ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK...

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ Gamze ÖZKALAY

ALFA LİPOİK ASİTİN ÇİPURA (Sparus aurata), HAMSİ (Engrailus engrasichalus) ve PALAMUT (Sarda sarda)’UN PROTEİN KALİTESİNE OLAN ETKİSİNİN İN VİTRO KOŞULLARDA İNCELENMESİ

SU ÜRÜNLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010


ALFA LİPOİK ASİTİN ÇİPURA (Sparus aurata), HAMSİ (Engrailus engrasichalus) VE PALAMUT (Sarda sarda)’UN PROTEİN KALİTESİNE OLAN

ETKİSİNİN İN VİTRO KOŞULLARDA İNCELENMESİ

Gamze ÖZKALAY

YÜKSEK LİSANS TEZİ

SU ÜRÜNLERİ ANABİLİM DALI

Bu tez 04/02/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği ile Kabul Edilmiştir. Bu Tez Enstitümüz Su Ürünleri Anabilim Dalında Hazırlanmıştır.

Kod no:

Bu Çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir.

Proje no: SÜF2009YL7 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirimlerin, Çizelge, Şekil ve Fotoğrafların

kaynak olarak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

……………………………..

Doç.Dr. Bahar KARAKAYA

Danışman

……………………………….

Prof.Dr. Abdurrahman POLAT

Üye

…………………….

Doç.Dr. Elif ORUÇ

Üye

Prof.Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü

I

ÖZ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

ALFA LİPOİK ASİTİN ÇİPURA (Sparus aurata), HAMSİ (Engrailus engrasichalus) ve PALAMUT (Sarda sarda)’UN PROTEİN KALİTESİNE

OLAN ETKİSİNİN İN VİTRO KOŞULLARDA İNCELENMESİ

Gamze ÖZKALAY


SU ÜRÜNLERİ ANABİLİM DALI

Danışman: Doç.Dr. Bahar KARAKAYA Yıl: 2010, Sayfa: 45 Jüri: Doç.Dr. Bahar KARAKAYA Prof.Dr. Abdurrahman POLAT Doç.Dr. Elif ORUÇ

Bu çalışmada, çipura, hamsi ve palamut türlerine Fe+2 katalizli oksitlendirme sistemi kullanılarak bir antioksidan olan alfa lipoik asitin protein kalitesine etkisi araştırılmıştır. Protein oksidasyonunu belirlemek için protein karbonil (nmol karbonil/mg protein) ve protein denatürasyonunu belirlemek için sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılmıştır. Genel lineer model (GLM) kullanılarak yapılan istatistiksel analiz sonucunda, karbonil düzeyini önemli oranda azaltan alfa lipoik asit miktarı çipura için %1 ve palamut için %0.5 olarak tespit edilmiştir. Hamsi için ise %0.5 ve %0.1 düzeylerinde alfa lipoik asit eklemesinin protein karbonil düzeyini önemli oranda azalttığı, fakat %1 düzeyinde alfa lipoik asit eklemesinin protein karbonil düzeyi üzerine önemli bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Protein bantlarının elektroforetik analizi sonucunda, alfa lipoik asitin bir antioksidan olarak protein bantlarının yoğunluğunun muhafazasında önemli bir etkiye sahip olmadığı hatta hamsi ve palamut gibi koyu renkli kasa sahip balıklarda %1 gibi yüksek düzeylerde kullanıldığında prooksidan olarak görev yaptığı saptanmıştır. Anahtar kelimeler: Alfa lipoik asit; Protein oksidasyonu; Protein denatürasyonu; Fe

katalizör

II

ABSTRACT

MSc THESIS

THE IN- VITRO INVESTIGATION OF ALPHA LIPOIC ACID SUPPLEMENTATION ON PROTEIN QUALITY OF SEA BREAM (Sparus aurata), ANCHOVY (Engrailus engrasichalus) AND ATLANTIC BONITO

(Sarda sarda)

Gamze ÖZKALAY

DEPARTMENT OF FISHERIES INSTITUTE OF NATUREL AND APPLIED SCIENCES

UNIVERSITY OF ÇUKUROVA

Supervisor: Assoc.Prof.Dr. Bahar KARAKAYA Year: 2010, Page: 45

Jüri: Assoc.Prof.Dr. Bahar KARAKAYA Prof.Dr. Abdurrahman POLAT Assoc.Prof.Dr. Elif ORUÇ

In this study, the effect of alpha lipoic acid as an antioxsidant on protein

quality of sea bream, anchovy and Atlantic bonita oxidized with Fe+2 catalyzed oxidation system were investigated. Protein carbonyl (nmol carbonyl/ mg protein) and sodium dodecyl sulfade polyacrylamide gel elctrophoresis (SDS-PAGE) were used to determine protein oxidation and denaturation, respectively. As a result of this study, a significantly decrease in the amount of protein carbonyl was obtained with 1% alpha lipoic acid supplementation for seabream and 0.5% alpha lipoic acid supplementation for Atlantic bonita. In anchovy, the amount of protein carbonyl decreased with 0.1% and 0.5% alpha lipoic acid supplementation. However, 1% alpha lipoic acid supplementation did not effect on the amount of protein carbonyl. Results from electrophoresis anaylses indicated that the alpha lipoic acid did not show a good antioxidant property for these species and also it showed prooxidant activity in the dark muscle of fish when it was used of the ratio of 1%.

Key words: Alpha lipoic acid; Protein oxidation; protein denaturation; Fe- catalyzed oxidation

III

TEŞEKKÜR

Yüksek Lisans tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve değerlendirilmesi

aşamasında yardımını esirgemeyen, tecrübe ve bilgi birikimi ile her zaman yanımda

olan danışman hocam sayın Doç.Dr. Bahar KARAKAYA’ya teşekkürü bir borç

bilirim.

Laboratuar çalışmalarımda emeği geçen Yüksek Lisans öğrencisi Elif Tuğçe

AKSUN’a ve Arş.Gör. Ayşe ŞİMŞEK’e teşekkür ederim.

Ayrıca tez çalışmam boyunca bana her konuda destek olan sevgili eşim Su

Ürünleri Mühendisi Koray ÖZKALAY’a ve hayatımın her aşamasında yanımda olup

bana sonsuz emeği ve desteği veren biricik aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

IV

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZET……………………………………………………………………………...... I

ABSTRACT………………………………………………………………………… II

TEŞEKKÜR………………………………………………………………………… III

İÇİNDEKİLER……………………………………………………………………... IV

ÇİZELGELER DİZİNİ…………………………………………………………….. V

ŞEKİLLER DİZİNİ………………………………………………………………… VI

1. GİRİŞ…………………………………………………………………………..... 1

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR………………………………………………………. 4

3. MATERYAL VE YÖNTEM……………………………………………………..

3.1. MATERYAL……………………………………………………………….

3.2. YÖNTEM…………………………………………………………………..

3.2.1. Protein Karbonil Değeri………………………………………………

3.2.2. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamit Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)..

3.2.3. İstatistiksel Analiz…………………………………………………….

16

16

17

17

18

18

4. BULGULAR VE TARTIŞMA………………………………………………….

4.1. Protein Karbonil Değerleri…………………………………………………

4.2. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamit Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)…….

19

19

25

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER…………………………………………………..

5.1. Sonuçlar…………………………………………………………………….

5.2. Öneriler…………………………………………………………………….

35

35

36

KAYNAKLAR……………………………………………………………………. 37

ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………….. 45

V

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1. Alfa Lipoik asitin ROS’ları temizleme etkisi……...………..…..

Çizelge 2.2. Dihidrolipoik asitin ROS’ları temizleme etkisi…………………

Çizelge 2.3. Protein oksidasyonuna karşı Na-ALA’ nin koruyucu etkisi…...

Çizelge 4.1. Farklı konsantrasyonlarda alfa lipoik asit içeren Çipura (100

mg/ml)’nın Fe+2-katalizli oksitlendirme sistemi ile

oksitlendirilmesi sonucu elde edilen protein karbonil düzeyleri

(nmol karbonil/mg protein)……………………………………..

Çizelge 4.2. Farklı konsantrasyonlarda alfa lipoik asit içeren Palamut (100

mg/ml)’un Fe+2-katalizli oksitlendirme sistemi ile


(nmol karbonil/mg protein)…………………………………….

Çizelge 4.3. Farklı konsantrasyonlarda alfa lipoik asit içeren Hamsi (100

mg/ml)’nin Fe+2-katalizli oksitlendirme sistemi ile


(nmol karbonil/mg protein)……………………………………..

6

7

8

19

20

21

VI

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 2.1. Bölge spesifik metal katalizli protein oksidasyonu……………….

Şekil 2.2. Farklı zamanlarda FeCl3/H2O2/askorbat ile inkübe edilen tavuk

miyozinlerinin SDS-PAGE analizi. Örneklerin elektroforezi %5

β-merkaptoetanolün varlığında (sıra 2-4) ve yokluğunda (sıra 5-

6) gerçekleştirilmiştir. Sıra 1, moleküler kütle standartı; Sıra 2-5

okside olmamış miyozini; Sıra 3-6, miyozinin 1 saatlik

oksidasyonunu; Sıra 4-7 miyozinin 24 saatlik oksidasyonunu

göstermektedir……………………………………………………

Şekil 2.3. Fe2+/H2O2 ile oksitlendiren dana homejanatlarında ki protein

karbonil düzeyleri (nmol protein karbonil/mg protein)üzerine

farklı diyetlerin etkisi……………………………………………

Şekil 3.1. Lipoik asitin yapısı………….……………………………………..

Şekil 4.1. Çipura, palamut ve hamsinin 37 oC’ de oksitlendirme

reaksiyonunun başlangıcında, Fe+2-katalizli oksitlendirme

sistemi ile oksitlendirilmesi sonucu elde edilen protein

profillerinin molekül ağırlığına göre dağılımı. Örneklerin

elektroforezi β-mercaptoetanol’ün yokluğunda (A) ve varlığında

(B) gerçekleştirilmiştir (K: Kontrol, 1: %0.1 alfa lipoik asit, 2:

%0.5 alfa lipoik asit, 3: %1 alfa lipoik asit, MW: moleküler

ağırlık)……………………………………………………………

Şekil 4.2. Çipura, palamut ve hamsinin 37 oC’ de 3. saatlik Fe+2-katalizli

oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilme sonucu elde edilen

protein profillerinin molekül ağırlığına göre dağılımı.

Örneklerin elektroforezi β-merkaptoetanol’ün yokluğunda (A)

ve varlığında (B) gerçekleştirilmiştir (K: Kontrol, 1: %0.1 alfa

lipoik asit, 2: %0.5 alfa lipoik asit, 3: %1 alfa lipoik asit, MW:

moleküler ağırlık)……………………………………………….

4

9

12

16

26

28

VII

Şekil 4.3. Çipura, palamut ve hamsinin 37 oC’ de 5. saatlik Fe+2-katalizli

oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilme sonucu elde edilen

protein profillerinin molekül ağırlığına göre dağılımı. Örneklerin

elektroforezi β-merkaptoetanol’ün yokluğunda (A) ve varlığında

(B) gerçekleştirilmiştir (K: Kontrol, 1: %0.1 alfa lipoik asit, 2:

%0.5 alfa lipoik asit, 3: %1 alfa lipoik asit)……………………….

30

1. GİRİŞ GAMZE ÖZKALAY

1

1.GİRİŞ

Organizmalar devamlı olarak reaktif oksijen türleri (ROS) adı verilen ve

protein, lipit ve nükleik asitlerin okside olmasına sebep olan çoklu bir sisteme maruz

kalırlar. ROS’lar, çeşitli radikal türlerden (OH., O2. -, CO2

.- ve NO.), radikal olmayan

türlerden (H2O2, ONO2-, HOCl, O3, ONOCO2-,CO, N2O2, NO2 ve O2), ve ROS’un

protein, nükleik asit ve lipitlerle reaksiyonu sonucu oluşan serbest radikallerden (.C,

RS., RSO

., RSSR

.-, R., RO

. ve ROO

.) oluşmaktadır (Stadtman, 2006). Balıklar da,

yaşayan diğer organizmalar gibi ölmeden önce vücutlarında oluşan oksidatif hasara

karşı kendilerini koruyabilecekleri bir sisteme sahiptirler. Fakat öldükten sonra bu

sistem, ROS’un meydana getirdiği oksidatif hasarı engelleyemeyecek hale gelir.

Balıkların kas dokusunda oluşan ROS’un yaptığı hasarlardan şimdiye kadar en çok

lipitlerin oksidasyonu ile ilgili çalışmalara ağırlık verilmiştir. Halbuki oluşan ROS

sadece lipitlerin oksitlenmesine değil aynı zamanda proteinlerinde oksitlenmesine

neden olmaktadır (Berlett ve Stadtman, 1997; Griffiths, 2000). Bu nedenle

balıklardaki protein oksidasyonunu belirlemek en az lipit oksidasyonunu belirlemek

kadar önemlidir. Çünkü protein oksidasyonunun özellikle etlerde jelleşme,

emülsifikasyon, vizkosite, çözünürlük ve su tutma kapasitesi gibi kas proteinlerinin

fonksiyonlarını değiştirdiği belirtilmektedir ( Liu ve Xiong, 2000). Bu değişimler,

balık ve balık ürünlerinin kalitesini olumsuz yönde etkileyerek hem raf ömrünün

kısalmasına hem de besin kayıplarına neden olabilmektedir. Balıkların işlenmesi ve

depolaması sırasında lipit oksidasyonunun kaliteye olan etkisi ile ilgili birçok

çalışma olmasına rağmen balık kaslarında protein oksidasyonu ile ilgili çalışmalar

oldukça kısıtlıdır.

