Listeria
monocytogenes in foods. Bacteriological Analytical Manual. Disponível
em: <http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-10.html>. Acesso em: 27out.
2009.
35. HOFER, E.; REIS, M.F. Espécies e sorovares de Listeria isolados de animais
doentes e portadores no Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira. Rio de
Janeiro. v.2, n.25, p.79-83, 2005
36. KABUKI, D.Y.; WIEDMANN, M.; BOOR, K.J. Molecular subtyping and
tracking of Listeria monocytogenes in latin-style-fresh-cheese processing
plants. Journal of Dairy Science. Champaign. v.87, n.9. p.2803-2812, 2004.
23
37. KELLS, J. & GILMOUR, A. Incidence of Listeria monocytogenes in two milk
processing environments, and assessment of Listeria monocytogenes blood
agar for isolation. International Journal of Food Microbiology. Amsterdam.
v.91, n.2, p.167-174, 2004.
38. KROPF, R.S.F. HACCP e as barreiras técnicas. Ponto focal de barreiras
técnicas ás exportações. Inmetro. Rio de Janeiro. PP.10, 2003. Disponível
em: http://www.inmetro.gov.br/infotec/artigos/docs/8.pdf. Acesso em: Nov.
2009.
39. KUHN, M. & GOEBEL, W. Pathogenesis of Listeria monocytogenes. in:
_____.Listeria, Listeriosis, and food safety, 2nd. ed. Marcel Dekker, Inc.,
New York, 1999. chap.5, p. 97-130.
40. LEMES-MARQUES, E.G.; CRUZ, C.D.; DESTRO, M.T. Pheno- and
genotypic characterization of Listeria monocytogenes clinical isolates from
southwestern region of the State of São Paulo, Brazil. Brazilian Journal of
Microbiology. São Paulo. v.38, p. 287-292, 2007.
41. LARANJEIRA, C.; MENTA, F. Tocantins imuniza mais de 99% do seu
rebanho. Agência de Defesa Agropecuária – ADAPEC. Governo do Estado
do Tocantins. Leitura 155, 2008. http://adapec.to.gov.br/noticia.php?id=196
42. LINDQVIST, R.; WESTÖÖ, A. Quantitative risk assessment for Listeria
monocytogenes in smoked or gravad salmon and rainbow trout in Sweden.
International Journal of Food Microbiology. Amsterdam. v.58, n.3, p.181-
196, 2000.
43. LÓPEZ, V.; SUÁREZ, M.; CHICO-CALERO, I.; NAVAS, J.; MARTÍNEZ-
SUÁREZ, J.V. Listeria monocytogenes en alimentos: ¿son todos los
aislamientos igual de virulentos?. Revista Argentina de Microbiologia.
Buenos Aires. v.38, p.224-234, 2006.
44. LUNGU, B.; RICKE, S.C.; JOHNSON, M.G. Growth, survival, proliferation
and pathogenesis of Listeria monocytogenes under low oxygen or anaerobic
conditions: A review. Anaerobe. London. v.15, n.15, p.7-17, 2009.
45. MARZOCCA, M.A.; MARUCCI, M.A.; SICA, P.L.; ALVAREZ, E.E. Deteccion
de Listeria monocytogenes en distintos productos alimenticios y en muestras
24
ambientales de una amplia cadena de supermercados de la ciudad de Bahia
Blanca (Argentina). Revista Argentina de Microbiologia. Buenos Aires.
v.36, p.179-181, 2004.
46. MIETTINEN, M.K.; SIITONEN, A.; HEISKANEN, P.; HAAJANEN, H.;
BJÖRKROTH, K.J.; KORKEALA, H.J. Molecular epidemiology of an outbreak
of febrile gastroenteritis caused by Listeria monocytogenes in cold-smoked
rainbow trout. Journal of Clinical Microbiology. Washington, DC. v.37, n.7,
p.2358-2360, 1999.
47. MORETRO, T. & LANGSRUD, S. Listeria monocytogenes: Biofilm formation
and persistence in food-processing environments. Biofilms. Cambridge
Journals. v.1, p.107-121. 2004.
48. NICHOLSON, F.A.; CHAMBER, B.J.; MOORE, A.; NICHOLSON, R.J.;
HICKMAN, G. Assessing and managing the risks of pathogen transfer from
livestock manures into the food chain. Water and Environmental Journal.
v.18, n.3, p.155-160, 2004.
49. NIGHTINGALE, K.K.; SCHUKKEN, Y.H.; NIGHTINGALE, C.R.; FORTES,
E.D. HO, A.J.; HER, Z.; GROHN, Y.T.; McDONOUGH, P.L. Ecology and
transmission of Listeria monocytogenes infecting ruminants and in the farm
environment. Applied and Environmental Microbiology, v.70, n.8, p.4458-
4467, 2004.
50. NZFSA – New Zealand Food Safety Authority. Microbial Pathogen Data
Sheets – Listeria monocytogenes. Prepared for the Ministry of Health. p. 1-4,
2002. Disponível em: http://www.nzfsa.govt.nz/science/data-sheets/listeria-
monocytogenes.pdf. Acesso em: nov. 2009.
51. PARIHAR, V.S.; LOPEZ-VALLADARES, G.; DANIELSSON-THAM, M-L., et
al., Characterization of human invasive isolates of Listeria monocytogenes in
Sweden 1986-2007. Journal of Foodborne Pathogens and Disease, New
York. v.5, n.6, p. 755-761, 2008
52. RADOSTITS, O.M.; GAY, C.C.; BLOOD, D.C.; HINCHCLIFF, K.W. Clínica
Veterinária – Um tratado de doenças dos bovinos, ovinos, suínos, caprinos e
eqüinos. Nona ed., Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. 2002. p.661-665.
25
53. RAMASWAMY, V.; CRESENCE, V.M.; REJITHA, J.S.; LEKSHMI, M.U.;
DHARSANA, K.S.; PRASAD, S.P.; VIJILA, H.M. Listeria – review of
epidemiology and pathogenesis. Journal of Microbiology, Immunology
and Infection, Taiwan. v.40, p. 4-13, 2007.
54. RIBEIRO-FURTINI, L. L.; ABREU, L. R. UTILIZAÇÃO DE APPCC NA
INDÚSTRIA DE ALIMENTOS – COMUNICAÇÃO. Ciência agrotécnica,
Lavras. v.30, n.2, p.358-363, 2006.
55. RISSI, D.R.; RECH, R.R.; BARROS, R.R.; KOMMERS, G.D.; LANGOHR,
I.M.; PIEREZAN, F.; BARROS, C.S.L. Forma nervosa de listeriose em
caprinos. Pesquisa Veterinária Brasileira. Rio de Janeiro. v.26, n.1, p.14-
20, 2006.
56. ROBERTS, A.J.; WIEDMANN, M.W. Pathogen, host and environmental
factors contributing to the pathogenesis of listeriosis. Cellular and Molecular
Life Sciences. Basel. v.60, p.904-918, 2003.
57. ROCOURT, J. The genus Listeria and Listeria monocytogenes: Phylogenetic
position, taxonomy, and identification. in: _____.Listeria, Listeriosis, and
food safety, 2nd. ed. Marcel Dekker, Inc., New York, 1999. chap.1, p. 1-20.
58. SCARCELLI, E.; PIATTI, R.M. Patógenos emergentes relacionados à
contaminação de alimentos de origem animal. Biológico. v.64, n.2, p.123-
127. 2002.
59. SENCZEK, D.; STEPHAN, R.; UNTERMANN, F. Pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE) typing of Listeria strains isolated from a meat
processing plant over a 2-year period. International Journal of Food
Microbiology. Amsterdam. v.62, p. 155-159, 2000.
60. SHANK, F.R.; ELLIOT, E.L.; WACHSMUTH, I.K.; LOSIKOFF, M.E. US
position on Listeria monocytogenes in foods. Food Control. Vurrey. v.7,
n.415, p.229-234, 1996.
61. SHIN, J.H.; RASCO, B.A. Effect of water phase salt content and storage
temperature on Listeria monocytogenes survival in chum salmon
(Oncorhynchus keta) roe and caviar (ikura). Journal of Food Science.
Chicago. v.72, n.5, 2007.
26
62. SILVA, M.R.; MIRANDA, V.P.; MENIN, A.; FERNANDES, F.S. Doenças
transmitidas pelo leite e sua importância em saúde pública. Ciência do
Leite. [online]. Jan. 2007. Disponível em:
http://www.cienciadoleite.com.br/doencastransmitidaspelo%20leite.htm.
Acesso em: Nov. 2009.
63. SLUTSKER, L. & SCHUCHAT, A. Listeriosis in humans. in: _____.Listeria,
Listeriosis, and food safety, 2nd. ed. Marcel Dekker, Inc., New York, 1999.
chap.4, p. 75-95.
64. SCHULZ, D; BATISTA, C.R.V. Atividade antibacteriana do extrato bruto de
Bacillus amyloliquefaciens frente a diferentes indicadores. Alimentos e
Nutrição. Araraquara, v.17, n1, p.73-77, 2006.
65. TODAR, K. Listeria monocytogenes. Todar's Online Textbook of
Bacteriology. University of Wisconsin-Madison, Department of Bacteriology.
2008. Disponível em: http://www.textbookofbacteriology.net/Listeria.html. 22
nov. 2009.
66. THOMSON, R.B. What is your MIC IQ?. (online). ). Etest News No 30. AB
biodisk. Solna, Sweden. 2004. Disponível em:
http://www.abbiodisk.com/pdf/etest_news/M0000485.pdf, Acesso em:11 set.
2009.
67. USDA/FSRIO – United States Department of Agriculture/Food Safety
Research Information Office. Pathogens and Contaminants. A focus on
Listeria monocytogenes. – Dec. 2005. Disponível em:
http://fsrio.nal.usda.gov/document_fsheet.php?product_id=156. Acesso em:
1º Nov. 2009.
68. VARGAS, L.V.; PIANTA, C.; IKUTA, N.; OLIVEIRA, S.J. Detecção de Listeria
monocytogenes em amostras de queijo colonial maturadas a temperatura
ambiente e sob refrigeração. Veterinária em Foco. v.4, n.1, p.31-43, 2006.
69. WALLS, I.; BUCHANAN, R.L. Use of food safety objectives as a tool for
reducing foodborne listeriosis. Food Control. Vurrey. v.16, p.795-799. 2005.
70. WESLEY, I.V. Listeriosis in animals. in: _____.Listeria, Listeriosis, and
food safety, 2nd. ed. Marcel Dekker, Inc.,New York. 1999. chap.3, p. 39-73.
27
CAPÍTULO II: CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE Listeria monocytogenes
ISOLADA EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL
COMERCIALIZADOS EM ARAGUAÍNA – TO.
RESUMO. A listeriose, infecção de origem alimentar, é causada pela Listeria
monocytogenes, bastonete amplamente disseminado no ambiente, patogênico
para animais e humanos. Embora tenha baixa prevalência, apresenta alto índice
de mortalidade, em torno de 20% a 40% da população susceptível, com sistema
imunológico comprometido. No presente trabalho, objetivou-se detectar a
presença de L. monocytogenes em alimentos de origem animal provenientes de
Araguaína, TO pelos métodos bacteriológicos convencionais e sistema imuno-
enzimático mini-VIDAS® (BioMérieux Vitek, Inc., Missouri, USA). Foram
coletadas 120 amostras de alimentos de origem animal em Araguaína, TO, entre
agosto de 2008 e março de 2009, sendo 30 de carne moída bovina, 30 de
lingüiça mista, 30 de leite in natura e 30 de queijo frescal. Após enriquecimento,
as amostras foram analisadas pelo mini-VIDAS® L. monocytogenes (LMO). Foi
encontrado que 6 (20%) das amostras de carne moída e 6 (20%) das amostras
de linguiça mista foram positivas para L. monocytogenes, e não se detectou a
presença desta bactéria nas amostras de leite in natura e queijo frescal. Os
valores encontrados em amostras de carne moída e lingüiça mista frescal são
relativamente altos quando comparados com dados de outros estados
brasileiros. A negatividade em todas as amostras dos produtos lácteos pode ser
devida à competição entre L. monocytogenes e a microbiota autóctone destes
produtos, geralmente comercializados em temperatura ambiente. Nestas
condições, pode-se concluir que tanto a carne moída crua quanto a lingüiça
mista, comercializada em açougues de Araguaína,TO, representam importante
veículo de Listeria monocytogenes.
Palavras-chave: Contaminação de alimentos, ensaio imunoenzimático, Listeria
monocytogenes, Patógeno de origem alimentar.
