UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA NÚCLEO ... · A 0.005 mg.L-1, a média da recuperação e...

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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA NÚCLEO BIOTECNOLÓGICO

Mestrado em Ciência e Biotecnologia Biotecnologia Aplicada à Agroindústria e Saúde

Desenvolvimento e validação de método multirresíduos para

determinação de pesticidas em suco de uva utilizando

QuEChERS por LC-MS/MS

Deise Ferreira de Souza

Videira 2015

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Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciência e Biotecnologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciência e Biotecnologia.

Área de Concentração: Biotecnologia Aplicada à Agroindústria e Saúde

Orientador: Prof. Dr. Edson Luiz de Souza

Co-Orientador: Prof. Dr. Endler Marcel Borges

Videira 2015

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Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciência e Biotecnologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciência e Biotecnologia.

Data: 04 de setembro 2015 Nota: A

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Edson Luiz de Souza (Orientador) Universidade do Oeste de Santa Catarina

Prof. Dra. Cristiane Spagnol Universidade do Contestado

Prof. Dra.Maria Elisabete Machado Universidade do Oeste de Santa Catarina

Prof. Dra. Jane Mary Lafayette Neves Gelinski, Universidade do Oeste de Santa Catarina

Prof. Dr. Endler Marcel Borges de Souza (co orientador) Universidade do Oeste de Santa Catarina

(suplente)

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Quando penso que cheguei ao meu limite, descubro que tenho forças para ir além.”

Ayrton Senna

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AGRADECIMENTOS

Inicialmente, quero agradecer a Deus por ter me mostrado o caminho, e

principalmente por ter me conduzido e me abençoado nas horas difíceis.

Agradeço especialmente, à Instituição Serviço Nacional de Aprendizagem

Industrial – SENAI pelo apoio financeiro que viabilizou meu ingresso no mestrado e

pela permissão em desenvolver o experimento deste trabalho na infraestrutura do

Laboratório da Tecnologia de Bebidas-LATEB. Dentre meus colegas de trabalho que

intercederam pela aprovação do subsídio, agradeço imensamente à José Carlos

Martinazzo Junior, Márcia Haveroth Trierweiler e Evandro Cesar Desiderio.

Agradeço a Universidade do Oeste de Santa Catarina-UNOESC, especialmente a

Dra. Jane Mary Lafayette Neves Gelinski, por implantar o mestrado em Ciência e

Biotecnologia aqui na nossa cidade, possibilitando ex-alunos continuarem sua

formação.

Agradeço ao meu esposo Juliano Simioni pela paciência, apoio, ajuda e dicas

durante o desenvolvimento do trabalho, ao meu filho amado Lorenzo Simioni, por me

proporcionar alegria nos momentos difíceis.

À minha amiga Daniela Menegat que corrigiu meu trabalho, deu dicas, escutava

minhas angústias e sempre me apoiou. Ao meu colega de cromatografia Maicon

Rodrigo Zangalli que me auxiliou bastante, compartilhou comigo as dificuldades e

conquistas no desenvolvimento do método.

Aos meus orientadores Dr. Edson Luiz de Souza e Dr. Endler Marcel Borges,

pelo apoio técnico e orientações quanto ao desenvolvimento do trabalho como um todo.

Aproveito para citar outros nomes de colegas (alguns que somente conversei por

telefone) que me deram dicas e me auxiliaram no decorrer do trabalho: Nelio Fleury

(LANAGRO de Goías), Rogério Giachini (Tecnovin), Ivani Blanco (Agilent

Technologies).

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RESUMO

SOUZA; D.F. Desenvolvimento e validação de método multirresíduos para

determinação de pesticidas em suco de uva utilizando QuEChERS por LC-

MS/MS. 2015. 133f. Dissertação (Mestrado) – Universidade do Oeste de Santa Catarina

A cromatografia líquida (Liquid chromatography, LC) acoplada à espectrometria de

massas (mass spectrometry, MS) é a técnica de separação mais eficiente comumente

utilizada no monitoramento de resíduos de pesticidas em alimentos, dentre outras

aplicações. Neste estudo, utilizou-se a técnica Liquid Chromatography – tandem mass

spectrometry (LC-MS/MS) para o desenvolvimento e validação de um método para a

quantificação de multipesticidas em suco de uva. Os métodos de preparo das amostras,

AOAC Official Method 2007.01 e Standard Method EN 15662 foram comparados e

ambos os testes apresentaram resultados estaticamente equivalentes, para amostras

fortificadas a 3 mg.L-1

. Dentre os parâmetros de validação, o efeito matriz foi testado

para 26 pesticidas (acefato, clorpirifos, dimetoato, trifloxistrobina, carbofurano,

azoxistrobina, bifentrina, boscalida, cimoxanil, clotianidina, difenoconazol, diurom,

famoxadona, fenamidona, fenarimol, imidacloprido, indoxacarbe, iprovalicarbe,

metalaxil, tebuconazol, tetraconazol, tiametoxam, triadimefom, triadimenol,

deltametrina, carbosulfano) comparando soluções padrão e extrato de amostra branca

fortificado a 2 mg.L-1

, nenhum efeito matriz foi observado. O Limite Máximo de

Resíduo (LMR) aceitável estabelecido no Brasil para cada analito foi considerado para a

construção das curvas de calibração. A 0.005 mg.L-1

, a média da recuperação e do

desvio padrão relativo foram 101% e 16%, respectivamente. A 2 mg.L-1

, a média da

recuperação e do desvio padrão relativo foram 112% e 11%, respectivamente. A

repetitividade foi testada em três concentrações 0,005 mg.L-1

, 0,1 mg.L-1

e 2 mg.L-1

, as

médias de coeficientes de variação foram 16,4%, 20,7% e 10,8%, respectivamente. A

precisão intermediária foi testada em três concentrações 0,005 mg.L-1

, 0,1 mg.L-1

e 2

mg.L-1

, as médias de coeficientes de variação foram 14,5%, 20,3% e 11,4%. Os limites

de quantificação foram determinados como o ponto mais baixo da curva de calibração,

onde a média da recuperação ficou em 93%. Deltametrina e Carbosulfano foram

excluídos do método por apresentarem recuperações inaceitáveis. O método para a

determinação de pesticidas de 24 moléculas foi validado para a matriz suco de uva

integral. Palavras Chaves: Multi pesticidas. Bebida. Espectrometria de Massa.

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ABSTRACT

SOUZA; D.F. Development and validation of method for determination of

multipesticides in grape juice using QuEChERS and LC -MS / MS. 2015. 133f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade do Oeste de Santa Catarina.

Liquid chromatography (LC) coupled to mass spectrometry (MS) is the most efficient

separation technique commonly used to monitor pesticide residues in food, among other

applications. In this study, we used a Liquid Chromatography – tandem mass

spectrometry (LC-MS / MS) technique for development and validation of a method for

quantifying multipesticidas in grape juice. The methods of preparation of the samples,

AOAC Official Method 2007.01 and Standard Method EN 15662 were compared and

both tests showed statistically equivalent results for samples spiked to 3 mg.L-1

. Among

the validation parameters the effect matrix was tested for 26 pesticides, (acephate,

chlorpyrifos, dimethoate, trifloxystrobin, carbofuran, azoxystrobin, bifenthrin,

boscalida, cymoxanil, clothianidin, difenoconazole, diuron, famoxadone, fenamidone,

fenarimol, imidacloprid, indoxacarb, iprovalicarb, metalaxyl, tebuconazole,

tetraconazole, thiamethoxam, triadimefom, triadimenol, deltamethrin, carbosulfan)

comparing standard solutions and the white sample extract fortified 2mg.L-1

, no matrix

effect has been observed. The acceptable Maximum Residue Limit (MRL) in Brazil for

each analyte was considered for the construction of calibration curves. The 0.005 mg.L-

1, the average recovery and relative standard deviation were 101% and 16%,

respectively. The 2 mg.L-1

, the average recovery and relative standard deviation were

112% and 11%, respectively. The repeatability was tested in three concentrations

0.005mg.L-1

, 0.1mg.L-1

and 2mg.L-1

, the average coefficients of variation were 16.4%,

20.7% and 10.8%, respectively. Intermediate precision was tested in three

concentrations 0.005mg.L-1

, 0.1mg.L-1

and 2mg.L-1

, the average coefficients of

variation were 14.5%, 20.3% and 11.4%, respectively. The limits of quantification

(LOQs) were defined as the lowest calibration level, where the average of recoveries, at

the LOQs, was 93%. Deltamethrin and Carbosulfan were excluded from the method for

presenting unacceptable recoveries. The method for the determination of pesticides 24

molecules was validated for the full array grape juice.

Key Words: Multi pesticides. Drinks. Mass Spectrometry

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema do processo de ionização por ESI .............................................................. 34

Figura 2 - Técnicas de ionização em função da polaridade e da massa molecular. ................... 35

Figura 3 - Esquema das principais partes de um espectrômetro de massa ................................. 36

Figura 4 - Ilustração do sistema de um Triplo Quadrupolo – QQQ. .......................................... 37

Figura 5 - TIC antes (a) e depois (b) da otimização das energias .............................................. 58

Figura 6 – Recorte do início da corrida comparando o TIC MRM (linha preta) com o TIC

DMRM (linha vermelha) ..................................................................................................... 59

Figura 7 – Extrato da amostra branca (linha vermelha) e branco do reagente (linha preta)

sobrepostos .......................................................................................................................... 68

Figura 8 - TIC do branco reagente (a) da matriz branca fortificada (b) e da amostra branca (c)68

Figura 9 - Estudo de efeito matriz - TIC do extrato da amostra branca fortificada 2mg.L-1

(a) e

TIC do padrão em solução 2 mg.L-1

(b) .............................................................................. 69

Figura 10 - TIC sobrepostos do extrato da matriz branca fortificada a 2 mg.L-1

(linha preta)

com a solução padrão 2mg.L-1

em solvente (linha vermelha) ............................................. 69

Figura 11 – TIC (a) da amostra A e transição de quantificação184143 (b) e qualificação

18495 (c) para Acefato .................................................................................................... 78

Figura 12 - TIC (a) da amostra A e transição de quantificação 192160 (b) e qualificação

192132 (c) para Carbendazim ......................................................................................... 78

Figura 13 - TIC (a) da amostra B e transição de quantificação 192160 (b) e qualificação


Figura 14 - TIC (a) da amostra C ............................................................................................... 79

Figura 15 - TIC (a) da amostra D e transição de quantificação 192160 (b) e qualificação


Figura 16 - TIC (a) da amostra E e transição de quantificação 192160 (b) e qualificação


Figura 17 - TIC (a) da amostra E e transição de quantificação 404372 (b) e qualificação

404344 (c) para Azoxistrobina ........................................................................................ 80

Figura 18 - TIC (a) da amostra F e transição de quantificação 192160 (b) e qualificação


Figura 19 - TIC (a) da amostra G e transição de quantificação 192160 (b) e qualificação



280160 (c) para Metalaxil ............................................................................................... 82



Figura 22 - TIC (a) da amostra G e canais do íon quantificador 30870 (b) e qualificador

308124 (c) para Tebuconazol .......................................................................................... 82

Figura 23 - TIC (a) da amostra H e transição de quantificação 192160 (b) e qualificação


Figura 24 - TIC (a) da amostra H e transição de quantificação 404372 (b) e qualificação


Figura 25 - TIC (a) da amostra I e transição de quantificação 192160 (b) e qualificação


9

Figura 26 - TIC (a) da amostra J e transição de quantificação 192160 (b) e qualificação


Figura 27 – TIC (a) e canais com as transições de quantificação 184143 (b) e qualificação

18495 (c) para ACEFATO .............................................................................................. 96

Figura 28- TIC (a) e canais com as transições de quantificação 292211 (b) e qualificação

292181 (c) para TIAMETOXAN .................................................................................... 97

Figura 29 - TIC (a) e canais com as transições de quantificação 256208 (b) e qualificação

256175 (c) para IMIDACLOPRIDO ............................................................................... 97


250169 (c) para CLOTIANIDINA .................................................................................. 98


230171 (c) para DIMETOATO ....................................................................................... 98


199110 (c) para CIMOXANIL ........................................................................................ 99


222165 (c) para CARBOFURAN ................................................................................... 99

Figura 34 - TIC (a) e canais com as transições de quantificação 23372,1 (b) e qualificação

233159 (c) para DIURON ............................................................................................. 100


280160 (c) para METALAXIL ..................................................................................... 100

Figura 36 -TIC (a) e canais com as transições de quantificação 404372 (b) e qualificação

404344 (c) para AZOXISTROBINA ............................................................................ 101


312236 (c) para FENAMIDONA .................................................................................. 101


343271 (c) para BOSCALIDA ...................................................................................... 102


294225 (c) para TRIADIMEFON ................................................................................. 102


321202 (c) para IPROVALICARB ............................................................................... 103


29699 (c) para TRIADIMENOL ................................................................................... 104


37270 (c) para TETRACONAZOL ............................................................................... 104


33181 (c) para FENARIMOL ....................................................................................... 105


308124 (c) para TEBUCONAZOL ............................................................................... 105


406337 (c) para DIFENOCONAZOL ........................................................................... 106


392238 (c) para FAMOXADON ................................................................................... 106


409145 (c) para TRIFLOXISTROBINA....................................................................... 107


528203 (c) para INDOXACARBE ................................................................................ 107


349293 (c) para CLORPIRIFOS ................................................................................... 108

10


422135 (c) para FENPIROXIMATO ............................................................................ 108


523181 (c) para DELTAMETRINA ............................................................................. 109


381160 (c) para CARBOSULFANO ............................................................................ 109


440166 (c) para BIFENTRINA ..................................................................................... 110


192132 (c) para CARBENDAZIN ................................................................................ 110

Figura 55 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para ACEFATO no intervalo de

concentração de 0,0025 – 1 mg.L-1

................................................................................... 111

Figura 56 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para TIAMETOXAN no intervalo

de concentração de 0,005 – 2 mg.L-1

................................................................................. 111

Figura 57 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para IMIDACLOPRIDO no

intervalo de concentração de 0,0025 – 1 mg.L-1

............................................................... 111

Figura 58 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para CLOTIANIDINA no intervalo


............................................................................... 112

Figura 59 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para DIMETOATO no intervalo de


................................................................................... 112

Figura 60 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para CARBOFURANO no intervalo


............................................................................... 112

Figura 61 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para CIMOXANIL no intervalo de


................................................................................... 113

Figura 62 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para METALAXIL no intervalo de


..................................................................................... 113

Figura 63 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para DIURON no intervalo de


................................................................................... 113

Figura 64 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para AZOXISTROBINA no


................................................................. 114

Figura 65 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para FENAMIDONA no intervalo


................................................................................... 114

Figura 66 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para BOSCALIDA no intervalo de


....................................................................................... 114

Figura 67 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para TRIADIMEFON no intervalo


................................................................................... 115

Figura 68 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para TRIADIMENOL no intervalo


................................................................................. 115

Figura 69 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para IPROVALICARBE no


............................................................... 115

Figura 70 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para TETRACONAZOLE no


................................................................. 116

Figura 71 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2)

para FENARIMOL no intervalo de


..................................................................................... 116

Figura 72 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para TEBUCONAZOL no intervalo


................................................................................... 116

Figura 73 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para FAMOXADONA no intervalo


................................................................................... 117

11

Figura 74 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para DIFENOCONAZOL no


................................................................... 117

Figura 75 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para INDOXACARBE no intervalo


................................................................................. 117

Figura 76 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para TRIFLOXISTROBINA no


................................................................. 118

Figura 77- CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para CLORPIRIFOS no intervalo de


..................................................................................... 118

Figura 78 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para FENPIROXIMATO no


................................................................. 118

Figura 79 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para DELTAMETRINA no


............................................................... 119

Figura 80 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para CARBOSULFAN no intervalo


............................................................................... 119

Figura 81 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r2) para BIFENTRINA no intervalo de


................................................................................... 119

Figura 82 - Gráfico de dispersão dos resíduos das respostas instrumentais em função da

concentração para ACEFATO .......................................................................................... 121


concentração para AZOXISTROBIN ............................................................................... 121


concentração para BIFENTRINA ..................................................................................... 122


concentração para DELTAMETRINA .............................................................................. 122


concentração para DIMETOATO ..................................................................................... 123


concentração para FENPIROXIMATO ............................................................................ 123


concentração para TRIFLOXISTROBINA ....................................................................... 124


concentração para CARBOSULFANO ............................................................................. 124


concentração para CLOTIANIDINA ................................................................................ 125


concentração para FENARIMOL ...................................................................................... 125


concentração para IMIDACLOPRIDO ............................................................................. 126


concentração para IPROVALICARBE ............................................................................. 126


concentração para TRIADIMENOL ................................................................................. 127


concentração para CIMOXANIL ...................................................................................... 127


concentração para DIURON ............................................................................................. 128


concentração para CLORPIRIFOS ................................................................................... 128

12


concentração para METALAXIL ...................................................................................... 129


concentração para INDOXACARBE ................................................................................ 129


concentração para TETRACONAZOL ............................................................................. 130


concentração para TIAMETOXAM .................................................................................. 130

Figura 102- Gráfico de dispersão dos resíduos das respostas instrumentais em função da

concentração para FAMOXADON ................................................................................... 131


concentração para FENAMIDONE................................................................................... 131


concentração para DIFENOCONAZOLE ......................................................................... 132


concentração para DIMETOMORFE ................................................................................ 132

Figura 106- Gráfico de dispersão dos resíduos das respostas instrumentais em função da

concentração para TEBUCONAZOL ............................................................................... 133


concentração para TRIADIMEFON ................................................................................. 133


concentração para CARBOFURAN .................................................................................. 134

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Relação de Pesticidas Inclusos no Método e suas classes químicas ......................... 25

Tabela 2- Resumo dos dados obtidos do Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em

Alimentos e do Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes nos últimos

cinco anos para uva ............................................................................................................. 28

Tabela 3 - Limites Máximos de Resíduos em uva no Brasil, Japão, Estados Unidos e Europa . 29

Tabela 4 - Etapas do método QUeChERS original .................................................................... 31

Tabela 5 - Referências de estudos multirresíduos em diversas matrizes utilizando o método de

QuEChERS para preparo da amostra .................................................................................. 32

Tabela 6 – Relação do LMR, massa molecular e fórmula estrutural dos pesticidas inclusos no

método multirresíduo em suco de uva ................................................................................. 44

Tabela 7 - Métodos de extração e limpeza que serão testados neste estudo .............................. 47

Tabela 8 - Preparo das soluções estoque e solução mãe ............................................................ 48

Tabela 9 – Detalhamento do preparo dos níveis das curvas de calibração ................................. 49

Tabela 10 - Relação entre concentração do analito e coeficiente de variação aceitável ............ 52

Tabela 11 - Fases móvel testadas no método ............................................................................. 54

Tabela 12 - Condições de Operação do HPLC utilizada para a implantação e validação do

método em estudo................................................................................................................ 55

Tabela 13 - Transições de quantificação, qualificação energias otimizadas e tempo de retenção

dos pesticidas em estudo ..................................................................................................... 56

Tabela 14 - Faixa e Intervalos testados para otimização das energias ....................................... 57

Tabela 15 - Comparação da altura dos picos antes e depois da otimização das energias do

fragmentor, cela de colisão e célula de aceleração .............................................................. 58

Tabela 16 - Condições de operação do espectrômetro de massas .............................................. 60

Tabela 17 – Teste de eficácia entre os métodos AOAC-2007.01 e EN 15662:2008 por meio da

comparação de recuperação, análise da variância e das médias para cada pesticida .......... 62

Tabela 18 – Faixa da curva de calibração CCAS para cada pesticida e LMR ........................... 65

Tabela 19 - Curvas analíticas y= ax+b, coeficiente de correlação (r2), teste de

homocedasticidade para o MMQO...................................................................................... 66

Tabela 20 - Curvas analíticas y= ax+b, coeficiente de correlação (r2), teste r para o MMQP ... 67

Tabela 21 – Verificação de Efeito matriz – Análise da Variância e comparação de médias entre

extrato da matriz branca fortificada a 2mg.L-1

(B) e padrão puro em solução a 2mg.L-1

(A)

............................................................................................................................................. 70

Tabela 22 – Médias, desvio padrão, resultados de repetitividade (CV) e precisão intermediária

(CV) em três níveis de fortificação (0,005, 0,1, 2 mg.L-1

) para dois analistas .................... 72

14

Tabela 23 – Resultados de recuperação (%) para amostras brancas fortificadas a 0,005 e 2

mg.L-1

.................................................................................................................................. 74

Tabela 24 - Limite de Detecção ................................................................................................. 75

Tabela 25 – Limite de Quantificação, teste de repetitividade do LQ e recuperação .................. 76

Tabela 26 – LMR e Resultados das amostras comerciais (A:J) analisadas pelo método validado

neste estudo ......................................................................................................................... 77

Tabela 28 - Etapas de extração e limpeza da amostra utilizando QuEChERS pelo método

AOAC-2007.01 ................................................................................................................. 120

Tabela 29 - Relação de Agrotóxicos autorizados pelo sistema AGROFIT do MAPA para a

cultura de uva .................................................................................................................... 135

15

LISTA DE EQUAÇÕES

Equação 1 - Limite de Detecção (LD) ....................................................................................... 53

16

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AOAC: Do inglês, Association of Official Analytical Chemists

