Title 黒色系ダリアにおける花弁の黒色化機構( Dissertation_全文 )

Author(s) 出口, 亜由美

Citation Kyoto University (京都大学)

Issue Date 2016-03-23

URL https://doi.org/10.14989/doctor.k19757

Right 許諾条件により本文は2016-07-19に公開

Type Thesis or Dissertation

Textversion ETD

Kyoto University

黒色系ダリアにおける花弁の黒色化機構

出口亜由美

2016

目 次

緒 言 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

第 1 章 黒色系ダリアに特異的な形質および遺伝子発現制御の解析 . . . . . . . . . . . . . . . . .5

第 1 節 測色による花色の評価 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

第 2 節 花色に関与する形質の比較調査 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

第 3 節 黒色系ダリアにおける色素蓄積の遺伝子制御の調査 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

第 4 節 考察 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

第 2 章 ‘黒蝶’の花弁の赤紫色化を引き起こす原因の解析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

第 1 節 ‘黒蝶’赤紫色個体からのウイルスの検出および除去 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

第 2 節 タバコ条斑ウイルス（ TSVd a h l i a）の塩基配列の調査 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

第 3 節 TSVd a h l i a 感染による赤紫色化機構の調査 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

第 4 節 TSVd a h l i a の接種および花色変化の調査 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

第 5 節 考察 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

第 3 章 ダリア花弁に蓄積する各種アントシアニンの花弁黒色化への寄与度の

評価 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

第 1 節 主要蓄積アントシアニンの同定および定量 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

第 2 節 各種アントシアニンの in v i tro 測色 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

第 3 節 考察 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

摘 要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

Abstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

謝 辞 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

引用文献 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

1

緒 言

黒という花色は，落ち着きのある色合いが魅力的であるのと，他の色を惹き立

てる花色であるとして人気が上昇している．黒色花を咲かせる植物種は数が少な

く，学 術 文献に お いて報 告 されて い るのは パ ンジー の 野生種 （ Viola tr icolor）

（ Clausen，1930），Lisianthius nigrescens（ Markham ら，2004），およびボタン（ Peony

spp.）（ Wang ら，2001）などに限られている．しかし，近年では，ペチュニア（ Petunia

hybrida），タチアオイ（ Althaea rosea），クレマチス（ Clemat is）などでも黒色系品

種が販売され始めた．黒色という花色は花卉産業においてこれからの利用価値が

見込める形質であるものの，花弁の黒色化の仕組みは明らかになっていない．

ダリア（ Dahlia variabi l i s）はキク科に属する高次倍数性（ 2n = 8x = 64）の花卉

であり（ Gatt ら，1998），花型，花色，花径が非常に豊富であるため，過去 100 年

で約 50,000 品種が育種されたといわれている（ McClaren， 2004）．黒色の品種も

多数存在し，なかでも中大輪セミカクタス咲きの‘黒蝶’は切り花ダリアの代名

詞にもなるほど人気の高い品種である．

ダリアの花弁に蓄積する色素はフラボノイド系色素であり，橙色から赤紫色の

アントシアニン，淡黄色のフラボンおよび黄色のカルコンが主たる構成色素であ

る（ Harborne ら，1990；Nordst röm・ Swain，1953，1956，1958）．アントシアニン

はペラルゴニジン系およびシアニジン系，フラボンはアピゲニン系およびルテオ

リン系，カルコンはイソリキリチゲニン系およびブテイン系が蓄積する．これら

のフラボノイド色素の合成経路は様々な植物種で研究されており（ Tanaka ら，

2008），ダリアにおいても合成を担う酵素について研究がなされ（ Fischer ら，1988；

Halbwirth ら， 2008； Thil l ら， 2012； Wimmer ら， 1998），各色素アグリコンの合

成経路は第 1 図のとおりであるとされる．アントシアニジン（ペラルゴニジンお

よびシアニジン）は糖の付加やアシル化などの過程を経て，アントシアニンとし

て液胞に蓄積する．ダリアにおいては，これらの色素合成酵素をコードする遺伝

子も多くが単離されている（ Ohno ら，2011a，2011b；Schlangen ら，2010；Suzuki

ら，2002）．また，アントシアニン合成に関しては，bHLH 様転写因子 DvIVS が合

成経路上の複数の遺伝子の発現量を正に制御し，花弁でのアントシアニン蓄積量

および桃色から赤紫色までの花色の濃淡の決定因子であることが明らかになって

いる（ Ohno ら，2011a，2013）．しかし，最濃色である黒色は DvIVS による制御で

は説明できず，花弁の黒色化には未知の機構が関与していることが示唆されてい

る．

本研究ではダリア花弁の黒色化機構を明らかにすることを目的とした．本研究

に先立ち，私はある農場において赤紫色の花をつける‘黒蝶’を発見した．この

‘黒蝶’赤紫色個体は遺伝子背景が本来の黒色花をつける‘黒蝶’と同じである

2

と推察され，花弁の黒色化の要因を探索するための比較調査を行うに適した個体

であると考えられた．そのため，複数の黒色系および赤紫色系品種とともに‘黒

蝶’赤紫色個体を実験に供試した．第 1 章では黒色系と赤紫色系間での比較解析

により黒色系品種に特異的な形質および遺伝子制御の特定を行い，第 2 章では‘黒

蝶’の赤紫色化の原因を調査した．第 3 章では，第 1 章および第 2 章で示唆され

た各種アントシアニンの花弁黒色化への寄与度の違いについて in v i tro 測色法に

よる評価を行った．これらの結果から，ダリアにおける花弁の黒色化機構および

他の植物種における黒色花作出の可能性を考察した．

＊図表中では赤紫色を purple と表記した．

3

Fig. 1 . Synthet ic pathway of f lavonoid pigments (aglycones) accumulated in dahl ia petals . CHS: chalcone synthase, CHI: chalcone isomerase, F3H: f lavanone 3-hydroxyrase, DFR: dihydroflavonol 4-reductase, ANS: anthocyanidin synthase , F3 'H: f lavonoid 3 '-hydroxyrase, CHR: chalcone reductase, CH3H: chalcone 3-hydroxyrase, FNS: f lavone synthase. Among these enzymes, only CHR remains to be isolated.

4-Coumaroyl CoA+ 3x malonyl-CoA

Chalcononaringenin(Chalcone)

Naringenin(Flavanone)

Eriodictyol(Flavanone)

Isoliquiritigenin(Chalcone)

Apigenin(Flavone)

Luteolin(Flavone)

Dihydrokaempferol(Flavanonol)

Dihydroquercetin(Flavanonol)

Leucopelargonidin(Leucoanthocyanidin)

Leucocyanidin(Leucoanthocyanidin)

Pelargonidin(Aanthocyanidin)

Cyanidin(Anthocyanidin)

Butein(Chalcone)

CHS + CHR CH3H

CHS

CHIF3'H

F3'HF3H

DFR

ANS

F3H

DFR

ANS

FNSFNS

4

Fig. 2 . Dahl ia cul t ivars used in th is s tudy. Black cul t ivars : ‘Fidalgo Blacky’, ‘Ms. Noir ’ , ‘Kokucho’ and ‘Black Cat’ . ‘Kokucho’ with purple f lowers: ‘Kokucho’ (purple) . Purple cul t ivars: ‘Cupid’ , ‘Yukino’ , ‘Super Gir l ’ , ‘Atom’ and ‘Evelyn Rumbold’ . Pink cul t ivars : ‘Jyunn-ai’ and ‘Saffron’ . Black-white bicolor cul t ivars : ‘Kazusa-shi ranami’ and ‘Kageboushi’ .

5

第 1 章 黒色系ダリアに特異的な形質および遺伝子発現制御の解析

植 物 組 織 に お い て 黒 色 の 色 調 が 現 れ る 原 理 に は ， ブ ド ウ （ Vit is v ini fera， V.

labruscana）の果皮のようなアントシアニンの高蓄積や（ Boss ら，1996；Shiraishi

ら，2007），パンジー（ Viola ×wit trockiana）やパフィオペディラム（ Paphiopedi lum

appletonianum）の花弁に存在する黒斑のようにアントシアニンとカロテノイドと

いった複数の色素の混在が報告されている（斎藤，1990）．また，花色には花弁に

蓄積する色素の組成や量以外にも，色素の蓄積組織や細胞内での局在，花弁表皮

細胞の構造，花弁 pH が関与していることが知られている（ Grotewold， 2006）．

本章では，まず，CIE（ Commission internat ionale de l 'éclairage：国際照明委員会）

が定める均等色空間の一つである L*a*b*表色系を用いてダリアの花色の数値評

価を行った．その上で，黒色系品種，赤紫色系品種および‘黒蝶’赤紫色個体を

用いて花色に関与すると報告のある形質について比較調査を行い，黒色系品種に

特異的な形質を特定した．さらに，特定された形質を生じる遺伝子制御機構につ

いて調査を行った．

第 1 節 測色による花色の評価

〈材料および方法〉

黒色系 4 品種（‘フィダルゴブラッキー’，‘ミズノアール’，‘黒蝶’，‘ブ

ラックキャット’），赤紫色系 5 品種（‘キューピット’，‘雪乃’，‘スーパー

ガール’，‘アトム’，‘エベリンランボルト’），桃色系 2 品種（‘純愛’，‘サ

フラン’）および‘黒蝶’赤紫色個体を供試した．色差計 NR-3000（日本電色工業）

を用いて，生花弁の L*a*b*値を測定した．L*は明度，a*は赤－緑，b*は黄－青を

示す数値であり， a*および b*から彩度を示す C* = (a*2 + b*2 )1 / 2 を計算した． 1 花

序あたり花弁 3 枚を 3 箇所ずつ，計 3 花序分測定し，各品種および‘黒蝶’赤紫

色個体の L*， a*， b*および C*の平均値を算出した．測定は測定台の影響が出な

いよう白色紙の上で行った． L*および C*の有意差検定はマンホイットニーの U

検定で行った．

〈結果〉

各品種の花弁の L*， a*， b*および C*は第 1-1 表のとおりであり，彩度 C*およ

び明度 L*による各品種の分布を第 1-1 図に示した．桃色系，赤紫色系，黒色系品

種の順に花色が淡色から濃色になるにしたがい L*は低くなった．一方で，C*は桃

色系から赤紫色系にかけては高くなり，黒色系になると低くなった．黒色系とそ

6

の他の色系（赤紫色系および桃色系）との比較では， L*は黒色系品種において有

意に低く（ P = 0 .007）， C*には有意な差はなかった（ P = 0 .234）．黒色系品種内で

は，見た目の花色（第 2 図）がより黒い品種ほど L*および C*がともに低い値を

示した．これは日本色彩研究所が定める PCCS（ Pract ical Color Co-ordinate System：

日本色研配色体系）でのトーン（第 1-2 図）において L*および C*が低くなるほど

黒色に近づくことと一致した．

7

Table 1-1. Petal colors described by CIE L*a*b* coordinates.

L* a* b* C*'Fidalgo Blacky' 14.14 ± 0.33 84.53 ± 1.51 2.34 ± 0.10 84.57 ± 1.51

'Ms. Noir' 14.22 ± 0.20 86.01 ± 5.50 3.06 ± 0.48 86.07 ± 5.51'Kokucho' 14.90 ± 0.17 94.12 ± 2.68 3.84 ± 0.42 94.20 ± 2.69'Black Cat' 15.94 ± 0.96 103.53 ± 1.61 6.58 ± 0.77 103.75 ± 1.62

'Kokucho' (purple) 17.22 ± 0.28 119.62 ± 2.07 8.76 ± 0.40 119.94 ± 2.08'Cupid' 20.55 121.42 -0.96 121.44

'Yukino' 21.53 ± 0.56 119.50 ± 1.28 11.46 ± 1.86 120.09 ± 1.23'Super Girl' 24.10 ± 1.10 111.74 ± 2.02 13.76 ± 2.72 112.70 ± 1.73

'Atom' 27.53 ± 1.48 106.92 ± 3.69 -7.47 ± 0.86 107.20 ± 3.67'Evelyn Rumbold' 29.45 ± 1.84 94.23 ± 4.17 1.39 ± 3.11 94.40 ± 4.14

'Jyunn-ai' 60.29 48.91 -12.99 50.61 'Saffron' 63.06 ± 0.25 46.62 ± 0.73 -10.83 ± 0.20 50.79 ± 0.69

C* was culculated as (a *

2+b *

2)

1/2.

CultivarCIE L*a*b*C* coordinates

Flower color

Data represent the average ± SE of total 27 collected data points:3 locations × 3 petals × 3 individual inflorescences (2 inflorescences in 'Cupid' and 'Jyunn-ai').

Black

Purple

Pink

8

Fig. 1-1. Dist r ibut ion of L* ( l ightness) and C* (chroma) values of black, purple , pink cul t ivars and ‘Kokucho’ (purple) . The raw data are shown in Table 1-1.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 50 100 150

L*

(Lig

htne

ss)

C* (Chroma)

Pink

Purple

'Kokucho' (purple)

Black

2 3 456

7

9

1

8

10

1112

1. 'Fidalgo Blacky'2. 'Ms.Noir'3. 'Kokucho'4. 'Black Cat'5. 'Kokucho' (purple) 6. 'Cupid'7. 'Yukino'8. 'Super Girl'9. 'Atom'

10. 'Evelyn Rumbold'11. 'Jyunn-ai'12. 'Saffron'

9

Fig. 1-2 . Tone def ined in Pract ical color coordinate system developed by Japan Color Research Inst i tute . h t tp: / /www.sikiken.co. jp/pccs/pccs04.html

10

第 2 節 花色に関与する形質の比較調査

〈材料および方法〉

黒色系 4 品種，赤紫色系 5 品種および‘黒蝶’赤紫色個体を供試した．

色素蓄積組織および細胞内での蓄積局在の観察［生切片の観察］

展開花弁を重ねたカミソリ 2 枚で切断し，カミソリの間にはさまれた花弁切片

をスライドグラスにのせた．カバーガラスをのせ，端から水を含ませた後，VHX

Digi tal Microscope（キーエンス）で観察した．

花弁表皮細胞の観察［レジン切片の観察］

展開花弁を FAA 固定液（エタノール：水：ホルマリン：酢酸 = 12： 6： 1： 1

v/v/v/v）に浸漬し，デシケーター中で一晩脱気した． FAA 固定した花弁をカミソ

リで 5 mm 四方に切り，流水で一晩洗浄し，組織中の FAA 固定液を水に置換した．

次に，以下の置換液および浸漬時間で組織中の水をエタノールに，さらにエタノ

ールから置換用レジンに置換した．

30％エタノール 30 分

50％エタノール 30 分

70％エタノール 30 分

90％エタノール 30 分

100（ 99）％エタノール 30 分以上

50％置換用レジン＋ 50％エタノール 2 時間

100％置換用レジン 1 時間以上

包埋用レジンをブロック作成用の型に約 3 mL 分注し，花弁サンプルを入れ，

シリカゲルを入れた容器内で固めた．固まったレジンブロックを型から取り出し，

ミクロトーム RM2155（ Leica Microsystem）を用いて厚さ 5 μm の切片を作成した．

水面で切片を伸展させ，スライドガラスに貼り付けて乾燥した．トルイジンブル

ーで 30 分間染色した後， 5 分間水洗した．乾燥させ， VHX Digi tal Microscope で

観察した．各品種花弁向軸面の表皮細胞から任意の 3 細胞を選択して，表層面に

対して垂直方向を縦として各細胞の縦（高さ）および横（幅）の長さを測定し，

縦横比の平均値を算出した．黒色系と赤紫色系（‘黒蝶’赤紫色個体を含む）間の

縦横比の有意差検定はマンホイットニーの U 検定で行った．

＊置換用レジン

Technovit 7100 l iquid（ Heraeus Kulzer） 100 mL に Hardner I（ Heraeus Kulzer） 1.0 g

を溶解して作成し， 4℃で保存した．

11

＊包埋用レジン

置換用レジンと Hardner I I（ Heraeus Kulzer）を 9： 1 の割合で混合して作成した．

花弁 pH の測定

生花弁 200 mg に蒸留水 6 mL を加え，乳棒および乳鉢を用いて花弁を磨砕し

た．1 分以内に pH メーター EX-20（堀場製作所）を用いて pH を測定した．3 つの

異なる花序の花弁を用い， 3 反復による平均値を算出した．有意差検定はマンホ

イットニーの U 検定で行った．

花弁蓄積色素の定量

展開花弁 100 mg を液体窒素中で凍結粉砕し，酢酸メタノール水溶液（酢酸：メ

タノール：蒸留水＝ 1： 4： 5 v/v/v） 1 mL を加え，よく混合した． 1.5 mL エッペ

ンドルフチューブに回収し，4℃で一晩放置した．4℃，20,600 g で 15 分間遠心分

離した後，上清をペトリ皿に回収し，風乾した．乾燥した色素を塩酸メタノール

水溶液（ 10％塩酸，50％メタノール）1 mL に再溶解し，25 µL を 1.5 mL エッペン

ドルフチューブに回収し，塩酸メタノール水溶液 475 µL を加え全量 500 µL の 20

倍希釈色素溶液を作成した．キャップロックを装着し， 95℃のウォーターバスで

1 時間加熱した．

C18 カラム（日本ウォーターズ）を装着した高速液体クロマトグラフィー（ High

performance l iquid chromatography： HPLC） LC10A システム（島津製作所）に 20

µL を注入し，流速 1 mL·min - 1，40℃で 50 分間解析を行った．溶出液は A 液（ 1.5％

リン酸）および B 液（ 1.5％リン酸，25％アセトニトリル，20％酢酸）の 2 種類を

用意し，測定開始後 40 分間で B 液の割合が 20％から 85％に，続く 5 分間で再び

20％になるように勾配を設定した．測定波長はアントシアニジンには 520 nm，フ

ラボンには 350 nm を使用した．検出されたピーク面積から各色素アグリコンの

蓄積量を算出した．検量線作成には，薄層クロマトグラフィーで回収したペラル

ゴニジン（立澤氏より提供），塩化シアニジン純品（和光純薬），アピゲニン純品

（和光純薬）およびルテオリン純品（ LKT Laboratories）を使用した．シアニジン

の検量線は塩化シアニジンとの分子量比から換算して作成した．

‘黒蝶’および‘黒蝶’赤紫色個体については，4 つの花弁発達ステージ（ S1：

着色前， S2：半分程度着色， S3：完全着色未展開， S4：完全着色完全展開）別に

生花弁 100 mg あたりの蓄積量を測定した．

12

〈結果〉

色素蓄積組織および細胞内での蓄積の局在

各品種および‘黒蝶’赤紫色個体の花弁生切片の写真を第 1-3 図に示した．す

べてにおいて，色素の蓄積は花弁向軸面および背軸面の表皮細胞のみでみられた．

また，表皮細胞内は一様に着色しており，黒色系と赤紫色系とで色素の蓄積様相

に違いはみられなかった．

花弁表皮細胞の形態

各品種および‘黒蝶’赤紫色個体の花弁レジン切片の写真を第 1-4 図に示した．

品種によって表皮細胞の大きさ，形，配列は様々であったが，各色系で目立った

特徴があるわけではなかった．黒色系と赤紫色系とで表皮細胞の縦横比に有意差

は認められなかった（第 1-2 表， P = 0.521）．

花弁 pH

各品種および‘黒蝶’赤紫色個体の測定結果を第 1-3 表に示した．すべてにお

いて花弁 pH は 4.9 から 5.5 までの弱酸性であり，一般的な花弁 pH の範囲内であ

った．黒色系品種ではおおよそ 5.0 付近であったのに対し，赤紫色系品種では黒

色系品種よりも高い値を示し，黒色系品種と赤紫色系品種および‘黒蝶’赤紫色

個体とでは 5％水準で有意な差がみられた（ P = 0.033）．しかし，黒色系と赤紫色

系での pH の差はわずか 0.5 程度であった．また，赤紫色系‘雪乃’と黒色系‘ミ

ズノアール’の値にはほとんど差がなく，‘黒蝶’赤紫色個体は‘黒蝶’およびそ

の他の黒色系品種と同等の値を示した．

フラボノイド色素蓄積量

各品種における色素アグリコン別蓄積量を第 1-5 図に示した．算出された各ア

グリコン量はそれらを骨格とする配糖体，すなわちアントシアニンおよびフラボ

ンの蓄積量を反映するものと考えられた．黒色系品種はアントシアニン（ペラル

ゴニジン系およびシアニジン系）の総蓄積量が比較的多かったが，‘フィダルゴブ

ラッキー’および‘ブラックキャット’は赤紫色系の‘雪乃’および‘スーパー

ガール’よりもアントシアニン総蓄積量が少なかった．また，黒色系品種はシア

ニジン系アントシアニンの割合が高く，絶対蓄積量が多い傾向がみられた．さら

に，黒色系品種と赤紫色系品種間での明確な違いとして，黒色系品種は赤紫色系

品種では蓄積がみられるフラボン（アピゲニン系およびルテオリン系）をほとん

ど蓄積していなかった．

‘黒蝶’はフラボンを蓄積していなかったのに対し，‘黒蝶’赤紫色個体は赤紫

色系品種のようにフラボンを蓄積していた（第 1-6 図 a , b）．‘黒蝶’赤紫色個体

13

ではフラボンが S1 から蓄積し始め， S3 で蓄積が最大となった．また，アントシ

アニンは‘黒蝶’と同様に S3 で蓄積が最大となったが，蓄積量は‘黒蝶’よりも

少なかった．S3 における‘黒蝶’でのアントシアニン総蓄積量と‘黒蝶’赤紫色

個体でのアントシアニンおよびフラボンの総蓄積量は概ね一致していた．また，

アグリコン別にアントシアニン蓄積量を比較すると，‘黒蝶’赤紫色個体でのペラ

ルゴニジン系アントシアニン蓄積量，シアニジン系アントシアニン蓄積量は‘黒

蝶’よりそれぞれ 0.74 mg， 0.55 mg（生花弁 100 mg あたり）少なく，シアニジン

系アントシアニンでのみ有意な差がみられた（第 1-6 図 c）．

14

Fig. 1-3 . Transverse sect ions of petals of black cul t ivars , purple cul t ivars and ‘Kokucho’ (purple) . (a) ‘Fidalgo Blacky’ , (b) ‘Ms. Noir ’ , (c) ‘Kokucho’ , (d) ‘Black Cat’ , (e ) ‘Kokucho’ (purple) , ( f ) ‘Cupid’ , (g) ‘Yukino’ , (h) ‘Super Gir l ’ , ( i ) ‘Atom’, ( j ) ‘Evelyn Rumbold’. Scale bar in ( j ) shows 100 µm.

15

Fig. 1-4. Transverse sect ions of adaxial petal epidermal cel ls of black cul t ivars , purple cul t ivars and ‘Kokucho’ (purple) . (a) ‘Fidalgo Blacky’ , (b) ‘Ms. Noir ’ , (c) ‘Kokucho’ , (d) ‘Black Cat’ , (e ) ‘Kokucho’ (purple) , ( f ) ‘Cupid’ , (g) ‘Yukino’ , (h) ‘Super Gir l ’ , ( i ) ‘Atom’, ( j ) ‘Evelyn Rumbold’. Scale bar in ( j ) shows 100 µm.

16

Table 1-2. Heights and widths of adaxial epidermal cells of petals.

'Fidalgo Blacky' 44.6 ± 2.4 30.4 ± 0.9 1.47 ± 0.05'Ms. Noir' 81.2 ± 5.0 43.7 ± 3.8 1.87 ± 0.08'Kokucho' 48.6 ± 0.6 30.4 ± 1.4 1.61 ± 0.09'Black Cat' 55.5 ± 3.0 36.6 ± 1.3 1.53 ± 0.13

'Kokucho' (purple) 62.3 ± 0.7 34.9 ± 1.5 1.80 ± 0.07'Cupid' 54.9 ± 2.6 52.9 ± 2.8 1.04 ± 0.05

'Yukino' 52.9 ± 2.3 30.5 ± 2.4 1.77 ± 0.17'Super Girl' 64.3 ± 2.8 37.8 ± 3.8 1.73 ± 0.11

'Atom' 71.6 ± 2.5 42.8 ± 1.2 1.67 ± 0.02'Evelyn Rumbold' 58.8 ± 4.6 33.9 ± 2.4 1.73 ± 0.06

Date represent the average ± SE of three cells.