28
PHENOTYPIC CHARACTERISTICS OF Listeria monocytogenes ISOLATED
FROM ANIMAL PRODUCTS SOLD IN ARAGUAINA- TO
ABSTRACT. Listeriosis is a foodborne disease caused by Listeria
monocytogenes, which is widely distributed in the environment and is pathogenic
to animals and human beings. Although listeriosis has low prevalence, it has a
high mortality rate of between 20% and 40% of susceptible populations with an
immunocompromised system. The aim of the present study was to detect the
presence of L. monocytogenes in foods of animal origin from Araguaina, TO,
using the immunoenzymatic method mini-VIDAS® (BioMérieux Vitek, Inc.,
Missouri, USA),120 food samples of animal origin were collected in Araguaina,
TO, between August 2008 and March 2009, of which 30 were ground beef
samples, 30 mixed sausage, 30 raw milk and 30 samples of fresh cheese. After
enrichment, samples were analyzed by conventional bacteriological methods and
the automated system mini-VIDAS® for L. monocytogenes (LMO). By the results,
6 (20%) were positive ground beef samples and 6 (20%) positive mixed sausage
samples. L. monocytogenes was not detected in the raw milk nor in the curd
cheese samples. Values found in the ground beef and mixed sausages were
relatively high when compared with data found in other Brazilian states. Negative
results in all the milk product samples may be due to competition between L.
monocytogenes and autochthonous microflora present in these products, which
are usually sold at room temperature. Accordingly, we conclude that both raw
ground beef and mixed sausage, as sold in butchers shops in Araguaina, TO, are
important vehicles for Listeria monocytogenes.
Key words: food-borne pathogen, food contamination, immunoenzymatic essay,
Listeria monocytogenes
29
1. INTRODUÇÃO
O interesse pela detecção de Listeria em alimentos, particularmente
por Listeria monocytogenes, vem se intensificando desde a década de 80, em
função dos vários surtos e casos esporádicos de listeriose de origem alimentar
ocorridos no Canadá, Estados Unidos e Europa (SILVA et al., 1998). Desde
então, os alimentos têm sido considerados pelos pesquisadores como fonte
primária da infecção por este microrganismo (LAGE et al., 1996).
Listeria monocytogenes apresenta características de resistência a
condições ambientais adversas como crescimento em pH e temperatura baixos e
em elevado teor de cloreto de sódio, condições que determinam, segundo
MARZOCCA et al. (2004), a existência de alguns alimentos considerados de alto
risco -por serem prováveis veiculadores do patógeno- como os prontos para o
consumo e os que são conservados por período prolongado em refrigeração,
A veiculação de L. monocytogenes por alimentos contaminados, pode
causar a listeriose, associada principalmente a alimentos processados prontos
para consumo. A maioria dos surtos e casos esporádicos de listeriose envolve
pessoas com deficiência imunológica, mulheres grávidas e seus fetos, recém-
nascidos e idosos. Devido à gravidade das infecções, vários países do mundo
têm adotado uma política severa visando o controle desse microrganismo. No
entanto, têm encontrado dificuldades devidas, principalmente, à sua ampla
distribuição, natureza psicrotrófica e tolerância a muitos conservantes (ALMEIDA
et al. 1999).
ROCOURT (1999) considerou seis espécies dentro do gênero Listeria,
L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. welshmeri, L. seeligeri, e L. grayi.
Uma atualização taxonômica reconheceu Listeria monocytogenes e L. ivanovii
como patogênicos para animais, porém, (HITCHINS, 2002) indica que somente L.
monocytogenes está relacionada com listeriose humana. Apesar de que a
listeriose humana pode ser causada por qualquer dos 13 sorotipos descritos de L.
monocytogenes, LEMES-MARQUES et al. (2007) reconheceram três deles como
os responsáveis pela maior parte dos casos, os sorotipos 1/2a, 1/2b, e 4b, por
serem freqüentemente isolados em alimentos (NEVES et al., 2008; VON LAER et
al., 2009).
30
É reconhecido que o ambiente natural alberga esporadicamente uma
diversidade de L. monocytogenes em quantidades pequenas, porém, FENLON
(1999) reforçaram que o descaso com as boas práticas de higiene e fabricação
pode tornar o meio ambiente em importante fonte de L. monocytogenes
virulentas, com habilidade de colonizar equipamentos e contaminar alimentos.
A listeriose, considerada como zoonose, tem sua ocorrência
documentada somente em países desenvolvidos, como Estados Unidos e
Europa, sendo desconhecida na África, Ásia, América do Sul e em alguns países
de Europa onde a doença não é notificada (GUERRA & BERNARDO, 2004).
Além disso, LUNDÉN et al. (2004) ressaltaram a necessidade de detecção
multinacional de surtos de listeriose, e me que já está sendo elaborado um
sistema de vigilância internacional padronizado.
A região de Araguaína, por sua localização geográfica, é considerada
zona de influência econômica no Estado do Tocantins, concentrada na pecuária,
segundo LARANJEIRA & MENTA (2008). Detém o segundo maior rebanho do
Tocantins, com 1.012.363 bovídeos de corte, os quais são destinados ao
consumo interno e externo. O Estado por sua vez é o 11º maior mercado
produtor de carne bovina do Brasil, contando com um rebanho de
aproximadamente 8 milhões de animais, e 15 frigoríficos com capacidade de
abater mensalmente mais de 165 mil animais (FIGUEIREDO, 2007).
Isto posto, objetivou-se com o presente estudo, realizar a
caracterização fenotípica de Listeria monocytogenes isoladas de carne moída
crua, linguiça mista frescal, queijo minas frescal e leite in natura, comercializados
no Município de Araguaína,TO, pelos métodos de cultivo bacteriológico
convencional e ensaio imunoenzimático.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Amostragem
Foram colhidas aleatoriamente, no período compreendido entre agosto
de 2008 e maio de 2009, 120 amostras de quatro grupos de alimentos, sendo 30
31
de carne moída, 30 de lingüiça mista, 30 de queijo frescal e 30 de leite in natura,
comercializados em açougues -carne moída e linguiça mista frescal-, feiras
municipais e supermercados da cidade -queijo frescal-, e domicílios particulares -
leite in natura-, no Município de Araguaina, Estado do Tocantins, Brasil.
Para a seleção de açougues, foi utilizada uma amostragem
probabilística aleatória estratificada. A listagem dos estabelecimentos comerciais
fornecida pela Prefeitura Municipal de Araguaína em 2008, contou com um total
de 136 açougues cadastrados, distribuídos em 10 setores do município, e que
compuseram o universo amostral.
Os produtos adquiridos foram manipulados exclusivamente pelo
comerciante. Após a colheita a quantidade mínima de 500 g ou mL de cada
produto, foram identificados e acondicionados em caixas isotérmicas com gelo
reciclável e encaminhadas por via terrestre até o Laboratório do Centro de
Pesquisa em Alimentos (CPA) da Escola de Veterinária da Universidade Federal
de Goiás (UFG) para o isolamento e identificação de Listeria monocytogenes.
Alguns tipos de queijos foram acondicionados integramente na embalagem
original.
2.2. Procedimento de isolamento
A técnica utilizada foi descrita na Instrução Normativa n° 62 de 26 de
agosto de 2003 (BRASIL, 2003) para pesquisa de L. monocytogenes em leites e
derivados, cárneos e derivados, entre outros, que considera um enriquecimento
seletivo primário e outro secundário prévio ao isolamento.
Enriquecimento primário e secundário
Para o enriquecimento primário foram pesados assepticamente 25 g de
cada amostra e imediatamente homogenizados com 225 mL de meio de cultura
“Modified Listeria Enrichment Broth” (UVM University of Vermont Médium, com
suplemento) em triturador por dois minutos. A seguir, incubou-se a 30± 1ºC por
24 h. Para o enriquecimento secundário, uma alíquota de 0,1 ml foi transferida
para tubos contendo 10 ml de caldo Fraser (FB-Fraser, Difco, com suplemento) e
32
incubado a 35± 1ºC por 24 h.
Ensaio imunoenzimático
Após enriquecimento secundário, as amostras foram submetidas ao
ensaio qualitativo imunoenzimático VIDAS® - LMO2 para detecção da presença
de L. monocytogenes, que emprega a tecnologia fluorimétrica ELFA (Enzyme
Linked Fluorescent Assay), com protocolo validado pela Associação Francesa de
Normalização (Association Française de Normalisation/AFNOR) (VAZ-VELHO et
al., 2000; BioMÉRIEUX, 2008). Como descrito no manual do VIDAS® Listeria
monocytogenes II [LMO2], BioMÉRIEUX (2008), o kit consta de cones e barretes
descartáveis. O cone é utilizado como fase sólida com os anticorpos anti-L.
monocytogenes adsorvidos na superfície interna da parede do cone. Os
antígenos presentes no caldo de enriquecimento localizado no barrete vão fixar-
se aos anticorpos fixos no cone, Os ciclos automáticos do aparelho consistem em
sucessão de aspiração e dispersão do meio. Anticorpos conjugados com
fosfatase alcalina se fixam aos antígenos de L. monocytogenes, que já estão
fixos aos anticorpos das paredes do cone. Finalmente, o substrato 4-metil-
umbeliferil fosfato é aspirado no cone e a enzima do conjugado catalisa a
hidrólise formando o produto 4-metil-umbeliferona, com fluorescência emita e
medida, pelo aparelho, a 450 nm.
Seleção e Isolamento
As amostras negativas ao ensaio imunoenzimático foram descartadas,
e as positivas foram semeadas em superfície de ágar Oxford Modificado (MOX –
Difco – France) e incubadas a 35± 1ºC por 24 - 48 h. Cada placa de ágar seletivo
MOX foi examinada visualmente para a presença de colônias com morfologia
típica de L. monocytogenes. ALLERBERGER (2003) considerou como colônias
características, nas primeiras 24 h de incubação, aquelas cinzentas com halos
negros, e com 48 h de incubação aquelas escuras com o centro côncavo e halo
negro.
33
Purificação das colônias típicas
As colônias típicas no ágar MOX foram repicadas em ágar Tripticase
de Soja (Tryptic Soy Agar -TSA – Difco) suplementado com 0,6% de extrato de
levedura (Yeast Extract – YE, Oxoid) e incubadas a 35ºC /24-48 horas. Após este
período, foram observadas em iluminação oblíqua para visualização da cor
característica, cinza azulada, como sugerido por DONNELLY (1999). Em
complemento, as colônias foram observadas também em microscópio de
contraste de fase, para visualizar movimentos característicos de Listeria spp.,
descritos por SHENOY et al. (2007).
Confirmação e Identificação
A partir das culturas purificadas, foram realizadas as provas
bioquímicas de coloração de Gram, produção de catalase, motilidade, redução de
nitrato a nitrito, reação em Ágar Tríplice Açúcar Ferro (Triple Sugar Iron –TSI), ve-
rificação de beta-hemólise, fermentação de carboidratos (dextrose, xilose,
rhamnose, manitol, maltose), provas de Vermelho de Metila/Voges Proskauer,
com parâmetros diferenciais interespecíficos estabelecidos por LOVETT (1988) e
ROCOURT (1999), e BRASIL (2003). Além de hidrolisar esculina para esculetina,
no ágar Oxford Modificado, que reage com os íons férricos e produz zonas
negras ao redor das colônias.
Uma vez isoladas e identificadas, as unidades formadoras de colônias
típicas foram enviadas ao Departamento de Bacteriologia do Instituto Oswaldo
Cruz, RJ, para sorotipagem. Os sorotipos descritos de Listeria monocytogenes
são 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7. Estes 13 sorotipos são
classificados por variações nos antígenos somáticos (O) e flagelares (H)
(SCARCELLI & PIATTI, 2002; LÓPEZ et al., 2006; LEMES-MARQUES et al.,
2007).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
34
Na Tabela 1, estão contidos os resultados da identificação de L.
monocytogenes em função da análise imunoenzimática mini-VIDAS®. Nota-se
que seis (20,0%) das amostras de carne moída e seis (20,0) de lingüiça mista
foram positivas para L. monocytogenes e que não se detectou a presença do
patógeno em amostras de leite in natura e queijo minas frescal.
Pelo método bacteriológico convencional, das 30 amostras de carne
moída crua conseguiu-se isolar L. monocytogenes em cinco (16,7%) das
amostras, sendo que três pertenciam ao sorotipo 1/2b e duas ao 4b. Das 30
amostras de linguiça mista frescal se obtiveram dois isolados de L.
monocytogenes (6,7%), sendo um do sorotipo 1/2a e outro do 1/2b (Tabela 2).
Observa-se que os sorotipos encontrados no presente estudo pertencem aos
tipos 1/2a, 1/2b e 4b, que segundo GILBRETH et al. (2005) são responsáveis por
90% dos casos de listeriose humana nos Estados Unidos. Destes, merece
especial atenção o sorotipo 4b, por ser o sorotipo mais virulento (KUHN &
GOEBEL, 1999; MANTILLA et al., 2007).
MESQUITA et al. (1995) também isolaram o sorotipo 1/2b em amostras
de carne moída provenientes de Goiânia. GO, porém, a frequência encontrada de
20% de L. monocytogenes encontrada neste estudo é relativamente alta quando
considerados os relatos de outros autores, como MANTILLA et al. (2007) que
encontraram a presença deste patógeno em 7% de L. monocytogenes das
amostras de carne moída, isoladas por técnicas bacteriológicas de confirmação.