AGROFIT: Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários

BPAs: Boas Práticas Agrícolas

CCAS: Curva de calibração do analito em solução

CCEMBF: Curva de calibração do extrato da matriz branca fortificado

CCMBF: Curva de calibração da matriz branca fortificada

CEN: Do inglês, Comité Européen de Normalisation

CGAR: Cromatografia gasosa de alta resolução

CLAE: Cromatografia de alta eficiência

CV: Coeficiente de variação

DAD: Detector de arranjo de diodos

DP: Desvio padrão

ESI: Do inglês, Electrospray Ionization

FDA: Do inglês, Food and Drug Administration

CGCRE/INMETRO : Coordenação Geral de Acreditação do Instituto Nacional de

Metrologia, Qualidade e Tecnologia

GC: Cromatografia Gasosa

GCB: Do inglês, Carbon Black

HPLC: Do inglês, High Performance/Pressure Liquid Chromatography

IBAMA: Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis

LC: Cromatografia líquida de alta eficiência

LC-MS: Do inglês, Liquid Chromatography with mass spectrometry

LC-MS/MS: Do inglês, Liquid Chromatography –tandem mass spectrometry

LC-ESI-MS/MS: Do inglês, Liquid Chromatography –tandem mass spectrometry with

Ionization by Electrospray

17

LD: Limite de detecção

LMR: Limite Máximo de Resíduo

LQ: Limite de quantificação

MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MS: Do inglês, Mass spectrometry

MRC: Material de Referência Certificado

MMQO: Método dos Mínimos Quadrados Ordinários

MMQP: Método dos Mínimos Quadrados Ponderados

MRM: Do inglês, Multiple Reaction Monitoring

m/z: Razão massa carga

NIST: Do inglês, National Institute of Standards and Technology

PARA: Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos

PNCRC: Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes em Alimentos

PSA: Do inglês, Primary secondary amine

r2: Coeficiente de correlação linear

SRM: Monitoramento de reação selecionada

T: Tamanho

TIC: Do Inglês, Total Content of Ions

TMRM: Do Inglês, Total Multiple Reaction Monitoring

tR: Tempo de retenção

UE: União Europeia

USDA: Do inglês, Agricultural Research Service of United States Department of

Agriculture

http://www.nist.gov/

18

SUMÁRIO

RESUMO ...................................................................................................................................... 6

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................... 8

LISTA DE TABELAS ................................................................................................................ 13

LISTA DE EQUAÇÕES ............................................................................................................. 15

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ........................................................... 16

INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 20

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 22

2.1. Objetivo Geral ............................................................................................................. 22

2.2. Objetivos Específicos .................................................................................................. 22

3. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 23

3.1. Suco de Uva ................................................................................................................ 23

3.2. Doenças, Pragas e Ervas Daninhas da cultura da Videira ........................................... 24

3.3. Os pesticidas e seu Controle no Brasil ........................................................................ 26

3.4. Preparo de Amostra ..................................................................................................... 30

3.5. Cromatografia ............................................................................................................. 33

3.6. Ionização por Electrospray: ........................................................................................ 33

3.7. Espectrometria de Massas ........................................................................................... 35

3.7.1. Espectrometria de massa sequencial ................................................................... 36

3.8. Métodos Multirresíduos para Análise de Pesticidas em Alimentos Usando

Espectrometria de Massa ......................................................................................................... 37

3.9. Estudo de Validação .................................................................................................... 38

3.9.1. Seletividade e Efeito matriz ................................................................................ 39

3.9.2. Linearidade .......................................................................................................... 39

3.9.3. Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) ................................. 40

3.9.4. Recuperação ........................................................................................................ 40

3.9.5. Precisão (Repetitividade e Reprodutibilidade intralaboratorial) ......................... 41

4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 43

4.1. Reagentes Químicos .................................................................................................... 43

4.2. Seleção dos Pesticidas ................................................................................................. 43

4.3. Seleção das Amostras .................................................................................................. 46

4.4. Aparatos ...................................................................................................................... 47

4.5. Procedimento de Extração e Limpeza ......................................................................... 47

4.6. Preparação dos Padrões de Calibração ........................................................................ 48

4.7. Condições do LC-MS/MS ........................................................................................... 49

19

4.8. Validação do método ................................................................................................... 50

4.8.1. Linearidade .......................................................................................................... 50

4.8.2. Seletividade/Efeito Matriz ................................................................................... 51

4.8.3. Precisão ............................................................................................................... 51

4.8.4. Recuperação ........................................................................................................ 52

4.8.5. LD e LQ .............................................................................................................. 53

4.8.6. Análise de amostras reais .................................................................................... 53

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 54

5.1. Desenvolvimento da metodologia ............................................................................... 54

5.1.1. Condições do HPLC ............................................................................................ 54

5.1.2. Otimização e Condições do MS/MS ................................................................... 55

5.1.3. Testes QuEChERS .............................................................................................. 60

5.2. Parâmetros de validação .............................................................................................. 64

5.2.1. Linearidade .......................................................................................................... 64

5.2.2. Seletividade e Efeito Matriz ................................................................................ 68

5.2.3. Precisão ............................................................................................................... 71

5.2.4. Tendência e Recuperação .................................................................................... 74

5.2.5. Limite de Detecção e Limite de Quantificação ................................................... 75

5.3. Análises em amostras reais ......................................................................................... 77

6. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 85

APÊNDICE A ............................................................................................................................. 96

APÊNDICE B ........................................................................................................................... 111

APÊNDICE C ........................................................................................................................... 120

APÊNDICE D ........................................................................................................................... 121

20

INTRODUÇÃO

Resíduos de pesticidas em alimentos (incluem bebidas) é um tema amplamente

discutido devido a sua importância para a segurança dos alimentos e para a proteção do

meio ambiente. Visando a regulação para o uso de pesticidas os órgãos competentes de

cada país estabelecem a relação de pesticidas autorizados, bem como Limite Máximo de

Resíduos (LMR) permitidos para cada cultura. No Brasil, o Ministério da Agricultura

Pecuária e Abastecimento (MAPA) é o órgão competente para conceder esta

autorização, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) cabe os estudos de

toxicidade e consequentemente o estabelecimento dos limites máximos permitidos.

A análise de resíduos de pesticidas ainda é um desafio [1] devido a grande

diversidade de substâncias (aproximadamente 900) [2] com diferentes características e

por normalmente estarem presentes em concentrações traços nas amostras. Todas estas

limitações levaram a um grande avanço na técnica de preparo da amostra, tecnologia

envolvida e metodologias analíticas para quantificação de pesticidas.

O preparo de amostras, para análise de multirresíduos de pesticidas passou por

significativa evolução com a inserção do método QuEChERS, a sigla é derivada das

palavras em inglês “Quick”, “Easy, “Cheap”, “Efective”, “Rugged”, proposto por

Anastassiades e Lehotay em 2003[3]. A proposta do QuEChERS é a utilização de um

método rápido, fácil, baixo custo, efetivo e robusto capaz de extrair agrotóxicos

altamente polares, bem como aqueles com elevada acidez ou basicidade, de matrizes

complexas [4]. O método QuEChERS foi reconhecido como método referência no

preparo das amostras destinadas à análise de multirresíduos de pesticidas pela

Association of Official Analytical Chemists – AOAC [5] e pelo Comité Européen de

Normalisation – CEN [6].

A cromatografia é a técnica analítica mais utilizada e de melhor desempenho na

separação e seletividade dos analitos em estudo [7]. Na Cromatografia Líquida (Liquid

Chromatography, LC) em especial, o sistema de separação ocorre pela interação entre o

analito e a fase estacionária da coluna cromatográfica. A LC permite o acoplamento a

diferentes sistemas de detecção [7].

O acoplamento da cromatografia líquida com a espectrometria de massa (Mass

Spectrometry, MS), associada a técnicas de ionização à pressão atmosférica causou

importante avanço na quantificação de elementos altamente polares e de alto peso

molecular [8]. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial

21

(Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry - LC-MS/MS) possui alta

seletividade devido a sua capacidade de identificar e quantificar os elementos pela sua

razão massa carga (m/z), e por sua capacidade de selecionar íons quantificadores e

qualificadores específicos da molécula em estudo.

Métodos multirresíduos são metodologias capazes de quantificar dezenas ou até

centenas de substâncias em uma única análise. Este tipo de metodologia facilitou muito

o controle de pesticidas, já que centenas destes estão disponíveis para uso nas culturas e

a quantificação individual torna-se inviável financeiramente.

A maioria dos métodos multirresíduos disponíveis na literatura são aplicáveis à

análise de pesticidas em frutas e legumes [9-18]. Portanto, métodos multirresíduos para

análise de pesticidas em alimentos e bebidas industrializados, por exemplo, o suco de

uva são necessários, uma vez que não existe garantia de que os processos industriais

removam os resíduos de pesticidas do produto. Outra justificativa sobre a necessidade

de métodos multirresíduos para produtos industrializados é a exigência do controle de

pesticidas como um requisito para exportação.

O Brasil é considerado o quinto maior produtor vitivinícola do hemisfério sul

[19]. Dos derivados da uva destaca-se o suco de uva integral e o suco de uva

concentrado. Em 2014, a comercialização do suco de uva integral foi ampliada em

46,3% (este percentual representa 10,1 milhões de litros), em comparação com safra de

2012 [14]. O suco de uva concentrado também apresentou expansão, no mesmo período

o país comercializou 17,2% (2,5 milhões de litros) a mais que 2012 [19]. O Brasil tem

tradição em exportação de suco de uva concentrado (principalmente para o Japão) e

recentemente vem ampliando os esforços para a exportação de suco de uva integral [14].

Diante deste cenário de perspectivas futuras para a exportação, alinhado à

necessidade de controles efetivos para a segurança dos alimentos e aos requisitos legais

de Limites Máximos de Resíduos (LMR) aceitáveis, este estudo possui como objetivo a

implantação de um método multirresíduo para a quantificação de pesticidas em suco de

uva, bem como sua validação.

22

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Desenvolver e validar um método por LC-MS/MS para identificação e quantificação

de multi pesticidas em suco de uva integral.

2.2.Objetivos Específicos

Testar dois métodos oficiais (AOAC- Official Method 2007.01 e CEN/TC 275

15662:2008) de extração e limpeza da amostra.

Avaliar as melhores condições analíticas para a separação dos analitos e a

otimização de energias para a identificação e quantificação dos pesticidas em estudo.

Executar processo de validação do método em estudo conforme requisitos da

Coordenação Geral de Acreditação do Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e

Tecnologia (CGCRE/INMETRO), Guidance document on analytical quality control

and validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed e o Manual

de Garantia da Qualidade Analítica do MAPA.

Realizar análises de multipesticidas em 10 amostras comerciais de suco de uva

integral, produzidos na região do Alto Vale do Rio do Peixe, SC utilizando o método

validado neste estudo.

23

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1.Suco de Uva

Segundo o (MAPA) o suco de uva é a bebida não fermentada, obtida do mosto

simples, sulfitado ou concentrado, de uva sã, fresca e madura [20]. No Brasil, as

Cultivares comumente utilizadas para a fabricação de suco de uva são as pertencentes

principalmente às espécies Vitis labrusca, V. bourquina e V. aestivalis [21] do grupo

denominado de “uvas americanas e híbridas” (Isabel, Bordô e Concord) [22].

As principais características das uvas são tradicionalmente utilizadas para a

fabricação do suco é a capacidade tintureira da uva Bordô, aroma e sabor da uva

Concord e o bom rendimento e produtividade da uva Isabel [23]. Estas variedades se

adaptam bem em clima temperado.

Com o intuito de incrementar o período de safra, a Embrapa Uva e Vinho de

Bento Gonçalves/RS lançou diversas variedades de uva (BRS Rúbea, Concord Clone

30, Isabel Precoce, BRS Cora, BRS Violeta, BRS Carmen e BRS Magna) que

complementam as variedades comumente utilizadas. Desta forma, para a obtenção das

novas variedades considerou-se a elaboração de materiais com ciclos produtivos

diferenciados, alta produtividade, além de características que agregam qualidade ao

suco de uva, como o alto conteúdo de matéria corante e de açúcares [22]. A utilização

destas novas variedades ainda é novidade, portanto a maior parte do suco de uva

Brasileiro ainda é elaborada a partir do corte de uvas das variedades Isabel, Bordô e

Concord.

Neste estudo, faz-se necessária uma breve abordagem sobre as características

físico-químicas e de composição da uva, uma vez que, as particularidades da fruta

destinada à fabricação do suco são importantes na definição do método de preparo das

amostras.

A legislação brasileira estabelece no padrão de identidade e qualidade do suco

de uva integral resultados mínimos de sólidos solúveis (14 ºBrix a 20 ºC), acidez total

(0,41g.100g-1

de ácido tartárico), resultados máximos de açúcares totais (20g.100g-1

),

acidez volátil (0,050g.100g-1

de acido acético) e sólidos insolúveis (5% v/v) [24].

Além dos parâmetros descritos na legislação é característica do suco de uva

integral apresentar pH na faixa de 3,2 a 3,4, ácido tartárico 0,46 a 0,87g.100g-1

,

densidade de cor 5,95 a 9,64 unidades de absorbância além de outros elementos como

24

vitamina C e compostos fenólicos [25-27]. Vários fatores interferem nestas

características, como a maturação na colheita, o manejo do parreiral, o local de

produção e principalmente as variedades de uva utilizadas para a fabricação do suco.

É conhecido que o suco de uva é uma importante fonte de antioxidantes naturais

devido à presença significativa de substâncias fenólicas, que podem ser divididas em

flavonóides (flavanas, os flavonóis e as antocianinas) e não flavonóides (ácidos

benzóicos e os ésteres tartáricos). Existem ainda outros compostos fenólicos como os

estilbenos e os fenóis voláteis [28].

Tiemi e colaboradores [29] pesquisaram as variações de compostos fenólicos em

uvas de diversas cultivares de Vitis Labrusca L. e Vitis Vinífera L., sendo a primeira

espécie muito utilizada para a produção do suco de uva integral e a segunda destinada à

produção de vinho fino. Neste estudo, os pesquisadores concluíram que as uvas da

cultivar Bordô (Vitis labrusca) sobre o porta-enxerto 420A apresentaram maior

conteúdo de fenólicos totais, antocianinas totais e capacidade antioxidante em

comparação com as demais variedades [29].

Em 2014 segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e estatística

(IBGE), o Brasil possuía 78.450 ha de videiras e produziu 1.388.859 toneladas de uvas

[30]. Os maiores produtores em ordem decrescente são: Rio Grande do Sul,

Pernambuco, São Paulo, Santa Catarina, Paraná, Bahia e Minas Gerais [31].

Em 2012, a produção de uvas destinadas ao processamento (vinho, suco e

derivados) foi de 830,92 milhões de quilos, o que representa 57,07% da produção

nacional. O restante da produção (42,93%) foi destinado ao consumo in natura [31].

A região sul do Brasil é responsável praticamente pela totalidade da produção de

suco de uva (integral e concentrado) nacional. Em 2013, o Rio Grande do Sul produziu

50,8 milhões de litros [32] e Santa Catarina produziu 7,1 milhões de litros de suco de

uva [33].

3.2.Doenças, Pragas e Ervas Daninhas da cultura da Videira

Neste estudo, é necessário fazer uma breve abordagem sobre as principais

doenças, pragas e ervas daninhas comuns à cultura da videira, pois em função das suas

ocorrências se faz necessária a aplicação de agroquímicos na cultura.

25

A doença da planta é uma desordem fisiológica ou anormalidade estrutural

deletéria à planta ou para alguma de suas partes ou produtos [34] comprometendo sua

produção.

A videira pode apresentar doenças de origem fúngica (antracnose, escoriose,

ferrugem, mancha das folhas, míldio, oídio, podridão amarga, podridão cinzenta,

podridão da uva madura) e viral (enrolamento da folha, complexo rugoso)

[35],[36],[37],[38],[39].

As pragas são espécies de insetos que podem danificar a cultura da videira,

causando, por exemplo, sucção de seiva, fitotoxicidade, depósito de excreções

açucaradas nas folhas, transmissão de agentes patogênicos, consumo das folhas e frutos,

depreciação da aparência das bagas entre outros problemas. As principais pragas que

afetam a videira são: Eurhizococcus brasiliensis (cochonilha pérola da terra),

Tetranychus urticae (acaro rajado), Anastrepha fraterculus (mosca-das-frutas), Atta spp.

(saúvas) e Acromyrmex spp. (quenquéns). A ervas daninhas competem com a videira

por água e nutrientes, por isso são feitas roçadas ou utilizados os herbicidas para o seu

controle.

A Tabela 1 relaciona os pesticidas inclusos no método em estudo desse trabalho

e sua classe de aplicação para o controle das doenças e pragas que atacam a cultura da

Videira. Em 11/2014, no Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários (AGROFIT), do

MAPA, eram relacionados 71 diferentes pesticidas autorizados para uso na cultura da

Videira (conforme ANEXO 1) [40].

Tabela 1 - Relação de Pesticidas Inclusos no Método deste estudo e suas classes

químicas

Pesticida Classe

*Acefato Acaricida/inseticida

*Clorpirifos Acaricida/inseticida/formicida

*Deltametrina Inseticida/formicida

*Dimetoato Acaricida/inseticida

*Fenpiroximato Acaricida

*Trifloxistrobina Fungicida

*Carbendazim Fungicida

*Carbofurano Acaricida/Cupinicida/Inseticida/Nematicida

Azoxistrobina Fungicida

Bifentrina Acaricida/Formicida/Inseticida

Continua...

http://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons

26

Boscalida Fungicida

Carbosulfano Acaricida/Inseticida/Nematicida

Cimoxanil Crescimento

Ciproconazol Fungicida

Clotianidina Inseticida

Difenoconazol Fungicida

Dimetomorfe Fungicida

Ditianona Fungicida

Diurom Herbicida

Famoxadona Fungicida

Fenamidona Fungicida

Fenarimol Fungicida

Imidacloprido Inseticida

Indoxacarbe Inseticida

Iprovalicarbe Fungicida

Metalaxil Fungicida

Permetrina Formicida/inseticida

Tebuconazol Fungicida

Tetraconazol Fungicida

Tiametoxam Inseticida

Triadimefom Fungicida

Triadimenol Fungicida

Triclorfom Acaricida/Inseticida

*Não Autorizado para a cultura, mas encontrados nas amostras de monitoramento dos programas federais (conf.

Detalhado no item a seguir).

Fonte: [40]

3.3.Os pesticidas e seu Controle no Brasil

Pesticidas são produtos químicos usados para controlar ou matar pestes, tais como

fungos, bactérias, insetos ou plantas indesejáveis que infestam áreas agrícolas ou

animais que causam ou transmitem doenças [41]. No Brasil, a legislação utiliza o termo

agrotóxico o qual define como sendo “os produtos e os componentes de processos

físicos, químicos ou biológicos destinados aos setores de produção, armazenamento e

beneficiamento de produtos agrícolas, pastagens, proteção de florestas e também em

ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da

flora e da fauna, a fim de preservá-la da ação danosa de seres vivos considerados

27

nocivos, bem como aqueles empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores

e inibidores do crescimento” [42].

No Brasil, o Decreto nº 4.074, de 04 de janeiro de 2002, regulamenta a Lei nº

7.802, de 11 de julho de 1989 [43], que dispõe sobre a pesquisa, a experimentação, a

produção, a embalagem e rotulagem, o transporte, o armazenamento, a comercialização,

a propaganda comercial, a utilização, a importação, a exportação, o destino final dos

resíduos e embalagens, o registro, a classificação, o controle, a inspeção e a fiscalização

de agrotóxicos, seus componentes e afins [43]. No referido Decreto ficam evidenciadas

as competências para os três órgãos envolvidos no controle de resíduos: MAPA,

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e o Instituto Brasileiro do Meio

Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis [43].

Segundo o Decreto supracitado é de responsabilidade do MAPA avaliar a

eficiência agronômica e a concessão do registro dos agrotóxicos. À ANVISA cabe a

avaliação e a classificação toxicológica dos agrotóxicos, cálculo do parâmetro de

segurança que consiste na Ingestão Diária Aceitável (IDA), estabelecimento do LMR e

do Intervalo de Segurança. Ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos

Naturais Renováveis (IBAMA) cabe a avaliação dos agrotóxicos destinados ao uso em

ambientes hídricos, na proteção de florestas nativas e de outros ecossistemas [43].

No Brasil, bem como em outros países o estabelecimento de níveis máximos de

resíduos (ou tolerâncias) tem o objetivo de evitar qualquer impacto adverso sobre a

saúde pública e incentivar as boas práticas agrícolas [44].

Por meio de um plano regulamentado, sistematizado e periódico de controle e

monitoramento, os órgãos competentes fiscalizam os níveis residuais de pesticidas em

amostras de produtos de origem animal e vegetal. No Brasil, o Plano Nacional de

Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC/Vegetal) do MAPA se constitui do

conjunto dos seguintes programas de controle de resíduos e contaminantes por cultura

de origem vegetal: Programa de Fiscalização e Inspeção, Subprograma de

Monitoramento para o Mercado Interno, Subprograma de Investigação, Processos de

Investigação, Subprogramas de Produtos Importados, Subprograma Exploratório e Ano

Safra [45]. Outro programa, igualmente importante, é o Programa de Análise de

Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA), coordenado pela ANVISA, que tem

objetivo de avaliar anualmente os níveis de resíduos de agrotóxicos nos alimentos de

origem vegetal que chegam à mesa do consumidor [46]. Ambos os programas geram

28

anualmente, relatórios com dados que são utilizados como indicadores de qualidade

subsidiando ações de fiscalização e pesquisa.

Os requisitos comerciais para a exportação são um forte aliado à segurança dos

alimentos, obrigando a implementação das Boas Práticas Agrícolas (BPAs) e uso

racional dos pesticidas.