Biyolojik örneklerdeki oksidatif stresin etkisini tespit etmek amacıyla

kullanılan en yaygın yöntem in vitro koşullarda metalle katalizlenen oksidasyon

(MKO) sistemleridir (Madurawe ve Lumpkin, 1997; Kato ve ark., 2001). Yapılan

çalışmalar, özellikle metalle katalizlenen oksidasyon sistemlerinin spesifik

proteinleri okside ederek proteinlerin fonksiyonlarının kaybolmasına, yapısal

değişikliklere ve protein yapılarını daha hassas hale getirerek indirgenmesine sebep


2

olduğunu göstermektedir (Stadtman ve Oliver, 1991; Requena ve ark., 2003;

Biridgewater ve ark., 2006). Decker ve ark. (1993), hindi kaslarının hem demir hem

de bakır askorbat varlığında oksitlenmesi sonucu, proteinlerin yapısının değiştiğini,

protein karbonil miktarının arttığını, protein çözünürlüğünün azaldığını ve

miyofibriler proteinlerin jel kuvvetinin ve su tutma kapasitesinin azaldığını

bulmuşlardır. Ayrıca, demirle oksitlenen proteinlerin, spesifik olmayan düşük

moleküler ağırlıklı proteinlere polimerize olduğunu veya parçalara ayrıldığını

bulmuşlardır. Martinaud ve ark. (1997), miyozin ve troponin T’nin oksidasyona karşı

daha hassas proteinler olduğunu ve metalle katalizlenen oksitlenme sistemlerinden

Fe+2/H2O2 oksidasyonun en etkili oksitlendirme sistemi olduğunu bulmuşlardır.

Günümüzde, gıda endüstrisinde oksidatif bozulmadan kaynaklanan kalite

kaybını indirgemek için kullanılan sentetik antioksidan maddeler, tüketici tarafından

zararlı etkileri bilindiği için tercih edilmemektedir. Bu nedenle araştırıcılar daha çok

doğal kaynaklı antioksidanlar üzerinde yoğunlaşmışlardır. Antioksidan bileşiklerin

etki şekli ve etkinlik düzeyi oldukça farklıdır. Genelde antioksidanlar; reaktif oksijen

ve nitrojen türevlerinin temizlenmesi, oksidatif stresten zarar gören dokuların tamiri,

endojen antioksidanların yenilenmesi ve metal şelasyonu gibi oldukça farklı etki

şekillerinden birini veya birkaçını ortaya koyarlar. İdeal bir antioksidanın, bilinen bu

etki şekillerinden birçoğunu yerine getirebilme özelliğine sahip olması gerekir.

Antioksidanlar içinde ideale yakın olan bileşik alfa lipoik asit (ALA) ve dihidrolipoik

asit (DHLA) redoks çiftidir (Biewenga ve ark., 1994; Packer ve ark., 1995; Chen ve

ark., 2003). ALA, bitkiler, hayvanlar ve insanlar tarafından sentezlenebilen doğal bir

bileşik olup oksitlenmiş veya indirgenmiş iki sülfür molekülü içermektedir. Bu

farklılık ALA’nın, hem pek çok önemli enzimin kofaktörü olarak görev yapmasını

sağlamakta hem de okside formu ve indirgenmiş formu ile antioksidan olarak görev

yapabilmesine imkan tanımaktadır. Ayrıca, tioktik asit diye de bilinen ALA, hem

suda hem de yağda çözünebilen güçlü ve etkili bir antioksidandır (Biewenga ve ark.,

1997). Bu özelliğinden dolayı suda çözünen C vitamini ve yağda çözünen E vitamini

gibi diğer antioksidanlardan daha fazla serbest radikal türüne karşı etkilidir (Goralska

ve ark., 2003). Bütün bunların yanında ALA’nın bazı metalleri tutucu özelliği de

bulunmakta olup bakır, manganez ve çinko ile stabil kompleksler oluşturmaktadır


3

(Sigel ve ark., 1978). ALA’nın arsenik zehirlenmesinde kullanılabileceği in vivo

çalışmaları ile gösterilmiştir (Grunert, 1960). Hem in vitro hem de in vivo

deneylerde, kadmiyuma bağlı hepatotoksisiteyi azalttığı bulunmuştur (Muller ve

Menzel, 1990). Ayrıca, böbreklerde civayı şelat edebildiği in vitro olarak

gösterilmiştir (Keith ve ark., 1997). Tüm bunların yanında birçok hastalığın (diyabet,

katarakt, glokom vs) yan etkilerini azalttığı veya ortadan kaldırdığı bilinmektedir

(Atmaca, 2003).

Çipura, hamsi ve palamut, ülkemizde olduğu gibi birçok ülkede de ekonomik

öneme sahip balık türleri arasındadır, bu balıklardaki oksidatif hasar, kalitede önemli

kayıplara sebep olmaktadır. Balık kasında, metal katalaz oksidasyon sistemleri

tarafından gerçekleştirilen proteinlerin oksidatif hasarları ile ilgili çalışmalar oldukça

sınırlıdır. Ayrıca, günümüzde tıp ve kozmetik alanında tedavi amacıyla yaygın bir

şekilde kullanılan ve kuvvetli bir antioksidan olan ALA’nın gıdalarda bir antioksidan

olarak kullanımıyla ilgili çalışma bulunamamıştır. Bu sebeple bu çalışmada, çipura,

palamut ve hamsinin kas homejenatlarına farklı konsantrasyonlarda ALA

eklemesinin balıklarının in vitro koşullarda kas proteinlerinde meydana gelen

değişimlere olan etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır.

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR GAMZE ÖZKALAY

4

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

Stadtman ve Oliver (1991), metal katalizli oksidasyon sisteminin proteinleri

nasıl oksitlediğini, Şekil 2.1’de gösterildiği gibi özetlemiştir. Buna göre, oksijeni

(O2) hidrojen peroksite (H2O2), demir üçü (Fe (III)) demir ikiye (Fe (II)) indirgeyen

katalizleme için elektron donör sistemine gerek duyulduğu belirtilmektedir.

Kullanılan elektron donör sistemine bağlı olarak, O2’in indirgenmesi, direkt olarak

H2O2 veren iki elektronlu bir mekanizma tarafından veya H2O2’in dismutasyonunu

takiben ilk süperoksit anyonunun önderliğinde sıralı transfer yolu ile üretilebilir.

Benzer şekilde, Fe(III)’ün Fe (II)’ye indirgemesi direkt olarak veya süperoksit (O2. -)

ara oluşum yolu ile gerçekleşebilir. Daha sonra oluşan bu Fe(II) proteinlerin metal

bağlama bölgeleri ile bağlanabilir. Fe(II)–protein kompleksi, H2O2 ile reaksiyona

girerek aktive olmuş oksijen türlerini (OH., ferril iyonları) meydana getirirler. Diğer

modifikasyonlar içerisinde, bazı amino asit kalıntıları karbonil türevlerine

dönüşürler.

Şekil 2.1. Bölge spesifik metal katalizli protein oksidasyonu


5

Decker ve ark. (1993), demir veya bakır askorbatla oksitlendirilen hindi

beyaz kas miyofibrillerinin oksidatif hasarını ölçmek için fiziksel, kimyasal ve

fonksiyonel özelliklerdeki değişimleri incelemişlerdir. Kontrol grubuyla

karşılaştırıldığında, hem demir hem de bakır ile oksitlendirilen hindi

miyofibrillerinin protein karbonil düzeylerinde önemli bir artışın olduğu

bulunmuştur. Askorbat konsantrasyonu 0’dan 25 mM düzeyine arttırıldığında hem

demir hem de bakır varlığında miyofibriler proteinlerin karbonil düzeylerinin

sırasıyla 2.6 ve 1.9 kat arttığı tespit edilmiştir. Kontrol grubuna göre, demir ve

bakırla oksitlendirilen miyofibriler proteinlerin çözünürlüklerinin, jel kuvvetlerinin

ve su tutma kapasitelerinin düştüğü bulunmuştur. Sodyum dodesil sülfat (SDS)

poliakrilamit jel elektroforez sonuçlarına göre; hem demir hem de bakırla

oksitlendirilen örneklerdeki miyozin ve aktinin polimerleşerek kaybolduğu

saptanmıştır.

Packer ve ark. (1995), ideal bir teropatik antioksidanın birçok kriteri olması

gerektiğini savunmuşlardır. Bunlar arasında, diyetlerden iyi absorbe edilebilmesi,

hücre ve doku içerisinde kullanılabilir forma dönüşebilmesi, hem membranda hem de

sıvı fazda antioksidan olarak kullanılabilmesi (diğer antioksidanlarla reaksiyona

girebilmesi) ve toksik olmaması gerektiği öne sürülmektedir. Antioksidanlar

arasında, lipoik asitin tüm bu yukarıda sayılan özellikleri göstermesinden dolayı

oksidatif hasarın birçok koşulunda iyi bir antioksidan olduğu belirtilmektedir.

Araştırıcılar tarafından lipoik asitin bir antioksidan olarak özellikleri şu şekilde

özetlenmiştir. (1) Direkt olarak ROS tutması, (2) Endojen antioksidanlar olan

glutatyon, E ve C gibi vitaminlerin tekrar oluşumunu sağlaması, (3) ROS üretiminin

indirgenmesine sebep olan metalleri tutma aktivitesinin olması.

Biewenga ve ark. (1997), alfa lipoik asitin (ALA) ve dihidrolipoik asitin

(DHLA) bir antioksidan olarak metal şelatlama kapasitesi, reaktif oksijen türlerini

(ROS) temizleme yeteneği, endojen antioksidanları yeniden oluşturma yeteneği ve

oksidatif hasarı onarma yeteneğini araştırmışlardır. ROS temizleyicileri olarak

bilinen ALA ve DHLA’nın (Çizelge 2.1. ve Çizelge2.2) birçok deneyde antioksidan

aktivite göstermesinin yanı sıra prooksidan aktivite de gösterebileceği belirtilmiştir.


6

Çizelge 2.1. Lipoik asitin ROS’ları temizleme etkisi

Oksidant Etki Üretici Algılayıcı Molekül

Algılayıcı Reaktif

Temizleme Kapasitesi

O2

- _ Ksantin oksidaz DMPO spin trap __ __ _ Hipoksantin

Oksidaz Sitokrom C __ __

H2O2 .OH HOCI CCI3O2

.

1ΔgO2

ONOO-

ABAP.

_ + + + + + + + + + + + + + + + _

__ H2O2/Fe2+

H2O2/Fe2+

H2O2/Fe2+/askorbat Aydınlatma NP˷III Aydınlatma NP˷III Aydınlatma NP˷III Aydınlatma NP˷III __ __ __ RadyolizisCCI4 Rubene otoperoksidasyon TermolizisNDPO2 __ __ Termolizis ABAP

Peroksit DMPO spin trap Luminol Deoksiriboz DMPO BSA Salisilik asit Apo˷B˷ protein α1˷AP TNB BSA __ __ __ Tirozin α1˷AP B˷fizikoeritrin

__ __ __ __ __ __ __ __ __

__ __ CCI3O2

. Rubrene 1ΔgO2 __ __ __

__ DHLA=LA __ k = 4.71 × 1010/M/dk k = 4.71 × 1010/M/dk __ __ __ DHLA, GSH, LA> GSMe>GSSG, sistin LA>GSMe>GSSG DHLA>GSH>GSMe> LA>sistin, GSSG k = 1.8 × 108/M/dk k = 1 × 108/M/dk (benzene) k = 1.38 × 108/M/dk DHLA, GSH> LA>GSSH DHLA, LA, Met> GSH>GSSG __

Kısaltmalar: a~-AP, a-l-antiproteaz; ABAP, 2,2'-azobis(2-amidinopropan)dihidrolhlorid; BSA, bovin serum albumin; DHLA, dihidrolipoik asit; DMPO, 5,5 -dimetil- 1-piyroline-N-oksit; GSMe, S-metilat glutatyon; LA, lipoik asit; NDPOz, endoperoksit 3,3'-( 1,4-napitilit )dipropionat; NP-III, N,N'-bis(2-hidroperoksit-2-methoksietil)-l,4,5,8-napithalen-tetrakarboksil dimit); TNB, 5-thio-2-nitrobenzoik asit


7

Çizelge 2.2. Dihidrolipoik asitin ROS’ları temizleme etkisi

Oksidant Etki Üretici Algılayıcı Molekül

Algılayıcı Reaktif

Temizleme Kapasitesi

O2

- + Ksantin oksidaz DMPO spin trap __ k= 3.3 × 105/M/dk H2O2 .OH HOCI CCI3O2

.

1ΔgO2

NO.

ONOO-

ABAP

+ _ + + _ _ + _ + + + _ + + + + +

Ksantin oksidaz Hipoksantin oksidaz

CytP450/adriamizin CytP450/adriamzin __ __ H2O2/Fe2+

H2O2/Fe2+/vitamin C __ __ Radiolizis CCI4 Termolizis NDPO2 Fotolizis duroquinone Makrofaj __ __ Termolizis ABAP

Epinefrin NBT DMPO spin trap __ __ __ DMPO spin trap Deoksiriboz α1˷AP BSA __ __ __ __ Tirozin α1˷AP B˷fizikoeritrin

__ __ __ DHLA H2O2 DHLA __ __ __ __ CCI3O2

.

