1  

What Cytometry Can Do for You: The Pros and Cons of Image and Flow Cytometry 

Webinar 31 October 2012 

 [0:00:10] Slide 1 Sean Sanders:  Hello everyone and welcome to this Science/AAAS webinar. I’m Sean 

Sanders, editor for custom publishing at Science.    Today’s webinar will be about all things cytometric. Flow cytometry 

has  been  used  for  decades  as  the  method  of  choice  to  gather valuable  data  on  an  individual  cell  level.  More  recently,  image cytometry  technologies  including  high‐content  analysis  have emerged  to  enable more detailed  cellular  and  subcellular  analysis, particularly of adherent cell types. Image cytometry has become less expensive and more accessible, giving experts and non‐experts alike fast and easy access to detailed data about their cells. 

   In this webinar, our esteemed speakers will share their views on the 

pros  and  cons  of  image  and  flow  cytometry  and  how  these technologies  might  be  applied  to  their  own  research.  It’s  my pleasure  to  introduce my  studio guests  for  today. They are Dr. Bill Telford from the NIH  in Bethesda, Maryland, Dr. Paul Gokhale from the  University  of  Sheffield  in  the  United  Kingdom,  and  Dr.  Liz Roquemore  from GE Healthcare based  in Cardiff  in  the UK. A  very warm welcome to you all. Thanks for being here.  

 Dr. Bill Telford:  Thank you, Sean.  Dr. Liz Roquemore:  Thank you. Pleasure to be here.  Sean Sanders:  You will notice that Dr. Gokhale  is not actually with us  in the studio 

today. Due  to  the big  storm on  the east  coast of  the US, his  flight over was unfortunately cancelled, but we are very pleased  that he could  join  us  through  an  audio  linkup.  So  welcome  to  you,  Dr. Gokhale. 

 Dr. Paul Gokhale:  It’s good to be here, Sean. Thank you.   

2  

Sean Sanders:  Before we  get  started,  I have  some  important  information  for our audience. Note  that  you  can  resize or hide  any of  the windows  in your  viewing  console.  The  widgets  at  the  bottom  of  the  console control  what  you  see.  Click  on  these  to  see  the  speaker  bios additional  information  about  technologies  related  to  today's discussion, or to download a PDF of the slides. 

   Each of our  speakers will  talk briefly about  their work. After which 

we will have a Q&A session during which our guests will address the questions submitted by our live online viewers. So if you're joining us live, start thinking about some questions right now and submit them at any time by typing them  into the box on the bottom  left of your viewing console and clicking the submit button. If you can't see this box,  just  click  the  red  Q&A  widget  at  the  bottom  of  the  screen. Please remember to keep your questions short and concise. This will give them the best chance of being put to our panel. 

   You can also  log  in to your Facebook, Twitter, or LinkedIn accounts 

during the webinar to post updates or send tweets about the event, just  click  the  relevant  widgets  at  the  bottom  of  the  screen.  For tweets, you can add the hash tag, #sciencewebinar. 

   Finally, thank you to GE Healthcare for sponsoring today's webinar.  Slide 2   Now,  I'd  like  to  introduce  our  first  speaker,  Dr.  Bill  Telford.  Dr. 

Telford  is  currently  the  director  of  the  flow  cytometry  core laboratory in the NCI Experimental Transplantation and Immunology Branch  at  the NIH. His main  research  interests  include  instrument development,  particularly  in  the  area  of  novel  solid  state  laser integration into flow cytometers, flow cytometric stem cell detection and  characterization,  and  functional  characterization  of  early apoptosis by flow and image cytometry. Welcome, Dr. Telford. 

 Dr. Bill Telford:  Thank you, Sean, for having me here today.   Slide 3    Okay. So what  I’d  like  to do  in  the next  few minutes  is give a brief 

overview of  just a  review of  flow  cytometry  for  those who need  it and also to talk a little bit about image cytometry, which is proven to be an important adjunct technique to flow cytometry. 

 Slide 4 

3  

  I think many people  in our audience are aware of what goes  into a traditional flow cytometer. You need first a biological sample, usually labeled with  some  sort  of  fluorescent marker.  You  need  to move these cells in a linear stream through a focused light source, usually a laser, it doesn’t have to be but it usually is. You then need to detect the fluorescence in a PMT with a filter and then you need to process that data out the other side. 

 Slide 5   So  this  is what  the data ends up  looking  like and when we do  flow 

cytometry, we’re generally analyzing three major applications and I’ll go through them one at a time. The first is fluorescent probes for cell surface  or  intracellular  labeling  usually  using  an  antibody  that’s tagged with a fluorescent marker like fluorescein or PE. Here, we’ve labeled mouse T‐cells  for  fast expression and CD8 expression using two fluorescent probes, FITC and PE. What I want to point out and I think this is obvious for many people who are familiar with flow but remember that all of this data is inter‐relational so that we can look at  the cells  that are CD8 positive  in  this  star plot over here on  the right and  look at  the Fas expression within  those cells and also  the Fas expression in the CD8 negative cells as well. Now this technology has  become  quite  powerful.  We  can  do  14,  26  parameter  flow cytometry and the  inter‐relational nature of  it gives us tremendous power. 

[00:05:01] Slide 6   Here,  we’re  looking  at  lymphoctyes  and  monocytes  and 

macrophages based on their forward and side scatter and we’re able to  look at the expression of numerous markers based on the ability to  gate  on  one  parameter  and  view  another.  All  parameters  are inter‐relational relative to the other parameters. 

 Slide 7   Fluorescent  proteins  is  probably  the  second  most  popular 

application for flow cytometry now. This started with GFP back in the mid‐‘90s.  There  are  now  literally  hundreds  of  fluorescent  proteins that span the visible spectrum and this  is another major application for flow cytometric analysis. 

 Slide 8   Finally, we have  a  large  variety of physiological  fluorescent probes 

that can measure the physiological state of a cell. We can look at the mitochondrial  membrane  potential,  the  plasma  membrane potential. We can visualize mitochondria,  look at DNA content. The 

4  

number of probes available of this type literally are in the hundreds right now and another common application for flow cytometry. 

 Slide 9   However,  traditional  flow  has  its  limits. We’re  basically  analyzing 

cells that are flying through a laser beam at about 10 meters/second and all we’re generally able to do in that format is measure the total fluorescence of the cell as  it passes through. We’re not getting any subcellular  data. We’re  able  to  look  at  the  area,  the width  of  the pulse,  the  height  of  the  pulse  here  as  the  cell  goes  through.  But generally the information we’re getting per cell is very, very limited. It’s just total fluorescence. 

   This  is  where  image  cytometry  comes  in.  Image  cytometry  has 

allowed us to actually visualize the cell and collect cytometric data at the same time. So we’re collecting the same data that we would with a  flow cytometry, but we’re also able  to get a picture, an  image of the cell and various aspects of  that  image can become parameters just like fluorescence or forward scatter is a parameter. 

   Another key characteristic of image cytometry is that the image and 

the cytometric data are correlated with each other. So you can look at  a  dot  plot  in  a  histogram  and  go  back  and  see what  that  cell actually is. 

 Slide 10    So  this  is  what  a  typical  image  cytometer  looks  like.  This  is  a 

Compycyte iCys instrument. You can see a lot of the components are pretty much  exactly  the  same  as  you’d  find  on  a  flow  cytometer. You’ve  got  lasers,  you’ve  got mirrors,  dichroics,  and  filters.  You’ve got  photomultiplier  tubes  for  detecting  that  data.  But  rather  than the data coming  from cells  in a  stream,  it’s now coming  from cells sitting  on  a  slide  or  on  a  horizontal  surface.  The  cells  are  static, they’re not moving. Now we often  refer  to  this  type of analysis as high  content  analysis  because  we’re  getting  more  than  just  raw fluorescent data here. We’re actually getting data pertaining to the interior structure of the cell.  

