8/13/2019 Seidel STATsites

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 2 , p p . 3 0 4 1 - 3 0 4 5 , M a r c h 1 9 9 5B i o c h e m i s t r y

S p a c i n g o f p a l i n d r o m i c h a l f s i t e s a s a d e t e r m i n a n t o f s e l e c t i v eST AT ( s i g n a l t r a n s d u c e r s and a c t i v a t o r s o f t r a n s c r i p t i o n ) DNAb i n d i n g and t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y( r e s p o n s e e l e m e n t s / i n t e r l e u k i n 4 / i n t e r l e u k i n 6 / c y t o k i n e s i g n a l t r a n s d u c t i o n / g e n e e x p r e s s i o n )

H . MARTIN S E I D E L * t , LAWRENCE H . M I L O C C O * , P E T E R L A M B * , J A M E S E . D A R N E L L , J R . O , ROBERT B . S T E I N * ,A ND J O N A T H A N R O S E N ** L i g a n d P h a r m a c e u t i c a l s I n c . , 9 3 9 3 Towne C e n t r e D r i v e , S a n D i e g o , C A 9 2 1 2 1 ; a n d t L a b o r a t o r y o f M o l e c u l a r C e l l B i o l o g y , R o c k e f e l l e r U n i v e r s i t y , Ne w Y o r k ,NY 1 0 0 2 1C o n t r i b u t e d b y J a m e s E . D a r n e l l , J r . , O c t o b e r 2 1 , 1 9 9 4AB STRACT S ig na l t r a ns d u c e rs a n d a c t i v a t o r s o f t r a n -s c r i p t i o n ( S T A T p r o t e i n s ) b i n d t o p a l i n d r o m i c s e q u e n c ee l e m e n t s r e l a t e d t o i n t e r f e r o n y ( I F N - y ) a c t i v a t i o n s i t e s ,w h i c h w e r e f i r s t i d e n t i f i e d i n t h e p r o m o t e r s o f I F N - y -i n d u c i b l e g e n e s . A l t h o u g h t h e s e q u e n c e s o f t h e n a t u r a l p a l -i n d r o m i c S T A T - b i n d i n g e l e m e nt s v a r y c o n s i d e r a b l y , t h e y c o n -f o r m t o t h e g e n e r a l s t r u c t u r e T T ( N ) 5 A A . W e h a v e s y s t e m a t -i c a l l y e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f t h e s p a c i n g b e t w e e n t h e TT a n dA A c o r e h a l f s i t e s o n t h e b i n d i n g o f t h e STAT c o m p l e x e sa c t i v a t e d b y I F N - y , i n t e r l e u k i n ( I L ) 6 , g r a n u l o c y t e -m a c r o p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r , a n d I L - 4 . W e s h o w t h a t i a s s u g g e s t e d e a r l i e r , a c o r e p a l i n d r o m i c TT-AA m o t i f w i t ha 5 - b p s pa c i n g d i s p l a y s g e n e r a l STAT b i n d i n g , i i a p a l i n -d r o m i c m o t i f w i t h a s p a c i n g o f 4 b p s e l e c t i v e l y b i n d s t oc o m p l e x e s c o n t a i n i n g S t a t 3 , a n d i i i a m o t i f w i t h a 6 - b ps p a c i n g s e l e c t i v e l y b i n d s t h e STAT c o m p l e x e s a c t i v a t e d b yI L - 4 . W e h a v e e x a m i n e d n a t u r a l e l e m e n t s i n t h e p r o m o t e r s o fc y t o k i n e - r e s p o n s i v e g e n e s t h a t d i f f e r i n h a l f - s i t e s p a c i n g a n df o u n d t h a t t h e y d i s p l a y b i n d i n g p r o p e r t i e s p r e d i c t e d f r o m t h es y n t h e t i c b i n d i n g s i t e s . F u r t h e r m o r e , t h e o b s e r v e d d i f f e r e n t i a ls e l e c t i v e b i n d i n g c h a r a c t e r i s t i c s f o r t h e m o s t p a r t c o r r e l a t ew i t h t h e a b i l i t y t o m e d i a t e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f t r a n s -f e c t e d t e s t g e n e s i n r e s p o n s e t o t h e c y t o k i n e s t e s t e d . Ourr e s u l t s t h u s d e m o n s t r a t e t h a t t h e s p e c i f i c i t y o f S T A T - d i r e c t e dt r a n s c r i p t i o n i n r e s p o n s e t o p a r t i c u l a r c y t o k i n e s o r c y t o k i n ef a m i l i e s d e p e n d s i n p a r t o n t h e s p a c i n g o f h a lf s i t e s w i t h i n t h ec o n s e r v e d r e s p o n s e e l e m e n t s e q u e n c e .A f t e r b i n d i n g t o t h e i r c e l l s u r f a c e r e c e p t o r s , m a n y s o l u b l ee x t r a c e l l u l a r s i g n a l i n g p r o t e i n s a r e t h o u g h t t o e x e r t t h e i rb i o l o g i c a l e f f e c t s b y i n d u c i n g a l t e r a t i o n s i n t h e p a t t e r n o f g e n ee x p r e s s i o n 1 , 2 ) . S i n c e m a n y c e l l s s i m u l t a n e o u s l y e x p r e s sr e c e p t o r s f o r a h o s t o f e x t r a c e l l u l a r s i g n a l i n g p r o t e i n s a n d t h ep h e n o t y p i c c h a n g e s i n d u c e d b y d i f f e r e n t p o l y p e p t i d e s v a r y ,s p e c i f i c i t y i n t h e s i g n a l i n g p r o c e s s m u s t e x i s t ( 2 ) . C o n s e -q u e n t l y , t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h s i g n a l s a r e t r a n s d u c e d f r o ma n o c c u p i e d c e l l s u r f a c e r e c e p t o r t o t h e n u c l e u s h a v e b e e n t h ef o c u s o f i n t e n s i v e i n v e s t i g a t i o n 3 , 4 .R e c e n t e x p e r i m e n t s e x p l a i n i n g i n t e r f e r o n ( I F N ) i n d u c t i o no f t r a n s c r i p t i o n h a v e s h e d l i g h t o n a g e n e r a l s i g n a l t r a n s d u c -t i o n m e c h a n i s m u s e d b y m a n y e x t r a c e l l u l a r s i g n a l i n g p r o t e i n s( f o r r e v i e w , s e e r e f s . 5 a n d 6 . I F N - - y s t i m u l a t e s t h e p h o s p h o r -y l a t i o n o n T y r a n d a c t i v a t i o n o f t w o c y t o p l a s m i c t y r o s i n ek i n a s e s b e l o n g i n g t o t h e JA K f a m i l y . A f t e r JA K a c t i v a t i o n ,S t a t l , a l a t e n t c y t o p l a s m i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r t h a t i s a mem-b e r o f a l a r g e r g e n e f a m i l y t e r m e d s i g n a l t r a n s d u c e r s a n da c t i v a t o r s o f t r a n s c r i p t i o n ( S T A T ) , i s p h o s p h o r y l a t e d o n as p e c i f i c T y r r e s i d u e . S t a t l t h e n h o m o d i m e r i z e s , t r a n s l o c a t e s t o