1ΔgO2 1ΔgO2

NO. (as NO2-)

__ __ __

k= 7.3 × 105/M/dk k= 4.8 × 105/M/dk k= 4.8 × 105/M/dk __ __ DHLA=LA __ DHLA, GSH, LA> GSMe>GSSG, sistin DHLA>GSH>GSMe> LA>sistin, GSSG k = 2.7 × 107/M/dk __ k = 5.7 × 105/M/dk __ DHLA, GSH> LA> GSSG DHLA, LA, Met> GSH> GSSG __

Kısaltmalar: a~-AP, a-l-antiproteaz; ABAP, 2,2'-azobis(2-amidinopropan)dihidrolhlorid; BSA, bovin serum albumin; DHLA, dihidrolipoik asit; DMPO, 5,5 -dimetil- 1-piyroline-N-oksit; GSMe, S-metilat glutatyon; LA, lipoik asit; NDPOz, endoperoksit 3,3'-( 1,4-napitilit )dipropionat; NP-III, N,N'-bis(2-hidroperoksit-2-methoksietil)-l,4,5,8-napithalen-tetrakarboksil dimit); TNB, 5-thio-2-nitrobenzoik asit

Perricone ve ark. (1999) tarafından, bovin serum albuminde (BSA) hidroksi

serbest radikalinin (OH.) sebep olduğu protein oksidasyonu ve bölünmesine karşı

alfa lipoik asitin (ALA) koruma etkisi araştırılmıştır. Çalışmada, iki farklı

oksidasyon sistemi kullanılmıştır. Bunlardan birisi, OH. serbest radikalleri BSA’nın

varlığında Fenton reaksiyonu tarafından oluşturulmuştur. Bu proteinin serbest

radikaller tarafından polimerizasyonu suda çözünürlük kaybıyla tespit edilmiştir.

Çalışma sonucunda, Na-ALA’nin bu tip protein denatürasyonuna karşı kuvvetli bir

koruyucu etkisi olduğu tespit edilmiştir. Kullanılan diğer yöntemde de, BSA

oksidasyonu 80 krad’lık Co-gamma irridasyonu kullanılarak sağlanmıştır. Bunun


8

sonucunda da, protein karbonil içeriğinin önemli oranda arttığı tespit edilmiştir.

ALA eklenen gruplarda ise bu karbonil oluşumunun etkili bir şekilde azaldığı

bulunmuştur (Çizelge 2.3). Bu çalışmadan elde edilen verilere göre, ALA ile OH.

radikalinin interaksiyonunun tiyosülfinat veya tiyosülfonat oluşumu veren disülfit

grupları ile olduğu öne sürülmüştür.

Çizelge 2.3. Protein oksidasyonuna karşı Na-ALA’nın koruyucu etkisi

Liu ve Xiong (2000) adlı araştırıcıların yapmış oldukları çalışmada,

enzimatik olmayan serbest radikal sistemi (FeCl3/H2O2/askorbat) ile tavuk

miyozinleri oksitlendirilerek elektroforetik değişimleri incelenmiştir. Bu çalışmanın

sonucunda, oksidasyonun miyozinin polimerizasyonuna ve bölünmesine sebep

olduğu bulunmuştur. Miyozin polimerlerlerinin daha çok disülfit kovalent bağlarla

oluştuğu tespit edilmiştir (Şekil 2.2).


9

Şekil 2.2. Farklı zamanlarda FeCl3/H2O2/askorbat ile inkübe edilen tavuk

miyozinlerinin SDS-PAGE analizi. Örneklerin elektroforezi %5 β-

merkaptoetanolün varlığında (sıra 2-4) ve yokluğunda (sıra 5-6)

gerçekleştirilmiştir. Sıra 1, moleküler kütle standardını; Sıra 2-5 okside

olmamış miyozini; Sıra 3-6, miyozinin 1 saatlik oksidasyonunu; Sıra 4-

7 miyozinin 24 saatlik oksidasyonunu göstermektedir.

Arivazhagan ve ark. (2002), yaşlı fareler ile genç farelerin çeşitli beyin

bölgeleri karşılaştırıldığında, metabolik bir antioksidan olarak DL-α-lipoik asitin lipit

peroksidasyonuna ve protein karbonil içeriğine olan koruyucu etkisini

araştırmışlardır. DL-α-lipoik asit deney farelerine intraperitonel olarak (100mg/kg

vücut ağırlığı/gün) uygulanmıştır. DL-α-lipoik asit uygulaması yapılmamış yaşlı

farelerin nükleik asit ve protein içerikleri düşük iken thiobarbiturik asit ve protein

karbonil içeriği yüksek bulunmuştur. Halbuki, 14 gün DL-α-lipoik asit uygulaması

yapılan yaşlı farelerin nükleik asit ve protein içerikleri yükselirken, lipit

peroksidasyonu ve protein oksidasyonu azalmıştır. Bu çalışmada elde edilen sonuca

göre, lipoik asitin yaşla bağlantılı oksidatif hasara karşı nöronal hücreler için kuvvetli

bir antioksidan olduğu bulunmuştur.


10

Moini ve ark. (2002)’nın yapmış oldukları bu çalışmada, ALA ve DHLA’nın

antioksidan ve prooksidan aktiviteleri araştırılmıştır. Bu araştırıcılar ALA ve

DHLA’nın direkt olarak serbest radikal tutma özelliği gösterdiğini ve kuvvetli bir

indirgen madde olduğunu belirtmişlerdir. İn vivo olarak yapılan çalışmalar, ALA

eklenmesinin oksidatif stresi azalttığı ve diğer antioksidanların düşük düzeylerini

yeniden onardığını göstermiştir. Bununla birlikte, in vitro yapılan çalışmalarda, ALA

ve DHLA’nın aynı zamanda prooksidan olarak da rol alabileceği bulunmuştur.

Pirlich ve ark. (2002), oksidatif stresin aralarında etanolün nörotoksisitesini

de içeren çok sayıda nörolojik bozukluğa sebep olduğunu belirtmektedirler. Yapılan

son çalışmalar, oksidatif stresle bağlantılı olarak ALA’nın potansiyel etkisinin

tanımlandığını ve bu nedenle bu çalışmada da etanolün sebep olduğu nörotoksisiteyi

engellemede, ALA’nın etkili olup olamayacağı hipotezini araştırmışlardır.

Çalışmada, 100-600 mM etanol ile 24 saatlik inkübasyon sonunda intraselüler

protein oksidasyonunda önemli bir artış olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte,

aynı hücrelerin 0,1 mM lipoik asit ile inkübasyonu sonucunda ise, etanolle ilgili

nörotoksisitenin önemli ölçüde azaldığını ve etanolün indüklemesiyle hücre içinde

meydana gelen protein oksidasyonunun tamamen engellediğini bulmuşlardır. Bu

sonuçlar, lipoik asitin radikal temizleme özelliğinin etanolün indüklediği

nörotoksisiteyi iyileştirmede etkili olduğunu göstermiştir.

Atmaca (2003)’nın yapmış olduğu çalışmada, tiyol içeren bazı bileşiklerin

antioksidatif etkileri araştırılmıştır. Bu araştırıcıya göre, tiyol içeren bir madde olarak

ALA’nın indirgenmiş formu olan DHLA’nın en etkili antioksidan olduğu

belirtilmiştir.

Çakatay ve Kayalı (2004), alfa lipoik asitin hem prooksidan hem de

antioksidan olarak yaşlı farelerin plasma proteinlerindeki protein karbonil,

nitrotirozin, ileri oksitlenmiş protein ürünleri ve protein tiyol gibi oksidatif protein

hasar parametrelerine ve oksidatif stres parametreleri olan toplam tiyol, protein

olmayan tiyol ve lipit hidroperoksit düzeylerini incelemişlerdir. Bu çalışmada, alfa

lipoik asit ( 100 mg/kg vücut ağırlığı/gün) Sprague-Dawley farelerine 14 gün

boyunca introperitional olarak uygulanmıştır. Çalışma sonucunda, alfa lipoik asit

uygulanan farelerde protein karbonil değerleri artarken, protein tiyol, protein


11

olmayan tiyol ve toplam tiyol düzeyleri değişmemiştir. Bu çalışmada, alfa lipoik asit

uygulanan yaşlı farelerde protein oksidasyonun bir gösterisi olan protein karbonil

değerlerinin yükselmesinin nedeni, alfa lipoik asitin prooksidan etki göstermesinden

dolayı olabileceği öne sürülmüştür.

Mercier ve ark. (2004) tarafından, dana eti homojenatlarındaki lipit ve protein

oksidasyonu üzerine otla ve karışık diyetle beslemenin etkisi in vitro koşullarda Fe+2

iyonu ve H2O2 tarafından kimyasal reaksiyonla belirlenmiştir. Lipit oksidasyonu

tiyobarbitürik asit (TBA-RS) ile protein oksidasyonu ise protein karbonil gruplarıyla

belirlenmiştir. Etin antioksidan durumunun belirlenmesi için vitamin E ve

antioksidan enzim aktivitelerinden süper oksit dismütaz (SOD), glutatyon peroksidaz

(GPx) ve katalaz enzim düzeyleri tespit edilmiştir. Sadece otla beslenen hayvanlarda

etteki lipit oksidasyon oluşumunun önemli bir şekilde engellendiği, protein

oksidasyonun ise önemli bir şekilde etkilenmediği tespit edilmiştir. Karışık diyetle

beslenen hayvanlardaki SOD ve GPx aktivitesi ters etki gösterirken, otla beslenen

hayvanlarda SOD aktivitesi artmış fakat GPx aktivitesi azalmıştır. Çalışmada, Fe+2

SO4 /H2O2 ile oksitlendirilen dana eti homojenatlarının başlangıç karbonil düzeyi,

taze etlerde bulunduğu belirtilen 3 nmol protein karbonil/mg protein olarak

bulunmuştur. İki farklı beslemeye tabi tutulan dana etlerindeki karbonil düzeylerinin

ilk 30 dk.lık kimyasal inkübasyon sonucunda en yüksek düzeye ulaştığı ve 5.saatlik

oksidasyona kadar ise bir azalmanın olduğu tespit edilmiştir (Şekil 2.3.). Uzun süreli

inkübasyondan sonra karbonil gruplarındaki bu azalmanın farklı oksidasyon

sistemlerinde de gözlemlendiği belirtmektedir. Bunun sebebinin, miyofibriler

proteinlerdeki indirgenmeden, çökelmeden veya ayrışmadan kaynaklandığı

belirtilmiştir.


12

Şekil 2.3. Fe2+/H2O2 ile oksitlendiren dana homejanatlarında ki protein karbonil

düzeyleri (nmol protein karbonil/mg protein)üzerine farklı diyetlerin etkisi

Suh ve ark. (2004) tarafından, alfa lipoik asit (ALA) veya onun indirgen

formu olan dihidrolipoik asitin (DHLA) hangisinin geçiş metal iyonlarını tuttuğunu

ve böylece demir ve bakır iyonunun sebep olduğu oksidatif stresi azalttığını

araştırmışlardır. Bu amaçla, askorbat varlığında ALA ve DHLA’nın demir veya

bakır katalizli oksidasyonun etkisini araştırmak için bu metal iyonlarının redoks

aktivitesi araştırılmıştır. Çalışmanın sonucunda, Fe(III)-sitrat tarafından oluşturulan

oksidasyonun DHLA ile önemli oranda azaldığı öne sürülmüştür.

Terjesen ve ark. (2004), yapmış oldukları bu çalışmada, besinsel lipoik asit

(LA) ve askorbik asit (AA)’in, Güney Amerika teleost pacu balığındaki, plazma

serbest amino asit (SAA) üzerine etkilerini araştırmışlardır. LA uygulanan

örneklerde, 23 bireyin 18’inde SAA’nın azaldığı; özelliklede toplam SAA’i önemli

oranda etkilediği bulunmuştur. Aynı zamanda, LA ve AA’in her ikisinde sülfür

içeren SAA konsantrasyonunu etkilediğini ve plazma sistin düzeyini önemli oranda

arttırdığını saptamışlardır. Bununla birlikte, dallanmış zincirli ve aromatik amino

asitler üzerine önemli bir etkisi bulunmamıştır. Bu çalışmadan elde edilen sonuca

göre, diyette suplament olarak LA kullanılacaksa, bunun SAA profiline etki

edeceğinin mutlaka göz önünde bulundurulması gerektiği öne sürülmüştür.


13

Zhao ve ark. (2004) tarafından, alfa lipoik asitin süper oksit anyon, hidroksi

radikal ve hidrojen peroksit yakalama kabiliyeti kemilumineens (CL) ile

değerlendirilmiştir. Araştırma sonucunda, ALA’nın nötral ve asidik koşullarda

süperoksit anyonlarını tutabildiği ve tutabilme etkisinin ALA’nın konsantrasyonuna

bağlı olduğu bulunmuştur. Nötral veya alkali koşullarda ise hidroksi radikallerle

reaksiyona giren ALA’nın CL yoğunluğunun ilk 10 dakikadan sonra azaldığı ve daha

sonra tekrar arttığı tespit edilmiştir. Bu sonucun sebebinin ALA’nın bilinmeyen

hidroksi radikallerini tutabilme özelliğinden kaynaklandığı belirtilmiştir. Önce

azalan ve sonra artan CL yoğunluğunun nedeninin ise, bilinmeyen bazı ara ürünler

sonucu oluşabileceği belirtilmektedir.

