DO DNA AO PRODUTO GÊNICO
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1 DO DNA AO PRODUTO GÊNICO DNA FORENSE E CLINICO FORS 241 Forensic DNA Profiling (3) Anderson The course introduces the student to the procedures involved in DNA profiling of evidence. This will include DNA extraction, quantitation, amplification and detection of mitochondrial DNA and short tandem repeat polymorphisms. This course is required for all forensic molecular biology students. FORS 242 Forensic Molecular Biology (3) Dawson Advanced methods of forensic molecular biology. Laboratory examinations and classifications of dried blood and other biological materials through a variety of nuclear and mitochondrial markers. Independent laboratory projects.
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DO DNA AO PRODUTO GÊNICO
DNA FORENSE E CLINICO
FORS 241 Forensic DNA Profiling (3) AndersonThe course introduces the student to the procedures involved in DNA profiling of evidence. This will include DNA extraction, quantitation, amplification and detection of mitochondrial DNA and short tandem repeat polymorphisms. Thiscourse is required for all forensic molecular biology students.
FORS 242 Forensic Molecular Biology (3) DawsonAdvanced methods of forensic molecular biology. Laboratory examinations and classifications of dried blood and otherbiological materials through a variety of nuclear and mitochondrial markers. Independent laboratory projects.
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Um exame de DNA, feito sem o consentimento de Roberta Jamilly Martins Borges, 23, provou, segundo a polícia, que ela não é filha natural de Vilma Martins Costa, 47, mulher acusada de levar o hoje adolescente Pedrinho -registrado como Osvaldo Martins Borges Júnior- de uma maternidade, em 1986.
Por meio de uma bituca de cigarro deixada por Roberta no lixo da delegacia, em janeiro deste ano, os peritos conseguiram isolar a saliva da jovem e fazer o exame. Os policiais tiveram ajuda de especialistas em genética e do Instituto de Pesquisa de DNA Forense, da Polícia Civil de Brasília.
BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE
-IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIMES ANIMAIS/VEGETAIS
-IDENTIFICAÇÃO DE INDIVÍDUOS
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IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIMES ANIMAIS
DETERMINAÇÃO DO INTERVALO POST MORTEM
Diferentes espécies de moscas procuram os corpos em diferentes intervalos post mortemENTOMOLOGIA FORENSE
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIMES ANIMAIS
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PCR-RFLP
Factor V Leiden humano
Relação com propensão a trombose profunda
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O CRIMINOSO NORMALMENTE DEIXA ALGO NA CENA DO CRIME OU LEVA CONSIGO ALGUMA COISA
BOTÂNICA FORENSE
Plantas podem ser identificadas utilizando-se apenas 1 mm de tecido seco, 5 grãos de pólen fresco ou 10 pgramas de DNA
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIMES VEGETAIS
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIMES VEGETAIS
-Caso Maricopa (Arizona - Maio de 1992)
Mulher foi morta e encontrada em um depósito abandonado.Suspeito nega ter estado perto do depósito.Encontradas sementes de Maricopa no furgão do suspeito.Através de um teste de genotipagem de DNA (RAPD) as sementes foram diagnosticadas como das árvores ao redor do depósito (teste cego com várias outras amostras).
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RAPD
Random Amplified Polymorphic DNAPrimers pequenos (x)10Temperatura de anelamento baixa
A B
-Produtos do mesmo tamanhoapresentam mesmo locus gênico
-Presença de produtos é um caracter dominante (AA ou Aa)
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IDENTIFICAÇÃO DE INDIVÍDUOS
-É necessário a utilização de regiões polimórficas de DNA.
-Quanto mais locus são testados, maior a probabilidade de acerto.
Para testes de paternidade e forense, até 18 locusdiferentes são testados.
-Normalmente são utilizados STR (short tandem repeats)
STR ou microssatélites
Locus específico no genoma
Presença de milhares no homem
Kits com microssatélites pré-estabelecidos
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STR ou microssatélites
-Regiões repetitivas de DNA (de 1 a 6 nucleotídeos)-Altamente polimórficos (polimorfismo de tamanho)-Facilmente tipados
EXEMPLO:
actaatctagcgggctagcttagcttaggctaatgctagctgcatgcatgcatgcatgcatgcatgcatgatctgcatgcagattttcgctccctaaccgctatagctagcgcat
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STR ou microssatélites
O FBI registrou 13 diferentes STR para o uso na identificação de criminosos. (CODIS – Combined DNA Index System)
13%4.3%2.3%9.9%1.7%4.4%8.2%Frequency
11, 1312, 1329, 3112, 1319, 2416, 1615, 18Genotype
D5S818 D18S51D21S11D8S1179FGAvWAD3S1358Locus
(Male)7.2%3.52%9.6%9.5%6.3%1.2%Frequency
X Y11, 118, 89, 9.311, 1110, 1011, 11Genotype
AMELCSF1POTPOXTHO1D16S539D7S820D13S317Locus
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STR ou microssatélites
STR ou microssatélites
Passos para a análise:
1. Extração do DNA
Normalmente em testes de paternidade o DNA é extraído de células da mucosa da boca. Para estudos forense, amostras de sangue, cabelo, fragmento de pele, etc...)