Para a cultura de videira, foco deste, estudo o MAPA autoriza 71 tipos de

pesticidas (consulta em 11/2014), dentre estes, as principais classes são os fungicidas,

inseticidas e herbicidas para controle das doenças, pragas e ervas daninhas,

respectivamente [47].

Na relação dos princípios ativos investigados nos programas supra citados, estão

inclusos pesticidas autorizados e não autorizados para cada cultura, controlando desta

forma o LMR e do uso de produtos proibidos ou banidos da lista dos aprovados.

Conforme se observa na Tabela 2 o uso de pesticidas não autorizados ainda é uma

prática utilizada pelos produtores. Dentre os anos de 2008 e 2013, nos principais estados

produtores, das 626 amostras de uvas coletadas pelos programas PNCRC e PARA,

foram identificadas 111 amostras positivas (17,7% do total de amostras analisadas) para

pesticidas não autorizados. No mesmo período o percentual de amostras com LMR

superior que o permitido foi de 4,7%.

Tabela 2- Resumo dos dados obtidos do Programa de Análise de Resíduos de

Agrotóxicos em Alimentos e do Plano Nacional de Controle de Resíduos e

Contaminantes nos últimos cinco anos para uva

Dados Programa PARA (ANVISA)

ANO Total de

amostras

analisadas

NA >LMR >LMR e NA Total de

insatisfatório

Nº % Nº % Nº % Nº %

2008 101 - - - - - - 33 32,6

2009 165 58 35,2 14 8,5 21 12,7 93 56,4

2010 - - - - - - - - -

2011 208 41 20 11 5,3 4 1,9 56 27,0

2012 - - - - - - - - -

TOTAL 474 99 20 25 5,2 25 5,2 182 38,3

Dados Programa PNCRC (MAPA)

ANO Nº de

amostras

analisadas

NA >LMR >LMR e NA Total de

insatisfatório

Nº % Nº % Nº % Nº %

2009/2010 27 0 0 0 0 - - 0 0

2010/2011 53 2 3,7 - - 3 5,6 5 9,4

2011/2012 67 10 14,9 - - 2 0,02 12 17,9

2012/2013 5 0 0 0 0 - - 0 0

TOTAL 152 12 7,8 0 0 - - 17 11,1

NA = Não autorizado para a cultura; > LMR = Acima do Limite Máximo de Resíduo; >LMR e NA = Acima do LMR e Não

autorizado para a cultura; Total de insatisfatório = Somatório de todos os resultados insatisfatórios. Fonte: Elaborado a partir de:

[48], [49], [50].

29

A Tabela 3 mostra o LMR aceitável para uva (apenas para os pesticidas inclusos

neste estudo) de acordo com a legislação dos principais países e regiões importadoras de

suco de uva incluindo o Brasil (consulta nov/2014).

Tabela 3 - Limites Máximos de Resíduos em uva no Brasil, Japão, Estados Unidos e

Europa LMRs em Uva (mg.L-1)

Pesticida Classe Brasil Japão USA Europa

Acefato Acaricida/inseticida NA 5,0 0,02 0,01

Clorpirifos Acaricida/inseticida/formicida NA 1,0 0,1 0,5

Deltametrina inseticida/formicida NA 0,5 0,05 0,2

Dimetoato Acaricida/inseticida NA 1,0 NA 0,02

Fenpiroximato Acaricida NA 2,0 1 0,3

Trifloxistrobina Fungicida NA 5,0 2 5

Carbendazim Fungicida NA 0,2 NA 0,3

Carbofurano Acaricida/Cupinicida/Inseticida/Nematicida NA 1 NA 0,01

Azoxistrobina Fungicida 0,5 10 2 2

Bifentrina Acaricida/Formicida/Inseticida 0,1 2 0,2 0,2

Boscalida Fungicida 3 10 5 5

Carbosulfano Acaricida/Inseticida/Nematicida 1 4 NA 0,01

Cimoxanil Crescimento 0,2 1 0,1 0,2

Ciproconazol Fungicida 0,1 4 NA 0,2

Clotianidina Inseticida 0,01 5 0,6 0,7

Difenoconazol Fungicida 0,2 4 4 0,5

Dimetomorfe Fungicida 2 5 3 3

Ditianona Fungicida 2 3 NA 3

Diurom Herbicida 0,1 0,05 0,05 0,01

Famoxadona Fungicida 0,5 2 2,5 2,0

Fenamidona Fungicida 0,2 2 1 0,5

Fenarimol Fungicida 0,05 1 01 0,3

Imidacloprido Inseticida 1 3 NA 1

Indoxacarbe Inseticida 0,02 2 NA 2

Iprovalicarbe Fungicida 0,1 2 NA 2

Metalaxil Fungicida 1 1 2 2

Permetrina Formicida/inseticida 0,05 5 NA 0,05

Tebuconazol Fungicida 2 10 5 0,5

Tetraconazol Fungicida 0,3 0,5 0,2 0,5

Tiametoxam Inseticida 0,5 5 0,2 0,9

Triadimefom Fungicida 2 0,5 NA 2

Triadimenol Fungicida 0,1 0,5 NA NA

Triclorfom Acaricida/Inseticida 0,5 0,5 NA 0,01

NA: Não autorizado

Fonte: Elaborado a partir de [51],[52].

30

A confirmação do cumprimento aos LMR aceitáveis, nos alimentos estabelecidos

pela legislação, é feita por análises cromatográficas por ser considerada a técnica mais

adequada, devido a sua capacidade de separação e quantificação das substâncias em

uma amostra complexa [7]. No entanto, a maioria das matrizes antes de serem inseridas

no sistema cromatográfico necessita passar por um processo de preparo da amostra

composto basicamente de extração dos pesticidas e limpeza da amostra.

3.4.Preparo de Amostra

Alimentos (inclui bebidas) são considerados misturas complexas para serem

analisadas devida sua composição. Os compostos presentes na amostra (com exceção do

analito) podem agir como interferentes na análise e no resultado, bem como, no bom

funcionamento do cromatógrafo. Desta forma, a amostra a ser analisada deve passar por

um processo prévio de preparação chamado de extração e limpeza (clean-up). Para

substâncias em concentrações traços, como o caso dos pesticidas, esta etapa torna-se

ainda mais importante e complexa devido a grande diversidade dos pesticidas [16, 53,

54].

O primeiro método (método de Mills) de extração para multirresíduos foi

desenvolvido por Mills et al. nos Estados Unidos em 1960. Este método é aplicável para

classe dos organoclorados apolares, em amostras não gordurosas analisadas por

cromatografia gasosa [55][56]. O método de Mills baseia-se na extração com

acetonitrila, adição de água ao extrato, seguida de uma etapa subsequente de partição,

promovida através da adição de solventes apolares (éter de petróleo ou hexano) [16].

Outros métodos foram implementados, por exemplo, em 1975 o método de Luke, mini-

Luke, extração líquido-líquido (LLE - Liquid-Liquid Extraction), extração em fase

sólida (Solid Phase Extraction, SPE) [57], microextração em fase sólida (SPME - Solid

Phase Microextraction) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME-

Dispersive Liquid-Liquid Microextraction) [58]. Os métodos tradicionais são

considerados caros e trabalhosos, desta forma existe um consenso sobre a necessidade

da busca de técnicas de preparo de amostra mais rápidas de baixo custo, que utilizem

pequenos volumes de solventes e que permitam valores de recuperação na faixa

aceitável [58]. Neste contexto, paralelo à inclusão e aumento de novos pesticidas com

características mais polares, novas técnicas analíticas, bem como, novos métodos de

extração foram necessários [16].

31

Em 2003, Anastassiades e colaboradores[3] apresentaram novo método para

preparo de amostras destinadas à análise multirresíduo de pesticidas o qual foi

denominado como QuEChERS – (do inglês: Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged,

Safe) [3]. A partir do seu desenvolvimento inúmeros pesquisadores utilizaram o método

em estudos de validação de metodologia multirresíduos para vários tipos de amostras [4,

9-11, 14-18, 59]. A principal vantagem deste método é ser capaz de extrair pesticidas

altamente polares, bem como, aqueles com elevada acidez ou basicidade de matrizes

complexas. A técnica utiliza pequenas quantidades de solventes, de forma mais rápida,

robusta e segura que as outras técnicas de preparo de amostras [4].

A primeira versão do método QuEChERS (original) consiste em extração com

acetonitrila (MeCN), partição com sulfato de magnésio (MgSO4), e cloreto de sódio

(NaCl), seguida da etapa de limpeza (Dispersive Solid Phase Extraction, D-SPE) com

150 mg de MgSO4 + 150g de PSA (primary secondary amine) [3] (Tabela 4).

Tabela 4 - Etapas do método QuEChERS original

Método Original QuEChERS

Extração 10g da amostra + 10 mL MeCN

Partição 4g MgSO4 + 1,0g NaCl

Limpeza 150mg MgSO4+ 25mg PSA

MeCN: Acetonitrila; MgSO4: Sulfato de Magnésio; NaCl : Cloreto de Sódio; PSA: Amina Primária Secundária.

Fonte: Elaborado a partir de: [3]

A acetonitrila proporciona extração de uma ampla faixa de pesticidas com diferentes

polaridades e, quando acidificada, permite recuperações satisfatórias de pesticidas que

geralmente apresentam problemas de estabilidade [15]. Os sais facilitam a extração de

analitos polares uma vez que diminuem a solubilidade destas substâncias na fase aquosa

e a quantidade de água na fase orgânica [15, 60]. A primary secondary amine- PSA

utilizada na etapa de limpeza retém os interferentes da matriz e finaliza o processo de

preparo da amostra antes da injeção no sistema cromatográfico [3].

Depois do desenvolvimento do método algumas modificações foram propostas

pelos próprios pesquisadores a fim de melhorar a eficácia do método, principalmente no

que tange a recuperação de elementos ácidos [15, 60].

Podem ser citadas modificações como: a adição de acetato de sódio como

tamponante em substituição ao cloreto de sódio. Na etapa de extração, a adição do ácido

acético em acetonitrila aumenta a estabilidade dos pesticidas antes da análise [61], além

disso, o ácido acético em conjunto com o acetato de sódio (NaAc) atua como tampão

32

(pH entre 4 e 5) evitando a degradação de substâncias sensíveis ao pH < 4 [16]. Estas

condições proporcionam boas recuperações (>70%) [16]. Após esta modificação o

método foi reconhecido pela Association of Official Analytical Chemists - AOAC como

método oficial de extração e limpeza de amostras destinadas à análise multirresíduos de

pesticidas em alimentos [62].

Anastassiades [3] propôs a inclusão de sais de citrato (0,5g Na2H-citrato

sesquihidratado + 1g Na3-citrato dihidratado) agindo como tamponantes. Esse método

foi reconhecido pelo Comité Européen de Normalisation (CEN) como referência em

extração e limpeza de amostras destinadas à análise multirresíduo de pesticidas [63].

Na Tabela 5 são observados alguns estudos realizados utilizando os métodos

modificados de QuEChERS, bem como as recuperações obtidas (a maioria entre 70–

120% de recuperação conforme critério aceitável para este parâmetro) [41].

Tabela 5 - Referências de estudos multirresíduos em diversas matrizes utilizando o

método de QuEChERS para preparo da amostra

Amostra Preparo da amostra Recuperação Ref.

Laranja, vinho

tinto, uva, uva

passas, farinha de

trigo

10 g amostra (laranja, uva, vinho tinto), 5 g amostra

(uva passa e farinha de trigo) + 10 mL MeCN 4 g

MgSO4+ 1,0 g NaCl +0,5 g hidrogenocitrato dissódico

sesquihidratado + 1,0 g citrato trissódico dihidratado

agitação manual 1 min centrifugação

60 – 127% [4]

Limão, Uva,

Cebola e tomate

10 g amostra + 10 mL MeCN agitação vortex 1 min

4 g MgSO4+ 1 g NaCl + 1 g citrato de sódio

dihidratado + 0,5 g hidrogenocitrato dissódico

sesquihidratado agitação manual 1 min

centrifugação clean-up: 6 mL sobrenadante + 150

mg PSA + 950 mg MgSO4, agitação centrifugação

filtração 0,45 µm injeção

70 – 110% [14]

Uva, alface laranja 15 g de amostra + 15 mL 1% HAc em MeCN 6 g

MgSO4+ 1,5 g NaAc agitação 1 min

centrifugação clean-up: 1 mL + 50 mg PSA + 150

mg MgSO agitação 30 s centrifugação ácido

fórmico injeção

68 – 98% [13]

Uva 10 g amostra + 10 mL MeCN 4 g MgSO4 + 1 g

NaCl agitação centrifugação injeção

clean-up: 1 mL + 25 mg PSA + 150 mg MgSO4

agitação centrifugação injeção

70 – 120% [10]

Maçã, Alface,

tomate, Uva,

Banana e Laranja

15 g amostra + 15 mL MeCN agitação 45 s 6 g

MgSO4 + 1,5 g NaCl agitação 45 s centrifugação

clean-up: 1 mL + 50 mg PSA + 150 mg MgSO4

agitação 20 s centrifugação injeção

71 – 102% [17]

33

Outras modificações importantes são aplicadas no método QuEChERS, por

exemplo, a inclusão do C18 na etapa de limpeza promovendo melhor eficácia

principalmente para amostras gordurosas [64], e ainda o uso de carbono grafitizado

(carbon Black - GCB) para amostras com alto teor de pigmento verde [65], por

exemplo, pimentão.

3.5. Cromatografia

A cromatografia é um método físico-químico de separação, que permite separar

os analitos de misturas complexas com grande precisão [66, 67]. Ela está fundamentada

na migração diferencial de substâncias de uma mistura, que ocorre devido a diferentes

interações da substância entre a fase móvel e a fase estacionária [66]. A fase

estacionária pode ser sólida ou líquida adsorvida em um sólido. Pode ser recheada numa

coluna ou espalhada por uma superfície, formando uma camada fina. A fase móvel pode

ser um líquido ou um gás [67]. A cromatografia de coluna é melhor compreendida

quando classificada quanto sua fase móvel em gasosa, líquida ou supercrítica. A

primeira utilizada na cromatografia gasosa (Gas Chromatography, GC) e a segunda

utilizada em cromatografia líquida (Liquid Chromatography, LC) [66]. Neste trabalho

utilizou-se a cromatografia líquida.

No passado, a técnica de LC era pouca utilizada para análises de pesticidas

devido à baixa seletividade e sensibilidade dos detectores existentes (antes do século

XX) quando eram comparados com os detectores disponíveis em GC [58].

Nos últimos 10 anos, o acoplamento da cromatografia líquida com detectores de

massas (LC-MS) associada às técnicas de ionização, tornou possível a inclusão de uma

técnica com alta seletividade, sensibilidade e especificidade [68].

3.6. Ionização por Electrospray

A ionização é um processo físico-químico que ocorre tanto no modo positivo

quanto negativo, dependendo das características do analito de interesse. Em geral a

ionização ocorre por protonação, caso comum em moléculas contendo grupamentos R-

NH4. No caso de moléculas que apresentam grupamentos ácidos em suas estruturas

ocorre a desprotonação [69, 70].

34

Também chamada de ionização suave a Electrospray Ionization (ESI) foi

desenvolvida nos anos 80 por John Bennett Fenn [69] permitiu uma ampliação

considerável de substâncias analisáveis por espectrometria de massa na medida em que

permitiu a inclusão daquelas não voláteis, termicamente lábeis e polares [71], isso

devido a sua capacidade de criação de íons à pressão atmosférica ao invés de vácuo [71,

72]. A ESI é uma técnica de ionização onde ocorrem três processos: oxidação/redução,

protonação/desprotonação e a formação de adutos com cátions como Na+, K

+e NH4

+.

Portanto, os íons formados dependem do balanço entre estes três processos. No modo

positivo, são formados íons do tipo [M+Na]+, [M+K]

+ e [M+NH4]

+. No modo negativo,

são formados íons do tipo [M-H]-.

A Figura 1 descreve o processo, onde a ionização é realizada a pressão

atmosférica. As gotículas, que saem do capilar, estão carregadas devido à aplicação de

uma diferença de potencial (2-5 KV) entre o capilar e o skimmer, as gotículas formadas

têm carga oposta à carga do skimmer e, portanto, são atraídas em direção a ele. Os íons

são solvatados no inter da gotícula, a média que a gotícula é atraída em direção ao

skimmer, o fluxo de nitrogênio, entre 150-350 °C seca a gotícula. Quando a gotícula

seca, a aproximação das cargas em seu interior se torna cada vez menor, em um dado

momento, a aproximação das cargas faz com que a gotícula exploda, liberando os íons

na forma não solvatada. Por sua vez, os íons, não solvatados, são levados para região

em alto vácuo do espectrômetro de massas pelo skimmer [7, 72].

Figura 1 - Esquema do processo de ionização por Electrospray

Fonte: [72]

35

Considerando que em ESI são gerados íons com múltiplas cargas, esta técnica

pode ser aplicada a substâncias com massas molares relativamente grandes [7, 69, 70],

pois, como o espectrômetro de massas mede a razão massa/carga (m/z) dos íons, o

intervalo de “massa” de aplicabilidade do instrumento pode ser expandido por um fator

equivalente ao número de cargas do íon [7].

A aplicação da ionização por ESI às substâncias de média e alta polaridade é

favorecida pelas características da técnica, pode-se visualizar na Figura 2 as condições

adequadas para uso da técnica ESI. Embora a figura não mostre, moléculas mais

apolares e de baixo peso molecular são comumente analisadas por GC (Gas

Chromatography).

Figura 2 - Técnicas de ionização em função da polaridade e da massa molecular.

Fonte: [1]

3.7.Espectrometria de Massas

O inglês Joseph J. Thomson iniciou os experimentos de espectrometria de

massas em 1897 [72], no início do século XX construiu o primeiro espectrômetro [71].

A técnica foi evoluindo e em 1953 o alemão W. Paul inventou o analisador quadrupolo

e o Ion Trap (aprisionadores de íons) [69]. Estudos posteriores foram dedicados à

evolução das técnicas de ionização [72].

Atualmente é consenso que a espectrometria de massas (Mass Spectrometry,

MS) é uma poderosa técnica analítica para a identificação e quantificação de substâncias

presentes em amostras complexas em baixas concentrações como ng Kg-1

[7, 71, 73].

A técnica baseia-se na identificação da composição química de substâncias

isoladas, ou de diferentes compostos em misturas complexas, através da determinação

36

de suas massas moleculares na forma iônica, (ou seja, com carga elétrica positiva ou

negativa), baseada na sua movimentação através de um campo elétrico ou magnético

[69]. A detecção dos íons selecionados é de acordo com a sua razão massa-carga (m/z)

[71], esta capacidade lhe confere altíssima sensibilidade, o que explica sua preferência

em análises quantitativas [70]. A técnica também tem se destacado em análises

qualitativas na identificação de elementos em misturas e na caracterização estrutural de

elementos desconhecidos, através da formação de íons-molécula e de seus respectivos

íons-fragmentos [69].

Um espectrômetro de massa é formado basicamente por três principais partes: o

sistema de ionização das moléculas, o analisador e o detector [69, 70] como mostrado

na Figura 3.

Alto Vácuo

Ionização das

moléculas

Separação e fragmentação dos

íons de acordo com sua massa caga

m/z pela aplicação de campos

elétricos e magnéticos

Detecção

do sinal

Figura 3 - Esquema das principais partes de um espectrômetro de massa

Fonte: Do Autor

3.7.1. Espectrometria de massa sequencial

Espectrometria de massas sequencial “tandem” (MS/MS) é um termo que

abrange uma série de técnicas que torna o método altamente seletivo e sensível à

obtenção de informações estruturais sobre os analitos e sobre suas massas molares [7].

A Figura 4 ilustra um sistema triplo quadupolo (QQQ), modelo que será

utilizado neste estudo. O sistema consiste de três conjuntos de quatro barras cilindricas

chamados de quadrupolo 1 (Q1), quadrupolo 2 (Q2 ou cela de colisão) e quadrupolo 3

(Q3).

Fonte Analisador de massa

Detector

37

Resumidamente, o sistema é composto inicialmente pela fonte de ionização onde

ocorre a ionização do analito e a dessolvatação (à pressão atmosférica) das moléculas

pela ação do gás secante à alta temperatura. O analito ionizado em fase gasosa é atraído

pelo skimmer, o qual focaliza os íons para o interior do analisador. O íon precursor é

selecionado no primeiro quadrupolo (Q1) bem como o desvio das massas não

selecionadas. Na cela de colisão (Q2), acontece a fragmentação do íon precursor e no

terceiro quadrupolo (Q3) acontece a seleção dos íons produto, e por fim, a detecção do

sinal. O fragmento de maior abundância (quantifier) é utilizado para a quantificação e

segundo fragmento de maior abundância (qualifier) é utilizado para a qualificação.

A Figura 4 representa um analisador de massas do tipo triplo quadrupolo (QQQ)

que foi utilizado neste trabalho.

Figura 4 - Ilustração do sistema de um Triplo Quadrupolo – QQQ

Fonte: [74]

3.8.Métodos Multirresíduos para Análise de Pesticidas em Alimentos Usando

Espectrometria de Massa

Atualmente mais de 900 pesticidas são utilizados em todo o mundo, legal e

ilegalmente, em produtos alimentícios e no tratamento do solo e das culturas [75]. A

identificação e quantificação de pesticidas em amostras de alimentos exigem a aplicação

de técnicas analíticas modernas e confiáveis capazes de quantificar muitos pesticidas

simultaneamente, mesmo que estes estejam presentes na concentração de traços em

amostras complexas. Nas últimas décadas, os métodos para a determinação do nível de

traço de pesticidas mudaram consideravelmente [44]. No entanto a capacidade de

38

monitorar centenas de agrotóxicos em uma única análise ainda é um problema

desafiador [1] devido a grande diversidade de elementos.

