1

REGULATORNI MOLEKULI RNK — "SKRIVENI JEZIK

RNK"

Prema hipotezi RNK sveta rani život bio je zasnovan na molekulima RNK koji su kasnije čuvanje

informacije "prepustili" stabilnijem molekulu DNK, a katalitičke funkcije svestranijim proteinima. Zbog

toga, bez obzira na njihove ključne uloge u procesima translacije i splajsovanja, molekuli RNK su

donedevno shvatani kao prolazni intermedijeri izmeĎu gena i proteina, kako i predviĎa centralna dogma

molekularne biologije. MeĎutim, fascinantno otkriće da se najveći deo genoma eukariota transkribuje na

vremenki i prostorno regulisan način (93% kod čoveka!), kao i otkriće različitih klasa nekodirajućih

RNK, dovelo je u pitanje tradicionalno shvatanje RNK i ukazalo da su molekuli RNK nastavili da

evoluiraju uporedo sa DNK i proteinima. Uzbudljiva otkrića vezana za molekule RNK u poslednjih

desetak godina ukazuju da oni obavljaju najraznovrsnije funkcije u današnjim eukariotskim ćelijama,

uključujući i čitav niz regulatornih funkcija.

Otkriće novog RNK sveta bitno je izmenilo naše shvatanje o organizaciji i funkcionisanju

eukariotskog genoma, a sa tim i osnovne koncepte molekularne biologije, kao što su definicija i

organizacija gena u genomu i centralna dogma molekularne biologije. Danas je jsano da kod eukariota

genom eksprimira dva nivoa informacija: iRNK, koje kodiraju proteine, i nekodirajuće RNK, uglavnom

sa regulatornom funkcijom. Regulatorne RNK su esencijalne u kontroli svih nivoa ekspresije genoma i

formiraju složenu regulatornu mrežu koja funkcioniše paralelno sa regulatornom mrežom proteina. Geni

se danas smatraju delovima genoma koji se transkribuju i koji su modularno, a ne linearno rasporeĎeni u

genomu.

1. MALE NEKODIRAJUĆE RNK - PREGLED

Nekodirajuće RNK su svi funkcionalni molekuli RNK koji se ne translatiraju u proteine. Najveći broj

njih obavlja regulatornu funkciju, a neki imaju strukturnu i/ili katalitičku ulogu. Regulatorni molekuli

RNK se dele u dve grupe: duge nekodirajuće RNK i male regulatorne RNK. Prema podacima projekta

ENCODE (The Encyclopedia of DNA Elements) iz 2013. godine broj gena za duge nekodirajuće RNK u

genomu čoveka je 13 870, a broj gena za male nekodirajuće RNK je 9 013

(http://www.gencodegenes.org/stats.html).

Duge nekodirajuće RNK (eng. long non-coding RNA, lncRNK) su duže od 200 nukleotida (nt),

ne sadrže jasan okvir čitanja i, uglavnom, predstavljaju regulatorne molekule koji su uključeni u svim

nivoima ekspresije genoma: epigenetičku, transkripcionu, post-transkripcionu, translacionu i post-

tanslacionu regulaciju.

Male nekodirajuće RNK (eng. small non-coding RNA) su dužine 20 do 30 nt, prepoznaju

komplementarnu sekvencu u ciljnim RNK i kroy interakciju sa proteinima familije Argonaut regulišu

invazivne nukleinske kiseline (virusne RNK i transpozone), post-transkripcionu ekspresiju genoma i

epigenetičku memoriju. Familija proteina Argonaut je evoluciono visoko konzervisana i

2

specijalizovana za vezivanje i ostvarivanje funkcije malih regulatornih RNK. Dve velike subfamilije

proteina Argonaut su proteini AGO i proteini PIWI (eng. P-element induced wimpy testis).

Represija ili utišavanje ciljnih nukleinskih kiselina koje su komplementarne malim nekodirajućim

RNK naziva se RNK interferencija (RNKi). RNKi je modularan mehanizam u kome male nekodirajuće

RNK prepoznaju ciljne nukleinske kiseline, a proteini familije Argonaut obavljaju efektorne funkcije,

samostalno ili kroz interakciju sa dodatnim proteinima.