 Slide 11   Another key aspect of image cytometry is that like flow cytometry it 

is event thresholded or event based. On a flow cytometer, a cell will go flying for the beam. You’ll use a characteristic like forward scatter to determine whether an object  is there or not and then you’ll take fluorescence  and other measurements off  that  cell. We do exactly 

5  

the  same  thing  in  image cytometry. We  set a parameter,  it can be scatter,  it can be fluorescence to  identify whether cells are present. The  instrument will  then  segment or  select  that object as  it has  in these scans here and then the cytometric data is taken. So we have both  image data,  cytometric data and  the  two are  correlated with one another. 

 Slide 12   It  can  be  really  quite  powerful  and  the  imagery  can  be  quite 

dramatic. These are mouse  lymphoma cells that have been  induced to  undergo  apoptosis  using  a  drug,  using  camptothecin.  We’ve labeled  them  with  three  apoptotic  markers,  a  caspase  substrate labeled with  fluorescein,  Annexin  V  labeled with  a  red  dye,  Alexa Fluor 647 plus 7‐AAD. We’re able  to get  the  image data and we’re able to see the presence of Annexin V labeling or caspase activation in the cells. 

   These  images  here  are  not  photographs.  They  are  actual  PMT 

reconstructed data and this PMT reconstructed data, this image data is the data by which the cytometric data is then derived. You can see the cytometric data on the right‐hand side of the slide  looking very much  like  you  would  see  off  of  a  traditional  flow  cytometry  but you’ve got the image data as well. 

 Slid 13   Now you can do a lot of very powerful things with this. We can look 

at the subcellular structure of a cell and express that structure as a fluorescent  parameter.  Here,  we’ve  taken  U2OS  cells.  This  is  a human  osteosarcoma  line  that’s  been  transfected with  a  GFP‐LC3 fusion  protein.  The  LC3  protein  during  autophagy  segregates  into these  very  tight,  punctate  regions.  It’s  normally  distributed  evenly throughout  the cell. We can measure  those punctate  regions using image cytometry and express them as a parameter. So we’re not just taking  total  fluorescence  here,  we’re  looking  at  the  fluorescence structure of something inside the cell.  

[00:10:24] Slide 14   Now  there  are  a  number  of  good  image  cytometer  systems  out 

there. This  is a sampling of them.  I’ve shown you some data on the Compycyte  iCys. The BD Biosciences Pathway systems,  the 450 and the 850 work very well  in this regard. The GE  IN Cell platforms, the 2000 and the 6000, the Cellomics and PerkinElmer systems as well. These  are  generally  very  sophisticated  systems.  They  can  collect many  fluorescent  parameters.  They  often  have multiple  excitation 

6  

lines either  lasers or  lamps. They archive the data and the data can be brought up later and correlated with the cytometric data.  

 Slide 15   There  is  one  stream‐based  image  cytometer  system  available.  It’s 

the  Amnis  ImageStream.  Rather  than  capturing  images  with  cells that are sitting on a slide or on a flat surface, this instrument actually captures the images in the stream. Here we have I believe these Raji cells that have been again  labeled with multiple apoptotic markers, caspase, Annexin V and DNA and you can see brightfield and also the individual  fluorescent  data  and  this  data  can  also  be  expressed cytometrically as dot plots and histograms. 

 Slide 16   Finally, there are a number of special purpose image cytometers out 

there currently. The GE Life Sciences Cytell  is one of these, the TTL Labtech Accumen, the Cytellect Celigo, the Beckman‐Coulter Vi‐cell. These  instruments generally do not archive  the data, but  they use the data,  the  image data as  the basis  for  the  cytometric data  they display.  These  systems  are  often  designed  for  specialty  or  specific applications  like  viability  apoptosis  or  basic  immunolabeling.  The imagery  is  generally  not  archived  but  sometimes  intracellular features  can  still  be  quantified  and  these  systems  also  distinguish themselves  in  generally  being  of  lower  cost  than  the  more sophisticated  systems.  So  they’re  very  good  for  specialty applications.  They  can  also  have  very  rapid  throughput  for applications where you need  to run  large numbers of samples very quickly and Dr. Gokhale will talk about that in a few minutes.  

   So I will conclude my talk at that point.  Slide 17  Sean Sanders:  Great.  Dr. Bill Telford:  And give it back to Sean.  Sean Sanders:  Thank you so much, Dr. Telford. Our second speaker for today is Dr. 

Paul Gokhale. Dr. Gokhale  is  currently  a  research  associate  at  the University  of  Sheffield.  Over  the  past  seven  years,  he  has  been involved  in  the  international  stem  cell  initiative  first  to  develop standards  to  characterize human embryonic  stem  cells and  second to identify common genetic changes that occur when human ES cells are cultured in vitro. More recently, Dr. Gokhale has been involved in projects to use real‐time  imaging and  image analysis to understand 

7  

how  human  embryonic  stem  cells  self‐renew  and  how  early differentiation decisions are controlled. Welcome, Dr. Gokhale. 

 Slide 18 Dr. Paul Gokhale:  Okay. Thank you very much, Sean. So  in my short presentation,  I’m 

going to take you through a brief overview of high content analysis, briefly talk about why it fits in with other cytological techniques that people are familiar with, some of the types of assays we commonly use with these systems, some factors to think about on the pros and cons compared with  flow cytometry. Then  I’ll go  through examples of how we do the segmentation analysis so you can see how all this fits together.  

 Slide 19   Okay. So where does high content analysis  fit  in the scheme of the 

sort of cell biological techniques? Well  it fits really  in between flow cytometry on  the one hand which has very, very good  throughputs and stats for generating signal cell data and the data analysis is very well refined over decades now. At the other end of the spectrum  is the conventional microscopy, which is quite labor intensive, you get fantastic data, but it’s not very good for looking at large numbers of cells and large numbers of conditions. 

 Slide 20   So what assay do we really use high content for? Well there’s quite a 

range now and  it gets bigger all  the  time. So we’ve got  things  like morphology  so  we  can  stain  the  samples  for  morphology  for example with phalloidin  to  look  at  the  actin  cytoskeleton. We  can look  for  things  like blebbing. People  look at neurite outgrowth and how  neurons  are  branching,  differentiation  because  of  the  cells change  shape  when  they  differentiate  typically.  The  fluorescent intensity type measures, which is probably the one you would guess we  would  use  it  for  which  things  like  cell  cycle,  for  marker expression, which is very similar to the flow cytometric type assays. 

[00:15:04]   Then we’ve  got  things  like  these  fluorescence distribution  sorts  of 

assays and  this  is where we  look  for  translocation of proteins  from the membrane to the cytosol or the cytosol into the nucleus. We can look at DNA damage by  looking for  foci  in a nuclei and we can also look  for  co‐localization.  So  if we  can  label  two  sets  of  structures within the cell fluorescently, we can see how they co‐localize. 

   Then we’ve got the next sort of set of two which perhaps ones which 

are becoming more common now. The first one is cell behavior over 

8  

time. So this is now becoming more and more important particularly in stem cell biology  is to actually  look at cells using time  lapse type systems and also high content imaging systems can do this now. It’s used  to actually get  real  time measurements of  things  like  the  cell division  times,  the  lineage  tracing, whether  the cells are migrating, and again shape changes based on the imaging.  