Assim também, YUCEL et al. (2005) isolaram a bactéria em 6,1% carne moída, e
SAMADPOUR et al. (2006) em 3,5% do mesmo tipo de amostra.
Chama a atenção a elevada contaminação por L. monocytogenes em
linguiça frescal, devido provavelmente ao processamento ao qual esse alimento é
submetido, como fatiamento, condimentação e outros ingredientes de cura,
tratamento térmico e longa vida útil de 45 dias (SILVA et al., 2004). LIMA et al.
(2005) observaram que a contaminação da matéria prima, durante o
processamento de linguiça mista, em uma planta de processamento de alimentos
em Pelotas, RS, resultou em 25% de contaminação do produto final.
Quando se considera que entre os ingredientes de preparação deste
tipo de linguiça artesanal encontram-se miúdos, é importante lembrar que pela
grande concentração de Listeria monocytogenes, as amígdalas de suínos tem
35
sido sugeridas como indicadores da prevalência desta bactéria no ambiente da
fazenda. FREDRIKSSON-AHOMAA et al. (2009) quantificaram a presença deste
patógeno em 32% das amostras de amígdalas em comparação a 4% em
amostras de fezes.
Cabe mencionar, para melhor compreender os resultados deste
trabalho, que fatores como o clima quente da região, acondicionamento do
produto cárneo em gôndolas refrigeradas de comercialização -muitas vezes de
maneira inadequada- assim como as condições diversas de armazenamento da
linguiça mista frescal, desde gôndolas refrigeradas à exposição ao ar livre do
produto, em açougues de comercialização poderiam ter contribuído para a
porcentagem de L. monocytogenes encontrada nestes alimentos.
No que tange à ausência de Listeria monocytogenes em amostras de
produtos lácteos, existem vários trabalhos, entre eles COLEMAN et al. (2003);
GUERRA & BERNARDO (2005); POPPI et al. (2008) que consideraram a inibição
de microrganismos indesejáveis, entre estes L. monocytogenes pela ação
antagônica com bactérias lácticas e Enterococcus que se multiplicam de maneira
acelerada devido às condições favoráveis de temperatura, pH e disponibilidade de
substrato. DURMAZ (2009) observou o comportamento da L. monocytogenes
quando inoculado em leite cru para elaboração de queijo branco. Verificou que
durante os primeiros 15 dias de maturação o número de L. monocytogenes
diminuiu significativamente enquanto o número de bactérias acido lácticas
aumentou, provavelmente pelo decréscimo do pH do meio.
A este respeito, estudos recentes realizados por NERO et al. (2009),
constataram a ausência total de L. monocytogenes e Salmonella sp. em leite cru,
onde a microbiota autóctone pode inibir total ou parcialmente o crescimento de
bactérias patogênicas, entre elas L. monocytogenes.
Os resultados negativos para a presença de L. monocytogenes em leite
in natura e queijo frescal produto deste trabalho, são semelhantes aos
encontrados por LEITE et al. (2002) que em 32 amostras de queijo coalho
analisadas encontraram somente uma amostra positiva para L. monocytogenes e
MARZOCCA et al. (2004) que analisaram 132 amostras de queijo de massa mole
e não detectaram L. monocytogenes. Porém, divergências com outros resultados
podem ser devidas às diferentes metodologias empregadas na análise
36
laboratorial, assim como as diferenças na tecnologia de produção deste queijo.
Outro fator relevante e que deve ser levado em consideração, conforme
VAZ-VELHO et al. (2000) e CASTELO BRANCO et. al. (2003), diz respeito às
limitações mostradas por ensaios imunológicos, com o teste de ELISA e mini-
VIDAS®-LMO, na detecção de Listeria em alimentos crus com baixos níveis de
Listeria e elevada microbiota competidora. Isto sugere que o resultado para este
grupo de alimentos possa ser devido simplesmente à baixa quantidade deste
patógeno neste tipo de amostras como no caso do leite e derivados, ou à
detecção de simplesmente microrganismos inativos, como nas amostras de
produtos cárneos, positivas no mini-VIDAS® e negativas pelo método
convencional.
Tabela 1 – Listeria monocytogenes identificadas em produtos de origem animal
comercializados em Araguaína, TO, segundo o ensaio imunoenzimático
Amostra No de amostras Amostras
positivas (%)
Carne moída 30 6 20
Lingüiça mista 30 6 20
Queijo frescal 30 0 0
Leite in natura 30 0 0
Total 120 12 10
Tabela 2 – Listeria monocytogenes isoladas em produtos de origem animal
comercializados em Araguaína, TO, pelo método bacteriológico convencional
Amostra No de
amostras No de isolados (%)
Sorotipo
1/2a (%) 1/2b (%) 4b (%)
Carne moída 30 5 (16,7) 3 (10,0) 2 (6,6)
Lingüiça mista 30 2 (6,7) 1 (3,3) 1 (3,3)
Total 60 7 (11,7)
37
4. CONCLUSÕES
A presença de Listeria monocytogenes, sorotipos 1/2a, 1/2b, e 4b,
comprovadamente envolvidos em surtos de listeriose, em amostras tanto de carne
moída quanto de lingüiça mista frescal na cidade de Araguaína, Estado do
Tocantins, revela o perigo ao qual estão expostos os consumidores deste tipo de
produtos. A ocorrência elevada (20%), tanto em carne moída quanto em lingüiça
frescal, evidencia a necessidade de estabelecer um sistema de controle de
alimentos comercializados, assim como a promoção de adequada educação
sobre a manipulação de alimentos, para evitar contaminação cruzada, e alertar
aos consumidores sobre os riscos de contaminação por L. monocytogenes,
principalmente para populações imunocomprometidas.
Agradecimentos
À coordenação do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de
Veterinária da Universidade Federal de Goiás – UFG; à coordenação de pós-
graduação da Universidade Federal de Goiás, pelo apoio logístico e financeiro
oferecido para a realização deste trabalho. Somos gratos ao Dr. Ernesto Hofer,
laboratório de Zoonoses Bacterianas (FIOCRUZ, RJ) por sorotipagem de L.
monocytogenes.
5. REFERÊNCIAS
1. ALLERBERGER, F. Listeria: growth, phenotypic differentiation and molecular
microbiology. FEMS Immunology and Medical Microbiology. v. 35, p. 183-
189, 2003.
2. ALMEIDA, P.F.; COMASTRI, R. DE C.; RODRICK, G.E. Listeria
monocytogenes: importância e distribuição em alimentos. Higiene
Alimentar, São Paulo, v.13, n. 64, p. 19-23, 1999.
3. BioMÉRIEUX. REF 30 704 VIDAS® Listeria monocytogenes II (LMO2). 2008.
4. BRASIL, Ministerio de Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária.
38
Secretaría de Defesa Agropecuária. Instrução Normativa No 62, de 26 de
agosto de 2003. Oficializa os Métodos Analíticos Oficiais para Análises
Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e Água. Diário
Oficial da União, Brasília, DF. p.14, de 18 de setembro de 2003. Seção 1.
5. CASTELO BRANCO, M.A.A.; FIGUEIREDO, E.A.T.; BORGES, M.F.; DA
SILVA, M.C.D.; DESTRO, M.T. Incidência de Listeria monocytogenes em
queijo coalho refrigerado produzido industrialmente. B. CEPPA, Curitiba,
v.21, n.2, p.393-408, 2003.
6. COLEMAN, M.E.; SANDBERG, S.; ANDERSON, S.A. Impact of microbial
ecology of meat and poultry products on predictions from exposure
assessment scenarios for refrigerated storage. Risk Analysis. v.23, n.1,
p.215-228, 2003.
7. DONNELLY, K. Conventional Methods to detect and isolate Listeria
monocytogenes. In: _____.Listeria, Listeriosis, and food safety, 2nd. ed.,
New York. Marcel Dekker, Inc., 1999. chap.7, p. 225-260.
8. DURMAZ, H. Fate of Listeria Monocytogenes in Carra cheese. Journal of
Food Safety. v.29, n.2, p. 253-260, 2009.
9. FENLON, D.R. Listeria monocytogenes in the natural environment. in:
_____.Listeria, Listeriosis, and food safety, 2. ed. Marcel Dekker, Inc.,
1999. chap.2, p. 21-37.
10. FIGUEIREDO, A. Tocantins comemora 10 anos sem aftosa em grande estilo.
Agência de Defesa Agropecuária – ADAPEC. Governo do Estado do
Tocantins. Leitura 119, 2007. http://adapec.to.gov.br/noticia.php?id=61
11. FREDRIKSSON-AHOMAA, M.; GERHARDT, M.; STOLLE, A. High bacterial
contamination of pig tonsils at slaughter. Meat Science. Atlanta. v.83, p.334-
336, 2009.
12. GILBRETH, S.E.; CALL, J.E.; WALLACE, F.M.; SCOTT, V.N.; CHEN, Y.;
LUCHANSKY, J.B. Relatedness of Listeria monocytogenes isolates
recovered from selected ready-to-eat foods and listeriosis patients in the
United States. Applied and Environmental Microbiology. V. 71, p. 8115 –
8122, 2005.
39
13. GUERRA, M.M.; BERNARDO, F.A. O risco da listeriose e a identificação do
perigo. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias. Lisboa, v.99, n.550,
p.69-76, 2004.
14. GUERRA, M.M.; BERNARDO, F.A. Influência da microflora de cura na
ocorrência de Listeria spp. em queijos tradicionais. Revista Portuguesa de
Ciências Veterinárias. Lisboa. v.100, n.555, p. 185-188. 2005.
15. HITCHINS, A. D. Detection and enumeration of Listeria monocytogenes in
foods. Bacteriological analytical manual [on-line]. Atualizado em Nov. 17
de 2002. Disponível em: <http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-10.html>.
Acesso 14 de fev. 2009.
16. KUHN, M. & GOEBEL, W. Pathogenesis of Listeria monocytogenes. in:
_____.Listeria, Listeriosis, and food safety, 2. ed. Marcel Dekker, Inc.,
1999. chap.5, p. 97-130.
17. LAGE, M. E; SILVA, T. J. P; CERQUEIRA, M. M. O. P; SAMPAIO, I. B. M;
SOUZA, R. M. Ocorrência de Listeria spp. em carne crua de frango no
mercado da cidade de Belo Horizonte - MG / Occurence of Listeria spp. in
raw broiler meat on retail sale in Belo Horizonte - MG – Brazil. Arquivo
Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. v.48, n.1, p.53-60, 1996.
18. LEITE, CL, C.; GUIMARÃES, A.G.; RIBEIRO, N.S.; SILVA, M.D.; ASSIS,
P.N. Pesquisa de Listeria monocytogenes e Escherichia coli em queijo do
tipo “coalho” comercializado em Salvador (BA). Importância para a saúde
pública. Revista Analítica.v.2, p. 38-41, 2002.
19. LARANJEIRA, C.; MENTA, F. Tocantins imuniza mais de 99% do seu
rebanho. Agência de Defesa Agropecuária – ADAPEC. Governo do Estado
do Tocantins. Leitura 155, 2008.
http://adapec.to.gov.br/noticia.php?id=196
20. LEMES-MARQUES, E.G.; CRUZ, C.D.; DESTRO, M.T. Pheno- and
genotypic characterization of Listeria monocytogenes clinical isolates from
southwestern region of the State of São Paulo, Brazil. Brazilian Journal of
Microbiology. v.38, p. 287-292, 2007.
40
21. LIMA, A.S.; VON LAER, A.E.; TRINDADE, P.S.; SILVA,W P. Listeria
monocytogenes dissemination in mixed fresh sausage processing evaluated
by serology and RAPD. Alimentos e Nutrição. Araraquara, v.16, n.3, p. 245-
251, 2005.
22. LÓPEZ, V.; SUÁREZ, M.; CHICO-CALERO, I.; NAVAS, J.; MARTÍNEZ-
SUÁREZ, J.V. Listeria monocytogenes en alimentos: ¿son todos los
aislamientos igual de virulentos?. Revista Argentina de Microbiologia.
v.38, p.224-234, 2006.
23. LOVETT, J. Isolation and identification of Listeria monocytogenes in dairy
products. Journal-Association of Official Analytical Chemists. v.71, p.
658-660, 1988.
24. LUNDÉN, J.; TOLVANEN, R.; KORKEALA, H. Human listeriosis outbreaks
linked to dairy products in Europe. Journal of Dairy Science. v. 87,n.13. p.
6–11, 2004.
25. MANTILLA, S.P.S.; M. FRANCO, TRINIDADE OLIVEIRA, L.A. ; BARBOSA
SANTOS, E.; GOUVÊA, R. Ocorrência de Listeria spp. Em amostras de
carne bovina moída comercializadas no município de Niterói, RJ, Brasil.
Ciências e Agrotecnologia. Lavras, v.31, n. 4, p. 1225-1230. 2007.
26. MARZOCCA, M.A.; MARUCCI, P.L.; SICA, M.G.; ALVAREZ, E.E. Detección
de Listeria monocytogenes en distintos productos alimentícios y en muestras
ambientales de una amplia cadena de supermercados de la ciudad de Bahia
Blanca (Argentina). Revista Argentina de Microbiologia. Buenos Aires.
v.36, p.179-181, 2004.