Utišavanje ekspresije gena pomoću RNKi ostvaruje se (1) post-transkripcionom

represijom/utišavanjem komplementarne ciljne RNK i (2) epigenetičkom utišavanjem komplementarnih

sekvenci u genomu. Na post-transkripcionom nivou RNKi reguliše stabilnost i translaciju ciljnih RNK

sledećim mehanizmima: endonukleolitičkom degradacijom, translacionim represijom/utišavanjem i

destabilizacijom ciljne iRNK. Poslednjih godina akumuliraju se podaci da male nekodirajuće RNK mogu

stimulisati translaciju ciljnih RNK. U epigenetičkoj regulaciji male nekodirajuće RNK usmeravaju

uspostavljanje odreĎne strukture hromatina u regionima genoma koji sadrže sekvence komplemantarne sa

malim RNK. Ovaj proces zahteva aktivnu transkripciju u regionu koji se epigenetički reguliše i uključuje

dva mehanizma: ko-transkripciono epigenetičko utišavanje i RNK-usmerenu metilaciju DNK (eng. RNA-

directed DNA methylation, RdDM).

RNKi otkrivena je 1998. godine kao veštački fenomen, kada je opisano da unošenje sintetičke

dvolančane RNK u C. elegans dovodi do produkcije malih RNK koje na sekvenca-specifičan način

degraduju iRNK. Samo osam godina kasnije, 2006. godine, za otkriće RNKi dodeljena je Nobelova

nagrada. Danas je poznato da je RNKi prirodan fenomen, široko zastupljen meĎu eukariotima. Biološki

procesi u kojima je uključena su odbrana od invazivnih nukleinskih kiselina (virusa i transpozona), i

epigenetička i post-transkripciona regulacija ekspresije gena povezana sa svim aspektima funkcionisanja

eukariotskih ćelija tokom razvića i u normalnim i patološkim uslovima. Od 2013. godine poznato je da

RNKi nije ekskluzivno svojstvo eukariota, već je reč o drevnom mehanizmu koji i prokarioti koriste kako

bi kontrolisali strane nukleinske kiseline.

Tabela 1. Klase malih nekodirajućih RNK

Vrsta Dužina

(nt) Prekursor

Obrada

prekursora

Subamilija

Argonaut Mehanizam delovanja Funkcija

siRNK 21-25

Egzogena ili

endogena duga

dvolančana RNK

Dicer AGO

Endonukleolitička

degradacija

Epigenetičko utišavanje

Odbrana od virusa

Regulacija transpozona

Regulacija ekspresije gena

miRNK 21-23

Jednolančana RNK

koja formira

strukturu ukosnice

Drosha i

Dicer AGO

Translaciona represija

Endonukleolitička

degradacija

Translaciona aktivacija

Regulacija ekspresije

gena

piRNK 24-32 Duge jednolančane

RNK Nepoznata PIWI

Endonukleolitička

degradacija

Epigenetičko utišavanje

Translaciona represija i

aktivacija?

Regulacija transpozona

Regulacija ekspresije gena

nt – nukleotid

Funkcije koje se primarno vezuju za odreĎenu klasu malih nekodirajućih RNK prikazane su u boldu

3

Veštačka RNKi primenjuje se kao veoma efikasna ekspreimentalna alatka za utišavanje gena.

Ona omogućava i novi pristup u dizajniranju genetičkih terapija koje mogu specifično isključiti funkciju

nekog gena.

Prema široko prihvaćenoj podeli, male nekodirajuće RNK dele se u tri klase, koje se meĎusobno

razlikuju po biogenezi (poreklu i načinu obrade prekursornog molekula od kojeg nastaju), proteinima

familije Argonaut sa kojima stupaju u interakciju, mehanizmima kojim ostvaruju RNKi i funkcijama koje

obavljaju (tabela 1).

Male interferirajuće RNK (eng. small interfering RNA, siRNA) su dužine 21-25 nt, nastaju

obradom dugog dvolančanog prekursora endoribonukleazom Dicer i stupaju u interakciju sa proteinima

AGO (slika 1, tabela 1). Dugi dvolančani prekursori siRNK su ili egzogeno unete (virusna RNK ili

sintetička RNK) ili endogeno sintetisane RNK. Ove regulatorne RNK imaju funkciju u odbrani od virusa,

kontoli transpozona i regulaciji ekspresije gena. Funkcije ostvaruju endonukleolitičkom degradacijom

ciljnog transkripta ili usmeravanjem epigenetičkog utišavanja.

MikroRNK (miRNK) su dugačke 21 do 23 nt, nastaju obradom jednolančanog prekursora RNK

u obliku ukosnice endoribonukleazama Drosha i Dicer, i stupaju u interakciju sa proteinima AGO.

MikroRNK imaju esencijalnu ulogu u post-transkripcionoj regulaciji ekspresije gena, koju ostvaruju

endonukleolitičkom degradacijom ciljne RNK, translacionom represijom i destabilizacijom ciljne iRNK,

ali i translacionom aktivacijom (slika 1, tabela 1).

RNK koje stupaju u interakciju sa proteinima PIWI (eng. PIWI-interacting RNA, piRNK) su

dugačke 24 do 32 nt, nastaju od veoma dugačkih jednolančanih prekursora čija obrada ne uključuje enzim

Dicer, stupaju u interakciju sa proteinima PIWI i dovode do degradacije ciljnih RNK (slika 1, tabela 1).