Flower color

Black

Purple

Cultivars Height (µm) Width (µm) Aspect ratio

17

Table 1-3. Petal cellular pHs of each cultivar.

Flower color Cultivars pH

'Fidalgo Blacky' 4.97 ± 0.03

'Ms. Noir' 5.13 ± 0.03

'Kokucho' 4.92 ± 0.03

'Black Cat' 5.08 ± 0.06

'Kokucho' (purple) 5.01 ± 0.02

'Cupid' 5.42 ± 0.03

'Yukino' 5.16 ± 0.02

'Super Girl' 5.35 ± 0.01

'Atom' 5.44 ± 0.02'Evelyn Rumbold' 5.50 ± 0.02

Data represent the average ± SE of three replications.

Black

Purple

18

Fig. 1-5. Contents of f lavonoid aglycones in petals of black and purple cul t ivars .Ap: apigenin, Lt : luteol in , Pg: pelargonidin , Cy: cyanidin. Data represent the average ± SE of each f lavonoid ( three biological repl icat ions; the data of ‘Cupid’ represent two biological repl icat ions) .

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

'Fid

alg

o B

lack

y'

'Ms.

Noi

r'

'Ko

kuch

o'

'Bla

ck C

at'

'Cup

id'

'Yu

kino

'

'Su

per

Girl

'

'Ato

m'

'Eve

lyn

Rum

bold

'

Con

tent

s of

fla

vono

id a

glyc

ones

(mg·

100

mg-

1F.

W.)

Ap Lt Pg Cy

19

Fig. 1-6. Contents of f lavonoid aglycones in petals of ‘Kokucho’ and ‘Kokucho’ (purple) a t four developmental s tages. (a) ‘Kokucho’, (b) ‘Kokucho’ (purple) , (c) the amounts of each aglycone in the ‘Kokucho’ and ‘Kokucho’ (purple) a t S3. Ap: apigenin, Lt : lu teol in, Pg: pelargonidin, Cy: cyanidin. Four petal developmental s tages; S1: uncolored, S2: half colored, S3: completely colored and folded, S4: completely colored and unfolded. Data represent the average ± SE of each f lavonoid ( three biological repl ica t ions) . Stat i s t ical analysis was performed with Mann-Whi tney U test . * P<0.05, N.S. not s ignif icant .

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

S1 S2 S3 S4

Co

nte

nts

of f

lavo

noi

d a

glyc

one

s(m

g·1

00 m

g-1

F.W

.)

Petal stage

ApLtPgCy

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

S1 S2 S3 S4

Con

tent

s o

f fla

von

oid

agl

yco

nes

(m

g·1

00

mg-

1F.

W.)

Petal stage

ApLtPgCy

(a) (b)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

Pg Cy Ap Lt

Co

nte

nts

of f

lavo

noid

agl

yco

ne

s(m

g·10

0 m

g-1

F.W

.)

'Kokucho''Kokucho' (purple)

＊＊

＊

N. S.

(c)

20

第 3 節 黒色系ダリアにおける色素蓄積の遺伝子制御の調査

〈材料および方法〉

フラボン合成酵素遺伝子（ DvFNS）のシークエンス解析

フラボン合成に関与する DvFNS の cDNA 全長配列およびゲノム全長配列をシ

ークエンス解析により決定した．全 RNA の抽出には Sepasol®-RNA I Super G（ナ

カライテスク）を用いた．cDNA の合成には ReverTra Ace（東洋紡）を用いた．全

RNA 50 ng・µL- 1 をテンプレートとして用い，oligo(dT)プライマーを用いて逆転写

した． DNA は MagExtractorT M -Plant Genome-（東洋紡）あるいは修正 CTAB 法

（ Murray・ Thompson， 1980）により抽出した．

‘雪乃’の cDNA，‘黒蝶’および‘黒蝶’赤紫色個体の DNA をテンプレート

に全長プライマー（第 1-4 表）を用いて PCR を行い，クローニングした後，シー

クエンス解析を行った． PCR の酵素には Blend Taq（東洋紡）を用いた． TA クロ

ーニングには DynaExpress TA PCR Cloning Kit（バイオダイナミクス研究所）を使

用した． Applied BiosystemsT M BigDye terminator v3 .1 cycle sequencing ki t（ Thermo

Fisher Scient if ic）を用いてサンプルを調製し， Applied BiosystemsT M ABI PRISM ®

3100 Genet ic analyzer（ Thermo Fisher Scient i f ic）でシークエンス解析を行った．

‘雪乃’の DvFNS cDNA 配列および‘黒蝶’の DvFNS ゲノム配列から‘黒蝶’

における推定 DvFNS cDNA 配列を決定した．使用したプライマーは第 1-4 表に示

したとおりである．また，DvFNS の全長プライマーを用いて，EmeraldAmp® PCR

Master Mix（タカラバイオ）でゲノミック PCR を行い，黒色系品種および赤紫色

系品種におけるゲノム配列の有無を確認した．

フラボノイドの合成および蓄積に関与する遺伝子の発現量の調査

黒色系 4 品種，赤紫色系 5 品種および‘黒蝶’の赤紫色個体の cDNA を A.C.

Mil l i -Q 水で 50 倍希釈したものをテンプレートとして用いた． Real- t ime RT-PCR

により，フラボン合成に関与する DvFNS，アントシアニン合成に関与する転写因

子 DvIVS，カルコン合成酵素遺伝子（ DvCHS1，DvCHS2），カルコン異性化酵素遺

伝子（ DvCHI），フラバノン 3-水酸化酵素遺伝子（ DvF3H），ジヒドロフラボノ

ール 4-還元酵素遺伝子（ DvDFR），アントシアニジン合成酵素遺伝子（ DvANS），

ア ン ト シ ア ニ ジ ン 3- グ ル コ ー ス 転 移 酵 素 遺 伝 子 （ anthocyanidin 3-

glucosyl transferase : Dv3GT）およびアントシアニン 3-マロニル基転移酵素遺伝子

（ anthocyanin 3-malonyl transferase : Dv3MT），シアニジンおよびルテオリン合成

に関与するフラボノイド 3 '水酸化酵素遺伝子（ DvF3'H）および液胞輸送に関与す

るグルタチオン S-転移酵素遺伝子（ glutathione S- transferase : DvGST）の発現量を

調査した．PCR の試薬には SYBR® Premix Ex Taq T M II（タカラバイオ）を用いて，

21

Applied BiosystemsT M 7900HT Fast Real- t ime PCR System（ Thermo Fisher Scient if ic）

で解析を行った．プログラムは｛（ 95℃・10 秒）→［（ 95℃・10 秒），（ 60℃・30 秒）］

×40 サイクル →95℃（ 15 秒） →60℃（ 15 秒） →72℃（ 15 秒）｝とした．使用した

プライマーは第 1-5 表に示したとおりである．発達ステージ別の花弁を用いた予

備実験において最も発現が高かったステージ（ DvFNS および DvF3'H；S2，その他

の遺伝子； S3）の花弁 cDNA を用いた．各遺伝子についての検量線は‘雪乃’の

cDNA の希釈系列を用いて作成した．内部標準には DvAct in を用いた．

DvFNS の small interfering RNA（ siRNA）の検出［ノーザンブロット解析］

各品種および‘黒蝶’赤紫色個体の S2 花弁から抽出した全 RNA を用いて，ノ

ーザンブロット解析により DvFNS の siRNA を検出した．解析は以下の手順にし

たがい行った．

ⅰ ) プローブの作成

①プラスミド DNA の抽出

②制限酵素処理

③フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿

④ジゴキシゲニン（ DIG）を用いた RNA ラベリング

ⅱ )炭酸バッファーによるプローブの切断

ⅲ )ノーザンブロット解析

①ポリアクリルアミドゲル電気泳動

②エレクトロトランスブロッティング

③ UV クロスリンク

④ハイブリダイゼーション

⑤洗浄および検出

各段階の詳細は以下のとおりである．

ⅰ ) プローブの作成

①プラスミド DNA の抽出

‘黒蝶’から全 RNA を抽出し，RT 反応により cDNA を作成した．DvFNS の全

長プライマー（第 1-4 表）を用いて RT-PCR を行い， PCR 産物をクローニング

した．大腸菌から QuickGene Plasmid ki t S II（ PL-S2）（倉敷紡績）を用いてプ

ラスミド DNA を抽出した．

②制限酵素処理

抽出したプラスミド DNA 3 μg をテンプレートとして， 37℃で 1 時間，制限酵

素処理を行った．酵素は HindⅢ（タカラバイオ）を用いた．

22

③フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿

制限酵素処理を行ったサンプルのフェノール・クロロホルム抽出 a )およびエタ

ノール沈殿 b )を行い， 13 μL の A.C. Mil l i -Q 水に溶解した．

a)フェノール・クロロホルム抽出

サ ン プ ル 100 μL に A.C. Mil l i -Q 水 100 μL を 加 え て 200 μL と し ，

phenol/chloroform/isoamyl alcohol を等量（ 200 μL）加え voltex にかけた．20,600

×g， 4℃で 15 分間遠心分離し，上清を回収した．

b)エタノール沈殿

サンプルの 0.01 倍量のグリコーゲン，0.1 倍量の 3M 酢酸ナトリウム（ pH5.2）

および 2.5 倍量の 100％エタノールを加え -20℃で 30 分間インキュベートし

た．20,600 ×g，4℃で 20 分間遠心分離し，上清を捨て，70%エタノールを 1 mL

加えた． 20,600 ×g で 5 分間遠心分離し，上清を捨て，減圧乾燥した．

④ DIG を用いた RNA ラベリング

1 . テンプレート DNA 13μL 全量を使用した． DIG RNA Label ing Kit（ロシュ・

ダイアグノスティックス）を用いて，37℃，2 時間のインキュベートにより

ラベリングを行った．

2 . 0 .2M EDTA（ pH8.0） 2 μL を加えて反応を停止させた．

3 . エタノール沈殿を行い，最終濃度が 100 ng/μL となるように A.C. Mil l i -Q 水

に溶解した．

ⅱ )炭酸バッファーによるプローブの切断

1 . 約 15 µg の RNA プローブに等量の炭酸バッファーを加え， 60℃でインキュ

ベートした．インキュベート時間は以下の計算式により求めた．

T=(Li-Lf) / (kLiLf) T＝時間（分）， Li＝プローブの最初の長さ

Lf＝プローブの最終的な長さ，ｋ＝定数（ 0.11kb/分）

今回は 150bp に切断するため，

T＝ (1.545-0.15)/(0.11・1.545・0.15)により 55 分間のインキュベートを行った．

＊炭酸バッファー組成（ pH10.2）

60mM Na2CO3

40mM NaHCO3

2. 10％酢酸 10 μL を加え反応を停止させた．

3 . エタノール沈殿を行い， 20 μL の A.C. Mil l i -Q 水に溶解した．

ⅲ )ノーザンブロット解析

①ポリアクリルアミドゲル電気泳動

23

1 . 15%ポリアクリルアミドゲルの作成

尿素 21.021 g

Tris 0 .27 g

ホウ酸 0.1375 g

を計量し，A.C. Mil l i -Q 水で 18 mL にフィルアップした．電子レンジで暖めて

溶解し，以下の試薬を加えた．

0.5 M EDTA (pH8.0) 200 μL

40% アクリルアミド /BIS (19:1) 18.75 mL

10% ペルオキソ二硫酸アンモニウム 170 μL

A.C. Mil l i -Q 水で 50 mL にフィルアップしてよく混和し， N,N,N,N-テトラメ

チルジアミン（ TEMED） 20 μL を加え，ゲル板に流し込んだ．

2 . サンプルの調整

全 RNA 10 μg を使用した．等量の loading dye を加え， 65℃で 10 分間変性処

理をした後，氷上で急冷した．

＊ loading dye 組成

2×loading dye

98% Formamide

10mM EDTA (pH8.0)

1mg/mL キシレンシアノール FF

1mg/mL ブロモフェノールブルー (BPB)

3 . 電気泳動

泳動には 0.5×TBE バッファーを用いた．サンプルをアプライする前にシリン

ジを用いて析出した尿素を除去した．150 V で 5 時間程度，BPB がゲルの下端

に達するまで泳動した．

②エレクトロトランスブロッティング

0 .5×TBE バッファー中で石綿，ろ紙，ゲル，メンブレン，ろ紙，石綿をこの順

に重ね，プレートで挟んだ．0.5×TBE バッファー中で 15 V，4℃，一晩ブロッテ

ィングした．ブロッティング終了後，メンブレンを 20×SSC に浸したろ紙の上

に 30 分間静置し，平衡化した後，風乾した．

③ UV クロスリンク

メンブレン CROSS LINKER XL-200（タイテック）を用いて 254 V， 0.12 J /cm2

の UV を照射し，クロスリンクした．

24

④ハイブリダイゼーション

1 . プレハイブリダイゼーション

メンブレンを 40℃に予熱した DIG Easy Hyb Granules （ロシュ・ダイアグノ

スティックス） 5 mL 中で， 40℃， 20 rpm で 30 分間以上振とうした．

2 . ハイブリダイゼーション

予熱した DIG Easy Hyb Granules 7mL にプローブ溶液を加えて，プレハイブリ

ダイゼーション溶液と入れ換えた． 40℃で一晩ハイブリダイゼーションを行

った．

⑤洗浄および検出

メンブレンを以下のとおりに洗浄し，抗体反応を行った後，バンドの検出を行

った．

1 . 低ストリンジェンシーバッファーで室温において 5 分間 ×2 回洗浄した．

＊低ストリンジェンシーバッファー組成

2×SSC

0.1% SDS

＊ 1×SSC 組成

0 .15 M NaCl

0.015 M クエン酸 Na・ 2H2O

2. 高ストリンジェンシーバッファーで 40℃において 15 分間 ×2 回洗浄した．

＊高ストリンジェンシーバッファー組成

0 .1×SSC

0.1% SDS

3. 洗浄バッファーで室温において 1～ 2 分間洗浄した．

＊洗浄バッファー組成

0 .1 M マレイン酸

0 .15 M NaCl (pH 7.5)

0 .3%(v/v) Tween20

4. ブロッキング溶液中で室温において 30 分間振とうした．

10×ブロッキング溶液をマレイン酸で 1×に希釈して用いた．

5 . 抗体溶液中で室温において 30 分間振とうした．

抗体溶液はブロッキング溶液 20 mL に Anti-DIG-AP Fab Fragments（ロシュ・

ダイアグノスティックス）を 4 μL 加えて作成した．

6 . 洗浄バッファーで 15 分間 ×2 回洗浄した．

7 . 検出バッファー中で 3 分間平衡化した．

25

＊検出バッファー組成

0 .1 M Tris-HCl(pH 9.5)

0 .1 M NaCl

8. CDP-Star をメンブレンに滴下し，LAS-3000mini（富士フイルム）を用いてバ

ンドを検出した．

smal l RNA の DvFNS へのマッピング

‘黒蝶’を供試した．S2 花弁 200 mg から Applied BiosystemsT M MirVana miRNA

Isolat ion Kit（ Thermo Fisher Scient if ic）を用いて small RNA を抽出した．次世代

シークエンサー I l lumina HiSeq 2000（ I l lumina）により small RNA を網羅的に検出

した．得られた small RNA 配列のうち 18-32 nt の small RNA を‘黒蝶’の DvFNS

ゲノム配列について，センス方向およびアンチセンス方向にミスマッチ 0 の条件

でマッピングした．また，DvFNS を赤紫色系品種と同程度発現し，フラボンを蓄

積する赤白複色系‘結納’の花弁から抽出した small RNA（ Ohno ら，2011b）も同

様に‘黒蝶’の DvFNS ゲノム配列へマッピングした．

26

Table 1-4. Primers for sequence analysis and genomic PCR of DvFNS

Name Orientation Sequence(5'-3')

FNS Full-F (for sequence) sense TCTCATCTTACCATGAATACACT

FNS Full-R (for sequence) antisense GCGAAGGGAAACACACTAGATTCGFNS Full-F (for genomic PCR) sense CCATGAATACACTCCTAGTACTCCFNS Full-R (or genomic PCR) antisense ATAAAGGACTATCACCAACGGFNS-1161R antisense ATATCCGGATTTAACACTCACAFNS-488F sense CAAACAAAATGAGAGTGTGAAFNS-800F sense ATGGCAAAGGGAAAGATTTTCTAGA

FNS-942R antisense TATTATTACTGCGGTTGTGTCTGTT

FNS-IntF1 sense ACGTGTGAGTTGAGCATCCCGAAT

FNS-IntR1 antisense TAATCTTGAAATAATTAAGAFNS-IntR2 antisense TGTGCGTTAAAAATCTAGGGTCATFNS 3’Race sense GCTGGAACAGACACAACCGCAGTAFNS 3’Race-1 sense ATGTTATTCGTAAACATTTFNS 3’Race-1R antisense ACCTCGTTCATCCATATTFNS 3’Race-2F sense AATATGGATGAACGAGGTFNS 3’Race-nested sense CCCTATGGTCATGGAAAAAGCAAAFNS 5’Race antisense CTCACATTTTCATTTGACTTCCGTAFNS 5’Race-1F antisense AATCCACCTCCGTCTCGGTTFNS 5’Race-1R antisense ATATCCTCGTACCTCTTCTTFNS 5’Race-nested antisense GGTGGATGAAGTCGGAAGGCTTCT

Table 1-5. Sequences of primers for real-time RT-PCR.Gene Forward primer (5'-3') Reverse primer (5'-3')

DvIVS CATAACCCAAGTAAAGAAAGCCATT CATCCATTTTTAAATTGTTTGTGGTDvCHS1 CATGTGCTAAGCGAATACGG CCTCTCCGGTGGTATTGAACDvCHS2 TGTCCCAACTACCATGCCGATTTC TTACACATTAAAATGACACAGTGADvCHI AGAAGCTGGGAATGCAGTGT GAGATCTGAGAGCCTTGATGCDvF3H TTGGAGGGAGATTGTGACCT GGCCCATTAACTCCTTGCTADvDFR CAACTTCCGGTCTATGACGAG TTTCGGCCAATGTTTTTGACDvANS GCTCCAACTCTTCTACAACG GAAATCCTGACCTTCTCCTTDv3GT AAACATCACCCTTCTTACTCT TTGAAAAGCGCGATGGATGTTDv3MT AAATACGAAGTTGTTTCAATC TTGCACTTTCTAATCCATCATDvGST ATGTGGTGGGATGATATTTCAAACA AACATTTATTTGTGAGTCACATACADvF3'H TCGGCTTCGTTGACGTGGTG TACGGTGCAAACACCAGATCCDvFNS GTGTGTTTCCCTTTGCTTCGTAAAA GCGAAGGGAAACACACTAGATTCGTDvActin TGCTTATGTTGGTGATGAAG CCCTGTTAGCCTTAGGATTT

27

〈結果〉

DvFNS の塩基配列

ゲノミック PCR の結果，すべての黒色系品種で赤紫色系品種と同様に DvFNS

のバンドが確認できた（第 1-7 図）．‘黒蝶’の DvFNS のゲノム配列は 1 種類で

あ っ た （ AB769841 ） ． ゲ ノ ム 配 列 か ら 推 定 さ れ た ‘ 黒 蝶 ’ の DvFNS cDNA

（ AB769842）は 1,545 bp であり 514 のアミノ酸をコードしていた．このアミノ酸

配列はガーベラ（ Garbera hybrida）の FNS II（ AAD39549）（ Martens・Forkmann，

1999）と 70％の相同性を示し，ダイズ（ Glycine max）の FNS II（ ACV65037）

（ Fliegmann ら，2010）およびリンドウ（ Gentiana tr i f lora）の FNS II（ BAD91809）

（ Nakatsuka ら， 2005）とそれぞれ 56％および 54％の相同性を示した．また，

D.variabi l i s‘ Feuerschein’から単離された FNS（ ADM67335）（ Thil l ら， 2012）

とは完全に一致した．‘黒蝶’の DvFNS ゲノム配列 （AB769841）には 1,150 bp の

イントロンが一つ含まれていた．‘黒蝶’と‘黒蝶’赤紫色個体とで DvFNS ゲノ

ム配列は完全に一致した．

遺伝子発現量

DvFNS は赤紫色系品種および‘黒蝶’赤紫色個体では十分な発現が確認された

のに対し，黒色系品種ではほとんど発現していなかった（第 1-8 図）．‘黒蝶’

赤紫色個体の DvFNS 発現量は‘黒蝶’の 44 倍であった．

DvIVS および DvIVS が発現制御する DvCHS1， DvF3H， DvDFR， DvANS の発現

量は，黒色系品種ではある程度高かった（第 1-9 図）．しかし，黒色系‘ミズノ

アール’と赤紫色系‘スーパーガール’はアントシアニンの総蓄積量がほとんど

同等であったにも関わらず，これらの遺伝子の発現量は‘スーパーガール’で高

く，他の黒色系品種もアントシアニンの総蓄積量に対して相対的に遺伝子発現量

が低い傾向にあった．DvCHS2，DvCHI，Dv3GT，Dv3MT，DvF3'H および DvGST の

発現量も黒色系品種で高いわけではなかった（第 1-9 図）．また，‘黒蝶’赤紫

色個体ではアントシアニン合成経路上の下流の遺伝子である DvF3H， DvDFR，

DvANS，Dv3GT および Dv3MT の発現量が‘黒蝶’と比較して低かったが，DvIVS

の発現量が低くなっているわけではなく，合成経路上流の遺伝子の発現量も低く

はなかった（第 1-9 図）．

DvFNS の s iRNA

ノーザンブロット解析の結果，黒色系‘黒蝶’および‘ブラックキャット’で

は 20 nt 付近に明確なバンドが確認された（第 1-10 図）．また，黒色系品種‘フ

ィダルゴブラッキー’および‘ミズノアール’でも同様のバンドがうすく検出さ

れた．一方で，赤紫色系 5 品種および‘黒蝶’赤紫色個体ではバンドは確認され

28

なかった．

smal l RNA の DvFNS へのマッピング

‘黒蝶’の花弁から抽出した small RNA 全 14,895,667 リードのうち，9,368,245

リードが 18-32 nt であった．このうち，11,574 が‘黒蝶’の DvFNS ゲノム配列に

マッピングされた（第 1-11 図 a）．マッピングされた small RNA で 21 nt のもの

は 10,279 リードであり，その多くが DvFNS のエキソン 2 にマッピングされてい

た． DvFNS ゲノム配列の 2,307 番目の塩基から 2,327 番目の塩基までと一致する

21 nt のアンチセンス small RNA が最も多くマッピングされ（ 4,192 リード），マ

ッピングされた全リードの約 40％を占めていた．また，赤白複色系‘結納’の花

弁から抽出した small RNA は，‘黒蝶’の DvFNS ゲノム配列にほとんどマッピン

グされなかった（全 17,455,041 リード中 674 リード，第 1-11 図 b）．

29

Fig. 1-7. Genomic PCR for ful l length of DvFNS . The bands indicated by an arrow are ful l length of DvFNS . 1 : ‘Fidalgo Blacky’ , 2: ‘Ms. Noir ’ , 3 : ‘Kokucho’ , 4: ‘Black Cat’ , 5 : ‘Kokucho’ (purple) , 6 : ‘Cupid’ , 7: ‘Yukino’, 8 : ‘Super Gir l ’ , 9 : ‘Atom’ and 10: ‘Evelyn Rumbold’.