Quantificação
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2. Amplificação do DNA
O DNA referente a cada locus é amplificado com oligonucleotídeos específicos daquele locus.
EX: actaatctagcgggctagcttagcttaggctaatgctagctgcatgcatgcatgcatgcatgcatgcatgatctgcatgcagattttcgctccctaaccgctatagctagcgcat
STR ou microssatélites
STR ou microssatélites
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STR ou microssatélites
3. Detecção do DNA amplificado
Utiliza-se oligonucleotídeos fluorescentes com diferentes espectros. Normalmente são possíveis 3 marcações diferentes dos oligos mais a marcação do padrão de peso.
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EXEMPLOS DE TESTES
EXEMPLOS DE TESTES
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EXEMPLOS DE TESTES
EXEMPLOS DE TESTES
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13%4.3%2.3%9.9%1.7%4.4%8.2%Frequency
11, 1312, 1329, 3112, 1319, 2416, 1615, 18Genotype
D5S818 D18S51D21S11D8S1179FGAvWAD3S1358Locus
(Male)7.2%3.52%9.6%9.5%6.3%1.2%Frequency
X Y11, 118, 89, 9.311, 1110, 1011, 11Genotype
AMELCSF1POTPOXTHO1D16S539D7S820D13S317Locus
PROBABILIDADES
-Neste caso as freqüências dos alelos 15 e 18 do locus D3S1358 são respectivamente 0.2825 e 0.1450. A frequencia em que se encontra um indivíduo 15,18 é:P=2pq que é igual a 2x 0.2825 x 0.1450 = .0819 (8,2%).
-A probabilidade de se encontrar um mesmo indivíduo com os mesmos alelos é: P=p1 x p2 x p3…..= 1.3 x 10-16.
Ou seja a chance de se encontrar este indivíduo é 1/ 1.3 x 10-16 que é igual a 7,7 milhõesde bilhões ou mais de 1 milhão a população da terra.
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PCR e o diagnóstico clínico
Prevenção precoce do câncer de mama
genes BRCA1 e BRCA2
BRCA1 e 2
Mulheres judias com ascendência ashkenazim tem chance de 1/40 de desenvolver algum tipo de mutação. Outras mulheres tem chance de 1/500
Existem 3 entre as 150 mutações encontradas mais ligadas ao desenvolvimento do câncer
Mulher com algumas destas 3 mutações tem 56% de chance de desenvolver tumores antes dos 70 anos
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PCR e o diagnóstico clínico
Prevenção de trombose profunda
Entre 40% e 60% dos casos de trombose venosa hereditáriadevem-se a presença do fator V resistente a açãoproteolítica da Proteína C ativada.
Um estudo realizado em 1994 mostrou que uma mutação no gene do fator V causa 95% dos casos de resistência a PCA.
A mutação do Fator V Leiden é encontrada em 30% a 60% dos pacientes com trombofilia hereditária e entre 3% a 7% das pessoas sadias em populações caucasianas.
FATOR V LEIDEN
Fig. 1 – Amplificação por PCR na região do exon 10 do gene do fator V, seguida de digestão pela enzima MnlI (Biolab“), para a detecção da mutação Fator V Leiden, Visualização após eletroforese em gel de poliacrilamida 7% e coloração por brometo de etídeo. Raia 1: marcador de peso molecular fX 174 RF/Hae III digest Pharmacia“); raias 2 e 3: pacientes que não apresentaram a mutação analisada; raias 4 e 6: pacientes com a mutação Fator V Leiden em heterozigose; raia 5: paciente com a mutação Fator V Leiden em homozigose.
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PCR e o diagnóstico clínico
Outros diagnósticos:
-PREVENÇAO A DEFEITOS DO TUBO NEURAL
-PROPENSÃO A DOENÇA DE ALZHEIMER
-IDENTIFICAÇÃO PRECOCE DA DOENÇA DO RIM POLICÍSTICO
-PREVENÇAO A DOENÇAS CARDÍACAS
PCR e o diagnóstico clínico
Detecção viral
HIV, hepatite B, hepatite C, etc...
PCR para detecção de Leishmania chagasiPCR para detecção e genotipagem de Plasmodium falciparumDetecção de parasitas em casos assintomáticos