Piwi RNK su karakteristične samo za životinje i imaju ključnu ulogu u kontroli transpozona i razviću i

diferencijaciji polnih ćelija. Endonukleolitički degraduju transkripte prepisane sa transpozona i

usmeravaju epigenetičko utišavanje genomskih kopija transpozona. Noviji podaci ukazuju da piRNK

mogu kontrolisati i ekspresiju gena translacionim represijom ili translacionom aktivacijom.

4

Slika1. Male nekodirajuće RNK. Tri klase malih nekodirajućih RNK razlikuju se prema biogenzi, proteinima

familije Argonaut sa kojima stupaju u interakciju, mehanizmima delovanja i funkcijama koje obavljaju. Male

interferirajuće RNK (siRNK) nastaju od egzogeno unetih ili endogeno sintatisanih dvolančanih prekursora koje u

citoplazmi obraĎuje Dicer. Stupaju u interakciju sa proteinima AGO i dovode do endonukleolitičke degradacije

ciljnog transkripta ili usmeravaju epigenetičko utišavanje ciljnih sekvenci u genomu (nije prikazano na slici).

MikroRNK (miRNK) nastaju od prekursora prepisanog sa gena za miRNK koji formira strukturu ukosnice i

obraĎuje se sa Drosha i Dicer. Stupaju u interakciju sa proteinima AGO i ukoliko se perfektno spare se ciljnom

RNK dovode do njene endonukleolitičke degradacije. U slučaju neperfektnog sparivanja sa ciljnom RNK, miRNK

dovode do translacione represije interferiranjem sa cirkularizacijom iRNK ili stabilnošću iRNK. Alternativni put

biogeneze miRNK iz mirtrona, prekursora miRNK kodiranog celim intronom, ne zahteva učešće Drosha več

iskrajanjem mirtorona nastaje pre-miRNK. RNK koje stupaju u interakciju sa proteinima PIWI (piRNK) nastaju od

veoma dugačkih jednolančanih prekursora čija obrada ne uključuje enzim Dicer i stupaju u interakciju sa proteinima

PIWI. Karakteristične su za životinje. Dovode do post-transkripcione degradacije aktivnih transpozona i

epigenetičkog utišavanja genomskih kopija transpozona (nije prikazano na slici).

5

2. MIKRORNK (MIRNK)

MikroRNK su otkrivene 2004. godine kod C. elegans, a kasnije su opisane kod svih izučavanih životinja,

biljaka i nekih virusa. Predstavljaju male nekodirajuće RNK sa esencijalnom funkcijom u

post-transkripcionoj regulaciji ekspresije gena kod životinja i biljaka. Procenjuje se da je jedna

polovina gena za proteine kod čoveka regulisana sa miRNK. Jedna miRNK može imati veliki broj

(stotine, čak i hiljade) ciljnih iRNK, dok jedna iRNK može biti regulisana sa većim brojem miRNK. Uz

to, eksprasija miRNK je tkvino i razvojno regulisana. Navedeno ukazuje da je regulacija ekspresije gena

sa miRNK veoma složena i da direktno ili indirektno utiče na skoro svaki aspekt razvića i funkcionisanja

u fiziološkim i patološkim stanjima. Mutacije u putu miRNK dovode do poremećaja razvića, i često su

letalne za embrion. Poremećaji u ekspresiji i funkciji miRNK vezuju se i za razna patološka stanja kao što

su maligne bolesti, razvojni poremećaji i bolesti imusnkog sistema.

2.1. Geni za mikroRNK

MikroRNK su kodirane genima koji su nezavisno rasporeĎeni u genomu ili su delovi gena za proteine,

gena za duge nekodirajuće RNK ili pseudogena (slika 2a). U okviru drugih gena, geni za miRNK nalaze

se u intronima, ali su opisani i u netranslatirajućim i kodirajućim delovima gena za proteine (slika 2a).

TakoĎe, geni za miRNK kod sisara mogu se nalaziti u ponovljenim sekvencama genoma, pre svega u

transpozonima. Neki geni za miRNK kod biljaka imaju introne, alternativno se splajsuju i sadrže

alternativne signale za poliadenilaciju.

Transkripti prepisani sa gena za miRNK formiraju strukturu ukosnice. U "ručici" dvolančane

drške nalazi se informaciju za zrelu miRNK (slika 2b). Sve je veći broj primera da obe "ručice" iz drške

sadrže informaciju za po jednu zrelu miRNK, od kojih svaka ima svoju grupu ciljnih transkripata.