30

Fig. 1-8. Relat ive transcript abundance of DvFNS . Al l data represent average ± SE (three biological repl icat ions) relat ive to the expression level of ‘Yukino’.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

DvF

NS

/ D

vAct

in

31

Fig. 1-9. Relat ive t ranscr ipt abundance of the genes involved in anthocyanin synthesis and vacuolar sort ing. (a) DvIVS , (b) DvCHS1 , (c) DvCHS2 , (d) DvCHI , (e) DvF3H , ( f ) DvDFR , (g) DvANS , (h) Dv3GT , ( i ) Dv3MT , ( j ) DvGST , (k) DvF3'H . Al l data represent the average ± SE [ three biological repl icat ions; The data of ‘Kokucho’ (purple) is f rom five biological repl ica t ions] . Data represent the expression level re lat ive to the maximum data [ ‘Kokucho’ (purple) for DvIVS and DvCHS2 , ‘Yukino’ for DvCHS1 , DvF3H , DvDFR , DvANS , Dv3GT and Dv3MT , ‘Kokucho’ for DvCHI , ‘Black Cat’ for DvGST and DvF3'H ) .

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

DvC

HS

2/ D

vAct

in

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

DvC

HI

/ DvA

ctin

0.00.20.40.60.81.01.21.4

DvC

HS

1 / D

vAct

in

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

DvF

3H

/ D

vAct

in

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

DvD

FR

/ D

vAct

in

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

DvI

VS

/ D

vAct

in

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

32

Fig. 1-9. Relat ive t ranscr ipt abundance of the genes involved in anthocyanin synthesis and vacuolar sort ing (cont inued) .

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

DvA

NS

/ DvA

ctin

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

DvG

ST

/ DvA

ctin

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Dv3

GT

/ D

vAct

in

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Dv3

MT

/ D

vAct

in

(g) (h)

(i) (j)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

DvF

3'H

/ DvA

ctin

(k)

33

Fig. 1-10. RNA gel blot hybridizat ion for DvFNS s iRNA detect ion . 1: ‘Fidalgo Blacky’ , 2: ‘Ms. Noir ’ , 3 : ‘Black Cat’ , 4 : ‘Kokucho’ , 5: ‘Kokucho’ (purple) , 6: ‘Super Gir l ’ , 7 : ‘Yukino’ , 8: ‘Cupid’ , 9: ‘Evelyn Rumbold’ , and 10: ‘Atom’. Ribosomal RNA on the elect rophoresed gel is shown in the lower photograph, which was rearranged to conform al ignment of cul t ivars to the upper photograph.

34

Fig. 1-11. Mapping of small RNAs on DvFNS genome. Small RNAs (18–32 nt long) without mismatch to ‘Kokucho’ DvFNS DNA were mapped on ei ther the sense s t rand (red: above the X-axis) or the ant isense s t rand (blue: below the X-axis) . (a) small RNAs extracted f rom petals of ‘Kokucho’. (b) smal l RNAs extracted f rom petals of a red-white bicolor cul t ivar, ‘Yuino’ (Ohno et a l . 2011b) in which DvFNS i s expressed s imilar to purple cul t ivars .

-600

-500

-400

-300

-200

-100

0

0

100

200

Exon 1 Intron Exon 2

100 bp

Num

ber

of

ma

tche

d r

ead

s pe

r m

illio

n re

ads

(18-

32 n

t)

(b) ‘Yuino’

-600

-500

-400

-300

-200

-100

0

0

100

200

Exon 1 Intron Exon 2

100 bp

Num

ber

of m

atch

ed r

eads

per

mill

ion

read

s(1

8-32

nt)

(a) ‘Kokucho’

35

第 4 節 考察

黒色系ダリアの定義付け

各品種および‘黒蝶’赤紫色個体の花弁の測色結果（第 1-1 表，第 1-1 図）か

ら，ダリアの黒色系品種は他色系品種と比較して花弁 L*が最も低い品種群である

と定義でき，さらに C*が低いほどより黒味が強いと考えられた．第 1 章の以降の

実験では主に L*を花色の指標として使用することとした．

黒色系品種に特異的な色素蓄積

黒色系品種と赤紫色系品種間における色素蓄積量の比較から，黒色系品種には，

①アントシアニン総蓄積量が比較的多い，②シアニジン系アントシアニンの蓄積

量が多い（割合が高い），③フラボンを蓄積していない，という 3 つの特徴がある

ことがわかった（第 1-5 図）．一般的にアントシアニン総蓄積量が多いほど組織の

色は濃色になるため，花弁での黒色発現はアントシアニン総蓄積量が多いことに

起因していると考えられてきた．しかし，各品種のアントシアニン総蓄積量と花

弁 L*との間には負の相関がみられたものの（ r = -0 .604），アントシアニン総蓄積

量が黒色系品種よりも多い赤紫色系品種（‘雪乃’および‘スーパーガール’）が

存在したことから，アントシアニン総蓄積量が多いことのみでは花弁黒色化の条

件は満たされないことが示唆された．

黒色系品種は総じてシアニジン系アントシアニンの蓄積量が多く，蓄積量が多

い品種ほど花弁 L*が低かった．よって，シアニジン系アントシアニンはペラルゴ

ニジン系アントシアニンよりも花弁 L*の低下に強く寄与する可能性が考えられ

た．また，黒色系および赤紫色系 9 品種におけるシアニジン系アントシアニン蓄

積量と花弁 L*との間の相関係数は -0.689 であり，アントシアニン総蓄積量と花弁

L*間よりも強い相関を示したことから，シアニジン系アントシアニン蓄積量は花

弁 L*の低下，すなわち花弁黒色化に強く関与していることが示唆された．しかし，

シアニジン系アントシアニンを黒色系品種と同程度蓄積していた‘キューピット’

は黒色を示さず，これは‘キューピット’のアントシアニン総蓄積量が少ないた

めであると考えられた．以上のことから，アントシアニン総蓄積量が比較的多い

こと，およびシアニジン系アントシアニン蓄積量が多いことは，いずれも花弁が

黒色を示すために必要な条件であると考えられた．

フラボンは無色に近い淡黄色色素であるが，コピグメンテーションによりアン

トシアニンの色調を変化させることが報告されている（ Asen ら，1972；Brouil lard，

1983； Goto ら， 1986； Yabuya ら， 1997）．コピグメンテーションはアントシアニ

ンの吸収極大波長を長波長側に移動させ，さらに吸光度を増大させることから，

青色効果および濃色効果があるとされる．そのため，黒色系品種において，フラ

36

ボンを蓄積しないことによるコピグメンテ―ションの消失が花弁の黒色化を促し

ている可能性は低いと考えられた．

‘黒蝶’赤紫色個体はフラボンを蓄積しており，その蓄積量分だけ‘黒蝶’よ

りもアントシアニン，特にシアニジン系アントシアニン蓄積量が減少していた（第

1-6 図）．アントシアニンとフラボンは合成経路が途中まで同じであり，フラバノ

ン（ナリンゲニンおよびエリオディクティオール）に F3H がはたらくとアントシ

アニン合成へ，FNS がはたらくとフラボン合成へと進む（第 1 図）．すなわち，ア

ントシアニンとフラボンは基質を取り合う関係であり，両色素の合成には競合が

生じると考えられている（ Davies ら， 2003）．‘黒蝶’赤紫色個体では，フラボン

が合成されることによってアントシアニン合成との間に基質競合が生じたために，

アントシアニンの総蓄積量が減少したと推測された．すなわち，‘黒蝶’およびそ

の他の黒色系品種ではフラボンを合成しないことによってフラボン―アントシア

ニン間の競合が生じないことで，アントシアニン総蓄積量が多くなり，またこの

際，仕組みは明らかではないが，特にシアニジン系アントシアニンの蓄積量が多

くなることで，花弁が黒色を示している可能性が考えられた．

花色に関与するその他の形質

一般的に花弁の色素は向軸および背軸面の表皮細胞に蓄積するが，柵状組織や

海綿状組織が着色することもあり，このような花弁では色素層が厚くなるため濃

色になるとされる（ Inagaki ら， 1996）．アサガオ（ Ipomoea ni l），カーネーション

（ Dianthus caryophyl lus）およびトルコギキョウ（ Eustoma grandif lorum）では，花

弁表皮細胞の液胞内にアントシアニンの凝集構造［ anthocyanic vacuolar inclusions

（ AVIs）］ができることで花色が変化し，暗くくすんだ色になることが報告されて

いる（ Markham ら，2000；Morita ら，2005；Okamura ら，2013；Zhang ら，2006）．

また，バラ（ Rosa hybrida）やカトレヤ（ Catt leya）では花弁表皮細胞の形状（縦

横比）と花弁の暗色化との関係が示唆されている（松井， 1990； Yasuda， 1964）．

供試したすべてのダリアの花弁で着色は表皮細胞のみでみられ，また，液胞内に

AVIs らしきものはみられなかったことから（第 1-3 図），着色組織および細胞内

での色素の在り方の違いにより花弁の黒色化が生じているわけではないことが示

された．また，色系により表皮細胞の大きさや形に傾向はなく（第 1-4 図），縦横

比にも差がなかったことから（第 1-2 表），表皮細胞の形態の違いにより花弁の黒

色化が生じているわけではないことが示された．

花弁 pH については主に高い pH による青色化が報告されている（ Fukada-Tanaka

ら，2000；Yamaguchi ら，2001；Yoshida ら，1995，2003）．これはアントシアニン

の色が pH により変化することに起因している．ダリアの黒色系品種と赤紫色系

品種（‘黒蝶’赤紫色個体を含む）とでは，花弁 pH に 5％水準で有意な差がみら

37

れ（ P=0.033），黒色系品種で低かった（第 1-3 表）．しかしながら， pH の差がわ

ずか 0.5 程度であること，‘黒蝶’と‘黒蝶’赤紫色個体で差がなかったことから，

花弁 pH が花弁黒色化を制御する主要因子である可能性は低いと考えられた．

DvFNS の転写後遺伝子サイレンシング

黒色系品種は赤紫色系品種と同様にゲノム中に FNSII をコードする DvFNS 配

列を有していた（第 1-7 図）．しかし，赤紫色系品種では DvFNS の十分な発現が

確認されたのに対し，黒色系品種ではほとんど発現していなかった（第 1-8 図）．

よって，黒色系品種においてフラボンが蓄積していないのは，DvFNS の発現が低

くフラボンが合成されないためであることが示唆された．

遺伝子の発現が抑制される仕組みの一つに， mRNA が切断分解される転写後遺

伝子サイレンシング（ Post- t ranscript ional gene si lencing：PTGS）がある（ Ghildiyal・

Zamore，2009；Hamilton ら，2002；Hannon，2002；Meister・Tuschl，2004）．PTGS

は二本鎖 RNA 由来の siRNA と相補的な配列をもつ特定の mRNA が， siRNA およ

びいくつかのタンパク質からなる RNA-induced si lencing complex（ RISC）により

認識されることで生じる．また，切断された mRNA 断片は s iRNA としてさらなる

切断分解を誘導すると考えられている．ノーザンブロット解析により，黒色系品

種でのみ DvFNS の siRNA が検出された（第 1-10 図）．また， DvFNS が赤紫色品

種並みに発現する‘結納’の花弁における small RNA（ Ohno ら，2011b）は，DvFNS

配列にほとんどマッピングされなかったのに対し，‘黒蝶’の smal l RNA は DvFNS

配列へマッピングされた（第 1-11 図）．これらの結果から，黒色系品種では DvFNS

の PTGS が生じていることが示唆され，そのために DvFNS の発現が抑制されてい

ると考えられた．また，‘黒蝶’赤紫色個体では DvFNS が赤紫色系品種と同程度

発現しており（第 1-8 図），siRNA のバンドが検出されなかったことから（第 1-10

図）， DvFNS の PTGS が何らかの理由で抑制されていると考えられた．

アントシアニン合成および輸送関連遺伝子の発現量は黒色系品種である程度高

かったが，アントシアニン総蓄積量に対して低い傾向にあり（第 1-9 図），黒色系

品種における比較的多いアントシアニン総蓄積量は DvIVS やその他のアントシア

ニン合成に関与する遺伝子の発現量のみでは説明できないと考えられた．トレニ

ア（ Torenia hybrida）では F3'H の過剰発現によりシアニジン系アントシアニンの

蓄積量が増加する（ Ueyama ら， 2002）．しかし，本実験で調査した DvF3'H の発

現量とシアニジン系アントシアニン蓄積量との間には弱い相関しかみられなかっ

た（ r = 0 .57）．また，DvF3'H 発現量とアントシアニン総蓄積量に対するシアニジ

ン系アントシアニン蓄積量の割合との間に相関はみられなかった（ r ＝ -0.18）．し

たがって，黒色系品種でのシアニジン系アントシアニンの高蓄積は，DvF3'H の発

現量により制御されているわけではないことが示唆された．

38

フラボノイド合成経路においてアントシアニン合成経路と分岐した先に合成さ

れる色素にはフラボン以外にも淡黄色色素のフラボノールがある．これまでに

FNS およびフラボノール合成酵素遺伝子（ Flavonol synthase： FLS）の発現を人工

的に抑制した研究結果がいくつか報告されているが，アントシアニン蓄積量への

影響は様々である．トルコギキョウでは FLS を発現抑制してもアントシアニン蓄

積 量 は 変 化 せ ず ， 中 間 産 物 で あ る ジ ヒ ド ロ フ ラ ボ ノ ー ル の 蓄 積 量 が 増 加 し た

（ Nielsen ら，2002）．タバコ（ Nicot iana tabacum）の FLS およびトレニアの FNSII

の発現抑制ではアントシアニン蓄積量が減少した（ Mahajan ら，2011；Ueyama ら，

2002）．一方で，ペチュニア（ Petunia hybrida）では FLS の発現抑制によりアント

シアニン蓄積量が増加した（ Davies ら，2003；Holton ら，1993）．ダリアの黒色系

品種におけるアントシアニン蓄積量はアントシアニン合成関連遺伝子の発現量の

みでは説明ができなかったことから，これらの品種では，ペチュニアでの FLS の

発現抑制のように， DvFNS が PTGS により発現抑制されることがアントシアニン

の増加，すなわち高蓄積につながっていると推測された．これにはフラボン ―ア

ントシアニン間の競合の消失が関与していると考えられ，またこの際，ペラルゴ

ニジン系アントシアニンよりもシアニジン系アントシアニンが優先的に蓄積増加

すると考えられた．DvFNS の発現量のピークはアントシアニン合成関連遺伝子の

ピークよりも早く，フラボンはアントシアニンよりも早い段階で合成・蓄積され

る（第 1-6 図）．‘黒蝶’赤紫色個体ではフラボン合成との分岐点以降のアントシ

アニン合成関連遺伝子の発現量が‘黒蝶’と比較して低く（第 1-9 図），このため

アントシアニンの蓄積量が減少していた可能性が考えられたが，これらの遺伝子

発現の低下はフラボンが合成されアントシアニン合成に回される基質量が減少し

たことで負のフィードバックが生じた結果である可能性も考えられた．

ダリアを含めた複数の植物種において CHS の PTGS が生じる際， smal l RNA は

CHS のエキソン 2 領域にマッピングされることが報告されている（ De Paoli ら，

2009； Kurauchi ら， 2009； Morita ら， 2012； Ohno ら， 2011b； Tuteja ら， 2009）

‘黒蝶’において，多くの small RNA が DvFNS のエキソン 2 領域にマッピングさ

れた（第 1-11 図）．また，DvFNS にマッピングされた small RNA の 40％を一種類

の 21 nt の small RNA が占めていたことについては，類似した現象がペチュニア

の PhCHS-A の共抑制でみられている（ De Paol i ら， 2009）．これらのことから，

ダリアの黒色系品種で生じる DvFNS の PTGS は様々な植物種で生じる CHS の

PTGS と共通した機構で誘導されている可能性が示唆された．内生的な PTGS は

ゲノム上の反復配列により生じると考えられており，ペチュニアの PhCHS-A では

縦列反復配列が（ Morita ら，2012），ダイズの CHS では逆位反復配列が PTGS 誘

導配列であることが報告されている（ Tuteja ら，2009）．ダリアにおいて，DvFNS

のエキソン 2 領域をプローブとするサザンブロット解析を行うと，黒色系品種と

39

赤 紫 色 系 品 種 で 異 な る 位 置 に バ ン ド が 検 出 さ れ る た め ， 黒 色 系 品 種 に お け る

DvFNS の PTGS は DvFNS 配列の上流あるいは下流に存在する特定のゲノム配列

により誘導されている可能性が考えられた．

黒色系品種におけるフラボノイド合成機構

本章で示唆されたダリアの黒色系品種に特異的なフラボノイド合成機構を赤紫

色系品種と比較して第 1-12 図に示した．赤紫色系品種では DvFNS が十分に発現

し，フラボンとアントシアニンの両方が花弁に蓄積する（第 1-12 図 a）．一方で，

黒色系品種では DvFNS が PTGS によって発現抑制され，フラボン合成が停止する

ため，フラボンを蓄積しない（第 1-12 図 b）．そのため，フラボン―アントシアニ

ン間の競合は生じず，アントシアニン，特にシアニジン系アントシアニンの蓄積

量が多くなる．シアニジン系アントシアニンはペラルゴニジン系アントシアニン

よりも花弁 L*を低下させる効果が高いと考えられ，その高蓄積が強く寄与するこ

とで花弁が黒色を示していると考えられた．また，‘黒蝶’赤紫色個体は，DvFNS

の PTGS が何らかの理由で機能しなくなった結果，フラボンが合成および蓄積さ

れ，アントシアニン蓄積量が減少したことにより，黒色ではなく赤紫色を示すよ

うになったと考えられた．

40

Fig. 1-12. The schematic view of f lavonoid synthesis and accumulat ion in purple and black dahl ia cul t ivars . (a) Purple; DvFNS i s expressed and both f lavones and anthocyanins are accumulated in petals . The rat io of cyanidin-based anthocyanins to total anthocyanins is relat ively low.(b) Black; The expression of DvFNS i s suppressed and then the competi t ion between f lavone and anthocyanin synthesis is abol ished, which increases anthocyanin accumulat ion, especia l ly, cyanidin-based anthocyanins. The rat io of cyanidin-based anthocyanins to total anthocyanins is re lat ively high. Because cyanidin-based anthocyanins wil l contr ibute much more to lowering petal L* than pelargonidin-based anthocyanins, the f lower color looks black.

Cy

Chalcone

Flavanone

Dihydroflavonol

Leucoanthocyanidin

Pelargonidin

CHI

F3H

DFR

ANS

CHS

ApigeninFNS

Cyanidin

Luteolin Lt

Anthocyanidins(Anthocyanins)

Flavones

(b) Black

(F3’H)

(F3’H)F3H

4-coumaroyl-CoA+ 3 ×malonyl-CoA

Pelargonidin

ANS

Cyanidin

Anthocyanidins(Anthocyanins)

(a) Purple

Chalcone

Flavanone

Dihydroflavonol

Leucoanthocyanidin

CHI

F3H

DFR

CHS

FNS(F3′ H)

(F3′ H)F3H

Apigenin

Luteolin Lt

Flavones

×

Pg

Lowering petal L*

PTGS

4-coumaroyl-CoA+ 3 ×malonyl-CoA

Cy

Pg

Ap Ap

41

第 2 章 ‘黒蝶’の花弁の赤紫色化を引き起こす原因の解析

第 1 章において，‘黒蝶’赤紫色個体は本来の黒色花をつける‘黒蝶’では発現

がほとんどみられない DvFNS を赤紫色品種と同程度発現しており，フラボンを蓄

積していた．そして，その結果として，アントシアニン，特にシアニジン系アン

トシアニンの蓄積量が減少したために花色が赤紫色になっていると考えられた．

また，‘黒蝶’赤紫色個体では DvFNS の s iRNA が検出されなかったことから，‘黒

蝶’において生じている DvFNS の PTGS が何らかの理由で生じなくなったこと

が，‘黒蝶’赤紫色個体での DvFNS の発現上昇およびそれに伴う赤紫色化の原因

であると考えられた．

‘黒蝶’赤紫色個体を京都大学附属京都農場で栽培すると，秋季から冬季の気

温の低い時期は花序全体が赤紫色を呈したが，夏季の気温の高い時期に花弁の一

部に黒色の筋が入るという現象が観察された（第 2-1 図）．‘黒蝶’の花弁の赤紫

色化は DvFNS の PTGS を抑制するようなゲノム突然変異が原因であると予想して

いたが，花序内でランダムに黒色部位が生じたことから，原因が突然変異ではな

い可能性が示唆された．花色変化はゲノムの突然変異の他にウイルス感染によっ

ても生じることが報告されており，この現象は color-breaking と呼ばれている．チ

ューリップ（ Tulipa gesneriana）では Potyvirus 属のチューリップブレーキングウ

イルス（ Tulip breaking virus）により color-breaking が生じる（ Dekker ら， 1993；

Lesnaw・ Ghabrial， 2000）．また，ラッパスイセン（ Narcissus pseudonarcissus）で

は Potexvirus 属のスイセンモザイクウイルス（ Narcissus mosaic vi rus）が，レッド

ス タ ー 型 の ペ チ ュ ニ ア で は Cucumovirus 属 の キ ュ ウ リ モ ザ イ ク ウ イ ル ス

（ Cucumber mosaic v irus： CMV）， Potyvirus 属のジャガイモ Y ウイルス（ Potato

virus Y）およびタバコエッチ病ウイルス（ Tobacco etch vi rus）が color-breaking を

起こすことが報告されている（ Hunter ら，2011；Teycheney・Tepfer，2001）．さら

に，高温は植物の RNA ウイルスに対する抵抗性を高めることが知られている

（ Chellappan ら，2005；Ghoshal・Sanfaçon，2014；Szit tya ら，2003）．そのため，

夏季に‘黒蝶’赤紫色個体の花色が一部黒色になる現象はウイルスへの抵抗性が

高まった結果として生じた可能性が考えられ，このことから‘黒蝶’の花弁の赤

紫色化にはウイルスが関与しているのではないかと推察した．

本章では，‘黒蝶’赤紫色個体が何らかのウイルスに感染している可能性を想定

し調査を行い，‘黒蝶’の花弁の赤紫色化を引き起こす原因を特定した．

42

Fig. 2-1. A f lower of ‘Kokucho’ (purple) showing par t ia l black color in summer. Arrows indicate black regions in purple petals .