Tokur ve Korkmaz (2007a), sardalya, palamut, hamsi ve lüferin lipit ve

protein kaliteleri üzerine demir katalizli oksidasyonun (Fe+2/H2O2) sebep olduğu

hidroksi radikal üretim sisteminin etkilerini araştırmışlardır. Bu araştırmada, siyah

kaslı balıkların lipitlerinde meydana gelen oksidatif hasarı ölçmek için, demir

katalizli oksidasyon sistemi kullanılarak, tiyobarbütirik asit reaktif madde (TBARs)

analizi yapılmıştır. Araştırma sonunda, demir katalizli oksidasyon ile inkübasyon

süresi arttırılan sardalya ve hamsinin, TBARs miktarının önemli bir biçimde arttığı

(p<0.05), buna karşın palamut ve lüferin maksimum TBARs miktarının

inkübasyonun ilk 3 saatinde elde edildiği ve daha sonra bir değişime uğramadığı

tespit edilmiştir. Protein oksidasyonunun göstergesi olarak ölçülen protein karbonil

miktarının ise Fe katalizli oksidasyon sisteminden farklı bir biçimde etkilendiği tespit

edilmiştir. Bu çalışmada, protein oksidasyonunun bir ölçüsü olarak tespit edilen

protein karbonil (nmol carbonyl/mg protein) düzeylerinin, türlere göre farklılık

gösterdiği bulunmuştur. Araştırmada, uzun inkübasyon süresi sonucunda (5 h) hamsi

dışında palamut, lüfer ve sardalya karbonil miktarının önemli bir oranda arttığı

saptanmıştır. Protein karbonil miktarındaki artış göz önüne alındığında, balık türleri

arasında en yüksek protein karbonil miktarı artışı palamut balığında görülmüştür. β-

merkaptoetanolün varlığı ve yokluğunda yapılan elektroforetik analiz sonucunda,

inkübasyon sonunda genel olarak tüm balıkların protein bantlarında kayıpların

olduğu ve bu bantlardaki en büyük kaybın, hamside görüldüğü bulunmuştur.

Çalışmada, inkübasyonun ilk bir saati içinde 50 kDa’dan daha büyük moleküler


14

ağırlığa sahip protein bantlarında bir kaybın meydana geldiği tespit edilmiştir.

Protein kayıplarının (hem yüksek hem düşük molekül ağırlığı) demir katalaz

inkübasyonu sırasında disülfit ve non-disülfit kovalent bağlanma sonucu olabileceği

belirtilmiştir. Bu çalışmada elde edilen verilere göre, Fe+2-katalizli oksidasyon

sistemi sonucunda oluşan TBARs’deki artış ve proteinlerdeki parçalanma ve

kayıpların nedeninin, kalite kaybına ve raf ömrünün kısalmasına sebep olan protein

ve lipit oksidasyonu sonucu olduğu belirtilmiştir.

Tokur ve Korkmaz (2007b), kefaller (Mugil cephalus)’de lipit ve proteinlerin

oksidatif hasarını, hidroksi radikal üreten Fenton tip reaktantlar (Fe+2SO4/H2O2)

kullanılarak in vitro koşullarda incelemişlerdir. Serbest radikallerin neden olduğu

lipit oksidasyonunu belirlemek için tiyobarbitürik asit-reaktif madde analizi (TBARs,

mg malonaldehit/ kg) kullanılmıştır. Proteinlerin oksidatif modifikasyonu, 2,4-

dinitrofenilhidrazin (DNPH) kullanılarak tespit edilen karbonil oluşumu ve DNPH ile

işaretlenmiş oksitlenmiş proteinlerin sodyum-dodesil sülfat poliakrilamit jel

elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrıştırılması ile tespit edilmiştir. Bu çalışma

sonucunda, lipitlerin Fe+2/H2O2 ile uzun süreli inkübasyonu (5 saat), TBARs

değerinde önemli bir artışa sebep olmuştur. Serbest radikal üreten sistemle

oksidasyon, inkübasyonun ilk 3 saatinde protein karbonil değerinin azalmasına ve

daha sonra 5. saate kadar artış göstermesine neden olmuştur. Elektroforez çalışması

sonucunda, inkübasyonun 3. saatinde 100 kDa ve 150 kDa molekül büyüklüğüne

yakın bantların yoğunluğunda azalma olmuş ve inkübasyonun 5. saatinde 50 kDa

üzerindeki bantlar gözden kaybolmuştur. Bu çalışma sonucunda elde edilen veriler,

serbest radikal üreten sistemin protein denatütasyonu olarak bilinen proteinlerin

indirgenmesine sebep olarak proteinlerin yapısını değiştirebildiği ve depolama

süresince istenmeyen tat ve kokunun gelişimine sebep olan lipit oksidasyonunu

artırabildiğini göstermiştir. Bu değişikliklerin, depolama ömrünün kısalmasına ve

kalitenin kaybına neden olduğu belirtilmiştir.

Trattner ve ark. (2007), alfa lipoik asit (LA) ve askorbik asitin (vitamin C)

Piaractus mesopotamicus balığının beyin ve kaslarındaki yağ asiti (YA) ve

antioksidan profiline olan etkisini çalışmışlardır. Askorbat (500 mg AA kg-1) ve/veya

lipoik asit (1000 mg kg-1) ilave edilen veya eklenmeyen diyetler olarak iki


15

faktöriyelli deneme yapılmıştır. Kaslardaki polar lipitlerde (PL) bulunan

Eikosapentanoik asit düzeyleri (20:5n−3, EPA), LA eklenen gruplarda (6.93%±0.43

vs. 5.83%±0.40 ve 6.68%±0.53 vs. 6.00%±0.39) artarken beyinde önemli bir değişim

saptanmamıştır. Çalışma sonucunda elde edilen bu verilere göre, lipit

metabolizmasındaki değişimlerden ziyade lipit peroksidasyonuna karşı LA’in

korumasının doğrudan etkili olabileceği öne sürülmüştür.

Singh ve Jialal (2008), farmakolojik olarak lipoik asitin, ağır metal

zehirlenmesi ile ilgili toksisiteyi etkin bir şekilde azalttığını belirtmektedirler. Ayrıca

antioksidan olarak lipoik asitin, doğrudan serbest radikalleri sona erdirdiği, geçiş

metal iyonlarını tuttuğu, sitasolik glutatyon ve vitamin C düzeyini arttırdığı ve

onların kayıpları ile ilgili toksisiteyi engellediğini belirtmişlerdir.

3. MATERYAL VE METOT GAMZE ÖZKALAY

16

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1. Materyal

Bu çalışmada materyal olarak çipura (Sparus aurata), hamsi (Engrailus

engrasichalus) ve palamut (Sarda sarda) kullanılmıştır. Araştırmada, antioksidan

olarak kullanılan alfa lipoik asitin (Sigma T5625) kimyasal yapısı Şekil 3,1’de

gösterilmiştir.

Şekil 3.1. Lipoik asidin yapısı (oksitlenmiş ve indirgenmiş formu).

Lipoik asit, (LA, 1,2, ditiyolane-3-pentanoik asit, 1,2-ditiyolan-3volerik asit

veya thiyoktik asit) sülfür içeren bir kofaktördür ve indirgenmiş formu olan

dihidrolipoik asitin ve lipoik asitin (DHLA, 6,8-dimerkaptooktanoik asit veya 6,8-

tiyooktik asit) her bir molekülünde iki adet tiyol grubu vardır.


17

3.2. Yöntem

Çipura (Sparus auratus), palamut (Sarda sarda) ve hamsi (Engrailus

engrasichalus) avlandıktan hemen sonra yerel bir balıkçıdan satın alınıp, buz içinde

Ç.Ü. Su Ürünleri Fakültesi İşleme Teknolojisi Bölümü Protein Araştırma

Laboratuarına getirilmiştir. İç organlarından temizlenen balıklar yıkandıktan sonra

filetoları çıkartılmıştır. Waring Blenderda homojenize edilen filetolardan 0.5 g et

örneği tartılmış ve test tüplerine aktarılmıştır. Et örneği bulunan test tüplerine 5ml 50

mM Tris-HCI ve 1 mM EDTA içeren tampon solüsyonu (pH 7.4) eklenerek yüksek

hızda 1 dakika homojenize edilmiştir. Daha sonra bu homejenatlara 100 mg/ml baz

alınarak farklı oranlarda alfa lipoik asit uygulanmıştır. Alfa lipoik asit uygulanmayan

grup kontrol grubu (K), alfa lipoik asit uygulanan gruplar ise %0.1, %0.5 ve %1

oranında alfa lipoik asit uygulanan gruplar olarak belirlenmiştir. Homojenatlarda

oksitlendirmeyi sağlamak için, 1/2 oranında demir sülfat (0.5mM) ve hidrojen

peroksit (1mM) Mercier ve ark. (2004)’nın önerileri doğrultusunda kullanılmıştır.

Homojenatlar 37 ºC’ye ayarlı su banyosunda 0, 3 ve 5 saat süresince inkübe

edilmiştir. Homojenatlardaki oksidasyon reaksiyonu, bütillenmiş hidroksitoluen

(BHT, %0.02 oranında) eklenerek durdurulmuştur.

3.2.1. Protein Karbonil Değeri

Protein karbonil içeriği Levine ve ark. (1994)’na göre 2,4 dinitrofenilhidrazin

(DNPH) ile protein karbonillerinin reaksiyonu ile belirlenmiştir. Örnekler %10

triklorasetik asit (TCA; w/v) ile çöktürüldükten sonra 12000 rpm’de 3 dakika

santrifüj edilmiştir. Örneklere, 2 M DNPH’li HCI ve 2 M DNPH’siz HCl eklendikten

sonra oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda bir saat boyunca karıştırılmıştır. Bu süre

bitimimde örnekler tekrar %10 TCA ile çöktürülmüş ve 12000 rpm’de 3 dakika

santrifüj edilmiştir. Çöktürülen protein peletleri etanol: etil asetat (1:1 v/v) ile

yıkanarak serbest DNPH solüsyonunun uzaklaştırılması sağlanmıştır. Daha sonra

12000 rpm de tekrar 3 dakika santrifüj edildikten sonra üst faz dışarı atılmış ve bu

işlem iki kez daha tekrarlanmıştır. Elde edilen protein peletlerine, 20 mM potasyum


18

fosfat tampon içeren 6 M guanidin- HCl (pH 2.3, triflor-asetik asit ile ayarlanmıştır)

eklenmiş ve herhangi bir çözülmeyen madde kalmaması için tekrar santrifüj

edilmiştir. DNPH konsantrasyonu guanidin solüsyonu kör olmak üzere 360 nm de

belirlenmiştir ve 22,000 M-1 cm-1 lik molar emilme katsayısı protein karbonil

miktarını tespit etmek için kullanılmıştır. Protein konsantrasyonu ise standart olarak

6 M guanidin içeren bovin serum albümin kullanılarak 280 nm’de belirlenmiştir.

Sonuçlar nmol karbonil /mg protein olarak verilmiştir.

3.2.2. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE)

Balıkların proteinlerinde meydana gelen denatürasyonu incelemek için,

BioRad marka mini vertikal sodyum dodesil sülfat (SDS) poliakrilamit jel

elektroforezi (PAGE) kullanılmıştır. Elektroforez işlemi %10’ luk poliakrilamit jel

ile Laemmli (1970) metoduna göre yapılmıştır. Jeller, %0.025 Coomassie Blue R-

250, %40 metanol ve %7 asetik asit ile boyanmış ve fazla boya %5 metanol ve %7

asetik asit ile 24 saat bekletilerek alınmıştır. Proteinlerin moleküler kütlesini

belirlemek için, triofosfat izomeraz (26,600 kDa), laktik dehidrogenaz (36,500 kDa),

ovalalbumin (45,000 kDa), püruvat kinaz (58,000 kDa), insan sütünden laktoferrin

(90,000 kDa) ve β-galaktosidaz (116,000 kDa) içeren sigma standardı (sigma P-

8748) kullanılmıştır.

3.2.3. İstatistiksel Analiz

Farklı konsantrasyonlardaki alfa lipoik asitin etkisi %5 önem düzeyinde

varyans analizi (Tek-yönlü ANOVA) kullanılarak Duncan karşılaştırma testi ile

değerlendirilmiştir. Aynı zamanda, tüm saatler göz önüne alındığında alfa lipoik

asitin protein karbonil düzeyine etkisi genel lineer model (GLM) kullanılarak tespit

edilmiştir.

4. BULGULAR VE TARTIŞMA GAMZE ÖZKALAY

19

4. BULGULAR VE TARTIŞMA

4.1. Protein Karbonil Değerleri

Araştırmada, farklı konsantrasyonlarda alfa lipoik asit içeren 100 mg/ml

çipura, hamsi ve palamut içeren homojenatların, 37 ºC’de 0, 3 ve 5. saatlerde Fe+2-

katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi sonucu elde edilen protein

karbonil (nmol/nmol karbonil/mg protein) düzeyleri Çizelge 4.1., 4.2. ve 4.3.’de

verilmiştir.