27. MESQUITA, A.J.; IARIA, S.T. NUNES, I.A. Bactérias do gênero Listeria em
carne e água residuária de lavagem de carcaça de um matadouro-frigorífico
e em carne moída comercializada na cidade de Goiânia-GO. ANAIS DAS
ESCOLAS DE AGRONOMIA E VETERINÁRIA, GOIÂNIA-GO, v. 25, p. 37-
45, 1995.
28. NERO, L.A.; MATTOS, M.R.; BELOTI, V.; BARROS, M.A.F.; ORTOLANI,
M.B.T.; FRANCO, B.D.G.M. Antagonistic activity against Listeria
monocytogenes and Salmonella enteritidis. Journal of Food Safety, v. 29, n.
41
2, p. 261-270, 2009.
29. NEVES, E.; LOURENÇO, A.; SILVA, A.C.; COUTINHO, R.; BRITO, L.
Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis of Listeria monocytogenes
isolates from different sources and geographical origins and representative of
twelve serovars. Systematic and Applied Microbiology. Stuttgart. v. 31, p.
387-392, 2008.
30. POPPI, L.B.; MANCILHA, I.M.; FERREIRA, A.J.P.; LEAL, D.D.M. Previous
notes: Evaluation of the antagonistic effect of Lactobacillus species on
Listeria monocytogenes in vitro. Brazilian Journal of Food Technology.
v.11, n.2, p.113-119, 2008.
31. ROCOURT, J. The genus Listeria and Listeria monocytogenes: Phylogenetic
position, taxonomy and identification. in: _____.Listeria, Listeriosis, and
food safety, 2. ed. Marcel Dekker, Inc., 1999. chap.1, p. 1-19.
32. SAMADPOUR, M. et al. Incidence of enterohemorrhagic Escherichia coli,
Escherichia coli O157, Salmonella, and Listeria monocytogenes in retail fresh
ground beef, sprouts, and mushrooms. Journal of Food Protection, Des
Moines, v. 69, n. 2, p. 441-443, 2006.
33. SCARCELLI, E.; PIATTI, R.M. Patógenos emergentes relacionados à
contaminação de alimentos de origem animal. Biológico. São Paulo. v.64,
n.2, p.123-127. 2002.
34. SILVA, M.C.D.; HOFER, E.; TIBANA, A. Incidence of Listeria monocytogenes
in cheese produced in Rio de Janeiro, Brazil. Journal Food Protection, v.
61, n.3, p. 354-356, 1998.
35. SILVA, W.P.; LIMA, A.S.; GANDRA, E.A.; ARAÚJO, M.R.; MACEDO, M.R.P.;
DUVAL, E.H. Listeria spp. In processing of fresh sausages in
slaughterhouses from Pelotas, RS, Brazil. Ciência Rural, Santa Maria. V.34,
n.3, p. 911-916, 2004.
36. VAZ-VELHO, M.; DUARTE, G.; GIBBS, P. Evaluation of mini-VIDAS rapid
test for detection of Listeria monocytogenes from production lines of fresh to
cold-smoked fish. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam. v.40,
n.2, p.147-151, 2000.
42
37. VON LAER, A.E.; LIMA, A.S.; TRINIDADE, P.S.; ANDRIGUETTO, C.;
DESTRO, M.T.; SILVA, W.P. Characterization of Listeria monocytogenes
isolated from a fresh mixed sausage processing line in Pelotas-RS by PFGE.
Brazilian Journal of Microbiology. v.40, p.574-582, 2009.
38. YÜCEL, N.; ÇITAK, S.; ÖNDER, M. Prevalence and antibiotic resistance of
Listeria monocytogenes in meat products in Ankara, Turkey. Food
Microbiology. Amsterdam. v.22, p.241-245, 2005.
43
CAPÍTULO III: SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA QUANTITATIVA DE
ISOLADOS DE Listeria monocytogenes ORIUNDOS DE
PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL COMERCIALIZADOS EM
ARAGUAÍNA - TO
RESUMO. Listeria monocytogenes é uma bactéria patogênica freqüentemente
encontrada em carnes e seus derivados, transmitida aos humanos por alimentos
contaminados que não foram submetidos a tratamento adequado, capaz de
ocasionar a listeriose. A presença de resíduos de antibióticos em alimentos pode
dar-se pelo uso excessivo destes em tratamento de animais produtores de
alimentos, tal prática favorece a seleção de linhagens bacterianas cada vez mais
resistentes, o que dificulta o tratamento médico. O objetivo deste estudo foi avaliar
a susceptibilidade antimicrobiana de Listeria monocytogenes, isoladas a partir de
amostras de carne moída bovina e lingüiça mista, obtidas em diferentes
estabelecimentos comerciais no município de Araguaína, TO, pelo método do E-
test E-test® (AB Biodisk, Solna, Sweden). As cepas de L. monocytogenes isoladas
foram submetidas a testes de sensibilidade aos seguintes antimicrobianos:
Ampicilina, Oxacilina, Levofloxacina, Gentamicina, Vancomicina,
Sulfametoxazol/Trimetoprima. Os subcultivos de L. monocytogenes foram
semeados em placas contendo ágar Mueller Hinton. Os valores do CIM
(concentração inibitória mínima) foram lidos no ponto de interseção entre a zona
elíptica de inibição e a escala na fita do Etest. Foi identificado que os
antimicrobianos Levofloxacina, Vancomicina e Ampicilina são os mais eficientes
para inibir o crescimento de isolados de Listeria monocytogenes. Foi observada a
resistência dos isolados aos antibióticos Oxacilina, Sulfametoxazol-Trimetoprim e
Gentamicina. Sugere-se ainda que a variação na resistência pode ter importantes
diferenças geográficas, dependendo provavelmente dos hábitos locais quanto ao
uso de antibióticos que devem ser re-considerados criticamente quando aplicados
em animais.
Palavras-chave: Listeria monocytogenes, Antimicrobianos, alimentos, E-test®
44
QUANTITATIVE ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY OF Listeria
monocytogenes ISOLATED FROM ANIMAL PRODUCTS SOLD IN
ARAGUAINA- TO
ABSTRACT. Listeria monocytogenes is a pathogen frequently found in meat
samples and products; if transmitted to humans via contaminated foods that have
not been properly treated, it can cause listeriosis. The widespread use of
antibiotics for animal treatment means that there is a higher risk of there being
antibiotic residues in food, which can lead to some strains of bacteria becoming
increasingly resistant and therefore making medical treatment more difficult. The
objective of this study was to evaluate the antimicrobial susceptibility of Listeria
monocytogenes isolated from raw ground meat and mixed sausage samples, sold
in different places in Araguaina, TO, by using the E-test method (AB Biodisk,
Solna, Sweden). Isolates sensitivity were tested for the antimicrobials ampicillin,
oxacillin, levofloxacin, gentamicin, vancomycin and trimethoprim-
sulfamethoxazole. L. monocytogenes subcultures were plated in Mueller Hinton
agar. After 15 minutes of absorption of the inoculum, strips of E-test were placed
on these plates and incubated overnight at 30 °C. The MIC values (minimum
inhibitory concentration) were read as the edge of the inhibition ellipse intersects
the side of the strip. Not all MIC interpretative break points for Listeria
monocytogenes were yet established by the CLSI, therefore we took values from
other gram positive bacteria. From the results, it was determined that
levofloxacin, ampicillin and vancomycin are more effective at inhibiting the growth
of Listeria monocytogenes, while some strains showed resistance to the
antibiotics oxacillin, trimethoprim-sulfamethoxazole and gentamicin. It was
concluded that the varying levels of resistance may be influenced by the
geographic strain distribution, probably depending on the local customs of
antibiotic use that should be reconsidered critically insofar as they pertain to
animals.
Key words: Listeria monocytogenes Antibimicrobials, food, E-test®
45
1. INTRODUÇÃO
A listeriose é uma doença causada pela ingestão de alimentos
contaminados com Listeria monocytogenes bactéria Gram-positiva, de ampla
distribuição no meio ambiente. Esta bactéria é um patógeno que pode causar
meningite ou septicemias em recém nascidos, pacientes imunocomprometidos e
idosos, ou levar a aborto. Diferentemente de outras doenças de origem alimentar,
apresenta elevada taxa de mortalidade, chegando até 30% dos casos, apesar da
administração apropriada de antimicrobianos (AURELI et al., 2003; SRINIVASAN
et al., 2005; AARESTRUP et al. 2007).
O aumento da população suscetível e da população de idosos, junto às
mudanças de produção de alimentos processados prontos para o consumo,
fatores determinantes para o aumento mundial no número de casos de listeriose
(CRESPO et al., 1999).
As condições genéticas de resistência em L. monocytogenes ainda não
estão claras, porém, AARESTRUP et al. (2007) indica que esta resistência a
antimicrobianos pode estar associada a variações nas superfícies que
proporcionam uma vantagem seletiva no ambiente de produção de alimentos.
A ampicilina, gentamicina, penicilina, streptomicina e
Trimetoprima/sulfametoxazol são drogas usadas em tratamentos clínicos de
listeriose humana, enquanto ampicilina, ciprofloxacina, clindamicina, eritromicina,
gentamicina, penicilina, quinupristina/dalfopristina, estreptomicina e
Trimethoprima/sulfamethoxazol são frequentemente usadas em medicina
veterinária. A primeira opção de antimicrobianos para o tratamento de listeriose é
a ampicilina ou ampicilina combinada com aminoglicosídeos, ou ainda a
estreptomicina ou gentamicina. Pacientes alérgicos a penicilinas podem ser
tratados com trimetroprina e sulfametoxazol. (LYON et al., 2008).
YUCEL et al. (2005) relataram que Listeria innocua é muito freqüente
em carnes e produtos derivados, encontraram 83,3% de positividade desse
microrganismo em amostras de carne crua coletadas em Ankara, Turquia. Esse
achado é importante quando se procura explicar a transferência de informação
genética de resistência de L. innocua para L. monocytogenes. A este respeito,
CHARPENTIER & COURVALIN (1999); HERNÁNDEZ & HERNÁNDEZ-GODOY
46
(2004) indicaram que a transferência de informação genética de resistência pode
acontecer não somente de L. innocua, mas também de gêneros bacterianos
pouco similares, como Enterococcus e Streptococcus, que reconhecidamente são
freqüentes portadores de resistência.
A resistência antimicrobiana é menor em L. monocytogenes do que em
outras bactérias Gram-positivas, porém o aparelho gastrintestinal de animais e o
ambiente de plantas processadoras de alimentos podem expor a Listeria
monocytogenes a uma conjugação de plasmídios que codificam para resistência
antimicrobiana com Enterococcus spp. e Staphylococcus spp (LYON et al., 2008).
Ainda o desenvolvimento de resistência antimicrobiana em bactérias
zoonóticas está associado principalmente ao uso de antibióticos em animais,
incluindo animais de estimação, de fazenda, peixes, e principalmente animais em
tratamentos contra infecções pulmonares, de pele, abscessos e mastites. Estes
patógenos podem contaminar a carne durante o abate e a ordenha os produtos
lácteos, ou vegetais adubados com excremento animal. (AARESTRUP et al.,
2007).
Entre os diferentes mecanismos de resistência bacteriana utilizada para
combater o mecanismo de ação de um determinado fármaco, CRESPO et al.
(1999) lembraram que Listeria pode ser refratária aos mecanismos bactericidas
de muitos antibióticos por ser intracelular, sendo poucos os agentes que
efetivamente podem penetrar o citosol das células que hospedam a Listeria.
Para conhecer o papel de patógenos em amostras ambientais e a
disseminação de resistência antimicrobiana a outras populações bacterianas, são
necessárias pesquisas de resposta antimicrobiana, que vão além de uma mera
investigação de disseminação da doença. (AARESTRUP et al., 2007).
Um método de determinação de suscetibilidade antibacteriana, descrito
por MARLEY et al. (1995) e BOLMSTRÖM (2000), utiliza a tecnologia de
gradiente de antimicrobiano predefinido (Etest®, AB BIODISK, Solna, Suécia),
consta de uma fita plástica com gradiente de antibiótico pré-definido estável em
um lado da fita e não dependente da difusão -como ocorre na difusão em disco de
antibiograma- e do outro lado uma escala quantitativa, que aplicado numa placa,
contendo meio de cultura, pode desenvolver uma elipse de inibição como efeito
do gradiente de antimicrobiano, dando a leitura da Concentração Inibitória Mínima
47
(CIM/MIC-Minimum Inhibitory Concentration).
Este valor da CIM foi definido por THOMSON (2004) como a
concentração mais baixa de um agente antimicrobiano que visualmente inibe o
crescimento de um microrganismo em condições experimentais definidas. Na
leitura visual da elipse de inibição sobre a placa, valores da CIM menores que o
ponto de corte são interpretados como suscetíveis, e aqueles maiores como
resistentes.