43

第 1 節 ‘黒蝶’赤紫色個体からのウイルスの検出および除去

〈材料および方法〉

植物材料

‘黒蝶’赤紫色個体を発見した農場から‘黒蝶’の塊根 18 球の提供を受け，京

都大学附属京都農場の露地圃場に植え付け栽培した．本来の黒色花をつける 5 株

（ B1-B5），および赤紫色花をつける 5 株（ P1-P5）を選抜し，実験に供試した．

ウイルス・ウイロイド検定

ウイルスおよびウイロイドの検定は RT-PCR により行った．ダリアに感染する

ことが報告されている 5 種のウイルス［ CMV，ダリアモザイクウイルス（ Dahlia

mosaic virus： DMV），インパチェンスえそ斑紋ウイルス（ Impat iens necrot ic spot

virus： INSV），トマト黄化えそウイルス（ Tomato spot ted wil t virus：TSWV），タバ

コ条斑ウイルス（ Tobacco st reak vi rus： TSV）］および 2 種のウイロイド［キク矮

化ウイロイド（ Chrysanthemum stunt viroid：CSVd），ジャガイモやせいもウイロイ

ド（ Potato spindle tuber vi roid：PSTVd）］を検定対象とした．葉あるいは花弁から

全 RNA を抽出し，ウイルス・ウイロイド特異的 Reverse プライマー（第 2-1 表）

を用いて RT 反応を行った． KOD Dash（東洋紡）を用いて第 2-1 表に示したプラ

イマーセットで PCR を行い，バンドの有無により感染を判断した．ポジティブコ

ントロールとして CMV，DMV，TSV および TSWV の外被タンパク（ coat protein：

CP）をコードする遺伝子の全長あるいは部分配列， CSVd の全長配列を挿入した

プラスミドを使用した（ INSV および PTSVd はポジティブコントロールなし）．ネ

ガティブコントロールには水を用いた．

超微小茎頂分裂組織培養によるウイルスの除去

‘黒蝶’赤紫色個体（ P3， P4， P5）の頂芽を供試した．超微小茎頂分裂組織培

養（ Hosokawa ら，2004）を行い，再生したシュートを修正 MS 培地（ Murashige・

Skoog， 1962）に移植した．発根した 5 系統（ l ine 1-5）を圃場に移植し，栽培し

た．開花後，第 1 章第 1 節と同様の方法で花弁の L*a*b*を測定した．上記のウイ

ルス・ウイロイド検定を行い，各ウイルスおよびウイロイドの感染の有無を調査

した

生育調査

‘黒蝶’超微小茎頂分裂組織培養系統 l ine 4（赤紫色）および l ine 5（黒色）を

供試した．挿し木により各系統 9 株ずつ用意し， 2014 年の 7 月 11 日に 24 cm ポ

ットに植え，ガラスハウスで 2014 年 12 月 29 日まで栽培した．草丈，節数，第 1

44

花花序の直径，第 1 花開花時の最上位葉の色および塊根重を測定し，平均値を算

出した．草丈および節数は 8 月 11 日，9 月 11 日および 10 月 6 日に測定し，草丈

に関しては第 1 花開花時にも測定した．地上部が枯れた後の 12 月 29 日に塊根を

掘り上げ，重量を測定した．

〈結果〉

‘黒蝶’赤紫色個体からのウイルスの検出

‘黒蝶’全 18 株のうち 5 株が赤紫色花をつけ，残り 13 株は本来の黒色花をつ

けた．赤紫色花をつけた 5 株（‘黒蝶’赤紫色個体： P1-P5）と，生育が同程度で

黒色花をつけた 5 株（‘黒蝶’：B1-B5）をウイルス・ウイロイド検定に供試した．

RT-PCR でウイルス・ウイロイド配列を検出した結果，‘黒蝶’では TSV のバンド

は検出されなかった一方で，すべての‘黒蝶’赤紫色個体で TSV のバンドが検出

された（第 2-2 図）．CMV および DMV は‘黒蝶’および‘黒蝶’赤紫色個体のい

ずれにおいても複数個体からバンドが検出された． TSWV および CSVd のバンド

はいずれの個体からも検出されなかった．また， INSV および PTSVd はポジティ

ブコントロールが入手できなかったためウイルス・ウイロイド配列由来のバンド

の特定ができなかったが，いずれの個体からもプライマー位置から推定される長

さにバンドは検出されなかった（データ略）．

超微小茎頂分裂組織培養によるウイルスの除去および花色の回復

超微小茎頂分裂組織培養により，‘黒蝶’赤紫色個体 P5 から 1 系統（ l ine 1），

P4 から 2 系統（ l ine 2 および 3）， P3 から 2 系統（ l ine 4 および 5）の全 5 系統の

Table 2-1. Primer sets for virus and viroid detection.

Virus / Viroid Forward primer (5'-3') Reverse primer (5'-3')

TSV CCCATAATACCGTGAACACT CCTGTTACTCCATCAACCAT

CMV TATTACCCTAAAGCCACCAA GTTAGCTTGGACTCCAGATG

DMV AAAAAGAGGCTACCATACCC ACTTCCTGCTAGGACACTCA

TSWV GTCAGGGGACAATAACTG CTGCTTCTCACTGTTTCC

INSV AAATCAATAGTAGCATTAAA CTTCCTCAAGAATAGGCAAT

CSVd CAACTGAAGCTTCAACGCCTT AGGATTACTCCTGTCTCGCA

PSTVd TAAACTCGTGGTTCCTGTGG GCCCCGAAGCAAAGAAAGAT

TSV: Tobacco streak virus, CMV: Cucumber mosaic virus, DMV: Dahlia mosaic virus, TSWV:Tomato spotted wilt virus, INSV: Impatience necrotic spot virus, CSVd: Chrysanthemum stuntviroid, PSTVd: Potato spindle tuber viroid.

45

再生個体を獲得した．圃場で栽培し，開花後に花色を調査したところ，l ine 4 は親

個体と同様に赤紫色花を咲かせたのに対し，その他の 4 系統（ l ine 1-3, 5）は黒色

花を咲かせた（第 2-2 表）．ウイルス・ウイロイド検定の結果，l ine 4 からのみ TSV

のバンドが検出され，その他の系統からは検出されなかった（第 2-3 図）．親個体

（ P3-P5）ではいずれも TSV のバンドが検出されていたため（第 2-2 図）， l ine 4

以外の系統では超微小茎頂分裂組織培養により TSV が除去されており， l ine 4 で

は TSV が除去されず残留したものと考えられた．また， CMV のバンドはすべて

の系統から検出された（第 2-3 図）．親個体 P3 および P4 では CMV のバンドが検

出されていたが，P5 では検出されていなかったため，すべての超微小茎頂分裂組

織培養系統でバンドが検出されたのはウイルスの除去の失敗あるいは栽培中の再

感染のためであると考えられた．

TSV が検出された l ine 4 と TSV が検出されなかった l ine 5（いずれも P3 由来）

とで，草丈，節数，第 1 花花序の直径，塊根重および葉色に有意な差はみられな

かった（第 2-4 図，第 2-3 表）．

46

Fig. 2-2. Virus and viroid detect ion in ‘Kokucho’ (purple) and ‘Kokucho’ . The cDNA from the leaves of f ive ‘Kokucho’ (purple) p lants (P1–P5) and f ive ‘Kokucho’ plants (B1–B5) was used for PCR. Primers used to detect each vi rus or viroid are l is ted in Table 2-1 . Plasmids containing the sequence of each vi rus or viroid were used as posi t ive controls (PC) and water was used as a negat ive control (NC). TSV: Tobacco s t reak virus , CMV: Cucumber mosaic virus, DMV: Dahlia mosaic vi rus , TSWV: Tomato spot ted wil t virus, CSVd: Chrysanthemum stunt viroid .

47

Table 2-2. Petal color described with lightness (L *) and chroma (C *).

L * 14.8 ± 0.3 18.3 ± 6.1 15.3 15.0 15.0 18.4 14.8

C * 88.2 ± 0.8 117.3 ± 1.2 89.7 87.6 93.5 121.2 83.7

Flower color

'Kokucho''Kokucho'(purple)

Individuals regenerated by leaf primordia-free shoot apical meristem(LP-free SAM) culture from 'Kokucho' (purple)

Line 1 Line 2 Line 3 Line 4 Line 5

Black

Data of 'Kokucho' and 'Kokucho' (purple) represent the average value ± SE of five plants each (B1-B5, P1-P5). Data of LP-free SAM culturedlines represent the average of two biological replications of each line (1-5).

Black Purple Black Black Black Purple

48

Fig. 2-3 . Virus and viroid detect ion from five l ines regenerated from leaf-pr imordia-free shoot apical meris tem (LP-free SAM) cul tures of ‘Kokucho’ (purple) . Plasmids containing the sequence of each virus or viroid were used as posi t ive controls (PC) and water was used as a negat ive control (NC). TSV: Tobacco st reak virus , CMV: Ccumber mosaic virus , DMV: Dahlia mosaic virus , TSWV: Tomato spot ted wil t v irus, CSVd: Chrysanthemum stunt viroid.

49

Fig. 2-4. Comparison of growth parameters between TSV-infected ‘Kokucho’ l ine 4 (purple) and TSV-uninfected ‘Kokucho’ l ine 5 (black) . (a) plant height a t four t ime points , (b) node number per plant a t three t ime points , (c) d iameter of the f i rs t -opened inf lorescence, (d) weight of tuberous roots per p lant . All data represent the average ± SE (n = 9) . No signif icant di fferences (P > 0 .05) were detected for any parameter by t - tes t .

0

20

40

60

80

100

120

140

160

11 Aug. 11 Sep. 6 Oct. At the 1stflower

opening

Pla

nt h

eig

ht (

cm)

Measurement date

Line 4 (TSV-infected)Line 5 (TSV-uninfected)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

11 Aug. 11 Sep. 6 Oct.

No

de

num

be

r p

er

plan

t

Measurement date

Line 4 (TSV-infected)

Line 5 (TSV-uninfected)

0

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4

6

8

10

12

Line 4 Line 5

Dia

me

ter

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he

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d

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cm)

0

20

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120

Line 4 Line 5

Wei

gh

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tub

ero

us

roo

tsp

er

pla

nt (

g)

(a) (b)

(c) (d)

50

L* a* b* C*

Line 4 (TSV-infected) 43.32 ± 0.46 6.11 ± 0.28 13.69 ± 0.51 15.03 ± 0.45

Line 5 (TSV-uninfected) 44.49 ± 0.48 5.34 ± 0.46 15.48 ± 0.71 16.50 ± 0.51

Table 2-3. Leaf colors described with CIE L*a*b* coordinates.

n = 9. All values represent the average ± SE of three point in the uppermost leaf at 1st flower opening.No significant differences (P > 0.05) were observed for any parameter by t -test.

51

第 2 節 タバコ条斑ウイルス（ TSVd a h l i a）の塩基配列の調査

〈材料および方法〉

BLAST データベースに登録されている複数の TSV の配列を参照して，RNA2 お

よび RNA3 の 3’末端配列にあたる RT 用の Reverse プライマーを設計した（第 2-4

表）．また， RNA2 に存在する 2b タンパク質， RNA3 に存在する移行タンパク質

（ movement protein：MP）および CP をコードする遺伝子の全長配列を増幅するた

めのプライマーセットを設計した（第 2-4 表）．‘黒蝶’赤紫色個体の葉から抽出

した全 RNA を用いて RT を行い，PCR により 2b タンパク質，MP および CP をコ

ードする遺伝子を増幅した．増幅産物をもとにクローニングを行い，各タンパク

質に対し 8 クローンのシークエンス解析を行うことで各塩基配列を決定した．

〈結果〉

‘黒蝶’赤紫色個体から単離されたウイルスの配列は，登録されている TSV の

配列と高い相同性を示したが，完全に一致するものはデータベースに存在しなか

った．そのため，単離された TSV は新系統であると考えられ，以降は TSVd a h l i a と

表記する．TSVd a h l i a の 2b タンパク質（ LC030106），MP（ LC030107），CP（ LC030108）

をコードする遺伝子はそれぞれ 618，873，717 bp であり，タンパク質は 205，290，

238 のアミノ酸残基からなると推定された． TSVd a h l i a の 2b タンパク質， MP， CP

をコードする塩基配列は TSV st rain WC の配列（ U75538， X00435）（ Cornel issen

ら，1984；Scot t ら，1998）とそれぞれ 89%，88%，92%の相同性を示した．また，

Verbesina encel ioides から単離された TSV（ JX463338，JX463339）（ Sharman・Thomas，

2013）とは 91%，95%，96%，ダイズから単離された TSV（ FJ403376，FJ403377）

と は 89%， 92%， 90%， ペ ポ カ ボ チ ャ （ Cucurbi ta pepo） か ら 単 離 さ れ た TSV

（ KM504247， KM504248）（ Padmanabhan ら， 2014）とは 87%， 91%， 90%の相同

性を示した．さらに，TSVd a h l i a の CP をコードする塩基配列は Xanthium occidentale

から単離された配列（ JX463349）（ Sharman・Thomas，2013）およびソラマメ（ Vicia

faba）から単離された配列（ AM933669）と 98%の相同性を示した．

Name Orientation Sequense (5'-3')

TSV-RNA2 Full-R2 antisense GCATCTCCATTTGGAGGCTSV-RNA3-Full-R2 antisense GCATCTCCTATAAAGGAGGCATCAGTAGTSV-2b-F1 sense GTTTGTCGAAGAACCGCTSV-2b-R1 antisense AAAGCGGCATCTCTCTSV-CP-F1 sense GCGAAGGCGTCGTTGAGGTTTSV-CP-R1 antisense GATTTCGGGAATCCCCTCGACTSV-MP-F sense ATGGCGTTAGTACCAACGATGTSV-MP-R antisense TCAGGCTGAAAGCAGGTTCC

Table 2-4. Primers for sequence analysis of TSVdahlia.

52

第 3 節 TSVd a h l i a 感染による赤紫色化機構の調査

〈材料および方法〉

色素定量および DvFNS の発現定量

‘黒蝶’超微小茎頂分裂組織培養系統 l ine 4（ TSVd a h l i a 感染，赤紫色）および l ine

5（ TSVd a h l i a 非感染，黒色）を供試した．展開花弁 100 mg を液体窒素中で凍結粉

砕し，塩酸メタノール水溶液（ 5％塩酸， 50％メタノール） 1 mL を加えよく混合

し， 4℃で一晩放置した． 4℃， 20,600 ×g で 15 分間遠心分離した後，上清を回収

した．全量 1.2 mL の 50 倍希釈色素溶液を作成し， 95℃のウォーターバスで 2 時

間加熱した．C18 カラム（日本ウォーターズ）を装着した HPLC システム（ L-7100，

L-7200， L-7420， L-7500；日立製作所）に 20 µL を注入し，第 1 章第 2 節と同様

のプログラムで測定を行った．塩化ペラルゴニジン純品（ Sigma-Aldr ich），塩化シ

アニジン純品，アピゲニン純品およびルテオリン純品を使用し，塩酸メタノール

水溶液（ 5％塩酸， 50％メタノール）で 1/2 希釈系列を作り，検量線を作成した．

ペラルゴニジンおよびシアニジンの検量線はそれぞれの塩化物との分子量比から

換算して作成した．DvFNS の発現量は，第 1 章第 3 節と同様の方法でサンプルを

調製し， LightCycler® 480 System（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いた

Real- t ime RT-PCR により調査した．

smal l RNA の DvFNS ゲノム配列へのマッピング

‘黒蝶’ l ine 4（ TSVd a h l i a 感染，赤紫色）を供試した．S2 花弁 200 mg から Applied

Biosystems T M MirVana miRNA Isolat ion Ki t を用いて small RNA を抽出した．I l lumina

HiSeq システム（ I l lumina）を用いてシングルエンド法で配列を解析した．18-32 nt の smal l

RNA を‘黒蝶’の DvFNS ゲノム配列（AB769841）について，ミスマッチ 0 の条件でマッピン

グした．

〈結果〉

TSVd a h l i a の感染の有無による色素蓄積および DvFNS 発現量の違い

超微小茎頂分裂組織培養により TSVd a h l i a が除去されず赤紫色のままであった

l ine 4 ではフラボンが蓄積していたのに対し， TSVd a h l i a が除去され黒色に戻った

l ine 5 ではフラボンはほとんど蓄積していなかった（第 2-5 図 a）．また， l ine 4 で

は l ine 5 と比較してアントシアニン総蓄積量およびシアニジン系アントシアニン

蓄積量が少なかった． DvFNS 発現量は l ine 4 で l ine 5 の約 7 倍であった（第 2-5

図 b）．これらの違いは第 1 章の‘黒蝶’赤紫色個体と‘黒蝶’における違いと同

様であった．

53

‘黒蝶’ TSVd a h l i a 感染個体における small RNA の DvFNS へのマッピング

18-32 nt の small RNA 全 24,846,705 リードのうち， 2,126 リードが‘黒蝶’の

DvFNS ゲノム配列にマッピングされた（第 2-6 図）．このうち 1,779 リードが 21

nt であり，多くが DvFNS のエキソン 2 領域にマッピングされた．マッピングされ

た small RNA の長さやマッピング領域は第 1 章第 3 節における ‘黒蝶’（ TSVd a h l i a

非感染）のマッピング結果（第 1-11 図）と同様であったが，‘黒蝶’TSVd a h l i a 感染

個体ではマッピングされる量が著しく少なかった（第 2-6 図）．また，‘黒蝶’に

おいて最もマッピング量の多かった 21 nt のアンチセンス small RNA（ゲノム配列

2,307 番目－ 2,327 番目の塩基と一致）は，‘黒蝶’TSVd a h l i a 感染個体では全くマッ

ピングされなかった．

54

Fig.2-5 . Flavonoid aglycone contents (a) and relat ive t ranscr ip t abundance of DvFNS (b) in petals of ‘Kokucho’ l ine 4 (TSVd a h l i a - infected, purple) and l ine 5 (TSVd a h l i a -uninfected , black) , der ived from leaf-pr imordia-free shoot apical meris tem cul tures . Ap: apigenin, Lt : luteol in , Pg: pelargonidin, Cy: cyanidin. All data represent averages of two biological repl icat ions. The t ranscript abundance of DvFNS in l ine 4 i s re lat ive to that in l ine 5.

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

Line 4 Line 5

DvF

NS

/ DvA

ctin

LP-free SAM cultured line

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Line 4 Line 5

Co

nten

ts o

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vono

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glyc

ones

(mg·

100

mg-

1F

.W.)

LP-free SAM cultured line

(a) (b)ApLtPgCy

55

Fig.2-6 . Mapping of small RNAs of TSVd a h l i a - infected purple ‘Kokucho’ onto the DvFNS genomic sequence. Small RNAs (18–32 nt long) with no mismatches to ‘Kokucho’ DvFNS genomic DNA (AB769841) were mapped onto ei ther the sense s t rand (above the X-axis) or the ant isense s t rand (below the X-axis) . The numbers of matched reads were calculated per mi l l ion reads. The upper graph adapts the same scale of the Y-axis as Fig. 1-11. The graph below is expressed on a smaller scale of the Y-axis than upper graph.

-4

-2

0

0

2

4

6

-600

-500

-400

-300

-200

-100

0

0

100

200

Exon 1 Intron Exon 2

100 bp

Num

ber

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read

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8-32

nt)

Exon 1 Intron Exon 2

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Num

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illio

n re

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(18

-32

nt)

56

第 4 節 TSVd a h l i a の接種および花色変化の調査

〈材料および方法〉

In vi tro 接木による TSVd a l h i a の接種

‘黒蝶’の他に黒色系 3 品種（‘フィダルゴブラッキー’，‘ミズノアール’，‘ブ

ラックキャット’），黒白複色系 2 品種（‘上総白波’，‘影ぼうし’）および桃色系

1 品種（‘純愛’）を供試した．TSVd a h l i a に感染している‘黒蝶’ l ine 4 を台木とし

て， TSVd a h l i a に感染していないことを確認した各品種のシュートを無菌環境で接

木し，修正 MS 培地上で育成した．約 1 カ月後に接木個体の葉から抽出した RNA

を用いて RT-PCR により TSVd a h l i a の感染（穂木への移行）を確認した．感染が確

認できた 2 個体（‘影ぼうし’は 1 個体）を新しい修正 MS 培地に移植し，発根後

に圃場へと移植した．また，接木を行っていない非接木対照区，および TSVd a h l i a

非感染の‘黒蝶’ l ine 5 を台木として接木を行った接木対照区（‘影ぼうし’はな

し）を用意し，同様に圃場で栽培した．開花後に花弁から抽出した RNA を用いて

再び感染の確認を行った．

諸項目の測定

［花色］第 1 章第 1 節と同様の方法で行った．黒白複色系品種は着色している花

弁基部で行った．

［色素蓄積量］第 3 節と同様の方法で行った．黒白複色系品種は花弁基部のみを

切り離して供試した．

［遺伝子発現量］第 1 章第 3 節と同様の方法でサンプルを調製し， LightCycler®

480 System を用いて DvFNS，DvIVS，DvCHS1，DvCHS2，DvCHI，DvF3H，DvDFR，

DvANS および DvF3'H の発現量を Real- t ime RT-PCR により調査した．黒白複色系

品 種 は 花弁 先 端 部お よ び 花弁 基 部 に分 け て RNA を 抽 出 し た ． DvActin お よ び

DvF3'H については第 2-5 表に示したプライマーを使用した．

Table 2-5. Sequence of primers for real-time RT-PCR.

Gene Forward primer (5'-3') Reverse primer (5'-3')

DvActin GCTGACAGGATGAGCAAG TCCACATCTGTTGGAAGGDvF3'H CATAACTGCCTTACTATTGTAC GTAGTTATACGCAATATGCTC

57

DvFNS および DvCHS の siRNA の検出［ノーザンブロット解析］

第 1 章第 3 節と同様の方法でノーザンブロット解析を行い， DvFNS および

DvCHS の siRNA を検出した． DvCHS の PTGS が確認されている赤白複色系‘結

納’（ Ohno ら，2011b）の S2 花弁から抽出した全 RNA を DvCHS の s iRNA 検出の

ポジティブコントロールとして用いた．DvFNS の siRNA 検出用のプローブ作成に

は DvFNS エキソン 2 領域を挿入したプラスミド DNA を，DvCHS の siRNA 検出用

のプローブ作成には DvCHS2 の全長を挿入したプラスミド DNA を使用した．

〈結果〉

供試したすべての品種で in v i tro 接木による TSVd a h l i a の接種に成功した．穂木

へと移行した TSVd a h l i a は花弁からも検出された（第 2-7 図）．

黒色系品種および黒白複色系品種の TSVd a h l i a 感染個体は，それぞれの TSVd a h l i a

非感染個体（非接木対照区および接木対照区）とは見た目に異なる色の花を咲か

せた（第 2-8 図）．ほとんどの品種の TSVd a h l i a 感染個体の花色は赤紫色であり，

‘フィダルゴブラッキー’の TSVd a h l i a 感染個体の花色のみが， TSVd a h l i a 非感染個

体よりわずかに青味がかかっていたものの，なおも黒色といえる色であった．黒

色系品種および黒白複色系品種の接木対照区は非接木対照区とほぼ同様の花弁

L*， a*， b*お よ び C*を 示 し た の に 対 し ， TSVd a h l i a 感 染 個 体 は こ れ ら の 対 照 区

（ TSVd a h l i a 非感染個体）よりも花弁 L*が高く，‘影ぼうし’を除いて花弁 C*も高

かった（第 2-6 表，第 2-9 図）．TSVd a h l i a の感染による花弁 L*の上昇は‘フィダル

ゴブラッキー’で最も小さかった．また，桃色系‘純愛’の TSVd a h l i a 感染個体の

花色は TSVd a h l i a 非感染個体と変わらなかった（第 2-8 図，第 2-9 図，第 2-6 表）．

黒色系品種および黒白複色系品種の TSVd a h l i a 感染個体の花弁にはフラボンが蓄

積しており， TSVd a h l i a 非感染個体と比較してアントシアニン総蓄積量が少なかっ

た（第 2-10 図）．また，これらの品種では TSVd a h l i a の感染によりシアニジン系ア

ントシアニンの蓄積量が大きく減少していた．一方で，‘純愛’では TSVd a h l i a 感染

による色素蓄積量の変化はみられなかった．

黒色系品種および黒白複色系品種の TSVd a h l i a 感染個体では DvFNS の発現量が

TSVd a h l i a 非感染個体と比較して著しく高く， 7-100 倍の値を示した（第 2-11 図）．

アントシアニン合成関連遺伝子 DvIVS，DvCHS1，DvCHS2，DvCHI，DvF3H，DvDFR，

DvANS およびシアニジン合成に関与する DvF3'H については，黒色系品種の花弁

および黒白複色系品種の花弁基部において TSVd a h l i a の感染により共通した発現量

の変化はみられなかった（第 2-12 図）．また，‘純愛’では DvFNS を含め，いず

れの遺伝子でも TSVd a h l i a の感染による発現量の変化はみられなかった（第 2-11 図，

第 2-12 図）．

黒色系品種および黒白複色系品種の TSVd a h l i a 非感染個体では DvFNS の siRNA

58

が検出されたのに対し， TSVd a h l i a 感染個体では検出されなかった（第 2-13 図）．

‘純愛’では TSVd a h l i a 非感染個体および TSVd a h l i a 感染個体のいずれにおいても

DvFNS の s iRNA は検出されなかった．

黒白複色系‘上総白波’および‘影ぼうし’は TSVd a h l i a 感染により花弁の先端

に白色部が形成されなくなり，全体が赤紫色となった（第 2-8 図）．赤紫色に着色

した花弁先端部の色素蓄積は花弁基部での色素蓄積（第 2-10 図）と同様であった

（データ略）．花弁先端の白色部形成は DvCHS1 および DvCHS2 の PTGS により生

じることが報告されている（ Ohno ら， 2011b）．‘上総白波’および‘影ぼうし’

の TSVd a h l i a 感 染 個 体 に お い て ， 本 来 白 色 と な る は ず で あ っ た 花 弁 先 端 部 で は

TSVd a h l i a 非感染個体と比較して DvCHS2 の発現量が高かった（第 2-12 図）．また，

‘影ぼうし’では DvCHS1 についても同様の傾向がみられた．さらに，‘上総白波’

および‘影ぼうし’の TSVd a h l i a 非感染個体からは‘結納’と同様に DvCHS の siRNA

が検出されたのに対し， TSVd a h l i a 感染個体では検出されなかった（第 2-13 図）．

59

Fig.2-7 . Detect ion of TSVd a h l i a in in v i tro graf ted plants . cDNA from half-colored, unexpanded petals f rom each plant was used. UC: ungraf ted contro ls , GC: graf ted controls (plants graf ted onto TSVd a h l i a -uninfected ‘Kokucho’ l ine 5) , TSV1 and TSV2: plants graf ted onto TSVd a h l i a - infected ‘Kokucho’ l ine 4 independent ly. Plasmid containing the ful l sequence of TSV CP was used as a posi t ive control (PC) and water was used as a negat ive control (NC).

