UNIVERSIDAD DR. JOSÉ MATÍAS DELGADO RED BIBLIOTECARIA … · 2013. 5. 30. · más estudiadas:...
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[Escribir texto] UNIVERSIDAD DR. JOSÉ MATÍAS DELGADO RED BIBLIOTECARIA MATÍAS DERECHOS DE PUBLICACIÓN Basados en El Reglamento de Graduación de la Universidad Dr. José Matías Delgado Capítulo VI, Art. 46 “Los documentos finales de investigación serán propiedad de la Universidad para fines de divulgación” Publicado bajo la licencia Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual de Creative Commons http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/ Se permite copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra siempre que se especifique el autor y el nombre de la publicación y sin objetivos comerciales, y también se permite crear obras derivadas, siempre que sean distribuidas bajo esta misma licencia Para cualquier otro uso se debe solicitar el permiso a la Universidad
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[Escribir texto]
UNIVERSIDAD DR. JOSÉ MATÍAS DELGADO
RED BIBLIOTECARIA MATÍAS
DERECHOS DE PUBLICACIÓN
Basados en
El Reglamento de Graduación de la Universidad Dr. José Matías Delgado
Capítulo VI, Art. 46
“Los documentos finales de investigación serán propiedad de la
Universidad para fines de divulgación”
Publicado bajo la licencia Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual de Creative Commons http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/
Se permite copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra siempre que se especifique el autor y el nombre de la publicación y sin objetivos comerciales, y también se permite crear obras derivadas,
siempre que sean distribuidas bajo esta misma licencia
Para cualquier otro uso se debe solicitar el permiso a la Universidad
1
Facultad de Ciencias de la Salud Dr. Luis Edmundo Vásquez
Escuela de Medicina
PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE
DOCTOR EN MEDICINA
Efecto protector de un extracto acuoso de hojas de Bixa orellana vs misoprostol en un modelo de úlceras gástricas inducidas por
indometacina en ratones
AUTORES: Br. Lourdes Montserrat Ángel Melgar
Br. Lourdes María Molina Méndez
ASESOR: Lic. María Teresita Bertolí Avella
PATOLOGO:
Dr. Pablo Escobar
2013
2
AGRADECIMIENTOS
“La realización del presente estudio no hubiera sido posible sin el apoyo de Dios, de
la intersección de Nuestra Madre la Santísima Virgen María, el apoyo desinteresado
de diversas personas a quienes deseamos expresarles nuestros sincero y eterno
agradecimiento, a quienes siempre se han sacrificado por darnos lo mejor, sobre
todo por darnos el ejemplo de lucha y perseverancia para lograr nuestras metas.
A quienes confíaron en nosotros y en nuestras habilidades. Gracias por brindarnos
el apoyo incondicional y por ayudarnos a ponernos de pie las veces que pensamos
que habíamos caído.
A quienes con mucha paciencia compartieron con nosotras sus conocimientos sobre
programas y análisis estadísticos. A quien con su experiencia y amplios
conocimientos patológicos nos ayudó. A quienes siempre nos dan ánimos para
seguir adelante y nos escuchan.
Finalmente, queremos agradecer especialmente a nuestra asesora de tesis y
maestra, por su dedicación, conocimiento y experiencia en el campo de la
investigación; en todo este proceso. Gracias por su ayuda y su tiempo; y, sobre todo,
por el ejemplo de fortaleza e integridad que siempre nos ha brindado.”
3
Contenido I. Planteamiento del Problema ............................................................................................................. 6
II. Justificación ........................................................................................................................................ 9
III. Marco Teórico .................................................................................................................................. 11
3.1. Fisiología gástrica ........................................................................................................................ 11
3.2. Anatomía del estómago ............................................................................................................... 11
3.3. Defensa de la mucosa Gastroduodenal. ....................................................................................... 12
3.4. Enfermedad Ulcero Péptica ......................................................................................................... 15
3.4.1. Epidemiología ........................................................................................................................... 15
3.4.2. Enfermedad ulcero péptica inducida por NSAID. .................................................................... 16
3.4.3. Patogénesis de los AINE en el tracto Gastrointestinal ............................................................. 17
3.4.4. Indometacina ............................................................................................................................ 19
3.4.4.1. Indometacina: efecto oxidativo/ antioxidativo ...................................................................... 20
3.4.5. Diagnóstico de Úlcera Péptica .................................................................................................. 20
3.4.6. Tratamiento de la Úlcera Péptica.............................................................................................. 21
3.4.6.1. Tratamiento Farmacológico ................................................................................................... 21
3.4.6.1.1. Misoprostol ......................................................................................................................... 23
3.4.6.1.2. Omeprazol .......................................................................................................................... 23
3.4.6.2. Tratamiento de Úlcera Gástrica con Medicina Natural ......................................................... 24
3.5. Costos del Tratamiento ................................................................................................................ 24
3.6. Bixa Orellana (Achiote)............................................................................................................... 25
3.6.1 Composición química ................................................................................................................ 25
3.6.1.1. Flavonoides ............................................................................................................................ 26
3.6.2 Tipos de achiote ......................................................................................................................... 27
3.7. Métodos de inducción y medición de úlceras en ratones ............................................................ 27
3.7.1. Modelos .................................................................................................................................... 27
3.7.1.1. Modelo de Úlceras en ratones ............................................................................................... 28
3.7.1.1.1. Anatomía Gástrica de Ratones .......................................................................................... 28
3.7.1.2. Modelo de inducción por Indometacina ................................................................................ 29
3.7.2. Métodos de cuantificación de úlceras gástricas en ratones ...................................................... 29
3.7.2.1 Medición Macroscópica ..................................................................................................... 29
3.7.2.2. Medición Microscópica ......................................................................................................... 30
4
3.7.2.3. Medición bioquímica ............................................................................................................. 31
IV. Objetivos ......................................................................................................................................... 33
4.1. General ...................................................................................................................................... 33
4.2. Específicos ................................................................................................................................ 33
V. Hipótesis ............................................................................................................................................ 34
VI. Metodología ..................................................................................................................................... 35
6.1 Tipo de estudio ............................................................................................................................. 35
Experimental ......................................................................................................................................... 35
6.2 Población ...................................................................................................................................... 35
6.3 Criterios de inclusión .................................................................................................................... 35
6.4 Criterios de exclusión ................................................................................................................... 35
6.5 Dieta ............................................................................................................................................. 36
6.6 Obtención del extracto acuoso de achiote .................................................................................... 36
6.7. Diseño Experimental ................................................................................................................... 36
6.7.1. Fase 1: Estandarización del Modelo ......................................................................................... 37
6.7.2. Fase 2: Efecto Organoprotector ............................................................................................... 37
6.8. Operativización de Variables....................................................................................................... 38
6.9. Procedimientos Experimentales .................................................................................................. 40
6.9.1. Aislamiento ............................................................................................................................... 40
6.9.2. Ayuno ....................................................................................................................................... 41
6.9.3. Administración vía oral de sustancias ...................................................................................... 41
6.9.4. Ligadura pilórica....................................................................................................................... 41
6.9.5. Dislocación Cervical................................................................................................................. 41
6.9.6. Gastrectomía ............................................................................................................................. 42
6.10. Fase Experimental ..................................................................................................................... 42
6.10.1. Fase 1. Estandarización del modelo de inducción de úlceras por indometacina. ................... 42
6.10.2. Fase 2. Organoprotección ....................................................................................................... 43
6.11. Manejo de la Muestra ............................................................................................................... 43
6.11.2. Análisis Macroscópico ........................................................................................................... 43
6.11.3. Análisis Digital ....................................................................................................................... 44
6.12. Análisis Bioquímico ............................................................................................................... 44
6.12.1. TBARS .................................................................................................................................. 44
6.13. Análisis Microscópico ............................................................................................................... 45
6.14. Método de recolección y análisis de la muestra ........................................................................ 45
5
6.14.1. Plan de procesamiento y análisis de datos .............................................................................. 45
6.14.2. Plan de almacenamiento de datos ........................................................................................... 45
6.14.3. Presentación de la información............................................................................................... 46
6.14.4. Consideraciones Éticas ........................................................................................................... 46
VII Resultados .................................................................................................................................... 47
7.1 Estandarización de métodos ....................................................................................................... 47
7.1.1. Estandarización de dosis de Indometacina ............................................................................... 47
7.1.2. Estandarización de filtros para la medición del área total de lesiones ..................................... 48
7.2. Actividad organoprotectora del achiote ...................................................................................... 48
7.2.1. pH gástrico ................................................................................................................................ 49
7.2.2. MDA ......................................................................................................................................... 51
............................................................................................................................................................ 52
7.2.3. Área de lesiones ........................................................................................................................ 52
7.3. Patología y hallazgos macroscópicos .......................................................................................... 53
7.3.1. Hallazgo macroscópico: Hemorragia ....................................................................................... 53
7.3.2. Hallazgos Macroscópicos: Contenido Gástrico ........................................................................ 54
............................................................................................................................................................ 54
7.3.2. Patología ................................................................................................................................... 55
VIII. DISCUSION: ................................................................................................................................. 60
8.1. Estandarización de métodos ........................................................................................................ 60
8.1.1. Caracterización y estandarización del modelo de úlcera inducida por indometacina y
ligadura pilórica .................................................................................................................................. 60
8.1.2. Estandarización de Métodos Bioquímicos ............................................................................... 61
8.1.3. Estandarización de Métodos Digitales ..................................................................................... 61
8.2. Actividad Citoprotectora del Achiote .......................................................................................... 62
8.2.1 pH gástrico ................................................................................................................................. 62
8.2.2. MDA ......................................................................................................................................... 62
8.2.3. Área de lesión ........................................................................................................................... 63
8.3. Patología y Hallazgos Macroscópicos ......................................................................................... 63
IX. CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 64
X. Recomendaciones .............................................................................................................................. 65
XI. Bibliografía ....................................................................................................................................... 66
6
I. Planteamiento del Problema
El uso de varios medicamentos causa muchos síntomas y enfermedades gastrointestinales,
y es importante hacer hincapié en que las enfermedades digestivas son causas importantes
de la morbilidad y la mortalidad en adultos mayores. Los Antiinflamatorios no esteroideos o
AINE (non-esteroidal anti inflamatory Drug NSAID) son uno de los grupos terapéuticos más
utilizados gracias a su efecto anti-inflamatorio, anti-pirético y analgésico; son fácilmente
accesibles sin prescripción médica, lo que conlleva un alto porcentaje de automedicación. A
pesar de que es un grupo de medicamentos útiles, aun cuando son administrados a las
dosis adecuadas y en los pacientes que lo necesiten, presentan un elevado número de
efectos adversos, principalmente relacionados al daño de la mucosa gástrica.(1)
Investigaciones recientes señalan que alrededor de 300 millones de personas alrededor del
mundo utilizan antiinflamatorios no esteroideos, y que 1.2% de la población en USA los
consume diariamente. Además de eso, 100 millones de prescripciones médicas de AINE
son encontradas anualmente. Actualmente, al menos 8% de la población adulta, tiene por lo
menos, una enfermedad crónica, y en su mayoría padecen al menos dos, esto nos lleva a
otro punto de gran relevancia estadística, ya que se calcula que serían aproximadamente
750 millones de personas arriba de 65 años que estarán padeciendo de algún tipo de
enfermedad crónica para el año 2050.(2)
Las complicaciones digestivas: úlcera gástrica sangrante, sangrado de úlcera duodenal,
úlcera péptica sangrante, entre otras, son la causa de 50,000 hospitalizaciones anuales,
1,000-2,500 muertes por año en España (3) y 16,500 muertes por año en Estados Unidos
(4).
