Tesis Pais - Final

7/21/2019 Tesis Pais - Final

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INSTITUTO SUPERIOR POLITCNICO JOS ANTONIO ECHEVERRA

FACULTAD DE INGENIERA QUMICA

Establecimiento del Espacio de Diseo del Proceso

Fermentativo de Obtencin de la Insulina

Recombinante en Pichia pastoris

Tesis en opcin al ttulo de Doctor en Ciencias Tcnicas

Por

Autor: M. C. Jos Manuel Pas Chanfrau

Centro de Inmunologa Molecular

Tutores: Dra. C. Mercedes Rodrguez Edreira

Instituto Superior Politcnico Jos Antonio Echeverra

Dr. C. Rolando Pez Meireles

Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa

La Habana

Diciembre 2010


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ii

AGRADECIMIENTOS

Deseo agradecer en primer lugar a la Direccin del Centro de Ingeniera Gentica y

Biotecnologa (CIGB) y en especial a su Director General el Dr. Luis S. Herrera Martnez, por

haber accedido amablemente a que se presentara este trabajo. Tambin, deseo expresar mi

especial gratitud a los compaeros, Dr. Eduardo Martnez Daz y M. C. Jorge Valds

Hernndez, ambos de la Direccin de Desarrollo del CIGB, en cuyas reas se llevaron a cabo

la totalidad de los experimentos, y sin cuyas ideas y tiles discusiones no hubiese sido posible

la culminacin de esta tesis. Deseo tambin decir que todos los resultados, parciales o

conclusivos de este trabajo, pertenecen al Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa.

Agradezco a mis tutores el Dr. C. Rolando Pez Meirelles (CIGB) y, muy especialmente, a la

Dra. C. Mercedes Rodrguez Edreira (ISPJAE), sus enseanzas, condescendencia e infinita

paciencia, a la hora de trasmitirme sus experiencias y conocimientos. Gracias a la profesora

Mercedes por haberme guiado tan certeramente en este trabajo.

Muchas gracias a la Dra. C. Ileana Pereda Reyes (CIPRO, ISPJAE) por haberme dado el impulso

inicial y estimulado constantemente en la culminacin de este proceso. Mi agradecimiento

sincero a los oponentes de la pre-defensa el Dr. C. Fidel Domenech Lpez (ICIDCA) y

fundamentalmente al Dr. C. Arturo Toledo Rivero (CIM), por la detallada revisin realizada al

documento original y las sugerencias dadas, que mejoraron notablemente este trabajo.

Muchas gracias tambin a los compaeros de mi colectivo del Centro de Inmunologa

Molecular (CIM); entre otros, al Dr. C. Ernesto Chico, M. C. Adolfo Castillo, Dra. C. Lizette

Fondevilla, Dr. C. David Curbelo, Dr. C. Daniel Amaro, M. C. Pablo Vitn, Ing. Katia Zorrilla y

M. C. Rosario Martnez, por sus consejos, apoyo y sugerencias.

A mi compaera la Dra. C. Carmen Menndez Rodrguez (CIGB), por las sugerencias tcnicas

realizadas al trabajo y por ayudarme, en todo momento, a lo largo de estos meses. Y a toda

mi familia por haberme apoyado incondicionalmente en estas ltimas semanas.


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iii

SNTESIS

La diabetes es causada por dficits de insulina, hormona secretada en el pncreas. A partir de

un clon de mini-proinsulina de Pichia pastoris (clon 27), se determin los espacios de diseo

(DS) y un espacio de operacin (OS) de la fermentacin a escala de laboratorio que da

solucin a la protelisis del producto. Un anlisis de riesgo permiti encontrar los parmetros

crticos del proceso (CPP) fermentativo que determinan el atributo crtico de calidad de la

mini-proinsulina (sus correctas estructuras primaria, secundaria y parcialmente la terciaria).

Los CPPencontrados fueron: el medio de cultivo, pH, temperatura y la fuente de nitrgeno.

Del anlisis surgi el medio MBSM, ms barato que el resto. Con 12 experimentos se

determin el DS, que estuvo formado por medios de cultivo: comerciales, MBSM;

suplementados con extracto de levadura, hidrolizado de casena o (NH4)2SO4; pH: 3,8-6,3 y

temperatura: 20-28C. El OSpropuesto consta de: MBSM con EDTA y (NH4)2SO4; pH=0,7t(C)-

9,1 y 20-22C. Con tres plantas de 2 millones bulbosao -1 cada una, se asegurara la

demanda del 2025 de los pacientes del ALBA a un precio preferencial (US$4,50/bulbo). Con

una inversin de US$146,39 millones se obtendra un VANUS$6,36 millones y un

TIR=10,85% al final del proyecto (15 aos).


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TABLA DE CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS ................................................................................... II

SNTESIS ................................................................................................. III

TABLA DE CONTENIDO ............................................................................... IV

LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................... VII

INTRODUCCIN .......................................................................................... 1

CAPTULO 1. REVISIN BIBLIOGRFICA ...................................................... 12

1.1 La Insulina Humana .................................................................... 12

1.1.1 La Diabetes Mellitus ........................................................ 12

1.1.2 Estructura de la Insulina Humana ..................................... 15

1.1.3 Vas para la Obtencin de la Insulina ................................. 16

1.1.4 Produccin de la Insulina Humana Recombinante ................ 18

1.2 Parmetros de la Fermentacin para la Expresin de Protenas

Heterlogas en Pichia pastoris........................................................... 21

1.2.1 Pichia pastoris como Sistema de Expresin ........................ 21

1.2.2 Medio de Cultivo Qumicamente Definido ........................... 22

1.2.3 Condiciones de Cultivo .................................................... 23

1.3 Entorno Regulatorio .................................................................... 26

1.3.1 Atributos de Calidad de la Insulina .................................... 35

1.4 Factibilidad Econmica del Proyecto .............................................. 38

CAPTULO 2. MATERIALES Y MTODOS ........................................................ 41


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v

2.1 Microorganismo empleado ........................................................... 41

2.2 Medios y Condiciones de Cultivo ................................................... 41

2.3 Determinaciones Analticas .......................................................... 45

2.3.1 Crecimiento Celular ......................................................... 45

2.3.2 Concentracin de Protenas .............................................. 45

2.3.3 Actividad Proteoltica en el sobrenadante de cultivo ............ 45

2.3.4 Anlisis de la Expresin por Electroforesis en Geles de

Poliacrilamida (Tricina-SDS-PAGE) y Western-Blot ...................... 46

2.3.5 Determinacin de la Concentracin de Mini-proinsulina ........ 47

2.4 Caracterizacin del Monmero de Mini-proinsulina .......................... 47

2.5 Otras Herramientas y Metodologas Empleadas .............................. 48

CAPTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIN .................................................... 50

3.1 Espacios de Diseo y Operacin del Proceso de Fermentacin para la

Obtencin de la Mini-proinsulina en Pichia pastoris............................... 50

3.1.1 Anlisis de Riesgo del Proceso Fermentativo de Obtencin de la

Mini-proinsulina Recombinante en Pichia pastoris........................ 51

3.1.2 Antecedentes con el Clon M44 Productor de la Mini-proinsulina

............................................................................................ 57

3.1.3 Establecimiento del Medio Basal Salino Modificado (MBSM) .. 58

3.1.4 Establecimiento del Espacio del Conocimiento y la Propuesta

de Espacio de Diseo ............................................................... 60

3.1.5 Experimentos en los Fermentadores de 2,5 L ..................... 64

3.1.6 Experimentos en el Fermentador de 14 L ........................... 80

3.2 Caracterizacin de la Mini-proinsulina ........................................ 84

3.2.1 Anlisis por Tricina-SDS-PAGE y Western-blot .................... 84


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vi

3.2.2 Repurificacin de las Muestras Colectadas de los Experimentos

de Fermentacin ..................................................................... 86

3.2.3 Conversin Enzimtica .................................................... 87

3.2.4 Caracterizacin por Espectrometra de Masas ..................... 88

3.3 Anlisis de Factibilidad Econmica de la Produccin de Insulina

Recombinante en los pases de La Alianza Bolivariana para las Amricas

(ALBA) ............................................................................................ 92

3.3.1 Algunas Consideraciones sobre el Mercado Mundial, Regional y

Nacional de la Insulina Humana ................................................ 92

3.3.2 Descripcin y Dimensionamiento de los Equipos del Proceso

Propuesto .............................................................................. 97

3.3.3 Anlisis Econmico ........................................................ 106

CONCLUSIONES .......................................................................................... I

RECOMENDACIONES .................................................................................. II

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................. - 1 -

AUTOBIBLIOGRAFA RELACIONADA CON LA TESIS .................................... - 25 -

ANEXOS ............................................................................................... - 26 -

Tablas ........................................................................................ - 26 -

Figuras ....................................................................................... - 29 -

Fotos .......................................................................................... - 36 -


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LISTA DE ABREVIATURAS

3-D Tres dimensiones

AcN Acetonitrilo

ADA Asociacin Americana de Diabticos (de sus siglas en ingls: American

Diabetic Association)

ADN cido Desoxirribonucleico

Ala Alanina

ALBA Alianza Bolivariana para las Amricas

ANOVA Anlisis de Varianza (del ingls:Analysis of Variance)

AOX1 Gen codificante para la enzima Alcohol OXidasa 1 de Pichia pastoris

AP Actividad Proteoltica

Arg Arginina

ARM Gastos anuales en materias primas (en ingls: Annual Raw Material),

US$ao-1

ARN cido Ribonucleico

AS Ventas anuales (en ingls:Annual Sale), US$ao-1

Asp cido asprtico

ATE Gastos totales anuales (en ingls:Annual Total Expenses), US$ao-1

ATG Acrnimo de Antigua y Barbudas, segn la ISO 3166-1 alpha 3

bbo Bulbo de 10 mL con 100 UImL-1

BOL Acrnimo de Bolivia, segn la ISO 3166-1 alpha 3

BSM Medio Basal Salino (de sus siglas en ingls: Basal Saline Medium)

BT Banco de Trabajo

CE Costo del Equipamiento, US$

CEPCI ndice de Costo de Plantas de Ingeniera Qumica (del ingls: Chemical


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Engineering Plant Cost Index)