60

Fig

.2-8

. F

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61

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1

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± 0.

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± 0.

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± 0.

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± 0.

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± 3

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106.

49 ±

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2.17

± 0

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124.

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y’15

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± 0.

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± 0.

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± 0.

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± 0.

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.17

± 1.

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.87

± 1.

4011

3.52

± 3

.98

114.

21 ±

1.5

7‘M

s. N

oir’

15.3

5 ±

0.60

15.8

8 ±

0.67

20.3

2 ±

0.92

21.1

0 ±

0.38

105.

77 ±

3.0

910

2.08

± 3

.26

120.

53 ±

1.5

512

9.73

± 0

.71

‘Bla

ck C

at’

16.4

5 ±

0.44

18.8

6 ±

1.17

20.7

4 ±

0.49

24.3

8 ±

1.51

113.

64 ±

1.7

011

3.78

± 1

.58

122.

38 ±

0.6

711

8.92

± 4

.35

‘Kaz

usa-

shira

nam

i’17

.40

± 0.

0416

.27

± 0.

1621

.31

± 0.

6120

.07

± 0.

2311

4.69

± 1

.29

111.

43 ±

1.0

112

1.08

± 2

.04

121.

16 ±

2.8

3‘K

ageb

oush

i’19

.73

± 0.

91

－32

.38

± 1.

13

－11

7.49

± 1

.49

－

94.9

4 ±

1.05

－

‘Jyu

nn-a

i’65

.34

± 1.

3464

.22

± 1.

8664

.53

± 1.

8962

.22

± 4.

0143

.00

± 1.

8248

.35

± 3.

8844

.50

± 4.

5652

.31

± 6.

53

Ung

raft

ged

cont

rol

G

raft

ed c

ontr

ol

TSV

dah

lia-

infe

cted

1

TSV

dah

lia-

infe

cted

2U

ngra

ftge

d co

ntro

l

Gra

fted

con

trol

T

SVd

ahli

a-in

fect

ed 1

T

SVd

ahli

a-in

fect

ed 2

‘Kok

ucho

’6.

35 ±

0.5

35.

39 ±

0.0

89.

23 ±

2.0

312

.06

± 1.

2610

7.32

± 3

.23

106.

63 ±

1.5

312

2.57

± 0

.73

125.

44 ±

4.1

8‘F

idal

go B

lack

y’3.

95 ±

0.4

04.

61 ±

0.3

52.

86 ±

0.2

52.

43 ±

1.2

892

.26

± 1.

6599

.98

± 1.

4211

3.55

± 3

.97

114.

26 ±

1.5

4‘M

s. N

oir’

5.28

± 0

.43

6.11

± 0

.19

11.0

2 ±

0.39

12.8

5 ±

1.08

105.

90 ±

3.1

010

2.26

± 3

.24

121.

03 ±

1.5

613

0.38

± 0

.72

‘Bla

ck C

at’

7.55

± 0

.71

10.3

6 ±

0.89

10.8

1 ±

0.68

12.8

8 ±

2.12

113.

89 ±

1.7

511

4.26

± 1

.55

122.

86 ±

0.6

211

9.69

± 4

.13

‘Kaz

usa-

shira

nam

i’8.

52 ±

0.8

07.

79 ±

0.3

911

.94

± 1.

929.

34 ±

1.1

511

5.01

± 1

.34

111.

70 ±

1.0

412

1.72

± 1

.99

121.

54 ±

2.8

5‘K

ageb

oush

i’11

.38

± 1.

59

－22

.54

± 1.

06

－11

8.07

± 1

.56

－

97.5

9 ±

1.27

－

‘Jyu

nn-a

i’-1

3.01

± 0

.66

-12.

41 ±

0.7

0-1

2.83

± 0

.15

-12.

53 ±

0.7

844

.96

± 1.

5549

.93

± 3.

8646

.36

± 4.

4253

.82

± 6.

50

All

data

rep

rese

nt th

e av

erag

e ±

SE o

f th

ree

inde

pend

ent f

low

ers.

C*

= (

a*2 ＋

b*2 )1/

2 .

Cut

ivar

a*

b*C

*

Tab

le 2

-6.

Pet

al c

olor

des

crib

ed w

ith C

IE L

*a*b

* c

oord

inat

es.

Cut

ivar

L*

62

Fig.2-9 . Distr ibut ions of L* ( l ightness) and C* (chroma) values of TSVd a h l i a -uninfected (ungraf ted control and graf ted control) p lants and TSVd a h l i a - infected plants . (a) ‘Kokucho’, (b) ‘Fidalgo Blacky’, (c) ‘Ms. Noir ’ , (d ) ‘Black Cat’ , (e) ‘Kazusa-shiranami’ , ( f ) ‘Kageboushi’ and (g) ‘Jyunn-ai’ . Each data point represents the average of 27 total values: 3 locat ions × 3 peta ls × 3 independent inf lorescences. Bars represent SE. The raw data are shown in Table 2-6.

0

10

20

30

105 115 125 135

L*

C*

‘Black Cat’

Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected

0

10

20

30

90 100 110 120

L*

C*

‘Fidalgo Blacky’

Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected

50

60

70

80

30 40 50 60

L*

C*

‘Jyunn-ai’

Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected

0

10

20

30

100 110 120 130

L*

C*

‘Kokucho’

Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected

0

10

20

30

100 110 120 130

L*

C*

‘Ms. Noir’

Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected

10

20

30

40

95 105 115 125

L*

C*

‘Kageboushi’

Ungrafted controlTSVdahlia-infected

0

10

20

30

100 110 120 130

L*

C*

‘Kazusa-shiranami’

Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

(g)

63

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Contents of flavonoid aglycones（mg·100 mg-1F. W.）

Ap

Lt Pg

Cy

'Ko

kuch

o'

'Fid

alg

oB

lack

y'

'M

s. N

oir'

'B

lack

Ca

t'

'K

azu

sa-s

hira

nam

i'

'K

age

bo

ush

i'

'J

yun

n-a

i'

Fig

.2-1

0.

Fla

vo

no

id a

gly

con

e co

nte

nts

of

pet

als

of

TS

Vd

ah

lia-u

nin

fect

ed (

un

gra

fted

co

ntr

ol

and

gra

fted

co

ntr

ol)

pla

nts

an

d

TS

Vd

ah

lia-i

nfe

cted

pla

nts

.

Ap

: ap

igen

in,

Lt:

lu

teo

lin

, P

g:

pel

arg

on

idin

, C

y:

cyan

idin

. D

ata

rep

rese

nt

the

aver

age

± S

E o

f ea

ch f

lav

on

oid

(th

ree

infl

ore

scen

ces;

th

e v

alu

es f

or

‘Ms.

No

ir’

gra

ft c

on

tro

l an

d ‘

Jyu

nn

-ai’

un

gra

fted

co

ntr

ol

rep

rese

nt

the

aver

age

of

two

in

flo

resc

ence

s ea

ch).

Alt

ho

ug

h v

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es a

re p

rese

nte

d a

s m

asse

s (m

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th

e sa

me

tren

ds

app

ly t

o m

ola

r m

asse

s b

ecau

se t

he

mo

lecu

lar

wei

gh

ts o

f p

elar

go

nid

in,

cyan

idin

, ap

igen

in,

and

lu

teo

lin

are

27

1,

28

7,

27

0,

and

28

6 g

mo

l-1,

resp

ecti

vel

y a

nd

n

earl

y e

qu

al.

64

Fig.2-11. Relat ive t ranscr ipt abundance of DvFNS in the petals of TSVd a h l i a -uninfected (ungraf ted control and graf ted control) plants and TSVd a h l i a - infected plants . RNA was extracted f rom hal f-colored, unexpanded petals . Data represent the averages ± SE of three biological repl ica t ions ( the values for ‘Kazusa-shiranami’ ungraf ted control , TSVd a h l i a - infected 1, 2 , ‘Jyunn-ai’ ungraf ted control and graf ted control represent the average of two biological repl icat ions) . DvActin was used as the internal standard.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

DvF

NS

/ D

vAct

in

DvFNS Ungrafted control

Grafted control

TSVdahlia-infected 1

TSVdahlia-infected 2

65

Fig.2-12. Relat ive t ranscr ipt abundance of the genes involved in anthocyanin synthesis in petals of TSVd a h l i a -uninfected (ungraf ted control and graf ted control) plants and TSVd a h l i a - infected plants . (a) DvIVS , (b) DvCHS1 , (c) DvCHS2 , (d) DvCHI , (e) DvF3H , ( f ) DvDFR , (g) DvANS , and (h) DvF3'H . Petal bases of ‘Kazusa-shiranami’ and ‘Kageboushi’ corresponded to the colored par ts of TSVd a h l i a -uninfected petals and the t ips corresponded to the uncolored parts . All data represent the average of two or three biological repl icat ions, excluding some abnormal scores . Standard error bars are appl ied to the data with three b iological repl ica t ions. DvActin was used as the internal s tandard.

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

DvI

VS

/D

vAct

in

DvIVS Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected 1TSVdahlia-iinfected 2

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

DvC

HS

1 /

DvA

ctin

DvCHS1Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected 1TSVdahlia-iinfected 2

0.0

4.0

8.0

12.0

16.0

20.0

24.0

28.0

DvC

HS

2/ D

vAct

in

DvCHS2 Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected 1TSVdahlia-iinfected 2

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

DvC

HI

/ DvA

ctin

DvCHI Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected 1TSVdahlia-iinfected 2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

DvD

FR

/ DvA

ctin

DvDFR Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected 1TSVdahlia-iinfected 2

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

DvA

NS

/ DvA

ctin

DvANSUngrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected 1TSVdahlia-iinfected 2

0.00.20.40.60.81.01.21.41.6

DvF

3H

/D

vAct

in

DvF3H Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected 1TSVdahlia-iinfected 2

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g)

0.000.020.040.060.080.100.120.14

DvF

3'H

/D

vAct

in

DvF3'H Ungrafted controlGrafted controlTSVdahlia-infected 1TSVdahlia-iinfected 2

(h)

66

Fig.2-13. RNA gel blot hybridizat ion for DvFNS s iRNA and DvCHS s iRNA detect ion.U: TSVd a h l i a -uninfected plant , I : TSVd a h l i a - infected plant . Ribosomal RNA on the electrophoresis gel is shown in the lower photograph.

67

第 5 節 考察

花色変化は TSVd a h l i a が花弁での PTGS を抑制することで生じる

ダリアに感染例のあるウイルスおよびウイロイドについて検定を行った結果，

本来の黒色花をつける‘黒蝶’からは TSVd a h l i a が検出されなかった一方で，‘黒

蝶’赤紫色個体ではすべての個体で TSVd a h l i a が検出され，感染が確認された（第

2-2 図）．また，超微小茎頂分裂組織培養により‘黒蝶’赤紫色個体からウイルス

の除去を試みた結果，TSVd a h l i a が残留した培養系統（ l ine 4）の花色は赤紫色のま

まであったのに対し， TSVd a h l i a が除去された 4 系統（ l ine 1-3, 5）は花色が黒色に

戻った（第 2-2 表，第 2-3 図）．本実験で検定したウイルスおよびウイロイドにお

いて感染の有無と花色の傾向が一致するものは TSVd a h l i a 以外にはなく，これらの

ことから，‘黒蝶’の赤紫色化は TSVd a h l i a の感染により生じていることが考えら

れた．未同定のウイルスが関与している可能性は排除しきれないが，超微小茎頂

分裂組織培養により TSVd a h l i a と未同定のウイルスが全く同様に残留あるいは除去

される確率は低いと考えられ，培養系統 5 系統において TSVd a h l i a 感染と花色の傾

向が完全に一致したことは TSVd a h l i a の感染が花弁の赤紫色化の原因であることを

強く示唆している．また，TSVd a h l i a の感染は植物体の生育へは影響を及ぼさず（第

2-4 図，第 2-3 表），花色へのみ影響を及ぼすことが示唆された．

TSVd a h l i a に感染している‘黒蝶’l ine 4 は花弁にフラボンを蓄積しており，非感

染の‘黒蝶’l ine 5 と比較してアントシアニン蓄積量，特にシアニジン系アントシ

アニン蓄積量が少なかった（第 2-5 図 a）．また， DvFNS の発現量は‘黒蝶’ l ine

4 で‘黒蝶’ l ine 5 よりも高かった（第 2-5 図 b）．よって，第 1 章で示唆されたよ

うに，DvFNS 発現量の上昇およびそれに伴う色素蓄積の変化が‘黒蝶’の赤紫色

化の原因であると考えられ，これには TSVd a h l i a の感染が関与していることが示唆

された．TSVd a h l i a 感染による色素蓄積および DvFNS 発現量の変化は‘黒蝶’以外

の黒色系品種および黒白複色系品種でもみられた（第 2-10 図，第 2-11 図）．第 1

章において黒色系品種での低い DvFNS 発現は PTGS に起因することが示唆されて

いる．‘黒蝶’ TSVd a h l i a 感染個体において DvFNS ゲノム配列にマッピングされた

smal l RNA 量（第 2-6 図）は，TSVd a h l i a 非感染の‘黒蝶’においてマッピングされ

た量（第 1-12 図）と比較して著しく少なかったことから，‘黒蝶’ TSVd a h l i a 感染

個体では DvFNS の PTGS が抑制されていることが示唆された．さらに，黒色系品

種および黒白複色系品種において，TSVd a h l i a 非感染個体では検出された DvFNS の

siRNA が TSVd a h l i a 感染個体では検出されなかったことから（第 2-13 図），これら

の品種において TSVd a h l i a が DvFNS の PTGS を抑制したことが示唆された．

ペチュニアおよびダイズではウイルスが CHS の PTGS を抑制することで花色パ

ターンや種皮色が変化することが報告されている（ Koseki ら，2005；Teycheney・

68

Tepfer 2001； Senda ら， 2004）．ダリアの複色系品種の白色部形成は DvCHS1 およ

び DvCHS2 の PTGS により生じる（ Ohno ら，2011b）．黒白複色系品種‘上総白波’

および‘影ぼうし’に TSVd a h l i a を感染させると，花弁基部が黒色から赤紫色に変

化しただけでなく，花弁先端部も白色から赤紫色へと変化し，赤紫色の単色花に

なった（第 2-8 図）．これらの TSVd a h l i a 感染個体では花弁先端部での DvCHS1 およ

び DvCHS2 の発現が高くなっており（第 2-12 図），さらに DvCHS の siRNA が検

出されなくなっていた（第 2-13 図）．これらの結果から，‘上総白波’および‘影

ぼうし’では花弁先端部で生じる DvCHS の PTGS が TSVd a h l i a により抑制された

ために白色部が形成されなくなったと考えられた．また，DvFNS および DvCHS の

いずれの PTGS も生じていない桃色系‘純愛’では， TSVd a h l i a の感染により遺伝

子発現量および色素蓄積量が変化することはなく，花色変化は生じなかった（第

2-8 図，第 2-9 図，第 2-10 図，第 2-11 図，第 2-12 図，第 2-13 図）．以上のことか

ら， TSVd a h l i a は PTGS を抑制する能力を有することが示唆され，黒色系ダリアお

よび複色系ダリアの花弁では感染により DvFNS や DvCHS の PTGS が抑制される

ことで色素蓄積が変化し，赤紫色化や単色化といった花色変化が生じると考えら

れた．

植物ウイルスには，自身の RNA が宿主にサイレンシングされることを防ぐた

めにサイレンシングサプレッサーを有するものがある（ Burgyán・Havelda，2011；

Li・Ding，2001； 2006；Roth ら，2004）．二本鎖 RNA ウイルスである TSV におけ

るサイレンシングサプレッサーの報告はないが，TSV と同じ I larvirus 属のアスパ

ラガスウイルス 2（ Asparagus-virus 2： AV-2）では 2b タンパク質がサイレンシン

グサプレッサーとして機能することが知られている（ Shimura ら，2013）．TSVd a h l i a

の 2b タンパク質（ LC030106）と AV-2 の 2b タンパク質（ AB745630）との塩基配

列の相同性は 41％ではあったものの， TSVd a h l i a においても 2b タンパク質がサイ

レンシングサプレッサーとして機能する可能性が考えられた．

CMV の 2b タンパク質もサイレンシングサプレッサーであると報告されている

が（ Brignet i ら，1998），‘黒蝶’において CMV 感染と花色の傾向は一致していな

かった（第 2-2 図，第 2-3 図）．また，TSWV の NSs タンパク質もサイレンシング

サプレッサーであると報告されている（ Takeda ら，2002）．しかし，TSWV は黒色

系品種や複色系品種に感染しても花色変化を引き起こさないことが観察されてい

る．CMV あるいは TSWV の感染個体において，葉ではウイルスが検出されるが，

花弁からは検出されないことから（データ略），これらのウイルスは花弁に侵入で

きないため，花色に関与する PTGS を抑制することができないのではないかと考

えられた．一方で，TSVd a h l i a は花弁からでも高感度で検出できた（第 2-7 図）．ま

た，TSV は種子伝染率が高く［ダイズ 2.6%–30.6%（ Ghanekar・Schwenk，1974），

ゴ マ ギ ク （ Parthenium hysterophorus） 6.8%–48%（ Sharman ら ， 2009）， イ チ ゴ

69

（ Fragaria ×ananassa）0%–35%（ Johnson ら，1984）］，茎頂培養および超微小茎頂

分裂組織培養での除去率が低いことからも（ Hosokawa，2008；仲ら，2007），花弁

を含む生殖器官にまで広く侵入することが示唆されている．それゆえ， TSVd a h l i a

は他のウイルスとは異なり，花弁での内生 PTGS を抑制することができ，花色変

化を引き起こすのではないかと考えられた．

花弁黒色化へのシアニジン系アントシアニンの役割および高蓄積のための二つの

機構

TSVd a h l i a の感染により，黒色系品種および黒白複色系品種の花弁 L*および C*

は高くなり，‘フィダルゴブラッキー’以外の品種で赤紫色化が生じた（第 2-8 図，

第 2-9 図，第 2-6 表）．赤紫色化は‘黒蝶’と同様の機構，すなわち TSVd a h l i a 感染

によるフラボン蓄積量の増加，およびアントシアニン，特にシアニジン系アント

シアニン蓄積量の減少によるものであった（第 2-10 図）．TSVd a h l i a の感染により，

アントシアニン合成関連遺伝子の発現量に一定の変化はみられなかったため（第

2-12 図），フラボンおよびアントシアニンの蓄積量の変化はいずれも DvFNS の

PTGS の抑制が原因であることが示唆された．よって，TSVd a h l i a の感染により赤紫

色化が生じた品種においては， DvFNS の PTGS が花弁の黒色化に必要な機構であ

ることが示された．

供試した黒色系品種のなかで最も黒味が強い‘フィダルゴブラッキー’は，

TSVd a h l i a の感染により他の黒色系品種と同様に色素蓄積が変化したにもかかわら

ず，花色の変化はわずかであり，なおも黒色といえる色を示した（第 2-8 図，第

2-9 図，第 2-10 図，第 2-6 表）．この結果から以下の二つのことが示された．一つ

目は，フラボンを蓄積していても花弁は黒色になり得るということである．フラ

ボンは無色に近い淡黄色の色素であり，また，アントシアニンとコピグメンテー

ションを生じる．実際に，‘フィダルゴブラッキー’の TSVd a h l i a 感染個体の花弁，

特に背軸面（データ略）は青味が強くなっており，コピグメンテーションが生じ

ていると考えられた．しかし，花色は黒色といえる色であったことから，フラボ

ンそのものの色およびフラボン―アントシアニン間のコピグメンテーション効果

は花弁の黒色化を阻むものではなく，フラボンを蓄積しないこと自体が黒色化に

関与しているわけではないことが示された．

二つ目は，DvFNS の発現抑制によるアントシアニン，シアニジン系アントシア

ニンの蓄積増加が生じなくても花弁は黒色になり得るということである．‘フィ

ダルゴブラッキー’では TSVd a h l i a の感染により他の品種と同様に DvFNS の PTGS

が抑制され，アントシアニン蓄積量が減少した．しかし，花色は黒色であったこ

とから，DvFNS の発現抑制およびそれに伴うアントシアニンの蓄積増加は花弁の

黒色化に必ずしも必要な機構ではないことが示された．‘フィダルゴブラッキー’

70

の TSVd a h l i a 感染個体でのアントシアニン総蓄積量は他の黒色系品種の TSVd a h l i a 感

染個体とほぼ同等であったが，花弁 L*は著しく低い値を示した（第 2-6 表，第 2-

9 図，第 2-10 図）．これらの TSVd a h l i a 感染個体の品種間での色素蓄積における違

いはペラルゴニジン系アントシアニンとシアニジン系アントシアニンの比率のみ

であり，‘フィダルゴブラッキー’はシアニジン系アントシアニンの割合が他の黒

色系品種と比較して著しく高かった（第 2-10 図）．第 1 章において，シアニジン

系アントシアニンはペラルゴニジン系アントシアニンよりも花弁 L*を下げる効

果が高いことが示唆されている．よって，‘フィダルゴブラッキー’は TSVd a h l i a に

感染し DvFNS の PTGS が抑制されても，なお花弁 L*を低く保つのに十分量のシ

アニジン系アントシアニンを蓄積していたために，赤紫色化することなく黒色を

保ったと考えられた．したがって， DvFNS の PTGS が生じなくても，シアニジン

系アントシアニンを高蓄積することができれば花弁は黒色になることが示唆され

た．また，‘フィダルゴブラッキー’の TSVd a h l i a 感染個体は花弁 C*も他品種の感

染個体と比較して著しく低い値を示した．そのため，シアニジン系アントシアニ

ンは花弁 C*を下げる効果もペラルゴニジン系アントシアニンより高いと考えら

れた．

以上のことから，シアニジン系アントシアニンの高蓄積がダリア花弁の黒色化

に最も強く寄与する因子であることが示唆された．また，この高蓄積は二つの独

立した機構により誘導されることが考えられた（第 2-14 図）．一つは DvFNS の

PTGS であり，もう一つは‘フィダルゴブラッキー’でみられるような高いシアニ

ジン合成能である．

後者に関して，‘フィダルゴブラッキー’はペラルゴニジン系アントシアニンを

ほとんど蓄積していないことから（第 2-10 図），ペラルゴニジンを合成できない

あるいは合成しにくいためにシアニジンが優先的に合成されている可能性が考え

られた．ペチュニアおよびシンビジウム（ Cymbidium hybrida）の DFR はペラルゴ

ニジンの基質であるジヒドロケンフェロールの触媒効率が低いため，ペラルゴニ

ジンをほとんど合成することができない（ Forkmann・Ruhnau，1987；Johnson ら，

1999）．ガーベラ（ Gerbera hybrida）の DFR も in v ivo において強い基質特異性を

示し，シアニジン合成特異的にはたらくアレルがみつかっている（ Bashandy ら，

2015）．また，ペチュニアの DFR における基質特異性は 1 アミノ酸残基の違いに

よって制御されることが示唆されている（ Johnson ら，2001）．ダリアの DvDFR は

複数アレルがみつかっており，‘フィダルゴブラッキー’ではアミノ酸の違いを伴

うある一塩基多型において一種類のアレルしか発現していないことが確認されて

いる．よって，この一塩基多型が DvDFR の基質特異性を制御し，シアニジンを優

先的に合成させることで，シアニジン系アントシアニンの高蓄積を誘導している

可能性が考えられた．

71

上記二つの機構が成立するには元来のアントシアニン合成能が高いことも必要

である．これは DvFNS の PTGS が生じていてもアントシアニン合成能が低いため

に桃色にしかならない実生系統（データ略）や，シアニジン系アントシアニンの

割合が高くても総アントシアニン蓄積量が少ないために赤紫色を示す‘キューピ

ット’（第 1 章参照）の存在から示唆される．ダリアのアントシアニン合成を制御

する DvIVS のプロモーターには，高発現型，すなわちアントシアニン高蓄積型の

Type 1 プロモーターがみつかっている（ Ohno ら， 2013）．黒色系品種および黒白

複色系品種はすべて DvIVS Type 1 プロモーター有していたことから（データ略），

DvIVS Type 1 プロモーターを有することは二つの機構によりシアニジン系アント

シアニンの高蓄積が誘導されるのに必要な条件であると考えられた．また，‘フィ

ダルゴブラッキー’が黒色系品種の中で最も黒味の強い色を示すのは，多くの黒

色系品種が DvFNS の PTGS による一つ目の機構のみで黒色を示しているのに対

し，二つの機構が併存することでシアニジン系アントシアニンが最も多く蓄積し

ているからだと考えられた．したがって，シアニジン系アントシアニンの高蓄積

を誘導する二つの機構は単独で機能する場合も花弁は黒色を示し得るが，同時に

機能する場合にはさらにシアニジン系アントシアニン蓄積量が多くなり，花弁は

より黒味が強い黒色になると考えられた（第 2-14 図）．

72

Fig.2-14. A model for black f lower color ing in dahl ia . There are two mechanisms resul t ing in high accumulat ion of cyanidin-based anthocyanins, a DvFNS PTGS-dependent mechanism ( lef t s ide) and a DvFNS PTGS-independent mechanism (r ight s ide) . When DvFNS PTGS occurs in petals , the resul t ing reduct ion in f lavone synthesis induces high accumulat ion of cyanidin-based anthocyanins and total anthocyanins, because of the absence of competi t ion between f lavone and anthocyanin synthesis . High accumulat ion of cyanidin-based anthocyanins contr ibutes s t rongly to lowering petal L* and C* , inducing the black f lower color in the absence of f lavones. On the other hand, high abi l i ty of cyanidin synthesis a lso induces high accumulat ion of cyanidin-based anthocyanins, resul t ing in the black f lower color even in the presence of f lavones. This may occur under the high potent ia l for anthocyanin synthesis conferred by the DvIVS Type 1 promoter. When the two mechanisms occur s imultaneously, f lower color may be more black.