   Then  finally  another  aspect  which  is  becoming  more  and  more 

common now is to look at what we term higher‐order structures and this  is  where  we  combine  various  features  that  we’ve  imaged together to create  larger objects that you might be  imaging. So the simplest one is that we create virtual cells within the software. So we tell the software that we need a nucleus and we tell we’re going to use  a  cytosol  and we  tell  the  software  that  those  tissue be  linked together  and  then  we  can  ask  questions  about  the  relationship between  fluorescence.  Within  those  two  compartments  if  we combine lots of cells together particularly with this is pretty relevant for pluripotent  stem  cells, you get  colonies and you  can ask about what the marker expression is across the whole colony. This has now been extended to embryos such as zebrafish embryos and things like that  and  tissue  distribution  by  looking  at  slides  as  tissue  stained slides. 

 Slide 21    So what factors do you need to think about when you’re doing these 

assays? Remember, these are imaging based assays so they go into a microscope. So one of the problems that we encounter of course  is that  typically  people  will  grow  cells  in  tissue  culture  plates  for example  and  these  can  vary  greatly  in  their  ability  to  be  imaged accurately  and easily.  So 6‐well plates  can  really –  very,  very  thick plastic  actually  compared with  coverslips  for  example  and  so  you may  find you have problems with sensitivity  in using  those sorts of plates so you have to change to either much thinner base plates or change completely to using coverslips.   

   The resolution required, you need to think about. As you use higher 

and higher NA  lenses,  they become more and more difficult  to use with standard tissue culture plastic just because of the thickness and because of the way the plastic is made. It’s not very even and things like that. So again, you may need to think about slides. 

   The well  size,  this  is one  that most people don’t  really  think about 

but can you really see enough of what you need to see in one well? You know,  if the well size  is small and you need to  look at  lots and 

9  

lots of cells, you may not have enough cells in one particular well. In the case of human ES cells, colonies,  it becomes a problem that we need to get enough colonies in our well to be able to see something meaningful. 

   Then  the  caveat  of  that,  of  course  the  counter  thing  to  that  is  of 

course remember that, you know, different size magnifications it will take you  longer to cover a particular area of a well or particularly a number of wells so that can slow the assay down and that maybe a factor for you. 

   Then the final thing you have to consider is of course the number of 

colors. Remember  that  typically we  can only deal with  four  colors, which  is  in contrast with flow cytometry, which can deal with more and  also  for  certain  fluorescent  reporters  and  things  they may  be very,  very  weak  and  you may  have  to  use  specialized  filter  sets, which  you  do  need  to  think  about  before  you  start  these experiments.  

 Slide 22   So  as  I mentioned,  there  are  some  pros  and  cons  regarding when 

you compare with flow cytometry. So in the acquisition side, the first really big, first major difference you’ll notice  is the throughput. The flow cytometers are very, very good at getting single cell data from large numbers of  cells. The high  content analysis  type  systems are much better for large numbers of conditions with a sort of moderate number of cells. So that’s the sort of thing you need to think about there. 

   As I’ve mentioned, the parameters, the flow cytometers have a huge 

color part they can see. It’s typically up to 12,  it can go even higher depending  on  the machine  configuration.  For microscope  systems it’s typical just four. 

   The sensitivity again as mentioned before,  the  flow cytometers are 

very,  very  sensitive  instruments because of  the way  the optics are arranged  and  the  type  of  detection  they  use.  The  high  content analysis systems  tend  to be  less sensitive  in part because  it’s going through a lot of glass in the objectives, in part because of the plates people  use  and  the  fact  they’re  using  CCD  detection.  Having  said that,  the  machines  are  getting  more  and  more  sensitive  due  to better camera technology and better light technologies. So in theory, they should become more sensitive but you do have to watch that.  

 

10  

  Obviously,  subcellular  imaging  then  apart  from  the  imaging  flow cytometers,  flow  cytometers    don’t  let  you  do  subcellular  analysis whereas high  content  analysis  that’s  really  routine  for  this  type of analysis.  

[00:20:17]   Okay.  On  the  data  analysis  side,  the  flow  cytometers  again  with 

single data, it collects single cell data very, very easily and this is for all systems that you will use it will be very, very easy to get this sort of single cell data. With the high content analysis because the cells are  stuck  down  and  next  to  each  other,  you  have  to  do  image analysis  to  separate  them  into  single  cells  first  of  all.  The major problem  there  is  of  course  some  cells will  pile  up  on  each  other where you may seeded them too densely and then that causes quite a lot of problems when we start to do the actual analysis.  

   Another  factor  which  again  as  I  mentioned  is  becoming  more 

fashionable  to  do  is  time  series  or  time  lapse  type  things  and  of course on  flow  cytometry, you  can only  really do  that by  sampling but  on  high  content  analysis  systems  now  that’s  becoming more routine.  The  systems  can  be  supplied  with  CO2,  humidified  CO2 systems and heated chambers and  the  software will enable you  to screen the time lapse images together to get that sort of data really quite easily now.  

   Of course, the final thing, which  is again the major thing about high 

content  analysis,  is  the  cell‐cell  relations  are  lost  with  flow cytometry.  So  in  high  content  analysis,  we  preserve  all  that. We know  exactly  where  we  got  the  information  from  so  those relationships can be reconstructed.  

 Slide 23   Okay.  So  what’s  the  actual  process  that  we  go  through?  So  the 

process  is  summarized here. We acquire  the  image. We do what’s called segmentation. Segmentation is where we pull out the features we’re interested in from the image and this is by sophisticated image analysis  algorithms.  Then what we  do  is we  then  have  to  tell  the software what  the  features  are  and  how we wanted  to  handle  it, which  is  called  feature  extraction. We  then  put  some  parameters into the software to tell it how we want to classify those features.  

   The  example  that  we  got  here,  just  the  most  simple  example  is 

you’ve got some Hoechst‐stained nuclei from human ES cells so you can see these colonies in this picture. They’ve been segmented. If we then do  some methodical  treatment  to  that  segmentation, we  can 

11  

then  dilate where we  think  the  nuclei  are  and  of  course  that will show us where the colonies are because it all merge together. Then what we do is we just tell the software well the colonies are the big blobs, everything else as you go  smaller  is not  the  colonies. That’s what you see in the final picture there where the colonies have been labeled  in green and  the  rest of  the cells have been  labeled  in  red and that’s how we then would extract where the colonies are from these images.  

 Slide 24   So how do we do that extraction, that segmentation extraction or at 

least what does it look like? So we’ve got some examples in the next few slides, which will just illustrate to you the types of segmentation you can do. So on the  left here, we’ve got nuclei segmentation and what will  typically  happen  here  is we will  apply  the  segmentation algorithm  and  then we  have  to  try  and  separate  the  nuclei  using other algorithms to separate them out from each of the – it’s called clump  breaking  or  anything  like  this.  So  that’s  because  of  they’re very close to each other in some situations.  

   On  the  right‐hand  side,  you’ve  got  mitochondrial  segmentation, 

which  is  of  course  they’re  really  quite  tiny  features.  For  this,  you would have to use high NA  lenses. You need a nice dye for this and then  there  are  algorithms, which  can  handle  these  types  of  small vesicular  features.  They  are  different  from  the  ones which  do  the nuclei segmentation, but most software will have various algorithms which can be applied to different features. 

 Slide 25   We’ve got  for  the whole cell  sort of  the cytosolic  level. This  is  just 

very, very simply you can  label the cytosol with various dyes as Dr. Telford alluded to there or with fluorescent proteins and it becomes relatively simple then to segment the cytosol, tell the software that’s the cytosol and away you go. Then finally sort of larger scale features again  as  I mentioned  is  the  colonies  and  things  like  this, which  is caused  when  we merge  the  nuclei  that  we  segmented  from  the original Hoechst  stain picture and  this gives us where  the  colonies are. The  red dots  in  this or  the  red  features  in  this picture here  in fact are fibroblasts which we use as feeder the cells, which are quite easily separable from the colonies.  

 Slide 26   Okay.  So what’s  the  sorts of measures we  can do? Well  it’s  really 

anything  you  can  think  of  that  you  could measure  from  an  image 

12  

once  you’ve  extracted  the  feature  from  it.  So we  get  all  sorts  of things from images once we started this process going. Again, in this example  of human  ES  cell  colonies, which  have  been  stained with Hoechst, have been  stained with pluripotency marker with SSEA 3, we  can get  the number of  cells  in  the  colony,  the number of  cells positive for the SSEA3, how far apart the nuclei are., and then going up to the colony  level how many colonies are  in the well, what the shape is, what the area is, and also the spatial relationship between the  colonies  and  things  like  the  number  of  positive  cells  in  the colonies.  So  you  can  really  get  a  lot,  vast  amounts  of  information about what this culture  is really  like and remember all of this  is the spatial  information  in particular was  lost with flow cytometry so we tend to use these things in conjunction with each other.  

 [00:25:34] Slide 27   This is an example of what the data would come out like eventually. 

So  we’ve  done  exactly  the  same  thing  here  but  we’ve  got  an additional marker which  is OCT4  another  pluripotency marker.  As you can  see by going  through all  this analysis process, you can get flow  cytometric  like  data,  i.e.,  population  histograms  after  these images either as univariate plots or bivariate plots. You can simulate setting gates just like you would in a flow cytometer and you can get numbers  that  are  proportionate  to  each  fraction  that  you’ve identified.  

   As Dr. Telford alluded to the advantage is we can go back to look at 

the  individual  cells  in  these  images  because  the  software  records where  it’s made all  these  images, where  it’s made all  this analyses from.  

 Slide 28    This  is another example  just to show you how you can get this flow 

cytometry  like data. This  is stained for BrDU and the DNA stain and you  get  this  sort of  classical horseshoe plot  to  show  the  cell  cycle phases, which is similar to what we would see with a flow cytometer. So  it’s  really quite  remarkable  that you can actually get  this out of really quite messy and complex images.  

 Slide 29   So I’ll finish there and it just remains for me thank various people in 

various  labs,  which  help  us  do  all  this  sort  of  stuff  because  we actually make  reports  and  all  sorts of  things  to  actually  test  these 

13  

systems  out  so  it’s  actually  quite  a  complex  exercise  and  I’ll  stop there. 

 Slide 30 Sean Sanders:  Wonderful.  Thank  you  so much,  Dr. Gokhale,  and  thank  you  very 

much for joining us even though you couldn’t make it into the studio. It’s great to have you on the line.  

   Our  final  speaker  for  this  webinar  is  Dr.  Liz  Roquemore.  Dr. 

Roquemore’s  training  is  in  diverse  aspects  of  intracellular  protein regulation, membrane protein trafficking, and cell phenotypes. She is now  the  technology manager  for  cell  applications  within  the  Cell Technologies Division of GE Healthcare Life Sciences and has played a  leading  role  in  the  development  and  validation  of  cell  lines, reagents, assays, and imaging tools for research and drug discovery. Her major focus area for her work has been the application of high throughput microimaging and analysis  technologies  for  cell biology research  and  drug  development,  most  recently  investigating  the combined use of stem cell‐derived model systems and high‐content analysis  techniques  to  enable  earlier  predictive  toxicity  testing. Welcome, Dr. Roquemore. 

 Slide 31    Thank you very, a pleasure to be here. So after that great overview 

of  HCA,  I’d  like  to  take  a  step  back  and  just  give  you  sort  of  an overview  of  image  cytometry  and  the  range  of  instrumentation that’s  available  for  doing  image  cytometry  and  also  the  types  of applications that those platforms are best suited to.  

 Slide 32   So  image  cytometry  in  its  broadest  sense  can  be  defined  as  the 

process of extracting and making sense of cytometric data obtained from  images  of  cells.  So  as  alluded  to  in  the  previous  talks,  those images  can  be  obtained  in  a  variety  of  ways  with  a  variety  of systems, but the emphasis is not so much on the images themselves in  image cytometry but on the data that we can extract from those cells and the knowledge that we can gain from that process.  

 Slide 33   Image  cytometry  has  four  basic  components.  Those  include  the 

cellular samples of course  that we’re working with,  the probes and sensors  that  we  add  to  the  cells  to  understand  their  function phenotype, the  imaging platforms that we’re working with, and not least of all the image analysis software which allows us to turn those 

14  

images  into  data.  All  four  of  those  components  are  continually evolving together so that advances in any one of those areas propels advances  in  the  others.  So  we’re  seeing  a  lot  of  very  exciting developments now  in each of  these  four areas as  image cytometry progresses.  

 Slide 34   So why  imaging as an approach  to cytometry? Well  I  think  the  two 

previous  speakers  have  summarized  very  nicely  the  fact  that with image  cytometry,  we  can  gain  quite  a  lot  of  information  about morphology, structure, kinetics and position and location of cells and also  the  orientation  of  cells  and  groups  of  cells  that  we may  be studying.  

   Also as a lot of the higher content imaging systems can process many 

samples  in  parallel, many  samples  very  quickly, we  can  do  higher throughput studies,  larger scale studies all the while collecting very comprehensive data from the cell population and building up unique fingerprints as to the cell phenotype. 

 [00:30:13]   Now we’re  also  seeing  the  emergence  of more  convenient  image 

cytometry systems, which are more compact, more affordable, more accessible to the members of the laboratory and they can be located throughout the lab, and you don’t necessarily need an expert to run those systems or any extensive training. So  image cytometers really fall on a spectrum from those which focus on depth and breadth of information  that we  can  gain  and  the  others  that  are  specialized more for ease of use and accessibility.  

 Slide 35   So  let’s  take  an  example  form  the  depth  and  breadth  end  of  that 

spectrum and we’ll look at cell cycle analysis as an example.  Slide 36   So perhaps one of the simplest ways of looking at cell cycle phase is 

to do DNA content analysis and when we’re working with adherent cells,  it  really  makes  a  lot  of  sense  to  go  for  an  image  based cytometry to do that because we don’t need to disturb the cells to be able to quantify the DNA content.  

 Slide 37   Doing  that, we  can  get  results, which  are  strikingly  similar  to  the 

results that we would get with flow cytometry. So here for example, 

15  

you can see  that we’re getting very similar cell cycle phase profiles but  there are  two main differences. The  first  is  that because we’re working with  an  imaging  technology, we  can  process  the  samples very quickly and also because we’re not having to remove the cells from the dish or undergo any centrifugation wash steps, the whole process is taking us a lot less time on a high content imager for these adherent cell types.  

   The second big difference is that not only do we get these cell cycle 

phase distributions from the intensity information, but we have a lot of morphological  information  that we get virtually  for  free with no extra time or effort.  

 Slide 38   So here you can see for example that when we treat with mitomycin 

C,  we’re  getting  a  dramatic  increase  in  the  nuclear  size. We  can follow  that  for every cell  in every  image and  that can give us more confidence in the conclusions that we draw from our cell cycle phase analysis, but it also can lead to new insights into the function and the mechanism of action of our drugs. 

 Slide 39   We can add a second sensor as shown in the previous talk to further 

delineate  the  S‐phase  cells.  In  this  case,  we’re  looking  again  at incorporation  of  bromodeoxyuridine  and we’re  getting  that  classic horseshoe‐shaped distribution of the cells. 

 Slide 40   But things get really  interesting  if we get a third sensor to the mix. 

Here, this  is something  that we could only do with an  image‐based platform  because  this  is  a GFP  sensor, which marks  the  cell  cycle phase position of the cell by not only its intensity but the position of this probe within the cell. So now, we see something very interesting here. So we’ve again got that classic horseshoe shaped distribution of  our  control  cells  in  blue  and  our  cells  treated  with  a  test compound  in  red.  You  can  see  that  the  test  compound  is  causing that horseshoe‐shaped plot to shift to the right, but now we’ve got a third  dimension  added  to  this  plot  and  that’s  represented  by  the diameter of the spheres that are plotted here. Those diameter of the spheres are telling us about the cell cycle phase position as reported by this GFP reporter. 

   What we find is that even though the cells on the right which are 8n 

are  in  the  position  that  you’d  expect G2  cells  to  be,  they  actually 

16  

have characteristics of G1 phase cells. So by using this GFP reporter, we’ve learned a little bit more about the mechanism of action of our compound, which happens to be where our kinase  inhibitor and  it’s causing  the  cells  to  undergo  a  process  called  endoreduplication where the nuclei divide but the cells cannot undergo cytokinesis. 

 Slide 41   So I hope that gives you a flavor of some of the many types of things 

you can do with an image cytometer that you maybe you couldn’t do with  other  technologies.  There  are  some  emerging  trends  in  the instruments that are available to do this and some of those include a more complete solution. So increasingly, we’re seeing systems which take  us  all  the way  from  acquisition  through  to  analysis  and  even interpretation  of  our  results  seamlessly.  We’re  also  seeing  more fluorescence‐based kits and assays available that can really cut down on our assay development times.  

   Another  thing  that we’re  seeing  is  that  the  systems  are  all  getting 

quite  fast  and  they’re  able  to  collect much  higher  quality  images than ever before. That’s very  important because  the quality of  the data  that we get  from HCA  is only as good as  the  images we  start with.  

   A  third  trend  that  we’re  seeing  is  towards  more  flexibility  with 

confocality. So instead of being locked in for example to a particular pinhole  sized  confocal  aperture, we’re  now  seeing  systems which give us variable aperture and that can really give us more flexibility in terms of the applications that we can cover.  All  of  these improvements are being made possible by new  technologies being incorporated  into  the  systems  including  scientific  grade  CMOS cameras, diode lasers and LED technology. 

 [00:35:20] Slide 42   But what about the more routine assays that we do every day in the 

laboratory  like  counting  cells  and doing  cell health  and phenotype analysis? For  those  systems, maybe high  content analysis  is a  little bit  of  an  overkill  but we  still want  to  get  some  of  the  benefits  of imaging. There, we might want to turn to systems, which are more focused on ease of use and accessibility. 

 Slide 43   A good example  there  is cell count and viability. So  this  is an assay 

that we do every day  in the  lab. It’s very simple and we really want 

17  

to be able  to do  it anywhere, anytime and not have  to  turn  to an expert to do  it. So typically we’ll run a two‐color assay  like this one where we’re marking the total cell population with a red dye and the dead  cell  population  with  a  green  dye  and  in  this  case  we  were running  it on a Cytell  Image Cytometer and you can see that we’re able  to  get  very  familiar  results.  We  can  set  our  thresholds  to separate  the  live  from  the dead  cells  and we’ve  got  a  selection of gating tools so that we can do further subpopulation analysis. 

 Slide 44   Then  we  can  generate  dose  response  curves  from  our  data  and 

here’s  an  example  of  a  camptothecin  dose  response  curve  and  its effect on cell viability. In case you’re wondering what that little disc is in the upper right‐hand corner, that is the sample holder for Cytell. It  can hold eight different  sample  cartridges.  So we’d  simply put a small  ‐‐ for this dose response curve, we  just put a small volume of sample into each of those eight cartridges and we get the results for the entire dose response curve in about two and a half minutes.  

   Now these are the results with  Jurkat cells, which are a suspension 

cell  type.  But  what  we  find  is  that  whether  we’re  working  with suspension cells or adherence cells, we’re getting results which are strikingly comparable to other image cytometers.  

 Slide 45   Then my last example is one where we were working with peripheral 

blood monocytes and we were developing an enrichment procedure for T‐cells and this is another one where an image cytometer came in handy. So here for example, you can see our results are showing us that  our  cells  are  about  96%  CD3  positives.  So  this  was  a  good verification  for  us  that  our  T‐cell  enrichment  process was working well. The other thing that we wanted to know about was the ratio of CD4 helper cells to CD8 cytotoxic T‐cells. That’s typically about 1.5 to 1 in the average individual and here you can see our results that we got with Cytell  showed we had 1.5  ratio, which corresponded very well to published results.  

   Another  thing  is  that we wanted  to migrate  this  assay  from  flow 

cytometry, which we do quite a lot of in the laboratory, to an image based cytometer so  that we could handle  this  routine assay a  little bit more readily within the lab. So we did a little bit of benchmarking and here  you  can  see  that we’ve  got  strikingly  comparable  results between the Cytell Image Cytometer and the flow cytometer that we had in our laboratory. 

18  

 Slide 46   So  what  are  the  things  that  we  had  to  consider  when  we  were 

thinking  about  doing  these  more  routine  assays  on  an  image cytometer? Well of course, we thought about the  level of expertise available  in  the  lab and where we would  like  this  instrument  to be located  and  we’re  finding  that  some  of  these more  value  image cytometers  can  be  located  anywhere  and  don’t  require  a  lot  of expertise. 

   Another  thing  to  consider  is  whether  we  go  with  predeveloped 

acquisition  and  analysis  protocol  or  user‐defined  ones. We  like  a mixture  of  both  because  the  predeveloped  ones  can  save  us  time and expertise but the freedom to create your own can give you some flexibility. 

   Speaking of flexibility, it’s also good to have flexibility for the various 

dyes  so  that we’re  not  locked  into  any  particular  assays.  If we’re working with an open system  like  this, we need  to  think about  the number  of  excitation  and  emission  channels  that  are  going  to  be available.  

   Last but not  least, speed  is something that needs to be considered. 

So when we want to think about the speed all the way from the time we load the sample to the time we get the results, and if we can run multiple  samples  in  parallel  that  can  really  save  us  time.  Another thing  to  remember  is  about  the  hidden  cost,  time  penalties  that might be associated. So for example  if a system needs to have a  lot of setup time or  if there’s calibration  involved or wash steps, those can be time penalties that maybe you hadn’t counted upon.  

 Slide 47   So just to summarize, I think in our experience we found that image 

cytometry and  flow cytometry are very complementary. One  is not necessarily going to replace the other but with image cytometry, we can get quite a  lot of additional morphological  information. We can use  adherent  cells  or  suspension  cells  and  increasingly  the technology to do that is becoming easier and more accessible.  

[00:40:03]   Now we’re  in a state where we’ve got quite a  lot of  instruments to 

choose  from  and  so  we  can  actually  afford  to  match  the  image cytometry  solution  to  our  needs  rather  than  being  driven  by  the instrumentation  in our assay choices, and  that’s  really a smart way to go.  

19  

   So  for  detailed  phenotyping  and  functional  studies  and  screens, 

we’re finding HCA has quite a lot to offer in terms of the power and flexibility that we have. For the more routine assays, I think it’s really worth  looking at  some of  these value  image cytometers  that  really can  bring  that  capability  right  to  your  bench  top without  a  lot  of added expertise required. 

 Slide 48   So  finally,  just  to show you some of  the  image cytometry solutions 

available from GE healthcare that we’ve used to generate the data in this presentation. At  the bottom  I’ve got  the  IN Cell Analyzer 6000 which  is  our  confocal  version  of  the  high  content  imager,  it’s  got variable aperture technology, the IN Cell Analyzer 2000 which is our very  flexible wide‐field system. Our most  recent  introduction  is  the Cytell  Image Cytometer, which  is quite compact.  It’s got  two  lasers and four emission channels and really does allow us to do quite a lot of the routine assays everywhere in the lab. 

 Slide 49   So  that  brings me  to  the  end  of  the  talk  and  I  just  like  to  thank 

people for their attention and hand back over to Sean.   Sean Sanders:  Great. Thank you so much, Dr. Roquemore, and thank you to all of 

our speakers for the wonderful presentation.   Slide 50      We’re  going  to move  right  on  to  the  questions  submitted  by  our 

online viewers. Just a quick reminder to those watching us  live that you can still submit your questions by typing them into the text box and  clicking  the  submit  button.  If  you  don’t  see  the  box  on  your screen, click the red Q&A widget and it should appear. 

   So we’ve got a lot of questions so I’m going to try knock through as 

many of them as possible. But the  first question  I’m going to ask  is about  the  percentage  of  assays  that  are  flow  versus  HCA  in  your experience. So  I know all of you have done both of these so maybe you can talk to that in your particular laboratory, Dr. Telford? 

 Dr. Bill Telford:  Sure. Well I run a core facility at the National Cancer Institute so we 

probably have about 80% of our work being flow cytometry and the other 20% being image cytometry. But the image cytometry tends to be  done  for  very  specific  purposes  where  the  imagery  is  really critical. We do  a  lot of  apoptosis  analysis on  the  image  cytometer 

20  

because  you  want  the  morphological  data  along  with  the fluorescence data and it’s very powerful for that purpose.  

   We have some other interesting applications too. We do a lot of cell‐

cell based assays where we want to look at cell‐cell interactions and that’s  something  again  where  you’re  not  going  to  get  that information out of traditional flow in the stream. You’ve got to have the cell sitting on a dish to collect that data. We have people who do very  small numbers of cells where  they’ll  just dab  them on a plate and allow them to settle. We have applications where people want to  analyze  their GFP  expression  in  a  96‐well  plate,  but  they  don’t want  to  discard  the  cells.  They  want  to  put  them  back  in  an incubator  and  keep  running  them. With  these  image  cytometers, with many of  them,  you  can put  the plate with  the  lid on, on  the instrument, scan it, and then put it back in the incubator. Again, you haven’t  destroyed  your  cells  as  part  of  the  analysis.  So  a  lot  of specialty applications  like  that where  flow cytometry  really doesn’t provide the advantages that image cytometry does. 

 Sean Sanders:  Great. Dr. Roquemore?  Dr. Liz Roquemore:  Well  I  think  our  experience  is  very  similar  to  yours  in  that  we 

probably  have  about  30%  of  the  people  in  the  lab  doing  flow cytometry and then maybe 70% of the assays would be high content analysis. We do a lot of cell production and I think flow cytometry is very  useful  there.  But  increasingly we’re  finding  these  bench  top image cytometers can really get the job done quickly. We don’t need to have a  lot of trained experts to do  it and so we’re getting those being used more and more often. Then on the high content analysis side, we’re finding that we can get really detailed cellular phenotype data  from the HCA, which we  just couldn’t get by any other means and  that’s  really  breaking  new  ground  in  terms  of  understanding how compounds act on a cell and predicting their toxicology, toxicity for example. 

 Sean Sanders:  Great. Dr. Gokhale?  Dr. Paul Gokhale:  Yeah it’s very similar actually to Dr. Telford. It’s about 80%, 20% and 

it’s  for  very  similar  reasons.  It’s  where  we  need  morphological information, we will  do  the  in  situ  high  content  assay  or  for  time lapse imaging. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Excellent.  

21  

Dr. Paul Gokhale:  For the rest, we do flow cytometry.  Sean Sanders:  Great. So the next question I’m going to ask, there’s been a couple of 

questions  about  resolution  and  size  limit  for  flow  and  image cytometry and I know that one of you did show a slide looking at the mitochondria.  So  really, what  is  the  resolution of  image  cytometry current? What  can you get down  to? Maybe Dr. Roquemore, we’ll start with you.  

 Dr. Liz Roquemore:  I think with the high content systems particularly  if you’re going for 

the  confocal ones, we  can go quite  small down  to  the micrometer size. 

 [00:45:02] Sean Sanders:  All right.  Dr. Liz Roquemore:   So we  can  see  small  things  like mitochondria. We  get  great  detail 

from  the cells. On  some of  the more bench  top  image cytometers, for Cytell for example the size range would be from 5 microns up to about 25 microns. 

 Sean Sanders:  Okay. Dr. Telford?  Dr. Bill Telford:  Yeah. Again, it really varies depending on the system, although some 

systems have some  flexibility. A  lot of the data  I showed  in my talk was from the Compycyte iCys system and it can go down to I believe 0.5 micron resolution. So you’re not visualizing individual organelles at that level but you can look at translocation from the cytoplasm to the nucleus. You can look at fluorescence polarity if the fluorescence is greater on one side of  the cell or another and you can also vary that resolution. So the higher the resolution, the slower the scan. If you need to scan 96‐well plates for viability, you can scan them but a very low resolution like a 5 or 10‐micron resolution and do a 96‐well plate in 15 minutes.  

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Bill Telford:  And the you can do the converse situation where you need to look at 

individual  cells  and  look  at  subcellular detail  and  the  scans  can be much longer than that. 

 Sean Sanders:  Great. Dr. Gokhale, how about in your experience?  

22  

Dr. Paul Gokhale:  It’s typically down to mitochondrial size to be honest with the much smaller  ‐‐you’re starting  to use very, very specialized optics done.  I mean  you  can  get  60  times  and  a  hundred  times  air  lenses  for example and water‐immersion on these systems. But as I alluded to in my talk, it becomes progressively more difficult to maintain focus on  things  in  an  automated  system  because  you  got  other  factors affecting you like autofluorescence caused by the plastic ware or the fact the plastic ware is not made flat. So you then start to really need to  be  thinking  about  systems,  which  look  at  coverslips  and  then maybe more of a hybrid system. You can now get software  for  the conventional  microscopes  which  behaves  much  more  like  a  high content system where you can take multiple fields  in a well or on a slide.  So  you  start  to  think  about  systems  like  that where  you’re using proper high confocal optics and things so. 

 Sean Sanders:  Great. Excellent. So I’m going to come to you, Dr. Telford, for a more 

specific question about stem cells. We have a couple of questions on that here. This person asks what markers and staining protocols you use to identify your stem cells and how you manage quality control? 

 Dr. Bill Telford:  Well we certainly – you know, most of our stem cell analysis is in the 

flow  cytometry  platform,  although  we  had  done  some  image cytometry as well. So we use a wide variety of cell surface markers. Most of our work is murine so we’ll look at [c‐Kit+, Sca‐1. We’ll look at  the  SLAM markers,  CD150,  244,  48. We  still  use  Hoechst  side population quite a bit. This  is an older technique.  It was developed by  Peggy  Gooddell  back  in  the  mid‐‘90s,  but  it’s  proven  to  be relatively  resilient  in  the  sense  that  it  does  –  while  certainly  not universal  it  does  appear  in  many  mammalian  stem  cell hematopoietic and non‐hematopoietic populations.  

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Bill Telford:  So  we  still  include  that  in  our  analysis  and  it’s  actually  quite 

compatible with  immunophenotyping  so we  don’t  lose  anything  if we add in the Hoechst red and Hoechst blue or dicycle red and blue. I think probably Dr. Gokhale can speak more to the imaging aspects of stem cells than we can. 

 Sean Sanders:  Sure. Sure. Dr. Gokhale?  Dr. Paul Gokhale:  Yeah. I mean we actually use the same antibodies we would use on 

flow cytometers, although of course from these antigens and things we discover,  the  image  cytometer didn’t  really exist  so  it’s exactly 

23  

the  same  antibodies.  So  it’s  very…  the  stains  and  everything  are really very similar apart  from the trypsinization of the cells to what we would use  for  flow cytometers. So and you have  the additional thing that we would coat Hoechst in with thick cells just to locate the cell so very, very similar. 

   With regards to quality control, all the antibodies are titered against 

cells  that we’re using  to  check  that  they  are  in  fact  at  the  correct place  in  the  titration curve and  the same  for  the secondaries. Also, we do have cell lines that we know express the markers that we use that can be used as positive control as well. So we tend to find that gives us a bit more consistency if we include those controls. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Now  stem  cells  tend  to  be  rather  delicate  cells  and  flow 

cytometry can be a little bit harsh as far as conditions are concerned so  I’m  guessing  that maybe  the HCA  systems might  be  a  little  bit better  for  looking  at  stem  cells?  So maybe  Dr.  Gokhale,  can  you comment on that?  

 Dr. Paul Gokhale:  Well yes. Well particularly human pluripotent cells,  like ES cells and 

human  embryonic  stem  cells,  do  not  like  being  on  their  own.  So when you trypsinize them, you’ll start to induce cell death in a large proportion of  them  in  theory. So whilst you can analyze  them on a traditional  flow cytometer, you know,  if you  just put  in and so you don’t care the cells die afterwards, if you want to recover them with the flow sorter,  I’m afraid you’re going to get quite high cell  losses. We typically factor it about 50% cell loss. 

[00:50:26]   The other factor when going through a flow sorters that we found is 

that  human  embryonic  stem  cells  have  very  little  cytosol  so  they don’t like going through these machines at very high speeds because they can’t endure shearing  forces which can  rip  them apart. So we have to turn all the pressures down and actually sort at a slower rate than you might be able  to  in  some of  the cell  types. Yeah,  it’s  just one  of  those  things.  The mouse  cells  clone  a  lot  better.  They’re actually  better  at  handling  this  but  for  some  reason  human embryonic stem cells just don’t like being on their own.  

 Sean Sanders:  Uh‐hum. So Dr. Telford,  I know you have some experience with the 

use of flow.  Dr. Bill Telford:  Yeah.  We’ve  observed  exactly  the  same  thing.  Really  the  only 

strategy you can do  is  turn down  the pressure on your  instrument. Use a  larger nozzle. Basically go back to the pressures that we used 

24  

15, 20 years ago for sorting all cells to try to, you know, minimize the damage.  Stem  cells,  particularly  human  stem  cells  they’re  like dendritic cells and apoptotic cells, they tend to be very, very fragile and  they don’t  tend  to deal with  the high differential pressures  in stream  and  air  sorters  very  well.  So  really  just  turn  down  the pressure and maximize the nozzle size. 

 Sean Sanders:  Right.  Dr. Bill Telford:  If you can.  Sean Sanders:  Dr. Roquemore, any comments on stem cells?   Dr. Liz Roquemore:  Yes. We work with  stem cells quite a  lot  in  the  lab and  I  think our 

experience  is similar  to  the other  two speakers  really  that  the cells like to be together. They don’t like a lot of shear forces and so a lot of time we are using the high content system to characterize those cells.  It  gives  them  time  to  recover  on  the  dish, makes  sure  that they’re expressing everything they should be expressing.  

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Liz Roquemore:  And  they’re  just generally happier cells  then when we go  to  image 

them.  Sean Sanders:  Right.  So  the  next  question  I  have  is  the  application  of 

immunocytometry  in microbiology  and  I’m  not  sure which  of  the speakers have much experience but maybe Dr. Roquemore, are you aware of anyone that’s using it for bacteria – 

 Dr. Liz Roquemore:  We  are  aware  of  some  applications where  people  are  using  high 

content  for  very  small  organisms  like  yeast  and  bacteria  but  you don’t hear about that a lot. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Liz Roquemore:  So I know that the resolution is there to do it but I’m not – you know, 

you don’t hear about a lot of applications in that area.  Sean Sanders:  Right.  Dr. Liz Roquemore:  Particularly because I think people are looking for things they can do 

at high speed screening.  

25  

Sean Sanders:  Okay. So the next question, the viewer seems very impressed by the data. He says  it seems that the assays are great, there’s no need  ‐‐ and it doesn’t seem there’s a need for an expert to be involved. But is this the truth, is this, the high content systems, are they something that you can set up and somebody maybe with  less experience can use? Dr. Telford, you want to try this? 

 Dr. Bill Telford:  You know, what we tell our users with the  image cytometry  is that 

the sample is 2/3 of the battle because unlike flow cytometry where you’re  triggering  on  individual  cells  and  most  of  your  trash  and debris  are  flying  away  and  you’re  not  seeing  them, with  imaging, you’re  seeing  everything.  You’re  seeing  all  the  garbage  and everything else. So you really need to do a very high quality sample preparation  and  what  we  tell  our  investigators  is  the  same techniques  and  care  that  you  apply  to  your microscopy  should  be applied to image cytometry as well because the same problems that you’ll  have with microscopy will  also  occur with  image  cytometry too. 

   You  choose  fluorochromes  that  don’t  bleach  easily. A  lot  of  these 

systems  have  lamp  or  laser  dwell  times  in  the  seconds  where  a typical  flow  cytometer  illuminates  that  the  cell  for  about  a microsecond.  So  we  like  to  use  some  of  the  newer  fluorinated, sulfonated  low molecular weight  probes  like  the  Alexa  Fluor  dyes work rather well, Quantum dots. Quantum nanoparticles work very well.  Take  the  same  precautions we would  from microscopy,  use reagents  that will prevent photobleaching. Anything you  can do  to maximize  the  intensity  of  your  fluorescence  and  to  keep  your samples as clean as possible should be applied here. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Great. Dr. Gokhale, I’ve got a question for you that came in 

during your presentation about the software packages that you use when you’re doing your analysis. Are these available commercially or are these something that’s being developed in your lab? 

 Dr. Paul Gokhale:  Well  the  images,  the  thing  that  I  showed  are  actually  from 

commercial packages, which is the GE developer toolbox.  Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Paul Gokhale:  There are other commercial packages out there, which will do similar 

things and you really do need to check them out if they will do what you want  them  to do with  the…  I would  strongly  recommend  that you test it on real images of your biology that you’re trying to look at 

26  

because you can have all sorts of problems trying to segment images with certain packages depending on how they do it.  