O aumento da população de pacientes imunocomprometidos e o
desenvolvimento contínuo de mecanismos de resistência dos patógenos humanos
implica a necessidade de pesquisa de susceptibilidade in vitro, em muitos casos
com valores exatos de MIC, para aplicar terapia para pacientes individuais.
Porém, quando se trata de patógenos não freqüentes e são usados métodos não
validados pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ou pela Food
and Drug Administration (FDA), é recomendável que os resultados sejam
expressos como “fins de investigação ou não padronizados” (THOMSON, 2004).
Por outro lado, COLOMBO et al. (1995) relataram que o Etest® é um
método potencialmente útil quando usado como alternativa à diluição em caldo,
proposta pelo CLSI e que avaliações sobre seu rendimento mostraram resultados
em perfeito acordo com os obtidos pelos métodos padronizados por CLSI.
A seleção do agente antimicrobiano e da dose exata mais efetiva pode
determinar a erradicação do patógeno, minimizando o risco de seleção de
resistência. THOMSON (2004) consideraram que a farmacocinética de um agente
antimicrobiano pode variar de uma droga para outra, de um sítio de infecção a
outro, e de paciente para paciente, revelando diferença significativa do ponto de
inibição.
Apesar da vasta investigação sobre a ocorrência de L. monocytogenes
em carne e seus derivados em vários países, pouco tem se relatado sobre este
microrganismo no Brasil, e principalmente no Estado do Tocantins. Nesse sentido,
objetivou-se com o presente estudo determinar a suscetibilidade antimicrobiana,
pelo método de Etest®, de isolados de L. monocytogenes oriundos de produtos de
origem animal comercializados em Araguaína-Tocantins.
48
2. MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo foi realizado no período compreendido entre agosto
de 2008 e julho de 2009, foram utilizados isolados de Listeria monocytogenes,
mantidos a -20ºC em caldo Luria-Bertani e Glicerol (0,5/0,5), provenientes de
carne moída e linguiça frescal comercializadas em Araguaína TO. Assim como a
cepa de referência ATCC 19115, obtida junto ao Instituto Adolfo Lutz em São
Paulo-SP.
No Centro de Pesquisa em Alimentos (CPA) da Escola de Veterinária
da Universidade Federal de Goiás (UFG), as unidades formadoras de colônias
típicas e confirmadas como Listeria monocytogenes, foram submetidas à
tecnologia de gradiente de antibiótico predefinido (Etest®, AB BIODISK, Solna,
Sweden) que utiliza uma fita plástica com gradiente de antibiótico pré-definido em
um lado e uma escala quantitativa no lado oposto (MARLEY et al., 1995;
BOLMSTRÖM, 2000).
Os antibióticos utilizados na determinação da susceptibilidade
antimicrobiana nas fitas de Etest® foram a Gentamicina, Vancomicina, Ampicilina,
Oxacilina, Trimetoprima/sulfametoxazol, e levofloxacina.
Os isolados estocados foram revitalizados em caldo BHI a 37ºC/18 h
em seguida foram estriados em TSA suplementado com 0,6 % extrato de
levedura, com auxilio de alça níquel-cromo, e incubadas a 35ºC/24h. Com auxilio
de swab esterilizado fez-se a suspensão bacteriana em solução salina até
concentração correspondendo ao tubo 2 da escala McFarland. A seguir, o inoculo
foi distribuído sobre placas de Agar Muller-Hinton, previamente incubadas a 35º
C/10-15 min após terem sido retiradas da geladeira. Deixou-se a temperatura
ambiente por 15-20 minutos, para permitir absorção do inoculo e, após esse
tempo, com auxílio de uma pinça flambada e resfriada, as fitas do Etest® foram
colocadas na superfície do meio, duas em cada placa, e incubadas a 37ºC por
uma noite.
Após incubação, foram realizadas as leituras dos valores da
concentração inibitória mínima de cada um dos seis antibióticos. O procedimento
foi realizado de acordo com sugestões do fabricante AB BIODISK (2007),
adaptado de WALSH (2007).
49
Na falta de valores de referência padronizados, foram utilizados os de
outros bastonetes Gram-positivos, apesar da inexistência de recomendação do
CLSI de pontos de corte que incluam várias bactérias fastidiosas, entre elas
Listeria monocytogenes, como relatado por JORGENSEN (2004), Este autor
sugere que na interpretação dos resultados, deve ser mencionada a utilização de
método não validado pelo CLSI.
JOYCE & WOODS (2004) explicaram que a leitura do CIM deve ser
realizada no ponto em que a elipse de inibição de crescimento intercepta a escala
da fita do Etest®.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ao analisar a Tabela 1, verifica-se que isolados tocantinenses de
Listeria monocytogenes oriundos de produtos de origem animal, são resistentes a
mais de dois antibióticos, com exceção do sorotipo 1/2a encontrado em linguiça
mista frescal.
Os isolados que apresentaram maior resistência aos antimicrobianos
testados foram provenientes de amostras de carne moída (c e d na Tabela 1), no
entanto o mais suscetível foi aquele isolado de linguiça mista frescal (g na Tabela
1).
Maior resistência foi observada para gentamicina, oxacilina e
trimetoprim/sulfametoxazol (TS) (85,7%). De forma similar vários autores já
reportaram resistência de Listeria monocytogenes a antimicrobianos como
YUCEL et al. (2005), que verificaram resistência de 66,0% a TS e 66% a
ampicilina em L. monocytogenes isoladas de produtos cárneos em Ankara,
Turquia. No Brasil, MANTILLA et al. (2008), relataram que todas as cepas
testadas foram resistentes a oxaciclina e ampicilina e gentamicina.
No presente trabalho, verifica-se também que a levofloxacina
(fluoroquinolona), vancomicina (glicopeptídeo) e ampicilina (beta-lactâmico)
foram os antimicrobianos aos quais os isolados apresentaram mais sensibilidade
(85,7%, 85,7% e 57,1%, respectivamente).
De acordo com a resistência encontrada frente aos antimicrobianos
50
testados, foi possível determinar 5 fenótipos diferentes, considerando o intervalo
entre o fenótipo B, resistentes a 5 dos 6 antimicrobianos testados, e fenotipo E,
resistente a 1 antimicrobiano (Tabela 1).
Tabela 1. Perfil de susceptibilidade de Listeria monocytogenes isoladas de
produtos de origem animal comercializados em Araguaína, TO, pelo método do
Etest®
GM1 VA AM OX TS LE
Fenótipo Sorotipo
Valores de referência2 - (μg/mL);
≤ 4 ≤ 4 ≤2 ≤ 2 ≤ 0.5 ≤ 2
a) 4/b3 R S S R R S A
A
B
b) 4b3 R S S R R S
c) 1/2b3 R R R R R S
d) 1/2b3 R S R R R R B
e) 1/2b3 R S S R R S C
f) 1/2b4 R S S R S S D
g) 1/2a4 S S S S R S E
1Antimicrobianos utilizados: Gentamicina, Vancomicina, Ampicilina, Oxacilina,
Trimetoprima/sulfametoxazol, e levofloxacina. 2Valor de referência: GM, VA, AM, LE, valores utilizados para Listeria
monicytogenes por LYON et al. (2008). OX, valores para Staphylococci. CLSI MIC
Criteria (μg/mL); GM, OX e AM ; VA valor para Corynebacterium spp., TS valor
para Listeria monocytogenes. (BioMÉRIEUX, 2009). 3Amostras de carne moída 4Amostras de lingüiça mista frescal
No entanto, considerando as características de crescimento intracelular
deste patógeno, sugere-se que a seleção da melhor droga a ser utilizada no
tratamento de infecções por este patógeno, deve ser baseada tanto nos
resultados da CIM, quanto nas considerações de acumulação celular do
antibiótico (SERAL et al. 2005).
O uso indiscriminado de antimicrobianos incide no aumento do número
de bactérias resistentes a drogas já utilizadas em humanos, como o caso de
ampicilina, antimicrobiano mais indicado para tratamento de listeriose, e a
51
utilização de antimicrobianos pouco efetivos contra Listeria, pode criar um nicho
específico para a L. monocytogenes, pela inibição de outras espécies
bacterianas, como explicado por SRINIVASAN et al. (2005), AARESTRUP et al.
(2007) e MANTILLA et al. (2008).
Existe um aumento na resistência aos antibióticos não somente por
parte de Listeria spp, mas também de outros grupos de bactérias, como relatado
por WALSH et al. (2001), como conseqüência do uso indiscriminado de
antibióticos em animais e humanos, podendo acontecer por mutação ou por
aquisição de material genético exógeno.
HANSEN et al. (2005) em estudos de suscetibilidade de cepas
dinamarquesas de L. monocytogenes de humanos, constataram que eram
sensíveis aos antibióticos testados, incluindo ampicilina e sulfametoxazol, e que
as cepas multiresistentes que circularam em outros locais ainda não haviam
chegado à Dinamarca. Os autores comentaram que a cepa multiresistente
isolada de infecção humana na França em 1988 deve-se, provavelmente, à
transferência de plasmídio originado de um enterococo-estreptococo, devido à
presença destas bactérias no trato intestinal do homem e animais junto a Listeria
spp.
A presença de cepas multiresistentes estaria associada a ambientes de
utilização extensiva de antibióticos contra Listeria, o que segundo AARESTRUP
et al. (2007), não acontece na Dinamarca, para evitar isso, sugeriram a
utilização de compostos antibacterianos específicos contra L. monocytogenes.
O método de difusão quantitativa Etest®, tem se mostrado fácil na sua
aplicação, e com vantagens quando comparado com o método de difusão em
ágar. Segundo DI BONAVENTURA et al. (1998) o Etest® é promissor, pois tem
uma aplicação mais simples e os resultados apresentam uma boa correlação
com os métodos de referência propostos pelo CLSI. Por outro lado, MARLEY et
al. (1995) e JOYCE & WOODS (2004), destacaram a simplicidade de aplicação
do Etest, porém, pelo custo relativamente elevado não recomendam sua
utilização em estudos de rotina, mas indicam seu uso frequente em pesquisa
clínica, na qual os dados quantitativos de suscetibilidade são necessários, ou
para organismos fastidiosos ou anaeróbios, pois a fita pode ser empregada
também em meios enriquecidos.
52
Existem trabalhos que utilizam o Etest® como método para confirmar a
multirresistência de bactérias, detectadas por outros métodos. Assim BEREZIN
et al. (2002), relataram a experiência em pacientes de um hospital em São
Paulo, com sintomas de meningite, com cepas não susceptíveis por outros
métodos nas quais determinaram a CIM às quais as cepas eram susceptíveis.
Deve-se ressaltar que no presente estudo foram utilizados valores
referenciais de outros microrganismos que não L. monocytogenes, mas neste
sentido FILIOUSIS et al. (2009) explicam que os pontos de corte de resistência
para esta bactéria, disponíveis no CLSI estão estabelecidos somente para
penicilina e para a combinação Trimetoprima/sulfametoxazol.
Essas diferenças geográficas de resposta aos antimicrobianos podem
ser um indicativo das práticas na criação e produção de animais de açougue. O
que reforça a sugestão de MANTILLA et al. (2008) sobre a necessidade de
implantar programas de controle de resíduos de antimicrobianos na produção
animal, pelos órgãos governamentais.
4. CONCLUSÕES
De acordo com as condições de realização do presente estudo e
conforme os resultados obtidos pode-se afirmar que:
Entre os antimicrobianos testados, a levofloxacina (fluoroquinolona),
vancomicina (glicopeptideo) e ampicilina (beta-Lactâmico) são os mais indicados
contra os isolados de Listeria monocytogenes oriundos de carne moída e lingüiça
mista frescal de Araguaína, Tocantins.
Todos os isolados de carne bovina moída e linguiça mista frescal
apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobianos, destacando a
multiresistência dos sorovares inclusive a alguns antimicrobianos recomendados
para terapia de listeriose.
Agradecimentos
À coordenação do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de
53
Veterinária da Universidade Federal de Goiás – UFG; à coordenação de pós
graduação da Universidade Federal de Goiás, pelo apoio logístico e financeiro.
Somos gratos ao Dr. Ernesto Hofer, Laboratório de Zoonoses Bacterianas
(FIOCRUZ, RJ) por sorotipagem de L. monocytogenes.
5. REFERÊNCIAS
1. AB BIODISK. Etest® Antimicrobial susceptibility testing for in vitro diagnostic
use. AB Biodisk, Solna, Sweden. 2007. Disponível em:
http://www.abbiodisk.com/pdf/etm_html/03_etm.htm. Acesso em: 21 de set.
2009.
2. AARESTRUP, F.M.; KNOCHEL, S.; HASMAN, H. Antimicrobial susceptibility
of Listeria monocytogenes from food products. Foodborne Pathogens and
Disease. New York. v.4, n.2, p. 216-221, 2007.
3. AURELI, P.; FERRINI, A.M.; MANNONI, V.; HODZIC, S.; WEDELL-
EEGAARD, C.; OLIVA, B. Susceptibility of Listeria monocytogenes isolated
from food in Italy to antibiotics. International Journal of Food Microbiology.