t h e n u c l e u s , b i n d s t o a d i s t i n c t DNA e l e m e n t , t h e I F N - , ya c t i v a t i o n s i t e ( G A S ) f o u n d i n t h e p r o m o t e r s o f I F N - y -i n d u c e d g e n e s , a n d i n d u c e s t r a n s c r i p t i o n . I n c o n t r a s t , I F N - al e a d s t o p h o s p h o r y l a t i o n o f b o t h S t a t l a n d S t a t 2 a n d a c t i v a t e sa DNA b i n d i n g c o m p l e x t h a t b i n d s a d i f f e r e n t c o n s e n s u ss e q u e n c e , t h e I F N - a - s t i m u l a t e d r e s p o n s e e l e m e n t , t h u s e x -p l a i n i n g t h e d i s t i n c t i v e p a t t e r n s o f g e n e i n d u c t i o n t h a t o c c u ra f t e r I F N - a a n d - , y t r e a t m e n t s ( 5 ) .I t w a s d i s c o v e r e d s u b s e q u e n t l y t h a t a h o s t o f c y t o k i n e s ,i n c l u d i n g v i r t u a l l y a l l o f t h o s e t h a t a c t t h r o u g h t h e c y t o k i n er e c e p t o r s u p e r f a m i l y ( 5 - 7 ) , a c t i v a t e o v e r l a p p i n g s e t s o f STATf a m i l y m e m b e r s a n d / o r S T A T - l i k e c o m p l e x e s t h a t b i n d t o t h es a m e GA S s e q u e n c e e l e m e n t s ( 5 ) . H o w e v e r , t h e d e t a i l s o fs p e c i f i c i t y o f b i n d i n g a n d t h e f u n c t i o n a l c o n s e q u e n c e s o fSTAT b i n d i n g t o t h e s e e l e m e n t s r e m a i n o b s c u r e . B y s y s t e m -a t i c a l l y d e t e r m i n i n g t h e a f f i n i t y o f v a ri o u s c y t o k i n e - a c t i v a t e dp r o t e i n s t o a s e r i e s o f s y n t h e t i c a n d n a t u r a l STAT b i n d i n ge l e m e n t s ( S B E s ) , we h a v e f o u n d t h a t s p a c i n g b e t w e e n i n v e r t e dr e p e a t s ( p a l i n d r o m i c h a l f s i t e s ) i n f l u e n c e s t h e s e l e c t i v i t y o fb o t h STAT DNA b i n d i n g a n d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n .

M A T E R I A L S AND METHODSR e a g e n t s . R e c o m b i n a n t h u m a n g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g ec o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r ( G M - C S F ) , i n t e r l e u k i n ( I L ) 4 , I L - 6 ,a n d o n c o s t a t i n M ( O S M ) w e r e o b t a i n e d f r o m R D S y s t e m s .Human I F N - , y w a s f r o m Amgen B i o l o g i c a l s .C e l l s a n d C e l l C u l t u r e . HepG2 ( h u m a n h e p a t o m a ) c e l l sw e r e o b t a i n e d f r o m t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n( A T C C ) a n d g r o w n i n E a g l e s minimum e s s e n t i a l m e d i u m /10 ( v o l / v o l ) f e t a l b o v i n e s e r u m ( F B S ) . U - 9 3 7 ( h u m a np r o m o n o c y t i c ) c e l l s ( A T C C ) w e r e g r o w n i n RP M I 1 6 4 0 m e -d i u m / 1 0 F B S . M E - 1 8 0 c e l l s ( h u m a n c e r v i c a l c a r c i n o m a )w e r e o b t a i n e d f r o m t h e AT C C a n d g r o w n i n M c C o y ' s 5 A / 1 0F B S . C y t o k i n e s w e r e u s e d a t t h e f o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s :

I F N - , y , 5 n g / m l ; I L - 4 , 1 0 - 3 0 n g / m l ; I L - 6 , 1 0 n g / m l ; GM-CSF,5 n g / m l .P r e p a r a t i o n o f N u c l e a r E x t r a c t s a n d G e l R e t a r d a t i o n A s -s a y s . N u c l e a r e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d 7 . N u c l e a re x t r a c t s w e r e p r e p a r e d f r o m u n t r e a t e d HepG2 c e l l s , HepG2c e l l s t r e a t e d f o r 1 5 m i n w i t h I F N - y o r 1 5 m i n w i t h I L - 6 ,u n t r e a t e d U - 9 3 7 c e l l s , a n d U - 9 3 7 c e l l s t r e a t e d f o r 3 0 m i n w i t hGM-CSF o r 3 0 m i n w i t h I L - 4 . T h e d o u b l e - s t r a n d e d o l i g o n u -c l e o t i d e p r o b e s w e r e f o r m e d b y a n n e a l i n g o l i g o n u c l e o t i d e sw i t h t h e s e q u e n c e s ( t h e a n t i s e n s e s t r a n d , e x c e p t w h e r e i n d i -c a t e d , w a s c o n s t r u c t e d s u c h t h a t , w h e n a n n e a l e d , b o t h s t r a n d sA b b r e v i a t i o n s : I L , i n t e r l e u k i n ; I F N , i n t e r f e r o n ; OSM, o n c o s t a t i n M ;G M - C S F , g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r ; S T A T ,s i g n a l t r a n s d u c e r s a n d a c t i v a t o r s o f t r a n s c r i p t i o n ; G A S , I F N - , y a c t i -v a t i o n s i t e ; S B E , STAT b i n d i n g e l e m e n t ; EMSA, e l e c t r o p h o r e t i c

I m o b i l i t y s h i f t a s s a y ; S I E , s i s - i n d u c i b l e e l e m e n t .t T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .3 0 4 1

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d a d v e r t i s e m e n t i na c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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P r o c . N a t L Acad S c i US A 9 2 ( 1 9 9 5 )w o u l d h a v e 5'-GATC o v e r h a n g s ; c o r e e l e m e n t s a r e u n d e r -l i n e d ) : 5 ' - G A T C T G C T T C C ( T ) n G G A A C G T - 3 ' , w h e r e n = 0( 4 s p A / 4 s p B ) , 1 ( 5 s p A ) , 2 ( 6 s p A ) , a n d 3 ( 7 s p A ) ; 5 -G A T C T G C T T C C ( C ) n G G A A C G T - 3 ' , w h e r e n = 1 ( 5 s p B ) ,2 ( 6 s p B ) , 3 ( 7 s p B ) , a n d 4 ( 8 s p B ) ; 5 ' - G A T C T G C T T C ( C ) n G A A -C G T - 3 ' , w h e r e n = 1 ( 3 s p C ) , 2 ( 4 s p C ) , 3 ( 5 s p C ) , 4 ( 6 s p C ) , 5( 7 s p C ) , a n d 6 ( 8 s p C ) ; 5'-GATCTGCTTC(T) GAACGT-3',w h e r e n = 2 ( 4 s p D ) , 3 ( 5 s p D ) , 4 ( 6 s p D ) , a n d 5 ( 7 s p D ) ;5 ' - G A T C T G C T T C T ( C ) n A G A A C G T - 3 ' , w h e r e n = 0 ( 4 s p E ) ,1 ( 5 s p E ) , 2 ( 6 s p E ) , a n d 3 ( 7 s p E ) ; 5'-GATCTCACTGTCAG-GAAGCGT-3' ( j u n B ) ; 5'-GATCCATTTCTGGAAATG-3'( S A A 3 ) ; 5 '-GATCGATTTCCCCGA A ATG-3 ' ( I R F - 1 ) ;5 '-GATCCA CTTCCCA AGA A CAGA-3 ' ( C e ) ; 5 ' - G A T C -CATTCCCCGTAAATC-3' ( S I E - 6 s p ) ; 5'-GATCCACTTTC-CA AGA A CAGA-3 ' ( C E - S s p ) ; 5'-GATCCATTTCCCGTA-AATC-3' ( m 6 7 / S I E - s e n s e ) ; 5'-CTAGGATTTACGGG-AAATG-3' ( m 6 7 / S I E - a n t i s e n s e ) . E l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t ys h i f t a s s a y s ( E M S A s ) w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d ( 7 ) .T r a n s i e n t T r a n s f e c t i o n A s s a y s . T h e l u c i f e r a s e r e p o r t e r p l a s -m i d s , b a s e d o n t h e p a r e n t t k - l u c p l a s m i d ( 7 ) , w e r e c o ns t ru c t e db y l i n k i n g t h e a p p r o p r i a t e o l i g o n u c l e o t i d e s e q u e n c e s i n m u l -t i p l e c o p i e s t o t h e p r o m o t e r o f t h e h e r p e s s i m p l e x v i r u st h y m i d i n e k i n a s e g e n e a t p o s i t i o n - 3 5 w i t h r e s p e c t t o t h e c a ps i t e . HepG2 a n d M E - 1 8 0 c e l l s w e r e t r a n s f e c t e d b y c a l c i u mp h o s p h a t e c o p r e c i p i t a t i o n w i t h t h e r e p o r t e r a n d a t r a n s f e c t i o nc o n t r o l p l a s m i d e x p r e s s i n g f - g a l a c t o s i d a s e a s d e s c r i b e d 7 .R e c o m b i n a n t c y t o k i n e s w e r e t h e n a d d e d a n d t h e c e l l s w e r eh a r v e s t e d a f t e r 5 h . C e l l s w e r e l y s e d a n d l u c i f e r a s e a n d1 3 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t i e s were d e t e r m i n e d . F o r e a c h s a m p l e ,t h e n o r m a l i z e d r e s p o n s e w a s d e t e r m i n e d b y d i v i d i n g r e l a t i v el i g h t u n i t s m e a s u r e d i n a l u c i f e r a s e a s s a y w i t h t h e f 3 - g a l a c t o -s i d a s e a c t i v i t y i n t h e same l y s a t e . F o l d i n d u c t i o n ( i n d u c e d /u n t r e a t e d ) w a s c a l c u l a t e d b y u s i n g t h e a v e r a g e d n o r m a l i z e dr e s p o n s e s f r o m t h r e e e x p e r i m e n t s .