[00:55:09]   For the time lapse imaging, we do develop our own software for that 

but that’s because it’s using phase contrast imaging so it’s using very sophisticated  image  analysis  techniques  to  do  that  so  that’s  not commercially available. But  I fully expect that sort of systems to be available  in  the  future  actually.  It’s  becoming  more  and  more common  to  incorporate  that  sort  of  analysis  into  these  software packages.  

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Excellent.  So  a  question  now  from  somebody  who’s 

obviously  looking  to  purchase  a  high  content  system  and  they’re interested in what you would say are the most important features to consider when  you’re  looking  at  an  instrument.  Dr.  Roquemore,  I know you might be a  little bit biased towards the GE machines but maybe you can all  talk about  the  things  that you  look  for. So we’ll start with you, Dr. Roquemore.  

 Dr. Liz Roquemore:  Yeah.  I’ll  try  to  be  as  unbiased  as  possible.  I  have  been  doing 

microscopy for a number of years and –  Sean Sanders:  Right.  Dr. Liz Roquemore:  ‐‐ used a  lot of different systems.  I think key when thinking about a 

system  is  going  to  be  the  flexibility  because  you  know  you’re investing quite a lot in a system and you want to make sure that it’s going  to be able  to do  the applications  that you’re doing now and the things that maybe are unforeseeable that you want to do in the future. Another thing has got to be image quality. I think, you know, you want to make sure you got the best optics that are available to generate  those  images because  the data  that you get  really  is only going  to  be  as  good  as  the  images.  The  third  thing  I would  say  is speed.  If  you’re  turning  to  a  high  content  system,  it’s  not  like  a research grade microscope. You’re  investing  in one so that you can get a lot of data from many different samples in order to be able to get  that  high  content  information  so  speed  is  really  important.  So those are three key things that I would look for.  

 Sean Sanders:  Right. Dr. Telford?  Dr. Bill Telford:  Yeah.  I  would  also  think  about  some  of  the  ways,  some  of  the 

internal  aspects  of  the  instrument whether  it’s  for  example  laser based  or  lamp  based. Most  image  cytometer  systems  either  use 

27  

lasers where they raster an image or use some of their line scanning or  they use a  lamp  like a xenon  lamp  to excite  the sample. On  the downstream  detection,  they  can  use  sometimes  photomultiplier tubes. CCD cameras and chips now are becoming more common  in some systems. As far as the laser‐based systems, I think you’re going to  have  better  sensitivity.  You  may  have  better  edge‐to‐edge uniformity of the sample than you will with the lamp‐based systems. But  laser  systems  tend  to  be  slower  and  lamp‐based  systems  can often be very, very rapid, have very high throughput. With the xenon lamp, you can also filter off any bandwidth you want really from the violet all  the way  to up  to  the  red. So  there’s a  certain amount of flexibility in excitation out there. 

   But  certainly  some  of  the  systems  that we’ve  talked  about  today, 

we’ve talked about the Compycyte  iCys, the GE IN Cell Systems, the PerkinElmer  systems.  These  are  all  being  used  very  actively  in laboratories now and we’ve tested most of them and they’re all very, very  good  at what  they  do.  So  they’re  all worth  considering.  Just think  about  what  your  application  is  going  to  be  and  whether sensitivity  is your primary concern,  is high throughput your primary concern, high versus low resolution and so forth.  

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Great. Dr. Gokhale, do you have anything to add?  Dr. Paul Gokhale:  Well  there’s  a  couple  of  things,  some  very,  very  sort  of  practical 

aspects is also focus systems. So with HCA systems one of the things that you want it to is go from field to field and be able to focus as it goes from well to well. You really got to have autofocus systems that can work very, very well. You know, so you must test that out with whatever plates or whatever you’re planning to use. The other thing is the software, will  it do the things that you want  it to do and  is  it easy  to  learn  and  stuff  like  that.  You  know,  you  want  to  be concentrating  on  looking  at  the  biology  and  understanding  the biology not having to, you know, relearn programming or something, you know. So I think those are the additional things. The points that the  others  speakers made  though  are  excellent  sort  of  guides  to what you should look for. 

 Sean Sanders:  Fantastic. Well we’re at  the  top of  the hour but  I’m going  to shoot 

one more question to you that maybe you can answer very briefly in 30  seconds.  That  is  where  do  you  see  the  field  of  high  content analysis moving in the next five to ten years or what would you like to see that will really drive your research? So we’ll start with you, Dr. Telford. 

28  

 Dr. Bill Telford:  What  I’d  like  to  see  is  all  flow  cytometers  have  imaging  where 

imaging  will  become  a  parameter  just  like  forward  scatter  or fluorescence  is  a  parameter.  I  think  you’re  seeing  it  in  the  Amnis Image Stream.  It’s sort of  the  forerunner of  this, which  is currently the one system that will do  in‐stream  imaging.  I think all the major manufacturers are looking at that very closely and I would very much like  to  see  a  picture  of  the  cell  be  a  parameter  and  all  the subsequent  intracellular  data  that  you  can  pull  out  of  that  be  a parameter just like fluorescence or forward scatter is.  

[01:00:14]   I think the slide‐based systems are quite well developed now. I think 

we’re  going  to  see  increases  in  speed  and  resolution  but  that’s another  direction  that  has  proven  to  be  very  productive  in biomedical sciences, and I think we’ll continue.  

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Gokhale, now about you?  Dr. Paul Gokhale:  More  colors  will  be  useful.  And  when  we  compare  it  with  flow 

cytometers,  at  the  moment  we’re  quite  limited  which  is  partly reagents so  it’s not really the manufacturer’s  fault. But  it would be good  to have  systems which  could handle more  colors  if we  could actually have the – if we have the reagents to do it.  

 Sean Sanders:  Right. Great. And Dr. Roquemore, last word for you.  Dr. Liz Roquemore:  I think we will see quite a lot of good developments in this area but 

one  of  the main  things  I’d  like  to  see  is  the  systems  continually become  easier  to  use.  So  the  emphasis  is  no  longer  on  being  an expert  to use  the  instrument but putting  the scientist  is  then  freed up to put the effort in to developing the assay and handling the cells properly and the instrument is just there and does its job. And also I think we will see great developments on the  image analysis side of things  so  that not only will  this  software be analyzing  the data  for you but  it will be  interpreting  it for you and helping you process all that great amount of high content data. 

 Sean Sanders:  Fantastic.  I  just wanted to mention very briefly before we close out 

the  webinar,  I  know  some  of  you  did  have  some  trouble downloading the slide deck. We will make sure that that is available on the on‐demand webinar so come back any time in about 48 hours to look for the on‐demand. You will get an email alerting you to that, the availability of that archive.  

Slide 51 

29  

  But we  are  unfortunately  out  of  time  now  for  this webinar  so  on behalf of myself  and our  viewing  audience,  I wanted  to  thank our speakers very much for being with us today: Dr. Bill Telford from the NIH, Dr. Liz Roquemore from GE Healthcare, and Dr. Paul Gokhale on the phone from the University of Sheffield.   

   Please go to the URL now at the bottom of your slide viewer to learn 

more about resources related to today’s discussion, and look out for more  webinars  from  Science  available  at  webinar.sciencemag.org. This  webinar  will  be  made  available  again  as  an  on‐demand presentation within approximately 24 to 48 hours from now. 

   We'd  love  to  know what  you  thought  of  the webinar,  send  us  an 

email at the address now up in your slide viewer, webinar@aaas.org.    Again,  thank you  to our wonderful panel and  to GE Healthcare  for 

their kind sponsorship of today's educational seminar. Goodbye.  [01:02:40]  End of Audio