Amsterdam. v.83, n.3. p. 325-330. 2003.
4. BEREZIN, E.N.; CARVALHO, L.H.; LOPES, C.R.; SANAJOTTA, A.T.;
BRANDILEONE, M.C.C.; MENEGATTI, S.; SAFADI, M.; GUERRA, M.L.C.S.
Meningite pneumocócica na infância: características clínicas, sorotipos mais
prevalentes e prognóstico. Jornal de Pediatria. Rio de Janeiro. v.77, n.1,
p.19-23, 2002.
5. BioMÉRIEUX. Etest technical manual (ETM). Etest® application sheet, 021.
Disponível em: http://www.abbiodisk.com/pdf/etm_html/09_etm.htm. Acesso
em: 14 set. 2009.
6. BOLMSTRÖM, A. Predefined gradients – a modern approach to anti-microbial
resistance testing. (online). Etest News No 27. AB biodisk. Solna, Sweden.
2000. Disponível em:
http://www.abbiodisk.com/pdf/etest_news/M0000356.pdf. Acesso em:11 set.
2009.
7. CHARPENTIER, E.; COURVALIN, P. Antibiotic Resistance in Listeria spp.
Minireview. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, DC.v.43,
54
n.9, p.2103-2108. 1999.
8. COLOMBO, A.L.; BARCHIESI, F.; McGOUGH, D.A.; RINALDI, M.G.
Comparison of Etest and National Committee for Clinical Laboratory
Standards broth macrodilution method for azole antifungal susceptibility
testing. Journal of Clinical Microbiology. Washington DC . v.33, n.3, p. 535-
540. 1995.
9. CRESPO, M.P.; VÉLEZ, J.D.; CASTANHEDA, CL.; HOYOS, F.; LÓPEZ, M.L.;
SALAZAR, J.C. Aislamiento de Listeria monocytogenes em um hospital de
tercer nível. Colombia Médica, Cali. v.30, n.002, p.89-98, 1999.
10. Di BONAVENTURA, G.; RICCI, E.; LOGGIA, N.D.; CATAMO, G.;
PICCOLOMINI, R. Evaluation of the E Test for antimicrobial susceptibility
testing of Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with long-term
bladder catherization. Journal of Clinical Microbiology, Washington, DC.
v.36, n.3. p.824-826, 1998.
11. FILIOUSIS, G.; JOHANSSON, A.; FREY, J. PERRETEN, V. Prevalence,
genetic diversity and antimicrobial susceptibility of Listeria monocytogenes
isolated from open-air food markets in Greece. Short Communication. Food
Control, Vurrey. v. 20, n.3, p. 314-317, 2009.
12. HERNÁNDEZ, B.B.; HERNÁNDEZ-GODOY, J. Resistencias a antibióticos en
Listeria monocytogenes y Salmonella enterica, aislados de alimentos de
origen animal. Revista de Salud Ambiental, Valencia. v.4, n.1, p. 42-46,
2004.
13. HANSEN, J.M.; GERNER-SMIDT, P.; BRUUN, BR. Antibiotic susceptibility of
Listeria monocytogenes in Denmark 1958-2001. Acta Pathologica,
Microbiologica et Immunologica Scandinavica. Sweden. v.113, p. 31-36, 2005.
14. JOICE, M.; WOODS, CH.W. Antibacterial susceptibility testing in the clinical
Laboratory. Clinical Infectious Diseases. Chicago. v.18, p.401-434, 2004.
15. JORGENSEN, J.H. Need for Susceptibility Testing Guidelines for Fastidious or
Less-Frequently Isolates Bacteria. Journal of Clinical Microbiology.
Washington, DC . v.42, n.2. 2004.
16. LYON, S.A.; BERRANG, M.E.; FEDORKA-CRAY, P.J.; FLETCHER, D.L.;
MEINERSMANN, R.J. Antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes
isolated from a poultry further processing plant. Foodborne Pathogens and
55
Disease. v.5, n.3, p.253-259, 2008.
17. MANTILLA, S.P.; FRANCO, R.M.; OLIVEIRA, L.A.T.; SANTOS, E.B.;
GOUVÊA, R. Resistência antimicrobiana de bactérias do gênero Listeria spp.
isoladas de carne moída bovina. Brazilian Journal of Veterinary Research
and Animal Science. São Paulo. v.45, n.2, p. 116-121, 2008.
18. MARLEY, E.F.; MOHLA, C.; CAMPOS, J.M. Evaluation of E-Test for
determination of antimicrobial MICs for Pseudomonas aeruginosa isolates
from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. Washington
DC. v.33, n.12, p. 3191-3193. 1995.
19. SERAL, C.; BARCIA-MACAY, M.; MINGEOT-LECLERQ, M.P.; TULKENS,
P.M.; VAN BAMBEKE, F. Comparative activity of quinolones (ciprofloxacin,
levofloxacin, moxifloxacin and garenoxacin) against extracellular and
intracellular infection by Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus
in J774 macrophages. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, London..
v.55, n.4, p.511-517, 2005.
20. SRINIVASAN, V.; NAM, H.M.; NGUYEN, L.T.; TAMILSELVAM, B.; MURINDA,
S.E.; OLIVER, S.P. Prevalence of antimicrobial resistance genes in Listeria
monocytogenes isolated from dairy farms. Foodborne Pathogens and
Disease. New York. v.2, n.3, p. 201-212, 2005.
21. THOMSON, R.B. What is your MIC IQ?. (online). ). Etest News No 30. AB
biodisk. Solna, Sweden. 2004. Disponível em:
http://www.abbiodisk.com/pdf/etest_news/M0000485.pdf, Acesso em:11 set.
2009.
22. WALSH, D.; DUFFY, G.; SHERIDAN, J.J.; BLAIR, I.S.; McDOWELL, D.A.
Antibiotic resistance among Listeria, including Listeria monocytogenes, in retail
foods. Journal of Applied Microbiology. Oxford. v.90, p.517-522, 2001.
23. WALSH, T. The gram negative threat – patients at risk?, Etest News No 32.
AB biodisk. Solna, Sweden. 2007. Disponível em:
http://www.abbiodisk.com/pdf/etest_news/M0000568.pdf, Acesso em:11 set.
2009.
24. YÜCEL, N.; ÇITAK, S.; ÖNDER, M. Prevalence and antibiotic resistance of
Listeria monocytogenes in meat products in Ankara, Turkey. Food
Microbiology, Amsterdam. v.22, p.241-245, 2005.
56
CAPÍTULO IV: CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Listeria monocytogenes
ISOLADAS DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL EM
ARAGUAÍNA - TO.
RESUMO. Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar que
causa a listeriose, doença fatal em aproximadamente 30% dos casos, e que
afeta principalmente pessoas imunocomprometidas. Métodos de subtipagem
molecular são ferramentas úteis na determinação das fontes em surtos de
listeriose, entre eles a Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (Pulsed Field Gel
Electrophoresis - PFGE) é considerada como gold standard para a tipagem de L.
monocytogenes. O presente trabalho tem como objetivo analisar as
características moleculares de cepas de L. monocytogenes isoladas de produtos
de origem animal obtidos em açougues de Araguaína, TO. Foram coletadas 30
amostras de carne moída e 30 amostras de linguiça mista frescal no segundo
semestre de 2008. Cinco (16,7%) das 30 amostras de carne moída crua foram
positivas ao patógeno, sendo que três pertenciam ao sorotipo 1/2b e duas ao
sorotipo 4b. Das 30 amostras de linguiça mista frescal duas (6,7%) foram
positivas para L. monocytogenes, sendo uma do sorotipo 1/2a e outra do 1/2b.
Os isolados foram submetidos à tipagem molecular pela técnica de PFGE,
utilizando-se para a digestão as enzimas de restrição ApaI e SmaI. A
similaridade entre eles foi determinada pelo coeficiente de Dice. A análise do
perfil de macrorrestrição obtido pela PFGE e a combinação de resultados obtidos
com a enzima SmaI permitiu a distribuição dos sete isolados em dois clusters,
dois pulsotipos e dois subtipos. Os resultados permitem concluir que os isolados
de L. monocytogenes sorotipos 4b, 1/2a e 1/2b são fortemente correlacionados
dentro dos mesmos sorotipos e em alguns casos entre os sorotipos, sugerindo
uma fonte comum.
Palavras-chave: Eletroforese em Gel em Campo Pulsado, enzimas de restrição,
Listeria monocytogenes
57
MOLECULAR PROFILES OF Listeria monocytogenes ISOLATED FROM
ANIMAL PRODUCTS IN ARAGUAÍNA - TO
ABSTRACT. Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that causes
listeriosis, a fatal disease in about 30% of cases, Listeria monocytogenes mainly
affects people with a compromised immune system. Molecular subtyping
methods are useful tools in determining the sources of listeriosis outbreaks.
Among these, Pulsed Field Gel Electrophoresis, or PFGE, is considered to be the
gold standard method for typing L. monocytogenes. The aim of this work was to
analyze the molecular characteristics of L. monocytogenes strains, taken from
meat from slaughterhouses in Araguaina, TO. We collected 30 samples of ground
beef and 30 samples of frescal sausage during the second half of 2008. Five out
of the 30 samples (16.7%) of raw ground beef tested positive, of which three
belonged to serotype b ½ and two to serotype 4b. Among the 30 samples of
sausage collected, two separate strains of L. monocytogenes were isolated
(6.7%), one of which was serotype ½ a and the other ½ b. Afterwards, the strains
were subjected to molecular typing by PFGE technique, using ApaI and SmaI
restriction enzymes. Similarities among the strains were determined by the Dice
coefficient. The macro restriction profile obtained by PFGE that was obtained with
both enzymes determined the distribution of the seven strains in two clusters, two
pulsotypes and two subtypes. The result indicates that L. monocytogenes
isolates, belonging to serotype 4b, ½ a and ½ b, are strongly correlated within
the same serotypes, and in some cases among other serotypes, suggesting that
they have a common source.
Key words Pulsed Field Gel Electrophoresis, restriction enzymes, Listeria
monocytogenes
58
1. INTRODUÇÃO
Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar agente da
listeriose cujos surtos esporádicos podem manifestar-se clinicamente como
septicemias, meningites, meningoencefalites e abortos, sendo fatal em
aproximadamente 30% dos casos. A listeriose afeta principalmente pessoas
imunocomprometidas, mulheres grávidas, recém-nascidos e idosos (PARIHAR et
al., 2008; FILIOUSIS et al., 2009).
Este patógeno é particularmente importante devido à sua habilidade de
se multiplicar em temperaturas de refrigeração, em elevadas concentrações de
sal e pela sua distribuição ubiquitária, além de formar biofilmes em
estabelecimentos processadores de alimentos (GRAVES et al.; 2005; SHEN et
al., 2006).
GRAVES et al. (1999) dividiram os métodos de subtipagem de Listeria
monocytogenes em duas categorias, a convencional (sorotipagem, fagotipagem)
e os métodos moleculares (Multilocus Enzyme Electrophoresis – MEE;
Chromossomal DNA Restriction Endonuclease Analysis – REA; Restriction
Fragment Length Polymorphism Analysis - RFLPs).
Isoladamente, as técnicas convencionais podem não detectar as fontes
dos surtos de listeriose, no entanto, os métodos de subtipagem molecular
apresentam-se como ferramentas úteis nesta detecção. Entre estes métodos, a
eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE- Pulsed Field Gel Electrophoresis)
proporciona uma subtipagem de grande sensibilidade e alto poder discriminatório,
sendo considerado o método gold standard para a subtipagem de L.
monocytogenes (TENOVER et al., 1997; BROSCH et al., 1996; BOU-M´HANDI et
al., 2007; FUGETT et al., 2007; LEMES-MARQUES et al., 2007). A PFGE
também pode ser usada, em estudos de longo prazo, para determinar a
persistência de uma espécie num ambiente, ou na determinação de contaminação
externa a um ambiente (SENCZEK et al., 2000; MORETRO & LANGSRUD,
2004). A este respeito, MELLO et al. (2008) garantiram que devido à
especificidade e sensibilidade dos métodos moleculares na identificação de
espécies L. monocytogenes, os métodos de sorotipagem vêm sendo substituídos
por esta técnica.
59
Na PFGE a bactéria intacta é localizada em blocos de agarose (plugs),
sua parede celular é lisada e ocorre digestão de suas proteínas. Dessa forma, as
enzimas de restrição reconhecem locais de corte distribuídos de maneira
diferenciada no genoma bacteriano, por isso os fragmentos são de diferentes
tamanhos que, por sua vez, formam padrões distintos quando são separados pela
eletroforese (GRAVES et al., 1999).
A separação de fragmentos de DNA cromossomal se dá pela
alternância dos campos elétricos em três direções perpendiculares (campo
pulsado), facilitando sua migração e proporcionando uma melhor resolução das
bandas no gel dependente do intervalo do pulso elétrico. Esta técnica além de
apresentar boa reprodutibilidade é altamente discriminatória com outras técnicas
de tipagem molecular disponíveis atualmente, sendo que a resolução alcançada
depende do tempo do pulso elétrico (FARAH, 1997; TENOVER et al., 1997;
BASIM & BASIM, 2001).