Muitos estudos foram desenvolvidos com intuito de otimizar os métodos para

análise de pesticidas em diversas matrizes. Desde o início da década de 1970 as análises

de resíduos de pesticidas eram realizadas por cromatografia gasosa (GC) com detectores

de captura eletrônica, nitrogênio-fósforo e / ou detecção de chama fotométrica [44]. A

cromatografia líquida era raramente utilizada para análises de pesticidas devido à baixa

seletividade e sensibilidade dos detectodes de ultra violeta (UV) e de fluorescência em

comparação com os instrumentos de GC (Gas Chromatography) [44]. Porém com a

ampla entrada de novos pesticidas com características de baixa volatilidade, alta

polaridade e instabilidade térmica foi necessário a inserção da técnica LC-MS/MS que

passou a ser amplamente utilizada para identificação de elementos em concentrações

traços, como o caso dos pesticidas [44, 76].

A maioria dos métodos multirresíduos inclui grandes números de pesticidas com

váriadas características físicas e químicas, esta grande diversidade exige profundo

estudo para conhecimento das melhores condições analíticas, de identificação e

quantificação dos analitos. Nos últimos anos, diversos estudos de métodos

multirresíduos por LC-MS/MS com bons resultados foram publicados [4, 9-12, 18, 44,

77-79] evidenciando a adequabilidade da técnica para análise multirresíduos de

pesticidas.

3.9.Estudo de Validação

Segundo o Documento de orientação sobre controle e validação de procedimentos

de qualidade analítica para análise de resíduos de pesticidas em alimentos e rações da

Comissão Europeia validação é o processo de caracterizar o desempenho esperado de

um método, no âmbito da especificidade, sensibilidade, exatidão, repetibilidade e

reprodutibilidade no laboratório [80]. Este guia é o documento oficial de refência na

União Europeia e traz o procedimento específico de validação de métodos para

pesticidas.

Pode se distinguir dois métodos de validação de metodologia: Interna (“in house

validation”) que consiste das etapas de validação do método no laboratório, onde o

mesmo foi desenvolvido, mas não inclui o parâmetro de reprodutibilidade necessário

para a validação completa (full validation) [81-83].

http://www.eurl-pesticides.eu/library/docs/allcrl/AqcGuidance_Sanco_2013_12571.pdf#_ENREF_80

39

O INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia) estebelece

no documento DOC-CGCRE-008 – Orientações sobre validação de métodos analíticos

de forma mais abrangente para todas as áreas. Para análises de elementos traços como,

por exemplo, os pesticidas. Os parâmetros a serem considerados na validação são:

precisão, seletividade, recuperação, robustez, sensibilidade/linearidade/faixa de

trabalho, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) [84].

O Manual de Garantia da Qualidade Analítica do MAPA estabelece os parâmetros e

critérios de aceitação de desempenho de método para resíduos e contaminantes em

alimentos. Estão relacionados neste manual os parâmetros que devem ser observados na

avaliação de desempenho ou validação do método, são eles: linearidade, sensibilidade,

faixa de trabalho, seletividade, efeito matriz, recuperação, precisão, limite de detecção,

limite de quantificação, limite de decisão, capacidade de detecção, incerteza de

medição, robustez [85].

3.9.1. Seletividade e Efeito matriz

A seletividade de um método instrumental de separação é a capacidade de

qualificar, de forma inequívoca analitos particulares em mistura ou na matriz sem a

interferência de outros componentes de comportamento semelhante [85, 86].

O efeito matriz é o estudo da interferência de substâncias presentes na matriz, que

podem influenciar no desempenho do resultado da análise. Desta forma, o método deve

ser capaz de selecionar o analito de interesse e avaliar o grau de interferência da matriz

(fenômenos de diminuição ou ampliação da resposta instrumental) [85].

O acoplamento do cromatógrafo líquido com o espectrômetro de massas melhora

significativamente a seletividade do método, uma vez que, os elementos que não forem

separados na coluna cromatográfica podem ser separados pelas suas massas no

espectrômetro de massas, minimizando as interferências da matriz [85, 87, 88].

3.9.2. Linearidade

Linearidade é a capacidade de o método produzir resultados diretamente

proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado

[85].

A linearidade do procedimento analítico é principalmente determinada pela

inclinação da curva de calibração. Se a curva de calibração é uma reta, a sensibilidade é

40

constante em toda a faixa de trabalho e é determinada, principalmente, pela inclinação b

da curva de calibração [85]. A verificação é feita a partir da equação da regressão linear,

determinada pelo método dos mínimos quadrados. Para tal, deve ser verificada a

ausência de valores discrepantes para cada nível de concentração e a homocedasticidade

dos dados, antes de fazer a regressão linear [81-83].

Três são os tipos possíveis de curva de calibração que podem ser elaboradas: CCAS

– Curva de Calibração do Analito em Solução: construída a partir dos padrões de

calibração do analito puro em solvente. Este tipo de curva de calibração somente poderá

ser utilizado se comprovada a inexistência do efeito de matriz. CCMBF – Curva de

Calibração da Matriz Branca Fortificada: construída a partir da matriz branca fortificada

com os padrões de calibração do analito puro. CCEMBF – Curva de Calibração do

Extrato da Matriz Branca Fortificado: construída a partir do extrato da matriz branca

fortificado com os padrões de calibração do analito puro [85].

3.9.3. Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ)

O limite de detecção é o menor valor de concentração do analito detectável pelo

método, ou que ele possa ser distinguido do branco/ruído[82]. Existem três formas de

conhecer o Limite de Detecção (LD): visual, relação sinal ruído e baseado em

parâmetros da curva analítica[86].

O Limite de Quantificação (LQ) representa a menor concentração da substância em

exame que pode ser quantificada, utilizando um determinado procedimento

experimental [81], na prática, corresponde normalmente à menor concentração da curva

de calibração (excluindo o branco).

3.9.4. Recuperação

A recuperação (R) é definida como a proporção da quantidade da substância de

interesse, presente ou adicionada na porção analítica do material teste, que é extraída e

passível de ser quantificada [81].

A determinação da veracidade deve ser feita por intermédio de ensaios de

recuperação utilizando-se material de referência certificado – MRC. Caso não haja

MRC disponível, a determinação da recuperação deve ser feita por intermédio de matriz

41

branca fortificada. Na falta de uma matriz branca pode-se usar uma amostra de ensaio

com baixa concentração do analito [85, 86].

A limitação do procedimento de recuperação é a de que a substância adicionada

não está, necessariamente, na mesma forma que a presente na amostra. Isso pode

implicar, por exemplo, na presença de substâncias adicionadas em uma forma que

proporcione melhor detecção, ocasionando avaliações excessivamente otimistas da

recuperação. Pelo fato de outros componentes da matriz poderem interferir na

separação, detecção ou na quantificação da substância, efeitos dos componentes da

matriz devem ser investigados[86].

3.9.5. Precisão (Repetitividade e Reprodutibilidade intralaboratorial)

É a estimativa da dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos

de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas.

As três maneiras de expressá-la são por meio da repetitividade, da precisão

intermediária (ou reprodutibilidade interna ou reprodutibilidade intralaboratorial) e da

reprodutibilidade. Sendo que a reprodutibilidade de um procedimento analítico somente

pode ser estimada mediante a participação de um ensaio interlaboratorial colaborativo

(EC), raramente disponível [85].

A repetitividade é caracterizada pelo grau de concordância entre resultados de

medições sucessivas, efetuadas nas mesmas condições como: o mesmo procedimento de

medição, mesmo observador, mesmo instrumento, mesmas condições, mesmo local, e

repetições no menor espaço de tempo possível [89] [85].

Também denominada reprodutibilidade interna, refere-se à precisão intermediária

avaliada sobre a mesma amostra ou padrões, utilizando o mesmo método, mesmo

laboratório, mas alterando algumas condições, tais como: dias de análise, analistas,

equipamentos e condições ambientais, entre outras, se necessário[85].

3.9.6. Sequência das etapas de validação de método analítico específico

para resíduos em alimentos

Vários são os documentos que trazem orientações sobre os parâmetros de validação,

no entanto cada processo deve ser analisado de forma específica a fim de decidir a

forma de aplicação de cada parâmetro e também a sequência lógica de um processo de

42

validação para que o estudo tenha coerência. O Manual da Garantia da Qualidade

Analítica do MAPA traz um fluxograma com a sequência das principais etapas a serem

cumpridas para a validação de métodos analíticos específicos para resíduos em

alimentos.

43

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1.Reagentes Químicos

Padrão mix pesticidas (Padrão orgânico customizado de 32 elementos em

acetonitrila grau LCMS, 1000 µg mL-1

, kit com 05 ampolas de 01 mL. Certificados

ISO 17025, ISO Guide 34, ISO 9001, rastreável ao NIST. Origem: USA) e Padrão

Carbendazim (Padrão orgânico em metanol grau HPLC, 100 µg mL-1

, 1 mL.

Certificado ISO 9001, ISO 17025, ISO Guide 34, rastreável ao NIST. Origem USA.)

ambos adquiridos da SPEX CertiPrep Group®, Ácido Acético (Pureza ≥99.8%) adquiro

da Sigma-Aldrich®

, Acetonitrila (Grau HPLC > 99,9%) adquirido da JT Baker®,

Metanol (> 99,9 pureza HPLC 4L) adquiridos da Merck Millipore®

(Darmstadt,

Alemanha), Kit QuEChERS (Método AOAC-2007.01 contendo os seguintes reagentes

= Sulfato de Magnésio (MgSO4), Primary secondary amine (PSA) e EN 15662:2008

contendo os seguintes reagentes = Sulfato de Magnésio (MgSO4), Primary secondary

amine (PSA), Cloreto de sódio (NaCl), Na2H-citrato sesquihidratado e Na3-citrato

dihidratado) ambos da Agilent Tecnologies®

, água ultrapura obtida pelo sistema Milli-Q

(Millipore®), Ácido Fórmico (grau de pureza 99,9%) da Merck Millipore

® (Darmstadt,

Alemanha).

4.2.Seleção dos Pesticidas

Não há relatos na literatura sobre LMR estabelecidos para pesticidas em produtos

industrializados, neste caso, utilizam-se como base os limites estabelecidos para as

frutas e vegetais que são utilizados como matéria prima para a fabricação dos produtos

industrializados.

A Tabela 6 relaciona os 33 pesticidas inclusos no estudo bem como o LMR, o peso

molecular e a fórmula estrutural. Os pesticidas inclusos neste estudo foram selecionados

dentre os 71 autorizados pelo sistema AGROFIT (em 11/2014) para a cultura uva e

porque são comumente cobrados pelos principais países importadores de suco de uva.

Adicionalmente, foram inclusos no estudo mais 8 pesticidas não autorizados

(Dimetoato, Acefato, Clorpirifos, Deltametrina, Trifloxistrobina, Fenpiroximato,

Carbendazim e Carbofurano), porém, com frequência de testes positivos no

monitoramento dos programas federais.

44

Tabela 6 – Relação do LMR, massa molecular e fórmula estrutural dos pesticidas

inclusos no método multirresíduo em suco de uva

Pesticida LMR

(mg.L-1

) MM F.E.

Acefato NA 183.17

Clorpirifos NA 350.59

Deltametrina NA 505.2

Dimetoato NA 229.26

Fenpiroximato NA 421.49

Trifloxistrobina NA 408.37

Carbendazim NA 191.19

Carbofurano NA 221.25

Azoxistrobina 0,5 403.39

Bifentrina 0,1 422.87

Boscalida 3 343.21

Continua...

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/31697?lang=en&region=US

45

Carbosulfano 1 380.54

Cimoxanil 0,2 198.18

Ciproconazol 0,1 291.78

Clotianidina 0,01 249.68

Difenoconazol 0,2 406.26

Dimetomorfe 2 387.86

Ditianona 2 296.32

Diurom 0,1 233.09

Famoxadona 0,5 374.39

Fenamidona 0,2 311.4

Fenarimol 0,05 331.2

Imidacloprido 1 255.66

Continua...


46

Indoxacarbe 0,02 527.83

Iprovalicarbe 0,1 320.43

Metalaxil 1 279.33

Permetrina 0,05 391.29

Tebuconazol 2 307.82

Tetraconazol 0,3 372.15

Tiametoxam 0,5 291.71

Triadimefom 2 293.75

Triadimenol 0,1 295.76

Triclorfom 0,5 257.44

LMR: Limite Máximo de Resíduo conf. Legislação Brasileira (mg.L-1); MM: Massa Molecular; F.E.:Fórmula Estrutural. NA: Não Autorizado.

4.3.Seleção das Amostras

As amostras utilizadas para o desenvolvimento do método multirresíduos e para

o processo de validação foram suco de uva integral orgânico comercial fabricado por


47

produtor da região. Foram analisadas ainda, amostras de suco de uva integral de marcas

comerciais locais produzidos a partir de uvas americanas e “híbridas” (Isabel, Bordô e

Concord).

4.4.Aparatos

LC-MS/MS: cromatógrafo (Agilent 1260 Infinity Quaternary LC) acoplado a

Espectrômetro de Massas Triplo-Quadrupolo (QQQ) modelo 6430, software

controle/aquisição/tratamento de dados (Mass Hunter®). Coluna Poroshell 120 EC –

C18 – 2,1 mm x 100 mm 2,7 µm, pré-coluna: UHPLC guard 3PK- poroshell 120 EC –

C18 2.1 mm x 5 mm x 2,7 µm, balança analítica (Shimadzu®), Centrífuga da Fanem

®

modelo Excelsa 2206, Banho ultrassônico da Quimis modelo 03350, Purificador de

água Milli-Q®

Reference, filtros para seringa Millex-HN, 0.45 µm, nylon, 13 mm, non-

sterile, Sistema de filtração Millipore®.

4.5.Procedimento de Extração e Limpeza

Neste estudo, foram testados dois métodos QuEChERS oficiais de extração e

limpeza da amostra da: AOAC (Official Method 2007.01) e do Comité Européen de

Normalisation (CEN/TC 275 15662:2008).

Amostras em branco (suco de uva orgânico) foram fortificadas (0,3 mg.L-1

) com o

mix de pesticidas e deixadas estabilizando por um dia em temperatura de refrigeração.

Foram preparadas 3 amostras independentes para cada método (AOAC e EN) conforme

detalhamento da Tabela 7 as quais foram injetadas em triplicatas resultando em 18

corridas analíticas.

Tabela 7 – Métodos de extração e limpeza que foram testados neste estudo

Association of Official Analytical Chemists (AOAC) [62] Européen de Normalisation (EN) [63]

AOAC-2007.01 EN 15662:2008

EX

TR

AÇ

ÃO

15ml da amostra + 15ml de acetonitrila acidificada

(1% Hac) + 6g MgSO4 + 1,5g NaAc

Agitação vigorosa por 1 min e centrifugação por 5

min a 3500 rpm

10 Ml da amostra + 10 Ml MeCN + 4g MgSO4 + 1g

NaCl + 0,5g Na2H-citrato sesquihidratado + 1g Na3-

citrato dihidratado

Agitação vigorosa por 1 min e centrifugação por 5

min a 3500 rpm

Continua...

48

CL

EA

N-U

P

Transferir 1ml do sobrenadante para o tubo

contendo150 mg MgSO4 + 50 mg PSA

Agitação vigorosa por 30 s centrifugação por 5 min a

3500 rpm

Transferir 1ml do sobrenadante em 150 mg MgSO4 +

25mg PSA

Agitação vigorosa por 30 s e centrifugação por 5 min

a 3500 rpm

Acidificar o sobrenadante do extrato obtido após a

etapa clean-up adicionando 5 µL de ácido fórmico a

5% (v/v) em 500µL

Com o término destes testes foi possível definir qual dos métodos supracitados

apresenta melhor eficácia na extração dos pesticidas em questão. O critério de aceitação

para a escolha do método será baseado na comparação estatística entre as médias e nos

percentuais de recuperação.

4.6.Preparação dos Padrões de Calibração

A partir do padrão mix A de 1000 mg.L-1

foi preparada a solução estoque B de 100

mg.L-1

a partir desta foram preparadas as soluções mãe C e D de 5 mg.L-1

e 1 mg.L-1

respectivamente. A Tabela 8 detalha o preparo das soluções (estoque e soluções mãe)

utilizadas para preparo das curvas de calibração.

Tabela 8 - Preparo das soluções estoque e solução mãe

PADRÃO (A) mix un

Volume Inicial 1 mL

Concentração Inicial 1000 mg.L-1

SOLUÇÃO ESTOQUE (B)

Volume gasto solução A 1 mL

Volume do balão 10 mL

Concentração da Solução estoque 100 mg.L-1

SOLUÇÃO MÃE (C)

Volume gasto solução B 1,25 mL

Volume do balão 25 mL

Concentração da Solução estoque 5 mg.L-1

49

Curva de Calibração do Analito em Solução (CCAS) foi construída a partir dos

padrões de calibração dos analitos em solvente. Foi testada a necessidade de construir a

Curva de Calibração no Extrato da Matriz Branca Fortificada (CCEMBF).

A curva será composta de 9 pontos de concentração (mg.L-1

): 0,0025, 0,005,

0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, e 5 mg.L-1

, englobando o maior e o menor LMR dos pesticidas

em estudo (0,01 e 3 mg.L-1

). Os pontos a considerar para cada pesticida dependerá do

LMR aceitável de cada um deles. Os volumes correspondentes foram adicionados no

balão e completados com acetonitrila (ACN). A Tabela 9 detalha o preparo da curva de

calibração (CCAS).

Tabela 9 – Detalhamento do preparo dos níveis das curvas de calibração

Níveis da curva (mg.L-1

) CCAS

Volume do balão (mL) Vol. pipetado (µL)/Solução

0,0025 25 12,5 de C

0,005 25 25 de C

0,01 10 20 de C

0,05 10 100 de C

0,1 25 25 de B

0,5 10 50 de B

1 10 100 de B

2 10 200 de B

5 10 500 de B

B: solução estoque (100 mg.L-1); C: Solução mãe (5 mg.L-1); D: Solução mãe (1 mg.L-1);

4.7.Condições do LC-MS/MS

Foi avaliado o desenvolvimento de um método para quantificação simultânea de 33

pesticidas. A definição das condições de ionização das moléculas para detecção por

espectrometria de massas, bem como as condições do LC foram avaliadas no decorrer

do trabalho.

Para tanto, foram avaliados parâmetros como: Composição da fase móvel, coluna de

separação, gradiente e vazão tomando por base os estudos [9, 10, 90, 91]. A otimização

das condições do espectrômetro de massas envolveu a avaliação e determinação da

energia de direcionamento (fragmentor) das moléculas no primeiro quadrupolo (Q1),

energia de colisão no segundo quadrupolo (Q2) e a energia da célula de aceleração

50

tomando por base os dados contidos no banco de dados (MassHunter pesticides

TMRM) e nos estudos de [92],[3].

4.8.Validação do método

O estudo de validação seguiu os critérios do Guidance document on analytical

quality control and validation procedures for pesticide residues analysis in food and

feed da Comissão Europeia [93], do INMETRO por meio do documento DOC-CGCRE-

008 – Orientações sobre validação de métodos analíticos [94] e do MAPA descritos no

Manual da Grantia de Qualidade Analítica, específico para resíduos e contaminantes em

alimentos [85].

Os parâmetros avaliados foram: Linearidade, seletividade/efeito matriz, precisão,

recuperação, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ).

4.8.1. Linearidade

Conforme descrito no item 3.9.2 a curva de calibração poderá ser uma de três

formas: CCAS, CCMBF e CCEMBF, este estudo iniciará com a curva tipo CCAS e ao

longo da validação se necessária serão feita as demais curvas. A curva CCAS será

construída conforme detalhado no item 4.6.

A verificação da curva seguiu o procedimento descrito no Manual de Garantia da

Qualidade Analítica do MAPA. A primeira etapa da verificação consiste no cálculo dos

coeficientes linear (a), angular (b), coeficiente de correlação linear (R2) e desvio padrão.

A segunda etapa da verificação da curva consistiu em construir os gráficos de dispersão

dos resíduos da regreção em função da concentração para avaliar a homogeneidade das

variâncias.

Se a distribuição dos resíduos for aleatória, apresentando envoltório retangular (retas

paralelas), deve-se considerar que há homogeneidade das variâncias e o Método dos

Mínimos Quadrados Ordinários (MMQO) pode ser aplicado [85].

Se os desvios-padrão de repetitividade da resposta instrumental em cada nível de

concentração da curva de calibração não forem estatisticamente iguais, sugerindo

heterocedasticidade, significa que os dados da calibração devem ser tratados pelo

Método dos Mínimos Quadrados Ponderados (MMQP) [85]. Se este for o caso neste

estudo, o teste de Cochran (nível de confiança de 95%) será utilizado para testar a

51

homogeneidade das variâncias. Após a definição do método aplicado à curva é

necessária a exclusão dos pontos aberrantes que pode ser feito pelo teste de Grubbs.

A última etapa da linearidade é testar a qualidade dos ajustes da curva por meio do

teste r para a linearidade entre x e y, se tr>tα significa que os ajustes estão adequados

[85].

O critério de aceitação da regressão linear (R2) segundo o INMETRO é de 0,90[89].

4.8.2. Seletividade/Efeito Matriz

Para avaliar o parâmetro de seletividade foram feitas comparações visuais dos

cromatogramas oriundos da injeção (em triplicata) do extrato da amostra branca, do

branco reagente (fase móvel) e o extrato de uma amostra branca fortificada a 2 mg.L-1

[85, 95]. Inicialmente foram comparados os sinais entre os brancos (reagente e extrato

da amostra branca fortificada) em seguida, as respostas obtidas do branco foram

comparadas com as respostas oriundas da injeção do extrato de uma amostra branca

fortificado a 2 mg.L-1

.