Çizelge 4.1. Farklı konsantrasyonlarda alfa lipoik asit içeren Çipura (100 mg/ml)’nın

Fe+2-katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi sonucu elde

edilen protein karbonil düzeyleri (nmol karbonil/mg protein)

37 ºC’de ki inkübasyon süresi (saat)

Alfa Lipoik Asit Oranları

Kontrol % 0.1 %0.5 %1

0 3,05±0,25a

1,71±0,19b

1,49±0,23b

1,74±0,22b

3 3,80±0,55bc

4,24±0,27c

3,50±0,10b

2,85±0,07a

5 4,89±0,22c

2,44±0,13b

4,54±0,26c

1,28±0,50a

Aynı satırdaki farklı harfler p<0.05 önem düzeyindeki farkı göstermektedir

Oksitlendirme reaksiyonunun başlangıcında, alfa lipoik asit eklenen tüm

örneklerde protein karbonil miktarının önemli bir biçimde azaldığı bulunmuştur

(p<0.05). Bununla birlikte, Çizelge 4.1’de de görüldüğü gibi farklı oranlardaki alfa

lipoik asit miktarlarının protein karbonil düzeyleri üzerine önemli bir etkiye sahip

olmadığı tespit edilmiştir (p>0.05). Oksitlendirmenin 3. saatinde ise, kontrol grubu,

%0.1 ve %0.5 düzeyinde alfa lipoik asit eklenen örnekler arasında önemli bir

faklılığın bulunmadığı tespit edilmiştir. Buna rağmen, %1 düzeyinde eklenen alfa

lipoik asitin kontrol grubuna göre protein karbonil miktarını önemli oranda azalttığı

bulunmuştur (p<0.05). Oksitlendirmenin 5. saatinde ise kontrol grubuna göre


20

çipuraların karbonil düzeyleri üzerine %0.5 düzeyindeki alfa lipoik asit eklemesinin

önemli bir etkisi bulunmazken, %0.1 ve %1’lik düzeylerin protein karbonil düzeyini

önemli oranda azalttığı bulunmuştur. Genel lineer model uygulanarak yapılan tek

yönlü varyans analizi sonucunda, tüm saatler göz önüne alındığında çipura protein

karbonil düzeyini önemli oranda azaltan alfa lipoik asit miktarı %1 olarak tespit

edilmiştir (p<0.05). Bunu sırasıyla %0.1 alfa lipoik asit eklenen grup, %0.5 alfa

lipoik asit eklenen grup ve kontrol grubu izlemiştir.

Çizelge 4.2. Farklı konsantrasyonlarda alfa lipoik asit içeren Palamut (100

mg/ml)’un Fe+2-katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi

sonucu elde edilen protein karbonil düzeyleri (nmol karbonil/mg

protein)

37 ºC’de ki

inkübasyon

süresi (saat)


Kontrol %0.1 %0.5 %1

0 2,06±0,11a 1,81±0,15a 2,06±0,15a

2,94±0,34b

3 3,68±0,27bc

3,30±0,10b

2,61±0,21a 3,88±0,50c

5 2,49±0,13c

2,28±0,10bc

1,89±0,17a

2,06±0,22ab

Aynı satırdaki farklı harfler p<0.05 önem düzeyindeki farkı göstermektedir.

Oksitlendirme reaksiyonunun başlangıcında, kontrol, %0.1 ve %0.5

düzeylerinde alfa lipoik asit eklenen palamut örneklerinin protein karbonil miktarları

arasında önemli bir faklılık bulunmazken (p>0.05), %1 oranında alfa lipoik asit

eklenen grupta protein karbonil miktarı önemli düzeyde yüksek bulunmuştur

(p>0.05). Oksitlendirmenin 3. saatinde ise, %0.5 alfa lipoik asit eklenen grup ile en

düşük karbonil değeri elde edilmiştir (p<0.05). %0.1 ve %1 düzeyinde alfa lipoik asit

eklenen grup ile kontrol grubu arasında ise önemli bir farklılık bulunmamıştır

(p<0.05). Oksitlendirmenin 5. saatinde ise, en düşük karbonil miktarı %0.5 alfa


21

lipoik asit eklenen örnekler ile sağlanmıştır (p<0.05). Genel lineer model

uygulanarak yapılan tek yönlü varyans analizi sonucunda, tüm saatler göz önüne

alındığında palamut’un protein karbonil düzeyini önemli oranda azaltan alfa lipoik

asit miktarı %0.5 olarak tespit edilmiştir (p<0.05).

Çizelge 4.3. Farklı konsantrasyonlarda alfa lipoik asit içeren Hamsi (100 mg/ml)’nin

Fe+2-katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi sonucu elde

edilen protein karbonil düzeyleri (nmol karbonil/mg protein)

37 ºC’de ki

inkübasyon

süresi (saat)


Kontrol % 0.1 %0.5 %1

0 3,09±0,28a

2,07±0,27b

1,67±0,23b

1,95±0,24b

3 3,75±0,40b

3,79±0,16b

3,05±0,23a

3,46±0,48b

5 2,50±0,10ab

2,44±0,06a

2,57±0,22b

5,23±0,20c

Aynı satırdaki farklı harfler p<0.05 önem düzeyindeki farkı göstermektedir

Oksitlendirme reaksiyonunun başlangıcında, alfa lipoik asit eklenen tüm

örneklerde protein karbonil miktarının önemli bir biçimde azaldığı bulunmuştur

(p<0.05). Bununla birlikte, farklı alfa lipoik asit miktarlarının protein karbonil

düzeyleri üzerine önemli bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir (p>0.05).

Oksitlendirmenin 3. saatinde, %0.5 oranında eklenen alfa lipoik asit miktarının

protein karbonil miktarını önemli oranda azalttığı (p<0.05) fakat diğer oranları ise

önemli düzeyde etkilemediği tespit edilmiştir (p>0.05). Oksitlendirmenin 5. saatinde

ise, kontrol grubu ile %0.1 ve %0.5 düzeyinde alfa lipoik asit eklemesinin önemli bir

etkisi bulunmazken (p>0.05), %1 düzeyinde alfa lipoik asit eklemesinin protein

karbonil düzeyini önemli oranda yükseltmiştir (p>0.05). Genel lineer model

uygulanarak yapılan tek yönlü varyans analizi sonucunda, tüm saatler göz önüne

alındığında %0.5 ve %0.1 alfa lipoik asit eklemesinin protein karbonil düzeyini


22

önemli düzeyde azalttığı, fakat %1 düzeyinde alfa lipoik asit eklemesinin ise protein

karbonil düzeyi üzerine önemli bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir (p<0.05).

Protein oksidasyonu, reaktif oksijen türleri (ROS) ile direkt olarak veya

oksidatif stresin sekonder ürünleri ile reaksiyonu sonucu indirek olarak indüklenen,

proteinlerin kovalent modifikasyonu olarak tanımlanmaktadır (Shacter, 2000).

Protein oksidasyonu, lipit oksidasyonuna benzer şekilde serbest radikal zincir

reaksiyonları şeklinde gelişmektedir.

Protein oksidatif modifikasyonunun pek çok farklı tipi olduğundan, protein

oksidasyonu için genel bir belirteç yoktur. Ancak, protein karbonil grupları oksidatif

indüklü hücresel hasarının en genel belirteci olarak kabul edilmekte ve yaygın olarak

kullanılmaktadır (Berlett ve Stadtman 1997; Chevion ve ark., 2000; Shacter, 2000;

Beal, 2002). Bunun nedenleri arasında, protein karbonil gruplarının birçok farklı

mekanizma ile ortaya çıkabilmesi, stabil olması ve basit ama duyarlı yöntemlerle

ölçülebilir olması sayılabilir (Shan ve ark., 1990). İyonize radyasyon, metal iyon-

katalizli reaksiyonlar, fotokimyasal prosesler ve enzim katalizli redoks reaksiyonları

tarafından oluşturulan reaktif oksijen türleri ile proteinlerin reaksiyonu sonucu

protein oksidasyonu oluşmaktadır. Amino asit yan zincirlerinin hidroksil veya

karbonil türevlerine modifikasyonu, protein-protein çapraz bağlarının oluşumu ve

polipeptit zincirlerinin fragmantasyonu proteinlerin oksidatif reaksiyonlarının

muhtemel sonuçlarıdır. Bunlar arasında, protein karbonil grubu içeriği genel bir

indikatördür ve protein oksidasyonunun en yaygın kullanılan belirtecidir. Protein

karbonil düzeylerinin, peptitlerin ana zincirlerinin ve lizin, prolin, arjinin, ve

treoninin gibi aminoasitlerin yan zincirlerinin oksitlenmesi sonucu oluştuğu

belirtilmektedir (Stadtman ve Berlett, 1998). Ayrıca, amino asitler ile ikincil lipit

oksidasyon ürünlerinin reaksiyonu sonucunda, proteinlerin karbonil gruplarının

oluştuğu öne sürülmektedir (Zamora ve ark., 1999a). Protein karbonil miktarının

ölçülmesinde birçok yöntem kullanılmaktadır. Fakat bunlardan en ucuzu, en hızlısı

ve en güveniliri, protein karbonillerinin 2,4-dinitrofenilhidrazin (DNPH) reaksiyonu

ile spektrofotometrik olarak ölçülmesidir (Berlett ve Stadtman, 1997; Adams ve ark.,

2001; Dalle-Done ve ark., 2003).


23

Biyolojik açıdan önemli geçiş metal iyonları olan Fe ve Cu’nun aracılık ettiği

metal katalazlı oksidasyon (MKO) sistemleri ile, amino asit kalıntılarının okside

olarak protein karbonil türevlerinin düzeylerini arttırdığı gösterilmiştir (Levine ve

ark., 1990; Stadtman ve Oliver, 1991). Demir, hem elektron alıcı hem de elektron

verici özellikte olduğu için redoks reaksiyonlarının katalizlenmesinde önemli bir

katalizördür (Kanner ve ark., 1988). Hidrojen peroksit (H2O2) ve demir tuzu ile

meydana gelen Fenton reaksiyonu, biyolojik sistemlerde oldukça kuvvetli reaktif

hidroksil radikallerinin oluşumunu sağlar (Gutteridge ve ark., 1981; Kanner ve ark.,

1986; Halliwell ve Gutteridge, 1999). Bu mekanizma, süperoksit radikali varlığında

Harber-Weiss reaksiyonu olarak bilinir ve aşağıda gösterildiği şekilde oluşur

(Kehrer, 2000).

Fe2+ + O2 →Fe3+ + .O2

- (1)

2 .O 2 -+ 2H+ → H2O2 + O 2 (2)

Fe2+ + H2O2 → .HO + HO- + Fe3+ (3)

Kuvvetli bir elektrofilik bileşik olan hidroksi radikali, lipitlerin otooksidasyon

zincir reaksiyonlarını hızlandırabilir ve doymamış lipitlerin çift bağlarıyla kolaylıkla

reaksiyona girebilir (Choe ve Min, 2006). Ayrıca, amino asit kalıntılarının yan

zincirlerindeki metal bağlama bölgeleriyle de reaksiyona girerek biyolojik

sistemlerde proteinlerin oksidasyonuna sebep olabilirler (Stadtman ve Oliver, 1991).

Bir geçiş metali olarak demirin, koyu kaslı balıklarda yüksek reaktivitesi ve

konsantrasyonu nedeni ile lipit oksidasyonunda önemli bir prooksidan olduğu daha

önceki çalışmalarda bulunmuştur (Hultin, 1992; Mei ve ark., 1998; Richards ve ark.,

2002; Richards ve Hultin, 2003; Undeland ve ark., 2004). Fenton kimyası ile elde

edilen oksitlendirmenin balıklarda protein karbonil düzeyine etkisi ile ilgili

çalışmalar oldukça sınırlıdır. Tokur ve Korkmaz (2007a) yapmış oldukları bir

çalışmada, Fe+2/H2O2 oksitlendirme sistemi ile özellikle palamut ve sardalyada 5

saatlik 37 oC’deki inkübasyon sonucunda, protein karbonil düzeylerinin arttığını


24

bulmuştur. Bu çalışmada da, 5 saatlik Fe+2/H2O2 ile inkübasyonu sonucunda

çipuraların karbonil düzeyi 3,05 nmol karbonil/mg proteinden 4, 89 nmol

karbonil/mg proteine, palamutların karbonil düzeyleri ise 2,06 nmol karbonil/mg

protein’ den 2,49 nmol karbonil/mg proteine kadar yükselmiştir. Benzer sonuçlar,

uzun süreli Fe+2/H2O2 oksidasyon sistemine maruz kalan etlerde (Mercier ve ark.,

2004) ve farklı oksitlendirme sistemlerinde de bulunmuştur (Batifoulier ve ark.,

2002). Srinivasan ve Hultin (1995) adlı araştırıcılar, soğukta depolanan uskumru

filetolarının başlangıcı ile 8. günleri arasında protein karbonil düzeylerinin enzimatik

olmayan serbest radikal oluşturan sislemle inkübe edildiklerinde önemli bir oranda

arttığını tespit etmişlerdir. Benzer şekilde, yine aynı araştırıcıların yapmış oldukları

başka bir çalışmada, yıkanmış ve kıyılmış morina kaslarının 5 oC’de 2 ile 24 saatlik

serbest radikal üreten sistemle inkübe edildiğinde protein karbonil düzeylerinin

arttığını tespit etmişlerdir (Srinivasan ve Hultin, 1997).