No Brasil faltam informações sobre surtos de listeriose, resistência
antimicrobiana das cepas clínicas e sua caracterização fenotípica e genotípica.
Entre as dificuldades no controle e no estudo da listeriose no Brasil, LEMES-
MARQUES et al. (2007) incluem a recuperação de organismos envolvidos nos
surtos, a falta de notificação e a demora na realização de análises clínicas
convencionais.
Considerando o exposto, objetivou-se com o presente estudo
caracterizar molecularmente isolados de Listeria monocytogenes oriundos de
carne moída e linguiça mista frescal de Araguaína, TO, empregando para tanto, a
eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE- Pulsed Field Gel Electrophoresis).
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Cepas bacterianas
As cepas de Listeria monocytogenes utilizadas neste estudo foram
isoladas a partir de amostras de carne moída e linguiça coletadas em açougues
de Araguaína, Tocantins, entre agosto e dezembro de 2008. As cepas foram
60
sorotipadas pelo Departamento de Bacteriologia do Instituto Oswaldo Cruz, RJ
(FIOCRUZ). Estes isolados de carne moída e linguiça foram coletadas em
açougues da cidade de Araguaína, Tocantins. As técnicas de isolamento, seleção,
confirmação e identificação, foram baseadas na Instrução Normativa n° 62 de 26
de Agosto de 2003 (BRASIL, 2003). Após identificação, as cepas foram
congeladas a -20OC em caldo Luria Bertani (LB) com 50% de glicerol .
Os estocados foram reanimados por inoculação em tubos contendo BHI
e incubadas a 37oC por 18 h.
2.2. Eletroforese em Gel de Campo Pulsado
O perfil genético dos isolados de Listeria monocytogenes foi
determinado por PFGE do DNA digerido pelas endonucleases de restrição ApaI e
SmaI, e a cepa de L. monocytogenes ATCC 19115 foi utilizada no gel como
controle interno da corrida, utilizando o aparelho CHEF DRII (Bio-Rad
Laboratories®, Hercules, CA, USA) seguindo os métodos de GRAVES &
SWAMINATHAN (2001) e CDC/PulseNet (2004) com modificações, descritas
brevemente a seguir.
Cada isolado de L. monocytogenes foi semeado em ágar Brain Heart
Infusion (BHI) com incubação overnight a 37ºC. Após a incubação, as colônias
foram transferidas com auxilio de swab umedecido com tampão TE (10 mM Tris, 1
mM EDTA pH 8.0), para tubos esterilizados contendo 3 mL de TE e então
ajustada a concentração para 1,3 – 1,4 em 610nm em espectrofotômetro.
Em seguida foram transferidos para um tubo Eppendorf, 120μL da
suspensão de bactérias adicionada de lisozima (10mg/mL – estoque) e 120μL de
SSP (1,2% agarose de corrida, 1% SDS, 0,2mg/ml proteinase K) para confecção
de pequenos blocos de agarose (plugs).
Os plugs foram transferidos para tubos Falcon contendo 5mL de
tampão de lise [50mM Tris pH 8,0, 50mM EDTA pH 8,0; 1,0% sarcosil; 0,15mg/mL
proteinase K] e incubados a 54ºC por um período de duas horas em banho Maria
(BM) com agitação. Após esse período, o tampão de lise foi desprezado e os
plugs foram lavados duas vezes com 10mL de água Tipo I esterilizada pré-
aquecida a 50ºC em BM com agitação por 10-15 minutos a 50ºC e então lavados
61
mais quatro vezes com 10mL de tampão TE (10mMTris, 1mM EDTA, pH 8.0)
esterilizado e pré-aquecido a 50oC em BM com agitação por 15 minutos a 50oC.
Em seguida os plugs foram estocados em tampão TE sob refrigeração.
A digestão de cada amostra de DNA contido nos plugs foi realizada por
duas enzimas separadamente. Em um tubo adicionou-se ao plug 150μL de
tampão de enzima 1X e 40U da enzima de restrição ApaI (Invitrogen, EUA) com
incubação a 30oC durante a noite. Em outro tubo adicionou-se 150μL do tampão
da enzima e 20U da enzima de restrição SmaI (Invitrogen, EUA) com incubação a
25oC durante a noite. A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de
agarose a 1% (agarose running gel, Sigma, EUA), em solução tampão Tris-Ácido
Bórico-EDTA 0,5x (Tris 90mM, ácido bórico 90mM e EDTA 2mM) no sistema
CHEF DRII (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA). Para a resolução dos fragmentos
de restrição foi utilizado corrente alternada com intervalos de pulso de 4 a 40
segundos a 6 V/cm e temperatura de 14ºC por 19 horas. Após a eletroforese os
géis foram corados com brometo de etídio (10mg/mL) e o padrão de bandas
visualizado e fotografado sob luz UV. Foi utilizado como padrão de peso
molecular o Lambda DNA ladder PFGE (New England Biolabs, Ipswich, MA)
posicionado nas extremidades do gel. O perfil eletroforético foi analisado
visualmente segundo os critérios estabelecidos por TENOVER et al., (1995) e
pelo software Bionumerics, vs. 4.5 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium).
A similaridade entre as cepas foi determinada pelo coeficiente de Dice e
os dendrogramas criados, utilizando-se UPGMA (unweighted-pair group method
using arithmetic averages). Um ponto de corte (cutoff) de 80% de similaridade foi
definido para determinação dos clusters, valor também utilizado nos trabalhos de
FRANCIOSA et al. (2005) e identificados com números arábicos. Os pulsotipos
(PT) foram empregados para identificar cepas com perfil eletroforético único e os
subtipos (ST), perfis com até três bandas de diferença, identificados com letras
maiúsculas e números, respectivamente.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das 30 amostras de carne moída crua, coletadas, cinco (16,7%) foram
62
positivas para Listeria monocytogenes sendo que três pertenciam ao sorotipo 1/2b
e duas ao sorotipo 4b. Das 30 amostras de lingüiça mista frescal coletadas foram
isoladas duas cepas (6,7%) de L. monocytogenes, sendo uma do sorotipo 1/2a e
uma do 1/2b. De acordo com KATHARIOU (2002) os sorotipos 1/2a, 1/2b e 4b
são os mais frequentemente envolvidos em casos de listeriose humana.
A análise do perfil de macrorrestrição obtido pelo PFGE e o resultado
obtido com a enzima de restrição, ApaI (Figura 1) permitiu a distribuição das sete
cepas em um único cluster (>80% de similaridade), dois pulsotipos (A e B) e dois
subtipos (A1 e B1). O pulsotipo B compreendeu quatro amostras sendo duas de
carne moída e duas de lingüiça mista frescal. Três destas amostras foram
classificadas como sorotipo 1/2b e uma como sorotipo1/2a evidenciando a
similaridade genética entre estes sorotipos.
Amostra Sorotipo Origem Cluster PT ST
A1
A
A2
1
B
4b
1/2b
Dice (Opt:0.70%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
10
0
95
90
85
89.784.7
100
80.9
.
.
.
.
.
.
.
A13
D
CM30
A15
A4
AL16
AL2
1/2 b
4 b
1/2 b
1/2 b
1/2 a
carne moída
carne moída
carne moída
carne moída
carne moída
linguiça
linguiça
Figura 1. Relação clonal de sete isolados de L. monocytogenes obtida por PFGE
após digestão com enzima ApaI. Os clusters (CL) foram designados por
algarismos arábicos, os pulsotipos (PT) por letras maiúsculas e os subtipos (ST)
por letras maiúsculas e algarismos arábicos, respectivamente.
63
Dice (Opt:0.70%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
Lilian
10
0
95
90
85
80
75
88.9
82.5
100
71.8
Lilian
.
.
.
.
.
.
.
D Sma
CM30 Sma
A13 Sma
A15 Sma
A4 Sma
AL16 Sma
AL2 Sma
4 b
N/S
1/2 b
1/2 b
1/2 b
1/2 a
N/S
carne moída
carne moída
carne moída
carne moída
carne moída
linguiça
linguiça
Amostra Sorotipo Origem Cluster PT ST
A
1 A1
A2
2 B
4b
1/2b
Figura 2. Relação clonal de sete isolados de L. monocytogenes obtida por PFGE
após digestão com enzima SmaI. Os clusters (CL) foram designados por
algarismos arábicos, os pulsotipos (PT) por letras maiúsculas e os subtipos (ST)
por letras maiúsculas e algarismos arábicos, respectivamente.
A análise do perfil gerado pela digestão com a enzima de restrição
SmaI foi semelhante à análise do perfil gerado pela enzima ApaI, com exceção do
agrupamento em cluster onde, de acordo com a similaridade das cepas, as
amostras digeridas com SmaI foram agrupadas em dois clusters (1 e 2, >80% de
similaridade) (Figura 2). De acordo com as Figuras 1 e 2, nota-se que o poder
discriminatório da enzima SmaI foi maior que ApaI.
Estes resultados evidenciam que os isolados de L. monocytogenes
sorotipos 4b, 1/2a e 1/2b são fortemente correlacionados dentro dos mesmos
sorotipos e, em alguns casos, entre os sorotipos, indicando uma origem comum.
Destaca-se que o procedimento de isolamento utilizou uma etapa de
enriquecimento da amostra, o que poderia inibir e/ou favorecer certos clones, de
acordo com LONCAREVIC et al. (1996).
BROSCH et al. (1994), relataram que sorotipos diferentes podem
apresentar perfis diferentes (REDP-Restriction Endonuclease Digestion Profile),
porém, às vezes, sorotipos diferentes podem apresentar REDPs iguais, como
aconteceu no presente trabalho e no estudo realizado por PARIHAR et al. (2008),
onde os sorotipos 1/2a e 1/2c, compartilharam o mesmo pulsotipo.
64
A este respeito, PIFFARETTI et al. (1989) já estabeleciam que a
identidade sorotípica entre isolados não indica necessariamente uma identidade
clonal. Corroborando, LÓPEZ et al. (2006) relataram que a diversidade genética
encontrada em alguns sorotipos de L. monocytogenes é tão grande quanto a
encontrada entre algumas espécies de Listeria.
Existe ainda discussão sobre a relação da origem de duas linhagens
encontradas em Listeria monocytogenes, a linhagem I representada pelos
sorovares 1/2b e 4b, e a linhagem II, representada por 1/2a e 1/2c (PARIHAR et
al., 2008). De acordo com NIGHTINGALE et al. (2005) a linhagem I seria
constituída por cepas adaptadas ao hospedeiro humano, enquanto a linhagem II
contaria com cepas ambientalmente adaptadas. FUGETT et al. (2007) ainda
lembraram a existência de uma terceira linhagem, representada principalmente
por isolados obtidos de listeriose animal, que inclui os sorotipos 4a, 4c e algumas
cepas do 4b.
A discriminação de resultados com enzimas diferentes pode variar
ainda em isolados da mesma origem, como acontecido no presente trabalho entre
as enzimas ApaI e SmaI. Da mesma forma, YDE & GENICOT (2004) explicaram
que na discriminação de três cepas enviadas ao Centro de Referência Belga, com
enzimas AscI e ApaI, foi observado que duas delas apresentaram um perfil
idêntico com a enzima AscI, porém diferentes quando utilizada a enzima ApaI.
Ainda, SHEN et al. (2006) também encontraram diferenças na discriminação de
bandas entre as enzimas AscI e ApaI.
Nesse sentido, faz-se necessária a identificação de Listeria
monocytogenes em diferentes ambientes, e associá-los aos diferentes pulsotipos
descritos em listeriose humana. Porém, no Brasil, tanto dados de isolamento de
humanos quanto do ambiente tem sido escassos, principalmente no segundo
caso. Portanto, não se tem ainda um mapeamento de distribuição geográfica e
temporal da ocorrência de L. monocytogenes e muito menos de seus pulsotipos.
Constituem ingredientes básicos da linguiça mista a carne de suino e
carne bovina cruas além de gordura (VON LAER et al., 2009), cuja preparação
nos pontos amostrados é artesanal e que, provavelmente, são pontos de revenda
deste produto. Nesse sentido, não se pode estabelecer a persistência de L.
monocytogenes, como sugerido por LONCAREVIC et al. (1996) uma vez que a L.
65
monocytogenes se estabelece em plantas de processamento onde os produtos
podem ter contaminação contínua.
Esta constatação é confirmada por VON LAER et al. (2009) ao
analisarem amostras da linha de processamento de linguiça mista frescal em
Pelotas, RS, Brasil. Esses autores observaram que nenhuma amostra do material
cru apresentava contaminação por L. monocytogenes, porém detectaram o
patógeno em todas as amostras do produto final. Às vezes a L. monocytogenes
persiste em uma linha de produção por um longo período de tempo podendo ser
considerada como cepa dominante (RORVIK et al., 2003), o que ressalta a
importância do ambiente como fonte de contaminação.