R E S U LT SSTAT P r o t e i n - D N A C o m p l e x e s : E f f e c t o f V a r i a t i o n s i n C o r e

H a l f - S i t e S p a c i n g o n DN A B i n d i n g . T h e o b s e r v a t i o n t h a tm u l t i p l e c y t o k i n e s a p p e a r t o a c t i v a t e g e n e s t h r o u g h STATb i n d i n g e l e m e n t s w i t h s i m i l a r DNA s e q u e n c e s r a i s e s t h eq u e s t i o n o f how c y t o k i n e - s p e c i f i c g e n e r e g u l a t i o n i s a c h i e v e d .A p a r t i a l l i s t o f p r e v i o u s l y c h a r a c t e r i z e d G A S - l i k e e l e m e n t s i ss h o w n i n T a b l e 1 . T h e s e q u e n c e s o f t h e s e p a l i n d r o m i c S B E sv a r y c o n s i d e r a b l y , t h e o n l y s t r o n g l y c o n s e r v e d h a l l m a r k b e i n ga c o r e h a l f s i t e c o m p o s e d o f a TT s e q u e n c e s e p a r a t e d f r o m i t sp a l i n d r o m i c c o u n t e r p a r t , AA, b y 5 b p . T h i s c o r e h a l f s i t e( b o l d f a c e t y p e ) i s e m b e d d e d i n t h e o b s e r v e d c o n s e n s u s h a l fs i t e s , w h i c h h a v e t h e s e q u e n c e s T T C C , T T A C , a n d TTCT( T a b l e 1 . W e n o t e d t h a t t h e p r o m o t e r s o f some p r e v i o u s l yr e p o r t e d c y t o k i n e - i n d u c e d g e n e s c o n t a i n p o s s i b l e S B E s 9 , 1 0 ,1 2 ) t h a t d i f f e r i n n u c l e o t i d e s p a c i n g b e t w e e n t h e i r h a l f s i t e s .T h e s e o b s e r v a t i o n s l e d u s t o t e s t t h e r o l e o f h a l f - s i t e s p a c i n gi n c y t o k i n e s e l e c t i v i t y o f S B E s . W e d e s i g n e d s e t s o f DNAs e q u e n c e e l e m e n t s t h a t c o n t a i n f i x e d c o r e STAT b i n d i n gm o t i f s (TT-AA) s e p a r a t e d b y a d e f i n e d n u m b e r o f b a s e p a i r s ,k e e p i n g t h e f l a n k i n g s e q u e n c e s i d e n t i c a l i n e a c h c a s e . T h ea b i l i t y o f t h e s e e l e m e n t s t o b i n d t o STAT c o m p l e x e s a c t i v a t e db y d i f f e r e n t c y t o k i n e s w a s t e s t e d b y EMSA.T r e a t m e n t o f HepG2 ( h u m a n h e p a t o m a ) c e l l s w i t h h i g hd o s e s o f I L - 6 a c t i v a t e d t h r e e S T A T - c o n t a i n i n g c o m p l e x e sc a l l e d S I F - A , - B , a n d - C r e f s . 1 6 a n d 1 7 ; t h e s e t h r e e c o m p l e x e sc a n b e s e e n i n F i g . 1 A , l a n e 5 s p A / I L - 6 ) . A n t i b o d y s u p e r s h i f te x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t S I F - C a n d S I F - A w e r e l i k e l y t o b eh o m o d i m e r s o f S t a t l a n d S t a t 3 , r e s p e c t i v e l y , w h i l e S I F - Br e a c t e d w i t h b o t h a n t i s e r a a n d i s , t h e r e f o r e , t h o u g h t t o b e ah e t e r o d i m e r . T h e r e l a t i v e p o s i t i o n s o f S I F - A , - B , a n d - C i n a nE M S A a r e i n d i c a t e d o n F i g . 1 A . I F N - , y i n d u c e d a c o m p l e x t h a ti s a h o m o d i m e r o f S t a t l a n d m i g r a t e d i d e n t i c a l l y t o S I F - C .T r e a t m e n t o f t h e human p r o m o n o c y t i c c e l l l i n e U - 9 3 7 w i t h

T a b l e 1 . STAT b i n d i n g e l e m e n t s i n t h e p r o m o t e r s o fc y t o k i n e - r e s p o n s i v e g e n e sG e n e

GA S e l e m e n t sGB PI R F - 1L y - 6 EF c - y R 1I C S B PM I Ga L 2 - m a c r oC o r e s p a c i n g 5 b p

I L - 6 r e s p o n s i v e g e n e sj u n BS A A 3C o r e s p a c i n g 4 b p

I L - 4 r e s p o n s i v e g e n e sC sC - y lC s y 4F c s R I I aC o r e s p a c i n g 6 b p

N u c l e o t i d e s e q u e n c e

TTACTCTAATTCCCCGAATTCCTGTAATTCTGGGAATTCTCGGAATTACTATAATTCTGGGAATT N N N N N A AGTCAGGAATTCTGGAATT N N N N A ATT CCC A AGA ATTCCTAGGAATTCCTAGGAATACCTGAGAATTNNNNNNAA