Se conoce que los AINE tienen como mecanismo de acción el inhibir a dos tipo de enzimas:
ciclooxigenasa-1 (COX-1) y ciclooxigenasa-2 (COX-2). Por lo que se cree que su efecto
adverso relacionado con daño a la mucosa gástrica es resultado de la inhibición de COX-1
quien es la responsable de la síntesis de prostaglandinas, la cual es responsable de la
agregación plaquetaria y protección de la mucosa gástrica. Por otra parte, gracias a su
efecto de inhibición de la COX-2 es que proveen su efecto antiinflamatorio.(5)
7
La indometacina es un derivado del indol, no esteroideo, fármaco con efecto anti-
inflamatorio, analgésico, y antipiréticos. Se utiliza en el tratamiento de diversas patologías
tales como: espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis reumatoide, gota, bursitis,
tendinitis sinovitis, y otras enfermedades inflamatorias, debido a su eficaz supresión del
dolor, la fiebre y el edema. La indometacina inhibe las enzimas COX-1 y COX-2,
produciendo daños a la mucosa gástrica por la inhibición de síntesis de PG.(6)
El misoprostol es un análogo de la prostaglandina considerado en muchos estudios como
citoprotector, ya que se ha documentado que disminuye la secreción de ácido de la mucosa
gástrica y aumenta la producción de bicarbonato. Acorde a la FDA su uso está aprobado en
humanos en la prevención de las ulceras gástricas inducidas por AINE(2)
El empleo de plantas con finalidad terapéutica ha sido una práctica que el hombre continúa
hasta hoy, debido a su fácil acceso, bajo costo en cuanto al procesamiento del producto.
Sin embargo el avance de la tecnología, los cambios culturales, determinó que gran parte de
estos conocimientos, se perdieran de forma irreversible, además, los estudios realizados en
cuanto al uso de éstas, aun siguen siendo escasos y pocos cuentan con las suficientes
bases científicas para su uso comercial. (7)
Son muchas las plantas medicinales con propiedades curativas utilizadas en diversas
patologías, entre éstas se encuentran las que poseen propiedad antiulcerosa, siendo las
más estudiadas: Aloe vera (sábila), Indigofera guatemalensis (añil), Solanum tuberosum
(papa), Bixa orellana (achiote). (7)(8)
En el Salvador existen plantaciones industriales de Bixa orellana utilizadas para fines no
médicos. En base a un estudio anterior, se demostró que el extracto de hojas de Bixa
orellana (achiote) posee un efecto citoprotector en ulceras gástricas inducidas por
indometacina; sin embargo en dicho estudio se utilizó el extracto comparándolo con un
inhibidor de bomba de protones (omeprazol), para determinar si el mecanismo de acción era
similar. El resultado final indicó que el extracto de hojas de Bixa orellana tenía tendencia a
poseer efecto citoprotector pero utiliza mecanismos de acción diferente. (7)
8
No se cuentan con estudios suficientes acerca de la eficacia y seguridad del uso del achiote
como protector de la mucosa, ni se conoce si el extracto acuoso del achiote posee un efecto
citoprotector de la mucosa gástrica comparable al del misoprostol.
El misoprostol, análogo de prostaglandina, ha demostrado que reduce el riesgo de úlcera
gástrica secundario al uso de AINE; (9) este estudio tiene como objeto demostrar si el
extracto de hojas de Bixa orellana posee un mecanismo de acción similar al del misoprostol.
¿Se comporta el extracto acuoso de hojas de Bixa orellana con los mismos efectos en la
mucosa gástrica que el misoprostol?
9
II. Justificación
Los países en desarrollo presentan un gran número de problemas de salud, además de la
falta de políticas apropiadas y la dificultad de tener acceso a medicamentos económicos; por
lo que, mucha de su población ha tenido que recurrir a utilizar las plantas medicinales como
solución, para las diferentes enfermedades. (8)
En el 2008, el Ministerio de Agricultura y Ganadería (MAG) invirtió más de 100,000 dólares
para reforzar el apoyo del proceso de agroindustrialización del achiote, en conjunto con la
fundación EDYTRA, del polígono Don Bosco, aumentando el rendimiento agroindustrial con
la re-adecuación de la planta, y modernización del procesamiento del achiote. Actualmente
en el país, existen 200 manzanas de Achiote, principalmente en los departamentos de La
Paz, Morazán y Santa Ana. (10)
Se decidió utilizar Bixa orellana (achiote) en nuestro estudio experimental, siendo esta una
de las plantas más utilizadas en El Salvador. Su fruto es el que se emplea como
condimentos para la comida o en la industria de colorantes; consideramos que se puede
explotar aún más el uso del achiote, demostrando las propiedades curativas de los
extractos obtenidos de sus hojas.
Se tomó la decisión de retomar un estudio realizado por Ancheta y Santamaria de la
Escuela de Medicina de la Universidad Dr. José Matías Delgado año 2011, (7) ya que no se
demostró resultados concluyentes debido a las limitaciones que se presentaron en este
estudio y dada las evidencias aportadas a favor del achiote se decidió continuar el estudio
reparando en los puntos que no se cubrieron en el primero:
1. En este estudio con Bixa orellana agregaremos al modelo de Indometaciona grupo
comparativo con omeprazol y otro grupo comparativo con misoprostol a fin de tener
mayor rango de estudio para evaluar el mecanismo de acción de Bixa orellana.
10
2. Debido que el estudio previo utilizó indometacina (Casa A), se decidió cambiar la
casa farmacéutica, por indometacina (Casa B), ya que la indometacina previamente
utilizada no era lo suficientemente efectiva para provocar ulceras gástricas.
3. En la primera fase del modelo, en la etapa de preparación quirúrgica, se utilizará
ketamina con acepromacina para asegurar el menor dolor que al mismo tiempo
disminuye el estrés durante la ligadura del píloro.
4. Lograr el número de roedores adecuado por grupo, con el objetivo de obtener y
mejorar la significancia estadística para corroborar que los resultados obtenidos en
el estudio mencionado no fuera al azar.
11
III. Marco Teórico
3.1. Fisiología gástrica
El estómago realiza una variedad de funciones que incluyen el almacenamiento de
alimentos, la exposición de los alimentos al ácido gástrico, además provee una barrera que
brinda protección contra agresiones endógenas y exógenas. El sistema nervioso controla el
proceso de coordinación de motilidad gastrointestinal, circulación, absorción, secreción
endócrina y exócrina e inclusive la saciedad, siendo así sus principales blancos las células
del músculo liso, las células de la mucosa secretora, aquellas de la microvasculatura y las
células inmunomoduladoras e inflamatorias. (11)
3.2. Anatomía del estómago
El epitelio que tapiza el estómago está formado por pliegues que contienen fositas gástricas
microscópicas, cada una ramificada a su vez en cuatro o cinco glándulas gástricas formadas
por células epiteliales muy especializadas. (12)
La composición de las glándulas gástricas varía con su localización anatómica. Las que se
encuentran en el cardias comprenden menos del 5% del área glandular gástrica total; la
mayor parte de las glándulas gástricas (75%) Se encuentran dentro de la mucosa oxíntica y
contienen células de cuello mucoso, parietales, principales, endocrinas y enterocromafines.
(12)
El estómago es rico en células productoras de péptidos hormonales, entre ellas las células
similares a las enterocromafines (ELC) que secretan histamina, la cual es el principal
estimulador paracrino de la secreción de ácido. (11)
La secreción ácida gástrica está regulada mediante la interacción de señales endócrinas,
paracrinas y neurocrinas por al menos tres vías mensajeras principales: (a)
gastrinahistamina, (b) Colecistocinina(CCK)-somatostatina y (c) neural, mediante la
Acetilcolina (Ach) y neuropéptidos. (11)
12
3.3. Defensa de la mucosa Gastroduodenal.
La mucosa gástrica se encuentra continuamente expuesta a varios factores y sustancias
nocivas como: acido clorhídrico altamente concentrado, reflujo de sales biliares, alcohol,
drogas y compuestos alimentarios de diferentes temperaturas, pH y osmolaridad, al igual
que sustancias con actividad detergente o citotóxica. También se ha observado que tienen
un factor dañino los productos bacterianos capaces de causar reacciones inflamatorias
locales y sistémicas. (13) (14).
“Defensa de la mucosa” es un término utilizado para describir los factores que permiten que
la mucosa permanezca intacta. La defensa de la mucosa gástrica es multifactorial, esto
incluye defensas locales y mecanismos neurohormonales. (14) La defensa se da por
niveles dependiendo que tanto el daño invada la mucosa. El sistema de defensa de la
mucosa se puede visualizar como una barrera de tres niveles, compuesta por elementos
preepiteliales, epiteliales y subepiteliales. (12)
Fig 1. Tomada de Harrison 16ª edición.
Capitulo 274- Ulcera Péptica y transtornos relacionados. Pág. 1926
13
La primera línea de defensa es una capa de moco y bicarbonato. El moco es secretado por
las células epiteliales de la superficie gastroduodenal, (12) sus constituyentes principales
son grandes glicoproteínas, mucinas y agua. Esta capa de moco es renovada
constantemente y constituye una barrera entre el contenido luminal y la mucosa. (14) (20)
El bicarbonato es secretado por las células epiteliales de superficie de la mucosa
gastroduodenal. (20) Se conoce que el estímulo de la PGE2 en el receptor EP1 estimula la
secreción de bicarbonato; además la secreción de bicarbonato se encuentra estimulada por
el factor liberador de corticotropina, uroganilyn, el ácido luminal, melatonina y la orexina A.
(15)
Las células epiteliales constituyen la siguiente línea de defensa, mediante diferentes
factores. (12) Estas células secretan moco, bicarbonato y generan prostaglandinas,
proteínas de choque térmico (las cuales previenen la desnaturalización proteica y protege
las células contra la injuria), factores péptidos de trébol (TFF´s) y catelicidinas. (14)
En el estómago humano las proteínas TFF1 están expresadas predominantemente en el
epitelio superficial foveolar del cuerpo y antro gástrico. Estos componentes los TFF´s juegan
un papel importante en las vesículas intracelulares secretoras de mucina y en el ensamblaje
de esta. Intervienen en la reparación de la mucosa al estimular la migración celular, inhibir
apoptosis e inflamación, y aumentar la función de barrera del moco. La TFF2 juega un papel
primordial manteniendo la red de mucosa y aumentando la viscosidad del gel mucoso. La
secreción de bicarbonato por la mucosa gástrica es solo del 10% con respecto a la
secreción ácida. (14) (16) (17).
Las células epiteliales se encuentran en constante renovación aproximadamente cada 3 a 7
días (18). Según otras bibliografías varía entre 2-4 días la renovación celular (14). Cuando
ocurre algún daño en la mucosa epitelial, las células remanentes en el borde del daño son
capaces de migrar para ocluir la disrupción creada en el epitelio. Este mecanismo se verifica
en pocos minutos, mientras que el aumento de la proliferación de células lleva un poco más
de horas. (19)
Y la tercera línea es a nivel subepitelial, donde un elaborado sistema microvascular situado
en la capa submucosa es el componente esencial del sistema de defensa y reparación, ya
14
que, suministra HCO3- que neutraliza el ácido generado por la secreción de HCL de las
células parietales, proporciona un aporte adecuado de micronutrientes y oxígeno y elimina
productos tóxicos metabólicos. (12) (11)
El endotelio de la vasculatura gástrica es responsable de la producción de prostaciclina y
óxido nítrico, fundamentales para mantener la viabilidad del epitelio gástrico. Además se
oponen a la acción a sustancias como el tromboxano A2, leucotrieno C4 y endotelina,
sustancias con una fuerte capacidad de vasoconstricción (22). Cuando existe un daño a la
mucosa epitelial como la ácidez gástrica, se produce un marcado aumento en la perfusión
sanguínea de esa zona afectada permitiendo una dilución rápida de la ácidez o agentes
lesivos, que se difunden a través del epitelio. Esta respuesta de hiperemia se produce por
mediación de los nervios aferentes gástricos y se encuentra en parte regulada por el óxido
nítrico, producido por la Oxido nítrico sintasa (4).