PTGS of DvFNS

Low flavone synthesis

High accumulation of cyanidin-based anthocyanins

High accumulation of total anthocyanins

High ability of cyanidin synthesis

DvIVSType 1 promoter

Black(with flavone)

Black(without flavone)

ex. ‘Kokucho’, ‘Ms. Noir’ etc. ex. TSVdahlia-infected ‘Fidalgo Blacky’

More Black(without flavone)

ex. ‘Fidalgo Blacky’

+

73

第 3 章 ダリア花弁に蓄積する各種アントシアニンの

花弁黒色化への寄与度の評価

第 1 章および第 2 章において，シアニジン系アントシアニンがペラルゴニジン

系アントシアニンよりも花弁 L*および C*を低下させる効果，すなわち花弁黒色

化への寄与度が大きいことが示唆された．様々な植物種において花色と蓄積する

各 ア ン ト シ ア ニ ン の 割 合 と の 関 係 が 報 告 さ れ て い る が （ Sakata ら ， 1995 ；

Torskangerpol l ら， 2005；Uddin ら， 2004；Wang ら， 2001），これらの報告で用い

られている品種は蓄積するアントシアニンの種類や量が様々であるため，シアニ

ジン系アントシアニンとペラルゴニジン系アントシアニン間における花弁黒色化

への寄与度の違いを推し量ることは難しい．また，アントシアニンの発色は主に

in v i tro において評価および比較がなされているが（ Cabri ta ら， 2000； Giust i ら，

1999；Stin tzing ら，2002；Torskangerpol l・Andersen，2005），シアニジン系アント

シアニンがペラルゴニジン系アントシアニンよりも総じて L*および C*が低いと

いう評価はされていない．

本章では，ダリアにおいてシアニジン系アントシアニンの高蓄積が花弁黒色化

に強く寄与する理由を明らかにするために，ダリア花弁に蓄積する主要アントシ

アニンの L*および C*を in v i tro で調査し，花弁黒色化への寄与度を評価した．

第 1 節 主要蓄積アントシアニンの同定および定量

〈材料および方法〉

HPLC 分析

黒色系 4 品種（‘黒蝶’，‘フィダルゴブラッキー’，‘ミズノアール’，‘ブラック

キャット’），赤紫色系 4 品種（‘キューピット’，‘雪乃’，‘アトム’，‘エベリンラ

ンボルト’）および桃色系 1 品種（‘純愛’）を供試した．各品種の展開花弁 100 mg

を凍結粉砕し，5％酢酸水 1 mL を加えて混合し，4℃で一晩静置した．20,600 ×g，

4℃で 15 分間遠心分離し，上清を回収した． 5％酢酸水で 10 倍希釈したものを第

2 章第 3 節と同様の HPLC システムを用いて波長 520 nm で解析した．各アントシ

アニンの検量線の作成には‘黒蝶’の花弁から抽出したアントシアニンの精製物

を用いた．

アントシアニンの分離精製および同定

‘黒蝶’の凍結乾燥花弁 20 g を 5％酢酸水 4 L に 24 時間浸し，フラボノイド色

素を抽出した．ダイヤイオン HP-20（三菱化学）に色素を吸着させ 5％酢酸水で洗

74

浄した後， 5％酢酸メタノール（ v/v）を用いて溶出し，アントシアニンの赤色分

画を回収した．回収したアントシアニン溶液を常温で濃縮し，BAW（ブタノール：

酢酸：水 =4： 1： 2 v/v/v）を用いたペーパークロマトグラフで展開した．色調の異

なる分画を切り出し，それぞれから 5％酢酸水を用いてアントシアニンを溶出し

た．粗精製されたアントシアニンを C18 分取カラム（ 19 × 150 mm，日本ウォータ

ーズ）を装着した分取 HPLC LC 10A システム（島津製作所）を用いて，40°C，流

速 4 mL·min- 1，530 nm で解析し，ピークごとにアントシアニンを回収した．ダイ

ヤイオン HP-20 を用いて溶媒を置換し，風乾して，主要アントシアニン 4 種の精

製粉末 80 mg を得た． 520 nm での HPLC 分析によってすべて純度 90％以上であ

ることを確認した．

各アントシアニンは HPLC でのアントシアニン標品とのピーク比較，あるいは

高速原子衝撃法を用いた高分解能質量分析（ high-resolut ion fast a tom bombardment

mass spect roscopy： HR-FABMS）および核磁場共鳴（ nuclear magnet ic resonance：

NMR）により同定した．アントシアニンの標品としてヤグルマギク（ Centaurea

cyanus）花弁に蓄積するペラルゴニジン 3,5-ジグルコシド（ Pg 3,5diG）（ Saito ら，

1964） お よ び バ ラ 花 弁 に 蓄 積 す る シ ア ニ ジ ン 3,5-ジ グ ル コ シ ド （ Cy 3,5diG）

（ Wills tä t ter・ Mall ison， 1915）の精製物を使用した． 1H –NMR スペクトル（ 400

MHz）および 1 3C-NMR スペクトル（ 100 MHz）は，JEOL AL-400（日本電子）を用

いて CD3 OD-TFA（ 9： 1）中で測定した．テトラメチルシランを NMR における化

学シフトの内部基準物質として使用した．

〈結果〉

各品種の花弁抽出液の HPLC 分析により，5～ 8 つのピークが検出された．ピー

クの数は品種により異なっていたが，いずれの品種においても 4 つの同じピーク

が大きく，残りのピークはトレースレベルであった．アントシアニン標品との比

較から， 4 つの主要ピークを示すアントシアニンのうち 2 種が Pg 3,5diG および

Cy 3,5diG であることが示された．残りの 2 種は HR-FABMS および NMR（第 3-1

表）により，ペラルゴニジン 3-（ 6 ' ' -マロニルグルコシド）-5-グルコシド（ Pg 3MG5G）

およびシアニジン 3-（ 6 ' ' -マロニルグルコシド） -5-グルコシド（ Cy 3MG5G）であ

ることが示された． HR-FABMS の結果は以下の通りであった．

Pg 3MG5G： HR-FABMS calc . for C3 0H3 3 O1 8: 681.1667. Found: 681.1674;

Cy 3MG5G： HR-FABMS calc . for C3 0H3 3 O1 9: 697.16149. Found: 697.1627.

各品種生花弁 100 mg あたりの主要アントシアニン 4 種の蓄積量を第 3-2 表に

示した．黒色系品種のアントシアニン総蓄積量は 2.3 mg から 3.4 mg と多かった

が，‘ブラックキャット’での蓄積量は赤紫色系‘雪乃’とほぼ同等であった．シ

アニジン系アントシアニンの割合は品種により様々であり，‘フィダルゴブラッ

75

キー’，‘アトム’および‘キューピット’ではシアニジン系アントシアニンの割

合が高く，その他の品種ではペラルゴニジン系アントシアニンの割合が高かった．

‘ブラックキャット’におけるシアニジン系アントシアニンの割合は‘雪乃’よ

りも高かった．また，花色に関係なくすべての品種において，3MG5G 型アントシ

アニンの蓄積量が 3,5diG 型アントシアニン蓄積量よりも多かった．この傾向はペ

ラルゴニジン系およびシアニジン系いずれにおいてもみられた．

76

13C (ppm) * 1H (ppm) * 13C (ppm) 1H (ppm)Anthocyanidin

2 165.4 164.73 146.0 146.14 135.9 9.00 s 134.8 8.92 s5 156.9 156.86 105.6 7.05 d(1.2) 105.5 7.02 d(2.0)7 170.3 169.88 97.6 7.12 d(1.2) 97.5 7.06 d(2.0)9 157.5 157.2

10 113.5 113.21' 120.8 121.12' 136.3 8.61 d(9.3) 118.6 8.02 d(2.4)3' 118.2 7.08 d(9.3) 147.74' 167.4 156.75' 118.2 7.08 d(9.3) 117.7 7.02 d(8.8)6' 136.3 8.61 d(9.3) 129.0 8.25 dd(2.4, 8.8)

Glucose(3)1 102.7 5.45 d(8.1) 102.4 5.49 d(7.8)2 74.5 3.71 t(8.7) 74.8 3.75 t(8.4)3 78.1 3.60 t(9.0) 78.0 3.62 t(8.2)4 71.5 3.47 t(8.5) 71.3 3.47 t(9.4)5 75.8 3.91 ddd(2.2, 6.7, 9.6) 75.7 3.93 ddd(2.2, 7.3, 9.6)

6a 65.6 4.37 dd(7.2, 11.8) 65.7 4.36 dd(7.2, 12.0)6b 4.49 dd(2.0, 11.8) 4.48 dd(1.9, 12.0)

Glucose(5)1 102.9 5.22 d(7.8) 102.8 5.22 d(7.8)2 74.8 3.73 t(8.5) 74.5 3.73 t(8.3)3 78.0 3.62 m 78.2 3.60 t(8.9)4 71.3 3.49 t(8.5) 71.6 3.49 t(9.3)5 78.9 3.61 m 78.9 3.62 m

6a 62.6 3.78 dd(5.5, 11.8) 62.6 3.78 dd(6.0, 12.0)6b 3.99 dd(2.2, 11.8) 3.99 dd(2.0, 12.0)

Malonic acid

CH3 49.4 3.43 s 49.4 3.49 m

COOH 168.9 170.4COOH 170.0 168.9

* 400 MHz for 1H and 100 MHz for 13C

Table 3-1. NMR spectroscopic data of pelargonidin 3-(6''-malonylglucoside)-5-glucoside and cyanidin 3-(6''-malonylglucoside)-5-

glucoside in CD3OD-TFA (9:1).

Pelargonidin 3-(6''-malonylglucoside)-5-glucoside Cyanidin 3-(6''-malonylglucoside)-5-glucoside

77

Tab

le 3

-2. T

he c

onte

nt o

f an

thoc

yani

ns in

100

mg

fres

h pe

tals

of

dahl

ia c

ulti

vars

.

Flow

erco

lor

Cul

tiva

rP

g 3,

5diG

(mg)

Pg

3MG

5G(m

g)C

y 3,

5diG

(mg)

Cy

3MG

5G(m

g)To

tal a

ntho

cyan

in(m

g)C

y/P

g3M

G5G

/3,5

diG

'Bla

ck C

at'

0.29

3 ±

0.00

41.

001

± 0.

007

0.21

5 ±

0.00

30.

838

± 0.

010

2.34

7 ±

0.01

50.

814

± 0.

005

3.62

5 ±

0.07

1

'Fid

algo

Bla

cky'

0.28

9 ±

0.01

30.

376

± 0.

020

0.46

3 ±

0.00

32.

248

± 0.

116

3.37

6 ±

0.13

04.

080

± 0.

164

3.48

8 ±

0.08

4

'Kok

ucho

'0.

377

± 0.

015

1.63

8 ±

0.09

90.

242

± 0.

012

1.02

5 ±

0.07

93.

282

± 0.

155

0.63

5 ±

0.05

44.

295

± 0.

010

'Ms.

Noi

r'0.

274

± 0.

014

1.26

7 ±

0.02

70.

192

± 0.

010

1.10

9 ±

0.11

02.

842

± 0.

145

0.84

2 ±

0.06

35.

114

± 0.

279

'Ato

m'

0.08

7 ±

0.00

20.

152

± 0.

002

0.17

4 ±

0.00

30.

703

± 0.

016

1.11

7 ±

0.09

63.

267

± 0.

016

3.66

3 ±

0.04

0

'Cup

id'

0.07

1 ±

0.00

00.

250

± 0.

004

0.09

6 ±

0.00

40.

577

± 0.

005

0.99

5 ±

0.00

52.

095

± 0.

023

4.94

7 ±

0.17

8

'Eve

lyn

Rum

bold

'0.

254

± 0.

016

0.51

6 ±

0.04

00.

067

± 0.

007

0.14

6 ±

0.01

50.

983

± 0.

072

0.27

6 ±

0.01

52.

065

± 0.

093

'Yuk

ino'

0.22

7 ±

0.03

81.

572

± 0.

059

0.05

3 ±

0.00

10.

547

± 0.

022

2.39

9 ±

0.08

60.

334

± 0.

009

7.92

3 ±

0.95

8

Pin

k 'J

yunn

-ai'

0.01

1 ±

0.00

10.

072

± 0.

007

0.00

4 ±

0.00

00.

028

± 0.

003

0.11

5 ±

0.01

10.

388

± 0.

002

6.68

4 ±

0.23

3

Dat

a re

pres

ent t

he a

vera

ge ±

SE

of

thre

e re

plic

atio

ns.

Bla

ck

Pur

ple

78

第 2 節 各種アントシアニンの in v i t ro 測色

〈材料および方法〉

第 1 節で同定された 4 種の主要アントシアニンの精製粉末をリン酸クエン酸緩

衝液に溶解し，溶解直後および溶解 30 分後の溶液の色（ CIE L*a*b*）を分光測色

計 CM-5（コニカミノルタ）で測定した．C*を計算し，L*a*b* C*について 3 反復

の平均値を算出した．

［ pH 別測定］

アントシアニン 0.5 mg を pH = 3.0， 4.0， 4.5， 5.0， 5.5， 6.0， 7.0 のリン酸クエ

ン酸緩衝液 1 mL に溶解した．

［濃度別測定］

アントシアニン 0.25，0.5，1.0，2.0，3.0 mg を pH 3.0 あるいは pH 5.0 のリン酸

クエン酸緩衝液 1 mL に溶解した．

［混合色素の測定］

3 ,5diG 型あるいは 3MG5G 型アントシアニンにおいて，ペラルゴニジン系：シ

アニジン系＝ 5： 0， 4： 1， 3： 2， 2： 3， 1： 4， 0： 5（質量比）で調製した計 1 mg

の混合色素を pH 5.0 のリン酸クエン酸緩衝液 0.5 mL に溶解した．

〈結果〉

pH4.0 から pH 6.0 において，すべての精製アントシアニンで溶解直後から急速

な退色がみられた．pH3.0 においては見た目に退色はみられず，pH7.0 においては

急速な退色はみられなかったものの約 1 日かけて徐々に退色が生じた．また，測

定に用いたすべての pH において，3MG5G 型アントシアニンはよく溶解したのに

対し， 3,5diG 型アントシアニンはわずかに溶け残りが生じ，さらに一度溶解した

アントシアニンの再結晶化がみられた．そのため，退色前後の色を調査するため

に溶解直後および溶解 30 分後に測色を行った．溶解 30 分後の時点では pH 7.0 を

除いて退色は終了して平衡状態を示しており，また再結晶化は生じていなかった．

溶解直後の L*は，pH 3.0 から pH 4.5 において，Pg 3MG5G が他の 3 種のアント

シアニンと比較して有意に高い値を示した（第 3-1 図 a）．また，C*もすべての pH

において Pg 3MG5G が高い値を示し，次いで Cy 3MG5G が高い傾向がみられた

（第 3-1 図 b）． Pg 3MG5G および Cy 3MG5G の C*が高かったのは， a*および b*

の絶対値が共に高いためであった（第 3-3 表）．

溶解 30 分後の L*はすべてのアントシアニンで溶解直後と比較して高くなって

おり， 4 種のなかでは Pg 3MG5G の値がわずかに高い傾向がみられた（第 3-1 図

c）．溶解 30 分後の C*は Pg 3,5diG， Cy 3,5diG および Cy 3MG5G では溶解直後と

比較して高くなっていたのに対し， Pg 3MG5G では pH 7.0 を除いて低くなってい

79

た（第 3-1 図 d）． pH 3.0 から pH 5.5 において Cy 3MG5G の C*が最も高く， Pg

3,5diG の C*が最も低かった．溶解 30 分後における溶液の見た目の色は，すべて

の pH において Pg 3MG5G が最も淡かった（第 3-1 図 e）．

黒色系品種の花弁 pH に近い pH 5.0 において，溶解直後の L*および C*はすべ

てのアントシアニンで濃度が高くなるほど低下した（第 3-2 図 a）．L*は 4 種のア

ントシアニンのなかで Pg 3MG5G がわずかに高い値を示した． C*は Pg 3,5diG，

Cy 3,5diG および Cy 3MG5G がほぼ同等の値を示したのに対し，Pg 3MG5G は他の

3 種のアントシアニンと比較して著しく高い値を示した． Pg 3MG5G の C*が高か

ったのは a*および b*の絶対値が共に高いためであった（第 3-4 表）．溶解 30 分後

の L*は溶解直後と同様にアントシアニン濃度が高くなるほど低下した（第 3-2 図

c）． C*は Pg 3,5diG， Cy 3,5diG および Cy 3MG5G ではアントシアニン濃度が高く

なるにつれ一度上昇し，さらに濃度が高くなると低下した（第 3-2 図 d）．Pg 3MG5G

ではアントシアニン濃度が高くなるにつれ上昇した（第 3-2 図 d）． Pg 3,5diG の

C*の低下はアントシアニン濃度 2.0 mg·mL− 1 から，Cy 3,5diG および Cy 3MG5G の

C*の低下は 3.0 mg·mL− 1 でみられた．これらの C*の変動は a*および b*の両方の

変動に伴ったものであった（第 3-4 表）． L*はすべてのアントシアニン濃度で Pg

3MG5G が最も高い値を示し， 3.0 mg·mL− 1 を除いて Pg 3,5diG が最も低い値を示

した． C*は 1.0 mg·mL− 1 までは Cy 3MG5G， 2.0 mg·mL− 1 以上では Pg 3MG5G が最

も高い値を示し，すべての濃度で Pg 3,5diG が最も低い値を示した．

溶解 30 分後の各アントシアニンの C*および L*によるプロット図（第 3-2 図 e）

において，低濃度から高濃度にかけてプロットを追うと，Pg 3,5diG，Cy 3,5diG お

よび Cy 3MG5G では右（ C*）に変曲点のある下向きの曲線を示し， Pg 3MG5G で

は右下がりの直線を示した．同濃度における各アントシアニンのプロット位置は

Pg 3,5diG が最も原点から近く，Pg 3MG5G が最も原点から離れていた．溶解 30 分

後の溶液の見た目の色は Pg 3,5diG が最も濃く，Pg 3MG5G が最も淡かった（第 3-

2 図 f）．

アントシアニンの退色が生じにくい pH 3.0 において，溶解直後の L*はすべて

のアントシアニンで濃度が高くなるほど低下した（第 3-3 図 a）．C*は Pg 3,5diG，

Cy 3,5diG および Cy 3MG5G では濃度が高くなるほど低下し， Pg 3MG5G では 0.5

mg·mL− 1 までは上昇し， 1.0 mg·mL− 1 では変わらず， 2.0 mg·mL− 1 以上で低下した

（第 3-3 図 b）．いずれの濃度でも L*は Pg 3MG5G が他の 3 種のアントシアニン

より高い値を示した．また， C*も 0.5 mg·mL− 1 以上で Pg 3MG5G が他の 3 種より

高い値を示した．溶解 30 分後の L*はすべてのアントシアニンで溶解直後と同様

に濃度が高くなるほど低下した（第 3-3 図 c）． C*は Pg 3,5diG， Cy 3,5diG および

Cy 3MG5G では 0.5 mg·mL− 1 まで， Pg 3MG5G では 1.0 mg·mL− 1 まで上昇し，それ

より高い濃度では低下した（第 3-3 図 d）．これらの C*の変動は a*および b*の両

80

方の変動に伴ったものであった（第 3-4 表）． L*は Pg 3MG5G が最も高い値を示

し，次いで Pg 3,5diG が高かった． C*は 0.25 mg·mL− 1 では Cy 3MG5G が高い値を

示したが， 1.0 mg·mL− 1 以上では Pg 3MG5G が他のアントシアニンよりも著しく

高い値を示した．

溶解 30 分後の各アントシアニンの C*および L*によるプロット図（第 3-3 図 e）

において，低濃度から高濃度にかけてプロットを追うと，すべてのアントシアニ

ンで右に変曲点のある下向きの曲線を示した．同濃度における各アントシアニン

のプロット位置は Pg 3MG5G が最も原点から離れていた．溶解 30 分後の溶液の

見た目の色は Pg 3MG5G が最も淡かった（第 3-3 図 f）．

3,5diG 型アントシアニンの混合色素では，溶解直後の L*および C*はシアニジ

ン系アントシアニンの割合にかかわらずほぼ一定であったが，溶解 30 分後の L*

および C*はシアニジン系アントシアニンの割合が高くなるほど高くなった（第 3-

4 図）． 3MG5G 型アントシアニンの混合色素では，シアニジン系アントシアニン

の割合が高くなるほど C*が低下し， L*もわずかに低下した（第 3-5 図）．混合色

素での測色結果は，各アントシアニン単体での測色結果（第 3-2 図）から予想さ

れるものと一致していた．

81

Fig. 3-1 . The color of the purif ied anthocyanin solut ions measured immediately or 30 min af ter dissolut ion in phosphate-ci t ra te buffer a t var ious pHs. (a) l ightness (L* ) immediately af ter dissolut ion, (b) chroma (C* ) immediately af ter dissolut ion, (c) L* a t 30 min af ter dissolut ion, (d) C* a t 30 min af ter dissolut ion. Pg 3 ,5diG: pelargonidin 3,5-diglucoside, Cy 3,5diG: cyanidin 3,5-diglucoside, Pg 3MG5G: pelargonidin 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside, Cy 3MG5G: cyanidin 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside. A 0.5 mg sample of each anthocyanin was dissolved in 1 mL of phosphate–ci t ra te buffer solut ion. C* was calculated as (a*2 + b*2 )1 / 2 . Al l data represent the average ± SE of three repl icat ions. (e) Color photographs at 30 min af ter d issolut ion. The buffer pH was 3.0, 4 .0 , 4 .5, 5 .0 , 5 .5, 6 .0, and 7.0 from lef t to r ight in each photograph.