CFC Capital fijo de inversin, US$

CIGB Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa

CIM Centro de Inmunologa Molecular

CoG Costo unitario de produccin (del ingls: Cost of Goods), US$g-1

US$bbo-1

CpA Carboxipeptidasa A

CpB Carboxipeptidasa B

CPP Parmetro Crtico del Proceso (de sus siglas en ingls: Critical Process

Parameter)

CQA Atributo Crtico de Calidad (de sus siglas en ingls: Critical Quality

Attribute)

CTC Capital total de inversin, US$

CTDP Costo Total Directo de Produccin, US$

CTIP Costo Total Indirecto de Produccin, US$

CTP Costo Total de Produccin, US$

CUB Acrnimo de Cuba, segn la ISO 3166-1 alpha 3

Cys Cistena

D Funcin de Deseabilidad

Da Dalton

DFP Diagrama del Flujo de Proceso

DM Diabetes Mellitus

DMA Acrnimo de Dominica, segn la ISO 3166-1 alpha 3

DMID Diabetes Mellitus Insulino-Dependiente

DMNID Diabetes Mellitus No Insulino-Dependiente

DO Oxgeno Disuelto (del ingls: Dissolved Oxygen), %


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ix

DoE Diseo de Experimentos (de sus siglas en ingls: Design of Experiments)

DS Espacio de Diseo (de sus siglas en ingls: Design Space)

EBA Cromatografa de cama expandida (del ingls: Expanded Bed-Adsorption)

ECU Acrnimo de Ecuador, segn la ISO 3166-1 alpha 3

EDTA cido etileno-diamino tetra-actico (de sus siglas en ingls: Ethylene

Diamine Tetra-acetic Acid)

EM Espectrmetro de masas

EMEA Agencia Europea de Medicamentos (de sus siglas en ingls: European

MEdicines Agency)

fD Factor de descuento

FMEA Anlisis Modal de Fallas y Efectos (de sus siglas en ingls: Failure Mode

and Effect Analysis)

GDP Buenas Prcticas de Desarrollo (del ingls: Good Developing Practices)

GEP Buenas Prcticas de Ingeniera (del ingls: Good Engineering Practices)

GF Cromatografa de Exclusin Molecular (del ingls: Gel Filtration

Chromatography)

GLP Buenas Prcticas de Laboratorio (del ingls: Good Laboratory Practices)

Glu cido glutmico

Gly Glycina

HC Hidrolizado de casena

HCP Protenas del Hospedero (de sus siglas en ingls: Host Cell Proteins)

His Histidina

HPLC Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (de sus siglas en ingls: High-

Performance Liquid Chromatography)

I+D Investigacin & Desarrollo

IC Intervalo de confianza


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x

ICH Congreso Mundial de Armonizacin (de sus siglas en ingls: International

Conference of Harmonization)

IDF Federacin Internacional de la Diabetes (del ingls: International

Diabetes Federation)

IEC Cromatografa de intercambio inico (del ingls: Ion Exchange

Chromatography)

IFA Ingrediente Farmacutico Activo

IH Insulina Humana

IH-r Insulina Humana recombinante

Ile Isoleucina

INEN Instituto Nacional de Endocrinologa de Cuba

IQ Calificacin de la Instalacin (del ingls: Installation Qualification)

L Litro (1 L = 10-3m3)

Leu Leucina

LS Litro de sobrenadante de cultivo

Lys Lisina

MBSM Medio Basal Salino Modificado

MM Millones

MPI Mini-proinsulina

MUI Mega (Un milln de) Unidades Internacionales de insulina humana

(1 UI = 0,0347 mg IH, por tanto: 1 MUI = 34,7 g IH)

Mut+ Fenotipo de mayor velocidad de consumo del metanol (del ingls:

Methanol utilization plus)

Muts Fenotipo de menor velocidad de consumo del metanol (del ingls:

Methanol utilization slow)

NIC Acrnimo de Nicaragua, segn la ISO 3166-1 alpha 3


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xi

OMS Organizacin Mundial de la Salud

OQ Calificacin de la Operacin (del ingls: Operation Qualification)

OS Espacio de Operacin (de sus siglas en ingls: Operational Space)

PAT Tecnologa Analtica del Proceso (de sus siglas en ingls: Process

Analytical Technology)

Phe Fenilalanina

pI Punto isoelctrico

PQ Calificacin del Procedimiento (del ingls: Procedural Qualification)

Pro Prolina

PT Productividad total, g MPIh-1

PTM1 Suplemento de sales trazas para los medios de Pichia pastoris

PU Precio Unitario, US$g-1

PVDF Difloruro de polivinilo (del ingls: Polyvinyl difluoride)

QbD Calidad por Diseo (de sus siglas en ingls: Quality by Design)

QRM Gestin del Riesgo en Calidad (de sus siglas en ingls: Quality Risk

Management)

RP-HPLC HPLC de fase reversa (del ingls: Reversed Phase HPLC)

RPN Nmero de prioridad de riesgo (del ingls: Risk Priority Number)

RSM Metodologa de la Superficie de Respuesta (del ingls: Response Surface

Methodology)

S, O, ND Severidad, Ocurrencia y No-Detectabilidad

SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (de

sus siglas en ingls: Sodium Dodecyl-Sulphate PolyAcrylamide Gel

Electrophoresis)

Ser Serina

TCA cido tricloroactico (del ingls: Trichloracetic Acid)


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xii

TFA cido trifluoroactico (del ingls: Trifluoroacetic Acid)

Thr Treonina

TIR Tasa Interna de Retorno, %

Tris Tris (hidroximetil)-metilamina

Tyr Tirosina

UF Ultrafiltracin

USFDA Agencia del gobierno estadounidense para los alimentos y

medicamentos (de sus siglas en ingls: United State Food and Drug

Administration)

Val Valina

VAN Valor Actual Neto, US$

VCT Acrnimo de San Vicente y Granadinas, segn la ISO 3166-1 alpha 3

VEN Acrnimo de Venezuela, segn la ISO 3166-1 alpha 3

VIF Factor de inflacin de la varianza (del ingls: Variance Inflation Factor)

WFI Agua para inyeccin (del ingls: Water for Injection)

YE Extracto de levadura (de sus siglas en ingls: Yeast Extract)

YNB Medio YNB (del ingls: Yeast Nitrogen Base)

YPD Medio de cultivo YPD (de sus siglas en ingls: Yeast Peptone Dextrose)

YPX Rendimiento producto-biomasa, g MPIg biomasa-1

YXS Rendimiento biomasa-sustrato, g biomasag fte. carbono-1


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1

INTRODUCCIN

La insulina humana (IH) es una hormona globular de 51 aminocidos, compuesta por dos

cadenas polipeptdicas independientes Ay B, conectadas entre s por dos puentes disulfuro

[1]. Esta hormona se produce en las clulas de los islotes de Langerhans en el pncreas y es

vital para los mecanismos de asimilacin de la glucosa.

Una ausencia total o niveles deficitarios de ella en el torrente sanguneo produce

hiperglicemia y diferentes desrdenes metablicos asociados a ella, conocidos como

diabetes mellitus (DM) [2].

Para el ao 2003, en el mundo existan ms de 150 millones de diabticos, pero este nmero

est por debajo del valor real, porque por cada caso diagnosticado en los pases del primer

mundo, se estima que existe al menos uno no diagnosticado y este valor asciende a 8 en los

pases del llamado tercer mundo [1, 3]. Se espera que en los prximos 25 aos el nmero de

personas con la enfermedad se duplique y se alcancen cifras de ms de 300 millones de

pacientes [1]. Un estudio realizado por la Federacin Internacional de la Diabetes ( IDF) del

2009, pronosticaba que el nmero de pacientes con DM para el 2010 y el 2030, sera de

284,6 y 438,4 millones, respectivamente [4].

En los pacientes con DM tipo 1 o diabticos insulino-dependientes (que representan

aproximadamente el 7% de todos los diabticos), existe una ausencia total o casi total de la

produccin de esta hormona, la cual debe ser suministrada por va exgena al paciente so

pena de poner en peligro su vida. En la DM de tipo 2, a pesar de que los niveles de la

hormona son insuficientes el padecimiento puede ser controlado con un adecuado rgimen

alimentario y de vida, sin la necesidad de suministrar la hormona de manera directa; aunque

algunos de estos pacientes tambin requieren de este frmaco.

La insulina fue usada por primera vez para el tratamiento de un paciente diabtico en enero

de 1922 [5]. Posteriormente comenz a ser extrada en gran escala a partir de pncreas de


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2

vacas y cerdos, expandindose sus fuentes de suministro considerablemente [2]. Entre 100 y

150 mg de insulina pueden ser obtenidos a partir de 1 kg de pncreas porcino [6], y de

acuerdo a los niveles actuales y perspectivos sera muy difcil satisfacer la demanda por esta

va [1]. Adicionalmente, la insulina de origen animal tiene otras desventajas. sta no es

idntica a la humana, pudiendo provocar efectos colaterales en algunos pacientes. Adems,

los procedimientos de extraccin son largos y difciles y los contaminantes virales,

potencialmente peligrosos, no siempre pueden ser eliminados con seguridad.

Con el advenimiento a inicio de los aos 70 del siglo pasado de la tecnologa del ADN

recombinante se abrieron nuevas perspectivas para el tratamiento de la enfermedad. A nivel

industrial la IH recombinante se produce fundamentalmente empleando Escherichia coli [7] y

Saccharomyces cerevisiae[8] como sistemas hospederos.

Ms recientemente ha sido expresada y sintetizada en la levadura metilotrfica Pichia

pastoris [9-11] la cual presenta algunas ventajas sobre los sistemas anteriores y que ha sido

utilizada con xito para la expresin de protenas heterlogas de diversos orgenes [12-15].

En el mundo existen unas pocas compaas que producen insulina recombinante, entre ellas

la Eli Lilly & Co.(Indianpolis, IN, EEUU) y la Novo Nordisk A/K(Bagsvaerd, Dinamarca). Entre

ambas poseen ms del 80% del mercado mundial, con ventas anuales que superan los

US$ 4 mil millones.

Pese a la ventaja que ofrece la insulina humana recombinante, razones bsicamente de costo

y disponibilidad hacen que alrededor del 30% de la insulina que se consume en el mundo sea

an de origen natural, bsicamente insulina porcina (17%), vacuna (8%) o mezclas de insulina

vacuna-porcina (5%) [16]. El precio de la insulina natural es de 20 a 60% menor que el precio

de la insulina humana recombinante [17], por lo que su consumo se reparte, principalmente,

entre los pases en vas de desarrollo [16, 18]. Por razones similares, se continan empleando


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3

en muchas naciones las presentaciones de 40 UImL-1, junto a la ms difundida y

recomendada presentacin en bulbos de 10 mL con 100 UImL-1[17].