Tioktik asit olarak da bilinen alfa lipoik asit (ALA), ilk olarak 1950'de sığır

karaciğerinden izole edilmiştir (Reed, 2001). ALA (kimyasal adı: 1,2-ditiolan-3-

pentanoik asit), (şekil 3.1.) prokaryotik ve ökaryotik hücrelerin bütün türlerinde

bulunmaktadır. Özellikle, yüksek metabolik aktiviteli dokulardan elde edilen

gıdalarda yüksek düzeyde bulunmaktadır (Herbert ve Guest, 1975; Mattulat ve

Baltes, 1992). Metabolik organlardan domuz kalbi gibi etler 1.1-1.6 mg/kg ALA

içeriğine sahipken, buzağı kasında ise sadece 0.07-0.15 mg/kg vardır (Mattulat ve

Baltes, 1992). Aynı zamanda ALA, insanlarda enerji formuna katılan birbirinden

farklı 2-okzo asit dehidrojenezin parçasıdır ve 2-okzo asit dehidrojenez multienzim

komplekslerinin lizin atıklarına bağlanarak kofaktör olarak görev alır (Fujiwara ve

ark., 1995; Morris ve ark., 1995). Piruvat dehidrojenaz, α-ketoglutarat dehidrojenaz

ve glisin dekarboksilaz gibi çeşitli enzimlerde açil gruplarını bağlar ve onların enzim

kompleksini bir yerinden diğer bir yerine transfer eder. Alfa lipoik asitin gıdalarda

antioksidan kullanımıyla ilgili herhangi bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bunun

yanında, in vivo yapılan birçok çalışma, yemlere eklenen ALA’nın iyi bir antioksidan

olduğu, oksidatif stresi azalttığı ve diğer antioksidanların azalmış düzeylerini

yeniden onardığını göstermiştir. Ayrıca, diyetteki ALA’nın antiobezite etkisinin

bulunduğu ve hayvanların büyüme performansı üzerine olumlu etkisinin olduğu


25

tespit edilmiştir (Moini ve ark., 2002; Kim ve ark., 2004). In vitro koşullarda yapılan

çeşitli model sistemlerle elde edilen sonuçlara göre, ALA ve DHLA, ROS’un etkisini

azaltmada yüksek reaktiviteye sahip olduğu bulunmuştur. Ayrıca, 0.05-1mM

konsantrasyonlardaki alfa lipoik asitin, hidroksi radikaller, hipoklorus asit ve singlet

oksijene karşı iyi bir tutucu olduğu öne sürülmüştür (Moini ve ark., 2002). Bu

çalışmada, bir antioksidan olarak alfa lipoik asitin protein oksidasyonunu

engellemede balık türlerine göre farklılık gösterdiği bulunmuştur. Bu sonucu

etkileyen birçok sebep olabilir. Balık türüne ve hatta aynı türdeki farklı bireylere ve

yaşlara göre değişebileceği gibi (Tokur ve Korkmaz, 2007b; Tokur ve Polat, 2010)

her birinin kendine özgü antioksidan/prooksidan sisteme sahip olabileceği de

(Stadtman ve Levine, 2003) bunlar arasında sayılabilir.

4.2. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE)

Araştırmada ml’ de 100 mg çipura, palamut ve hamsi eti bulunan

homojenatların 37 oC’deki 0, 3 ve 5 saatlik Fe+2-katalizli oksitlendirme sistemi ile

oksitlendirilmesi sonucu elde edilen protein profillerinin molekül ağırlığına göre

dağılımı Şekil 4.1, 4.2 ve 4.3 ’ de gösterilmiştir.


26

Şekil 4.1. Çipura, palamut ve hamsinin 37 oC’ de oksitlendirme reaksiyonunun

başlangıcında, Fe+2-katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi

sonucu elde edilen protein profillerinin molekül ağırlığına göre dağılımı.

Örneklerin elektroforezi β-mercaptoetanol’ün yokluğunda (A) ve

varlığında (B) gerçekleştirilmiştir (K: Kontrol, 1: %0.1 alfa lipoik asit, 2:

%0.5 alfa lipoik asit, 3: %1 alfa lipoik asit, MW: moleküler ağırlık).


27

Proteinlerdeki S-S köprüsünü indirgeyen β-merkaptoetanol’ün varlığında ve

yokluğunda yapılan SDS-PAGE analizlerine göre, oksitlendirme reaksiyonunun

başlangıcında Fe+2-katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilen ve farklı

düzeylerde alfa lipoik asit eklenen çipura, palamut ve hamsi türlerinin protein bant

yoğunlukları üzerine etkisi Şekil 4.1’de görülmektedir. Bu analiz sonucuna göre,

farklı düzeylerde alfa lipoik asit eklemesinin çipura ve palamut türlerinin protein

bant yoğunlukları üzerine önemli bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Buna

rağmen, hamsi balığının kontrol grubundaki (K) bant yoğunluğunun alfa lipoik asit

eklemesi yapılan örneklere göre daha farklı olduğu, diğer örneklerde ise 90 kDa’a

yakın moleküler ağırlığa sahip bantların yoğunluğunun özellikle %1 düzeyinde alfa

lipoik asit eklenen örneklerde daha az olduğu dikkat çekmektedir. Elektroforez

bantlarındaki yoğunluğun azalması proteinlerin denatüre olarak daha yüksek

moleküler ağırlıklı polimerler oluşturduğunu göstermektedir. Bu çalışmada, %1 gibi

yüksek oranda yapılan alfa lipoik asit eklemesinin oksitlendirme sonucu oluşan

polimerleşmeyi engellemediği, aksine artırdığı saptanmıştır. Başka bir ifadeyle,

yüksek oranda kullanılan alfa lipoik asit eklemesinin hamsi balığı için bir bakıma

prooksidan olarak rol oynadığı görülmüştür. Alfa lipoik asitin kuvvetli bir

antioksidan olmasının yanı sıra bir prooksidan olarak rol oynadığı ile ilgili bilimsel

çalışmalar mevcuttur (Moini ve ark., 2002, Biewenga ve ark., 1997). İndirgen madde

içeren elektroforez örneklerinde ise, hamsi dışında yine çipura ve palamut’un bant

yoğunlukları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, alfa lipoik asit eklemesinin önemli

bir etkisi görülmezken, hamside %1 düzeyinde alfa lipoik asit eklenen örneğin

hemen hemen tüm bant yoğunluklarında bir azalma görülmüştür. Bu azalmanın β-

merkaptoetanol’ün varlığında ve yokluğunda görülmesi polimerleşmenin disülfit

olmayan kovalent bağlarla gerçekleştiğini göstermektedir (Decker ve ark., 1993;

Saeed ve Howell, 2002).


28

Şekil 4.2. Çipura, palamut ve hamsinin 37 oC’ de 3 saatlik Fe+2-katalizli

oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilme sonucu elde edilen protein

profillerinin molekül ağırlığına göre dağılımı. Örneklerin elektroforezi

β-merkaptoetanol’ün yokluğunda (A) ve varlığında (B)

gerçekleştirilmiştir (K: Kontrol, 1: %0.1 alfa lipoik asit, 2: %0.5 alfa

lipoik asit, 3: %1 alfa lipoik asit, MW: moleküler ağırlık).


29

Oksitlendirmenin 3. saati için yapılan elektroforez analizinde, indirgen

maddenin yokluğunda, kontrol ve alfa lipoik asit eklenen çipura örneklerindeki

protein bant yoğunluğunda herhangi bir değişiklik görülmemiştir. Aynı şekilde,

kontrol grubu ve %0.1 oranında alfa lipoik asit eklenen palamut örnekleri arasında

önemli bir farklılık görülmemiştir. Ancak, %0.5 oranında alfa lipoik asit eklenen

örneğin 116 kDa molekül ağırlığına yakın protein bantlarının yoğunluğunda bir

azalma olduğu görülmüştür. 26,60 kDa’ın altındaki iki bantta ise tamamen

kaybolduğu görülmüştür. %1 oranında alfa lipoik asit eklenen örneklerde ise, 116

kDa’nın üstündeki molekül ağırlığına yakın protein bantlarının yoğunluğundaki

azalmanın, %0.5 düzeyinde alfa lipoik asit eklenen örneğe göre daha fazla olduğu ve

26,60 kDa’ın altında iki bandında %0.5 alfa lipoik asit eklenen örnekte olduğu gibi

tamamen kaybolduğu tespit edilmiştir. Hamside ise, 3 saatlik oksitlendirme

sonucunda özellikle alfa lipoik asit içeren örneklere göre kontrol grubunun 116 kDa

molekül ağırlığına sahip protein bandının daha yoğun olduğu görülmektedir.

İndirgen maddenin varlığında yapılan analiz sonucuna göre ise, indirgen maddenin

yokluğunda olmayan düşük moleküler ağırlıklı yeni bantların oluştuğu

görülmektedir. Bu da oksitlendirmenin 3. saatinde disülfit köprüleriyle kovalent

polimerleşmenin olduğunu göstermektedir. Burada elde edilen verilere benzer

şekilde, yapılan birçok çalışma MKO sistemi ile oksitlendirilen proteinlerin disülfit

çapraz bağları ile polimerleştiğini ve/ veya bölündüğünü göstermiştir (Liu ve Xiong,

2000; Ooizumi ve Xiong, 2004; Thanonkaew ve ark., 2006). Elektroforez

sonuçlarından elde edilen bu sonuçlara göre, alfa lipoik asitin hamsi için iyi bir

antioksidan olmadığı hatta yüksek düzeylerde kullanıldığında bir prooksidan olarak

rol oynadığı bulunmuştur.


30

Şekil 4.3. Çipura, palamut ve hamsinin 37 oC’ de 5 saatlik Fe+2-katalizli

oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilme sonucu elde edilen protein

profillerinin molekül ağırlığına göre dağılımı. Örneklerin elektroforezi β-

merkaptoetanol’ün yokluğunda (A) ve varlığında (B) gerçekleştirilmiştir

(K: Kontrol, 1: %0.1 alfa lipoik asit, 2: %0.5 alfa lipoik asit, 3: %1 alfa

lipoik asit)


31

Oksitlendirmenin 5. saati diğer saatlerle karşılaştırıldığında indirgen

maddenin yokluğunda, çipura balığının bant yoğunluklarının tüm örneklerde azaldığı

yani çoğu proteinin okside olarak polimerleştiği görülmektedir. Kontrol grubu ile

alfa lipoik asit eklenen örnekler karşılaştırıldığında ise, alfa lipoik asitin bir

antioksidan olarak önemli bir etkisinin olmadığı görülmektedir. İndirgen maddenin

varlığında ise, özellikle 26,60 kDa’ın altındaki protein bantlarının yok olduğu fakat

bazı bantların yoğunluğunda ise artış olduğu görülmektedir. Palamutta ise, diğer

saatlerle karşılaştırıldığında, özellikle indirgen maddenin yokluğunda, kontrol grubu

ve %0.1 düzeyinde alfa lipoik asit içeren örneklerin protein yoğunluğunda bir azalma

olduğu görülmüştür. Fakat bu azalma, %0.5 ve %1 alfa lipoik asit eklenen örneklerde

görülen azalmadan çok daha az olduğu tespit edilmiştir. %0.5 alfa lipoik asit içeren

örneklerde bantların çoğunun yok olduğu ve bantların yoğunluğunun azaldığı

görülmüştür. %1 düzeyinde alfa lipoik asit eklenen örneklerde de bant yoğunluğunda

bir azalmanın olduğu fakat %0.5 düzeyinde eklenen örneklere göre daha az olduğu

tespit edilmiştir. İndirgen maddenin varlığında ise, özellikle 26,60 kDa’ın moleküler

ağırlığın üzerinde yeni bantların ortaya çıktığı görülmektedir. Hamsi balığında ise,

indirgen maddenin yokluğunda 90 kDa’ın üzerindeki ve 26,60 kDa’ın altındaki tüm

bantların hem kontrol grubundaki örneklerde hem de alfa lipoik asit eklenen

örneklerde tamamen ortadan kalktığı görülmüştür (Şekil 4.3-A). Bununla birlikte

kontrol grubu ile %0.1 düzeyinde alfa lipoik asit içeren örneklerde 90 kDa moleküler

ağırlığına sahip proteinlerle 26,60 kDa’lık moleküler ağırlığına sahip protein

bantlarının arasındaki proteinlerin yoğunluğunun %0.5 ile %1 düzeyinde alfa lipoik

asit içeren örneklere göre daha yoğun olduğu tespit edilmiştir. İndirgen maddenin

varlığında ise, kaybolan bu bantların 26,60 kDa’ın üzerinde moleküler ağırlığa sahip

proteinlerde olduğu görülmüştür. Tokur ve Korkmaz (2007a), Fe+2-katalizli

oksidasyon sisteminde 3 saatlik inkübasyon sonucunda hamsi’nin 50 kDa’dan daha

büyük moleküler ağırlığa sahip protein bantlarının tamamen yok olduğunu

bulmuştur. Bu sonuç, bu çalışmada hamsi ile yapılan örneklerdeki sonuçlarla

benzerlik göstermektedir.

Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, Fe+2-katalizli oksitlendirme sonucu

oluşan polimerleşme ve/veya çökelmenin daha çok disülfit kovalent bağlarla


32

meydana geldiğini göstermektedir. Bunun yanında disülfit olmayan kovalent

bağlarında oksitlendirme sonucu meydana geldiği görülmektedir. Yapılan birçok

çalışmada, proteinlerin oksidatif modifikasyonu sonucunda intra veya inter protein

çapraz bağların oluştuğu ve bunu etkileyen birçok mekanizmanın bulunduğu

belirtilmektedir. (Jiang ve Lee, 1985; Stadtman, 1990; Berlett ve Stadtman, 1997;

Dalle-Done ve ark., 2001; Stadtman ve Levine, 2003). Stadtman (1990), reaktif

oksijen türlerinin meydana getirdiği oksitlenme sonucu ortaya çıkan protein-protein

çapraz bağ oluşumunu şu şekilde özetlemiştir: (a) Bir proteinin karbonil grubu ile

diğer proteinin lizin amino asidinin N-ɛ-amino grubu ile reaksiyonu sonucu Schiff-

baz çapraz bağlanmış türevlerinin oluşumu, (b) aynı proteinin veya iki farklı

proteinin sistin kısmının oksitlenmesi sonucu intra veya inter disulfit çapraz

bağlanmış türevlerin oluşması, (c) proteinlerin histidin, lizin veya sistein

kalıntılarına doymamış aldehit gruplarının bağlanması sonucu aldehidrik grup

oluşmasıyla diğer proteinin Schiff baz protein–protein çapraz bağlanmış türevlerin

oluşması (d) protein–protein çapraz bağları, bağlanmış iki farklı proteinin lizin

kalıntılarıyla çok doymamış yağ asitlerinin (PUFA) oksidasyonu sonucu oluşan

malonaldehitin aldehit grubuyla birleşerek oluşması diye sıralanabilir. Bu çalışmada

da, koyu renkli kas içeren hamsi ve palamuda göre beyaz renkli kas içeren çipura

arasında faklılıklar olduğu görülmektedir. Özellikle koyu renkli kaslara sahip

balıkların Fe+2-katalizli oksitlenmeye karşı daha hassas olduğu görülmektedir. Bunun

sebeplerinden birisinin, bu balıkların kaslarında çok daha fazla doymamış yağ

asitlerine sahip olmalarından kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Çünkü yapılan

çalışmalarda, lipit oksidasyon ürünlerinin, proteinlerin primer yapılarını değiştirerek

üçüncül ve sekonder yapılarınında değişmesine sebep olduğu saptanmıştır (Meng ve

ark., 2005). Ayrıca, lipit oksidasyon ürünleri tarafından proteinlerin oksidasyonu ile,

amino asitlerin yan zincirlerinin oksitlenmesine, peptit bağlarının ayrılmasına ve

kovalent protein-protein çapraz bağlı bileşiklerin oluşmasına neden olduğu tespit

edilmiştir (Zhu ve ark., 1994; Stadtman ve Berlett, 1997; Hidalgo ve Zamora, 2000;

Zamora ve ark., 2000). Bunun sonucunda, inaktif bileşiklerin oluştuğu, proteinlerin

çökeldiği ve protein çapraz bağların oluştuğu gösterilmiştir (Saeed ve ark., 1999;

Refsgaard ve ark., 2000; Stadtman ve Levine, 2003; Saeed ve Howell, 2004). Diğer


33

bir sebepte, koyu renkli kaslara sahip balıkların kas dokularındaki kan proteinlerinin

demir ve oksijeni daha fazla içermesinden dolayı olabilir. Çünkü daha önce yapılan

çalışmalarda, bir geçiş metali olarak demirin, siyah kaslı balıklarda yüksek

reaktiviteye sahip olduğu ve konsantrasyonun fazlalığı nedeni ile lipit

oksidasyonunda önemli bir prooksidan olduğu bulunmuştur (Hultin, 1992, Mei ve

ark., 1998; Richards ve ark., 2002; Richards ve Hultin, 2003; Undeland ve ark.,

2004).

Yapılan çalışmalarda, proteinlerin gıdalarda farklı model sistemlerde bir

antioksidan olarak görev yaptığı ve lipit oksidasyonunu azalttığı belirtilmektedir.

Proteinlerin ve amino asitlerin antioksidan mekanizması gıda sistemlerinde şöyle

açıklanmaktadır: (1) lipit hidroperoksit-geçiş metal interaksiyonunun oluşmasını en

aza inderek (2) pro-oksidatif metalleri tutarak (3) proteinlerde bulunan sülfidril

gruplar nedeniyle serbest radiakelleri inaktive ederek. Bunlara ek olarak, protein,

peptit ve amino asitlerin lipit oksidasyonunun sebep olduğu hasarları engellemede

sahip oldukları bazı amino asitlerden (histidin, lizin, tiyrozin, fenilalanin, tiriptofan,

prolin, metiyon ve sistin) kaynaklandığı düşünülmektedir. Bu çalışmada, belki de

palamut ve hamside bulunan bu proteinler bir antioksidan görevi görerek lipitlerin

oksidasyonunu da engellemiş olabilir. Fakat bu yorumu yapabilmek için mutlaka lipit

oksidasyonununda değerlendirilmesi gerekmektedir.

Bu çalışmada, protein bantlarının elektroforetik analizi sonucunda, alfa lipoik

asidin bir antioksidan olarak protein bantlarının yoğunluğunun muhafazasında

önemli bir etkiye sahip olmadığı hatta hamsi gibi koyu renkli kasa sahip balıklarda

%1 gibi yüksek düzeylerde kullanıldığında prooksidan olarak görev yaptığı

saptanmıştır.

Son zamanlarda, tıp ve farmakolojik alanlarında ALA ile yapılan model

sistemlerden elde edilen sonuçlara göre, ALA’nın antioksidan etkisi ile

intramoleküler disülfit oluşumunu katalizleyen etkilere karşı koruyuculuğu

konusunda farklı görüşler bulunmaktadır (McCarty, 2001). In vitro model

sistemlerde yapılan bazı çalışmalar, ALA’nın direkt veya indirekt olarak hücresel

proteinlerin oksitlenmesine sebep olacağı gözlenmiştir (Moini ve ark., 2002). Bu

bulgular bizim elde ettiğimiz sonuçları destekler niteliktedir. Bu çalışmada da, jel


34

örneklerinde de görüldüğü gibi, ALA’nın özellikle koyu renkli kaslara sahip hamsi

ve palamut örneklerinde bir prooksidan olarak rol oynadığı saptanmıştır.

5.SONUÇ VE ÖNERİLER GAMZE ÖZKALAY

35

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

5.1. Sonuçlar

In vitro koşullarda Fe+2-katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilerek

farklı düzeylerdeki alfa lipoik asitin çipura, palamut ve hamsinin protein

oksidasyonuna ve denatürasyonuna olan etkisinin incelendiği bu çalışmada, aşağıda

belirtilen sonuçlar bulunmuştur.

1. Genel lineer model uygulanarak yapılan tek yönlü varyans analizi sonucunda, tüm

saatler göz önüne alındığında çipura protein karbonil düzeyini önemli oranda azaltan

alfa lipoik asit miktarı %1 olarak tespit edilmiştir (p<0.05). Bunu sırasıyla %0.1,

%0.5 ve kontrol izlemiştir.


saatler göz önüne alındığında palamutun protein karbonil düzeyini önemli oranda

azaltan alfa lipoik asit miktarı %0.5 olarak tespit edilmiştir (p<0.05).


saatler göz önüne alındığında hamsiye %0.5 ve %0.1 alfa lipoik asit eklemesinin

protein karbonil düzeyini önemli oranda azalttığı, fakat %1 düzeyinde alfa lipoik asit

eklemesinin ise protein karbonil düzeyi üzerine önemli bir etkisinin olmadığı tespit

edilmiştir (p<0.05).

4. Protein bantlarının elektroforetik analiz sonucunda, alfa lipoik asitin bir

antioksidan olarak protein bantlarının yoğunluğunun muhafazasında önemli bir

etkiye sahip olmadığı hatta hamsi ve palamut gibi koyu renkli kasa sahip balıklarda

%1 gibi yüksek düzeylerde kullanıldığında prooksidan olarak görev yaptığı

saptanmıştır.

5. Hem protein karbonil değeri hem de elektroforez sonuçları balıklarda Fe+2-

katalizli oksitlendirme sisteminin etkili bir oksitlendirme ajanı olduğunu göstermiştir.

6. Protein karbonil ve elektroforez verilerine göre, alfa lipoik asit’ in etki düzeyinin

antioksidan veya prooksidan olarak türlere göre farklılık gösterdiği bulunmuştur.

5.SONUÇ VE ÖNERİLER GAMZE ÖZKALAY

36

7. Her ne kadar alfa lipoik asit eklemesi protein karbonil düzeyini azaltsa da

elektroforez örnekleri göz önüne alındığında çipura, palamut ve hamsi gibi türler için

gıda katkı maddesi olarak iyi bir antioksidan olmadığı düşünülmektedir.

5.2. Öneriler

Bu çalışmadan elde edilen verilere göre gelecekte bu konu ile ilgili çalışacak

bilim adamlarının göz önünde bulundurması gerekli konular aşağıdaki şekilde

özetlenmiştir.

1. Alfa lipoik asit, tıp ve farmakoloji bilim dalında bir antioksidan olarak yoğun

olarak çalışılmıştır. Bu çalışmada, alfa lipoik asit ilk defa gıda katkı maddesi

olarak protein kalitesine olan etkisi ile araştırılmıştır. Fakat elde edilen

çalışmanın sonucuna göre, alfa lipoik asitin gıdalarda katkı maddesi olarak

balıklarda kullanılmasının protein kalitesi açısından uygun olmadığı

bulunmuştur.

2. Biyolojik sistemlerde oldukça karmaşık ve birbiriyle ilişkili birçok

mekanizma gerçekleşmektedir. In vitro koşullarda elde edilen veriler her

zaman gerçek sonuçları vermeyebilir. Bu nedenle, in vivo çalışmalarında

mutlaka yapılması ve alfa lipoik asitin antioksidan veya prooksidan etkisinin

buna göre değerlendirilmesi gereklidir.

3. Alfa lipoik asit, hem suda hem de yağda çözünen bir madde olmasına

rağmen, yapılan in vitro çalışmalarda, suda iyi çözünmediği ve bu nedenle

antioksidan olarak iyi bir şekilde değerlendirilemediği öne sürülmektedir. Bu

çalışmada da, protein karbonil düzeyindeki farklılıklar göz önüne alındığında

alfa lipoik asitin tampon çözeltide homojenizasyonu ile çözündüğü

düşünülmektedir. Fakat bu çalışmanın yine de diğer çalışmalarda belirtildiği

üzere Na-ALA haline getirilerek uygulanması, bir antioksidan olarak

kullanılabileceğini veya kullanılamayacağını daha net ortaya çıkaracaktır.

37

KAYNAKLAR

ADAMS, S., GREEN, P., CLAXTON, R., SIMCOX, S., WILLIAMS, M.V.,

WALSH, K. 2001. Reactive carbonyl formation by oxidative and

nonoxidative pathways. Front. Biosci. 6:17–24.

ARIVAZHAGAN, P., THILAKAVATHY, T., RAMANATHAN, K., KUMARAN,

S., PANNEERSELVAM, C. 2002. Effect of DL-α-lipoic acid on the status of

lipid peroxidation and protein oxidation in various brain regions of aged rats.

J. Nutr. Biochem. 13:619–624.

ATMACA, G. 2003. Sarımsağın ve bazı Tiol İçeren Bazı Bileşiklerin Antioksidatif

Etkileri. Trakya Üni. Tıp Fak. Derg. (1-3):54-60.

BATIFOULIER, F., MERCIER, Y., GATELLER, P., RENERRE, M. 2002.

Influence of Vitamin E on lipid and protein oxidation induced by H2O2-

activated MetMb in microsomal membranes from turkey muscle. Meat Sci.

61:389–395.

BEAL, M.F. 2002. Oxidatively modified proteins in aging and disease. Free Radic

Biol. Med. 32:797-803.

BERLETT, B.S., STADTMAN, E.R. 1997. Protein oxidation in aging, disease, and

oxidative stres. J. Biol. Chem. 272:20313-20316.

BIEWENGA, G., DE JONG, J., BAST, A. 1994. Lipoic acid favors thiolsulfinate

formation after hypochlorous acid scavenging: a study with lipoic acid

derivatives. Arch. Biochem. Biophys. 312:114-20.

BIEWENGA, GP., HAENEN, GR., BAST, A. 1997. The pharmacology of the

antioxidant lipoic acid. Gen. Pharmacol. 29 (3):315-331.

BIRIDGEWATER, J. D., LIM, J., VACHET, R. W. 2006. Transition metal–peptide

binding studied by metal-catalyzed oxidation reactions and mass

spectrometry. Anly. Chem. 78:2432–2438.

CHEN, H.J., WU, S.B., CHANG, C.M. 2003. Biological and dietary antioxidants

protect against DNA nitration induced by reaction of hypochlorous acid with

nitrite. Arch. Biochem. Biophys. 415:109-16.

38

CHEVION, M., BERENSHTEIN, E., STADTMAN, E.R. 2000. Human studies

related to protein oxidation: protein carbonyl content as a marker of damage.

Free Radic Res. 33:99-108.

CHOE, E., MIN, D.B. 2006. Critical Reviews in Food Sci. Nutr. 46:1–22.

ÇAKATAY, U., KAYALI, R. 2004. Plasma protein oxidation in aging rats after

alpha-lipoic acid administration. Biogerontol. 6:87–93.

DALLE-DONE, I., ROSSI, R., GIUSTARINI, D., LUSINI, L., MILZANI, A.,

SIMPLICIO, P.D. 2001. Actin carbonylation: from a simple marker of

protein oxidation to relevant signs of severe functional impairment. Free

Radical Biol. Med. 31:1075–1083.

DALLE-DONE, I., ROSSI, R., GIUSTARINI, D., MILZANI, A., COLOMBO, R.

2003. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clin. Chim.

Acta. 329:23–38.

DECKER, E.A., XIONG, Y. L., CALVERT, J.T., CRUM, A.D., & BLANCHARD,

S.P. 1993. Chemical, physical, and functional properties of oxidized turkey

white muscle myofibrillar proteins. J. Agric. Food Chem. 41:186–189.

FUJIWARA, K., OKAMURA-IKEDA, K., MOTOKAWA, Y. 1995. Assay for

protein lipoylation reaction. Meth. Enzym. 251:333-350.

GORALSKA, M., DACKAR, R., HOLLEY, B., MCGAHAN, M.C. 2003. Alpha

lipoic acid changes iron uptake and storage in less epitelial cells. Exp. Eye.

Res. 76 (2):241-48.

GRIFFITHS, H.R. 2000. Antioxidant and protein oxidation. Free Rad. Res. 33:47-

58.

GRUNERT, R.R. 1960. The effect of DL α-lipoic acid on heavy-metal intoxication

in mice and dogs. Arch. Biochem. Biophys. 86:190-194.

GUTTERIDGE, J. M. C., ROWLEY, D. A., HALLIWELL, B. 1981. Superoxide

dependent formation of hydroxyl radical in the presence of iron salts.

Biochem. J. 199:263–265.