82

3.

04.

04.

55.

05.

56.

07.

0

Pg

3,5d

iG23

.17

± 0.

1015

.56

± 0.

5612

.24

± 0.

549.

26 ±

1.0

58.

22 ±

0.3

87.

43 ±

0.3

26.

84 ±

0.4

3C

y 3,

5diG

30.5

2 ±

1.07

15.5

9 ±

0.83

9.81

± 0

.64

7.15

± 0

.64

5.90

± 0

.46

4.94

± 0

.07

2.56

± 0

.21

Pg

3MG

5G31

.81

± 0.

4135

.76

± 0.

5137

.28

± 1.

0530

.44

± 0.

1328

.64

± 0.

5226

.40

± 0.

6616

.34

± 0.

38C

y 3M

G5G

35.0

9 ±

0.63

23.8

2 ±

0.18

18.6

1 ±

0.51

11.5

4 ±

0.71

10.2

8 ±

0.40

8.20

± 0

.34

3.46

± 0

.11

Pg

3,5d

iG12

.46

± 0.

290.

09 ±

0.1

7-2

.50

± 0.

20-3

.22

± 0.

45-2

.34

± 0.

38-2

.83

± 0.

44-4

.19

± 0.

25C

y 3,

5diG

10.5

4 ±

0.47

1.39

± 0

.41

-0.3

2 ±

0.29

-0.6

2 ±

0.11

-0.9

5 ±

0.16

-1.1

3 ±

0.05

-1.6

1 ±

0.09

Pg

3MG

5G28

.46

± 0.

4119

.50

± 0.

5114

.06

± 0.

539.

35 ±

0.1

08.

26 ±

0.2

57.

31 ±

0.3

53.

11 ±

0.2

0C

y 3M

G5G

15.0

4 ±

0.43

6.98

± 0

.52

4.40

± 0

.08

1.59

± 0

.38

1.16

± 0

.23

0.65

± 0

.21

-0.4

8 ±

0.07

Pg

3,5d

iG28

.08

± 0.

3017

.06

± 0.

2111

.09

± 0.

257.

79 ±

0.2

69.

94 ±

0.1

413

.39

± 0.

329.

60 ±

0.3

6C

y 3,

5diG

37.1

1 ±

0.39

24.1

6 ±

0.46

14.8

2 ±

0.35

11.1

7 ±

0.15

10.1

4 ±

0.17

17.2

1 ±

0.02

7.62

± 0

.68

Pg

3MG

5G29

.76

± 0.

2520

.19

± 0.

2514

.28

± 0.

0910

.37

± 0.

139.

80 ±

0.0

910

.49

± 0.

0630

.32

± 0.

69C

y 3M

G5G

39.4

3 ±

0.37

30.7

6 ±

0.30

19.7

7 ±

0.40

13.6

3 ±

0.22

12.6

7 ±

0.14

13.4

7 ±

0.30

8.15

± 0

.23

Pg

3,5d

iG19

.71

± 0.

415.

52 ±

0.1

31.

91 ±

0.1

8-0

.16

± 0.

19-2

.73

± 0.

49-1

0.67

± 0

.26

-9.4

9 ±

0.24

Cy

3,5d

iG13

.55

± 0.

133.

38 ±

0.3

61.

77 ±

0.1

31.

55 ±

0.1

70.

91 ±

0.0

7-4

.67

± 0.

15-5

.88

± 0.

38P

g 3M

G5G

26.2

1 ±

0.41

9.24

± 0

.21

4.40

± 0

.12

2.12

± 0

.07

1.77

± 0

.08

1.51

± 0

.12

0.64

± 0

.37

Cy

3MG

5G16

.91

± 0.

243.

72 ±

0.1

60.

84 ±

0.1

10.

05 ±

0.1

6-0

.27

± 0.

01-1

.11

± 0.

07-1

.18

± 0.

09

0 m

in in

dica

tes

imm

edia

tely

aft

er d

isso

luti

on a

nd 3

0 m

in in

dica

tes

30 m

in a

fter

dis

solu

tion

.D

ata

repr

esen

t the

ave

rage

± S

E o

f th

ree

repl

icat

ions

.

30 m

in

a* b*

Tab

le 3

-3.

CIE

a*

and

b*

of

puri

fied

ant

hocy

anin

sol

utio

ns (

0.5

mg·

mL

−1 )

at v

ario

us p

Hs.

pH

0 m

in

a* b*

83

Fig. 3-2. The color of the purif ied anthocyanin solut ions (pH 5.0) a t various anthocyanin concentrat ions measured immediately or 30 min af ter dissolut ion. (a) l ightness (L* ) immediately af ter dissolut ion, (b) chroma (C* ) immediately af ter dissolut ion, (c) L* a t 30 min af ter dissolut ion, (d) C* a t 30 min af ter dissolut ion. Pg 3,5diG: pelargonidin 3,5-diglucoside, Cy 3,5diG: cyanidin 3,5-diglucoside, Pg 3MG5G: pelargonidin 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside, Cy 3MG5G: cyanidin 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside. C* was calculated as (a* 2 + b* 2 ) 1 / 2 . All da ta represent the average ± SE of three repl icat ions. (e) Color plot pat tern of C* (X-axis) and L* (Y-axis) a t 30 min af ter dissolut ion. ( f ) Color photographs a t 30 min af ter dissolut ion. Anthocyanin concentrat ion was 0.25, 0 .5, 1 .0 , 2 .0 , and 3.0 mg·mL− 1 f rom lef t to r ight in each photograph.

84

Fig. 3-3. The color of the purif ied anthocyanin solut ions (pH 3.0) a t various anthocyanin concentrat ions measured immediately or 30 min af ter dissolut ion. (a) l ightness (L* ) immediately af ter dissolut ion, (b) chroma (C* ) immediately af ter dissolut ion, (c) L* a t 30 min af ter dissolut ion, (d) C* a t 30 min af ter dissolut ion. Pg 3,5diG: pelargonidin 3,5-diglucoside, Cy 3,5diG: cyanidin 3,5-diglucoside, Pg 3MG5G: pelargonidin 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside, Cy 3MG5G: cyanidin 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside. C* was calculated as (a*2 + b*2 )1 / 2 . Al l data represent the average ± SE of three repl icat ions. (e) Color plot pat tern of C* (X-axis) and L* (Y-axis) a t 30 min after dissolut ion. (f ) Color photographs at 30 min af ter dissolut ion. Anthocyanin concentrat ion was 0 .25, 0 .5, 1 .0 , 2 .0 , and 3.0 mg·mL− 1 f rom lef t to r ight in each photograph.

85

0.25

0.5

12

30.

250.

51

23

Pg

3,5d

iG18

.19

± 1.

708.

10 ±

0.4

31.

68 ±

0.0

70.

28 ±

0.0

80.

13 ±

0.0

524

.66

± 0.

2623

.67

± 0.

4211

.42

± 0.

483.

13 ±

0.9

50.

99 ±

0.1

2C

y 3,

5diG

19.9

0 ±

1.56

6.98

± 0

.14

0.97

± 0

.06

0.03

± 0

.00

0.10

± 0

.04

35.8

8 ±

0.22

27.4

6 ±

0.56

12.9

6 ±

1.34

3.94

± 1

.19

0.71

± 0

.20

Pg

3MG

5G38

.74

± 0.

3427

.89

± 0.

9719

.05

± 0.

619.

89 ±

0.1

17.

13 ±

0.0

727

.89

± 0.

2332

.99

± 0.

0637

.04

± 0.

2132

.35

± 0.

2425

.49

± 0.

30C

y 3M

G5G

22.7

4 ±

0.42

10.9

8 ±

0.43

3.73

± 0

.10

1.26

± 0

.06

1.07

± 0

.27

39.3

7 ±

0.24

32.2

8 ±

0.95

19.1

5 ±

0.51

6.44

± 0

.09

4.04

± 0

.52

Pg

3,5d

iG-4

.97

± 0.

27-2

.52

± 0.

15-1

.10

± 0.

10-1

.34

± 0.

12-1

.47

± 0.

1513

.94

± 0.

2613

.01

± 0.

313.

43 ±

0.3

5-0

.42

± 0.

45-0

.93

± 0.

08C

y 3,

5diG

-3.0

6 ±

0.37

-0.5

9 ±

0.12

-0.9

8 ±

0.09

-1.3

9 ±

0.04

-1.0

6 ±

0.06

10.4

7 ±

0.08

9.49

± 0

.30

3.04

± 0

.30

-0.0

2 ±

0.28

-1.2

2 ±

0.08

Pg

3MG

5G8.

73 ±

0.2

18.

42 ±

0.3

84.

87 ±

0.3

11.

39 ±

0.1

00.

85 ±

0.2

023

.62

± 0.

4129

.40

± 0.

3726

.05

± 0.

2414

.22

± 0.

318.

52 ±

0.1

7C

y 3M

G5G

3.07

± 0

.21

1.82

± 0

.18

-0.4

3 ±

0.09

-0.7

6 ±

0.07

-0.9

5 ±

0.17

15.1

6 ±

0.21

13.3

9 ±

0.65

5.41

± 0

.51

0.62

± 0

.12

-0.1

5 ±

0.19

Pg

3,5d

iG4.

63 ±

0.2

88.

50 ±

0.2

813

.51

± 0.

209.

08 ±

1.6

15.

65 ±

0.2

623

.01

± 0.

2128

.52

± 0.

2029

.29

± 0.

3914

.37

± 0.

285.

49 ±

0.0

7C

y 3,

5diG

5.62

± 0

.34

10.4

7 ±

0.33

18.7

9 ±

0.33

22.7

6 ±

0.38

17.5

4 ±

0.61

32.6

3 ±

0.35

35.9

0 ±

0.39

32.2

1 ±

0.28

10.4

3 ±

0.36

2.86

± 0

.14

Pg

3MG

5G4.

97 ±

0.1

310

.11

± 0.

2319

.65

± 0.

1831

.73

± 0.

6434

.30

± 0.

2824

.35

± 0.

1230

.71

± 0.

3237

.43

± 0.

2235

.42

± 0.

6330

.36

± 0.

59C

y 3M

G5G

6.85

± 0

.14

13.5

1 ±

0.09

23.0

9 ±

0.55

27.9

0 ±

0.26

20.8

8 ±

0.82

37.5

1 ±

0.48

37.8

6 ±

0.45

31.7

0 ±

0.56

13.7

4 ±

0.47

6.05

± 0

.12

Pg

3,5d

iG0.

98 ±

0.1

9-0

.38

± 0.

25-7

.42

± 0.

20-5

.62

± 1.

61-3

.36

± 0.

2614

.48

± 0.

2020

.21

± 0.

2618

.88

± 0.

474.

52 ±

0.2

40.

24 ±

0.0

1C

y 3,

5diG

0.99

± 0

.07

1.32

± 0

.14

0.84

± 0

.09

-1.5

7 ±

0.04

-1.8

4 ±

0.18

7.06

± 0

.25

12.6

1 ±

0.22

13.5

0 ±

0.20

2.28

± 0

.20

-0.6

5 ±

0.10

Pg

3MG

5G1.

29 ±

0.0

81.

96 ±

0.0

33.

59 ±

0.2

26.

49 ±

0.1

79.

76 ±

0.1

518

.96

± 0.

1027

.40

± 0.

5130

.79

± 0.

2518

.39

± 0.

4711

.86

± 0.

36C

y 3M

G5G

0.31

± 0

.02

0.18

± 0

.07

-0.8

3 ±

0.02

0.98

± 0

.22

3.26

± 0

.34

9.95

± 0

.23

15.8

0 ±

0.23

13.0

4 ±

0.48

3.22

± 0

.27

0.36

± 0

.03

0 m

in in

dica

tes

imm

edia

tely

afte

r di

ssol

utio

n an

d 30

min

indi

cate

s 30

min

afte

r di

ssol

utio

n.

Dat

a re

pres

ent t

he a

vera

ge ±

SE

of t

hree

rep

licat

ions

.

30 m

in

a* b*

Tab

le 3

-4.

CIE

a*

and

b*

of

puri

fied

ant

hocy

anin

sol

utio

ns a

t pH

5.0

and

pH

3.0

pH 5

.0pH

3.0

Con

cent

rati

on (

mg·

mL−1

)C

once

ntra

tion

(m

g·m

L−1

)

0 m

in

a* b*

86

Fig. 3-4. The l ightness (L* ) and chroma (C* ) of the solut ion of mixed 3,5-diglucoside- type anthocyanins at var ious proport ions of Pg and Cy measured immediately (a , b) or 30 min af ter dissolut ion (c , d) . Pg 3,5diG: pelargonidin 3,5-diglucoside, Cy 3 ,5diG: cyanidin 3,5-diglucoside. The buffer pH was 5.0, and the concentrat ion of tota l anthocyanins was 1.0 mg·mL− 1 . C* was ca lculated as (a* 2 + b*2)1 / 2 . Data represent the average ± SE of three repl icat ions (only the data for 5:0 represent the score of one sample) .

40

45

50

55

60

65

70

5:0 4:1 3:2 2:3 1:4 0:5

L*

Proportion of anthocyanins（Pg 3,5diG:Cy 3,5diG）

0

2

4

6

8

10

5:0 4:1 3:2 2:3 1:4 0:5

C*

Proportion of anthocyanins（Pg 3,5diG:Cy 3,5diG）

404550556065707580

5 : 0 4 : 1 3 : 2 2 : 3 1 : 4 0 : 5

L*

Proportion of anthocyanins（Pg 3,5diG:Cy 3,5diG）

0

5

10

15

20

25

30

5 : 0 4 : 1 3 : 2 2 : 3 1 : 4 0 : 5

C*

Proportion of anthocyanins（Pg 3,5diG:Cy 3,5diG）

(a) (b)

(c) (d)

87

Fig. 3-5. The l ightness (L* ) and chroma (C* ) of the solut ion of mixed 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside- type anthocyanins at var ious proport ions of Pg and Cy measured immediately (a , b) or 30 min af ter dissolut ion (c , d) . Pg 3MG5G: pelargonidin 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside, Cy 3MG5G: cyanidin 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside . The buffer pH was 5 .0 , and the concentrat ion of total anthocyanins was 1.0 mg·mL− 1 . C* was calculated as (a*2 + b*2)1 / 2 . Data represent the average ± SE of three repl icat ions (only the data for 5:0 represent the score of one sample) .

40

45

50

55

60

65

70

5:0 4:1 3:2 2:3 1:4 0:5

L*

Proportion of anthocyanins（Pg 3MG5G:Cy 3MG5G）

0

2

4

6

8

10

5:0 4:1 3:2 2:3 1:4 0:5

C*

Proportion of anthocyanins（Pg 3MG5G:Cy 3MG5G）

404550556065707580

5 : 0 4 : 1 3 : 2 2 : 3 1 : 4 0 : 5

L*

Proportion of anthocyanins（Pg 3MG5G:Cy 3MG5G）

0

5

10

15

20

25

30

5 : 0 4 : 1 3 : 2 2 : 3 1 : 4 0 : 5

C*

Proportion of anthocyanins（Pg 3MG5G:Cy 3MG5G）

(a) (b)

(c) (d)