Segn una encuesta del 2002, realizada por la Federacin Internacional de la Diabetes ( IDF)

en 74 pases de todos los continentes, mostr que, en 30 de ellos las personas con diabetes

no contaban con un acceso ininterrumpido a la insulina todo el tiempo [18]. Las principales

razones fueron los costos, la falta de disponibilidad en la regin, los problemas de transporte,

la falta de adecuacin de los suministros o la mala calidad de la insulina [18]. El problema se

agravaba por el hecho de que de los 74 pases, 31 gravaban la insulina en porcentajes que

iban del 1% al 90%, a pesar de que la OMS ha calificado a la insulina como medicamento

esencial, con la peticin explcita a los gobiernos de que no incrementen sus costos con tasas

impositivas [16, 17, 19].

A todo esto se suman las dificultades que se presentan con los suministros diabticos, como:

jeringas desechables, equipos de diagnstico, aseguramientos en la cadena de almacenaje y

distribucin, etc., que encarecen notablemente el tratamiento de la enfermedad [17, 19].

Segn los datos brindados al IDF por una importante firma de estudios de mercado ( IMS

Health, Norwalk, CT, EEUU) y que cubra alrededor del 80% de la poblacin mundial, en el

2005, slo en las regiones desarrolladas de Europa y Norteamrica se garantizaba

completamente la cobertura de insulina [18]. Un estudio desarrollado en 2006*

indicaba que

la situacin no haba mejorado: tan slo el 20% de los pases encuestados eran capaces de

garantizar un acceso constante a la insulina [20].

A 89 aos de su descubrimiento, miles de personas con diabetes tipo 1 y 2 mueren cada ao

en los pases en vas de desarrollo, ya sea por falta de acceso a la insulina o por no poder

pagarla. Muchas ms personas con diabetes tipo 2 se veran enormemente beneficiadas del

uso de la insulina, si fuese accesible para ellas [18].

*Vea encuesta en el sitio:www.idf.org/insulin
http://www.idf.org/insulinhttp://www.idf.org/insulinhttp://www.idf.org/insulinhttp://www.idf.org/insulin


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Por otro lado, a pesar de que las principales patentes de proceso asociadas a la tecnologa de

produccin de insulina ya expiraron, lo que convierte a la insulina en un biosimilar, el know-

howasociado a su produccin y formulacin contina en manos de unas pocas compaas en

el mundo, por lo que ha tenido poco impacto el trmino del perodo de proteccin de las

patentes sobre los niveles de produccin y los precios de la insulina [18, 21].

Slo con la aparicin de nuevos productores en el mercado se pudiera contribuir a la

disminucin real de los precios de este medicamento y a garantizar su suministro

establemente en todo el mundo. Con ello tambin se contribuira a evitar la situacin actual,

en donde los ricos con diabetes ven mejorar y aumentar sus expectativas y calidad de vida,

mientras que muchos pobres mueren porque no pueden costearse el tratamiento [18].

En Cuba, segn un estudio realizado, entre los aos 1990-94, en nios y adolescentes

menores de 14 aos, exista entre ellos, una prevalencia de la DM tipo 1 de 2,6 0,3

pacientes por cada 100 000 [22].

En cuanto a la poblacin adulta, en sendos estudios realizados entre las aglomeraciones

urbanas de las ciudades de La Habana y Santiago de Cuba, en los aos 1998 y 1987, y entre

una poblacin de ms de 25 y 15 aos, respectivamente, arroj una prevalencia de 11,8%

[23] y 4.6% [24] de la poblacin.

Segn, se conoce, en la actualidad, unos 34 kg de insulina por ao, son necesarios para

satisfacer la demanda nacional. No obstante, los crecimientos que se pronostican para el

mercado cubano, pudieran colocar esta demanda en un futuro no muy lejano en los 50 kg.

Por todo lo expuesto anteriormente, para Cuba, pas bloqueado por la superpotencia, sera

de sumo inters contar con una tecnologa para producir este frmaco, que permitiera

asegurar, bajo cualquier circunstancia, darle tratamiento a sus pacientes diabticos.


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En el marco de la Alianza Bolivariana para Las Amricas (ALBA), mecanismo de integracin

basado en la complementariedad de las economas y que hace nfasis en el desarrollo social

y solidario de sus miembros, pudiera insertarse adecuadamente este proyecto, e intentar

buscar una solucin conjunta a las necesidades para los millones de diabticos, que viven en

los pases del ALBA, que tienen dificultades para acceder a este vital frmaco.

En el Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB, La Habana, Cuba), se ha estado

trabajando durante los ltimos aos en la obtencin de clones capaces de producir las

cantidades necesarias del precursor de la insulina, que permita desarrollar una tecnologa

autnoma para producir esta hormona.

El sistema de expresin en la levadura metilotrfica Pichia pastorisdesarrollado a mediados

de la dcada de 1980, est basado en el uso del promotor AOX1, y permiti un incremento

sustancial en los rendimientos de protenas con respecto a los obtenidos en

Saccharomyces cerevisiae [15, 25, 26]. Su desventaja fundamental consiste en la intensa

actividad proteoltica observada en los sobrenadantes de cultivos de alta densidad, que lleva

a una limitacin importante en su capacidad de acumular de forma intacta la protena de

inters [13, 27]. Se han ensayado con xitos parciales, diversas estrategias para reducir la

actividad proteoltica contra las protenas de inters. Estos mtodos se han basado en la

manipulacin de las condiciones de fermentacin, como la adicin de fuentes de nitrgeno

orgnico [15, 28, 29], el cultivo a valores de pH extremos [30-32], el crecimiento a bajas

temperaturas [33], as como el uso de cepas de P. pastorismutantes de proteasas vacuolares

[34], o combinando varias de las estrategias anteriores [35].

Los primeros precursores de insulina expresados en S. cerevisiae, del tipo B1-30-K-R-A1-21, eran

convertidos a insulina por procesamiento secuencial con las enzimas Tripsina y

Carboxipeptidasa B (CpB) [36, 37]. Posteriormente se implement un procedimiento ms

Fundada en La Habana el 14 de diciembre del 2004, y la forman en la actualidad ocho estados: Antigua yBarbuda, Bolivia, Cuba, Dominica, Ecuador, Nicaragua, San Vicente y Granadinas, y Venezuela.


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sencillo de obtencin de insulina por transpeptidacin trptica a partir del precursor

B1-29-A-A-K-A, proceso con una mayor complejidad tecnolgica, pero que elimina la

necesidad de emplear la CpB [38].

En un trabajo previo se demostr que era posible de expresar la mini-proinsulina (MPI) de

estructura B1-30-K-R-A1-21 en la levadura metilotrfica P. pastorisy que su expresin poda ser

incrementada aumentando el nmero de copias del gen por retransformaciones sucesivas

[11]. Sin embargo, se observ en dicho trabajo que la expresin se vea afectada por la

intensa actividad proteoltica del hospedero, lo cual afecta la eficiencia del proceso

fermentativo [11].

PROBLEMA DE INVESTIGACIN:

Cuba no cuenta con una tecnologa autctona para la obtencin de la insulina humana lo que

constituye el problema de investigacinque debe ser resuelto. La etapa de fermentacin es

una de las etapas principales de la tecnologa para la produccin de insulina. En dicha etapa

es necesario encontrar las condiciones que permitan evitar la accin de las proteasas del

sistema hospedero, con lo que se lograra establecer sus condiciones ptimas de operacin.

OBJETO DE LA INVESTIGACIN:

Obtencin de la mini-proinsulina, precursor de la insulina humana recombinante y primer

paso para la produccin de la insulina humana, requerida para el tratamiento de la Diabetes

Mellitus tipo I

CAMPO DE INVESTIGACIN:

Obtencin de frmacos por va de la ingeniera gentica y recombinante

OBJETIVO GENERAL:

Establecer el espacio de diseo y proponer un espacio de operacin del proceso de

fermentacin de Pichia pastoris para obtener la mini-proinsulina que cumpla con los


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atributos crticos de calidad de la insulina a escala de laboratorio, que al ser exitosamente

escalado, permita implementar un proceso comercial y econmicamente viable.

OBJETIVOS ESPECFICOS:

1. Determinar, mediante un Anlisis de Riesgo, los parmetros del proceso de

fermentacin catalogados como crticos en el proceso de obtencin de la mini-

proinsulina

2. Probar la criticidad de los parmetros de fermentacin establecidos a partir del

anlisis de riesgo

3.

Demostrar que la mini-proinsulina expresada en P. pastoris posee la estructuraprimaria, secundaria y parte de su estructura terciaria adecuadas, lo que constituye el

atributo crtico de calidad de la mini-proinsulina, de especial relevancia en la posterior

obtencin del monmero de la insulina

4.

Estimar la Demanda Perspectivade insulina humana en los pases miembros del ALBA

para el 2025

5. Realizar un Anlisis de Pre-factibilidad Econmica de la produccin de la insulina

humana para suministrar la demanda dentro de los pases miembros del ALBA

HIPTESIS PRELIMINAR:

Es posible identificar los Parmetros Crticos y establecer el Espacio de Diseo del proceso

de fermentacin de la mini-proinsulina en Pichia pastoris

, tales que, al garantizar el

Atributo Crtico de Calidad del precursor de la insulina, asegure la integridad de la molcula

y el establecimiento de un proceso econmicamente viable.

MTODOS DE INVESTIGACIN:

Mtodo Hipottico-Deductivo: Se emple para la elaboracin de la hiptesis del

trabajo.

Mtodo Histrico-Lgico: Se emple para el estudio y anlisis crtico de los trabajos

existentes en la literatura especializada, y a partir de dicho anlisis tomar los aspectos

positivos para aplicarlos creadoramente y darle solucin al problema cientfico

planteado.


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Mtodo Analtico-Sinttico: Se emple para descomponer el problema de investigacin

en varios sub-problemas menos complejos que fueron adecuadamente resueltos,

despus de ser estudiados separadamente.

Mtodo de Comparacin-Clasificacin: Se emple en el anlisis de los resultados de los

diseos experimentales, en el anlisis del modelo fermentativo que mejor se adecu a

los datos experimentales y en el anlisis sobre la pertinencia o no de producir en Cuba

la insulina, comparando cada una de las respuestas obtenidas con reportes obtenidos

de la literatura especializada.

Mtodo de la Observacin Cientfica: Se emple para la definicin del problema de

investigacin, plantear la hiptesis preliminar, elaborar los objetivos y el informe de los

resultados.

Mtodo de la Medicin: Se emple para encontrar los valores cualitativos de los

parmetros de operacin del proceso de fermentacin y los atributos de calidad de la

insulina, para lograr posteriormente encontrar los nexos entre estos grupos de

magnitudes, que permitan resaltar su criticidad dentro del proceso fermentativo.

Mtodo Experimental: Se emple para demostrar la hiptesis planteada y dar

cumplimiento al objetivo general del trabajo.

NOVEDAD CIENTFICA:

La novedad cientfica del presente trabajo consiste en que, por primera vez, se logra

controlar la degradacin proteoltica que ejerce la Pichia pastorissobre la mini-proinsulina y

se garantizan los atributos crticos de calidad de la molcula, mediante el empleo de los

recientes lineamientos de la ICHy la aplicacin de los conceptos emanados de la Calidad por

Diseo a la tecnologa de produccin de la Insulina humana recombinante; mediante un

enfoque de anlisis de riesgoy estableciendo el espacios de diseodel procesofermentativo.

ACTUALIDAD DEL TRABAJO:

La actualidad del trabajo est dada por la aplicacin de los lineamientos y directrices

recientes de la ICH para el desarrollo de productos farmacuticos, lo que presupone la

mejora continua del proceso productivo y una conocimiento mayor, tanto de la molcula que

compone el ingrediente farmacutico activo, como del proceso que da lugar a su obtencin.


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IMPACTO CIENTFICO:

El impacto cientfico de la tesis est dado en los resultados alcanzados que permiten la

obtencin de los parmetros requeridos para la implementacin de la fermentacin en la

escala industrial, y con ello el establecimiento de una tecnologa autctona de obtencin de

la insulina humana recombinante.

Adicionalmente, este trabajo pudiera servir como referencia para la expresin de otras

protenas heterlogas en P. pastorissensibles a la degradacin por proteasas.

IMPACTO ECONMICO:

El desarrollo de una tecnologa propia para la obtencin de la insulina humana recombinante

a partir de P. pastoris, permitira sustituir un rengln de importacin nacional (el pas eroga

actualmente ms de US$ 4 millones al ao), a la par que abrira interesantes perspectivas

comerciales, dado el hecho del aumento sostenido de la demanda de este frmaco.

IMPACTO SOCIAL:

El presente trabajo es una contribucin necesaria para lograr contar con una tecnologa

autctona de produccin de la insulina humana, hormona vital en la actualidad para ms de

90 000 cubanos y alrededor de 290 000 ciudadanos que residen en los pases del ALBA y que

crece, de ao en ao, con una tasa anual de 2,50,5%. Contar con esta tecnologa

contribuira a la independencia tecnolgicade nuestro pas y del ALBA, permitira garantizar

este vital frmaco bajo cualquier escenario por desfavorable que fuese y sera una

contribucin de Cuba al tratamiento de esta pandemia moderna.

Los resultados de este trabajo han sido reflejados en tres publicaciones internacionales del

campo de la biotecnologa, una tesis de pregrado y dos tesis de maestra, y se han

presentado trabajos en cuatro eventos internacionales. El trabajo de desarrollo de un

proceso de obtencin de insulina humana ha sido premiado como Logro Institucional del

CIGBen los aos 2003 y 2005.


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Establecimiento del Espacio de Diseo del

Proceso Fermentativo de Obtencin de la

Insulina Recombinante en Pichia pastoris


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CAPTULO 1

REVISIN BIBLIOGRFICA


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CAPTULO 1. REVISIN BIBLIOGRFICA

1.1 La Insulina Humana

1.1.1 La Diabetes Mellitus

La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad producida por una alteracin en el

metabolismo de los carbohidratos en la que aparece una cantidad excesiva de azcar en la

sangre y a veces en la orina. Fue por primera vez descrita en un papiro egipcio descubierto

por el egiptlogo y novelista alemn Georg M. Ebers (1837-1898) en una tumba en la

antigua ciudad de Tebas en el ao 1862. La antigedad del documento se ubica entre los

aos 3 000 y 1 500 antes de nuestra era [39].

La DM es una enfermedad del sistema endocrino, causada por la reduccin del nivel de

insulina secretada por el pncreas, aunque tambin se puede desarrollar, en caso de una

pobre respuesta de los tejidos a la insulina [2]. La insulina juega un papel crucial en la

regulacin de la concentracin de glucosa en la sangre. Hasta el presente no existe cura

para la diabetes y de no ser tratada puede conllevar al coma diabtico y a la muerte [2].

Sin embargo, un diagnstico a tiempo y un tratamiento eficaz pueden prevenir muchos de

sus sntomas y elevar la calidad de vida de las personas que la padecen.

En el ao 1985, se contabilizaban unos 30 millones de personas en el mundo con este

padecimiento. Diez aos despus esta cifra alcanzaba los 135 millones de pacientes. Para

el ao 2003 existan 171 millones de pacientes con DM en el mundo. La cifra se elev a

ms de 180 millones para el 2005 y se estima que para el 2030 esta cifra alcanzar los 366

millones [40]. Se cree sin embargo, que estas cifras son conservadoras y que en realidad

algunas estadsticas de muertes por afecciones cerebro-vasculares, estn relacionadas con


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la DM directamente[41]. La mortalidad global atribuible a la diabetes se estim en unos

2,9 millones de muertes para el ao 2000, lo que represent el 5,2% de todas las muertes

ocurridas en ese ao [42], mientras que, segn la Federacin Internacional de Diabticos

(IDF), ya para el 2007 la cifra fue de 3,8 millones, contabilizando el 6% de todos los

decesos, casi la misma cantidad que provocan el VIH/SIDA.

Se estima que los pacientes diabticos en Cuba para al ao 2000 rondaban los 480 000 y

ubica esta cifra en unos 855 000 para el 2030, para un crecimiento anual promedio de

2,14% [40]. Por otra parte, segn cifras brindadas por el Dr. Oscar Daz, Jefe del Grupo

Nacional de Endocrinologa y Director del Instituto Nacional de Endocrinologa (INEN, La

Habana), en marzo del 2008, existan en Cuba unos 375 095 diabticos, de los cuales

75 000 (20%), constituan pacientes insulino-dependientes**. Sin embargo en un estudio

piloto de pesquisaje activo realizado en la occidental provincia de La Habana, en la

localidad de Jaruco, se encontr un incremento en un ~2,5% en la poblacin de diabticos

ms un incremento de un 5,5% de pacientes pre-diabticos, por lo que la cifra real de

diabticos en Cuba podra rondar a cifras cercanas a los estimados de la OMS.

A nivel mundial, el incremento de la enfermedad est en el rango del 2-6% anual [43], lo

que permite que se catalogue a la DM como una de las pandemias modernas y unos de los

grandes retos de la medicina moderna en la actualidad.

En Cuba la diabetes ha estado entre las 10 primeras causas de muerte durante las ltimas

dcadas. En el 2006 ocasion 2 056 defunciones, para una tasa de 18,2 por cada 100 000

habitantes. Su tasa de prevalencia se increment de 19,3 en el ao 1996, a 33,3 por cada

1 000 habitantes en el 2006 [44].

Para ms informacin, consulte el sitio:http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.html Para ms informacin:http://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD37B7FA0-B63432BA3 **Tomado del sitio:http://www.sld.cu/sitios/diabetes/
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.htmlhttp://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.htmlhttp://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.htmlhttp://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD37B7FA0-B63432BA3http://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD37B7FA0-B63432BA3http://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD37B7FA0-B63432BA3http://www.sld.cu/sitios/diabetes/http://www.sld.cu/sitios/diabetes/http://www.sld.cu/sitios/diabetes/http://www.sld.cu/sitios/diabetes/http://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD37B7FA0-B63432BA3http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.html


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1.1.1.1 Tipos de Diabetes y algunos sntomas de la enfermedad

Existen dos tipos de diabetes. En la DM insulino-dependiente (DMID), comnmente

llamada diabetes de comienzo juvenil, el organismo no produce insulina o la produce en

muy pequeas cantidades. Los sntomas aparecen de forma sbita y en individuos

menores de 20 aos de edad, en la mayora de los casos alrededor de la pubertad. La

DMID representa del 5 - 10% de todos los casos de la enfermedad diagnosticados cada

ao. La DMID es considerada una enfermedad autoinmune, pues el sistema inmune

destruye las clulas pancreticas productoras de insulina

[45]. Los cientficos creen que

factores genticos y ambientales, tales como virus y protenas de alimentos pueden de

alguna forma activar al sistema inmunolgico para destruir las propias clulas [45].

En la DM no insulino-dependiente (DMNID), llamada diabetes de comienzo en adultos,

pues se manifiesta, como regla, despus de los 40 aos y con frecuencia despus de los 55

aos, el organismo produce cantidades insuficientes de insulina o no es capaz de utilizarla

en el transporte de glucosa. Los sntomas caractersticos de la DMNID incluyen infecciones

repetidas en la piel, dificultades en la cicatrizacin de heridas, cansancio generalizado,

inflamacin y adormecimiento de las manos y los pies [3]. Debido al desarrollo lento de la

enfermedad, muchos pacientes no se dan cuenta de que estn enfermos [3]. La DMNID

constituye del 90 al 95% de todos los casos diagnosticados cada ao. Cerca del 20% de

dichos pacientes reciben, no obstante, insulina en sus tratamientos.

1.1.1.2 Costos asociados a la enfermedad

Dependiendo del pas, la DM puede generar entre el 5 y el 14% de los gastos de salud [46].

Diamond estima que el costo anual asociado a esta enfermedad en los EEUU ascenda, en

el ao 2002, a ms de US$ 100 mil millones [3]. En otro estudio presentado por la

Asociacin Americana de Diabticos (ADA) situaban la cifra total en los US$ 132 mil

millones [47]. El propio estudio, conclua que el gasto mdico promedio anual de un

Consulte el sitio:http://www.aventis.com/ future/fut0203/metabolism_out_of_balanceVea el sitio:http://www.dragonbiotech.com/
http://www.aventis.com/%20future/fut0203/metabolism_out_of_balancehttp://www.aventis.com/%20future/fut0203/metabolism_out_of_balancehttp://www.aventis.com/%20future/fut0203/metabolism_out_of_balancehttp://www.dragonbiotech.com/http://www.dragonbiotech.com/http://www.dragonbiotech.com/http://www.dragonbiotech.com/http://www.aventis.com/%20future/fut0203/metabolism_out_of_balance


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paciente diabtico era de US$ 13 243, mientras que un no diabtico era de tan slo US$ 2

560, lo que significa que el gasto anual de un paciente diabtico es ms de 5 veces el gasto

de una persona no diabtica [47].

A nivel mundial, para el 2007, se contabilizaron gastos de US$ 232 mil millones, y se

estiman en unos US$ 302,5 mil millones para el 2025. La OMS, por otro lado, asegura que

en el decenio 2005-2015, China perder US$ 558 mil millones de ingresos nacionales

previstos debido a las cardiopatas, los accidentes vasculares cerebrales y la diabetes. Se

cree que de acuerdo a los ritmos de crecimiento actuales, la DM se convertir en una de

las enfermedades ms comunes y en uno de los problemas ms graves de salud pblica en

las sociedades del futuro [3].

Como en el resto de las enfermedades, en la DM se observan marcadas diferencias en

cuanto a la distribucin de los fondos destinados a la enfermedad. Se conoce que cerca

del 80% de todos los gastos mundiales son consumidos por los pases desarrollados, e

incluso, en un solo pas, los EEUU con cerca del 8% de todos los diabticos en el mundo, se

consume aproximadamente el 50% de todos los fondos destinados al cuidado de la DM y

en Europa se consume otro 25%***.

1.1.2 Estructura de la Insulina Humana

La molcula de insulina est formada por dos cadenas polipeptdicas, denominadas Ay B,

de 21 y 30 aminocidos respectivamente (Fig. 1). Esta molcula se forma a partir de un

precursor, la proinsulina, que cuenta adems con una cadena Cadicional que se pierde

durante la maduracin de la molcula. Dichas cadenas se encuentran unidas por dos

puentes disulfuro que se establecen entre las cistenas localizados en las posiciones A7-B7

y A20-B19. Adicionalmente la cadena Acontiene un puente disulfuro intracatenario (A9-

A11). Tiene una frmula molecular de: C257H383N65O77S6 (masa molecular: 5807,69 Da) y

posee un punto isoelctrico de pI 5,4. Fue aislada por primera vez de un pncreas canino,

Vea el sitio:http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.html ***Para ms informacin:http://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD3-87B7FA0-B63432BA3
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.htmlhttp://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.htmlhttp://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.htmlhttp://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD3-87B7FA0-B63432BA3http://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD3-87B7FA0-B63432BA3http://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD3-87B7FA0-B63432BA3http://www.idf.org/home/index.cfm?unode=3B9691D3-C026-2FD3-87B7FA0-B63432BA3http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.html


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por el cirujano canadiense Frederick G. Banting (1891-1941) y su asistente Charles H. Best

(1899-1978) en el ao 1921 [5, 48] y cristalizada por Abel en 1926 [49, 50]. Su estructura

primaria fue elucidada en 1953 por Sanger y Thompson [51].

En 1966, tres laboratorios, en Alemania [52], EEUU [53] y

China [54], de manera independiente, lograron sintetizar

qumicamente la insulina.

En los humanos, el gen de la insulina est localizado en el

cromosoma 11. En 1967, Steiner descubri que la insulina

era sintetizada como proinsulina, la cual es procesada a

insulina por una serie de procesos enzimticos [55]. La

insulina humana es producida en las clulas de los islotes

de Langerhans, en forma de pre-proinsulina. El pre-pptido

(pptido seal) es removido una vez que llega al retculo

endoplasmtico. La proinsulina se pliega correctamente

tambin en este compartimiento de las clulas y es

transportada hacia el aparato de Golgi y procesada

subsecuentemente hasta la molcula madura que es

almacenada en las vesculas transportadoras que la llevan hacia la membrana una vez que

las clulas reciben la seal para ello [1, 56-58]. El pptido Cde unin, es secretado junto

a la insulina madura al torrente sanguneo y aunque no han sido descubiertos receptores

del pptido C, se cree que ste posee alguna funcin biolgica an por descubrir [59].

1.1.3 Vas para la Obtencin de la Insulina

Un extracto obtenido de pncreas canino fue empleado con xito por primera vez en un

paciente diabtico el 11 de enero de 1922, cuando el adolescente de 14 aos Leonhard

Thompson fue inyectado con el preparado y se logr disminuir, hasta niveles casi

Figura 1. Representacin esque-mtica de la posible estructuraterciaria de la insulina humana,modificado de [3].


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normales, la concentracin de azcar en su orina y sangre. El xito del descubrimiento se

divulg rpidamente y cubri de esperanzas a millones de diabticos en todo el mundo.

Para el ao 2000 ms de 7 000 kg de insulina eran necesarios para satisfacer la demanda

de este frmaco [1]. sta era muy difcil, sino imposible, de satisfacer a partir de las

tecnologas de extraccin de insulina de pncreas bovino y porcino [1]; mxime si el

crecimiento de la demanda no se vislumbra que se detenga y se aproxima al 3% anual.

Slo a travs de la tecnologa del ADN recombinante se podran obtener las cantidades

necesarias para cubrir las necesidades presentes y futuras asociadas a la diabetes [60].

Desde el descubrimiento de la insulina por Banting y Best [48], en los aos 20 del siglo

pasado, la evolucin de los preparados para tratar a los pacientes diabticos ha mostrado

una evolucin sostenida. Inicialmente, la insulina fue aislada a partir de pncreas de

ganado porcino y bovino mediante una serie de extracciones complejas. Esta va, produjo

reacciones adversas, que fueron reducindose a medida que se desarrollaban productos

de una mayor pureza, tendientes a eliminar los contaminantes de origen animal

provenientes de los pncreas utilizados [60].

Por otro lado, las insulinas de origen animal son ligeramente diferentes de la humana. La

porcina tiene un aminocido diferente en la cadena By la bovina tiene dos ms diferentes

en la A [39]. Estas diferencias estructurales por s solas son suficientes para provocar

reacciones inmunolgicas desfavorables en algunos pacientes diabticos [60].

Para corregir el problema de la heterogeneidad entre las molculas de insulina humana y

porcina se dise un procedimiento de humanizacin de la hormona, reemplazando la

AlaB30del extremo C-terminal de la cadena Bpor ThrB30, a travs de una reaccin de trans-

peptidacin mediada por la tripsina (EC.3.4.21.4) en presencia de ster de treonina en

exceso [8, 11, 60].

Otros procedimientos, como la obtencin de insulina a partir del pncreas de cadveres o

su sntesis qumica han sido descartados por su alto riesgo y precio prohibitivo, adems de

http://www. aventis.com/future/ fut0203 /the_discovery of_insulin


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las posibles implicaciones ticas, filosficas y religiosas que el primero, pudiera traer

consigo [11, 39].

1.1.4 Produccin de la Insulina Humana Recombinante

Con la irrupcin de la ingeniera gentica a finales de los aos 70 del siglo pasado

comenzaron los intentos de producir la insulina en microorganismos. Como fruto de

ingentes esfuerzos, se logr lanzar al mercado la Humulin, el primer producto de la

tecnologa del ADN recombinante para el tratamiento de la DMID, en el ao 1982 [61].

1.1.4.1 Produccin de Insulina en Escherichia coli

En el procedimiento original, de Eli & Lilly and Co. (Indianpolis, IN, EEUU) se obtenan por

separado las cadenas A y B de la insulina a partir de cepas recombinantes de E. coli

transformadas con genes que codifican para dichas cadenas. Posteriormente las cadenas

eran sometidas a una serie de modificaciones qumicas in vitro, transformndolas en la

insulina humana [11, 60, 62]. Este procedimiento fue sustituido a partir de 1986, por uno

ms simple que elimina la necesidad de la sntesis separada de las cadenas Ay B; proceso

que an hoy es empleado para la obtencin del producto [63].

1.1.4.2 Produccin de Insulina en Saccharomyces cerevisiae

En 1986, investigadores de la Novo Nordisk A/K (Bagsvaerd, Dinamarca) patentaron un

procedimiento para la obtencin de la insulina humana, empleando un precursor ms

corto que el natural, al que denominaron mini-proinsulina (MPI), y utilizando como

hospedero a la levadura S. cerevisiae, con un amplio historial de servicios a la

humanidad, siendo catalogada como completamente segura para el hombre [36, 37].

La levadura, como organismo eucariota, posee la capacidad de efectuar transformaciones

post-traduccionales y de secretar las protenas heterlogas [64, 65]. La capacidad de

formar correctamente los puentes disulfuro, posibilita el plegamiento de la molcula de la

pro-insulina, tal y como ocurre en las clulas

del pncreas humano, lo que facilita su

aislamiento y purificacin.


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Figura 2. Precursores cortos de la Insulina y su conversin a Insulina. (A) MPI: B1-30-KR-A; (B) MPI:B1-29-AAK-Autilizados por Thim y col. [2, 3].

(B)(A)


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Dicho precursor lograba secretarse casi ntegramente y puede ser convertido in vitro a

insulina humana por la accin combinada o secuencial, de las enzimas tripsina

(EC.3.4.21.4) y carboxipeptidasa B (EC 3.4.17.2), ambas de origen bovino (Fig. 2A) [37].

Aos ms tarde se ampli esta idea y se empez a utilizar el espaciador AK- entre las

cadenas Ay Bde la insulina porcina, que slo difiere de la humana por la presencia de una

Ala en la posicin B30 [66]. Debido a que el aminocido B29 es una lisina al efectuar el

tratamiento enzimtico con la tripsina, bajo determinadas condiciones, sta realiza el

corte despus de la LysB29y entre la lisina del espaciador y el aminocido de la posicin

A1, quedando la molcula des-ThrB30-insulina. Posteriormente a travs de la reaccin de

sntesis con la propia tripsina y en presencia de cantidades en exceso de un ster de

treonina se efecta la adicin de la treonina en la posicin correcta B30, obtenindose la

insulina humana (Fig. 2B) [8, 66].

1.1.4.3 Expresin de precursores de Insulina en la Levadura Pichia pastoris

Kjeldsen y col. [9], hicieron un estudio comparativo de la expresin del precursor corto de

la insulina (MPI, B1-29-AAK-A), demostrando algunas ventajas como la ausencia total de la

molcula intracelularmente y el procesamiento completo de la molcula a lo largo de su

ruta de secrecin.

Para un precursor similar, Wang y col. [10], reportaron niveles de expresin del orden de

los 1,5 gL-1 de MPI, aunque se brinda escasa informacin sobre las condiciones

experimentales del hallazgo.

Por otra parte, Zhu y col. [67], reportaron niveles ms modestos (181 mgL -1) los que

fueron logrados con un clon Mut+ con 12 copias del casete de expresin. En el propio

estudio, los autores aseguran que los clones con ms de 12 copias del casete de expresin

disminuye significativamente el nivel de expresin del precursor.

Ms recientemente, Gurramkonda y col. reportaron los ms elevados valores de expresin

hasta ahora obtenidos de

3 gL-1de MPI (B1-29-AAK-A), empleando una cepa X-33 de P.


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pastoris, y optimizando previamente el uso de codones, el vector de expresin, el medio y

las condiciones de cultivo [68].

En el CIGB, se ha laborado durante ms de una dcada en la obtencin de esta hormona.

Los primeros intentos fueron realizados empleando E. coli como hospedero [69]. Despus

de explorar en la levadura S. cerevisiae, se logr obtener niveles apreciables y crecientes

de la MPI, utilizando la construccin B-KR-A en la levadura P. pastoris, a travs del

aumento del nmero de copias del casete de expresin [11, 39].

1.2 Parmetros de la Fermentacin para la Expresin

de Protenas Heterlogas en Pichia pastoris

1.2.1 Pichia pastoris como Sistema de Expresin

Esta levadura ha sido ampliamente utilizada en la expresin de protenas recombinantes

[12, 13, 15, 71-75]. Desde que Ogata y col. [70] describieran la capacidad de la levadura

Pichia pastorisde utilizar eficazmente el metanol como fuente de carbono a la actualidad,

cerce de 500 protenas recombinantes de diferentes orgenes han sido expresadas en este

hospedero y su nmero no para de aumentar[12, 72, 76].

La popularidad de esta levadura se basa en su potencialidad para producir muy altos

niveles de protenas forneas y su capacidad para crecer hasta muy altas densidades

celulares en medios qumicamente definidos, en los que se pueden lograr rutinariamente

rendimientos de 5 a 40% de las protenas celulares; resultando valoresms altos que los

obtenidos en la levadura S. cerevisiae,y con frecuencia equivalente a los de E. coli [77, 78].

Adicionalmente, cultivar a gran escala P. pastoris hasta alta densidad celular es

relativamente fcil y se obtienen altos rendimientos volumtricos [11-13, 79-81], como

por ejemplo los 12 gL-1de fragmentos C de la toxina del ttano [28] y de 3 a 4 gL -1de

albmina de suero humana [77, 82] y de 6 a 10 gL-1de factor de necrosis tumoral [25, 83].

Con el uso de este sistema, tambin se obtienen altos rendimientos en protenas

Para ver un listado ms completo, revisar el sitio:http://www.kgi.edu/x753.xml
http://www.kgi.edu/x753.xmlhttp://www.kgi.edu/x753.xmlhttp://www.kgi.edu/x753.xmlhttp://www.kgi.edu/x753.xml


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intracelulares, logrndose una alta estabilidad gentica y es posible aumentar la escala sin

mermas en los rendimientos [64], como lo demuestra un reporte de 4 gL-1de interleucina

2 intracelular, lo que representa un 30% del total de protenas [77].

Ms recientemente, se ha logrado la expresin de complejas protenas humanas,

reproduciendo en las protenas expresadas en P. pastoris, el complejo patrn de

glicosilacin que las clulas de mamfero le confieren a sus protenas nativas [84-89]. Esto

ha permitido la expresin extracelular de un anticuerpo monoclonal completamente

funcional en una cepa glico-ingenierizada de P. pastorishasta alcanzar niveles de 1 gL-1en

el sobrenadante de cultivo [90].

1.2.2 Medio de Cultivo Qumicamente Definido

Aunque se reconoce la capacidad de P. pastoris de alcanzar elevadas concentraciones

celulares con medios salinos, la abundante bibliografa que ha sido publicada sugiere que

la composicin ptima del medio de cultivo para lograr los mejores resultados depende de

la cepa escogida y las particularidades de la protena fornea que se va a expresar en este

hospedero [79, 91, 92].

Se recomienda comenzar los estudios de expresin, empleando el medio basal salino

(BSM) de Invitrogen Co.(Carlsbad, CA, EEUU) [93], el cual ha sido ampliamente probado

con xito, para la expresin de cientos de protenas heterlogas [12].

A pesar del xito acumulado con su empleo, el medio BSM presenta algunos

inconvenientes fciles de observar a simple vista cuando se prepara y esteriliza,

notndose una turbidez de color blanquecina antes de inocular, en especial los cultivos en

los que se preestablece valores de pH 5 [94]. Este cambio de coloracin se atribuye a la

baja solubilidad de los cationes polivalentes de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+) presentes

en el suplemento PTM1, en presencia del orto-fosfato (HPO42-) [95]. Esta ligera

precipitacin no es muy problemtica y tiende a desaparecer sin dejar secuelas a medida

que el cultivo se desarrolla, pero puede acarrear problemas de desbalance, sobre todo en


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la medida que el pH del medio se incrementa por encima de pH 5 [94]. Una solucin a este

problema fue propuesta por Oehler y col. [96] y consiste en la sustitucin del medio del

cido orto-fosfrico por el hexametafosfato de sodio [(NaPO3)6], una sal que no forma

precipitados en presencia de cationes de calcio y magnesio.

Tambin han aparecido nuevos medios de cultivo alternativos, como los propuestos por

Daugulis y col. [97, 98] o el denominado como FM22 formulado por Stratton y col. [99].

Todos ellos, han sido ideados, no obstante, para alcanzar, al igual que el medio BSM, altas

densidades celulares en los cultivos de P. pastoris[79].

El medio BSM de Invitrogen fue desarrollado a partir de los trabajos desarrollados por

Wegner y col. [100, 101], en los cuales se establecieron los rangos necesarios para el

crecimiento hasta altas densidades celulares de la levadura P. pastoris para su empleo

como fuente de protena unicelular.

1.2.3 Condiciones de Cultivo

Se conoce que P. pastorises mesfila, y capaz de crecer y multiplicarse entre 20 y 37C

[35, 102], aunque, segn experiencias del autor, puede soportar, por cortos espacios de

tiempo, temperaturas fueras de este rango.

En cuanto al pH, como el resto de las levaduras, es capaz de crecer a pH cidos o neutros,

lo que significa en trminos prcticos un rango bastante amplio que cubre desde pH 3

hasta pH 7 [35], aunque otros autores han enmarcado este rango de pH 2,8 a 6,5 [103].

Diferentes autores han sealado la importancia de la correcta seleccin del pH para la

expresin extracelular de protenas forneas en P. pastoris [14, 33, 35, 77, 102-105]. El

amplio rango en que puede multiplicarse esta levadura, que oscila entre los pH 2,8 y 7, sin

que se afecte apreciablemente la velocidad especfica de crecimiento, hace que el pH sea

una variable ideal para optimizar la expresin de protenas heterlogas [35, 72].

Los cultivos de esta levadura en los que se emplea el promotor AOX1, suelen dividirse en

dos fases, una de crecimiento y otra de produccin [94]. La primera fase, cuyo objetivo es


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alcanzar la mayor densidad celular posible y desreprimir el gen AOX1 para su uso en la

fase productiva, a su vez, se divide en dos etapas, una en que se cargan todos los

nutrientes de una vez como en un lote, y otra que comienza una vez agotada esta etapa y

en la que se incrementa el lote inicial con determinada cantidad de medio fresco

(comnmente se emplea slo la fuente de carbn suplementada con determinadas

cantidades de soluciones trazas y vitaminas). En esta fase, la fuente de carbono que se

utiliza es el glicerol, por representar un sustrato menos represor del gen AOX1 que la

glucosa, aunque recientemente ha sido empleada la glucosa, en lugar del glicerol, y un

sistema de control adecuado para producir fitasa recombinante con P. pastoris[106].

En la segunda fase se cambia la fuente de carbono, por el metanol. En dependencia del

fenotipo que tenga, la cepa ser capaz de crecer a una velocidad mayor (Mut+) o una

menor (MutS). Existe tambin una tercera posibilidad en que se pueden bloquear los dos

genes, el AOX1y el AOX2, y en ese caso se tiene un fenotipo Mut0(o Mut-para algunos

autores) y dicha cepa podr expresar el gen heterlogo, pero ser incapaz de utilizar el

metanol como fuente de carbono [107].

Algunos autores han observado que la acumulacin de la protena fornea en el medio de

cultivo va en aumento durante un perodo de la fase productiva, pero a partir de algunas

decenas de horas del inicio de la induccin tal acumulacin no slo deja de observarse,

sino que comienza a disminuir, a pesar de que el crecimiento del cultivo contina su

aumento [91, 105, 108]. Este fenmeno ha sido atribuido a la existencia en P. pastoris de

un sistema proteoltico fuerte y bien estructurado que compite con la expresin de

protenas heterlogas [91, 108].

Diferentes han sido las estrategias para evitar las consecuencias de la degradacin

proteoltica [14, 33, 104, 106, 108-112]. Entre las ms utilizadas han estado la utilizacin

de cepas mutantes de proteasas [34, 113, 114], cepas hipersecretoras [115], la

modificacin de la estructura de la protena para hacerla menos vulnerable a la accin de

Los precios de mercado de la glucosa son comparativamente menores a los del glicerol (N. del A.).


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las proteasas del hospedero [116, 117], la adicin de inhibidores de proteasas [118], lo

que incluye su fusin a otro fragmento [102, 119], la manipulacin del pH en el medio de

cultivo [120, 121], la manipulacin del oxgeno en el cultivo [122-126] y efectuar los

procesos de cultivo a temperaturas reducidas [33, 127].