R e f ( s ) .5

2 3553 258

91 0

1 1 , 1 21 2 , 1 31 41 2 , 1 5

L y - 6 E , m u r i n e s u r f a c e a n t i g e n ; I C S B P , i n t e r f e r o n c o n s e n s u s s e -q u e n c e b i n d i n g p r o t e i n ; M I G , m o n o k i n e i n d u c e d b y I F N - , y ; a 2 - m a c r o ,r a t a 2 - m a c r o g l o b u l i n ; C y l , C y l s t e r i l e t r a n s c r i p t ; C y 4 , C y 4 s t e r i l et r a n s c r i p t ; F c s R I I a , l o w - a f f i n i t y I g E r e c e p t o r . T h e GA S e l e m e n t sl i s t e d i n c l u d e e l e m e n t s k n o w n t o b e r e s p o n s i v e t o I F N - , y o r I L - 6 .GM-CSF ( 7 ) a n d I L - 4 ( 7 , 1 8 ) a l s o a c t i v a t e d d i s t i n c t GA Sb i n d i n g c o m p l e x e s t h a t d i d n o t r e a c t w i t h a n t i s e r a t o S t a t l , - 2 ,- 3 , o r - 4 a n d , t h e r e f o r e , c o n t a i n e d d i f f e r e n t STAT p r o t e i n s .T h e s e c o m p l e x e s a r e l i k e l y t h e s a m e a s t h o s e d e s c r i b e d f o rt h e s e l i g a n d s i n o t h e r c e l l l i n e s ( 1 2 , 1 9 , 2 0 ) . A STAT a c t i v a t e db y I L - 4 i n THP-1 c e l l s h a s b e e n c l o n e d r e c e n t l y a n d c o u l d b ea c o n s t i t u e n t o f a l l r e p o r t e d I L - 4 - i n d u c e d c o m p l e x e s ( 2 1 ) .H a v i n g e s t a b l i s h e d t h e m i g r a t i o n p a t t e r n o f e x t r a c t s f r o mI F N - - y - a n d I L - 6 - t r e a t e d HepG2 c e l l s a n d GM-CSF- a n dI L - 4 - t r e a t e d U - 9 3 7 c e l l s , w e t e s t e d t h e e f f e c t o f c h a n g i n g t h es p a c i n g o f t h e TT-AA c o n s e r v e d s e q u e n c e s o n t h e b i n d i n g o ft h e STAT c o m p l e x e s a c t i v a t e d b y t h e s e f o u r c y t o k i n e s ( F i g . 1A - F ) .T h e i n d i v i d u a l m e m b e r s o f t h e s e t o f o l i g o n u c l e o t i d e sd e s i g n a t e d s p A [ T T C C ( T ) , G G A A ] e x h i b i t e d c l e a r STATb i n d i n g p r e f e r e n c e s ( F i g . 1 A a n d B ) . T h e o l i g o n u c l e o t i d e w i t ht h e 5 - b p s p a c i n g ( 5 s p A , n = 1 , w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h es p a c i n g a s s o c i a t e d w i t h m o s t o f t h e S B E s c h a r a c t e r i z e d t o d a t e ,b o u n d s t r o n g l y t o t h e c o m p l e x e s a c t i v a t e d b y a l l f o u r o f t h et e s t e d c y t o k i n e s ( F i g . 1 A ) a n d s p e c i f i c a l l y s h o w e d t h e I F N - - yi n d u c t i o n o f a c o m p l e x i d e n t i c a l t o S I F - C a n d t h e I L - 6i n d u c t i o n o f a c o m p l e x t h a t m i g r a t e d l i k e S I F - A [ t h e s e b a n d sw e r e c o n f i r m e d t o b e r e a c t i v e t o S t a t l - o r S t a t 3 - s p e c i f i ca n t i s e r a ( 1 6 ) a n d w i l l b e r e f e r r e d t o a s S t a t l a n d S t a t 3h o m o d i m e r s ] . T h e s l i g h t l y d i f f e r e n t m i g r a t i o n s o f t h e I L - 4 -a n d G M - C S F - i n d u c e d b a n d s c a n a l s o b e s e e n . T h e o l i g o n u -c l e o t i d e w i t h t h e 4 - b p s p a c i n g b e t w e e n t h e TT-AA h a l f s i t e s( 4 s p A , n = 0 ) s h o w e d s e l e c t i v e b i n d i n g t o t h e S t a t 3 h o m o d i m e rt h a t i s p r e f e r e n t i a l l y i n d u c e d b y I L - 6 ( F i g . 1 A ) . T h i s s p a c i n gc o r r e s p o n d s t o t h e s p a c i n g o f t h e STAT b i n d i n g s i t e s f o u n d i nt h e I L - 6 - r e s p o n s i v e j u n B a n d SAA3 p r o m o t e r s ( T a b l e 1 . I nc o n t r a s t , o l i g o n u c l e o t i d e s w i t h t h e 6 - b p s p a c i n g ( 6 s p A , n = 2 ,w h i c h c o i n c i d e s w i t h t h e e l e m e n t s f o u n d i n t h e r e g u l a t o r yr e g i o n s o f I L - 4 - r e s p o n s i v e g e n e s , s e l e c t i v e l y b o u n d t h e STATc o m p l e x e s a c t i v a t e d b y I L - 4 ( F i g . 1 B ) .T h e b i n d i n g s p e c i f i c i t i e s o b s e r v e d f o r t h e s p A s p a c i n g s e tw e r e m o s t l y r e c a p i t u l a t e d b y u s i n g t w o a d d i t i o n a l s e t s o fs p a c i n g e l e m e n t s , s p B [ T T C C ( C ) n G G A A , F i g . 1 C a n d D ] a n ds p C [ T T C ( C ) n G A A , F i g . 1 E a n d F ] , w h i c h d i f f e r f r o m t h e s p As e r i e s i n t h e s e q u e n c e s b e t w e e n t h e TT-AA c o n s e r v e ds e q u e n c e . One n o t a b l e d i f f e r e n c e w a s t h a t t h e 4 s p C e l e m e n t

3 0 4 2 B i o c h e m i s t r y : S e i d e l e t a L

8/13/2019 Seidel STATsites

3/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 9 2 ( 1 9 9 5 ) 3 0 4 3A P r o b e : 4 s p A 5 s p A

C y t o k i n e : _ 9 9 c:

STAT _ AC o m p l e x e s [:. :,,, . . . . . . . . . . . . . .5B P r o b e : 6 s p A 7 s p AzC y t o k i n e : c _ z - u CD

Probe: 4sp. 4spA) 5spB

STATC o m p l e x e s

P r o b e : 4 spC 4 s p B

C ~~~~ n -'C y t o k i n e :cc_X C iSTAT

ComplexesP r o b e : 5 s p C 7s p C

C y t o k i n e : v , c [ CDSTATC o m p l e x e s L

F P r o b e : 5 s p C 4 s p CC y t o k i n e : u,c- ,=Zt.

STAT I _C o m p l e x e s : 'G P r o b e : j u n BG

C y t o k i n e : C ,S A A 3

_z 2 TC IL C a n

C o m p l e x e s C o n s t i t .

P r o b e : S I E S I E - 6 s pC y t o k i n e : c e9 zE9 CSTATC o m p l e x e s _

P r o b e : CE C E - 5 s pC y t o k i n e : c 0 : @ >S T A TC o m p l e x e s

F I G . 1 . S e l e c t i v e b i n d i n g o f STAT c o m p l e x e s t o DNA s e q u e n c ee l e m e n t s t h a t d i f f e r i n c o r e h a l f - s i t e s p a c i n g . N u c l e a r e x t r a c t s f r o m