88

第 3 節 考察

ダリアにおいてシアニジン系アントシアニンの高蓄積が花弁黒色化に強く寄与す

る理由

ダリア花弁に蓄積する主要な 4 種のアントシアニンは Pg 3,5diG, Cy 3,5diG, Pg

3MG5G および Cy 3MG5G であり，Takeda ら（ 1986）および Yamaguchi ら（ 1999）

で報告されているものと一致した．その他微量に検出されたアントシアニンのう

ち 2 種は Takeda ら（ 1986）および Yamaguchi ら（ 1999）で報告されているペラル

ゴニジン 3,5-ジマロニルグルコシドおよびシアニジン 3,5-ジマロニルグルコシド

であると考えられた．黒色系品種でのみ蓄積しているアントシアニンはなかった

ことから，黒色という花色は 4 種の主要アントシアニンの蓄積量により制御され

る量的な形質であることが示唆された．シアニジン系アントシアニンの割合は品

種により様々であったが，すべての品種において 3MG5G 型アントシアニンの割

合は 3,5diG 型アントシアニンよりも高く，蓄積量が多かった（第 3-2 表）．ダリ

アの DvIVS は Dv3MT の発現量も正に制御することが示唆されることから，合成

されるアントシアニンの多くが同時に発現している Dv3MT によりマロニル化さ

れるため，ダリア花弁では主に 3MG5G 型アントシアニンが蓄積していると考え

られた．

アントシアニンは弱酸性から塩基性域では水和反応により無色の擬塩基に変化

するため，溶解直後から退色が生じる．そのため，退色の前後である溶解直後お

よび溶解 30 分後において各種アントシアニンの溶液色を評価した．これまでの

報告（ Brouil lard， 1988； Fossen ら， 1998； Heredia ら， 1998； Hurtado ら， 2009；

Torskangerpol l・ Andersen， 2005）にも示されるように，アントシアニン溶液の色

およびその安定性は pH によって異なった（第 3-1 図，第 3-3 表）．ダリアの黒色

系品種の花弁 pH に近い pH 5.0 において， Pg 3MG5G が他のアントシアニンと比

較して著しく高い C*を示し，L*もわずかに高い値を示した（第 3-2 図）．Pg 3MG5G

の高い C*は a*および b*がいずれも高いことに起因していた（第 3-4 表）．また，

溶解 30 分後においては Pg 3,5diG が 4 種のアントシアニンのなかで最も低い L*

および C*を示した． C*および L*を座標軸に各濃度における値をプロットした際

に，それぞれのアントシアニンの座標と原点（ L* = 0，C* = 0；黒）との距離が短

いほど，アントシアニンの色は黒に近く，花弁黒色化への寄与度が大きいと考え

られる．よって，溶解 30 分後の値をプロットした第 3-2 図 f から，pH 5.0 におけ

る花弁黒色化への寄与度の大きさは Pg 3,5diG > Cy 3,5diG ≒ Cy 3MG5G >> Pg

3MG5G であると考えられた．ダリア赤紫色系品種には花弁 pH が 5.5 程度のもの

もあるが（第 1-3 表），それぞれのアントシアニンの L*および C*は pH 5.0 と pH

5.5 でほぼ同等の値であったため（第 3-1 図），この pH 域では各アントシアニン

89

の花弁黒色化への寄与度の大きさに変わりはないと考えられた．アントシアニン

は酸性条件では水和反応すなわち退色が起こりにくい構造となる．発色が比較的

安定的な pH 3.0 では，特に高濃度において， Pg 3MG5G が他のアントシアニンと

比較して著しく高い L*および C*を示した（第 3-3 図）．高い C*は a*および b*が

いずれも高いことに起因していた（第 3-4 表）．溶解 30 分後の値をプロットした

第 3-3 図 f から， pH 3.0 における黒色化への寄与度の大きさは Cy 3,5diG ≒ Cy

3MG5G ≥ Pg 3,5diG >> Pg3MG5G であると考えられた．

本実験で精製した 4 種のアントシアニンはそれぞれ分子量が異なるため，質量

濃度（ mg·mL- 1）が同じ場合，各アントシアニンのモル濃度（ mol·mL- 1）は異なる．

しかし， 3.0 mg·mL− 1 での Pg 3MG5G（ = 5.0·10- 6 mol·mL− 1）の色は 2.0 mg·mL− 1 で

のその他 3 種のアントシアニン（ = 2.9~3.3·10- 6 mol·mL− 1）の色よりも淡かったこ

とから，モル濃度で比較したとしても Pg 3MG5G が 4 種のアントシアニンで最も

淡く，黒色から遠い色を示すと考えられた．したがって，pH 5.0 および pH 3.0 の

いずれにおいても， 4 種のアントシアニンのなかで Pg 3MG5G が最も花弁 L*およ

び C*を下げる効果が低く，花弁黒色化への寄与度が小さいことが示唆された．

ストック（ Matthiola incana)では，同程度のアントシアニン総蓄積量を示す品種

間での比較において，シアニジン系アントシアニンの割合の高い品種が割合の低

い（ペラルゴニジン系アントシアニンの割合が高い）品種よりも低い花弁 L*を示

す（ Tatsuzawa ら，2012）．一方で，Hippeastrum hybridum およびトルコギキョウで

は，シアニジン系アントシアニンの割合の高い品種において花弁 L*が低いことは

なく，また，花弁 C*は高いことが報告されている（ Byamukama ら，2006；Uddin

ら，2004）．これらの報告はシアニジン系アントシアニンがペラルゴニジン系アン

トシアニンより必ずしも低い L*および C*を示すわけではないことを示唆してい

る． In vi tro では， Cy 3,5diG の L*および C*は Pg 3,5diG と比較して必ずしも高い

わけではなく（第 3-2 図，第 3-3 図），花弁黒色化への寄与度が大きいとはいえな

かった．一方で， Cy 3MG5G の L*および C*は Pg 3MG5G よりも有意に低く（第

3-2 図，第 3-3 図），花弁黒色化への寄与度が大きいことが示唆された．また，混

合色素の測色において，シアニジン系アントシアニンの割合が高くなるにつれて

L*および C*の低下がみられたのは 3MG5G 型アントシアニンのみであった（第 3-

4 図，第 3-5 図）．これらの結果から，アントシアニン間の花弁黒色化への寄与度

の違いはアグリコンの種類により生じるのではなく，修飾基に大きく影響を受け

て生じていることが示唆された．したがって，ダリアにおいてシアニジン系アン

トシアニンの高蓄積が花弁黒色化に強く寄与するのは，ダリアに主に蓄積するの

が 3MG5G 型アントシアニンであり，かつ Cy 3MG5G が Pg 3MG5G よりも花弁黒

色化への寄与度が大きいためだと考えられた．

90

新しい黒色系ダリアの可能性

本測定において， 3,5diG 型アントシアニンの L*および C*は Cy 3MG5G と比較

して同等あるいは低いことが示された（第 3-2 図，第 3-3 図）．さらに，再結晶化

が生じた後の溶液の色も Cy 3MG5G と同程度に濃い色であった（データ略）．そ

のため，アントシアニンのマロニル化を抑制，つまり Dv3MT の発現を抑制し，

3,5diG 型アントシアニンのみを蓄積させることでも花弁を黒色にすることができ

る可能性が考えられた． 3,5diG 型アントシアニンを蓄積するバラでは，花弁表皮

細胞内にアントシアニンの凝集体（ AVIs）が形成されることが報告されている

（ Yasuda，1974； 1976；Yasuda・Yoneda，1985）．また，カーネーションは通常リ

ンゴ酸が付加したアシル化アントシアニンを蓄積しているが，アントシアニン 3-

マリル基転移酵素遺伝子のノックダウンにより 3,5diG 型アントシアニンのみを

蓄積させると，AVIs が形成され，くすんだ花色あるいは金属光沢を示すことがわ

かっている（ Okamura ら，2013；Sasaki ら，2013）．本測定において 3,5diG 型アン

トシアニンでは再結晶化が生じたことも考慮すると， 3,5diG 型アントシアニンの

蓄積は AVIs 形成に関与していると考えられる．よって， 3,5diG 型アントシアニ

ンのみを高蓄積させたダリアは，AVIs を形成することによって，くすんだ黒色や

金属光沢のある黒色といった新しい花色になる可能性が考えられた．

黒色花作出へのアプローチ

ダリアを用いた本研究により，花弁が黒色になる基本原理は「花弁黒色化への

寄与度の大きいアントシアニンの高蓄積」であることが示唆された．したがって，

他の植物種における黒色花作出には，「花弁黒色化への寄与度の大きいアントシ

アニン」を見出し，それを「高蓄積させる」ためにアントシアニン合成系を制御

することが有効であると考えられた．

ダリアに蓄積するアントシアニンの測色から，各アントシアニンの花弁黒色化

への寄与度はアグリコンごとに決まるわけではなく，修飾基の影響を受けて個々

に異なることが示唆された．アントシアニンのアグリコンはシアニジンとペラル

ゴニジンの他にもデルフィニジン，ペオニジン，ペチュニジン，マルビジンなど

が存在する．また，植物の花弁に蓄積するアントシアニンは糖やアシル基の種類，

数および配位も様々である．これらのアントシアニンの花弁黒色化への寄与度は

個々に異なると考えられる．そのため，今後，様々な植物種に蓄積する様々な種

類のアントシアニンの色を in v i tro で評価し，より L*および C*が低い，すなわち

「花弁黒色化への寄与度の大きいアントシアニン」を特定することが，多様な植

物種において黒色花を作出する上で重要となると考えられた．アントシアニンの

L*は濃度が高くなるにつれて低下するが，C*は一度上昇し，その後低下する．そ

のため，花弁黒色化への寄与度を評価する際は，C*が低下し始める濃度を見極め

91

た上で，それ以上の濃度で L*および C*の比較を行うのが適切だと考えられた．

「高蓄積させる」に関しては，アントシアニンの総蓄積量を増加させることと，

寄与度の高いアントシアニンの割合を増加させるという 2 つのアプローチが考え

られる．ダリアのアントシアニン総蓄積量は他の植物種と比較すると多く，これ

はダリアに黒色系が存在する一つの理由であると考えられた．しかし，アントシ

アニン総蓄積量が少ない植物種では，多くの場合，その他のフラボノイドがある

程度蓄積している．キク（ Chrysanthemum ×morifo l ium）においてはアントシアニ

ン総蓄積量の 2～ 1690 倍のフラボンが蓄積しており（ Brugliera ら， 2013），トル

コギキョウの桃色から紫色の品種ではアントシアニン総蓄積量が生花弁 100 mg

あたり 0.1～ 0.8 mg である一方で，フラボノールは 1.5～ 2.5 mg 蓄積していること

が報告されている（ Uddin ら，2002）．したがって，これらのフラボノイドをアン

トシアニンに変えることができればアントシアニン総蓄積量を増加させることが

可能であると考えられる．よって，ダリアにおける DvFNS の発現抑制のように，

基質競合相手の合成を抑制することは黒色花作出にとって重要な戦略となるだろ

う．また，花弁には通常複数種のアントシアニンが蓄積するため，寄与度の高い

アントシアニンの割合を増やすことでも高蓄積は誘導できると考えられる．この

場合はより少量の総蓄積量で黒色を示すことができると考えられる．

最後に，本研究から推察されたアントシアニン蓄積と花弁黒色化との関係性を

まとめ，第 3-6 図に示した．すべてのアントシアニンは花弁 L*および C*（高濃度

に限る）を下げる効果をもち，花弁黒色化へ寄与するが，その寄与度の大きさは

個々のアントシアニンで異なる．寄与度が異なるアントシアニンを花弁に蓄積す

る場合，各アントシアニンの寄与度は加算される．寄与度の合計値はアントシア

ニン総蓄積量と各アントシアニンの割合により決定され，その値がある一定値（閾

値）を超えた場合にのみ花弁は黒色に見える．また，アントシアニン固有の寄与

度が大きければ大きいほどより少量の蓄積量で閾値を超えることができる．第 3-

6 図に示したこの関係性を考慮し，固有の寄与度，総蓄積量，割合の 3 点に着目

してアントシアニン蓄積を制御することが黒色花作出の基本となると考えられた．

92

Fig. 3-6. The presumable re lat ionship between the accumulat ion of anthocyanins and their contr ibut ion to black f lower coloring. “Anthocyanin A” has re la t ively lower contr ibut ion to b lack f lower coloring with higher L* and C* , whereas “Anthocyanin B” has relat ively higher contr ibut ion with lower L* and C* . When the total contr ibut ion exceeds the hypothet ical threshold, f lower color looks black. Four representat ive cases are shown. (1 ) Not black due to low proport ion of anthocyanin B and re lat ively lower accumulat ion of total anthocyanins. The total contr ibut ion can not exceed the threshold , therefore the f lower color wil l not be black. (2 ) Black due to re lat ively higher accumulat ion of total anthocyanins. The proport ion of anthocyanin A and B is the same as (1 ) . The total contr ibut ion exceed the threshold and the f lower color looks black. (3 ) Black due to high proport ion of anthocyanin B. Total anthocyanin accumulat ion is the same as (1 ) . The total contr ibut ion exceed the threshold and the f lower color looks black. (4 ) Not black due to insuffic ient accumulat ion of total anthocyanins. The proport ion of anthocyanin A and B is the same as (3 ) . The total contr ibut ion can not exceed the threshold and the f lower color wil l not be black.

Threshold forblack flower color

Black

not Blacknot Black

Black

1 2 3 4

1

3

1

33

11

3

Totalanthocyanin

Totalcontribution

Totalanthocyanin

Totalcontribution

Totalanthocyanin

Totalcontribution

Totalanthocyanin

Totalcontribution

AnthocyaninA

AnthocyaninB

Contribution to black flower coloring

Contribution to black flower coloring

93

摘 要

黒という花色は花卉産業においてこれからの利用価値が見込める形質であるも

のの，黒色花は現在限られた植物種にしかみられず，また花弁が黒色になる仕組

みは明らかでない．ダリア（ Dahlia variabi l i s）は高次倍数性のキク科の花卉であ

り，黒色系品種を多数有する．ダリアにおいては， bHLH 転写因子 DvIVS がアン

トシアニンの蓄積量を制御し，シアニック系品種の花色の濃淡を決定するため，

最濃色である黒色は DvIVS の高発現により生じるものと予想されていた．しかし，

DvIVS の発現量では黒色という形質は説明できず，花弁の黒色化には未知の機構

が関与することが考えられた．本研究では，ダリアの黒色系品種，赤紫色系品種

および偶然見出した赤紫色花をつける黒色系‘黒蝶’（‘黒蝶’赤紫色個体）を

用いて解析を行い，花弁の黒色化機構を明らかにした．また，他の植物種での黒

色花作出の可能性を考察した．

第 1 章 黒色系ダリアに特異的な形質および遺伝子発現制御の解析

花色の異なる品種群を用いた花色の数値評価により，黒色系品種は他の色系品

種と比較して花弁 L*が低い品種群であり，さらに C*が低いほど黒味が強いこと

が示された．黒色系 4 品種と赤紫色系 5 品種間において色素蓄積量を比較した結

果，黒色系品種には，①アントシアニン総蓄積量が多い，②シアニジン系アント

シアニンの蓄積量が多い（割合が高い），③フラボンを蓄積していない，という 3

つの特徴があることがわかった．また，赤紫色系品種のなかにはアントシアニン

総蓄積量が黒色系品種よりも多いものがあったことから，アントシアニンの総蓄

積量が多いことのみでは黒色化の条件は満たされないことが示唆された．‘黒蝶’

赤紫色個体はフラボンを蓄積しており，本来の黒色花をつける‘黒蝶’よりもア

ントシアニン蓄積量，特にシアニジン系アントシアニン蓄積量が少なかった．フ

ラボンとアントシアニンは生合成基質が同じであることから，フラボン合成とア

ントシアニン合成との間には競合が存在することが推測された．また，黒色系品

種と赤紫色系品種および‘黒蝶’赤紫色個体間において色素蓄積の様相，花弁表

皮細胞の形状および花弁 pH に大きな違いはなく，これらの形質は花弁黒色化に

寄与していないと考えられた．

アントシアニンおよびフラボン合成に関与する複数の遺伝子の発現量を調査し

た結果，黒色系品種と赤紫色系品種（‘黒蝶’赤紫色個体を含む）間においてフ

ラボン合成酵素遺伝子（ DvFNS）の発現量に顕著な違いがあり，黒色系品種では

ほとんど発現していなかった．黒色系品種でのみ DvFNS の s iRNA が検出され，

‘黒蝶’において small RNA が DvFNS 配列にマッピングされたことから，黒色系

品種では DvFNS の転写後遺伝子サイレンシング（ PTGS）が生じていることが示

94

唆された．したがって，黒色系品種では DvFNS が PTGS によって発現抑制され，

フラボンの合成が生じず，フラボン ―アントシアニン間の競合が消失することで，

アントシアニン，特にシアニジン系アントシアニンの合成・蓄積量が増加した結

果，花弁が黒色を示していると考えられた．

第 2 章 ‘黒蝶’の花弁の赤紫色化を引き起こす原因の解析

‘黒蝶’赤紫色個体は夏場に花弁の一部が黒色になるという現象が観察されこ

とから，この不安定な花色変化の原因が突然変異ではなくウイルス感染である可

能性を考えた．ダリアに感染例のあるウイルスおよびウイロイドの検定を行った

ところ，‘黒蝶’赤紫色個体で新系統のタバコ条斑ウイルス（ TSVd a h l i a）が検出さ

れた．超微小茎頂分裂組織培養により‘黒蝶’赤紫色個体から TSVd a h l i a を除去す

ると本来の黒色花を咲かせたことから， TSVd a h l i a の感染が‘黒蝶’の赤紫色化の

原因であることが示唆された．また，‘黒蝶’ TSVd a h l i a 感染個体では small RNA

が DvFNS 配列にマッピングされなかったことから，TSVd a h l i a は DvFNS の PTGS を

抑制することでフラボン合成を促し，花色を赤紫色に変化させていると考えられ

た． TSVd a h l i a を他の黒色系 5 品種に接種したところ，すべての品種で‘黒蝶’と

同様にフラボンの蓄積，およびそれに伴うアントシアニン，特にシアニジン系ア

ントシアニンの減少がみられた．この色素蓄積の変化は TSVd a h l i a により DvFNS の

PTGS が抑制されたことに起因するものであった． 4 品種は TSVd a h l i a の感染によ

り‘黒蝶’と同じく赤紫色に変化したが，最も黒味の強い‘フィダルゴブラッキ

ー’は多少花色が変化したのみでなおも黒色を示した．各品種の TSVd a h l i a 感染個

体のアントシアニン総蓄積量は同程度であったが，‘フィダルゴブラッキー’の

TSVd a h l i a 感染個体では他の品種と比較してシアニジン系アントシアニンの割合が

極めて高かった．以上のことから， DvFNS の PTGS が生じずフラボンを蓄積して

も，シアニジン系アントシアニンを高蓄積することができれば，花弁は黒色にな

ることが示唆された．ゆえに，花弁黒色化に最も強く寄与する因子はシアニジン

系アントシアニンの高蓄積であると考えられた．また，この高蓄積は二つの独立

した機構， DvFNS の PTGS および高いシアニジン合成能により誘導され，これら

二つの機構が同時にはたらくことでシアニジン系アントシアニンの蓄積量はさら

に増え，‘フィダルゴブラッキー’のように黒味の強い黒色になることが示唆さ

れた．

第 3 章 ダリア花弁に蓄積する各種アントシアニンの花弁黒色化への寄与度の

評価

ダリア花弁ではシアニジン系アントシアニンがペラルゴニジン系アントシアニ

ンよりも黒色化に強く寄与することが示唆されたため，花弁に蓄積する主なアン

95

トシアニンの色を in v i tro で測定し，花弁黒色化への寄与度を評価した．花弁に

蓄積する主なアントシアニンはペラルゴニジン 3‐マロニルグルコシド‐ 5‐グ

ルコシド（ Pg 3MG5G），シアニジン 3‐マロニルグルコシド‐ 5‐グルコシド（ Cy

3MG5G），ペラルゴニジン 3,5‐ジグルコシド（ Pg 3,5diG）およびシアニジン 3,5‐

ジグルコシド（ Cy 3,5diG）の 4 種であった． 4 種のアントシアニンを‘黒蝶’の

花弁から抽出精製し，花弁の pH に近い pH 5.0 およびアントシアニンが安定して

発色する pH 3.0 において濃度別に測色したところ，いずれの pH でも，特に濃度

が高い場合に，Pg 3MG5G のみが著しく高い L*および C*を示し，他の 3 種のアン

ト シ ア ニ ン と 比 較 し て 花 弁 黒 色 化 へ の 寄 与 度 が 小 さ い こ と が 示 唆 さ れ た ． Cy

3MG5G は Pg 3MG5G よりも顕著に大きい花弁黒色化への寄与度を示したのに対

し，Cy 3,5diG の寄与度は Pg 3,5diG と比較して同等あるいは小さかったことから，

シアニジン系アントシアニンはペラルゴニジン系アントシアニンよりも総じて花

弁黒色化への寄与度が大きいわけではないことが示唆された．黒色系，赤紫色系

および桃色系計 9 品種において，シアニジン系アントシアニンとペラルゴニジン

系アントシアニンの比率は品種によって様々であったが，すべての品種で 3MG5G

型アントシアニンが 3,5diG 型アントシアニンよりも多く，2-8 倍量蓄積していた．

したがって，ダリアにおいては 3MG5G 型アントシアニンが主要蓄積アントシア

ニンであり，Cy 3MG5G の花弁黒色化への寄与度が Pg 3MG5G よりも大きいため，

シアニジン系アントシアニンの高蓄積が花弁の黒色化にとって最も重要な因子と

なることが示唆された．

以上のことから，花弁が黒色になる基本原理は「花弁黒色化への寄与度の大き

いアントシアニンの高蓄積」であることが示唆された．ダリアの黒色系品種の多

くでは， DvFNS の PTGS によりアントシアニン総蓄積量の増加とともに，寄与度

の大きいシアニジン系アントシアニンの割合が増加することで花弁が黒色化して

いることが明らかになった．アントシアニンのアグリコンはシアニジンやペラル

ゴニジン以外にもあり，また，付加する糖やアシル基の種類も多様である．その

ため，他の植物種における黒色花作出のためには，多様なアントシアニンのなか

から花弁黒色化への寄与度がより大きいアントシアニンを見出し，それを高蓄積

させるために合成機構を制御することが有効であると考えられた．

96

Mechanisms Controlling Black Flower Coloring in Dahlia

Ayumi DEGUCHI

Abstract

Black f lower color is a highly at t rac t ive t rai t in the f lor icul ture industry;

however, only a few species have black f lowers and the mechanisms control l ing black

f lower color ing are largely unknown. The dahl ia species Dahlia variabi l is , which

belongs to Asteraceae, shows substant ial var iat ions in f lower t ra i ts , and has many black

cul t ivars . In cyanic dahl ia cul t ivars , a basic hel ix- loop-hel ix t ranscr ipt ion factor, DvIVS ,

determines f lower color intensi ty through upregulat ing the quanti ty of anthocyanins

accumulated in the petals . Therefore, i t had been presumed that black f lower color

resul ted from a high expression of DvIVS . However, the expression of DvIVS a lone was

insuffic ient to ful ly explain black f lower color ing, suggest ing the presence of other

novel control l ing mechanisms. In this s tudy, the mechanisms control l ing black f lower

color ing were elucidated through comparison analyses between black and purple dahl ia

cul t ivars and purple f lowering plants of a black cul t ivar ‘Kokucho’ [ ‘Kokucho’

(purple)] which I found for tui tously. Furthermore, I a lso discussed the possib i l i ty of

creat ing black f lowers in var ious other species .

Chapter 1

A numerical evaluat ion of f lower color indicated that black cul t ivars showed

lower petal l ightness (L* ) than other colored cul t ivars , and that lower chroma (C* ) a lso

contr ibuted to the black appearance. A quant i ta t ive analysis of pigments from four black

and f ive purple cul t ivars suggested that b lack cul t ivars have three character is t ics:

re lat ively high accumulat ion of to tal anthocyanins, high accumulat ion (proport ion) of

cyanidin-based anthocyanins, and low accumulat ion of f lavones. Some purple cul t ivars

showed higher accumulat ion of to tal anthocyanins than some black cul t ivars , suggest ing

that high accumulat ion of to tal anthocyanins i s not enough on i ts own to induce black

f lower color. ‘Kokucho’ (purple) accumulated f lavones in quant i t ies s imi lar to purple

cul t ivars , with lower amount of total and cyanidin-based anthocyanins than or igina l

‘Kokucho’ , suggest ing competi t ion between f lavone and anthocyanin biosynthesis . In

regard to the local iza t ion of pigment accumulat ion, s t ructure of petal epidermal cel ls

and petal cel lular pH, no marked difference was found between black and purple f lowers ,

97

suggest ing that these t ra i t s have l i t t le to do with black f lower coloring in dahl ia .

A quant i ta t ive expression analysis of the genes involved in f lavone and

anthocyanin biosynthesis revealed low expression of f lavone synthase II (DvFNS) in al l

black cul t ivars . ‘Kokucho’ (purple) showed a cer tain level of DvFNS expression similar

to purple cul t ivars . Small - interfer ing RNA of DvFNS was detected only in black

cul t ivars . Small RNAs in or iginal ‘Kokucho’ were mapped onto the DvFNS genome

sequence. These suggests that post- t ranscr ipt ional gene si lencing (PTGS) of DvFNS

occurred in black cul t ivars . Therefore, i t was considered that the suppression of DvFNS

due to PTGS abol ishes the competi t ion between f lavone and anthocyanin biosynthesis ,

leading to higher accumulat ion of total and cyanidin-based anthocyanins, and the

resul tant black f lower color ing in dahl ias .

Chapter 2

‘Kokucho’ (purple) sometimes produces mosaic-colored f lowers with black

par ts in purple petals . This suggests the possibi l i ty that the change in f lower color i s

not induced by a mutat ion but by a virus infect ion. The detect ion of vi ruses and viroids

that have previously been reported to infect dahl ias revealed that ‘Kokucho’ (purple)

was infected with a new st rain of the tobacco st reak vi rus (TSVd a h l i a ) . When TSVd a h l i a

was el iminated f rom ‘Kokucho’ (purple) through leaf pr imordia-free shoot apical

meris tem cul ture, the resul t ing f lowers were black. Therefore, i t i s suggested that the

infect ion with TSVd a h l i a was the cause of the change in f lower color f rom black to purple

in ‘Kokucho’ . ‘Kokucho’ infected with TSVd a h l i a showed signif icant ly lower quant i t ies

of small RNAs mapping onto the DvFNS genome sequence than or iginal ‘Kokucho’.

From these resul ts , i t i s suggested that TSV d a h l i a encodes a s i lencing suppressor and

induces the change in f lower color through the suppression of DvFNS PTGS, fol lowed

by a change in pigment accumulat ion.

Graf t inoculat ion of TSVd a h l i a in to f ive o ther b lack cul t ivars induced an increase

in f lavones and a decrease in anthocyanins, par t icular ly cyanidin-based anthocyanins.

This change of p igment accumulat ion resul ted f rom the suppression of DvFNS PTGS.

In four of the f ive cul t ivars , f lower color changed from black to purple due to the

infect ion with TSVd a h l i a , s imilar to that found in ‘Kokucho’. On the other hand, in

‘Fidalgo Blacky’ , a very deep black cul t ivar, f lower color remained black. TSVd a h l i a -

infected plants of ‘Fidalgo Blacky’ had a higher proport ion of cyanidin-based

anthocyanins than those of other cul t ivars . These resul ts demonstrated that high

accumulat ion of cyanidin-based anthocyanins can induce black f lower color ing, even i f

the PTGS of DvFNS and consequent low flavone accumulat ion do not occur. Therefore,

98

i t was considered that high accumulat ion of cyanidin-based anthocyanins i s the most

important factor for black f lower color ing in dahl ia . Moreover, i t i s proposed that there

are two different mechanisms that induce high accumulat ion of cyanidin-based

anthocyanins: a DvFNS PTGS-dependent mechanism, and an independent mechanism

al lowing high cyanidin biosynthesis . I f both mechanisms occur simultaneously, f lower

color wil l be blacker than when only one mechanism is act ive.

Chapter 3

To examine the possibi l i ty that cyanidin-based anthocyanins lower petal L* and

C* in dahl ias , and contr ibute more to the black f lower color ing than pelargonidin-based

anthocyanins, a color evaluat ion of the anthocyanins accumulat ing in dahl ia petals was

performed. Four anthocyanins, pe largonidin 3,5-diglucoside (Pg 3,5diG); cyanidin 3,5-

diglucoside (Cy 3,5diG); pelargonidin 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside (Pg

3MG5G); and cyanidin 3-(6 ' ' -malonylglucoside)-5-glucoside (Cy 3MG5G) were the

main accumulates in dahl ia peta ls . These anthocyanins were puri f ied f rom petals o f

‘Kokucho’ and their colors were evaluated in v i tro at var ious concentrat ions. At pH 5.0,

which is approximately the same pH as dahl ia petals , and at pH 3.0 , a t which

anthocyanins are relat ively s table , the L* and C* of Pg 3MG5G were much higher than

those of the other three anthocyanins, par t icular ly a t h igher concentrat ion. Therefore,

i t i s suggested that of the four anthocyanins, Pg 3MG5G had the lowest contr ibut ion to

lowering petal L* and C* , namely black f lower coloring. Whereas Cy 3MG5G had a

higher contr ibut ion to black f lower color ing than Pg 3MG5G, Cy 3,5diG had a s imilar

or lower contr ibut ion than Pg 3,5diG. This suggests that the difference in the

contr ibut ion between cyanidin-based and pelargonidin-based anthocyanins depended on

the malonylat ion. The proport ion of cyanidin-based anthocyanins var ied among the

cul t ivars , whereas the amounts of the 3MG5G-type anthocyanins were 2–8 t imes higher

than those of the 3,5diG-type anthocyanins in al l nine cul t ivars . Considering these

resul ts , i t i s suggested that because 3MG5G-type anthocyanins predominant ly

accumulate in petals , and Cy 3MG5G has a s ignif icant ly higher contr ibut ion to lowering

L* and C* than Pg 3MG5G, the high accumulat ion of Cy-based anthocyanins i s the most

important factor for the black f lower color ing in dahl ias .

In this s tudy, i t was revealed that the fundamental mechanism control l ing black

f lower coloring was high accumulat ion of the anthocyanin, which has high contr ibut ion

to black f lower color ing. In most black dahl ia cul t ivars , black f lower coloring is

induced by PTGS of DvFNS resul t ing in high accumulat ion of total anthocyanins and

99

high proport ion of cyanidin-based anthocyanins , which have a higher contr ibut ion to

black f lower color ing than pelargonidin-based ones in dahl ia . The contr ibut ion of each

anthocyanin to black f lower color ing may depend on the s t ructure , such as the type of

aglycone, sugar or acyl moiet ies . Therefore , the eff ic ient approach for creat ing black

f lowers in var ious species may be to f ind an anthocyanin which has the high

contr ibut ion to black f lower color ing, and to induce high accumulat ion of the

anthocyanin in petals .

100

謝 辞

本論文をまとめるにあたり，京都大学大学院農学研究科教授 土井元章博士に

は懇切丁寧なご指導とご校閲を賜りました．また，同教授 奥本 裕博士，同准

教授 田尾龍太郎博士にもご検閲を賜りました．ここに深く感謝の意を表します．

研究計画や実験の遂行にあたり，同准教授 細川宗孝博士にご指導とご助言を

賜りました．また，同助教 大野 翔博士には終始ご指導とご助言を賜りました．

同助教 水田洋一博士には多くの助言を賜りました．岩手大学農学部准教授 立

澤文見博士には色素解析全般のご指導およびご協力をいただきました．基礎生物

学研究所助教 星野 敦博士には遺伝子解析手法をご指導いただきました．福田

農園 福田遵裕氏および奈良県農業総合センター 仲 照史氏には植物材料をご

提供いただきました．ここに厚く御礼を申し上げます．

本研究を遂行できたのは，ともに研究生活を過ごした京都大学蔬菜花卉園芸学

研究室の方々の支えと激励のおかげでもあります．また，進学を決断した日から

今日に至るまで応援し続けてくれた家族にも心から感謝の意を表します．

101

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