Tambin, se conoce que el agotamiento de las fuentes de nitrgeno es uno de los factores

que induce la produccin de proteasas en la clula hospedera [14, 128], por lo que

suplementar los cultivos con alguna fuente, inorgnica u orgnica, de nitrgeno que de

manera directa elimine este dficit, constituye una de las vas para superar los efectos

negativos que sobre la expresin de la protena de inters ejercen las proteasas. De

manera que, suplementar el medio con hidrolizado de casena (HC) [29], peptona [129],

extracto de levaduras (YE) [130] y adicionando alguna otra fuente de origen orgnico [131,

132] o inorgnico [105, 109, 133, 134], han sido vas exploradas para minimizar los efectos

de este fenmeno.

En los casos de excesos de in amonio en el cultivo, Mendoza-Vega y col. [129] han

reportado la disminucin significativa de la concentracin de protenas totales en el

sobrenadante del medio de cultivo, en la produccin de hirudina en S. cerevisiae.

Por ltimo, se ha reportado que la adicin de EDTAal medio de cultivo, ha sido la causa de

la mejora en la estabilidad del producto heterlogo [104], lo que parece asociado a que el

EDTA impide agregaciones no deseadas de ste y de favorecer la solubilidad de algunas

sales complejas, as como tambin a la posible accin sobre las metalo-proteasas que esta

sustancia inhibe. Adicionalmente, el EDTAes un agente quelante, el cual desfavorece la

posible dimerizacin y posterior hexamerizacin de la molcula de MPI, evento que ha

sido detectado no slo en la insulina madura, sino que tambin en la proinsulina [57] y la

MPI [135]. Por ltimo, existen reportes de que el EDTAejerce un positivo efecto sobre las

membranas de las levaduras para propiciar la secrecin de protenas heterlogas [136].

En resumen, es posible encontrar una composicin de medio de cultivo, qumicamente

definido, que se adece al crecimiento de la cepa de P. pastoris que se emplea para la


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expresin y secrecin extracelular de la MPI. De modo similar, es posible encontrar, a

escala de laboratorio, las condiciones de cultivo ms favorables para disminuir, al mnimo

posible, la degradacin proteoltica de la MPI expresada en este hospedero.

1.3 Entorno Regulatorio

Unida al desarrollo de la biotecnologa, y en especial en sus aplicaciones en la medicina,

ha estado la intencin de garantizar la seguridad de los productos de esta ciencia para los

potenciales consumidores de sus logros. Innumerables accidentes, asociados al

desconocimiento unos y a la negligencia otros, han impulsado a que los gobiernos

establezcan fuertes controles sobre las compaas y empresas biotecnolgicas, a travs de

el otorgamiento de licencias, inspecciones y recomendaciones, cuya violacin pueden

acarrear fuertes sanciones para los infractores.

Pudiera creerse errneamente que tales eventos ha sido una prctica ya superada en la

actualidad y que constituye un asunto resuelto y que por tanto, las actuales regulaciones

slo son el fruto o consecuencia de los errores del pasado. Slo dos ejemplos recientes

para demostrar que es menester estar vigilantes, en octubre de 2006, mueren ms de 100

personas en Panam al consumir un jarabe anticatarral formulado con dietilenglicol****. En

marzo de 2008, mueren 19 personas en los EEUU al tratarse con una heparina

contaminada.

Esto demuestra la necesidad de que los procesos productivos deban ser exhaustivamente

diseados y controlados de manera responsable, so pena de poner en riesgo, lo ms

preciado, la vida humana. Sin embargo, existi la tendencia de querer pre-establecer

rgidamente los procesos productivos en momentos muy tempranos de su desarrollo,

cercenando las posibles mejoras tecnolgicas que pudieran surgir ulteriormente producto

de la experiencia acumulada con el empleo del producto y su caracterizacin fsico-

****Vea el sitio: http://es.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADndrome_de_par%C3%A1lisis_e_insuficiencia_renal_aguda Consulte el sitio:http://www.quiminet.com.mx/nt6/nt_%2584%259C%252B%2517%25F3XRv.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADndrome_de_par%C3%A1lisis_e_insuficiencia_renal_agudahttp://es.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADndrome_de_par%C3%A1lisis_e_insuficiencia_renal_agudahttp://www.quiminet.com.mx/nt6/nt_%2584%259C%252B%2517%25F3XRv.htmhttp://www.quiminet.com.mx/nt6/nt_%2584%259C%252B%2517%25F3XRv.htmhttp://www.quiminet.com.mx/nt6/nt_%2584%259C%252B%2517%25F3XRv.htmhttp://www.quiminet.com.mx/nt6/nt_%2584%259C%252B%2517%25F3XRv.htmhttp://es.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADndrome_de_par%C3%A1lisis_e_insuficiencia_renal_aguda


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qumica y farmacolgica; lo que unido a la necesidad de registrar los productos ms

tempranamente haca que fuese extremadamente engorrosa la tarea de la mejora

efectiva de los procesos una vez registrados. Esto ltimo provoca que muchas compaas

se vieran tentadas a burlar estas recomendaciones y a establecer procedimientos

engaosos para sortear las barreras regulatorias.

La contradiccin existente entre la necesidad de establecer reglas definidas para la

elaboracin de los medicamentos y la necesidad de la mejora continua de los procesos

para su fabricacin, parece que puede ser resuelta con los conceptos que han emanado

en los ltimos aos al intentar armonizar las regulaciones vigentes de las farmacopeas de

los pases que encabezan el desarrollo del sector farmacutico (EEUU, Europa y Japn). En

efecto, expertos de estos pases han elaborado un marco conceptual, a travs de

lineamientos y recomendaciones recogidas en el Encuentro Internacional sobre la

Armonizacin(ICH) [137-142].

Segn estos lineamientos, lo ms importante es garantizar la seguridad del medicamento

a lo largo de toda la vida til del mismo, construyendo su calidad desde el propio diseo

y no verificndola solamente en la etapa final. Esta idea se resume en el concepto de

calidad por diseo (QbD), que presupone una etapa de desarrollo del producto con una

extensa caracterizacin fsico-qumica y farmacolgica del ingrediente farmacutico activo

(IFA), con un conocimiento profundo de los mecanismos de accin del IFA avalados por los

estudios pre-clnicos y por los ensayos clnicos realizados [138, 140-144].

La QbDconstituye un acercamiento sistemtico al desarrollo que empieza con pre-definir

los objetivos y da nfasis a la comprensin del producto y el proceso, basndose en el

conocimiento cientfico y el manejo adecuado del riesgo sobre la calidad [141, 143, 144].

La QbDno es un evento aislado, es un proceso que presupone que el conocimiento y la

experiencia ganada por un producto en su proceso productivo puede acumularse y

revertirse en la mejora del propio producto u otros similares a lo largo de todo el ciclo de


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vida del mismo [145]. La QbDes una oportunidad prometedora para las compaas para

capitalizar el ambiente regulatorio vigente y enfocar a la industria hacia la calidad del

producto farmacutico y el control del proceso productivo a travs del uso y potenciacin

de los avances de la ciencia, garantizar la conformidad regulatoria y la inversin adecuada

para el beneficio de los pacientes y accionistas [144-146].

Lo que la QbDcomo concepto expresa es que los productos, y los procesos que los hacen

posible, debern ser diseados para reunir por adelantado las especificaciones de los

propios productos y sus requisitos de control de proceso [145]. Cuando los lineamientos

de la QbDse apliquen, se deben alcanzar productos ms puros y potentes, procesos ms

robustos, confiables y seguros, y procesos en los que se alcanzan una productividad

superior [140-142, 144, 145, 147].

Actualmente existe un intenso debate entre desarrollistas, productores y las agencias

regulatorias, en cmo implementar estos conceptos [140-142, 144, 147-150].

En el documento emitido por la USFDABuenas Prcticas de Produccin de Farmacuticos

para el siglo XXI basados en un enfoque de riesgo contiene conceptos innovadores con

los que sta agencia confa que se modernicen las regulaciones para la produccin de

farmacuticos y su control de la calidad. Algunos de los conceptos que se mencionan

incluyen la utilizacin desde las etapas iniciales del desarrollo del producto las ms

avanzadas tecnologas, la utilizacin de tcnicas de direccin de la calidad y recomienda la

implementacin de enfoques basados en anlisis de riesgo [151]. Producto de esta

iniciativa es la aplicacin de los novedosos avances cientfico-tecnolgicos en el proceso

productivo con la implementacin de la iniciativa denominada tecnologa analtica del

proceso(PAT) de la USFDA[149, 151, 152].

La PATha sido definida como un sistema para el diseo, el anlisis y el control del proceso

de produccin a partir de mediciones oportunas (o sea durante el proceso) de atributos

Para ms detalles vea el sitio:http://www.fda.gov/oc/guidance/gmp.html
http://www.fda.gov/oc/guidance/gmp.htmlhttp://www.fda.gov/oc/guidance/gmp.htmlhttp://www.fda.gov/oc/guidance/gmp.htmlhttp://www.fda.gov/oc/guidance/gmp.html


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crticos de calidad (QCA) de variables del proceso, de las materias primas y productos

intermedios, con el objetivo de asegurar la calidad del ingrediente farmacutico activo

(IFA) y el producto final[152]. De tal modo, que el objetivo de la iniciativa PATes mejorar

la comprensin y el control de los procesos productivos, los cuales sean consistentes con

nuestros lineamientos vigentes del sistema de calidad del producto: la calidad no puede

ser medida dentro de los productos, sta deber ser inherente al producto o deber

existir por diseo [150].

Actividades como la QbD y la PAThan sido prctica habitual en las compaas qumicas

desde mediados de los aos 1950 [145]. Las compaas de este sector abrazaron estos

conceptos ya que con ellos ahorraban grandes cantidades de dinero y tiempo en sus

actividades de desarrollo [145].

Para complementar esta iniciativa han sido emitidos por la USFDA y el resto de las

farmacopeas del primer mundo otros documentos, y son la ICH Q7A sobre las buenas

prcticas para la produccin de ingrediente farmacutico activo [139], la ICH Q8sobre el

desarrollo de productos farmacuticos [138] y la ICH Q9sobre el manejo del riesgo [137].

En la ICH Q7Ase describen las posibles fuentes de obtencin de productos farmacuticos

que cubre desde la medicina tradicional, pasando por la sntesis qumica, hasta los

procesos fermentativos basados en la tecnologa del ADN recombinante [139]; mientras

que en la ICH Q8, se plantea que el objetivo de desarrollo farmacutico es disear

productos de calidad y sus procesos de fabricacin para entregar productos que realicen

las funciones especificadas y que lo hagan de manera consistente.