O efeito matriz foi avaliado por meio da comparação dos resultados entre o extrato

de amostra branca fortificado a 2 mg.L-1

(3 extratos preparados independentes e

injetados em triplicata) e dos analitos puros em solvente a 2 mg.L-1

(injetados em

triplicata). A verificação deve ser feita utilizando o teste F para análise da

homogeneidade de variâncias e o teste t de Student para as comparações entre as

médias.

Para considerar que a matriz não possui efeito significativo no método o tcalculado

tanto para os casos de variâncias estatisticamente diferentes quanto para variâncias

estatisticamente iguais deve ser menor que o tcritíco [85].

O estudo de efeito matriz é dispensável nos casos onde se utiliza a CCEMBF.

4.8.3. Precisão

A precisão foi calculada pela repetitividade dos analistas (neste estudo foi testada a

repetitividade de dois analistas) e precisão intermediária mudando o analista.

A repetitividade do analista (dois analistas) foi calculada a partir da fortificação de

amostra da matriz branca fortificada em três níveis de concentração (0,005mg.L-1

,

0,1mg.L-1

e 2mg.L-1

). Foram realizadas 7 preparos (extração e clean up) independentes

da amostra e injetadas em triplicata no cromatógrafo.

52

A verificação da repetitividade foi realizada pelo cálculo das concentrações médias

obtidas das amostras independentes, o cálculo do desvio padrão e o coeficiente de

variação da repetitividade dos resultados em cada nível de fortificação.

Em condições de repetitividade, o coeficiente de variação deve tipicamente situar-se

abaixo dos valores apresentados na Tabela 10, conforme a concentração.

Tabela 10 - Relação entre concentração do analito e coeficiente de variação aceitável

Concentração Coeficiente de Variação (%)

C < 1 mg/kg 35

1 mg.kg-1

≤ C < 10 mg.kg-1

30

10 mg.kg-1

≤ C < 100 mg.kg-1

20

100 mg.kg-1

≤ C < 1000 mg.kg-1

15

1000 mg.kg-1

≤ C < 10000 mg.kg-1

10

10 mg.kg-1

≤ C < 100 mg.kg-1

7,3

100 mg.kg-1

≤ C < 1000 mg.kg-1

5,3

1000 mg.kg-1

≤ C < 10000 mg.kg-1

3,7

10 g.kg-1

≤ C < 100 g.kg-1

2,7

100 g.kg-1

≤ C < 1000 g.kg-1

2

Fonte: [85]

O procedimento para avaliação da precisão intermediária foi o mesmo aplicado para

a repetitividade, mas mudando o analista e o dia.

A verificação da precisão intermediária foi feita calculando a concentração média

(neste caso dos dois analistas), os desvios padrão de reprodutibilidade e os coeficientes

de variação para cada nível de concentração combinando todos os resultados.

Em condições de reprodutibilidade interlaboratorial o coeficiente de variação (CV)

não pode exceder os valores da Tabela 10 para cada concentração.

4.8.4. Recuperação

A recuperação foi avaliada por meio da fortificação da amostra branca em dois

níveis de concentrações (0,005 mg.L-1

e 2 mg.L-1

) avaliando o percentual de

recuperação entre o valor observado e o valor esperado para cada nível de fortificação.

O critério de aceitação da recuperação para pesticidas segundo a SANCO é de 70 a

120% [93].

53

4.8.5. LD e LQ

A avaliação do LD foi realizada pelo método proposto pelo INMETRO o qual

estabelece teoricamente o LD do método avaliando a resposta de 7 amostras brancas

aplicando a fórmula abaixo:

Equação 1 - Limite de Detecção (LD)

X = média dos valores dos brancos da amostra

t = é a distribuição de Student

s = desvio-padrão amostral dos brancos da amostra

Neste estudo, conforme recomenda o INMETRO o LQ será estabelecido como o

menor ponto da curva de calibração[94]. O qual será avaliado experimentalmente pela

precisão (repetitividade) de 7 amostras preparadas independentes fortificadas de acordo

com a menor concentração dos pontos estabelecidos na curva de cada pesticida.

4.8.6. Análise de amostras reais

Foram analisadas 10 marcas comerciais de suco de uva de Santa Catarina

codificadas sequencialmente de A a J com intuito de verificar se os produtos estão

conforme com a legislação vigente. As amostras foram preparadas e injetadas em

duplicata.

Para o estudo de validação onde foram aplicados testes estatísticos como Teste t,

Teste F, Cochran, Teste R foi utilizado software Excel.

54

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1.Desenvolvimento da metodologia

5.1.1. Condições do HPLC

A partir de uma solução padrão de 5mg.L-1

(do mix contendo os 32 pesticidas mais

o Carbendazim em acetonitrila) foram avaliadas as condições de separação dos analitos.

A Tabela 11 apresenta as fases móvel testadas, estas fases móvel foram utilizadas em

outros estudos, conforme suas respectivas referências. Cabe ressaltar que todas as fases

móvel foram preparadas, filtradas em membrana de 0,45 micra e degaseificadas no

banho ultrassônico por 15 min.

Tabela 11 - Fases móvel testadas no método

Fase Móvel Referência

10% ACN e 90% H2O com 0,1% HCOOH. [96]

(A) Água acidificada com ácido fórmico 0,1% e (B) acetonitrila

acidificada com ácido fórmico 0,1%. [97, 98]

(A) água/metanol (95:5 v/v) com formato de amônia 5mM e 0,1% ácido

fórmico e (B) água/metanol (5:95 v/v) com formato de amônia 5mM e

0,1% ácido fórmico.

[99]

A terceira fase móvel testada (água e metanol) [99] foi a que teve um melhor

desempenho na separação dos analitos em estudo.

Por se tratar de um método multirresíduos será necessário trabalhar com o

monitoramento de íons segmentado, ou seja, as transições são monitoradas de forma

programada considerando o tempo de retenção dos analitos. Para este método é

necessário uma maior precisão do tempo de retenção, caso contrário, a sensibilidade e

especificidade da análise pode ser comprometida [100]. Neste caso, optou-se por utilizar

a coluna poroshell 120 EC – C18 – 2,1 mm x 100 mm 2,7 µm que reproduz resultados

mais precisos em relação ao tempo de retenção dos analitos [101]. Sua conformação que

consiste de um núcleo sólido de sílica com um invólucro poroso, dá-lhe todas as

vantagens de desempenho de partículas totalmente porosas menores, mas com mais

baixas contrapressões [101]. Foi utilizada também a pré-coluna: UHPLC guard 3PK-

poroshell 120 EC – C18 2.1 mm x 5 mm x 2,7 µm.

55

A Tabela 12 mostra as condições de operação do HPLC utilizado no estudo. Os

demais parâmetros como: o gradiente, a vazão a temperatura da coluna e volume de

injeção foram baseados nos estudos: [9-11, 97-99].

Tabela 12 - Condições de Operação do HPLC utilizada para a implantação e validação

do método em estudo

Parâmetro Condição

Coluna Pré-coluna: UHPLC guard 3PK- Poroshell 120 EC – C18 2.1 mm x 5 mm x 2,7 µm

Coluna: Poroshell 120 EC – C18 – 2,1 mm x100 mm 2,7 µm

Fase Móvel A: Água/metanol (95:5 v/v) com formato de amônia 5 mM e 0,1 % ácido Fórmico.

B: Água/metanol (5:95 v/v) com formato de amônia 5 mM e 0,1 % ácido Fórmico.

Gradiente 0 min 30% B

5 min 95% B

15 min 100% B

17 min 100% B

Vazão

Temp. da coluna

Vol. de injeção

0,3 mL min-1

Temp.: 40ºC

1 µL

(Tempo total da corrida 17 min, sendo 4,5 de pós corrida)

5.1.2. Otimização e Condições do MS/MS

5.1.2.1.Determinação dos íons moleculares e íons filhos

Utilizando por base as informações contidas no banco de dados MassHunter

pesticides TMRM iniciou-se o estudo para a determinação dos íons moleculares,

quantificador (quantifier) e um qualificador (qualifier) de cada um dos 33 pesticidas

inclusos neste estudo.

Com as informações contidas no banco de dados montou-se um método MRM

(Multiple Reaction Monitoring) com todos os pesticidas em estudo no software de

aquisição, os quais foram analisados no modo positivo [M + H] +

. As informações

contidas no banco de dados a respeito dos pesticidas como íons quantificadores,

qualificadores, energias de direcionamento e colisão foram testadas e comparadas pelos

modos de aquisição de varredura no primeiro (Precursor Ion) e no segundo (Product

Ion) quadrupolo.

A maioria dos íons moleculares apresentaram-se protonados ([M+H]+), com

exceção dos íons moleculares da Bifentrina, Deltametrina, Famoxadona e Triclorfon

que foram encontrados com aduto de amônia ([M+NH4]+) oriundo do formato de

amônio adicionado à fase móvel.

56

Os íons filhos adquiridos no segundo quadrupolo (Product Ion) foram classificados

como quantificadores (primeira transição) e qualificadores (segunda transição) baseados

na maior e segunda maior abundância dos picos respectivamente. A Tabela 13 relaciona

todos os pesticidas inclusos no método, bem como as transições, energias e tempo de

retenção dos analitos após a confirmação dos dados.

Tabela 13 - Transições de quantificação, qualificação energias otimizadas e tempo de

retenção dos pesticidas em estudo 1º Transição 2º Transição

Pesticida MM Molecular Q1 TQ F - CE RT Q1 TC F - CE

Acefato 183.17 [M + H]+ 184 143 50-0 1,11 184 95 50-25

Azoxistrobina 403.39 [M + H]+ 404 372 80-10 7,72 404 344 80-25

Bifentrina 422.87 [M + NH4]+ 440 181 70-10 12,64 440 166 70-55

Boscalida 343.21 [M + H]+ 343 307 100-20 7,97 343 271 100-35

Carbendazim 191.19 [M + H]+ 192 160 90-15 1,67 192 132 90-35

Carbofurano 221.25 [M + H]+ 222 123 80-20 6,25 222 165 80-5

Carbosulfano 380.54 [M + H]+ 381 118 90-20 12,0 381 160 90-10

Cimoxanil 198.18 [M + H]+ 199 128 50-5 4,06 199 110 50-15

Ciproconazol 291.78 [M + H]+ 292 70 100-30 8,32 292 125 100-20

Clorpirifos 350.59 [M + H]+ 349 198 90-19 10,30 349 293 90-10

Clotianidina 249.68 [M + H]+ 250 131 70-10 2,59 250 169 70-5

Deltametrina 505.2 [M + NH4]+ 523 281 90-12 11,10 523 181 90-35

Difenoconazol 406.26 [M + H]+ 406 251 130 – 25 9,32 406 337 130-15

Dimetoato 229.26 [M + H]+ 230 198 70 - 5 3,20 230 171 70-10

Dimetomorfe 387.86 [M + H]+ 388 301 130 - 20 8,08 388 165 130-35

Ditianona 296.32 - - - - - - - -

Diurom 233.09 [M + H]+ 233 72,1 90-15 7,32 233 159 90-30

Famoxadona 374.39 [M + NH4]+ 392 331 40-5 8,95 392 238 40-15

Fenamidona 311.4 [M + H]+ 312 92 80-30 7,87 312 236 80-10

Fenarimol 331.2 [M + H]+ 331 268 130-25 8,40 331 81 130-35

Fenpiroximato 421.49 [M + H]+ 422 366 110-15 10,80 422 135 110-35

Imidacloprido 255.66 [M + H]+ 256 208 80-15 2,42 256 175 80-15

Indoxacarbe 527.83 [M + H]+ 528 150 100-40 9,33 528 203 100-25

Iprovalicarbe 320.43 [M + H]+ 321 119 80-15 8,29 321 202 80-5

Metalaxil 279.33 [M + H]+ 280 220 80-10 7,26 280 160 80-20

Tebuconazol 307.82 [M + H]+ 308 70 80-15 8,88 308 124 110-40

Tetraconazol 372.15 [M + H]+ 372 159 110-45 8,40 372 70 110-20

Tiametoxam 291.71 [M + H]+ 292 211 100-10 1,70 292 181 100-20

Triadimefom 293.75 [M + H]+ 294 197 90-10 8,13 294 225 90-10

Triadimenol 295.76 [M + H]+ 296 70 80-5 8,29 296 99 80-20

Triclorfom 257.44 - - - - - - - -

Trifloxistrobina 408.37 [M + H]+ 409 186 100-15 9,37 409 145 100-50

MM: Massa Molecular; Q1: Íon Molecular; TQ: Transição de Quantificação; TC: Transição de Qualificação F:

Energia do Fragmentor; CE: Energia de fragmentação; RT: Tempo de Retenção

57

Na comparação com o banco de dados pode-se observar que as abundâncias dos

íons, bem como as energias envolvidas na fragmentação podem variar, isso ocorre

devido às condições envolvidas nos estudos.

A molécula de Ditianona foi excluída do método por não ser possível encontrar suas

massas na análise qualitativa nas condições testadas, pois foram realizados testes no

modo negativo, massas com aduto de amônio e mesmo assim as massas não foram

encontradas. A literatura diz que a Ditianona é uma mólecula difícil de ser quantificada

por sua instabilidade e rápida degradação [102]. São necessários mais estudos para a

quantificação desta molécula.

A molécula de Triclorfom também foi excluída do método por não apresentar boa

fragmentação nas condições testadas, necessitando mais estudo para sua quantificação.

5.1.2.2.Otimização das energias

Após a confirmação das massas dos íons, o método MRM anteriormente montado

foi atualizado. A segunda etapa foi a confirmação das energias (fragmentor, cela de

colisão e célula de aceleração) que teve como base as condições relacionadas no banco

de dados MassHunter pesticides TMRM. Embora o banco de dados sirva como um

parâmetro inicial é necessário a confirmação das energias, já que as condições de estudo

para a elaboração do banco são diferentes daquela encontrada neste estudo.

Desta forma, foram otimizadas as condições de direcionamento dos íons no

fragmentor, a fragmentação na cela de colisão e a energia da célula de aceleração, os

testes foram realizados conforme as faixas apresentadas na Tabela 14:

Tabela 14 - Faixa e Intervalos testados para otimização das energias

Energias Faixa testada (V) Intervalo (V)

Fragmentor 20 – 160 10 em 10

Cela de Colisão 0 – 60 5 em 5

Célula de aceleração 1 – 7 1 em 1

Após a realização dos testes, foi possível à determinação da energia aplicada que

resultou na maior abundância do pico para cada molécula nos três casos. A Figura 5 traz

o TIC (Total Content of Ions) do método antes e após a otimização das energias, é

visível o aumento da abundância (observar a escala), simetria e formato dos picos.

58

Figura 5 - TIC antes (a) e depois (b) da otimização das energias

A Tabela 15 compara a altura dos picos antes e depois da otimização das

energias, onde se pode observar que, com exceção da Clotianidina e do Cimoxanil que

aumentaram a abundância em apenas 0,42% e 1,99% respectivamente, os demais

aumentaram na faixa de 10,99 a 3804% após a otimização das energias do fragmentor,

cela de colisão e célula de aceleração.

Tabela 15 - Comparação da altura dos picos antes e depois da otimização das energias

do fragmentor, cela de colisão e célula de aceleração

Pesticida Altura dos picos (abundância)

% De Aumento

Antes Depois

Acefato 2951 6884 133,28

Azoxistrobina 54069 114315 111,42

Bifentrina 116 1317 1035,34

Boscalida 1469 9095 519,13

Carbendazim 20573 26134 27,03

Carbofurano 37447 111298 197,21

Carbosulfano 15767 52560 233,35

Cimoxanil 8430 8598 1,99

Ciproconazol 8028 16412 104,43

Clorpirifos 3444 9750 183,1

Clotianidina 2837 2849 0,42

Deltametrina 94 2070 2102,13

Difenoconazol 4952 24486 394,47

Dimetoato 10118 16784 65,88

Dimetomorfe 2945 18827 539,29

Ditianona - - -

(a)

(d)

59

Continua...

Diurom 4988 23025 361,61

Famoxadona 1714 7554 340,72

Fenamidona 2264 2504 10,6

Fenarimol 1560 3072 96,92

Fenpiroximato 26935 53935 100,24

Imidacloprido 3048 4033 32,32

Indoxacarbe 654 2716 315,29

Iprovalicarbe 12410 114989 826,58

Metalaxil 28500 77995 173,67

Tebuconazol 3709 23280 527,66

Tetraconazol 397 15500 3804,28

Tiametoxam 3440 8877 158,05

Triadimefom 275 9623 3399,27

Triadimenol 852 10039 1078,29

Triclorfom - - -

Trifloxistrobina 2859 59443 1979,15

Após a otimização das energias montou-se o método DMRM (Dynamic Multiple

Reaction Monitoring), o qual considera o tempo de retenção do analito para a realização

do monitoramento das massas. Esta configuração melhora bastante a seletividade,

sensibilidade e reprodutibilidade do método porque diminui significativamente as

transições simultâneas e consequentemente estende o tempo de permanência.

A Figura 6 mostra um recorte ampliado do início da corrida, onde se compara os

picos obtidos pelo MRM (linha preta) com os picos obtidos pelo DMRM (linha

vermelha). Ainda na mesma figura é visível a melhoria na simetria e formato dos picos.

Figura 6 – Recorte do início da corrida comparando o TIC MRM (linha preta)

com o TIC DMRM (linha vermelha)

60

No APÊNDICE A estão relacionados todos os canais dos pesticidas inclusos no método.

5.1.2.3.Condições do MS/MS

Com exceção das energias que foram testadas, as demais configurações do

espectrômetro de massas foram baseadas em outros estudos [3, 9-11, 91, 97, 99]. A

Tabela 16 resume as condições de operação do espectrômetro de massas utilizado neste

estudo.

Tabela 16 - Condições de operação do espectrômetro de massas

Parâmetros Condições

Fonte Electrospray

Temp. gás secante 300ºC

Vazão do gás 11 L min-1

Pressão do Nebulizador 15 psi

Voltagem do Capilar 4.000 V

Voltagem Fragmentor 30 – 160 V

Voltagem da Cela de Colisão 0 – 60 V

5.1.3. Testes QuEChERS

Finalizada a otimização do método iniciou-se o teste para a comparação da eficácia

dos métodos oficiais de extração e clean up (AOAC- Official Method 2007.01 e

CEN/TC 275 15662:2008) para o grupo de pesticidas em estudo. As amostras foram

fortificadas (0,3mg.L-1

) e preparadas conforme descrito no item 4.5 da metodologia.

Conforme a Tabela 17 o método AOAC-2007.01 apresentou média de recuperação

(97,31%) superior ao método EN 15662:2008 (95,31%) e o método AOAC-2007.01

apresentou desvio padrão superior (1,54E-02) ao EN 15662:2008 (1,16E-02). No

entanto quando analisados as recuperações por analito foi possível identificar que o

Carbosulfano e a Bifentrina apresentaram média de recuperação abaixo dos limites

aceitáveis de (70 – 120% [93]) para EN 15662:2008 com 19,34% e 62,25%

respectivamente. Os demais apresentaram recuperações dentro da faixa aceitável em

ambos os métodos.

Foram aplicados os testes F para análise da variância entre os dados e o teste t de

Student para análise das médias. As variâncias obtidas foram consideradas equivalentes

para as comparações entre os dois conjuntos de dados (AOAC, EN), já que para

61

nenhum dos analitos o Fcalculado foi maior que o Fcrítico (19). A análise entre as médias

para variâncias equivalentes apresentou diferença significativa para Bifentrina,

Carbossulfano e Imidacloprido, o primeiro com média de resposta de 0,2360 e 0,1868, o

segundo 0,2368 e 0,0580 e o último 0,3561 e 0,3119 para AOAC e EN,

respectivamente. Para os demais analitos o tcalculado foi < que o tcrítico evidenciando que

não existe diferença entre as médias e que ambos os métodos poderiam ser utilizados.