( n = 2 ) b o u n d t o b o t h t h e S t a t 3 h o m o d i m e r a n d t h e p r e s u m e dS t a t l - S t a t 3 h e t e r o d i m e r ( l a n e I L - 6 ) . T h u s , t h e 4 - b p s p a c i n gc a n a c c o m m o d a t e S t a t 3 - c o n t a i n i n g c o m p l e x e s o t h e r t h a nS t a t 3 h o m o d i m e r s b u t d o e s n o t b i n d t h e S t a t l h o m o d i m e r . As e c o n d d i f f e r e n c e w a s t h a t t h e 5 s p C e l e m e n t ( n = 3 ) d i d n o tb i n d t o t h e S t a t 3 h o m o d i m e r a n d b o u n d o n l y w e a k l y t o t h eS t a t l - S t a t 3 h e t e r o d i m e r b u t s t i l l b o u n d t h e S t a t l h o m o d i m e r( l a n e s I F N - , y a n d I L - 6 ) . A d d i t i o n a l s e t s o f s p a c i n g e l e m e n t s( s p D a n d s p E ) w e r e t e s t e d i n t h e s a m e f a s h i o n b y EMSA, a n dt h e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . T h e s e d a t a c o n f i r m t h es p a c i n g p r e f e r e n c e s o f t h e GM-CSF- a n d I L - 4 - a c t i v a t e d STATc o m p l e x e s n o t e d i n F i g . 1 A a n d B . N o s p e c i f i c b i n d i n g w a so b s e r v e d f o r o l i g o n u c l e o t i d e s w i t h a s p a c i n g o f 3 b p o r 7 b p o rm o r e ( F i g . 1 B , D , a n d E a n d d a t a n o t s h o w n ) .T h e c o m p o s i t i o n o f t h e s p a c i n g n u c l e o t i d e s a l s o h a s a ni m p a c t o n t h e a b i l i t y o f o l i g o n u c l e o t i d e s t o b i n d . D a t a w i t h5 s p C ( d e s c r i b e d a b o v e ) a n d o t h e r o l i g o n u c l e o t i d e s e t s p o i n tt o t h e c o n t r i b u t i o n o f t h e e x t e n d e d h a l f s i t e s a n d s p a c i n gn u c l e o t i d e s t h e m s e l v e s t o STAT r e c o g n i t i o n , a s t h e s p D[ T T C ( T ) n G A A ] a n d s p E [ T T C T ( C ) n A G A A ] s e t s d o n o t b i n d t oS t a t l o r S t a t 3 c o m p l e x e s r e g a r d l e s s o f s p ac i ng ( T a b l e 2 ) .B i n d i n g o f STAT C o m p l e x e s t o N a t u r a l E l e m e n t s . W e n e x tw i s h e d t o c o r r e l a t e s p e c i f i c b i n d i n g a b i l i t y o f v a r i o u s s y n t h e t i cs p a c i n g e l e m e n t s w i t h t h a t o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g e l e m e n t s t h a td i f f e r i n h a l f - s i t e s p a c i n g , s u c h a s t h e j u n B a n d SAA3 ( 4 - b ps p a c i n g ) , h i g h - a f f i n i t y S I E ( 2 2 ) a n d I R F - 1 ( 5 - b p s p a c i n g ) , a n dhuman C E ( 6 - b p s p a c i n g ) e l e m e n t s . T h e j u n B e l e m e n t b e h a v e dm u c h l i k e t h e 4 s p A a n d 4 s p B e l e m e n t s a n d s e l e c t i v e l y b o u n dt h e S t a t 3 h o m o d i m e r ( F i g . 1 G , I L - 6 l a n e ) . T h e SAA3 e l e m e n ts h o w e d n o b i n d i n g d i s c r i m i n a t i o n b e t w e e n t h e STAT c o m -p l e x e s t e s t e d ( F i g . 1 G ) a n d b e h a v e d much l i k e t h e s y n t h e t i ce l e m e n t s w i t h a 5 - b p s p a c i n g [ h o w e v e r , t h i s e l e m e n t h a s t h es e q u e n c e TTT(N)4AAA s o t h a t i t c o u l d b e c o n s i d e r e d t o h a v ea 4 - , 5 - , o r 6 - b p s p a c i n g b e t w e e n TT a n d A A ] . T h e h i g h -a f f i n i t y S I E , a v a r i a n t o f t h e e l e m e n t i n t h e c - f o s p r o m o t e r t h a tc o n f e r s r e s p o n s i v e n e s s t o p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r ( 2 2 ) ,b o u n d a l l STAT c o m p l e x e s t e s t e d ( F i g . 1 H ) a s d o e s t h e I R F - 1GA S r e f s . 2 3 - 2 6 a n d d a t a n o t s h o w n ) . T h e human C s e l e m e n tb e h a v e d i n t h e s a m e m a n n e r a s t h e s y n t h e t i c 6 - b p - s p a c i n gHepG2 c e l l s e i t h e r u n t r e a t e d ( u n ) o r t r e a t e d w i t h I F N - y o r I L - 6 a n df r o m U - 9 3 7 c e l l s e i t h e r u n t r e a t e d ( u n ) o r t r e a t e d w i t h GM-CSF (GM)o r I L - 4 w e r e i n c u b a t e d w i t h t h e i n d i c a t e d l a b e l e d p r o b e s a n d a n a l y z e db y EM S A. T h e STAT c o m p l e x e s , i f p r e s e n t , a r e i n d i c a t e d b y b r a c k e t s .( A a n d B ) E M S A a n a l y s i s o f t h e s p A s e r i e s [ T T C C ( T ) , G G A A ] . T h e4 s p A e l e m e n t h a s a 4 - b p s p a c i n g b e t w e e n t h e TT-AA h a l f s i t e s , t h e5 s p A e l e m e n t h a s a 5 - b p s p a c i n g , t h e 6 s p A e l e m e nt h a s a 6 - b p s p a c i n g ,a n d t h e 7 s p A e l e m e n t h a s a 7 - b p s p a c i n g . B a n d s A , B , a n d C i n Ad e n o t e t h e r e l a t i v e m i g r a t i o n s o f t h e S I F - A , S I F - B , a n d S I F - Cc o m p l e x e s i n l a n e 5 s p A / I L - 6 . ( C a n d D ) E M S A a n a l y s i s o f t h e s p Bs e r i e s [ T T C C ( C ) n G G A A J . T h e 4 s p B e l e m e n t h a s a 4 - b p s p a c i n gb e t w e e n t h e TT-AA h a l f s i t e s , 5 s p B h a s a 5 b p s p a c i n g , 6 s p B h a s a6 - b p s p a c i n g , a n d 7 s p B h a s a 7 - b p s p a c i n g . ( E a n d F ) E M S A a n a l y s i so f t h e s p C s e r i e s [ T T C ( C ) n G A A ] . T h e 3 s p C e l e m e n t h a s a 3 - b p s p a c i n gb e t w e e n t h e TT-AA h a l f s i t e s , 4 s p C h a s a 4 b p s p a c i n g , 5 s p C h a s a5 - b p s p a c i n g , a n d 6 s p C h a s a 6 - b p s p a c i n g . ( G ) B i n d i n g o f STATc o m p l e x e s t o e l e m e n t s w i t h a 4 - b p s p a c i n g f r o m t h e p r o m o t e r s o fI L - 6 - r e s p o n s i v e g e n e s . J u n B i s f r o m t h e m u r i n e j u n B p r o m o t e r , a n dSAA3 i s f r o m t h e m u r i n e s e r u m a m y l o i d A3 p r o m o t e r [ b e c a u s e o f i t sTTT(N)4AAA s t r u c t u r e , t h e S A A 3 e l e m e n t c a n b e v i e w e d a s h a v i n ga m b i g u o u s s p a c i n g b e t w e e n t h e TT-AA h a l f s i t e s ] . ( H a n d I ) B a s ec h a n g e s t h a t a l t e r c o r e h a l f - s i t e s p a c i n g i n n a t u r a l STAT b i n d i n ge l e m e n t s a l t e r t h e i r STAT b i n d i n g s p e c i f i c i t y . S I E i s t h e h i g h - a f f i n i t yv a r i a n t o f t h e s i s - i n d u c i b l e e l e m e n t ( S I E ) f r o m t h e h u m a n c - f o sp r o m o t e r , a n d C s i s t h e STAT b i n d i n g e l e m e n t f r o m t h e h u m a n C sc o n t r o l r e g i o n . T h e S I E e l e m e n t h a s a 5 - b p s p a c i n g b e t w e e n t h eTT-AA h a l f s i t e s . T h e S I E - 6 s p e l e m e n t d i f f e r s f r o m t h e S I E b y as i n g l e b a s e s u b s t i t u t i o n a n d h a s a 6 - b p s p a c i n g . T h e C s e l e m e n t h a s a6 - b p s p a c i n g , a n d t h e C s - 5 s p e l e m e n t d i f f e r s f r o m C s b y a s i n g l e b a s es u b s t i t u t i o n a n d h a s a 5 - b p s p a c i n g .

B i o c h e m i s t r y : S e i d e l e t a L

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4/5

3 0 4 4 B i o c h e m i s t r y : S e i d e l e t a lT a b l e 2 . STAT c o m p l e x b i n d i n g t o e l e m e n t s d i f f e r i n g i n c o r eh a l f - s i t e s p a c i n gS p a c i n g , B i n d i n gb p S e q u e n c e I F N - - y I L - 6 GM-CSF I L - 4

s p A s e r i e s4 TTCCGGAA - + - -5 TTCCTGGAA ++ ++ +++ ++6 TTCCTTGGAA - - - +++7 TTCCTTTGGAA - - - -

s p B s e r i e s4 TTCCGGAA - + - -5 TTCCCGGAA ++ +++ +++ ++6 TTCCCCGGAA - - - +++7 T T C C C C CGG A A - - - -8 T T C C C C C CGG A A - - - -

s p C s e r i e s3 TTCCGA A - - - -4 TTCCCGAA - +++ - -5 T T C C C CG A A ++ - +++ ++6 TTCCCCCGAA - - - +++7 T T C C C C C CG A A - - - -8 T T C C C C C C CG A A - - - -

s p D s e r i e s4 TTCTTGAA - 5 TTCTTTGAA - - + +6 TTCTTTTGAA - - - +7 TTCTTTTTGAA - - - -

s p E s e r i e s4 TTCTAGAA - - - -5 TTCTCAGAA - - ++ ++6 TTCTCCAGAA - - - ++7 TTCTCCCAGAA - - - -B i n d i n g a f f i n i t i e s a s e s t i m a t e d b y b a n d i n t e n s i t y f r o m E M S Aa n a l y s i s w e r e r a t e d a s f o l l o w s : - , n o t d e t e c t a b l e o r f a i n t l y v i s i b l e ; + ,w e a k i n t e n s i t y ; + + , m o d e r a t e i n t e n s i t y ; + + + , s t r o n g i n t e n s i t y . T h ef l a n k i n g s e q u e n c e s w e r e i d e n t i c a l f o r a l l o f t h e e l e m e n t s . S p a c i n g

n u c l e o t i d e s a r e i n b o l d f a c e t y p e . E n t r i e s i n t h e I F N - - y c o l u m n i n d i c a t eb i n d i n g b y t h e S t a t l h o m o d i m e r . E n t r i e s i n t h e I L - 6 c o l u m n i n d i c a t eb i n d i n g b y S t a t 3 - c o n t a i n i n g c o m p l e x e s .e l e m e n t s a n d b o u n d t o t h e I L - 4 - a c t i v a t e d STAT c o m p l e x e ss e l e c t i v e l y ( F i g . 1 I ) .T h e d i c h o t o m y b e t w e e n b i n d i n g s p e c i f i c i t y c o n f e r r e d b y as p a c i n g o f 5 b p a n d 6 b p w a s e x a m i n e d i n more d e t a i l . A s i n g l eb a s e c h a n g e w a s made i n t h e h i g h - a f f i n i t y S I E t h a t c o n v e r t e di t f r o m a 5 - b p s p a c i n g t o a 6 - b p s p a c i n g ( S I E - 6 s p , TTCCCCG-T A A ) , a n d a s i n g l e b a s e c h a n g e w a s m a d e i n t h e C s e l e m e n tt h a t c o n v e r t e d i t f r o m a 6 - b p s p a c i n g t o a 5 - b p s p a c i n g ( C s - 5 s p ,TTCCAAGAA). T h e s e e l e m e n t s w e r e t h e n e x a m i n e d f o r t h e i rb i n d i n g t o t h e STAT c o m p l e x e s i n t h e t e s t e x t r a c t s b y E M S A( F i g . 1 H a n d I . T h e S I E - 6 s p m u t a t i o n c o n v e r t e d t h e S I Es e q u e n c e f r o m a n o n s e l e c t i v e STAT b i n d i n g s e q u e n c e t o as e l e c t i v e I L - 4 - a c t i v a t e d STAT b i n d i n g s e q u e n c e . C o n v e r s e l y ,t h e C s - 5 s p m u t a t i o n c o n v e r t e d t h e C s e l e m e n t f r o m a ne x c l u s i v e I L - 4 - a c t i v a t e d STAT b i n d i n g s e q u e n c e t o a s e q u e n c et h a t d i s p l a y s a more g e n e r a l STAT b i n d i n g p a t t e r n . T h e s er e s u l t s f u r t h e r s u p p o r t t h e c o n c e p t t h a t s p a c i n g o f t h eTT-AA h a l f s i t e s c a n p l a y a p i v o t a l r o l e i n d e t e r m i n i n g t h es p e c i f i c i t y o f STAT b i n d i n g .T r a n s c r i p t i o n a l A c t i v i t i e s o f STAT C o m p l e x e s o n S p a c i n gE l e m e n t s . W e n e x t e x a m i n e d t h e f u n c t i o n a l c o n s e q u e n c e s o fv a r y i n g t h e c o r e h a l f - s i t e s p a c i n g on STAT t r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o n i n t r a n s i e n t t r a n s f e c t i o n s . S e v e r a l o f t h e s y n t h e t i ca n d n a t u r a l SBEs w e r e p l a c e d i n m u l t i p l e t a n d e m c o p i e su p s t r e a m o f t h e h e r p e s s i m p l e x v i r u s t h y m i d i n e k i n a s e m i n i -m a l p r o m o t e r d i r e c t i n g t h e e x p r e s s i o n o f t h e f i r e f l y l u c i f e r a s eg e n e . T h e r e p o r t e r c o n s t r u c t s w e r e t h e n t r a n s f e c t e d i n t oHepG2 c e l l s o r I L - 4 - r e s p o n s i v e M E - 1 8 0 ( c e r v i c a l c a r c i n o m a )c e l l s . I F N - y a n d I L - 6 t r e a t m e n t o f M E - 1 8 0 c e l l s r e s u l t e d i n

P r o c . N a t l . Acad S c i . USA 9 2 ( 1 9 9 5 )a c t i v a t i o n o f t h e s a m e STAT c o m p l e x e s i nd uc e d b y t h e s ec y t o k i n e s i n HepG2 c e l l s . O SM, w h o s e r e c e p t o r s h a r e s t h eg p l 3 O s i g n a l i n g c o m p o n e n t w i t h t he I L - 6 r e c e p t o r ( 2 7 ) , a c t i -v a t e d t h e s a m e DNA b i n d i n g c o m p l e x e s a s d o e s I L - 6 i n b o t hc e l l l i n e s ( r e f s . 1 7 a n d 2 8 a n d d a t a n o t s h o w n ) .T h e t r a n s f e c t i o n r e s u l t s f o r t h e r e p o r t e r c o ns t ru c t s i nHepG2 c e l l s a r e s h o w n i n F i g . 2A (GM-CSF a n d I L - 4 w e r e n o tt e s t e d , a s HepG2 c e l l s d o n o t e x p r e s s t h e i r r e c e p t o r s ) . T h er e p o r t e r c o n t a i n i n g t h e 4 s p C e l e m e n t ( 4 - b p s p a c i n g ) w a ss p e c i f i c a l l y i n d u c e d b y I L - 6 a n d O SM, t h e t w o c y t o k i n e s t h a tp r e d o m i n a n t l y a c t i v a t e d S t a t 3 , b u t n o t b y I F N - y , w h i c h p r e -d o m i n a n t l y a c t i v a t e d S t a t l . T h e r e p o r t e r c o n t a i n i n g t h e n a t i v ej u n B e l e m e n t ( 4 - b p s p a c i n g ) a l s o s h o w e d a s e l e c t i v e , t h o u g hm o d e s t , i n d u c t i o n b y I L - 6 a n d O S M . T h e s e r e s u l t s c o r r e l a t ed i r e c t l y w i t h t h e b i n d i n g d a t a s h o w n a b o v e ( F i g . 1 . I n t e r e s t -i n g l y , t h e n a t i v e SAA 3 e l e m e n t [ t h e e l e m e n t w i t h t h eTTT(N)4AAA c o m p o s i t i o n ] , w h i c h d i d n o t d i s c r i m i n a t e i nb i n d i n g b e t w e e n t h e STAT c o m p l e x e s t e s t e d , m e d i a t e d p r e f -e r e n t i a l i n d u c t i o n b y I L - 6 a n d OSM c o m p a r e d t o I F N - , y i nHepG2 c e l l s . T h e r e p o r t e r s c o n t a i n i n g t h e 5 s p A a n d I R F - 1

Ac0

~ 0

U -

t t t C \ t t tD x x x x x x xv C ) n c < m C O c n . : 0 0:C

4bp 5bp 6bpS p a c i n g S p a c i n g S p a c i n gB

C0~ 0

, I F N g M E - 1 8 01 o B I L - 68 D O S m6 - [ 3 I L - 44 -2 -0 - u t t t

_ x x xX C m

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 9 2 ( 1 9 9 5 ) 3 0 4 5e l e m e n t s ( 5 - b p s p a c i n g ) , w h i c h b o u n d t o a l l o f t h e STATc o m p l e x e s t e s t e d , s h o w e d n o s e l e c t i v i t y a n d m e d i a t e d t r a n -s c r i p t i o n a l i n d u c t i o n b y a l l t h r e e c y t o k i n e s . T h e r e p o r t e r sc o n t a i n i n g t h e e x p a n d e d 6 - b p s p a c i n g d i d n o t r e s p o n d t oI F N - , y , I L - 6 , o r OSM. T h u s , t h e o b s e r v e d i n v i t r o STATb i n d i n g s p e c i f i c i t y f o r t h e v a r i o u s b i n d i n g s i t e s i s i n m o s ti n s t a n c e s a r e l i a b l e i n d i c a t o r o f t h e i r t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y i nHepG2 c e l l s .T h e t r a n s f e c t i o n r e s u l t s f o r t h e r e p o r t e r c o n s t r u c t s i n M E -1 8 0 c e l l s a r e s h o w n i n F i g . 2 B . T h e e l e m e n t s w i t h a 4 - b ps p a c i n g a g a i n s e l e c t i v e l y m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n a l i n d u c t i o n b yI L - 6 a n d OSM, a c t i v a t o r s o f S t a t 3 . T h e r e p o r t e r s c o n t a i n i n gt h e 5 - b p s p a c i n g e l e m e n t s a g a i n r e s p o n d e d t o I F N - , y , I L - 6 , a n dOSM; h o w e v e r , s o m e w h a t s u r p r i s i n g l y , t h e y d i d n o t r e s p o n d t oI L - 4 t h o u g h t h e y b o u n d t o t h e I L - 4 - a c t i v a t e d STAT c o m p l e x .T h e r e p o r t e r c o n t a i n i n g t h e 6 - b p s y n t h e t i c s p a c i n g e l e m e n t6 s p B d i d n o t r e s p o n d t o a n y o f t h e c y t o k i n e s t e s t e d ( t h o u g h i tb o u n d s p e c i f i c a l l y t o t h e I L - 4 - a c t i v a t e d STAT c o m p l e x ) , b u tt h e n a t u r a l C s e l e m e n t w i t h a 6 - b p s p a c i n g m e d i a t e d s t r o n ga n d e x t r e m e l y s e l e c t i v e t r a n s c r i p t i o n a l i n d u c t i o n b y I L - 4 a n di s , t h e r e f o r e , a f u n c t i o n a l a c t i v a t i o n s i t e .

D I S C U S S I O NT h e r e c e n t d i s c o v e r i e s t h a t t h e STAT c o m p l e x e s a c t i v a t e d b ya v a r i e t y o f e x t r a c e l l u l a r s i g n a l i n g p r o t e i n s b i n d t o s i m i l a rDNA e l e m e n t s r a i s e s t h e q u e s t i o n o f w h e t h e r a n d ho w t r a ns c r i p t i o n a l s p e c i f i c i t y i n e n d o g e n o u s g e n e s o c c u r s 2 , 5 , 6 .O u r r e s u l t s p r o v i d e e v i d e n c e t h a t a t l e a s t a p a r t o f a n ys p e c i f i c i t y t h a t e x i s t s i n S T A T - m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n a l i n d u c -t i o n d e p e n d s o n t h e s p a c i n g b e t w e e n t h e p a l i n d r o m i c c o r e h a l fs i t e s o f S B E s . I n a d d i t i o n , i t i s c l e a r t h a t s e q u e n c e s b e t w e e n t h eTT a n d AA p a l i n d r o m i c b o u n d a r i e s a l s o a f f e c t s p e c i f i c i t y . T h es p a c i n g o f 5 b p b e t w e e n t h e TT-AA c o r e s e q u e n c e i s f o u n di n many p r e v i o u s l y c h a r a c t e r i z e d n a t u r a l s i t e s , a n d s e v e r a l o ft h e 5 - b p - s p a c e d s y n t h e t i c s e q u e n c e s b o u n d c o m p l e x e s i n d u c e db y a l l f o u r t e s t c y t o k i n e s . T h e s e 5 - b p - s p a c i n g e l e m e n t s m e d i -a t e d t r a n s c r i p t i o n a l i n d u c t i o n b y c y t o k i n e a c t i v a t o r s o f e i t h e rS t a t l o r S t a t 3 ( I F N - , y , I L - 6 , a n d O S M ) , b u t t h e y d i d n o t d i r e c tt r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n b y t h e I L - 4 - i n d u c e d S T A T s . I t h a sb e e n r e p o r t e d t h a t t h e F c e R I I b e l e m e n t ( 1 5 ) , w h i c h h a s a 5 - b ps p a c i n g ( T T C T A A G A A ) , b i n d s t o t h e I L - 4 - a c t i v a t e d STATc o m p l e x ( 1 2 , 1 8 ) a n d i s n e c e s s a r y f o r I L - 4 - i n d u c e d e x p r e s s i o no f t h e F c s R I I b g e n e ( 1 8 ) . W e f o u n d t h a t t h i s 5 - b p s p a c i n ge l e m e n t a l s o d o e s n o t c o n f e r I L - 4 r e s p o n s i v e n e s s i n t h e c o n t e x to f a m i n i m a l p r o m o t e r e v e n w h e n m u l t i m e r i z e d ( H . M . S . a n dL . H . M . , u n p u b l i s h e d d a t a ) .T h e c l e a r e s t r e s u l t s w i t h r e s p e c t t o s p e c i f i c STAT b i n d i n ga n d s e l e c t i v e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n w e r e w i t h c h a n g e s i ns p a c i n g o f t h e TT-AA c o r e t o 4 o r 6 b p . T h e 4 - b p s p a c i n g( p a r t i c u l a r l y w i t h C C C G a s t h e b a s e s ) a l l o w e d b i n d i n g o n l y b yc o m p l e x e s c o n t a i n i n g S t a t 3 . A c c o r d i n g l y , t h e n a t u r a l ( j u n Ba n d S A A 3 ) a n d s y n t h e t i c 4 - b p - s p a c i n g e l e m e n t s m e d i a t e d as e l e c t i v e r e s p o n s e t o a c t i v a t o r s o f S t a t 3 ( I L - 6 a n d O S M ) .E l e m e n t s w i t h a 6 - b p s p a c i n g , w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e S B E si n s e v e r a l I L - 4 - r e s p o n s i v e g e n e s , s t r o n g l y a n d s e l e c t i v e l y b i n dt o t h e STAT p r o t e i n s a c t i v a t e d b y I L - 4 . T h o u g h t h e c o n s t r u c tc o n t a i n i n g t h e s y n t h e t i c 6 - b p - s p a c i n g e l e m e n t was n o t i n d u c e db y I L - 4 , t h e n a t u r a l s i t e f r o m t h e human C s c o n t r o l r e g i o n ,w h i c h c o n t a i n s a s i t e w i t h a 6 - b p s p a c i n g , w a s a c t i v e .T h e s e r e s u l t s s h o w t h a t w h i l e b i n d i n g o f STAT c o m p l e x e s t oS B E s may b e a g u i d e t o e f f e c t i v e n e s s o f a p r o m o t e r e l e m e n ti n t r a n s c r i p t i o n , t h e r e i s n o a s s u r a n c e t h a t b i n d i n g w i l l e n s u r ei n d u c t i o n . I n a d d i t i o n t o t h e i m p o r t a n c e o f s e q u e n c e s w i t h i nt h e c o r e , w e h a v e a l s o n o t e d some e f f e c t s o f s e q u e n c e s o u t s i d et h e 9 - t o 1 0 - b p b o u n d a r y o f t h e c o n s e r v e d e l e m e n t ( H . M . S . ,L . H . M . , P . L . , a n d J . E . D . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . I n s p i t e o f t h e s e

c a v e a t s , we f e e l t h a t t h e e x p e r i m e n t s c l e a r l y e s t a b l i s h a d i f -f e r e n c e b e t w e e n t h e a b i l i t y o f G A S - l i k e e l e m e n t s c o n t a i n i n gt h e c o r e m o t i f TT-AA s p a c e d 4 , 5 , a n d 6 b p a p a r t t o d i r e c tg e n e e x p r e s s i o n i n r e s p o n s e t o d i f f e r e n t c y t o k i n e s .T h e s p a c i n g e f f e c t s o b s e rv e d w i t h STAT b i n d i n g t o S B E s a r er e m i n i s c e n t o f r e s u l t s o b t a i n e d f o r i n t r a c e l l u l a r r e c e p t o r s s u c h a st h e r e t i n o i c a c i d a n d v i t a m i n D 3 r e c e p t o r s b i n d i n g t o t h e i r r e -s p o n s e e l e m e n t s ( 2 9 - 3 1 ) . T h u s , b y a n a l o g y , STAT r e s p o n s e e l e -m e n t s c o m p o s e d o f v a r i o u s l y s p a c e d d i r e c t r e p e a t s a n d i n v e r t e dp a l i n d r o m e s o f t h e SBE c o r e h a l f s i t e m a y e x i s t . I n t r i g u i n g l y , t h ec o n s e n s u s I F N - a - s t i m u l a t e d r e s p o n s e e l e m e n t i s m a d e u p o f ad i r e c t r e p e a t o f t h e SBE h a l f - s i t e s e q u e n c e GAA s e p a r a t e d b ye i t h e r 2 o r 3 b p 5 .I n c o n c l u s i o n , o u r r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t t h e s p e c i f i c i t y o fS T A T - d i r e c t e d t r a n s c r i p t i o n i n r e s p o n s e t o p a r t i c u l a r c y t o -k i n e s o r c y t o k i n e f a m i l i e s d e p e n d s i n p a r t o n t h e s p a c i ng o fh a l f s i t e s w i t h i n t h e c o n s e r v e d r e s p o n s e e l e m e n t s e q u e n c e .W e t h a n k D . E . L e v y , P . T a p l e y S . - S . T i a n , L . K e s s l e r , J . H a s l a m ,a n d J . M i n e r f o r h e l p f u l d i s c u s s i o n s . J . E . D . i s a c o n s u l t a n t w i t h L i g a n dP h a r m a c e u t i c a l s .

1 . M i y a j a m a , A . , K i t a m u r a , T . , H a r a d a , N . , Y o k a t a , T . A r a i , K . ( 1 9 9 2 )A n n u . R e v . I m m u n o l . 1 0 , 2 9 5 - 3 3 1 .2 . L e v y , D . D a r n e l l , J . E . , J r . ( 1 9 9 0 ) Ne w B i o l . 2 , 9 2 3 - 9 2 8 .3 . F a n t l , W. J . , J o h n s o n , D . E . W i l l i a m s , L . T . ( 1 9 9 3 ) A n n u . R e v . B i o c h e m .6 2 , 4 5 3 - 4 8 1 .4 . K i s h i m o t o , T . , T a g a , T . A k i r a , S . ( 1 9 9 4 ) C e l l 7 6 , 2 5 3 - 2 6 2 .5 . D a r n e l l , J . E . , J r . , K e r r , I . M . S t a r k , G . R . ( 1 9 9 4 ) S c i e n c e 2 6 4 , 1 4 1 5 - 1 4 2 1 .6 . I h i e , J . N . , W i t t h u h n , B . A . , Q u e l l e , F . W . , Y a m a m o t o , K . , T h i e r f e l d e r ,W. E . , K r e i d e r , B . S i l v e n n o i n e n , 0 . ( 1 9 9 4 ) T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 9 ,2 2 2 - 2 2 7 .7 . L a m b , P . , K e s s l e r , L . V . , S u t o , C . , L e v y , D . E . , S e i d e l , H . M . , S t e i n , R . B . R o s e n , J . ( 1 9 9 4 ) B l o o d 8 3 , 2 0 6 3 - 2 0 7 1 .8 . W e g e n k a , U . M . B u s c h m a n n , J . , L u t t i c k e n , C . , H e i n r i c h , P . H o r n , F .( 1 9 9 3 ) Mo. C e l l . B i o l . 1 3 , 2 7 6 - 2 8 8 .9 . N a k a j i m a , K . , K u s a f u k a , T . , T a k e d a , T . , F u j i t a n i , Y . , N a k a e , K . H i r a n o ,T . ( 1 9 9 3 ) M o l . C e l l . B i o . 1 3 , 3 0 2 7 - 3 0 4 1 .1 0 . H a t t o r i , M . , A b r a h a m , L . J . , N o r t h e m a n n , W. F e y , G . H . ( 1 9 9 0 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i . USA 8 7 , 2 3 6 4 - 2 3 6 8 .1 1 . R o t h m a n , P . , C h e n , Y . Y . , L u t z k e r , S . , L i , S . C . , S t e w a r t , V . , C o f f m a n , R . A l t , F . ( 1 9 9 0 ) M o . C e l l . B i o . 1 0 , 1 6 7 2 - 1 6 7 9 .1 2 . K o t a n i d e s , H . R e i c h , N . ( 1 9 9 3 ) S c i e n c e 2 6 2 , 1 2 6 5 - 1 2 6 7 .1 3 . X u , M . S t a v n e z e r , J . ( 1 9 9 2 ) EMBO J . 1 1 , 1 4 5 - 1 5 5 .1 4 . S i d e r a s , P . , M i z u t a , T . - R . , K a n a m o r i , H . , S u z u k i , N . , O k a m o t o , M . K u z e ,K . , O h n o , H . , D o i , S . , F u k u h a r a , S . , H a s s a n , M . S . , H a m m a r s t r o m , L . ,S m i t h , E . , S h i m i z u , A . H o n j o , T . ( 1 9 8 9 ) I n t . I m m u n o l . 1 , 6 3 1 - 6 4 2 .1 5 . S u t e r , U . , T e x i d o , G . H o f s t e t t e r , H . ( 1 9 8 9 ) J . I m m u n o l . 1 4 3 , 3 0 8 7 - 3 0 9 2 .1 6 . Z h o n g , Z . , W e n , Z . D a r n e l l , J . E . , J r . ( 1 9 9 4 ) S c i e n c e 2 6 4 , 9 5 - 9 8 .1 7 . R a z , R . , D u r b i n , J . E . L e v y , D . E . ( 1 9 9 4 ) J . B i o . C h e m . 2 6 9 , 2 4 3 9 1 - 2 4 3 9 5 .1 8 . K o h l e r , I . R i e b e r , E . P . ( 1 9 9 3 ) E u r . J . I m m u n o L 2 3 , 3 0 6 6 - 3 0 7 1 .1 9 . L a r n e r , A . C . , D a v i d , M . , F e ld m a n, G . M . , I g a r a s h i , K . , H a c k e t t , R . , W e b b ,D . S . A . , S w e i t z e r , S . M . , P e t r i c o i n , E . F . , I I I , F i n b l o o m , D . S . ( 1 9 9 3 )S c i e n c e 2 6 1 , 1 7 3 0 - 1 7 3 3 .2 0 . S c h i n d l e r , C . , K a s h l e v a , H . , P e r n i s , A . , P i n e , R . R o t h m a n , P . ( 1 9 9 4 )EMBO J . 1 3 , 1 3 5 0 - 1 3 5 6 .2 1 . H o u , J . , S c h i n d l e r , U . , H e n z e l , W. J . , H o , T . C . , B r a s s e u r , M . M c K n i g h t ,S . L . ( 1 9 9 4 ) S c i e n c e 2 6 5 , 1 7 0 1 - 1 7 0 6 .2 2 . W a g n e r , B . J . , H a y e s , T . E . , H o b a n , C . J . C o c h r a n , B . H . ( 1 9 9 0 ) EMBO

J . 9 , 9 2 7 - 9 3 2 .2 3 . S i m s , S . H . , C h a , Y . , R o m i n e , M . F . , G a o , P . , G o t t l i e b , K . D e i s s e r o t h ,A . B . ( 1 9 9 3 ) M o l . C e l l . B i o l . 1 3 , 6 9 0 - 7 0 2 .2 4 . Y u a n , J . , W e g e n k a , U . M . , L u t t i c k e n , C . , B u s c h m a n n , J . , D e c k e r , T . ,S c h i n d l e r , C . , H e i n r i c h , P . C . H o r n , F . ( 1 9 9 4 ) M o . C e l l . B i o l . 1 4 ,1 6 5 7 - 1 6 6 8 .2 5 . P i n e , R . , C a n o v a , A . S c h i n d l e r , C . ( 1 9 9 4 ) EMBO J . 1 3 , 1 5 8 - 1 6 7 .2 6 . H a r r o c h , S . , R e v e l , M . C h e b a t h , J . ( 1 9 9 4 ) EMBO J . 1 3 , 1 9 4 2 - 1 9 4 9 .2 7 . S t a h l , N . Y a n c o p o u l o s , G . D . ( 1 9 9 3 ) C e l l 7 4 , 5 8 7 - 5 9 0 .2 8 . A k i r a , S . , N i s h i o , Y . , I n o u e , M . , W a n g , X . - J . , W e i , S . , M a t s u s a k a , T . ,Y o s h i d a , K . , S u d o , T . , N a r u t o , M . K i s h i m o t o , T . ( 1 9 9 4 ) C e l l 7 7 , 6 3 - 7 1 .2 9 . U m e s o n o , K . , M u r a k a m i , K . K . , T h o m p s o n , C . C . E v a n s , R . M . ( 1 9 9 1 )C e l l 6 5 , 1 2 5 5 1 2 6 6 .3 0 . N a a r , A . M . B o u t i n , J . - M . , L i p k i n , S . M . Y u , V . C . , H o l l o w a y , J . M . , G l a s s ,C . K . R o s e n f e l d , M . G . ( 1 9 9 1 ) C e l l 6 5 , 1 2 6 7 - 1 2 7 9 .3 1 . C a r l b e r g , C . ( 1 9 9 3 ) B i o c h e m B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 9 5 , 1 3 4 5 - 1 3 5 3 .3 2 . K a n n o , Y . , K o z a k , C . A . , S c h i n d l e r , C . , D r i g g e r s , P . H . , E n n i s t , D . L . ,G l e a s o n , S . L . , D a r n e l l , J . E . , J r . , O z a t o , K . ( 1 9 9 3 ) M o l . C e l l . B i o l . 1 3 ,3 9 5 1 - 3 9 6 3 .

B i o c h e m i s t r y : S e i d e l e t a t