Fig. 2. Factores, mediadores y mecanismos de importancia en la fisiopatología de la enfermedad ulcero péptica.
Tomado de: Højgaard L, Mertz Nielsen A, Rune SJ. (20)
15
3.4. Enfermedad Ulcero Péptica
Enfermedad heterogénea atribuible a una serie de factores, que de forma aislada o en
combinación, actúan produciendo un desequilibrio entre los elementos agresivos y
defensivos de la mucosa gastroduodenal, que conlleva a la aparición de lesiones que se
extienden como mínimo hasta la muscularis mucosae, esto ocurre principalmente en el
estómago y región proximal del duodeno. (21)
3.4.1. Epidemiología
Aproximadamente 500,000 personas desarrollan enfermedad ulcero péptica en Estados
Unidos cada año. En un 70% ocurre en las edades entre los 25 y 64 años de edad.(1) La
información sobre prevalencia e incidencia de úlcera gástrica en El Salvador es escasa; en
el Instituto Salvadoreño del Seguro Social (ISSS), las enfermedades gastrointestinales
generales son la tercera causa de hospitalización para el 2010(1); mientras tanto, en el
segundo y tercer nivel de atención del Ministerio de Salud (MINSAL), se realizaron 1,469
ingresos hospitalarios relacionados con gastritis y duodenitis, presentando una tasa de
letalidad de 0.20, tasa de mortalidad 0.04 y 4,250 días de estancia hospitalaria secundario a
los ingresos. (7)
MORBILIDAD MASCULINO FEMENINO TOTAL
Gastritis no especificada 26,075 79,480 105,555
Otras gastritis agudas 3,985 11,972 15,957
Úlcera péptica no especificada como aguda, ni crónica, sin
hemorragia ni perforación
2,031 6,714 8,745
Gastritis crónica no especificada 2,195 6,220 8,415
Tabla 1: Morbilidad de consulta de1º nivel de atención. Tomado de vigilancia epidemiológica de El Salvador
(VIGEPES/2010)
La prevalencia de úlcera en consumidores de NSAID alcanza el 15 al 20%; 1 a 3 % presenta
complicaciones mayores como hemorragia y perforación, 40% de ellos presenta gastritis
erosiva y 15% duodenitis erosiva. Se presume que la acción analgésica y antiinflamatoria de
estos productos enmascara el desarrollo de esta lesión. (22)
16
3.4.2. Enfermedad ulcero péptica inducida por NSAID. Más de 17,000,000 personas en Estados Unidos consumen NSAID de forma diaria,
convirtiéndolos en uno de los más utilizados mundialmente. Existen alrededor de 20 tipos
diferentes de NSAID agrupados en 6 clases diferentes, acorde a su composición química.
(23)
Los síntomas de dispepsia no guardan relación con el cuadro patológico inducido por
NSAID. Más del 80% de los individuos con complicaciones graves por NSAID no tienen
antecedentes de dispepsia. (12)
Es importante identificar a los pacientes que están expuestos a un mayor riesgo de
complicación y muerte por el uso de AINE; entre los factores de riesgo se encuentran:
ancianidad, antecedentes de úlcera, empleo concomitante de glucocorticoides, dosis alta de
AINE, usos de múltiples preparados de éste tipo, empleo concomitante de anticoagulantes, y
enfermedad grave o que afecte múltiples órganos. (12)
Fig. 3. Mecanismos por los cuales los NSAID producen lesión de la mucosa. Tomada de Harrison 16ª edición.
Capitulo 274- Ulcera Péptica y transtornos relacionados.
17
3.4.3. Patogénesis de los AINE en el tracto Gastrointestinal
ANTIINFLAMATORIO NO ESTEROIDEOS (AINE)
Familia Ejemplo Dosis
Salicilato Acetilado Aspirina 325-650 mg cada 4-6h
Salicilato (no acetilado) Diflunisal 500 mg cado 8-12h
Acido propionico Ibuprofeno 400-800 mg cada 6h
Naproxeno 250mg cada 8 hora
Ketoprofeno 25-50 mg cada 6-8h
Acido Acetico Diclofenac 50mg cada 8h
Sulindaco 150-200mg cada 12h
Indometacina 25-50mg cada 8-12h
Oxicams Meloxicam 7.5-15mg cada 24h
Piroxicam 10-20 mg cada día
Fenamatos Ácido Mefenamico 250mg cada 6h
Tabla 2. Antiinflamatorios No Esteroideos. Uptodate 2012
Farmacocinetica: En su mayoría son absorbidos casi completamente, con poco efecto del
primer paso, y está estrechamente unido a proteínas del suero con pequeños vólumenes de
distribución. (23)
Interacciones: con diferentes grupos: anticoagulantes, antiplaquetarios, antihipertensivos,
digoxina, diuréticos, glucocorticoides, litio, inhibidores selectivos de serotonina,metotrexate,
entre otros.(23)
El principal mecanismo causante de los efectos adversos del tracto gastrointestinal superior
asociados a AINE, es la inhibición sistémica de la síntesis de prostaglandinas, que se
encuentran involucradas en la reparación y defensa de la mucosa gastrointestinal. (12)
La lesión de la mucosa se produce también como consecuencia del contacto tópico con los
AINE. El ácido acetilsalicílico y muchos otros AINE son ácidos débiles que se mantienen en
18
forma lipófila no ionizada cuando se encuentran con el medio ácido del estómago. En estas
condiciones, los AINE emigran a través de las membranas lípidas de las células epiteliales,
provocando lesión celular cuando son atrapados intracelularmente en forma ionizada. Los
AINE por vía tópica también pueden alterar la capa de moco superficial, permitiendo la
retrodifusión de H+ y pepsina, lo que incrementa la lesión de las células epiteliales. (12) (23)
Las prostaglandinas son derivados del ácido araquidónico por la fosfolipasa A2 e isoenzimas
ciclooxigenasa. Entre los principales efectos de los AINE es inhibir a la ciclooxigenasa
(prostaglandina sintasa) que a su vez impide que el acido araquidonico se transforme a
prostaglandinas, prostaciclinas, o tromboxanos. (Fig. 4) (24)
La COX 1 se expresa constitutivamente en muchos tejidos produciendo prostanoides, que
están envueltos en la defensa y reparación de la mucosa gastrointestinal, agregación
plaquetaria y la trombosis, además de algunas vías de la regulación del dolor del sistema
nervioso central.
Fig. 4 Sintesis de tromboxanos y prostaglandinas PG: prostaglandinas, Tx: Tromboxanos
Up to date 2012
19
La COX 2 también se expresa constitutivamente en tejidos como el endotelio vascular, riñón
y algunas zonas del sistema nervioso central, pero puede ser inducida en muchos tejidos y
en los leucocitos en respuesta a un estímulo inflamatorio. (25)
Los AINE al inhibir COX 1, la cual se encuentran involucradas en la reparación y defensa de
la mucosa gastrointestinal, altera la barrera mucosa protectora frente al ácido gástrico. (25)
Este ácido, junto a la acción corrosiva de la pepsina, exacerba y potencia el daño mucoso
gástrico, iniciado por el efecto de la inhibición de prostaglandinas. El ácido gástrico
desempeña así, un papel fundamental en el daño gastroduodenal asociado a los AINES.
(22)
La elevación del pH intragástrico por encima de 4, es por tanto, clave en el tratamiento y
prevención de los efectos adversos del tracto gastrointestinal superior, vinculados al uso de
AINES. (22)
3.4.4. Indometacina
La indometacina es un fármaco antinflamatorio no esteroideo, derivado del indol, con efecto
antinflamatorio, analgésico y antipirético. En cuanto al mecanismo de acción, esta, actúa a
nivel de la síntesis de prostaglandinas, inhibiendo las enzimas COX-1 y COX-2, la cual es
necesaria para producir daño gástrico, puede ser inhibidor de fosfolipasa A y C, reduce la
migración de los neutrófilos y disminuye la proliferación de células T y B.6 (5)
La indometacina es un fármaco de primera opción para producción de úlceras en modelos
experimentales, ya que posee un alto potencial ulcerogenico en comparación con otros
AINE. (30)
Además de sus efectos sobre la producción de PG, la indometacina ha demostrado ser un
agonista de los receptores de prostaglandina D2 (DP), y la activación de estos
receptores promueve la quimiotaxis de las células Th2, eosinófilos, y basófilos, así como la
desgranulación de los eosinófilos y la liberación de citoquinas de las células Th2. (30)
20
En estudios han demostrado que los daños en el tejido gástrico producidos por
indometacina presentan parámetros reducidos de antioxidantes. El daño a la mucosa
gástrica se produce a través del aumento de mieloperoxidasa (MPO) y de malondialdehido
(MDA). La medición de los niveles de peroxidación lipídica es utilizada para determinar el
daño oxidativo. La peroxidación lipídica es una razón de daño importante para la membrana
de la célula; MDA es el producto final de la peroxidación de lípidos y se utiliza para indicar el
nivel de la peroxidación de lípidos. (5) (30)
3.4.4.1. Indometacina: efecto oxidativo/ antioxidativo
En la etiopatogenia de las ulceras gástricas inducidas por indometacina se ha encontrado
que existe relación de los radicales libres de oxigeno con la formación de las ulceras
gástricas. (30)
Indometacina produce daño gástrico via incrementando la mieloperoxidación de mucosa
(MPO) y malondialdehido (MDA). Dos horas posterior a administrar indometacina hay un
aumento en la producción de radicales tóxicos de oxigeno (superóxido y peróxido de
hidrógeno) en la mucosa gástrica. (5)
Las células fagociticas causan producción descontrolada de reactivos oxigeno como los
aniones superoxidos y radicales de hidroxilo. Por lo que, su medida ayuda a medir y
determinar el daño oxidativo en tejido gástrico. (5)
El MDA es el producto final de la peroxidación de los lípidos, y también esta utilizado para
indicar el nivel de peroxidación lipidica. (5)
3.4.5. Diagnóstico de Úlcera Péptica
Actualmente se basa en la historia clínica, exámenes endoscópicos y radiológicos (utilizando
papilla de sustancia baritada). Este último brinda un adecuado medio diagnóstico, mediante
la secuencia de imágenes por relleno y a doble contraste bajo visión fluoroscópica. Sin
embargo se puede aplicar una terapéutica empírica en personas menores de 45 años sin
factores de riesgo para ulcera péptica. (12)
21
Específicamente para úlceras pépticas inducidas por AINES se toman como factores de
riesgo importantes: dosis altas, uso concomitante de 2 ó más AINES, enfermedad
comórbida, historia de úlcera sangrante previa, co-tratamiento con esteroides o
anticoagulantes y, la infección concurrente por H. pylori. (4)
3.4.6. Tratamiento de la Úlcera Péptica
3.4.6.1. Tratamiento Farmacológico Desde el punto de vista farmacológico y atendiendo a su mecanismo de acción son
diferenciables 4 grupos (26)(32):
- Inhibidores de la acidez gástrica (anti ácidos)
- Inhibidores de la secreción gástrica (anti H2, antimuscarínicos, antigastrinas,
inhibidores de la bomba de protones y agonistas de la somatostatina)
- Con efecto antisecretor y protector de la mucosa gástrica (prostaglandinas,
acexamato de zinc)
- Protectores de la mucosa (sucralfato, carbenoxolona y sales de bismuto)
22
Tabla 3. Farmacología de los antiulcerosos. S. Tomás Vecina (26)
Tabla 4. Eficacia de la Terapia antiulcerosa en la patología ulcerosa. S. Tomás Vecina (26)
23
3.4.6.1.1. Misoprostol
El misoprostol es un análogo sintético 15-desoxi-L6-hidroxi-L6-methyaln de prostaglandina
(PGE1). Descubierto en Searle en 1973, el Misoprostol ha sido objeto de una extensa
evaluación clínica de la enfermedad de úlcera péptica y las enfermedades relacionadas. Es
eficaz en la curación de úlceras tanto gástrica y duodenal y para la prevención y curación de
lesiones inducidas por antiinflamatorios no esteroideos. Es la primera prostaglandina a estar
disponibles para el tratamiento de la enfermedad de úlcera péptica, y el primer fármaco
encontrado eficaz contra la gastropatía inducida por AINE. (31)
La capacidad de prostaglandina análoga para controlar y prevenir la ulceración gástrica,
conocido como citoprotección, es una propiedad terapéutica muy importante. La PGE1
(misoprostol) y PGE2 análoga han sido estudiadas clínicamente, una vez que se sintetiza
predominantemente por la mucosa gástrica, disminuye la secreción de ácido y bicarbonato.