Neste caso, torna-se importante enfatizar a colocação de VON LAER et
al. (2009), sobre a discordância que existe em relação às fontes de contaminação
mais importantes de L. monocytogenes. Enquanto alguns autores consideram a
importância dos equipamentos e do ambiente, outros acreditam que a matéria
prima seria a fonte mais comum de contaminação.
4. CONCLUSÕES
A similaridade encontrada entre as amostras oriundas de produtos
produzidos e comercializados em locais diferentes sugere a contaminação
ambiental dos locais de comercialização dos produtos.
Apesar da diferença fenotípica observada em relação à sorotipagem, a
análise molecular evidenciou a característica clonal ou forte relação de
similaridade entre diferentes sorotipos de Listeria monocytogenes. Como os
produtos positivos para esta bactéria foram produzidos em locais diferentes e
comercializados também em locais diferentes, sugere-se que a hipótese de
contaminação ambiental dos locais de revenda dos produtos seja a mais plausível
para explicar a similaridade entre as cepas encontradas.
O monitoramento constante da circulação de sorotipos envolvidos em
surtos de listeriose humana e animal através de técnicas moleculares como o
PFGE, se constitui uma ferramenta importante na prevenção da disseminação
desta bactéria entre os produtos de origem animal.
66
Agradecimentos
À coordenação do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de
Veterinária da Universidade Federal de Goiás, Brasil; à coordenação de pós
graduação da Universidade Federal de Goiás, e à coordenação do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás pelo apoio
logístico e financeiro oferecido para a realização deste trabalho. Somos gratos ao
Dr. Ernesto Hofer, laboratório de Zoonoses Bacterianas (FIOCRUZ, RJ) por
sorotipagem de L. monocytogenes.
5. REFERÊNCIAS
1. BASIM, E.; BASIM, H. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) technique and
its use in Molecular Biology. Turkish Journal of Biology, Ankara. v.25, p.405-
418, 2001.
2. BOU-M`HANDI, N.; JACQUET, CH.; EL MARRAKCHI, A.; MARTIN, P.
Phenotypic and molecular characterization of Listeria monocytogenes strains
isolated from a marine environment in Morocco. Foodborne Pathogens and
Disease. v.4, n.4, p.409-417, 2007.
3. BRASIL. Ministério de Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária.
Secretaria de Defesa Agropecuária. Métodos analíticos oficiais para
análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e
água. Instrução Normativa No 62, de 26 de agosto de 2003.
4. BROSCH, R.; CHEN, J.; LUCHANSKY, J.B. Pulsed-field fingerprinting of
listeriae : identification of genomic divisions for Listeria monocytogenes and
their correlation with serovar. .Applied and Environmental Microbiology.
v.60,n.7,p.2584-2592,1994.
5. BROSCH, R.; BRETT, M.; CATIMEL, B.; LUCHANSKY, J.B.; OJENIYI, B.;
ROCOURT, J. Genomic fingerprinting of 80 strains from the WHO multicenter
international typing study of Listeria monocytogenes via pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE). International Journal of Food Microbiology,
Washington, DC. v.32, p.343-355, 1996.
67
6. CDC/PulseNet, The national molecular subtyping network for foodborne
disease surveillance. Standardized Protocol For Molecular Subtyping of
Listeria monocytogenes by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE).
USA. 2004.
7. FARAH, S.B. DNA no diagnóstico das doenças humanas. In: ______ DNA,
segredos & mistérios. São Paulo: Sarvier, 1997. cap. 5, p 103-140.
8. FILIOUSIS, G.; JOHANSSON, A.; FREY, J. PERRETEN, V. Prevalence,
genetic diversity and antimicrobial susceptibility of Listeria monocytogenes
isolated from open-air food markets in Greece. Short Communication. Food
Control. Vurrey. v. 20, n.3, p. 314-317, 2009.
9. FRANCIOSA, G.; MAUGLIANI, A.; FLORIDI, F.; AURELI, P. Molecular and
experimental virulence of Listeria monocytogenes strains isolated from cases
with invasive listeriosis and febrile gastroenteritis. FEMS Immunology and
Medical Microbiology, Amsterdam. v.43, p.431-439, 2005.
10. FUGETT, E.B.; SHOONMARKER-BOPP, D.; DUMAS, N.B.; CORBY, J.;
WIEDMANN, M. Pulsed-Field gel electrophoresis (PFGE) analysis of
temporally matched Listeria monocytogenes isolates from human clinical
cases, foods, ruminant farms, and urban and natural environments reveals
source-associated as well as widely distributed PFGE types. Journal of
Clinical Microbiology, Washington, DC. v.45, n.3, p. 865-873, 2007.
11. GRAVES, L.M.; SWAMINATHAN, B.; HUNTER, S. Subtyping Listeria
monocytogenes. in: _____.Listeria, Listeriosis, and food safety, 2. ed.
Marcel Dekker, Inc., 1999. chap.9, p. 279-297.
12. GRAVES, L.M.; HUNTER, S,B.; ONG, A.R.; SCHOONMAKER-BOPP, D.;
HISE, K.; KORNSTEIN, L.; DeWITT, W.; HAYES, P.S.; DUNNE, H.; MEAD, P.;
SWAMINATHAN, B. Microbiological Aspects of the Investigation that traced the
1998 outbreak of Listeriosis in the United States to contaminated hot dogs and
establishment of molecular subtyping-based surveillance for Listeria
monocytogenes in the PulseNet Network. Journal of Clinical Microbiology,
Washington, DC. v.43, n.5, p. 2350-2355, 2005.
68
13. GRAVES, L.M. & SWAMINATHAN, B. PulseNet standardized protocol for
subtyping Listeria monocytogenes by macrorestriction and pulsed-field gel
electrophoresis. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam.
v.65, p. 55-62, 2001,
14. KATHARIOU, S. Listeria monocytogenes virulence and pathogenicity, a food
safety perspective. Journal of Food Protection, v.65, p.1811-1829, 2002.
15. LEMES-MARQUES, E.G.; CRUZ, C.D.; DESTRO, M.T. Pheno- and genotypic
characterization of Listeria monocytogenes clinical isolates from southwestern
region of the State of São Paulo, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology.
São Paulo. v.38, p. 287-292, 2007.
16. LONCAREVIC, S.; THAM, W.; DANIELSSON-THAM, M.L. The clones of
Listeria monocytogenes detected in food depend on the method used. Letters
in Applied Microbiology, v.22, p.381-384, 1996.
17. LÓPEZ, V.; SUÁREZ, M.; CHICO-CALERO, I.; NAVAS, J.; MARTÍNEZ-
SUÁREZ, J.V. Listeria monocytogenes en alimentos: ¿son todos los
aislamientos igual de virulentos?. Revista Argentina de Microbiologia. v.38,
p.224-234, 2006.
18. MELLO, J.F.; EINSFELDT, K.; FRAZZON, A;P.G.; COSTA, M.; FRAZZON, J.
Molecular analysis of the LAP gene of Listeria monocytogenes isolated from
cheeses in Rio Grande do Sul, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology. São
Paulo. v.39, p.169-172, 2008.
19. MORETRO, T. & LANGSRUD, S. Listeria monocytogenes: Biofilm formation
and persistence in food-processing environments. Biofilms. Massachusetts.
v.1, p.107-121. 2004.
20. NIGHTINGALE, K.K.; WINDHAM, K.; WIEDMANN, M. Evolution and molecular
phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal
listeriosis cases and foods. Journal of Bacteriology. Washington, DC. v.187,
n.16, p.5537–5551, 2005.
69
21. PARIHAR, V.S.; LOPEZ-VALLADARES, G.; DANIELSSON-THAM, M-L., et al.,
Characterization of human invasive isolates of Listeria monocytogenes in
Sweden 1986-2007. Journal of Foodborne Pathogens and Disease, New
York. v.5, n.6, p. 755-761, 2008.
22. PIFFARETTI, J.C.; KRESSEBUCH, H.; AESCHBACHER, M.; BILLE,J.;
BANNERMAN, E.; MUSSER, J.M.; SELANDER, R.K.; ROCOURT, J. Genetic
characterization of clones of the bacteria Listeria monocytogenes causing
epidemic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America. V.86, p.3818-3822, 1989.
23. RORVIK, L.M.; AASE, B.; ALVESTAD, T.; CAUGANT, D.A. Molecular
epidemiological survey of Listeria monocytogenes in broilers and poultry
products. Journal of Applied Microbiology. Oxford. v.94, p.633-640, 2003.
24. SENCZEK, D.; STEPHAN, R.; UNTERMANN, F. Pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE) typing of Listeria strains isolated from a meat
processing plant over a 2-year period. International Journal of Food
Microbiology, Amsterdam. v.62, p. 155-159, 2000.
25. SHEN, Y.; LIU, Y.; ZHANG, Y.; CRIPE, J.; CONWAY, W.; MENG, J. HALL, G.;
and BHAGWAT, A.A. Isolation and characterization of Listeria monocytogenes
isolates from ready-to-eat foods in Florida. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, DC. v.72, n.7, p.5073-5076, 2006.
26. TENOVER, F.C.; ARBEIT, R.D.; GOERING, R.V.; MICKELSEN, P.A.;
MURRAY, B.E.; PERSING, D.H.; SWAMINATHANs B. Interpreting
chromosomal DNA restriction patterns produced by Pulsed-Field Gel
Electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. Journal of Clinical
Microbiology, Washington, DC. v.33, n.9, p. 2233-2239, 1995.
27. TENOVER, F.C.; ARBEIT, R.D.; GOERING, R.V. How to select and Interpret
molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial
infections: A review for healthcare epidemiologists. Infection Control and
Hospital Epidemiology. New Jersey. v.18, n.6. p.61-74, 1997.
70
28. VON LAER, A.E.; LIMA, A.S.; TRINIDADE, P.S.; ANDRIGUETTO, C.;
DESTRO, M.T.; SILVA, W.P. Characterization of Listeria monocytogenes
isolated from a fresh mixed sausage processing line in Pelotas-RS by PFGE.
Brazilian Journal of Microbiology. São Paulo. v.40, p.574-582, 2009.
29. YDE, M.; GENICOT, A. Use of PFGE to characterize clonal relationships
among Belgian clinical isolates of Listeria monocytogenes. Journal of Medical
Microbiology. Stuttgart. v.53, p.399-402, 2004.
71
CAPITULO V: CONSIDERAÇÕES FINAIS
A presença de Listeria monocytogenes, principalmente de sorotipos
envolvidos em surtos de listeriose, em amostras tanto de carne moída quanto de
lingüiça mista frescal na cidade de Araguaína, Estado do Tocantins, evidencia a
necessidade de estabelecer sistema de vigilância específico para o Estado, que
considere o controle de alimentos comercializados, assim como a promoção de
adequada educação sobre a manipulação de alimentos, para evitar contaminação
cruzada, e alertar aos consumidores sobre os riscos de contaminação por L.
monocytogenes, principalmente para populações imunocomprometidas.
Na avaliação de perigo da enfermidade causada por Listeria
monocytogenes, até o desenvolvimento de novas técnicas associadas a
marcadores de virulência, todos os isolados devem ser considerados patogênicos
e as únicas recomendações permitidas neste aspecto são as de prevenção, pois
ate o momento os trabalhos laboratoriais de detecção e identificação deste
patógeno, parecem ser insuficientes para determinar o risco real da ingestão
desta bactéria a traves de um determinado alimento, visto a complexidade na
correlação de numerosos fatores de virulência com a diversidade genética
existente dentro da própria espécie bacteriana, além da grande variabilidade de
susceptibilidade imunitária humana, que sinalizariam o verdadeiro potencial
patogênico das cepas encontradas em um determinado alimento.
Pela revisão de literatura sobre pesquisas recentes quanto à prevenção
e inibição de Listeria monocytogenes, é recomendado que sejam tomados em
consideração fatores intrínsecos e extrínsecos de um determinado produto, no
qual patógenos podem desenvolver antes de danos aparentes acontecerem,
geralmente antes do tempo de vida útil nas prateleiras do comercio.
A nova portaria no 09, do MAPA (BRASIL, 2009) já considera algumas
características físico-químicas de fabricação de produtos de origem animal,
determinantes para monitorar e controlar Listeria monocytogenes, assim como pH
> 4.4 (superior a quatro ponto quatro) ou Atividade de Água > 0.92 (superior a
zero pons to noventa e dois) ou concentração de cloreto de sódio <10 % (inferior
a dez por cento), provavelmente como reflexo de últimas pesquisas realizadas
neste tema. Por isso, ainda recomenda-se re-ver o tempo de vida de produtos,
72
principalmente aqueles considerados de risco, como alimentos prontos para o
consumo, que geralmente precisam de refrigeração.
Pelos resultados obtidos na tipagem molecular, as cepas de Listeria
monocytogenes isoladas em lingüiça mista frescal e carne moída de Araguaína
(TO) podem ser parte de um grupo clonal com característica de persistência nos
ambientes de processamento, que seriam considerados como fonte de
contaminação do produto final, o que evidencia a necessidade de adoção de
medidas de controle higiênico-sanitárias desses ambientes para garantir a
segurança dos consumidores.