62

Tabela 17 – Teste de eficácia entre os métodos AOAC-2007.01 e EN 15662:2008 por meio da comparação de recuperação, análise da variância

e das médias para cada pesticida

A B

Pesticida AOAC-1 AOAC-2 AOAC-3

Desvio

Padrão Média

das

médias

Recuperação EN-1 EN-1 EN-1

Desvio

Padrão Média

das

médias

Recuperação

ttabelado:

2,77

Ftabelado:

19

(s) (s) tcalculado Fcalculado

*Acefato 0,2773 0,2916 0,2988 9,85E-03 0,2893 96,42% 0,2908 0,3067 0,3088 8,93E-03 0,3008 100,26% 1,39 1,44

*Clorpirifos 0,2405 0,2614 0,2661 1,18E-02 0,256 85,33% 0,2268 0,2503 0,249 1,15E-02 0,2415 80,50% 1,33 1,11

*Deltametrina 0,2866 0,3047 0,2977 8,10E-03 0,2963 98,78% 0,2801 0,2954 0,2956 1,13E-02 0,2942 98,05% 0,24 1,94

*Dimetoato 0,3195 0,3426 0,3437 1,20E-02 0,3353 111,76% 0,3259 0,3538 0,3542 1,46E-02 0,3435 114,50% 0,68 1,34

*Fenpiroximato 0,2861 0,3103 0,3136 1,31E-02 0,3034 101,12% 0,2875 0,3067 0,3082 1,08E-02 0,3011 100,35% 0,92 1,34

*Trifloxistrobina 0,297 0,3236 0,3211 1,28E-02 0,3139 104,63% 0,2978 0,3233 0,3221 1,31E-02 0,3145 104,83% 0,05 1,02

*Carbofurano 0,2934 0,3195 0,3172 1,28E-02 0,31 103,34% 0,304 0,3344 0,3335 1,50E-02 0,3235 107,83% 1,04 1,37

Azoxistrobina 0,2814 0,3079 0,3096 1,38E-02 0,2996 99,87% 0,2861 0,3084 0,3113 1,31E-02 0,3027 100,89% 0,24 1,2

Bifentrina 0,2154 0,2391 0,2535 1,69E-02 0,236 78,66% 0,1759 0,197 0,1949 9,46E-03 0,1868 62,25% 3,91 3,49

Boscalida 0,2982 0,3221 0,3176 1,17E-02 0,3126 104,21% 0,2957 0,3219 0,3217 1,33E-02 0,3129 104,31% 0,02 1,38

Carbosulfano 0,2408 0,2542 0,2154 1,72E-02 0,2368 78,94% 0,0491 0,0599 0,0588 7,38E-03 0,058 19,34% 14,45 5,54

Cimoxanil 0,2981 0,3212 0,3262 1,32E-02 0,3152 105,05% 0,304 0,3286 0,3301 1,36E-02 0,3215 107,18% 0,51 1,03

Clotianidina 0,2119 0,3226 0,3221 9,50E-02 0,2855 95,18% 0,3127 0,3395 0,334 1,52E-02 0,3315 110,49% 1,2 15

Difenoconazol 0,2651 0,2904 0,2962 1,43E-02 0,2839 94,64% 0,2721 0,2921 0,2933 1,07E-02 0,2858 95,26% 0,15 1,93

Dimetomorfe 0,3025 0,2962 0,2928 1,01E-02 0,2972 99,05% 0,2937 0,3 0,3029 5,45E-03 0,2979 99,30% 0,19 1,27

Diurom 0,3038 0,3269 0,3306 1,27E-02 0,3205 106,82% 0,308 0,3367 0,3368 1,39E-02 0,3261 108,70% 0,45 1,18

Famoxadona 0,2381 0,2573 0,2626 1,15E-02 0,2527 84,23% 0,2445 0,2631 0,2602 9,08E-03 0,2561 85,38% 0,36 1,63

Fenamidona 0,2772 0,2988 0,3011 1,15E-02 0,2924 97,46% 0,2761 0,3016 0,3037 1,25E-02 0,2923 97,42% 0,01 1,17

Fenarimol 0,2307 0,2437 0,2615 1,39E-02 0,2453 81,77% 0,2365 0,2612 0,2533 1,36E-02 0,25 83,35% 0,42 1,68

Imidacloprido 0,3521 0,3612 0,3483 7,77E-03 0,3539 117,96% 0,3239 0,3035 0,3089 1,22E-02 0,3119 103,97% 5,19 1,01

Indoxacarbe 0,273 0,2943 0,3032 1,36E-02 0,2902 96,73% 0,2817 0,3049 0,2964 9,79E-03 0,2933 97,76% 0,28 2,2

63

Iprovalicarbe 0,2959 0,3214 0,3169 1,20E-02 0,3114 103,80% 0,2932 0,3241 0,3232 1,53E-02 0,313 104,35% 1,6 0,62

Metalaxil 0,2877 0,3107 0,316 1,31E-02 0,3048 101,60% 0,2925 0,3163 0,3182 1,30E-02 0,3063 102,10% 0,12 1,29

Tebuconazol 0,269 0,2972 0,2983 1,45E-02 0,2881 96,04% 0,2744 0,2989 0,2963 1,19E-02 0,289 96,33% 0,07 1,65

Tetraconazol 0,2624 0,2883 0,2926 1,45E-02 0,2811 93,70% 0,271 0,2922 0,2941 1,15E-02 0,2849 94,97% 0,32 1,77

Tiametoxam 0,304 0,2963 0,2912 7,89E-03 0,2972 99,06% 0,2989 0,2989 0,2898 5,06E-03 0,3002 100,07% 0,65 1,82

Triadimefom 0,2796 0,3009 0,2976 1,00E-02 0,2927 97,57% 0,2763 0,3015 0,3022 1,29E-02 0,2921 97,36% 0,05 1,42

Triadimenol 0,2529 0,2773 0,2808 1,35E-02 0,2704 90,12% 0,2603 0,2791 0,2875 1,20E-02 0,2742 91,41% 0,34 1,51

MÉDIAS 1,54E-02 0,2919 97,31 1,16E-02 0,2859 95,31

A: Médias das triplicatas para as três amostras preparadas independentes pelo método AOAC; B: Médias das triplicatas para as três amostras preparadas independentes pelo método EN; Desvio

Padrão: calculado entre as 9 leituras de cada método; Médias das médias: Média entre as médias de triplicata para cada método; Recuperação: Percentual de recuperação entre a concentração

esperada e a concentração obtida.

64

Levando-se em consideração os dois critérios de aceitação, consideramos que o

método mais apropriado para o grupo de pesticidas em questão é o AOAC-2007.01, que

apresentou faixa de recuperação dentro do limite aceitável estabelecido pela SANCO

para todos os analitos. Desta forma, o procedimento descrito pela AOAC-2007.01 será o

método utilizado na etapa da validação e na análise das amostras reais deste estudo.

5.2. Parâmetros de validação

O estudo de validação seguiu a sequência lógica do processo conforme descreve o

Manual de Garantia da Qualidade Analítica do MAPA. A validação iniciou-se pelo

estudo da linearidade, posteriormente avaliar a seletividade, seguida do estudo da

exatidão, precisão e por fim o LD e LQ do método [85]. Para o método ser considerado

validado, o mesmo deve atender a todos os critérios de aceitação dos parâmetros da

validação. Além do atendimento dos critérios da validação, o método precisa atender a

realidade que se pretende aplicar, ou seja, deve atender aos LMR estabelecidos, caso

contrário, não terá aplicabilidade comercial.

5.2.1. Linearidade

Construção da curva

Para o estudo de validação inicialmente foi construída uma curva de calibração tipo

CCAS seguindo os passos descritos na seção 3.9.2 da metodologia e na seção 4.6 -

Preparação dos Padrões de Calibração.

Os LMR dentre os estabelecidos pelo Brasil, Japão, USA e Europa para os

pesticidas estudados foram utilizados como critério para a definição da faixa da curva.

Nove pontos foram incluídos a fim de possibilitar a quantificação na faixa de 0,01 a 3

mg.L-1

.

Os pontos foram analisados em triplicata nas seguintes concentrações: 0,0025,

0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, e 5 mg.L-1

. Devido o tamanho da faixa que o método

precisa abranger foi necessário trabalhar com uma faixa específica para cada analito.

Neste caso, foram excluídos os dois pontos mais extremos, finalizando a curva com 7

pontos. A Tabela 18, relaciona a faixa da curva de cada pesticida analisado, bem como,

o menor limite máximo de resíduos aceitável entre os países e regiões citadas.

65

Tabela 18 – Faixa da curva de calibração CCAS para cada pesticida e LMR

Pesticida

CCAS

LMR* (mg.L-1

) Range (mg.L

-1)

Acefato 0,0025 - 1 NA

Clorpirifos 0,005 - 2 NA

Deltametrina 0,0025 - 1 NA

Dimetoato 0,0025 - 1 NA

Fenpiroximato 0,0025 - 1 NA

Trifloxistrobina 0,0025 - 1 NA

Carbofurano 0,0025 - 1 NA

Azoxistrobina 0,005 - 2 0,5

Bifentrina 0,0025 - 1 0,1

Boscalida 0,01 -5 3

Carbosulfano 0,0025 - 1 NA

Cimoxanil 0,0025 - 1 0,1

Clotianidina 0,0025 - 1 0,01

Difenoconazol 0,01 - 5 0,2

Dimetomorfe 0,01 -5 2

Diurom 0,0025 - 1 0,01

Famoxadona 0,01 - 5 0,5

Fenamidona 0,01 - 5 0,2

Fenarimol 0,0025 - 2 0,05

Imidacloprido 0,0025 - 1 NA

Indoxacarbe 0,005 - 2 NA

Iprovalicarbe 0,0025 - 1 NA

Metalaxil 0,005 - 2 1

Tebuconazol 0,01 - 5 0,5

Tetraconazol 0,005 - 2 0,2

Tiametoxam 0,005 – 2 0,2

Triadimefom 0,01 - 5 NA

Triadimenol 0,0025 - 1 NA

*LMR: Limite Máximo de Resíduos para uva (escolhido o menor limite entre Brasil, Japão, USA e Europa); NA: Não Autorizado

Na Tabela 19, estão apresentados os dados que inicialmente foram tratados

pelo MMQO para a obtenção do coeficiente angular (b), linear (a) e de correlação (r2).

A homocedasticidade da curva foi testada por meio de inspeção visual dos gráficos de

dispersão dos resíduos (APÊNDICE D) e em seguida a homocedasticidade foi

verificada pelo teste de Cochran. Quando o gráfico de resíduos sugere

homocedasticidade (os dados apresentam-se aleatoriamente dispersos) os dados podem

ser tratados pelo MMQO – Método dos Mínimos Quadrados Ordinários.

66

Tabela 19 - Curvas analíticas y= ax+b, coeficiente de correlação (r2), teste de

homocedasticidade para o MMQO

MMQO

Cochran

Calculado

Pesticidas y = ax + b r2 (Ctab: 0,561)

Acefato y= 90061,9309 *x 583,139936 0,9991 0,809

Clorpirifos y= 63041,2883 *x -557,683032 0,9984 0,89

Deltametrina y= 15329,8715 *x 54,376506 0,9976 0,936

Dimetoato y= 137348,937 *x 606,28671 0,9992 0,857

Fenpiroximato y= 280242,005 *x 669,18156 0,9995 0,806

Trifloxistrobina y= 403387,388 *x 2311,803612 0,9981 0,791

Carbofurano y= 460062,253 *x 2189,313784 0,9992 0,813

Azoxistrobina y= 566698,69 *x -3866,180936 0,9984 0,756

Bifentrina y= 6858,4867 *x 52,598976 0,9966 0,943

Boscalida y= 72080,4021 *x 1483,253148 0,9984 0,628

Carbosulfano y= 223872,655 *x 3394,941104 0,994 0,785

Cimoxanil y= 122652,914 *x -980,313147 0,9986 0,927

Clotianidina y= 24275,5897 *x 117,93789 0,9991 0,985

Difenoconazol y= 118402,111 *x 3497,444156 0,9986 0,615

Diurom y= 146612,307 *x 1117,604854 0,9995 0,958

Famoxadona y= 56795,4402 *x -1

373,124009 0,9992 0,72

Fenamidona y= 95361,1586 *x 3745,903567 0,9975 0,517

Fenarimol y= 13248,8035 *x -25,624483 0,9985 0,913

Imidacloprido y= 26491,6103 *x 120,201561 0,9995 0,684

Indoxacarbe y= 20462,3888 *x -61,561557 0,9982 0,499

Iprovalicarbe y= 681289,065 *x 2981,903075 0,9992 0,738

Metalaxil y= 409076,305 *x -1

138,694565 0,9992 0,875

Tebuconazol y= 120507,752 *x 4162,038191 0,9984 0,747

Tetraconazol y= 73426,8193 *x 3921,87174 0,9971 0,683

Tiametoxam y= 62198,1229 *x -1

00,168257 0,9985 0,965

Triadimefom y= 58537,247 *x 2017,779138 0,9982 0,562

Triadimenol y= 50450,2801 *x 325,293214 0,9989 0,605

r2: Correlação Linear, Ctab: Cochran tabelado (para 7 níveis e 3 replicatas).

Conforme apresentado na Tabela 19 todos os resultados de correlação linear

foram superiores a 0,99 atendendo aos critérios do INMETRO de 0,90. Na mesma

tabela, é possível observar que, com exceção do Indoxacarbe e Fenamidona os demais

pesticidas apresentaram dados da curva heterocedásticos já que o Cochran calculado

ficou maior que o Cochran tabelado (0,561). Quando o gráfico dos resíduos apresenta

tendência (os dados não estão aleatoriamente dispersos) a curva é considerada

heterocedástica e os dados devem ser tratados pelo MMQP – Método Mínimos

Quadrados Ponderados (1/SD^2

) [85]. Nestas condições conforme descrito na

metodologia é necessário tratar os dados pelo MMQP.

67

A Tabela 20, apresenta os resultados para coeficiente linear (a), angular (b) e

coeficientes de correlação linear para os dados da curva utilizando o MMQP. O r2

de

todas as curvas apresentaram-se superiores a 0,90 conforme critério de aceitação do

INMETRO [94]. Ainda na Tabela 20 é apresentado o teste r onde é possível observar

que para todas as curvas o tr > que o tcritico de 2,093 demonstrando que o ajuste foi

adequado e que de fato o MMQP deve ser aplicado.

Tabela 20 - Curvas analíticas y= ax+b, coeficiente de correlação (r2), teste r para o

MMQP

MMQP Teste r

y=aw.x+bw r

2

(tcritico: 2,093)

Acefato y= 93136,4743 *x 249,345629 0,999185 156,583

Clorpirifos y= 59904,39616 *x 56,17682 0,998747 126,246

Deltametrina y= 15310,11216 *x 21,313408 0,999422 185,892

Dimetoato y= 142163,9249 *x 120,886787 0,999407 183,524

Fenpiroximato y= 279331,4904 *x 399,785797 0,998714 124,623

Trifloxistrobina y= 420563,2364 *x 514,271243 0,998382 111,106

Carbofurano y= 485006,1649 *x 439,301928 0,9992 158,068

Azoxistrobina y= 558593,5827 *x 645,267231 0,998872 133,099

Bifentrina y= 7412,315184 *x 8,40261 0,997706 93,274

Boscalida y= 72062,47526 *x 148,550458 0,99872 124,897

Carbosulfano y= 264741,1201 *x 305,010974 0,987352 39,514

Cimoxanil y= 119371,3185 *x 73,574278 0,999524 204,981

Clotianidina y= 25375,29538 *x 28,201152 0,999889 424,182

Difenoconazol y= 120840,6834 *x 365,342901 0,998761 126,962

Diurom y= 150042,8383 *x 268,794366 0,998102 102,544

Famoxadona y= 54285,14373 *x 10,137106 0,996695 77,662

Fenamidona y= 98588,89458 *x 293,962785 0,997694 93,018

Fenarimol y= 12791,14299 *x 17,488316 0,998336 109,531

Imidacloprido y= 26923,25636 *x 50,386226 0,999282 166,876

Indoxacarbe y= 20788,99233 *x 25,886376 0,999601 223,813

Iprovalicarbe y= 687010,0527 *x 1487,30873 0,997651 92,171

Metalaxil y= 503303,7899 *x 682,934723 0,999594 221,965

Tebuconazol y= 123382,2851 *x 322,905991 0,999642 236,353

Tetraconazol y= 79801,92795 *x 305,426465 0,99666 77,259

Tiametoxam y= 60490,53457 *x 177,912879 0,997864 96,66

Triadimefom y= 60368,02396 *x 126,23998 0,998567 118,04

Triadimenol y= 52146,72258 *x 92,305746 0,998676 122,806

r2: Coeficiente de correlação

Diante dos resultados obtidos depois do ajuste para r

2, podemos afirmar que o

método possui correlação entre concentração e resposta. No APÊNDICE B são

apresentadas todas as curvas de calibração.

68

5.2.2. Seletividade e Efeito Matriz

Conforme descrito na metodologia, foram comparados visualmente os sinais

oriundos do extrato da amostra branca com o sinal do branco reagente. A Figura 7

apresenta o TIC do extrato da matriz branca (linha vermelha) sobreposto com o TIC do

branco reagente linha preta onde é possível observar a inexistência de interferentes com

as massas dos pesticidas inclusos no método.

Figura 7 – Extrato da amostra branca (linha vermelha) e branco do reagente (linha

preta) sobrepostos

Na Figura 8, quando comparados o sinal cromatográfico dos brancos (amostra

(c) e reagente (a)) com o extrato da amostra branca fortificada (b), pode-se confirmar

que nenhum interferente está presente.

Figura 8 - TIC do branco reagente (a) da matriz branca fortificada (b) e da amostra

branca (c)

(a)

(b)

(c)

69

Para o estudo de efeito matriz foram fortificadas 3 amostras brancas

independentes, a 2 mg.L-1

(injetadas em triplicata) e preparados 3 padrões em solução a

2 mg.L-1

(injetados em triplicata). Inicialmente, conforme mostra a Figura 9 foram

comparados visualmente o TIC oriundo do extrato da matriz branca fortificada (a) com

o padrão em solução (b).

Figura 9 - Estudo de efeito matriz - TIC do extrato da amostra branca fortificada

2mg.L-1

(a) e TIC do padrão em solução 2 mg.L-1

(b)

A Figura 10 mostra o TIC do extrato da matriz branca fortificada (linha preta)

sobreposto com o TIC do padrão em solução (linha vermelha), onde visualmente pode-

se observar que uma leve amplificação do sinal cromatográfico em alguns picos para a

o extrato da amostra branca fortificada (linha preta).

Figura 10 - TIC sobrepostos do extrato da matriz branca fortificada a 2 mg.L-1

(linha

preta) com a solução padrão 2mg.L-1

em solvente (linha vermelha).

(a)

(b)

70

Conforme descrito na metodologia, para verificar a inexistência de efeito matriz

as respostas oriundas da análise do extrato da matriz branca fortificada e do padrão em

solução foram tratados estatisticamente pela análise da variância pelo teste F e

comparação de médias pelo teste t de Student.

Conforme pode ser observado na Tabela 21, nenhum dos pesticidas em estudo

sofreu efeito da matriz de forma significativa. As variâncias entre as amostras testadas

foram consideradas equivalentes já que em todos os casos o Fcalculado foi < que Ftabelado,

as médias foram consideradas estatisticamente iguais já que em todos os casos o tcalculado

foi < que o tcritico. Neste caso dispensa-se a necessidade de fabricação da curva de

calibração do tipo CCEMBF – Curva de Calibração no Extrato da Matriz Branca

Fortificada. A

Tabela 21 – Verificação de Efeito matriz – Análise da Variância e comparação de

médias entre extrato da matriz branca fortificada a 2mg.L-1

(B) e padrão puro em

solução a 2mg.L-1

(A)

Pesticida

A

(mg.L-

1)

D.P. de A

B

(mg.L-

1)

D.P. de B Ftabelado: 19 tCritico para variâncias equivalentes:2,77

Fcalculado tCalculado

Acefato 1,7141 8,74E-02 1,6513 1,29E-01 2,19 0,70

Clorpirifos 1,7169 6,51E-02 1,8079 1,46E-01 5,05 0,98

Deltametrina 1,9077 4,13E-02 2,0143 1,40E-01 11,51 1,27

Dimetoato 1,5116 3,92E-02 1,5626 1,17E-01 8,97 0,71

Fenpiroximato 1,7766 7,19E-02 1,8985 1,44E-01 3,99 1,31

Trifloxistrobina 1,6585 6,10E-02 1,7449 1,20E-01 3,87 1,11

Carbofurano 1,5097 4,68E-02 1,5726 1,09E-01 5,46 0,92

Azoxistrobina 1,6205 6,67E-02 1,7035 1,29E-01 3,74 0,99

Bifentrina 1,1766 2,00E-01 1,1617 1,74E-01 1,32 0,10

Boscalida 1,7223 3,41E-02 1,8160 1,34E-01 15,52 1,17

Carbosulfano 1,7426 7,63E-02 1,6405 6,11E-02 1,56 1,81

Cimoxanil 1,7480 6,53E-02 1,8504 1,31E-01 4,01 1,21

Clotianidina 1,6260 4,73E-02 1,7639 1,19E-01 6,27 1,87

Difenoconazol 1,7416 6,09E-02 1,8300 1,37E-01 5,08 1,02

Diurom 1,5185 6,10E-02 1,5819 1,11E-01 3,34 0,86

Famoxadona 1,5569 6,11E-02 1,6540 1,34E-01 4,78 1,15

Fenamidona 1,6134 4,59E-02 1,7078 1,17E-01 6,51 1,30

Fenarimol 1,6259 6,44E-02 1,7066 1,31E-01 4,15 0,96

Imidacloprido 1,6521 4,48E-02 1,7626 1,33E-01 8,80 1,36

Indoxacarbe 1,5986 6,77E-02 1,6893 1,27E-01 3,51 1,09

Iprovalicarbe 1,7381 4,51E-02 1,8188 1,23E-01 7,45 1,07

Metalaxil 1,5206 4,51E-02 1,5819 1,09E-01 5,79 0,90

Tebuconazol 1,6628 6,58E-02 1,7472 1,35E-01 4,22 0,97

71

Tetraconazol 1,5983 6,79E-02 1,6863 1,28E-01 3,53 1,05

Tiametoxam 1,5653 6,56E-02 1,6958 1,24E-01 3,58 1,61

Triadimefom 1,6691 4,22E-02 1,7443 1,16E-01 7,47 1,06

Triadimenol 1,5721 5,76E-02 1,6441 1,24E-01 4,65 0,91

A: média de concentração obtida do padrão puro em solvente (2mg.L-1); B: média de concentração obtida do extrato da matriz

branca fortificada (2mg.L-1); D.P de A: Desvio Padrão entre as respostas para padrão puro em solvente; D.P de B: Desvio Padrão

entre as respostas para extrato da matriz branca fortificada.

5.2.3. Precisão

A precisão foi calculada em termos de repetitividade e precisão intermediária. Cada

analista (dois) preparou sete amostras independentes em cada concentração testada (0,005, 0,1 e

2 mg.L-1

). Foram calculadas as médias, desvio padrão e coeficiente de variação de cada analista

para a obtenção dos resultados de repetitividade, a precisão intermediária foi calculada com base

no coeficiente de variação estimado entre os analistas.

A Tabela 22 detalha os resultados da precisão para os três níveis de fortificação. O

nível 0,005mg.L-1

apresentou médias de leitura de 0,0054 e 0,0049, médias de desvio padrão de

8,61E-04 e 7,08E-04 e médias de coeficiente de variação (repê) de 16,4 e 14,5% para os

analistas 1 e 2 respectivamente. A precisão intermediária calculada em termos de coeficiente de

variação ficou em 16,5%, tanto a repê quanto a precisão intermediária apresentaram resultados

de CV abaixo do critério de aceitação de 35% para todos os pesticidas, estando de acordo com a

SANCO. O nível de fortificação intermediário (0,1mg.L-1

) apresentou médias de leitura de

0,1152 e 0,1149, médias de desvio padrão de 2,36E-02 e 2,32E-02 e médias de coeficiente de

variação (repê) de 20,7 e 20,5% para os analistas 1 e 2 respectivamente. A precisão

intermediária calculada em termos de coeficiente de variação ficou em 20,3%, tanto a repê

quanto a precisão intermediária apresentaram resultados de CV abaixo do critério de aceitação

de 30% para todos os pesticidas, estando de acordo com a SANCO. Ainda na Tabela 22, para o

nível de fortificação 2mg.L-1

os resultados foram, médias de leitura de 2,1640 e 2,1562, médias

de desvio padrão de 2,34E-01 e 2,41E-01 e médias de coeficiente de variação (repê) de 10,8 e

11,2% para os analistas 1 e 2 respectivamente. A precisão intermediária calculada em termos de

coeficiente de variação ficou em 11,4%, tanto a repê quanto a precisão intermediária

apresentaram resultados de CV abaixo do critério de aceitação de 30% para todos os pesticidas,

estando de acordo com a SANCO.

72

Tabela 22 – Médias, desvio padrão, resultados de repetitividade (CV) e precisão intermediária (CV) em três níveis de fortificação (0,005, 0,1, 2

mg.L-1

) para dois analistas

0,005 (mg.L-1) 0,1 (mg.L-1) 2 (mg.L-1)

Repe (1) Repe (2) P.I. (CV)



Média D.P. C.V. Média D.P. C.V. Média D.P. C.V. Média D.P. C.V. Média D.P. C.V. Média D.P. C.V.

Acefato 0,0049 7,91E-04 16,3 0,0045 6,46E-04 14,4 15,4 0,1097 1,42E-02 13,0 0,1070 1,47E-02 13,8 12,9 1,9444 1,66E-01 8,5 1,8792 2,44E-01 13,0 10,6

Clorpirifos 0,0055 9,50E-04 17,2 0,0052 6,75E-04 13,0 15,1 0,1392 2,45E-02 17,6 0,1354 2,28E-02 16,9 16,6 2,2430 2,92E-01 13,0 2,1330 2,24E-01 10,5 11,7

Deltametrina 0,0070 1,66E-03 23,7 0,0057 1,52E-03 26,7 26,5 0,1404 2,24E-02 16,0 0,1365 2,81E-02 20,6 17,7 2,7838 4,81E-01 17,3 2,3620 4,09E-01 17,3 18,7

Dimetoato 0,0059 4,77E-04 8,1 0,0046 5,35E-04 11,5 15,5 0,1131 2,20E-02 19,5 0,1170 2,05E-02 17,5 17,9 2,1877 1,82E-01 8,3 2,1572 2,36E-01 10,9 9,3

Fenpiroximato 0,0054 1,09E-03 20,4 0,0051 8,93E-04 17,5 18,5 0,1238 2,11E-02 17,0 0,1346 2,85E-02 21,2 19,1 2,4762 3,44E-01 13,9 2,3782 3,07E-01 12,9 13,1

Trifloxistrobina 0,0053 7,07E-04 13,2 0,0050 5,50E-04 10,9 12,1 0,1271 2,16E-02 17,0 0,1261 2,05E-02 16,2 16,0 2,1204 1,39E-01 6,6 2,2286 1,69E-01 7,6 7,3

Carbofurano 0,0054 8,13E-04 15,2 0,0051 9,37E-04 18,4 16,4 0,1153 2,44E-02 21,1 0,1330 2,33E-02 17,5 19,9 2,1267 1,92E-01 9,0 2,1275 1,42E-01 6,7 7,6

Azoxistrobina 0,0056 8,72E-04 15,6 0,0058 6,45E-04 11,2 13,1 0,1198 3,16E-02 26,3 0,1249 2,92E-02 23,3 24,0 2,3200 2,42E-01 10,4 2,1929 2,13E-01 9,7 10,1

Bifentrina 0,0043 6,56E-04 15,3 0,0046 5,68E-04 12,3 13,8 0,1073 1,51E-02 14,0 0,1222 1,41E-02 11,6 14,0 1,9220 1,99E-01 10,4 2,0796 2,86E-01 13,8 12,5

Boscalida 0,0059 1,13E-03 19,1 0,0059 7,07E-04 11,9 15,3 0,1154 2,20E-02 19,0 0,1154 2,80E-02 24,3 21,0 2,1420 2,04E-01 9,5 2,2308 2,96E-01 13,3 11,4

Carbosulfano 0,0015 4,14E-04 27,7 0,0021 3,77E-04 17,6 28,0 0,0185 4,93E-03 26,6 0,0148 4,39E-03 29,6 29,3 1,3870 1,93E-01 13,9 0,9703 1,30E-01 13,4 22,7

Cimoxanil 0,0053 1,00E-03 18,8 0,0054 7,65E-04 14,1 15,9 0,1104 2,88E-02 26,1 0,1051 2,43E-02 23,2 23,9 2,1513 1,95E-01 9,1 2,3248 2,11E-01 9,1 9,6

Clotianidina 0,0060 1,12E-03 18,6 0,0049 5,40E-04 11,1 18,9 0,1123 2,19E-02 19,5 0,1123 1,83E-02 16,3 17,3 2,2694 2,18E-01 9,6 2,1302 2,52E-01 11,8 10,8

Difenoconazol 0,0051 7,79E-04 15,2 0,0047 6,43E-04 13,5 14,4 0,1190 2,46E-02 20,6 0,1336 3,27E-02 24,4 22,8 2,2459 2,64E-01 11,8 2,2973 3,10E-01 13,5 12,2

Diurom 0,0055 7,46E-04 13,6 0,0049 5,59E-04 11,5 13,9 0,1212 1,46E-02 12,1 0,1102 1,68E-02 15,3 14,0 2,1629 2,37E-01 10,9 2,2118 2,69E-01 12,1 11,2

Famoxadona 0,0057 7,51E-04 13,1 0,0053 6,95E-04 13,2 13,4 0,1106 2,60E-02 23,5 0,1146 3,23E-02 28,2 25,1 2,2171 2,38E-01 10,7 2,3577 3,14E-01 13,3 12,1

Fenamidona 0,0053 7,81E-04 14,7 0,0048 5,83E-04 12,1 14,0 0,1174 2,81E-02 23,9 0,1035 2,36E-02 22,8 23,5 2,2089 2,70E-01 12,2 2,0726 2,10E-01 10,1 11,4

Fenarimol 0,0063 1,33E-03 21,2 0,0051 1,03E-03 20,3 23,0 0,1187 3,46E-02 29,1 0,1153 3,41E-02 29,5 28,2 2,0727 1,69E-01 8,2 2,2343 2,52E-01 11,3 10,3

Imidacloprido 0,0059 6,25E-04 10,7 0,0054 6,32E-04 11,8 11,7 0,1142 2,35E-02 20,6 0,1159 2,52E-02 21,7 20,4 2,2033 2,58E-01 11,7 2,1952 2,31E-01 10,5 10,7

Indoxacarbe 0,0061 8,74E-04 14,3 0,0051 7,63E-04 15,0 17,2 0,1321 3,42E-02 25,9 0,1342 3,32E-02 24,7 24,3 2,1079 2,72E-01 12,9 2,2121 2,48E-01 11,2 11,8

Iprovalicarbe 0,0053 9,95E-04 18,8 0,0047 6,47E-04 13,9 17,6 0,1200 1,75E-02 14,6 0,1102 1,47E-02 13,4 14,2 2,1515 2,39E-01 11,1 2,1332 2,20E-01 10,3 10,3

Metalaxil 0,0052 8,54E-04 16,5 0,0051 7,06E-04 13,8 14,7 0,1069 2,10E-02 19,7 0,1145 1,99E-02 17,4 18,1 2,1109 1,57E-01 7,4 2,2417 2,22E-01 9,9 9,0

73

Tebuconazol 0,0055 7,09E-04 13,0 0,0050 7,48E-04 15,0 14,3 0,1186 2,46E-02 20,7 0,1092 1,82E-02 16,6 18,7 2,2257 2,96E-01 13,3 2,1331 2,55E-01 12,0 12,4

Tetraconazol 0,0063 9,08E-04 14,3 0,0056 7,74E-04 13,8 15,0 0,1430 3,41E-02 23,9 0,1221 2,64E-02 21,6 23,6 2,1979 2,18E-01 9,9 2,3185 2,93E-01 12,6 11,3

Tiametoxam 0,0059 6,47E-04 11,0 0,0048 6,75E-04 14,1 15,8 0,1057 2,37E-02 22,5 0,1063 1,90E-02 17,8 19,5 2,1907 2,30E-01 10,5 2,2622 1,82E-01 8,0 9,1

Triadimefom 0,0058 9,73E-04 16,9 0,0056 8,02E-04 14,4 15,3 0,1169 2,96E-02 25,3 0,1093 2,79E-02 25,6 24,7 2,1372 1,84E-01 8,6 2,2542 1,67E-01 7,4 8,2

Triadimenol 0,0032 6,09E-04 19,1 0,0027 5,04E-04 18,8 20,4 0,1150 2,59E-02 22,5 0,1197 2,67E-02 22,3 21,6 2,1219 2,49E-01 11,8 2,1003 2,25E-01 10,7 10,8

Médias 0,0054 0,0009 16,4 0,0049 0,0007 14,5 16,5 0,1152 0,0236 20,7 0,1149 0,0232 20,5 20,3 2,1640 0,2344 10,8 2,1562 0,2413 11,2 11,4

DP: Desvio Padrão; CV: Coeficiente de Variação; PI: Precisão Intermediária; Repê(1): Resultados de repetitividade do analista 1; Repê(2): Resultados de repetitividade do analista 2

74

5.2.4. Tendência e Recuperação

A recuperação foi testada em dois níveis de concentração 0,005 e 2mg.L-1

para três

amostras independentes. Na Tabela 23 podem-se observar as médias e o percentual de

recuperação de cada pesticida, Deltametrina, Carbossulfano e Fenpiroximato

apresentaram recuperações acima de 120% ou abaixo de 70% os demais apresentaram

resultados dentro da faixa aceitável estabelecida pela SANCO de 70 a 120% [93].

Tabela 23 – Resultados de recuperação (%) para amostras brancas fortificadas a 0,005 e

2 mg.L-1

Média Recuperação (%)

0,005 mg.L-1

2 mg.L-1

0,005 mg.L-1

2 mg.L-1

Acefato 0,005 1,815 100,86% 90,75%

Clorpirifos 0,006 2,352 112,74% 117,61%

Deltametrina 0,006 2,895 129,63% 144,75%

Dimetoato 0,006 2,184 118,49% 109,18%

Fenpiroximato 0,005 2,608 106,81% 130,39%

Trifloxistrobina 0,005 2,328 96,96% 116,38%

Carbofurano 0,005 2,13 96,89% 106,52%

Azoxistrobina 0,006 2,204 114,02% 110,19%

Bifentrina 0,005 2,107 102,59% 105,37%

Boscalida 0,006 2,372 119,00% 118,61%

Carbosulfano 0,002 1,376 30,31% 68,78%

Cimoxanil 0,005 2,394 108,06% 119,72%

Clotianidina 0,005 2,355 102,93% 117,77%

Difenoconazol 0,005 2,279 107,30% 113,97%

Diurom 0,005 2,218 96,89% 110,92%

Famoxadona 0,005 2,167 103,50% 108,34%

Fenamidona 0,005 2,279 101,45% 113,93%

Fenarimol 0,005 2,232 103,72% 111,58%

Imidacloprido 0,005 2,271 102,99% 113,57%

Indoxacarbe 0,005 2,283 103,25% 114,15%

Iprovalicarbe 0,005 2,303 104,76% 115,17%

Metalaxil 0,005 2,362 96,55% 118,09%

Tebuconazol 0,005 2,317 99,84% 115,87%

Tetraconazol 0,005 2,279 105,77% 113,93%

Tiametoxam 0,005 2,369 99,53% 118,43%

Triadimefom 0,006 2,231 110,95% 111,56%

Triadimenol 0,004 1,993 72,27% 99,67%

Média 101,78% 112,41%

75

5.2.5. Limite de Detecção e Limite de Quantificação

Os limites de detecção e quantificação foram calculados conforme descrito na

metodologia. Na Tabela 24 podem ser observados os limites de detecção para cada

pesticida, os resultados foram obtidos a partir da leitura de 7 replicatas de amostra

branca (neste caso o valor de t unilateral, para 99% de confiança é 3,143) e calculados

com base na equação estabelecida pelo INMETRO.

Tabela 24 - Limite de Detecção

Pesticida Média DP LD

Acefato 0,0006 5,00E-04 0,0021

Clorpirifos 0,001 1,00E-03 0,004

Deltametrina 0,0002 7,00E-04 0,0023

Dimetoato 0,0005 6,00E-04 0,0023

Fenpiroximato 0,0003 2,00E-04 0,0009

Trifloxistrobina 0,0002 1,00E-04 0,0005

Carbofurano 0,0006 5,00E-04 0,0021

Azoxistrobina 0,0001 2,00E-04 0,0007

Bifentrina 0,00003 5,00E-04 0,00153

Boscalida 0,009 1,00E-04 0,0093

Carbosulfano 0,0002 5,00E-04 0,0017

Cimoxanil 0,0003 3,00E-04 0,0012

Clotianidina 0,0004 5,00E-04 0,0019

Difenoconazol 0,005 9,00E-04 0,0077

Diurom 0,0001 7,00E-04 0,0022

Famoxadona 0,0009 9,00E-04 0,0036

Fenamidona 0,003 8,00E-04 0,0054

Fenarimol 0,0008 3,00E-04 0,0017

Imidacloprido 0,0006 4,00E-04 0,0018

Indoxacarbe 0,0001 4,00E-04 0,0013

Iprovalicarbe 0,0002 5,50E-04 0,00185

Metalaxil 0,0008 1,00E-03 0,0038

Tebuconazol 0,007 3,00E-04 0,0079

Tetraconazol 0,001 9,00E-04 0,0037

Tiametoxam 0,0003 3,00E-04 0,0012

Triadimefom 0,004 5,00E-04 0,0055

Triadimenol 0,0003 3,00E-04 0,0012

Média: Médias das leituras de 7 replicatas de amostra branca (mg.L-1); DP: Desvio Padrão entre as leituras das amostras brancas;

LD: Limite de Detecção (mg.L-1).

76

Os menores pontos da curva de calibração de cada pesticida foram estabelecidos

como LQ, os quais foram testados experimentalmente e avaliados em termos de

repetitividade e recuperação. Conforme pode ser observado na Tabela 25 os coeficientes

de variação para todas as moléculas ficaram abaixo do critério máximo de 30% e as

recuperações com exceção do Carbosulfano (66%), ficaram dentro da faixa aceitável de

70 a 120%, confirmando que o LQ estabelecido pode ser aplicado na prática.

Tabela 25 – Limite de Quantificação, teste de repetitividade do LQ e recuperação

Teste de Repetitividade para LQ

Pesticida LD (mg.L-1) LQ (mg.L-1) DP Média CV (%) Recuperação (%)

Acefato 0,0021 0,0025 2,29E-04 0,002191 10,45 87,64

Clorpirifos 0,0040 0,005 5,49E-04 0,004719 11,64 94,37

Deltametrina 0,0023 0,0025 3,41E-04 0,002093 16,29 83,7

Dimetoato 0,0023 0,0025 3,13E-04 0,002152 14,56 86,07

Fenpiroximato 0,0009 0,0025 5,35E-04 0,002204 24,27 88,17

Trifloxistrobina 0,0005 0,0025 2,29E-04 0,002104 10,88 84,14

Carbofurano 0,0021 0,0025 1,95E-04 0,002112 9,24 84,48

Azoxistrobina 0,0007 0,005 4,96E-04 0,004837 10,26 96,74

Bifentrina 0,0015 0,0025 3,72E-04 0,002046 18,16 81,86

Boscalida 0,0093 0,01 2,12E-03 0,011677 18,12 116,77

Carbosulfano 0,0017 0,0025 2,07E-04 0,001651 12,54 66,04

Cimoxanil 0,0012 0,0025 3,29E-04 0,002129 15,45 85,14

Clotianidina 0,0019 0,0025 1,35E-04 0,002129 6,32 85,17

Difenoconazol 0,0077 0,01 1,83E-03 0,010202 17,98 102,02

Diurom 0,0022 0,0025 1,40E-04 0,002167 6,45 86,7

Famoxadona 0,0036 0,01 1,97E-03 0,010331 19,04 103,31

Fenamidona 0,0054 0,01 2,33E-03 0,011666 19,95 116,66

Fenarimol 0,0017 0,0025 1,35E-04 0,002192 6,14 87,67

Imidacloprido 0,0018 0,0025 1,63E-04 0,002295 7,11 91,82

Indoxacarbe 0,0013 0,005 3,74E-04 0,004634 8,06 92,68

Iprovalicarbe 0,0019 0,0025 2,85E-04 0,002123 13,44 84,93

Metalaxil 0,0038 0,005 3,56E-04 0,004769 7,46 95,39

Tebuconazol 0,0079 0,01 2,03E-03 0,012279 16,55 122,79

Tetraconazol 0,0037 0,005 6,32E-04 0,004767 13,26 95,33

Tiametoxam 0,0012 0,005 5,02E-04 0,004588 10,95 91,76

Triadimefom 0,0055 0,01 1,54E-03 0,010167 15,12 101,67

Triadimenol 0,0012 0,0025 2,24E-04 0,002215 10,09 88,62

LD: Limite de Detecção; LQ: Limite de Quantificação; DP: Desvio Padrão; CV: Coeficiente de Variação;

77

5.3.Análises em amostras reais

Nesta seção são apresentados os resultados das amostras reais analisadas pelo

método validado neste estudo (24 moléculas). As amostras foram codificadas

sequencialmente de A a J e analisadas em duplicata de injeção. Na Tabela 26 estão

apresentados apenas as moléculas que foram quantificadas.

A molécula de Tiofanato Metílico, não inclusa neste método, é um pesticida

autorizado para a cultura de uva, que por sua vez pode se degradar em Carbendazim

resultando em quantificações falso positivas para Carbendazim [103]. Neste contexto os

resultados positivos para Carbendazim são inconclusivos pela falta da molécula de

Tiofanato Metílico no método impossibilitando confirmar se o Carbendazim é oriundo

da degradação do Tiofanato Metílico.

Tabela 26 – LMR e resultados das amostras comerciais (A:J) analisadas pelo método

validado neste estudo

Pesticidas

LMR em diferentes

regiões (mg.L-1

)

Resultados amostras comerciais (mg.L

-1)

Bra

sil

Ja

pão

US

A

Eu

rop

a

A B C D E F G H I J

Acefato NA 5,0 0,2 0,01 0,0338 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD

Carbendazim NA 0,2 NA 0,3 + + - + + + + + + +

Azoxistrobina 1 1 2 2 <LD <LD <LD <LD <LQ <LD 0,0081 <LQ <LD <LD

Metalaxil 0,5 10 2 2 <LD <LD <LD <LD <LD <LD 0,0058 <LD <LD <LD

Tebuconazol 2 10 5 0,5 <LD <LD <LD <LD <LD <LD 0,1085 <LD <LD <LD

NA: Não Autorizado; LQ: Limite de Quantificação; LD: Limite de Detecção

Conforme mostra a Tabela 26, a amostra A apresentou 0,0338 mg.L-1

de

Acefato, estando desta forma, em desacordo com a legislação brasileira que não permite

o uso deste pesticida na cultura de uva, foi possível ainda, detectar Carbendazim na

mesma amostra. As Figura 11 e Figura 12, mostram o TIC (a) e os canais com as

transições de quantificação (c) e de qualificação (b) para Acefato e Carbendazim

respectivamente encontrados na amostra A.

78

Figura 11 – TIC (a) da amostra A e transição de quantificação184143 (c) e

qualificação 18495 (b) para Acefato

Figura 12 - TIC (a) da amostra A e transição de quantificação 192160 (c) e

qualificação 192132 (b) para Carbendazim

Na Figura 13, pode-se observar o TIC (a) e os canais com as transições de

quantificação (c) e de qualificação (b) para Carbendazim encontrados na amostra B.

Figura 13 - TIC (a) da amostra B e transição de quantificação 192160 (c) e


(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

79

Na amostra C não foram encontrados nenhum dos pesticidas em estudo conforme

pode ser observado na Figura 14.

Figura 14 - TIC (a) da amostra C

A amostra D apresentou Carbendazim. Na Figura 15, pode-se observar o TIC (a) e

os canais com as transições de quantificação (c) e de qualificação (b) para Carbendazim

encontrados na amostra D.

Figura 15 - TIC (a) da amostra D e transição de quantificação 192160 (c) e


A amostra E foi positiva para Carbendazim e foi detectada a presença de

Azoxistrobina < que o LQ. Nas Figura 16 e Figura 17 é possível observar o TIC (a) e os

canais com as transições de quantificação (c) e de qualificação (b) para Carbendazim e

Azoxistrobina, respectivamente.

(a)

(a)

(b)

(c)

80

Figura 16 - TIC (a) da amostra E e transição de quantificação 192160 (c) e


Figura 17 - TIC (a) da amostra E e transição de quantificação 404372 (c) e

qualificação 404344 (b) para Azoxistrobina

A amostra F apresentou Carbendazim conforme pode ser observado na Figura 18,

onde se compara o TIC (a) e os canais com as transições de quantificação (c) e de

qualificação (b) do Carbendazim.

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

81

Figura 18 - TIC (a) da amostra F e transição de quantificação 192160 (c) e


Na amostra G, foram quantificadas concentrações de Metalaxil, Azoxistrobina e

Tebuconazole. No entanto, as concentrações encontram-se dentro do LMR aceitável

para o Brasil, Japão, Estados Unidos e Europa. Foi identificada a presença de

Carbendazim. Nas Figura 19, Figura 20, Figura 21 e Figura 22 se pode observar os TIC

(a) e os canais com as transições de quantificação (c) e de qualificação (b) para cada um

dos pesticidas encontrados na amostra G.

Figura 19 - TIC (a) da amostra G e transição de quantificação 192160 (c) e


(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

82


qualificação 280160 (b) para Metalaxil



Figura 22 - TIC (a) da amostra G e canais do íon quantificador 30870 (c) e

qualificador 308124 (b) para Tebuconazol

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

83

A amostra H apresentou 0,0025mg.L-1

de azoxistrobina, dentro dos LMR aceitáveis,

porém apresentou Carbendazim que não é permitido para a cultura de uva. Nas Figura

23 e Figura 24 se pode observar os TIC (a) e os canais com as transições de

quantificação (c) e de qualificação (b) para cada um dos pesticidas encontrados na

amostra H.

Figura 23 - TIC (a) da amostra H e transição de quantificação 192160 (c) e


Figura 24 - TIC (a) da amostra H e transição de quantificação 404372 (c) e


As amostras I e J apresentaram positividade para Carbendazim estando em

desacordo com a legislação brasileira. Nas Figura 25 e Figura 26 é possível observar

os TIC (a) e os canais com as transições de quantificação (c) e de qualificação (b)

para cada um dos pesticidas encontrados nas amostras I e J respectivamente.

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

84

Figura 25 - TIC (a) da amostra I e transição de quantificação 192160 (c) e


Figura 26 - TIC (a) da amostra J e transição de quantificação 192160 (c) e


(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

85

6. CONCLUSÕES

Foi desenvolvido método analítico para a quantificação de multi pesticidas em suco

de uva integral pela técnica de LC-MS/MS. O estudo incluiu testes de otimização das

condições de separação dos analitos por cromatografia líquida. Foram testadas

condições de fragmentação das moléculas, bem como a inserção do monitoramento

segmentado das massas com base no tempo de retenção dos analitos.

Na etapa de análise qualitativa dos analitos e otimização das energias, foram

excluídos do método os seguintes pesticidas: Ditianona, Triclorfon, Ciproconazol,

Dimetomorfe e carbendazim. Os dois primeiros, por se apresentarem muito instáveis às

energias de fragmentação testadas. O Ciproconazol e o Dimetoforme por apresentarem

isômeros dificultando a quantificação e o Carbendazim que foi possível apenas realizar

a análise qualitativa. A inclusão destes pesticidas no método é possível, desde que, seja

realizado novo estudo mais aprofundado para a quantificação.

Dentre os dois procedimentos (AOAC- Official Method 2007.01 e CEN/TC 275

15662:2008) testados para o preparo das amostras, o AOAC foi escolhido para compor

o método. Estatisticamente, as variâncias foram equivalentes entre os dois métodos

testados, no entanto, houve diferença significativa entre as médias das respostas para

Bifentrina, Carbossulfano e Imidacloprido. Houve ainda recuperações abaixo do critério

de aceitação da SANCO (70 – 120%) para Bifentrina (62,25%) e Carbossulfano

(19,34%) quando utilizado o método CEN/TC 275 15662:2008.

O método foi validado internamente no laboratório por meio do estudo da

linearidade, seletividade, efeito matriz, precisão, recuperação, LD e LQ. A linearidade

do método foi avaliada utilizando o MMQP e verificada avaliando o r2. Para todas as

substâncias analisadas, o r2 ficou acima do critério de aceitação do INMETRO de 0,90.

O método apresentou-se seletivo e isento de efeito da matriz, já que, as respostas

obtidas entre o extrato branco fortificado não diferem estatisticamente das respostas

obtidas da injeção do padrão puro em solução na mesma concentração.

A precisão foi testada em termos de repetitividade e precisão intermediária. Para o

nível baixo de concentração (0,005mg.L-1

), tanto a repê quanto a precisão intermediária

apresentaram CV inferiores ao critério de aceitação de 35% para C < 1 mg/kg.

Igualmente para o nível intermediário (0,01mg.L-1

) e nível alto (2mg.L-1

), tanto a repê

quanto a precisão intermediária apresentaram CV inferiores ao critério de aceitação de

30% para 1 mg.kg-1

≤ C < 10 mg.kg-1

.

86

No parâmetro de recuperação para as duas concentrações testadas 0,005 e 2mg.L-1

, a

Deltametrina apresentou recuperação de 129,63 e 144,75% respectivamente, resultado

superior ao critério de aceitação de 70-120% segundo a SANCO. A molécula de

Fempiroximato também apresentou recuperação superior (130,39%) ao critério de

aceitação, no nível de fortificação de 2mg.L-1

. E a molécula de carbossulfano

apresentou recuperações de 30,31% e 68,78% para os níveis de 0,005 e 2 mg.L-1

respectivamente estando em desacordo com o critério de aceitação.

Os limites de detecção foram calculados baseados nas respostas de amostras

brancas, conforme define o INMETRO. O limite de quantificação, foi definido

considerando os LMR aceitável para cada molécula e pelo menor ponto de concentração

da curva de calibração, os quais foram testados experimentalmente.

Diante dos resultados, pode-se concluir que o método multirresíduos foi validado e

pode ser reproduzido com confiabilidade na rotina do laboratório para a quantificação

dos seguintes pesticidas: Acefato, Clorpirifos, Dimetoato, Trifloxistrobina,

Carbofurano, Azoxistrobina, Bifentrina, Boscalida, Cimoxanil, Clotianidina,

Difenoconazol, Diurom, Famoxadona, Fenamidona, Fenarimol, Imidacloprido,

Indoxacarbe, Iprovalicarbe, Metalaxil, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiametoxam,

Triadimefom, Triadimenol (24 moléculas).

Das amostras comerciais analisadas pelo método validado apenas a amostra A

apresentou resultado insatisfatório as demais apresentaram resultados abaixo do LD ou

dentro dos LMR estabelecidos.

87

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Brasil, limão, lima ácida, maçã, mamão, manga, melão, milho, morango,

pimenta do reino, tomate e uva de que trata o Plano Nacional de Controle de

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96

APÊNDICE A

Figura 27 – TIC (a) e canais com as transições de quantificação 184143 (c) e

qualificação 18495 (b) para ACEFATO

(a)

(b)

(c)

97

Figura 28- TIC (a) e canais com as transições de quantificação 292211 (c) e

qualificação 292181 (b) para TIAMETOXAN

Figura 29 - TIC (a) e canais com as transições de quantificação 256208 (c) e

qualificação 256175 (b) para IMIDACLOPRIDO

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

98


qualificação 250169 (b) para CLOTIANIDINA


qualificação 230171 (b) para DIMETOATO

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

99


qualificação 199110 (b) para CIMOXANIL


qualificação 222165 (b) para CARBOFURAN

(a)

(b)

(c)

100

Figura 34 - TIC (a) e canais com as transições de quantificação 23372,1 (c) e

qualificação 233159 (b) para DIURON


qualificação 280160 (b) para METALAXIL

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

101

Figura 36 -TIC (a) e canais com as transições de quantificação 404372 (c) e

qualificação 404344 (b) para AZOXISTROBINA


qualificação 312236 (b) para FENAMIDONA

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

102


qualificação 343271 (b) para BOSCALIDA


qualificação 294225 (b) para TRIADIMEFON

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

103


qualificação 321202 (b) para IPROVALICARB

(a)

(b)

(c)

104


qualificação 29699 (b) para TRIADIMENOL


qualificação 37270 (b) para TETRACONAZOL

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

105


qualificação 33181 (b) para FENARIMOL


qualificação 308124 (b) para TEBUCONAZOL

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

106


qualificação 406337 (b) para DIFENOCONAZOL


qualificação 392238 (b) para FAMOXADON

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

107


qualificação 409145 (b) para TRIFLOXISTROBINA


qualificação 528203 (b) para INDOXACARBE

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

108


qualificação 349293 (b) para CLORPIRIFOS


qualificação 422135 (b) para FENPIROXIMATO

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

109


qualificação 523181 (b) para DELTAMETRINA


qualificação 381160 (b) para CARBOSULFANO

(a)

(b)

(c)

(a)

(b)

(c)

110


qualificação 440166 (b) para BIFENTRINA


qualificação 192132 (b) para CARBENDAZIN

(a)

(b)

(c)

111

APÊNDICE B

Figura 55 - CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r

2) para ACEFATO no



2) para TIAMETOXAN no



2) para IMIDACLOPRIDO no


112


2) para CLOTIANIDINA no



2) para DIMETOATO no



2) para CARBOFURANO no


113


2) para CIMOXANIL no



2) para METALAXIL no



2) para DIURON no intervalo


114


2) para AZOXISTROBINA no



2) para FENAMIDONA no



2) para BOSCALIDA no


115


2) para TRIADIMEFON no



2) para TRIADIMENOL no



2) para IPROVALICARBE no


116


2) para TETRACONAZOLE

no intervalo de concentração de 0,005 – 2 mg.L-1


2) para FENARIMOL no



2) para TEBUCONAZOL no


117


2) para FAMOXADONA no



2) para DIFENOCONAZOL



2) para INDOXACARBE no


118


2) para

TRIFLOXISTROBINA no intervalo de concentração de 0,005 – 1 mg.L-1

Figura 77- CCAS - y= ax+b, coeficiente de correlação (r

2) para CLORPIRIFOS no



2) para FENPIROXIMATO


119


2) para DELTAMETRINA no



2) para CARBOSULFAN no



2) para BIFENTRINA no


120

APÊNDICE C

Tabela 27 - Etapas de extração e limpeza da amostra utilizando QuEChERS pelo

método AOAC-2007.01

Etapa 1 Etapa 2

Etapa 3 Etapa 4

Etapa 5 Etapa 6

Etapa 7 Etapa 8

121

APÊNDICE D


concentração para ACEFATO


concentração para AZOXISTROBIN

-2500,000

-2000,000

-1500,000

-1000,000

-500,000

0,000

500,000

1000,000

1500,000

2000,000

2500,000

3000,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

-150000,000

-100000,000

-50000,000

0,000

50000,000

100000,000

150000,000

200000,000

0,005 0,105 0,205 0,305 0,405 0,505 0,605 0,705 0,805 0,905 1,005 1,105 1,205 1,305 1,405 1,505 1,605 1,705 1,805 1,905

122


concentração para BIFENTRINA


concentração para DELTAMETRINA

-500,000

-400,000

-300,000

-200,000

-100,000

0,000

100,000

200,000

300,000

400,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

-800,000

-600,000

-400,000

-200,000

0,000

200,000

400,000

600,000

800,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

123


concentração para DIMETOATO


concentração para FENPIROXIMATO

-4000,000

-3000,000

-2000,000

-1000,000

0,000

1000,000

2000,000

3000,000

4000,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

-8000,000

-6000,000

-4000,000

-2000,000

0,000

2000,000

4000,000

6000,000

8000,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

124


concentração para TRIFLOXISTROBINA


concentração para CARBOSULFANO

-20000,000

-15000,000

-10000,000

-5000,000

0,000

5000,000

10000,000

15000,000

20000,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

-15000,000

-10000,000

-5000,000

0,000

5000,000

10000,000

15000,000

20000,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

125


concentração para CLOTIANIDINA


concentração para FENARIMOL

-800,000

-600,000

-400,000

-200,000

0,000

200,000

400,000

600,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

-400,000

-300,000

-200,000

-100,000

0,000

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000

600,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

126


concentração para IMIDACLOPRIDO


concentração para IPROVALICARBE

-600,000

-400,000

-200,000

0,000

200,000

400,000

600,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

-15000,000

-10000,000

-5000,000

0,000

5000,000

10000,000

15000,000

20000,000

25000,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

127


concentração para TRIADIMENOL


concentração para CIMOXANIL

-1500,000

-1000,000

-500,000

0,000

500,000

1000,000

1500,000

2000,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

-15000,000

-10000,000

-5000,000

0,000

5000,000

10000,000

15000,000

20000,000

25000,000

30000,000

35000,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

128


concentração para DIURON


concentração para CLORPIRIFOS

-20000,000

-10000,000

0,000

10000,000

20000,000

30000,000

40000,000

50000,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

-5000,000

-4000,000

-3000,000

-2000,000

-1000,000

0,000

1000,000

2000,000

3000,000

4000,000

0,005 0,105 0,205 0,305 0,405 0,505 0,605 0,705 0,805 0,905 1,005 1,105 1,205 1,305 1,405 1,505 1,605 1,705 1,805 1,905 2,005

129


concentração para METALAXIL


concentração para INDOXACARBE

-25000,000

-20000,000

-15000,000

-10000,000

-5000,000

0,000

5000,000

10000,000

15000,000

20000,000

0,005 0,105 0,205 0,305 0,405 0,505 0,605 0,705 0,805 0,905 1,005 1,105 1,205 1,305 1,405 1,505 1,605 1,705 1,805 1,905 2,005

-3000,000

-2500,000

-2000,000

-1500,000

-1000,000

-500,000

0,000

500,000

1000,000

1500,000

0,005 0,105 0,205 0,305 0,405 0,505 0,605 0,705 0,805 0,905 1,005 1,105 1,205 1,305 1,405 1,505 1,605 1,705 1,805 1,905 2,005

130

Figura 100 - Gráfico de dispersão dos resíduos das respostas instrumentais em função

da concentração para TETRACONAZOL


da concentração para TIAMETOXAM

-20000,000

-15000,000

-10000,000

-5000,000

0,000

5000,000

10000,000

15000,000

20000,000

25000,000

0,005 0,105 0,205 0,305 0,405 0,505 0,605 0,705 0,805 0,905 1,005 1,105 1,205 1,305 1,405 1,505 1,605 1,705 1,805 1,905 2,005

-4000,000

-3000,000

-2000,000

-1000,000

0,000

1000,000

2000,000

3000,000

4000,000

0,005 0,105 0,205 0,305 0,405 0,505 0,605 0,705 0,805 0,905 1,005 1,105 1,205 1,305 1,405 1,505 1,605 1,705 1,805 1,905 2,005

131

Figura 102- Gráfico de dispersão dos resíduos das respostas instrumentais em função

da concentração para FAMOXADON


da concentração para FENAMIDONE

-8000,000

-6000,000

-4000,000

-2000,000

0,000

2000,000

4000,000

0,01 0,51 1,01 1,51 2,01 2,51 3,01 3,51 4,01 4,51 5,01

-15000,000

-10000,000

-5000,000

0,000

5000,000

10000,000

15000,000

20000,000

25000,000

0,01 0,51 1,01 1,51 2,01 2,51 3,01 3,51 4,01 4,51 5,01

132


da concentração para DIFENOCONAZOLE


da concentração para DIMETOMORFE

-15000,000

-10000,000

-5000,000

0,000

5000,000

10000,000

15000,000

20000,000

25000,000

0,01 0,51 1,01 1,51 2,01 2,51 3,01 3,51 4,01 4,51 5,01

-30000,000

-20000,000

-10000,000

0,000

10000,000

20000,000

30000,000

0,01 0,51 1,01 1,51 2,01 2,51 3,01 3,51 4,01 4,51 5,01

133

Figura 106- Gráfico de dispersão dos resíduos das respostas instrumentais em função

da concentração para TEBUCONAZOL


da concentração para TRIADIMEFON

-8000,000

-6000,000

-4000,000

-2000,000

0,000

2000,000

4000,000

0,01 0,51 1,01 1,51 2,01 2,51 3,01 3,51 4,01 4,51 5,01

-10000,000

-5000,000

0,000

5000,000

10000,000

15000,000

0,01 0,51 1,01 1,51 2,01 2,51 3,01 3,51 4,01 4,51 5,01

134


da concentração para CARBOFURAN

-15000,000

-10000,000

-5000,000

0,000

5000,000

10000,000

15000,000

0,0025 0,1025 0,2025 0,3025 0,4025 0,5025 0,6025 0,7025 0,8025 0,9025 1,0025

135

ANEXO 1

Tabela 28 - Relação de Agrotóxicos autorizados pelo sistema AGROFIT do MAPA

para a cultura de uva

Nome Grupo químico Classe

1 Abamectina Avermectina Acaricida/Inseticida

2 Ácido giberélico Giberelina Regulador de Crescimento

3 Ametrina Triazina Herbicida

4 Azoxistrobina Estrobilurina Fungicida

5 Bacillus thuringiensis Biológico Inseticida Microbiológico

6 Benalaxil Acilalaninato Fungicida

7 Bifentrina Piretróide Acaricida/Formicida/Inseticida

8 Boscalida Anilida Fungicida

9 Brometo de metila Alifático halogenado

Formicida/Fungicida/Herbicida/Inseticida/Nematicida

10 Captana Dicarboximida Fungicida

11 Carbosulfano Metilcarbamato de benzofuranila Acaricida/Inseticida/Nematicida

12 Cianamida Carbimida Regulador de Crescimento

13 Cimoxanil Acetamida Fungicida

14 Ciproconazol Triazol Fungicida

15 Clorotalonil Isoftalonitrila Fungicida

16 Clotianidina Neonicotinóide Inseticida

17 Cresoxim-metílico Estrobilurina Fungicida

18 Dicloreto de paraquate Bipiridílio Herbicida

19 Difenoconazol Triazol Fungicida

20 Dimetomorfe Morfolina Fungicida

21 Ditianona Quinona Fungicida

22 Diurom Uréia Herbicida

23 Enxofre Inorgânico Acaricida/Fungicida

24 Etefom Etileno (precursor de) Regulador de Crescimento

25 Famoxadona Oxazolidinadiona Fungicida

26 Fenamidona Imidazolinona Fungicida

27 Fenarimol Pirimidinil carbinol Fungicida

28 Fentiona Organofosforado Acaricida/Cupinicida/Formicida/Inseticida

29 Fluopicolide Benzamida Fungicida

30 Folpete Dicarboximida Fungicida

31 Fosetil Fosfonato Fungicida

32 Glifosato Glicina substituída Herbicida

33 Glifosato-sal de isopropilamina

Glicina substituída Herbicida

34 Glufosinato - sal de amônio

Homoalanina substituída Herbicida/Regulador de Crescimento

35 Hidróxido de cobre Inorgânico Bactericida/Fungicida

36 Imibenconazol Triazol Fungicida

37 Imidacloprido Neonicotinóide Inseticida

38 Indoxacarbe Oxadiazina Inseticida

39 Iprodiona Dicarboximida Fungicida

40 Iprovalicarbe Carbamato Fungicida

http://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/!ap_ing_ativo_detalhe_cons?p_id_ingrediente_ativo=2



























































































































136

41 Lambda-cialotrina Piretróide Inseticida

42 Mancozebe Alquilenobis(ditiocarbamato) Acaricida/Fungicida

43 Manebe Alquilenobis(ditiocarbamato) Fungicida

44 Metalaxil-M Acilalaninato Fungicida

45 Metconazol Triazol Fungicida

46 Metiram Alquilenobis(ditiocarbamato) Fungicida

47 Miclobutanil Triazol Fungicida

48 Óleo mineral Hidrocarbonetos alifáticos Acaricida/Adjuvante/Fungicida/Inseticida

49 Orizalina Dinitroanilina Herbicida

50 Oxicloreto de cobre Inorgânico Bactericida/Fungicida

51 Óxido cuproso Inorgânico Bactericida/Fungicida

52 Paraquate Bipiridílio Herbicida

53 Piraclostrobina Estrobilurina Fungicida

54 Pirazofós Fosforotioato de heterociclo Fungicida/Inseticida

55 Pirimetanil Anilinopirimidina Fungicida

56 Piriproxifem Éter piridiloxipropílico Inseticida

57 Procimidona Dicarboximida Fungicida

58 Propinebe Alquilenobis(ditiocarbamato) Fungicida

59 Quinometionato Quinoxalina Acaricida/Fungicida

60 Simazina Triazina Herbicida

61 Sulfato de cobre Inorgânico Bactericida/Fungicida

62 Sulfosato Glicina substituída Herbicida

63 Tebuconazol Triazol Fungicida

64 Tiametoxam Neonicotinóide Inseticida

65 Tiofanato-metílico Benzimidazol (precursor de) Fungicida

66 Triadimefom Triazol Fungicida

67 Triadimenol Triazol Fungicida

68 Triclorfom Organofosforado Acaricida/Inseticida

69 Triflumizol Imidazol Fungicida

70 Zeta-cipermetrina Piretróide Inseticida

71 Zoxamida Benzamida Fungicida

Fonte: http://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons. Consulta em: 11/2014






























































































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