El uso del misoprostol se ha limitado debido a su efecto como un poderoso abortivo, el cual,
no debe ser utilizado por mujeres embarazadas o las mujeres en edad fertil. (2)
3.4.6.1.2. Omeprazol
Forma parte de los Inhibidores de bomba de protones, H+K+ - ATPasa, que en general son
los más potentes inhibidores de la secreción gástrica. Este es una base débil que actúa
como prodroga y necesita de un ambiente ácido para inhibir a la bomba H+k+ -ATPasa. Su
estructura química es piridilmetilsulfinil benzimidazoles.Una vez activadas por el ácido,
estas se acumularan en los canalículos secretores de las células parietales, donde son
activados a especies de sulfenamidas, las cuales forman uniones disulfito con residuos de
cisteína en la subunidad alfa de H+K+ -ATPasa. Se metabilizan en hígado, este inhibe la
CyP2C19 (aumentado sustratos de diazepam y fenitoina). (2) (32)
En general, es bastante bien tolerado, con un excelente perfil de seguridad. Sus tres
principales efectos adversos relacionados con su uso prolongado son: hipergastrinemia,
atrófia gástrica e hipoclorhidria crónica. (32)
24
3.4.6.2. Tratamiento de Úlcera Gástrica con Medicina Natural
Existen investigaciones referidas a productos naturales que han comprobado efecto sobre la
mucosa gástrica, como por ejemplo la Indigofera Guatemalenses (añil)(27), mate, sangre de
grado, Aloe vera (sábila) (8), Bixa orellana (achiote) (7), entre otras plantas. Una de las
familias de plantas herbáceas más utilizadas para medicina natural es la familia de las
solanáceas, de las cuales algunas utilizadas como tratamiento de ulcera péptica son:
Solanum nigrum (conocido como hierba mora, tabaco cimarrón, entre otros nombres) el cual
tiene propiedades antiulcerogénicas y de curación de úlceras y S. tuberosum (Papa).
3.5. Costos del Tratamiento En los Estados Unidos el costo por paciente con ulcera gástrica oscila entre $263 a $866 al
año. El aspecto que implica más costo es el manejo hospitalario que ocupa 62% y los
medicamentos el 35% (28). En nuestro país no hay datos epidemiológicos que reflejen el
costo del tratamiento de úlcera péptica, sin embargo los costos que implican no pueden ser
pagados por la población de escasos recursos. Es allí donde entran las etnoprácticas para
las cuales hay muchas opciones de plantas medicinales, algunas con muchos estudios que
comprueban su eficacia y otras en las cuales no hay muchos datos que respalden su uso.
Las investigaciones demuestran que curar las úlceras toma menos tiempo y cuesta menos
que una décima parte de la cantidad necesaria para dar tratamiento a una úlcera durante
toda una vida (29):
• El tratamiento más extremo, la vagotomía o cirugía para corregir úlceras, cuesta
aproximadamente $17.000 y requiere de 307 días de tratamiento durante un período de
15 años.
• La terapia de mantenimiento con medicamentos para bloquear la producción de ácido
estomacal cuesta aproximadamente $11.000 y requiere de 187 días de tratamiento durante
un período de 15 años. Este enfoque solamente da tratamiento a los síntomas, pero no cura
la úlcera.
• La terapia con antibióticos toma 17 días y cuesta menos de $1.000. En el 90 por ciento de
los pacientes, la úlcera se cura completamente y no reaparece.
25
3.6. Bixa orellana (Achiote)
El achiote pertenece a la familia bixácea; Es una planta originaria de América tropical.
Sinonimos: annatto, bixa americana, annotta. Muy conocida por su sinónimo de annato,
annatto es un pigmento producto de la hoja de achiote, el cual es comúnmente usado como
agente colorante de ünguentos y yesto. Contiene el pigmento bixina, el cual es utilizado en
comida y en la industria de cosméticos (proporcionan colorción amarillo/rojo). (33)
Descripción botánica: árbol de 3-8 m de alto, con tronco leñoso, erecto y ramificado en su
parte superior; forma una copa frondosa. Hojas persistentes, alternas y corvadas, evadas o
acorazonadas, lisas y puntiagudas, largamente pedunculadas, con escamitas pardas. Flor
hermafrodita, de tamaño regular de 4 cm de ancho, 5 pétalos color blanco o rosado, se
disponen en panículas terminales. Fruto en cápsula espinosa, que encierra la semilla en su
interior, de 3-4 cm de largo, ovoides o cónicas, café-rojizo o amarillo, pequeñas espinas
lisas. (7)
Actualmente en el país su encuentra en el departamente de La Paz, Santa Ana y Morazán.
Se usa ampliamente en medicina tradicional, y se le atribuyen diversas propiedades
medicinales, como: diuréticas, antidisentérica, antivenérea, hipoglicemiante, antiinflamatorio
prostático y antiulceroso gástrico. (7)
De las extracciones realizadas en las hojas de Bixa orellana, se han obtenido sustancias
químicas como flavonoides, alcaloides, antraquinonas, esteroides, saponinas, que justifican
su uso como planta medicinal.
3.6.1 Composición química
En las hojas encontramos: Bixaganeno, ishwarano (aceite esencial) entre otros mono y
sesquiterpenos; flavonoides: 7-bisulfato de apigenina, 7- bisulfato de luteolina, 8-bisulfato de
hipolaetina, glucósido de apigenina, bisulfato de apigenina, hipoaletina, cosmosiina, entre
otros como: flavonas, antocianidinas y sesquiterpenlactonas; carotenoides: bixina,
norbixina, orelina, β-caroteno, criptoxantina, metilbixina, zeaxantina, luteína; ácido
tomentósico; vitaminas (A, B, y C); proteínas; azúcares; celulosa; grasas; calcio, fierro y
26
fósforo; diterpenos: farnesilacetona, geraniol, geranil formato, alcaloides (vestigios), ácido
gálico (benzenoide) y ácido alfitólico. (34)
3.6.1.1. Flavonoides
Los flavonoides son pigmentos naturales, presentes en los vegetales, que brindan
protección al organismo de daños producidos por agentes oxidantes, el organismo humano
no produce estas sustancias químicas protectoras, por lo que deben de obtenerse mediante
la alimentación o por medio de suplementos. Se encuentran ampliamente distribuidos en
plantas, frutas, verduras y representan componentes sustanciales de la parte no energética
de la dieta humana. (35)
Los flavonoides contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo-
fenólicos y excelentes propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición, lo
que les confiere una gran capacidad antioxidante. Por ello, desempeñan un papel esencial,
frente a los fenómenos de daño oxidativo, y tienen efectos terapéuticos en un elevado
número de patologías, incluyendo la cardiopatía isquémica, ateroesclerosis, el cáncer. (35)
Los flavonoides se encuentran en frutas, verduras, semillas y flores, así como en cerveza,
vino, té verde, té negro y de soya, las cuales son consumidas en la dieta humana de forma
natural. (36)
Se ha identificado más de 5000 flavonoides, entre los que se pueden destacar:
citroflavonoides, isoflavonoides, proantocianidinas y antocianidinas, ácido elágico, catequina
y caenferol. (36)
El creciente interés en los flavonoides se debe a la apreciación de su amplia actividad
farmacológica. Pueden unirse a los polímeros biológicos tales como enzimas,
transportadores de hormonas y ADN; quelar iones metálicos transitororios, tales como
hierro, cobre y zinc, catalizar el transporte de electrones y depurar radicales libres.
Debido a este hecho se han descrito efectos protectores en diferentes patologías, tales
como: úlcera estomacal, duodenales e inflamaciones. (35) (36)
27
3.6.2 Tipos de achiote
a) Por el color de las flores y cápsulas: hay árboles que producen flores blancas con
cápsulas verdes y árboles con flores rosadas y cápsulas en diferentes tonos rojizos.
b) Por la forma de las cápsulas: los árboles pueden diferenciarse unos de otros por la forma
de las cápsulas, siendo éstas redondas, acorazonadas, oblongas, lancetadas, con mucho,
pocos o ningún apéndice o setas.
c) Por el color del pigmento: esta es una característica que puede diferenciarse en los
árboles y se presenta de color rojo o anaranjado.
d) Por la época de floración y cosecha: generalmente la floración y la cosecha de la mayoría
de variedades ocurren en julio y diciembre. Hay otras variedades en las cuales ocurre en
octubre y abril.
e) Por su tolerancia al mildiú: debido a su tolerancia natural a la enfermedad del mildiú
polvoriento, causado por el hongo Oidium bixae Viegas, las variedades de achiote pueden
clasificarse en susceptibles o tolerantes.
f) Por su contenido de bixina.
g) Por el color del tallo: Rojo, café y amarillo (7)
3.7. Métodos de inducción y medición de úlceras en ratones
3.7.1. Modelos
La utilización de modelos animales en la inducción de úlceras gástricas, ha permitido
ampliar los conocimientos en la complejidad y multifactorialidad de las úlceras gástricas. Se
han desarrollado diferentes modelos, lo cuales se enfocan al daño agudo en la mucosa
gástrica; para este objetivos se utilizan sustancias necrotizantes como el etanol, ácidos o
bases fuertes, Antinflamatorios no esteroideos, isquémia o estímulos estresantes. (37)
28
El efecto de las sustancias necrotizantes es a nivel de la mucosa gástrica, provocando
ruptura y desprendimiento del epitelio, además de, congestión vascular. Por esta razón las
sustancias en dichos modelos son administradas por vía orogastrica, por medio de una
cánula.
Los Antinflamatorios No Esteroideos mas utilizados en la inducción de úlceras gástricas son:
aspirina e indometacina, ambos causan daño a nivel local, sin embargo la indometacina
puede provocar úlceras gástricas por mecanismos sistémicos, por medio de la inhibición de
la síntesis de prostaglandinas, perjudicando la microcirculación a nivel de la mucosa
gástrica, promoviendo así, la adición de neutrófilos a la células endoteliales. (37)
3.7.1.1. Modelo de Úlceras en ratones
Las características fisiológicas de la secreción gástrica para humanos, como para ratones,
son similares, presentando inclusive, secreción de ácido y pepsina, con una distribución de
los valores para pepsinógeno sérico en ambos son similares; es de hacer notar que de la
misma forma que sucede en humanos, la formación úlceras, se encuentra determinada por
factores propios del individuo. (37)
3.7.1.1.1. Anatomía Gástrica de Ratones
El tracto intestinal puede medir de la siguiente manera: esófago 4 cm; duodeno, yeyuno e
íleon 34 cm; colon y recto 14 cm.(38)
El estómago se divide en dos grandes regiones, cardíaca, que es la que se encuentra
relacionada al esófago, y la región pilórica está relacionada con el duodeno, ambas
claramente diferenciables, por una línea blanquecina que las divide, y cambios
macroscópicos visibles en la mucosa de ambas
porciones. (38)
Fig. 5. Anatomía del ratón. The Anatomy of the Laboratory Mouse.