HALLIWELL, B., GUTTERIDGE, J.M.C. 1999. The chemistry of free radicals and

related ‘reactive species’. Free Radicals Biol. Med. 36–100.

39

HERBERT, A.A., GUEST, J.R. 1975. Lipoic acid content of Escherichia coli and

other microorganisms. Arch. Microbiol. 106:259-266.

HIDALGO, F.J., ZAMORA, R. 2000. Modification of bovine serum albumin

structure following reaction with 4,5(E)-Epoxy-2(E)-heptenal. Chem. Res.

Toxicol. 13:501-508.

HULTIN, H.O. 1992. Biochemical deteriotion of fish muscle H. Huss M. Jakobsen

ve J. Liston (Editör),Quality Assurance. Fish Industry, Amsterdam, pp. 125-

139.

JIANG, S., LEE, T. 1985. Changes in free amino acids and protein denaturation of

fish muscle during frozen storage. J. Agric. Food Chem. 33:839–844.

KANNER, J., HAREL, S., HAZAN, B. 1986. Muscle Membranal Lipid Peroxidation

by an “Iron Redox Cycle” System: Initiation by Oxy Radicals and Site-

Specific Mechanism. J. Agric. Food Chem. 34:506-510.

KANNER, J., HAZAN, B., DOLL, L. 1988. Catalytic “Free” Iron Ions in Muscle

Foods. J. Agric. Food Chem. 36:412-415.

KATO, Y., KITAMOTO, N., KAWAI, Y., OSSAWA, T. 2001. The hydrogen

peroxide/copper ion system, but not other metal-catalyzed oxidation systems,

produces protein-bound dityrosine. Free Radical Biol. Med. 31:624–632.

KEHRER, J.P. 2000. The Haber–Weiss reaction and mechanisms of toxicity.

Toxicol. 149 :43–50.

KEITH, R.L., SETIARAHARDJO, I., FERNANDO, Q. 1997. Utilization of renal

slices to evaluate the efficacy of chelating agents for removing mercury from

the kidney. Toxicol. 116:67-75.

KIM, M.S., PARK, J.Y., NAMKOONG, C., JANG, P.G., RYU, J.W., SONG, H.S.,

YUN, J.Y., NAMGOONG, I.S., HA, J., PARK, I.S., LEE, I.K., VIOLLET,

B., YOUN, J.H., LEE, H.K., LEE, K.U. 2004. Anti-obesity effects of alpha-

lipoic acid mediated by suppression of hypothalamic AMPactivated protein

kinase. Nature .Med. 10(7):727-733.

LAEMMLI, U.K. 1970. Cleavage of stuctural proteins during the assembly of the

head of bacteriophage T4. Nature. 277:680–685.

40

LEVINE, RL., GARLAND, D., OLIVER, CN., AMICI, A., CLIMENT, I., LENZ,

A.G., AHN, B.W., SHALTIEL, S., STADTMAN, E.R. 1990. Determination

of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Meth. Enzymol.

186:464–478.

LEVINE, R.L., WILLIAMS, J.A., STADTMAN, E.R., SHACTER, E. 1994.

Carbonyls assays for determination of oxidatively modified proteins. Meth.

Enzymol. 23:346–357.

LIU, G., XIONG, Y.L. 2000. Electrophoretic pattern, thermal denaturation, and in

vitro digestibility of oxidized myosin. J. Agric. Food Chem. 48:624-630.

MADURAWE, R. D., LUMPKIN, J. A. 1997. Quantitation of protein damage in

metal ion-catalyzed oxidation systems. Chem. Eng. Commun. 162:23–44.

MARTINAUD, A., MERCIER, Y., MARINOVA, P., TASSY, C., GATELLIER, P.,

RENERRE, M. 1997. Comparison of oxidative processes on myofibrillar

proteins from beef during maturation and by different model oxidation

systems. J. Agric. Food Chem. 45:2481–2487.

MATTULAT, A., BALTES, W. 1992. Determination of lipoic acid in meat of

commercial quality. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194:326-329.

MCCARTY, M.F. 2001. Versatile cytoprotective activity of lipoic acid may reflect

its ability to activate signalling intermediates that trigger the heat-shock and

phase II responses. Med. Hypoth. 57:313–317.

MEI, L., DECKER, E.A., MCCLEMMENTS, D.J. 1998. Evidence of iron

association with emusion droplets and its impact on lipid oxidation. J. Agric.

Food Chem. 46:5072–5077.

MENG, G., CHAN, J.C.K., ROUSSEAU, D., LI-CHAN, E.C.Y. 2005. Study of

protein-lipid interactions at the bovine serum albumin/oil interface by raman

microspectroscopy. J. Agric. Food Chem. 53:845-852.

MERCIER, Y., GATELLER, P., Renerre, M. 2004. Lipid and protein oxidation in

vitro, and antioxidant potential in meat from Charolais cows finished on

pasture or mixed diet. Meat Sci. 66(2): 467–473.

41

MOINI, H., PACKER, L., SARIS, NILS-ERIK, L. 2002. Antioxidant and Prooxidant

Activities of α-Lipoic Acid and Dihydrolipoic Acid. Toxicol. App.

Pharmacol. 182:84–90.

MORRIS, T.W., REED, K.E., CRONAN, J. E. 1995 Lipoic acid metabolism in

Escherichia coli: the lplA and lipB genes define redundant pathways for

ligation of lipoyl groups to apoprotein. J. Bacteriol. 177:1-10.

MULLER, L., MENZEL, H. 1990. Studies on the efficacy of lipoate and

dihydrolipoate in the alteration of cadmium toxicity in isolated hepatocytes.

Biochem. Biophys. Acta. 1052:386-391.

OOIZUMI, T., XIONG, Y.L. 2004. Biochemical susceptibility of myosin in chicken

myofibrils subjected to hydroxyl radical oxidizing systems. J. Agric. Food

Chem. 52:4303–4307.

PACKER, L., WITT, E.H., TRITSCHLER, H.J. 1995. Alpha-lipoic acid as a

biological antioxidant. Free Radic Biol. Med. 19:227-250.

PERRICONE, N., NAGY, K., HORVATH, F., DAJKO, G., URAY, I., ZS.-NAGY,

I. 1999. Alpha lipoic acid (ALA) protects proteins against the hydroxyl free

radical-induced alterations: rationale for its geriatric topical application. Arch.

Gerontol. Geriatr. 29:45-56.

PIRLICH, M., KIOK, K., SANDIG, G., LOCHS, H., GRUNE, T. 2002. Alpha-lipoic

acid prevents ethanol-induced protein oxidation in mouse hippocampal HT22

cells. Neurosci. Letter. 328:93–96.

REED, L.J. 2001. A trail of research from lipoic acid to alpha-keto acid

dehydrogenase complexes. J. Biol. Chem. 276:38329–38336.

REFSGAARD, H.F., TSAI, L., STADTMAN, E.R. 2000. Modifications of proteins

by polyunsaturated fatty acid peroxidation products. PNAS. 2:611-616.

REQUENA, J.R., LEVINE, R.L., STADTMAN, E.R. 2003. Recent advances in the

analysis of oxidized proteins. Amino Acids 25:221–226.

RICHARDS, M.P., ØSTDAL, H., ANDERSEN, H.J. 2002. Deoxyhemoglobin

mediated lipid oxidation in washed fish muscle. J. Agric. Food Chem.

50:1278–1283.

42

RICHARDS, M.P., HULTIN, H.O. 2003. Hemolysates from mackerel, herring and

trout promoto lipid oxidation at different rates. Fish Sci. 69:1298–1300.

SAEED, S., FAWTHROP, S.A., HOWELL, N.K. 1999. Electron spin resonance

(ESR) study on free radical transfer in fish-protein interaction. J. Sci. Food

Agric. 79:1809–1816.

SAEED, S., HOWELL, N. K. 2002. Effect of lipid oxidation and frozen storage on

muscle proteins of Atlantic mackerel (Scomber scombrus). J. Sci. Food

Agric. 579–586.

SAEED, S., HOWELL, N.K. 2004. Rheological and differential scanning

calorimetry studies on structural and textural changes in frozen Atlantic

mackerel (Scomber scombrus). J. Sci. Food Agric. 84:1216–1222.133.

SHACTER, E. 2000. Quantification and significance of protein oxidation in

biological samples. Drug Metab. Rev. 32:307-326.

SHAN, X, AW, T., JONES, D.P. 1990. Glutathione-dependent protection against

oxidative injury. Pharmac. Ther. 47:61-71.

SIGEL, H., PRIJS, B., McCORMICK, D.B., SHIH, J.C.H. 1978. Stability of binary

and ternary complexes of a-lipoate and lipoate derivatives with Mn 2+ , Cu

2+ , and Zn 2+ in solution. Arch. Biochem. Biophys. 187:208-214.

SINGH, U., JIALAL, I. 2008. Alpha-lipoic acid supplementation and diabetes. Nutr.

Rev. 66(11):646–657.

SRINAVASAN, S., HULTIN, H. O. 1995. Hydroxyl radical modification of fish

muscle proteins. J. Food Biochem. 18:405–425.

SRINIVASAN, S., HULTIN, H.O. 1997. Chemical, physical, and functional

properties of cod proteins modified by a nonenzymic free-radicalgenerating

system. J. Agric. Food Chem. 45:310–320.

STADTMAN, E.R. 1990. Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: biochemical

mechanism and biological consequences. Free Radical Biol. Med. 9:315–325.

STADTMAN, E.R., OLIVER, C.N. 1991. Metal-catalyzed oxidation of proteins. J.

Biol. Chem. 266:2005–2008.

STADTMAN E.R., BERLETT, B.S. 1997. Free radical-mediated modification of

proteins. DB Wallace (Editor) Free radical toxicol, Washington, p. 71–78.

43

STADTMAN, E.R., BERLETT, B.S. 1998. Reactive oxygen-mediated protein

oxidation in aging and disease, Drug Metab. Rev. 30: 225–243.

STADTMAN, E. R., LEVINE, R.L. 2003. Free radical-mediated oxidation of free

amino acids and amino acid residues in proteins. Amino Acids, 25, 207–218.

STADTMAN, E. R. 2006. Protein oxidation and aging. Free Radical Res. 40(12):

1250–1258.

SUH, J.H., ZHU, B.Z., DESZOEKE, E., FREI, B., HAGEN, T.M. 2004.

Dihydrolipoic acid lowers the redox activity of transition metal ions but does

not remove them from the active site of enzymes. Redox Report. 1:57-61.

TERJESEN, B. F., PARK, K., TESSER, M. B., PORTELLA, M. C., ZHANG, Y.,

DABROWSKI, K. 2004. Lipoic Acid and Ascorbic Acid Affect Plasma Free

Amino Acids Selectively in the Teleost Fish Pacu (Piaractus mesopotamicus).

J. Nutr. 134:2930–2934.

THANONKAEW, A., BENJAKUL, S., VISESSANGUAN, W., DECKER, E. A.

2006. The effect of metal ions on lipid oxidation, color and physicochemical

properties of cuttlefish (Sepia pharaonis) subjected to multiple freezethaw

cycles. Food Chem. 95:591–599.

TOKUR, B., KORKMAZ, K. 2007a. The effects of an iron-catalyzed oxidation

system on lipids and proteins of dark muscle fish. Food Chem. 104:754–760.

TOKUR, B., KORKMAZ, K. 2007b. The effects of Fenton type (Fe+2/H2O2)

oxidation system on lipid and protein oxidation of grey mullet (Mugil

cephalus). Journal of FisheriesSciences.com, 1(1): 41-47.

TOKUR, B., POLAT, A., 2010. Myofibrillar and sarcoplasmic protein oxidation and

degradation of thin-lipped grey mullet (Liza ramada) during refrigerated

storage (+4 0C). J. Muscle Foods. 21: 102–118.

TRATTNER, S., PICKOVA, J., PARK, K. H., RINCHARD, J., DABROWSKI, K.

2007. Effects of α-lipoic and ascorbic acid on the muscle and brain fatty acids

and antioxidant profile of the South American pacu Piaractus mesopotamicus.

Aquacult. 273:158–164.

44

UNDELAND, I., KRISTINSSON, H.G., HULTIN, H.O. 2004. Hemoglobinmediated

oxidation of washed minced cod muscle phospholipids: effect of pH and

hemoglobin source. J. Agric. Food Chem. 52:4444–4451.

ZAMORA, R., ALAIZ, M., HIDALGO, F.J. 1999a. Modification of histidine

residues by 4,5-epoxy-3-alkenals. Chem. Res. Toxicol. 12:654-660.

ZAMORA, R., ALAIZ, M., HIDALGO, F.J. 2000. Contribution of pyrrole formation

and polymerization to the nonenzymatic browning produced by amino-

carbonyl reactions. J. Agric. Food Chem. 48:3152-3158.

ZHAO, Y., LI, Y., YU, W., JIANG, S. 2004. Scavenging ability on ROS of alpha-

lipoic acid (ALA). Food Chem. 4:563-567.

ZHU, M., SPINK, D.C., YAN, B., BANK, S., DECAPRIO, A.P. 1994. Formation

and structure of cross-linking and monomeric pyrrole autoxidation products

in 2,5-hexanedione –treated amino acids, peptides and protein. Chem. Res.

Toxicol. 7: 551-558.

45

ÖZGEÇMİŞ

19 Mayıs 1983 tarihinde Adana’da doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini

Adana’da tamamladıktan sonra 2002 yılında Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri

Fakültesini kazanarak lisans eğitimine başladı ve 2006 yılında mezun oldu. Aynı yıl

Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Su Ürünleri Anabilim Dalında

Yüksek Lisans öğrenimine başladı.

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK...

Documents

Transcript of ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK...