Replicação do DNA
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Replicação do DNA
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
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Mitose / Meiose
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Como acontece a síntese do DNA?
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Meselson-Stahl experiment
• 1957• Cresceram E. coli em meio
com N-15 e depois voltaram pra N-14
• Purificação do DNA das bactérias
• Três tipos de DNA– N-15 + N-15– N-15 + N-14– N-14 + N-14
• Ao aquecer o N-15 + N-14 e separar as fitas ficava claro que uma fita continha N-15 e outra N-14
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Replicação semi-conservativa
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Origens de replicação
• Locais com um contexto de sequência específico
• Ligam proteínas específicas
• Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação
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Origens de replicação
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Replicação
• DNA Polimerase III• Sentido 5’ → 3’• Nucleotídeos 3P
são adicionados– Liberação de
Pirofosfato
http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf
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Primase
• Ribonucleoproteína• Liga-se à helicase em
procariotos formando o chamado primossomo
• Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH
• DNA polimerase lenta e sujeita a erros
• Evita a progressão da forquilha uma vez que a fita líder anda mais rápido
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Micrografia, bolha de replicação
Forquilhas de replicação
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Forquilha de replicação
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Replicação das fitas
• Fita líder– Primase age uma vez
• Fita retardada– Primase age várias vezes– 1967, Fragmentos de Okasaki Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication possible
discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967 Jun;20(3):255-60
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Primase na fita retardada
• Deslocamento da forquilha de replicação
• Primase faz primer
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Direções de replicação na Forquilha
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Desenovelamento do DNA
• Retirada das histonas• Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs)• DNA helicase
– Quebra pontes de H
• DNA topoisomerases– Tiram a tensão
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Forquilha de replicação
Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua)
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DNA polimerase• Enzimas que catalisa a reação
de síntese do DNA
• Adiciona nucleotídeos tri-fosfato à extremidades 3’OH livre
• Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’>3’ (endonuclease 5’>3’)
• Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre)
• Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’>5’)
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Tipos de DNA polimerase
• DNA polimerase I– Descoberta em 1956 (Kornberg pai)– Função precisa descoberta apenas em 1969: remove
o primer de RNA da fita descontínua
• DNA polimerase III– Descoberta em 1970 (Kornberg filho)– Principal enzima que realiza a replicação em
procariotos
• DNA polimerase II– Lenta, envolvida em reparo do DNA
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DNA Replication
• DNA Pol precisa de um molde inicial
• Primase: gera um molde de RNA complementar
• A DNA Pol III agora é capaz de adicionar bases à extremidade 3’OH
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Eliminação dos
fragmentos de Okasaki
DNA Pol I
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Mecanismo da enzima Ligase
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Visão geral
Repare na posição do primer de
RNA
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Reparo pela Polimerase
• Mecanismo de verificação(Proof-reading)
• DNA-polimerase possui– Uma atividade de
polimerização 5’→ 3’– Uma atividade de
exonuclease 3’→ 5’
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Reparo pela Polimerase
• Mecanismo de verificação(Proof-reading)
• DNA-polimerase possui– Uma atividade de
polimerização 5’→ 3’– Uma atividade de
exonuclease 3’→ 5’
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DNA Repair
• Checagem de pareamento incorreto(eucariotos)
• Proteínas especiais para reparo do erro
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E as extremidades dos cromossomos?
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Doenças causadas por problemas no mecanismos de replicação
• Ataxia de Friedreich's– dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares,
na fala e doenças no coração)– forma mais comum das ataxias herdadas– A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40
repetições, o indivíduo apresenta a doença.
• Xeroderma pigmentosum – envelhecimento precoce – aumento na incidência de câncer– Falha no mecanismo de reparação
do DNA causado pela luz UV
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Ciclo celular
• A replicação do DNA é regulada temporalmente
• Fase S do ciclo celular
• Checkpoints do ciclo celular
• Ciclinas
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Conclusões
• Replicação semi-conservativa• Bolha de replicação avança em duas direções• Fita líder e fita retardada• Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA• Primase faz o primer• DNA polimerase III, DNA polimerase I• DNA ligase• Telomerase