29
El pH gástrico en ratones, sin ayuno es de 2.98 (SD 0.3) y en ayunas es de 4.04 (SD 0.2).
(39) La capacidad de volumen del estómago del ratón, es importante para determinar el
parámetro de las dosis orales, para un ratón de 20g el volumen normal de es de 0.4 mL. El
pH gástrico de los humanos oscila entre 1.2 a 1.8. (39) (40)
3.7.1.2. Modelo de inducción por Indometacina
La indometacióna ha sido el primer antinflamatorio no esteroideo utilizado en dichos
modelos, gracias a un mayor potencial ulcerógenico, donde previamente se someten los
animales de experimentación a 12 horas de ayuno sólido y 12 horas de ayuno líquido, para
administrar por medio de cánula orogástrica una solución de indometacina, a dosis de 20-
40mg/Kg de peso. 6 horas después, los animales son sacrificados, para posteriormente
realizar la extracción de la muestra gástrica. (41)
3.7.2. Métodos de cuantificación de úlceras gástricas en ratones
3.7.2.1 Medición Macroscópica
Existen varios métodos para cuantificar el tamaño de las úlceras, entre estos tenemos: los
cuantitativos no sistemáticos, como son la suma de longitudes de las lesiones, o el índice de
úlcera, donde se multiplica el largo por el ancho, obteniendo así el área de la misma. El
problema de estos métodos, es que secundario a la forma irregular a que se presentan las
úlceras, se pierden ciertas áreas con el cálculo realizado. (42)
También existen los métodos sistemáticos, en el cual las muestras son colocadas en una
lámina cuadriculada, midiendo así su tamaño, ya sea a simple vista, con un microscopio o
estereoscópio, las desventajas de estos métodos, son que si bien se obtienen, una mejor
cuantificación del área, toman mucho tiempo, y en el caso del que emplea un estereoscópio,
este queda fuera del alcance de los laboratorios pequeños. (42)
30
Otro método propuesto por Kahn H, este se basa en el empleo del programa de manejo de
imágenes Scion Image Software. (42)(43) Evalúa la intensidad y densidad del área
hemorrágica de una imagen escaneada del estómago de ratones con úlceras inducidas por
etanol e indometacina, el software asigna, una cantidad determinada de pixeles por
distancia lineal (Pxl x mm) determinando el tamaño del área afectada.
La ventaja de este método, es que presenta un bajo costo y una alta eficacia para
determinar el área afectada, no importando lo pequeñas que sean las lesiones.
3.7.2.2. Medición Microscópica
Este método se basa en la preparación de cortes histológicos y su posterior evaluación por
un especialista o patólogo quien da su opinión sobre el daño encontrado. La enorme
desventaja de este método, es que puede dar paso a la subjetividad del observador
Figura 6. Imágenes escaneadas de estómago de ratón con inducción de úlceras con indometacina (A) y etanol (B) (42)
31
especialista y además se requiere de una persona capacitada y con experiencia. Sin
embargo, este método puede ser mejorado mediante una escala que otorga un puntaje a
cada una de las características encontradas en las úlceras gástricas disminuyendo la
subjetividad del evaluador. Un Ejemplo de esta escala diseñada para ratas es la creada por
Morini G. y Grandi D (44).
- Grado 0: Todas las células de la mucosa gástrica se encuentran
intactas.
‐ Grado 1: Las células de la mucosa que se encuentran en la superficie
luminal se encuentran dañadas y parcialmente exfoliadas, las células de
las criptas se encuentran intactas.
‐ Grado 2: Células de la superficie luminal, se encuentran
extensamente dañadas, aunado el daño de las células de las criptas,
mientras las células glandulares se encuentran intactas.
‐ Grado 3: Aunado al daño de las células superficiales y las criptas, se
evidencia el daño en el área parietal de las células glandulares gástricas,
numerosas células exfoliadas y necrosis completa de la capa celular
superficial.
‐ Grado 4: Daño grado 3 severo que se extiende a la porción inferior de
las glándulas y edema de submucosa.
3.7.2.3. Medición bioquímica
Medición del estrés oxidativo: En el pensamiento médico actual está ampliamente
establecido que en momentos de daño tisular en organismos aerobios, se generan especies
reactivas de oxígeno, los cuales pueden provenir de una deficiencia en los mecanismos de
32
eliminación de estas sustancias ó un aumento en su producción. Una acumulación de
especies reactivas de oxígeno puede posteriormente causar peroxidación lipídica, daño de
la membrana celular, ruptura del ADN y degradación proteíca (45).
La medición del estrés oxidativo puede ser de dos formas: Directa: como, su nombre lo
indica, es la medición de las sustancias oxidantes en el cuerpo. Este método posee la
enorme desventaja que las especies reactivas de oxígeno en el cuerpo poseen una vida
media muy corta. El radical hidroxilo posee una vida media de 10(-10) segundos (46). La
espectrometría de la resonancia de la rotación (espín) de electrones es la única técnica
analítica que mide directamente los radicales libres de oxígeno, pero su aplicación en el ser
humano no es factible aún, además se necesita de equipos que son excesivamente caros
(46).
Método Indirecto: consiste en la determinación de productos terminales de la acción
oxidante. Estos productos derivan de la acción de las especies reactivas de oxígeno (ERO)
en las proteínas, ADN y lípidos. Los EROs inducen en la proteínas la acumulación de grupos
44carbonilos, que pueden ser evaluados después de la condensación con 2-
4dinitrofenilhidrazina (2-4 DNFH). Este método es muy prolongado e involucran una gran
cantidad de solventes (41) (46).
Existen aproximadamente 12 productos de degradación del DNA por estrés oxidativo de los
cuales dos han sido utilizados como marcadores: entre ellos tenemos el Timidin glicol (TG) y
8-OH 2-deoxiguanosina. Para ambas sustancias existen kits de ensayo de ELISA para medir
su concentración en tejidos; Sin embargo, la medición de la lipoperoxidación constituye el
valor estándar cuando se trata de la medición de la acción de los radicales libres de oxígeno
en el tejido y existen varias formas de medirlo.
El más conocido se basa en la reacción del ácido tiobarbitúrico, un producto de la
degradación de la oxidación de los fosfolípidos, con el malondialdehido (MDA), formando así
un color susceptible a ser medido por métodos fluorométricos o cromatográficos. (41)
También se pueden medir otros aldehídos procedentes también de la lipoperoxidación,
como el 4 hidroxinonenal o la detección de hidrocarburos volátiles en el aire expirado como
el etano y el pentano; pero la mayor desventaja de estos últimos es que requieren equipo
especializado (46).
33
IV. Objetivos
4.1. General
Demostrar el efecto citoprotector del misoprostol vrs extracto acuoso de las hojas de
Bixa orellana en úlceras gástricas inducidas por indometacina en modelo de ratones
albinos suizos.
4.2. Específicos
Estandarizar los métodos de análisis macroscópicos y bioquímicos.
Comparar la actividad citoprotectora del extracto acuoso de hojas de Bixa Orellana
con misoprostol y omeprazol en ulceras gástricas inducidas por indometacina en
modelo de ratones, mediante estudios macroscópicos, microscópicos y bioquímicos.
34
V. Hipótesis
El extracto acuoso de las hojas de Bixa orellana tienen efecto citoprotector en las
úlceras gástricas inducidas por indometacina en ratones
35
VI. Metodología
6.1 Tipo de estudio
Experimental
6.2 Población
60 ratones heterocigotos derivados de la línea de ratones albinos suizos adultos, de sexo
femenino, criados en las instalaciones del laboratorio de la Universidad Dr. José Matías
Delgado, en un ambiente de 12 horas de luz, con 12 horas de oscuridad, con temperatura
ambiente controlada de 27 ºC; alimentados con comida para perros marca KNINO y agua ad
libitum.
La selección de ratones de un mismo sexo se realizó para disminuir el efecto de la
variabilidad genética, la cual ha sido comprobada en estudios anteriores (27). El sexo
femenino fue seleccionado debido a que los ratones de sexo masculino demuestran una
mayor agresividad lo cual podía causar exclusión de sujetos en estudio por lesiones
causadas entre ellos principalmete durante las 24 horas de ayuno previas al experimento.
Cada uno de los grupos está detallado en la tabla (7)
6.3 Criterios de inclusión
- Ratones albinos suizos mayores de 6 semanas de vida
- Ratones albinos suizos del sexo femenino
- Ratones con 24 horas de ayuno
- Ratones con peso que se encuentre entre 20 – 30 g
6.4 Criterios de exclusión
- Ratones sexo masculino
- Ratones con malformaciones evidentes
- Ratones que se encuentren gestando al momento de la fase experimental
- Ratones que mueran en cualquier etapa del experimento antes de ser sacrificados por
dislocación cervical
36
6.5 Dieta
Para cumplir con los requerimientos estándar en la alimentación de los roedores de
laboratorio, según la formulación AIN-93m, la cual es una de las más utilizadas en los
experimentos de laboratorios, debido a su contenido de proteínas y grasa, que permite el
adecuado crecimiento y mantenimiento del ratón adulto, así como la etapa de embarazo y
lactancia, por lo cual, se eligió el alimento de marca KNINO, de la empresa nacional
TECNUTRAL, debido a su composición es compatible con la dieta antes mencionada. (27)
6.6 Obtención del extracto acuoso de achiote
Las hojas de Bixa orellana, fueron proporcionadas por parte del polígono industrial Don
Bosco, posteriormente se limpiaron y se transportaron al laboratorio.
Se seleccionaron las hojas, las cuales fueron maceradas en un molino de mano. Estas se
colocaron en agua en una relación de 1 g / 10 mL de agua. Dejando reposar por 24 horas en
un recipiente de vidrio, cubierto por papel aluminio, colocándolo posteriormente en un lugar
oscuro a temperatura ambiente. Posterior a eso se sometió a temperatura de 40°C para
eliminar el exceso de agua, el cual se almacenó en frasco cubierto con papel aluminio, a
temperatura de 4°C, hasta el momento de su utilización. (7)
6.7. Diseño Experimental
Durante la crianza de los ratones se dividieron en cajas por sexo, separando ratones
machos de ratones hembra al momento de ser destetado por la madre, para disminuir el
riesgo que se encuentren gestando al momento del experimento.
COMPONENTE DIETA
KNINO AIN-93M
Proteína mínima 18% 17%
Grasa mínima 7% 7%
Fibra mínima 6% 5%
Tabla 5. Componentes de la Dieta.
37
Previo al experimento se transfirieron a jaulas anticoprofágicas 24 horas antes del
experimento, para colocarlos en condiciones de ayuno de sólidos por 24 horas, y 12 horas
sin ingesta de agua.
Al momento del experimento se tomaron los ratones al azar, se les asignó a cada uno un
número, el cual se colocó por igual número de rayas en la cola con marcador permanente;
luego se procedió a trabajar cada grupo experimental, tomando los ratones en orden
numérico.
6.7.1. Fase 1: Estandarización del Modelo
GRUPO N DESCRIPCIÓN INTERVENCIÓN
AINE 10 Grupo de inducción de úlceras
gástricas con Indometacina
24 horas de ayuno
12 horas de ayuno de agua
Indometacina
Ligadura pilórica
TBARS y pH
SANO 5 Grupo control de la mucosa
gástrica normal
24 horas de ayuno
12 horas de ayuno de agua
Ligadura pilórica
TBARS y pH
Tabla 6. Estandarización del modelo.