La informacin y conocimiento ganados de los estudios de desarrollo farmacuticos y la

experiencia industrial proporcionan el conocimiento cientfico suficiente para apoyar el

establecimiento del espacio de diseo (DS), las especificaciones, y los controles del

proceso productivo [138].


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30

Posteriormente, en un anexo aadido a este lineamiento [143], se detalla que el

desarrollo farmacutico debe incluir, como mnimo, los elementos siguientes:

La definicin del perfil del producto designado en relacin a la calidad, seguridad y

eficacia, considerado la va de administracin, la presentacin final, la dosificacin,

biodisponibilidad, dosificacin y estabilidad

La identificacin de los CQAde modo que aquellas caractersticas del producto que

tengan un impacto en la calidad del producto puedan estudiarse y ser controladas

La determinacin de los atributos de calidad de la IFA, los excipientes, etc., y

seleccionando el tipo y cantidad de excipientes que deban ser adicionados al

producto farmacutico de la calidad deseada

La seleccin de un proceso industrial apropiado

La identificacin de la estrategia de control del proceso ms conveniente

El CQA constituye una propiedad o caracterstica fsica, qumica, biolgica y/o

microbiolgica, que debe estar dentro de un lmite, rango, o en una distribucin

apropiada, para que slo as, pueda asegurar la calidad deseada del producto [153]. Los

CQAs son generalmente asociados con la sustancia componente del producto, los

excipientes, los productos intermedios dentro del proceso y el producto final [153].

Un parmetro crtico del proceso (CPP) es un parmetro cuya variabilidad tiene un

impacto sobre un atributo crtico de calidad (CQA) y por consiguiente debe controlarse

para asegurar que el proceso produzca el producto con la calidad deseada [143].

El espacio de diseo(DS) constituye la combinacin multidimensional e interaccin de las

variables de entrada (por ejemplo, los atributos de los materiales) y los parmetros del

proceso que han demostrado que aseguran la calidad del producto [138, 143].

El DS es un concepto que puede ser aplicado tanto a un proceso completo, como a

determinadas operaciones e incluso a una operacin aislada [154]. Si un proceso se


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31

encuentra operando dentro del DS, aunque sus variables de proceso no coincidan con las

predefinidas, no ser considerado como un cambio de proceso [138]. El movimiento fuera

del DSse considerar como cambio y normalmente ser necesario gestionar un proceso

de post-aprobacin con la agencia regulatoria correspondiente [138]. El DSser propuesto

por el productor solicitante y ser sujeto a la valoracin, revisin y aprobacin por la

agencia regulatoria correspondiente [138, 143]. Un proceso bien diseado se espera que

sea robusto y consistente en reproducir la productividad y calidad del producto. La fuente

primaria de la variabilidad de los procesos biolgicos complejos es la interaccin entre dos

o ms variables del proceso [150].

Inicialmente se establece la variabilidad aceptable en la calidad del producto y son

establecidos los atributos de comportamiento del proceso, basados en los datos clnicos

obtenidos con el producto, conocimientos reportados de productos similares y el

conocimiento cientfico fundamentado de las caractersticas de la molcula (Fig. 3).

Posteriormente, son realizados los estudios de caracterizacin del proceso que permitan

explorar los rangos de caracterizacin del proceso y poder establecer los rangos

aceptables de las variables donde se obtengan los parmetros operacionales crticos del

proceso. Al operar dentro de tales rangos aceptables se podr asegurar la calidad del

ESPACIO DEL CONOCIMIENTO

ESPACIO DE DISEO

Variabilidad aceptableen los atributos

crticos de calidad

Estudios decaracterizacin del

Proceso

Figura 3. Ilustracin de la creacin del espacio de diseo a partir de los estudios de caracterizacin delproceso y la interrelacin entre el espacio de diseo y los espacios de caracterizacin y de operacin [143].

ESPACIO DEOPERACIN


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producto [150]. Basndose en valores lgicos y posibles, los estudios de caracterizacin

deben cubrir amplios rangos de calidad del producto y de los atributos de

comportamiento del proceso, ms all de aqullos para los cuales son tpicamente

testados. Del mismo modo, es deseable que el rango de operacin del proceso se

encuentre dentro de los lmites del DSy que garantice la robustez, repetitividad y calidad

del producto [150, 151, 155, 156].

La informacin de los estudios de desarrollo farmacuticos puede ser una base para el

manejo del riesgo en la calidad. Es importante reconocer que la calidad no puede

probarse en el producto; en su lugar, la calidad debe ser inherente al proceso productivo y

construirse junto con l y deber durar todo el ciclo de vida del producto [153]. Los

cambios realizados en la formulacin y los procesos durante las etapas del desarrollo y

manejo del ciclo de vida del producto deben verse como oportunidades que se tiene de

ganar en conocimiento adicional y el establecimiento de un adecuado DS. De manera

similar, puede ser til el conocimiento generado por los experimentos fallidos [138].

En la ICH Q9, se establece que la gestin del riesgo en calidad (QRM) es un proceso

sistemtico de evaluacin, control, comunicacin y revisin de riesgos a la calidad del

producto farmacutico a lo largo de toda su vida til. En la figura A-1, del Anexo, se

muestra el diagrama bsico para efectuar el manejo del riesgo, el cual consta de cuatro

componentes: la valoracin, el control, la revisin y la comunicacin del riesgo [137].

Varias tareas debern ser completadas antes de ejecutar la evaluacin del riesgo. Se

deben acometer la definicin del alcance de la evaluacin, la definicin del equipo

evaluador y establecer las acciones que den respuesta a la evaluacin del riesgo [157].

Frecuentemente el QRMes llevado a cabo por equipos multidisciplinarios de especialistas

formados por expertos de las diversas reas involucradas [137, 158].


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Existen diversas herramientas para implementar el manejo del riesgo en calidad, las cuales

se podrn aplicar aislados o en complementacin, en dependencia del estado del

producto, el nivel de informacin requerida, y el alcance del proceso de manejo del riesgo.

Entre las herramientas ms empleadas para el QRMse encuentran: el anlisis modal de

fallas y efectos (FMEA), anlisis del rbol de fallas, anlisis de riesgo y control de los

puntos crticos, anlisis operativo del riesgo y anlisis preliminar del riesgo [137]. La

gestin del riesgo es necesario que sea incorporado en todo el ciclo de vida del producto

farmacutico, aunque sus objetivos varen en dependencia de la etapa en que se

encuentre el producto.

Al analizar las directrices de la ICH Q7A, Q8, Q9y Q10, resalta el profuso uso matemtico/

estadstico que se pretende dar, como soporte al logro del objetivo principal, de proveer

seguridad y eficacia a bajo costo, a los pacientes con el empleo de los productos

farmacuticos obtenidos bajo estos preceptos [159].

Las herramientas estadsticas que se necesiten dependern del momento en que se

encuentre el producto en su ciclo de vida. En las etapas de desarrollo del producto y del

proceso, se emplearn frecuentemente el diseo de experimentos(DoE) y la evaluacin y

construccin de modelos que ajusten los datos obtenidos[158]; mientras que durante la

etapa de produccin, suelen emplearse las cartas de control de proceso y la minera de

datos. Cada compaa deber establecer sus propias normas y maneras, adecundolas a

su experiencia y necesidad, implementndolas a travs de procedimientos de operacin.

Rathore y col. [151] proponen un esquema, en la que el desarrollo de un producto

farmacutico se subdivide en tres etapas: la de desarrollo temprano, la de desarrollo

comercial y la etapa de post-lanzamiento (Fig. 4). Ntese que la acumulacin del

conocimiento sobre el proceso no se detiene y continua despus del lanzamiento

comercial a travs del monitoreo del proceso y que la informacin acumulada, y


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adecuadamente sistematizada, puede ser empleada creadoramente para convertir ms

robustos los procesos, contribuyendo a la mejora continua de stos.

En resumen, los conceptos emanados de las ICH Q7A, Q8, Q9y Q10[137-139, 143, 153,

154, 160], deben verse como un intento de las agencias regulatorias por impulsar el

conocimiento por parte de los productores de los productos que elaboran, y con ello

aumentar la eficacia y seguridad de los mismos, al tiempo que se disminuyan

sustancialmente las prdidas por concepto de rechazo y no conformidad en los procesos

productivos

[161].

Para su implementacin se requiere desde las etapas iniciales de desarrollo articular

esfuerzos y recursos, para acumular

conocimientos cientficos y

evidencias clnicas en los productos

que permitan determinar sus

atributos crticos de calidad (CQA)

primero y luego, en el proceso de

manufactura, determinar los

parmetros crticos del proceso(CPP),

y los espacios del conocimiento, de

diseo (DS) y de la operacin (OS),

con lo que se reducira la variabilidad

de los procesos y aumentara la

robustez de stos.

Estos elementos insertados en un

proceso productivo adecuadamente instrumentado, segn los conceptos de la tecnologa

analtica del proceso (PAT) permitiran reducir sustancialmente las prdidas por rechazo e

A finales de 2006, las prdidas en el sector farmacutico de EEUU, asociadas a estos conceptos rondaban los 50 milmillones de US$ anuales.

DESARROLLOTEMPRANO DEL

PROCESO

DESARROLLOCOMERCIAL DEL

PROCESO

CARACTERIZACINDEL PROCESO

VALIDACIN DELPROCESO

COMPLETAMIENTOREGULATORIO

MONITOREODEL PROCESO

DESARROLLO

TEMPRANO

DESARROLLO

COMERCIAL

POST-LANZAMIENTO

Figura 4. Una ilustracin de las fases de desarrollo de unproceso: Desarrollo temprano del proceso, comercializaciny post-lanzamiento [151].


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inconformidades, y por ende, incrementar la seguridad para los pacientes y la

productividad de los procesos farmacuticos, para beneplcito de los productores.

1.3.1 Atributos de Calidad de la Insulina

La insulina humana, es una de las molculas ms estudiadas y caracterizadas que existe

[162, 163]. Sanger y col. [51, 164-167] determinaron, entre 1949-1955, la estructura

primaria de la insulina, trabajos por lo que recibi el premio Nobel en Qumica en 1958.

Ha sido de las pocas protenas que ha podido ser sintetizada qumicamente [168, 169].

Despus de la hormona de crecimiento humana, fue la segunda molcula expresada por

las tcnicas del ADN recombinante [7, 170], y fue la primera en ser cristalizada [171],

hecho que contribuy a que Ho

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