6.7.2. Fase 2: Efecto Organoprotector
GRUPO N DESCRIPCIÓN INTERVENCIÓN
G1 10 Ligadura pilórica 24 horas de ayuno
12 horas de ayuno de agua
Ligadura pilórica
TBARS y pH
G2 10 Inducción de úlcera gástrica
con Indometacina
24 horas de ayuno
12 horas de ayuno de agua
Indometacina
Ligadura pilórica
TBARS y pH
38
G3 10 Omeprazol + Inducción de
úlcera gástrica con
Indometacina
24 horas de ayuno
12 horas de ayuno de agua
Omeprazol
Indometacina
Ligadura pilórica
TBARS y pH
G4 10 Misoprostol + Inducción de
úlcera gástrica con
Indometacina
24 horas de ayuno
12 horas de ayuno de agua
Misoprostol
Indometacina
Ligadura pilórica
TBARS y pH
G5 10 Extracto acuoso de Bixa
orellana (ahiote) + Inducción
de úlcera gástrica con
Indometacina
24 horas de ayuno
12 horas de ayuno de agua
Extracto acuoso de achiote
Indometacina
Ligadura pilórica
TBARS y pH
Tabla 7. Fase 2. Efecto citoOrganoprotector
6.8. Operativización de Variables
VARIABLE DEFINICIÓN CONCEPTUAL MEDICIÓN INDICADORES
Edad Número de semanas
transcurridas desde el nacimiento
hasta la fecha de estimación,
siendo una semana 7 días
transcurridos
Semanas Número de semanas
Daño a la mucosa
gástrica
Injuria 6 horas posterior a la
administración de indometacina,
100 mg/Kg por cánula en modelo
experimental en ratones
Milímetros
cuadrados
Análisis
macroscópico a
través de scanner
Scion Image
Software
Área total de las
lesiones
Es la sumatoria de la extensión o
superficie de todas las lesiones
producidas.
Milímetros
cuadrados
Cantidad total de
milímetros
cuadrados.
39
Analizadas por Scion
image
Área media de
lesiones
Valor que se obtiene dividiendo la
suma de las áreas de lesión entre
el número de lesiones
Milímetros
cuadrados
Media aritmética del
área de lesión
Máximo Valor máximo obtenido en las
pruebas
Milímetros
cuadrados
Valor máximo de
milímetros cuadrados
Mínimo Valor mínimo obtenido en las
pruebas
Milímetros
cuadrados
Valor mínimo de
milímetros cuadrados
Intensidad de la
lesión
Grados de la lesión
histopatológica
Grados (I-IV) Escala patológica de
Morini y Grandi
Dosis Cantidad de fármaco u otras
sustancias que se administren en
una vez
mg/Kg Volumen
Concentración de
Achiote
Volumen administrado de Bixa
Orellana (0.2ml) por cánula a
animales en experimentación
Mililitros Volumen
Concentración de
sustancia control
de
organoprotección
Cantidad administrada de
misoprostol (2ug/raton),
Omeprazol (30mg/kg) por cánula
administrada a animales de
experimentación
Mililitros Volumen
Organoprotector Compuesto que protege un
órgano de daño tanto por
mecanismos citoprotectores como
gastroprotectores
Milímetros Medición por scaner
Poseer efecto
citoprotector y
gastroprotector
Gastroprotector Compuesto que protege la
mucosa estomacal
Medición de
proteínas totales y
pH y reducción del
área de las lesiones
Citoprotector Compuesto que proteje a las
células por debajo del epitelio
de la mucosa gástrica
Concentración de
ácido
tiobarbitúrico y
medición de pH
Patología
40
Efecto
organoprotector
de Bixa orellana
Disminución de la injuria gástrica
en animales de experimentación
con terapia de bixa Orellana y
alteraciones macroscópicas,
microscópicas y bioquímicas
La diferencia
entre las
variables
analizadas no
seas
estadísticamente
significativas del
grupo control
Medición mediante
análisis
macroscópico,
microscópico y
mediciones
bioquímicas de
lipoperoxidación, pH
y cuantificación de
proteínas totales
Moco Moco de la mucosa gástrica ml Presencia o ausencia
a nivel macroscópico
pH Potencial de hidrogeniones,
medida de acidez o alcalinidad
Unidad pH Rango: 2.5 – 4.5 tira
Y 3.5- 7.0 papel
Tabla 8. Operativización de Variables
6.9. Procedimientos Experimentales
En cada una de las fases, se encuentran procedimientos comunes, los cuales se detallan a
continuación:
6.9.1. Aislamiento
Dependiendo al grupo al que fueron asignados, se colocaron las cajas anticoprofágicas
identificadas respectivamente con el nombre del grupo experimental de cada una de las
fases.
41
6.9.2. Ayuno
El ayuno se realizó durante 24 horas; las primeras 12 horas se retiró el alimento sólido,
permitiéndoles la ingesta de agua; al cumplir ésta primera etapa, se les retiró el agua, para
cumplir las 24 horas de ayuno sólido y 12 horas de líquido.
6.9.3. Administración vía oral de sustancias
Posterior a inmovilizar al ratón, se administró vía orogástrica con cánula rígida de punta
roma, la sustancia respectiva al animal, dependiendo al grupo que pertenece. De la misma
forma que se realizó la inducción de la úlcera gástrica con Indometacina.
6.9.4. Ligadura pilórica
Este procedimiento consta de los siguientes pasos: (47)
Preparación de la región operatoria: a cada ratón se le rasuró el abdomen.
Anestesia: (48) Se administró vía intraperitoneal Ketamina 50mg/ml a dosis de 4-
10mg/kg/dosis + Acepromazina a dosis de 0.15 mg/kg/dosis. (49) (50)
Laparotomía (47)
o Se realizó incisión a nivel de línea media cuidando la hemostasia de los
tejidos
o Se identificó el piloro, para luego ligarlo con seda 4-0.
o Se procedió a cerrar capa muscular con seda 4-0, realizando puntos
continuos.
o Se cerró piel con seda 4-0, realizando puntos continuos.
o Se colocó apósito de gasa.
6.9.5. Dislocación Cervical
Se procedió a colocar al ratón en una base sólida, se colocó una pinza kocher a nivel del
cuello, realizando firme presión sobre la base del cráneo mientras se tiró de la cola del ratón
con fuerza.
42
6.9.6. Gastrectomía Se realizó una incisión de laparotomía abdominal y se extrajo el estómago de cada animal,
pinzando el tercio inferior del esófago y el píloro, efectuando una gastrectomía. El estómago
se seccionó a lo largo de la curvatura mayor para su observación, éste se lavó con solución
salina normal y se cortó en dos porciones, de ellas la primera se colocó en nitrógeno líquido
para su conservación y posterior análisis bioquímico.
La segunda porción se colocó sobre papel plástico transparente, para la digitalización de la
imagen y posterior análisis utilizando al programa Scanner Scion Image Software y
finalmente análisis histopatológico.
6.10. Fase Experimental
6.10.1. Fase 1. Estandarización del modelo de inducción de úlceras por indometacina.
Fig. 7. Diagrama de ubicación y gastrectomía del estómago del ratón.
Fig. 8. Fase 1. Estandarización del modelo
43
6.10.2. Fase 2. Organoprotección
Fig.9. Fase 2. Organoprotección
6.11. Manejo de la Muestra
Se obtuvo el contenido gástrico liberando la ligadura a nivel de cardias gástrico,
introduciendo una micropipeta para medición de pH del contenido.
El estómago se seccionó a lo largo de la curvatura mayor, para su observación,
posteriormente se realizó lavado con solución salina normal, y se colocó en papel plástico
transparente, para su análisis.
Se procedió a realizar análisis macroscópico (ver punto 6.10.2), de ahí, se obtuvo la mitad
del estómago, tomando de referencia lo que antes era la curvatura menor, destinando la
primera muestra para análisis patológico y la segunda para el análisis de lipoperoxidación
con el kit TBARS. (Fig. 7)
6.11.2. Análisis Macroscópico
Se realizó análisis macroscópico por medio de digitalización de imágenes utilizando scaner
EPSON stylus TX 160, el cual fue calibrado previamente, en modo profesional, a resolución
de 600 dpi, para la obtención de imágenes.
N=40
G2 G3
G4
G5
Misoprostol
1h
44
Los estómagos preparados en papel transparente, se colocaron en el plato de scaneo, para
obtener la imagen digital que fue archivada en formato TIFF, codificándola según el grupo y
número, en una base de datos.
6.11.3. Análisis Digital
El análisis se realizó utilizando el programa Scion Image Software, según el procedimiento
descrito por Khan et al (42). Luego de realizar la captura de la imagen, se procedió al
análisis, utilizando el software anteriormente dicho. Utilizando los siguientes parámetros:
Índice de substracción de -125 puntos
Calibración de 12 pixeles = 1 mm
6.12. Análisis Bioquímico
6.12.1. TBARS
Se procedió al procesamiento de la muestra según las siguientes instrucciones del kit
TBARS de la casa Health Care: (51)
Paso 1: se reunió la muestra gástrica
o Preparación de la muestra: se congelo el tejido gástrico en nitrógeno líquido
inmediatamente se trituró en mortero y pistilo preenfriados. Se resuspendió el
tejido en 500 ul de solución salina normal (para evaluar la concentración de
ácido tiobarbiturico en membranas, organelas y núcleos), se colocó en un
mortero de porcelana para su maceración.
Paso 2: se marcó cada tubo de vidrio desechable con el número estándar o del del
ratón y se agregaron
Paso 3: 100 µl de la muestra o del estándar al tubo apropiadamente rotulado
Paso 4: 100 µl de solución SDS (sodium dodecyl sulfate) y se agitó para mezclar el
contenido
Paso 5: se agregó 2.5 mL de TBAR/reactivo buffer con fuerza hacia abajo por los
lados del tubo
Paso 6: se tapó cada tubo con esferas de vidrio y se incubó a 95 ºC por 60 min
Paso 7: se retiró cada tubo de la incubadora y se enfriaron en un baño de hielo por
10 min
45
Paso 8: se centrifugó las muestras a 3000 RPM por 15 minutos
Paso 9: se removió el sobrenadante de las muestras para análisis
Paso 10: se realizó análisis con espectofotómetro: lectura de la absorbancia del
sobrenadante a 532nm
6.13. Análisis Microscópico
Posterior a la digitalización de la imagen del estómago, tres porciones al azar de cada grupo
fueron fijadas en formalina al 10%, y enviada al laboratorio de patología, siendo teñidas con
hematoxilina/eosina donde se realizó y determinó la presencia de lesión, utilizando la escala
patológica diseñada por Morini G. Y Grandi D (44).
Para cada muestra se determinó el total de la longitud de la mucosa examinada, y la
longitud de la mucosa con cada uno de los grados de daño. En cada estómago examinado,
se calculó el promedio de la longitud de la lesión gástrica en las diferentes lesiones de cada
muestra.
6.14. Método de recolección y análisis de la muestra
6.14.1. Plan de procesamiento y análisis de datos
El análisis estadístico se realizó por medio del programa SPSS 16.0 y StatGraphic Ceturion
X donde se utilizaron las pruebas de Normalidad y homegeneidad de Varianzas:
Kolmogorov-Smirnov y Levene,
Ya que se contaba con más de dos variables; para la variable de MDA, pH y los datos
histopatológicos no cumplioeron con algunas de las condiciones para realizar estadísticas
parametricas se utilizó la prueba Kruskal Wallis para comparación de las medianas y se
realizó como post test.
6.14.2. Plan de almacenamiento de datos
El almacenamiento de datos se realizó en el programa de Microsoft Excel 2007, para
Windows 7.
46
6.14.3. Presentación de la información
Se realizaron las gráficas correspondientes con el programa estadístico StatGraphic
Ceturion X y SPSS 16.0 . Además de tablas comparativas con los resultados observados y
según su codificación con ambos programas
6.14.4. Consideraciones Éticas
Para asegurar el uso y cuidado apropiado de los ratones utilizados durante este trabajo, nos
basamos en el documento: “Elementos Esenciales Para Investigación Animal, Una Guía
Para La Investigación Personal, del Centro de Información del Bienestar Animal
Departamento de Agricultura de Estados Unidos Americanos Biblioteca Nacional de
Agricultura”, y a su vez, en el Acta de Bienestar Animal (AWA).
En donde se provoco el mínimo dolor posible, tanto en la aplicación de los medicamentos,
como a la hora de sacrificarlos, previo a la laparotomía y gastrectomía, para el estudio
histopatológico posterior.
Los ratones se separaron durante su crianza en grupos dependiendo de su sexo para evitar
la reproducción entre ellos, y así evitar la probabilidad de utilizar hembras en estado
gestante durante la realización de la fase experimental.
47
VII Resultados
7.1 Estandarización de métodos
7.1.1. Estandarización de dosis de Indometacina
Para poder estandarizar la dosis se utilizó indometacina de dos diferentes casas
comerciales (A y B). La indometacina de la casa A fue utilizada en un estudio previo (7), en
el cual una de las recomendaciones que hicieron es aumentar la dosis que está descrita en
la literatura, de 20-40mg/kg a 68mg/kg, que fue la dosis con la cual pudieron observar
formación de úlceras.
En nuestro estudio se utilizó la indometacina de la casa B, ya que al realizar una
comparación se observó diferencia tanto en solubilidad, como se observa en la Fig.10; Sin
embargo basándonos en los resultados obtenidos en el trabajo de Ancheta Santamaría (7),
se decidió iniciar con una dosis de 90.6 mg/kg.
Fig. 10. Dilución de Indometacina Casa A y Casa B
48
7.1.2. Estandarización de filtros para la medición del área total de lesiones
Esta se realizó ya que el trabajo previo de evaluación de (7) , presentó problemas para la
utilización de este método dada la naturaleza coloreada de estas sustancias . Después de
comparadas las lecturas y reproducidas digitalmente las imágenes se utilizó el filtro 145, ya
que era el que representaba con mayor precisión en la delimitación de las áreas de
lesiones..
7.2. Actividad organoprotectora del achiote
La N consistió de 10 individuos para cada grupo de estudio, siendo un total de 55 individuos,
al momento del experimento fallecieron sujetos debido a las siguientes causas:
‐ Fallecer posteriormente a la administración del anestésico
‐ Fallecer durante el procedimiento de ligadura gástrica
‐Fallecer durante el periodo post operatorio
Posteriormente se incluyeron los sujetos que fallecieron a cada grupo para completar la N
de 10 individuos.
Fig.11. Estandarización de filtros Scion Image , A: Filtro 130, B: Filtro 145
A
B
49
7.2.1. pH gástrico
En nuestro estudio, para medir el pH se utilizó papel pH cuyo rango es de 3.5 – 6.8 y tiras
de pH con rango de 2.5-4.5 de laboratorios Merck. Al procesar todas las muestras, en el
papel pH, al intentar procesar el grupo que catalogamos como sanos, no era
colorimétricamente comparable, por lo que se excluyó en el proceso. El pH tira si pudo
procesar todas las muestras, incluyendo las muestras de los estómagos sanos (Figura 13)
Posterior a esto se utilizó la prueba Kruskal-Wallist, la cual prueba la hipótesis nula de que
las medias de pH tira dentro de cada uno de los 6 niveles de tratamiento son los mismos.
Los datos de todos los niveles se combinan primero y son clasificados desde el más
pequeño al más grande (Tabla 9)
Tratamiento Tamaño Muestra
Rango Promedio
Achiote 10 22.15 Indometacina 9 28.38 Misoprostol 10 30.35 Omeprazol 10 30.15
SHAM 10 32.70 Sanos 4 5.50
Test statistic = 11.9395 P-Value = 0.0356265
Tabla 9. Kruskal-Wallis Test de pH tira para tratamiento.
Figura 12 pH gástrico vs tratamiento. A: pH papel vs tratamiento; B: pH tira
vs tratamiento
50
Basándonos en esto, se procedió a procesar el resultado con Test de rango múltiples, esta
tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar qué medias son
significativamente diferentes de las otras no encontrándose difrencias entre niguno de los
grupos de tratamiento pero si de estos con el grupo control. De los grupos de tratamiento es
el grupo Achiote el que tuvo una tendencia mayor a disminuir el pH (tabla 10)
Method: 95.0 percent LSD
Tratamiento ratones Media Grupos Homogeneos Sanos 4 2.5 X Achiote 10 3.42 X Indometacina 9 3.77778 X Omeprazol 10 3.85 X Misoprostol 10 3.91 X SHAM 10 4.02 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Limites Achiote - Indometacina -0.357778 0.665475
Achiote - Misoprostol -0.49 0.647726
Achiote - Omeprazol -0.43 0.647726
Achiote – SHAM -0.6 0.647726
Achiote – Sanos * 0.92 0.856861 Indometacina - Misoprostol -0.132222 0.665475
Indometacina - Omeprazol -0.0722222 0.665475
Indometacina - SHAM -0.242222 0.665475
Indometacina - Sanos * 1.27778 0.870356 Misoprostol - Omeprazol 0.06 0.647726
Misoprostol - SHAM -0.11 0.647726
Misoprostol - Sanos * 1.41 0.856861 Omeprazol - SHAM -0.17 0.647726
Omeprazol - Sanos * 1.35 0.856861 SHAM – Sanos * 1.52 0.856861
* denotes a statistically significant difference.
Tabla 10. Test de rangos múltiples para pH tira por niveles de Tratamiento
51
7.2.2. MDA La medición de la peroxidación de lípidos de membrana es una medida del daño celular
producto de cada uno de los tratamientos mostró ausencia de diferencias estadísticas
significativas P>0.05
Tratamiento Población Rango
promedio
Achiote 10 23.9
Indometacina 10 28.75
Misoprostol 9 31.7222
Omeprazol 10 21.9
SHAM 10 28.5
Sanos 4 28.75
Prueba estadistica = 2.61015 Valor P = 0.759823
Respecto a su capacidad en la disminución del daño celular, se observó que no existe
diferencia entre grupos de tratamiento respecto al grupo control sano, siendo los grupos
omerazol y achiote los que mostraron una tendencia similar este grupo y los grupos Sham
y Misoprostol los que mostraron mayor tendencia a la producción de lípidos peroxidados
de membrana (Figura 13)
Fig. 13. Concentración de MDA
Ach Indo Miso Ome SHAM Sanos
Means and 95.0 Percent LSD Intervals
Tratamiento
24
29
34
39
44
49
54
Concentr
ació
n M
DA
Tabla 11. Kruskal-Wallis Test de Concentración MDA
para Tratamiento
52
En la figura 14 se resume de manera más práctica la respuesta de los diferentes grupos
respecto a su capacidad para disminuir el MDA. Donde se observa en los grupos
desviaciones estándares grandes; además se ven los grupos no homogéneos.
7.2.3. Área de lesiones
La tabla 12 resume los hallazgos que se encontraron con el programa Scion Image, con
filtro 145.
Tabla. 12. Resumen Estadístico del área de lesiones con filtro 145
Con fin de estandarizar nuestros resultados con scion images, podemos concluir que con el filtro 145 se pudo obtener una información más confiable, ya que era casi equiparable respecto al tejido de estudio, disminuyendo la probabilidad de obtener resultados falsos positivos.
Tratamiento N Promedio Derivacion Estandar
Coeficientede variacion
Minimo Maximo Rango Stnd. skewness
Achiote 10 45.754 7.92686 17.325% 38.69 64.8 26.11 2.24046
Indometacina 10 163.943 77.2124 47.0971% 71.26 334.44 263.18 1.51618
Misoprostol 10 136.315 59.894 43.938% 85.01 276.04 191.03 2.31736
Omeprazol 10 159.729 71.4243 44.7159% 64.81 274.91 210.1 0.462829
SHAM 10 69.325 27.3153 39.4018% 18.06 104.08 86.02 -0.894653
Sanos 3 79.63 5.67915 7.13192% 73.44 84.6 11.16 -0.652012
Total 53 113.01 70.7187 62.5772% 18.06 334.44 316.38 3.6753
Fig. 13. MDA VS TRATAMIENTO
Achiote
Indometacina
Misoprostol
Omeprazol
SHAM
Sanos
Box-and-Whisker Plot
0 20 40 60 80 100
Concentración MDA
Tra
tam
iento
Tabla 12. Resumen estadístico de aérea de lesión en filtro 145
Fig. 14. MDA VS TRATAMIENTO
53
Prueba estadistica = 34.3071 Valor P = 0.0000020683
Tabla 13. Área Total con filtro 145.
7.3. Patología y hallazgos macroscópicos
7.3.1. Hallazgo macroscópico: Hemorragia En base a la gráfica 16 se puede observar que la incidencia de sangrado del grupo de
achiote fue mucho menor que el grupo con misoprostol y fue comparable con el omeprazol.
Tratamiento Muestra Rango promedio
Achiote 10 7.7 Indometacina 10 39.0 Misoprostol 10 35.8 Omeprazol 10 37.5 SHAM 10 16.9 Sanos 3 20.6667
Ach Indo Miso Ome SHAM Sanos
Means and 95.0 Percent LSD Intervals
Tratamiento
80
120
160
200
240
280
Are
a
Tota
l 1
30
Fig. 15. Efecto de los ftros en la medición de las areas totales de lesiones Filtro 130 y 145 .
En las graficaslas iguientes abreviaturas significan Ach: achiote, Indo: Indometacina, Miso:
Misoprostol, Ome: Omeprazol, SHAM: ligadura.
54
7.3.2. Hallazgos Macroscópicos: Contenido Gástrico En la figura 17 se puede observar que en cuanto a contenido gástrico el grupo de achiote presentó abundante cantidad de éste.
Fig. 16. Hemorragia
Fig. 17. Contenido Gástrico
55
7.3.2. Patología
Se tomaron tres muestras de cada grupo de estudio, las cuales se enviaron a patología, para
describir los hallazgos se hizo una sumatoria de las variables de inflamación, hiperemia,
hemorragia y edema, representado como puntaje global siendo éste proporcional al grado de
lesión.
Descriptive Statisticsa
Grupo N Minimum Maximum Mean Std. Deviation
SHAM Inflamación 3 2.00 3.00 2.3333 .57735
Hiperemia 3 2.00 2.00 2.0000 .00000
Hemorragía 3 1.00 2.00 1.3333 .57735
Edema 3 1.00 2.00 1.6667 .57735
Puntaje global
histopatológico 3 6.00 9.00 7.3333 1.52753
Valid N (listwise) 3
Indometacina Inflamación 3 2.00 2.00 2.0000 .00000
Hiperemia 3 1.00 2.00 1.3333 .57735
Hemorragía 3 1.00 1.00 1.0000 .00000
Edema 3 1.00 2.00 1.3333 .57735
Puntaje global
histopatológico 3 5.00 6.00 5.6667 .57735
Valid N (listwise) 3
Omeprazol Inflamación 3 1.00 2.00 1.6667 .57735
Hiperemia 3 1.00 3.00 2.0000 1.00000
Hemorragía 3 1.00 3.00 1.6667 1.15470
Edema 3 1.00 2.00 1.3333 .57735
Puntaje global
histopatológico 3 4.00 9.00 6.6667 2.51661
Valid N (listwise) 3
Misoprostol Inflamación 4 2.00 2.00 2.0000 .00000
Hiperemia 4 1.00 2.00 1.2500 .50000
Hemorragía 4 .00 1.00 .7500 .50000
Edema 4 1.00 2.00 1.2500 .50000
56
Puntaje global
histopatológico 4 4.00 7.00 5.2500 1.25831
Valid N (listwise) 4
Achiote Inflamación 3 1.00 1.00 1.0000 .00000
Hiperemia 3 .00 1.00 .6667 .57735
Hemorragía 3 .00 .00 .0000 .00000
Edema 3 1.00 1.00 1.0000 .00000
Puntaje global
histopatológico 3 2.00 3.00 2.6667 .57735
Valid N (listwise) 3
Añil Inflamación 3 1.00 2.00 1.6667 .57735
Hiperemia 3 1.00 2.00 1.3333 .57735
Hemorragía 3 .00 1.00 .3333 .57735
Edema 3 1.00 1.00 1.0000 .00000
Puntaje global
histopatológico 3 3.00 6.00 4.3333 1.52753
Valid N (listwise) 3
Sanos Inflamación 3 1.00 1.00 1.0000 .00000
Hiperemia 3 1.00 1.00 1.0000 .00000
Hemorragía 3 .00 .00 .0000 .00000
Edema 3 1.00 1.00 1.0000 .00000
Puntaje global
histopatológico 3 3.00 3.00 3.0000 .00000
Valid N (listwise) 3
Test Statisticsa,b
Inflamación Hiperemia Hemorragía Edema
Puntaje global
histopatológico
Chi-Square 15.296 10.275 15.179 6.053 15.185
df 6 6 6 6 6
Asymp. Sig. .018 .114 .019 .417 .019
a. Kruskal Wallis Test
Tabla 14. Puntaje Global de hallazgos patológicos
57
Test Statisticsa,b
Inflamación Hiperemia Hemorragía Edema
Puntaje global
histopatológico
Chi-Square 15.296 10.275 15.179 6.053 15.185
df 6 6 6 6 6
Asymp. Sig. .018 .114 .019 .417 .019
b. Grouping Variable: Grupo
En la figura 18 se muestran las sustancias detectadas como gastrolesivas y las tres
sustancias detectadas como posibles gastroprotectoras con su respectivo porcentaje de
protección tisular en base a concentración de MDA, área de lesión y resultados de patología.
Fig. 18. Puntaje global de resultados de Patología Media e Intervalo 95% LSD. Sham:
Ligadura, Indo: Indometacina, misol: misoprostol, ome: omeprazol
Tabla 15. Consolidación estadística
58
Fig. 19. Hallazgos microscópicos A. Hiperemia B. Inflamación C.
Hemorragia. Media e Intervalo 95% LSD. SHAM: ligadura, Indo:
Indometacina, miso: Misoprostol, ome: Omeprazol
59
Grupos con efecto agresor
PORCENTAJES DE PROTECCIÓN
Grupos con efecto
protector
MDA
AREA DE LESION
PATOLOGIA
IINNDDOOMMEETTAACCIINNAA SSHHAAMM
AACCHHIIOOTTEE OOMMEEPPRRAAZZOOLL MMIISSOOPPRROOSSTTOOLL
MDA
MDA
MDA MDA
pH
MDA
pH
pH pH
pH
16.87%
72.1%
53.01%
-10.33%
16.86%
7.25%
23.86%
2.57%
-17.66%
Lesion Lesion Patologia Patologia
Lesion Lesion Patologia Patologia Lesion Patologia
60
VIII. DISCUSION:
La úlcera gástrica, es una patología con etiología multifactorial, la cual posee diversos
mecanismos muchos de los cuales no están aun perfectamente dilucidados, pero que
poseen una importancia significante para la formación y profilaxis de la misma. (5)
El uso crónico de AINE causa un estímulo nocivo a las células gástricas, el cual puede
progresar hasta la formación de úlceras, para la cual, muchas de las alternativas de
tratamiento, involucran altos costos económicos, lo cual hace difícil para poblaciones de
bajos recursos el obtenerlas. Por esa razón el tratamiento se presta a explorar nuevas
terapias, donde se hace necesario el estudio de sustancias naturales como Bixa orellana. (7)
8.1. Estandarización de métodos
8.1.1. Caracterización y estandarización del modelo de úlcera inducida por
indometacina y ligadura pilórica
El modelo reproducido tiene características similares a los reportados ampliamente en la
literatura ya que la Indometacina es el fármaco de elección para la inducción experimental
de úlceras gástricas e intestinales (5).
El modelo de inducción de úlceras en ratones por indometacina, se encuentra descrito en la
literatura con una dosis de 20‐40 mg/Kg de peso, con resultados óptimos de úlceras en las
muestras histopatológicas de la mucosa gástrica.
Ancheta y Santamaria demostraron que el uso de bicarbonato tiene una acción lesiva, así
además que, a las dos horas se observa presencia de sangre en el contenido gástrico, un
aumento en el área total de las lesiones y elevación de la concentración de MDA.(7) Esto
último se respalda por lo descrito por Suleyman et. al. quien describe que la Indometacina
aumenta la producción de radicales libres a través de la mieloperoxidasa que cataliza la
producción de ácido hipocloro derivado del peróxido de hidrógeno que lleva al aumento de
los niveles de peroxidación lipídica a las dos horas de haber sido administrada (5).
61
La ligadura pilórica por sí sola es capaz de producir estrés oxidativo y daño en la mucosa,
así como se evidencio en los resultados donde reportaban altas concentraciones de MDA,
así como también un aumento en el pH. Bae D.K. et. al. encontraron en modelos de
inducción de úlceras que la ligadura pilórica induce una retención de ácido gástrico que es
secretado por una activación colinérgica y estimula la actividad de la pepsina que resulta
posteriormente en una injuria de la pared gástrica y sangramiento que también se acumula.
(53)
Otros posibles mecanismos de producción de estrés oxidativo es el desacople de las
enzimas cinasas de la cadena respiratoria y el efecto agonista de la Indometacina en el
receptor de prostaglandina D de los PNL’s que estimulan la liberación de histamina (5).
Suleyman et. al. describe que posterior a las dos horas se observa una disminución
significativa del pH por inhibición de las PG, siendo este uno de los elementos
determinantes en la inducción de las ulceras por AINES. (5)(52)
Debido al vaciamiento gástrico hay una disminución del contenido de sangre, lo cual permite
apreciar mejor las imágenes características de las lesiones con patrones lineales finos
asociados a las úlceras inducidas por Indometacina y que son diferentes de las inducidas
por otros agentes como el etanol (44).
8.1.2. Estandarización de Métodos Bioquímicos
El método utilizado por el TBARS Assay-kit para determinar concentracion de MDA es
colorimétrico. Los fabricantes de este kit (Zeptometrix) reconocen que, a pesar que este es
un metodo confiable, el método más sensible para esta medición es el fluorométrico (51).
Esto podría ser una limitante del estudio, ya que no se utilizó por falta de disponibilidad del
mismo, así como otra de las limitantes es el no contar con las herramientas para pesar el
tejido.
8.1.3. Estandarización de Métodos Digitales
El análisis digital que se utilizó para las muestras fue el software Scion Image, quien en sus
especificaciones y la bibliografía consultada, recomiendan utilizar el filtro 125 para detección
de sangre en tejidos, sin embargo, en el estudio de Ancheta y Santamaria (7) demostraron
62
que con el filtro 125 se obtiene un área mayor de lesión, al igual que en el presente estudio
el filtro 130; por lo contrario, al utilizar el filtro 145 el área de lesiones y la desviación
estándar disminuyeron considerablemente (ver figura 11 y 12). Además que dichos
resultados pudieron verse influidos por la acción lesiva del bicarbonato.
8.2. Actividad Citoprotectora del Achiote
8.2.1 pH gástrico
En la literatura encontramos reportado que el pH normal del raton es de 2.98‐4.04 (54), por
lo cual consideramos necesario para menor sesgo utilizar tiras de pH con rango similar.
En base a la tabla 9 podemos observar que el resultado de las tiras de pH de rango 2.5- 4.5
no es estadísticamente significativo, sin embargo podemos observar que el achiote si tiene
efecto protector relacionado a disminuir el pH gástrico en úlceras gástricas inducidas por
indometacina.
Posteriormente se utilizó la prueba de Multiple Range Tests para evaluar los diferentes
grupos, comparando las medias de cada grupo. En la prueba de Multiple Range Tests los
resultados del pH de los tejidos tratados con achiote fue el más cercano al pH de los tejidos
sanos, inclusive con mejor respuesta que el omeprazol.
Ancheta y santamaria (7) al igual que los hallazgos de éste estudio, se comprobó que
achiote permite mantener un ambiente en la luz gástrica cerca del normal, que disminuye el
efecto lesivo de la indometacina.
8.2.2. MDA
El malodialdehido (MDA) es el resultado final del proceso de peroxidación lipidica, lo cual es
a consecuencia del proceso de isquemia-reperfusión, la isquemia produce radicales libres,
los cuales afectan los ácidos grasos de la membrana celular, sufriendo acortamiento de las
cadenas laterales, liberando el ácido malodialcehído (7) (5). La determinación del MDA se
basó en la reacción colorimétrica de los peróxidos lipídicos con el ácido tiobarbiturico, para
dar MDA (51).
63
Nuestros resultados sobre el achiote con el MDA no fueron estadísticamente significativos,
como se puede observar en la tabla 11, sin embargo de manera general, en base a nuestros
resultados, tampoco vimos que tuviera un efecto respecto a la peroxidación lipídica, en
disminuir los niveles de MDA.
8.2.3. Área de lesión
Al ser evaluadas las muestras por programa Scion Image, con los filtros 130 y 145, se
observa que existen variaciones tanto en el área total de lesiones y las desviaciones
estándar, siendo para el filtro 145, los valores del grupo Achiote, Sanos y SHAM los de
menor grado de lesión lo cual coincide con los hallazgos histopatológicos.
8.3. Patología y Hallazgos Macroscópicos
Durante la extracción gástrica, post ligadura pilórica, Se observaron en la totalidad de los
estómagos llenos de contenido gástrico, de una sustancia líquida un poco viscosa diferente
del moco.
Según la literatura, hay autores que sugieren que la gastroprotección encontrada por los
flavonoides se puede explicar a través de un complejo no postaglandino dependiente que
está relacionado en alguna manera en un incremente en el contenido glicoproteico y la
viscosidad de el moco gástrico. (56)
En los resultados de patología se describieron las variables de inflamación, hiperemia y
hemorragia en grados leve, moderada y severa, y edema en presencia o ausencia de éste;
representados por un puntaje global de menor a mayor siendo proporcional al grado de
lesión. Tabulando los resultados estadísticos encontramos diferencia significativa en cuanto
inflamación y hemorragia, por lo que podemos afirmar que el tejido tratado con achiote fue
similar al tejido del grupo sano.
64
IX. CONCLUSIONES
‐ El modelo de inducción de úlceras en ratones por indometacina es efectivo
‐ Scion Image es un método útil para cuantificar lesiones gástricas al utilizar extractos de
plantas con pigmentos coloreados similares a la sangre
‐ El macerado de Bixa orellana tiene tendencia a ser citoprotector
‐ El macerado de Bixa orellana mantiene valores de pH gástrico cercanos a los valores
normales
‐ La ligadura pilórica es un factor que produce estrés tisular
-La dosis de indometacina descrita por la literatura para obtener úlceras gástricas es la
adecuada.
65
X. Recomendaciones
‐ Es necesario obtener un extracto purificado de las hojas de achiote, para poder cuantificar dosis por kilogramo de peso, verificando los rangos de efectividad
‐ Se debe de obtener una caracterización del extracto de las hojas de Bixa orellana
‐ Se recomienda aumentar la N ‐ Para evaluar un posible efecto de cicatrización del achiote, es necesario realizar un modelo de exposición crónica al achiote
‐ Se recomienda comparar muestras de ambos sexos
‐ Se recomienda utilizar el extracto con diferentes modelos de inducción de úlceras
‐ Es necesario la cuantificación de flavonoides del extracto
‐ Realizar un estudio fitoquímico y conocer las concentraciones exactas de las diferentes sustancias
- Se recomienda utilizar Omeprazol de diferente casa comercial
66
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