Karakteristična sekundarna struktura ukosnice omogućava da se bioinformatičkim predikacijama

identifikuju nove miRNK i njihovi ciljni geni. Bioinformatički identifikovane miRNK označavaju se

prefiksom miR i rednim brojem. Baza podataka za miRNK, MiRBase (http://www.mirbase.org/), sadrži

24 521 bioinformatički predviĎenih prekursora miRNK u genomima 206 vrsta, za koje je procenjeno da

mogu eksprimirati 30 424 zrele miRNK (Release 20, 2013. godina). U odnosu na 2011. godinu broj

predviĎenih zrelih miRNK se skoro udvostručio. Potvrda da je predviĎena sekvenca ćelijska miRNK

podrazumeva njeno identifikovanje u ćelijama, kao i utvrĎivanje da ekspresija ciljnog gena zavisi od

prisustva ispitivane miRNK. Za preko 300 prijavljenih sekvenci iz genoma čoveka postoji

eksperimentalna potvrda da predstavljaju miRNK.

6

Slika 2. Geni za mikroRNK i njihovi transkripti : a) geni za miRNK nalaze se u okviru različitih regiona gena,

najčešće u intronima; b) Transkripti prepisani sa gena za miRNK formiraju karakterističnu strukturu ukosnice i u

ručici ukosnice sadrže sekvence za jednu ili dve različite miRNK (sekvence označene crvenim i plavim slovima).

2.2. Biogeneza mikroRNK i formiranje utišavajućeg kompleksa miRISC

Funkcionalne miRNK su obično dugačke 21 do 23 nt i nastaju od prekursornog molekula, primarne

miRNK (pri-miRNK) koja ima strukturu ukosnice (slike 1 i 4). Pri-miRNK sa nezavisnih gena

transkribuje Pol III, a gene za miRNK koji su deo drugih gena najverovatnije transkribuje Pol II. U

nukleusu, delovanjem endoribonukleaze Drosha od pri-miRNK nastaje prekursor miRNK

(pre-miRNK), koji se transportuje u citoplazmu (slike 1 i 4). U citoplazmi, pre-miRNK je supstrat za

drugu endoribonukleazu Dicer, čijom aktivnošću nastaje dvolanĉana miRNK. Ona stupa u interkaciju sa

jednim od proteina AGO, nakon čega se formira kompleks jednolančana miRNK-AGO. Ovaj kompleks

sa dodatnim proteinima, formira utišavajući kompleks miRISC (eng. miRNA-induced silencing

complexes), koji deluje na ciljne iRNK (slike 1 i 4).

Ključni proteini u biogenezi miRNK su Drosha i Dicer. Pripadaju endoribonukleazama iz

familije RNaza III. RNaze III deluju na dvolančane RNK uvodeći po jedan prekid u oba lanca. Drosha i

Dicer imaju vezivne domene za dvolanĉanu RNK (eng. double strand RNA binding domains, dsRBDs),

duge oko 65 aminokiselina, pomoću kojih prepoznaju i vezuju dvolančanu RNK (slika 3). Pomoću dva

simetrična RNazna domena uvode po jedan prekid u oba lanca dvolančane RNK. Mesto sečenja

selektuju merenjem, a ne prepoznavanjem specifične sekvence RNK (slika 4). Dvolančani prekid u RNK

supstartu je asimetričan, tako da oba proteina ostavljaju jednolančane 3'-krajeve dužine dva nt (eng.

3'-overhang) (slika 4). Drosha sadrži još dva domena za protein-protein interakcije(slika 3). Dicer sadrži

još četiri funkcionalna domena, od kojih domen PAZ specifično prepoznaje i vezuje jednolančani 3'-kraj

dužine dva nt. Naziv je dobio po proteinima u kojima se nalazi (Piwi, Argonaute i Zwille) (slika 3).

7

Kičmenjaci i C. elegans sadrže po jedan gen za Dicer, dok D. melanogaster sadrži dva. Biljke

imaju veći broj proteina sličnih Diceru (eng. Dicer-like proteins), koji obavljaju specijalizovane funkcije

u kompleksu sa različitim proteinima koji se vezuju za dvolančane RNK. Genomi biljka ne sadrže ortolog

gena za Drosha, i svi koraci u biogenezi miRNK kod Arabidopsis thaliana obavljaju se pomoću jednog

od četiri proteina sličnih Diceru.

Slika 3. Domenska organizacija ribonukleaza Drosha i Dicer i njihovih pomoćnih proteina: Drosha i Dicer,

kao i njihovi pomoćni proteini DGCR8 (eng. DiGeorge syndrome critical region gene 8) i TRBP (eng. TAR RNA

binding protein), imaju jedan ili više domena za prepoznavanje i vezivanje dvolančane RNK (plavi pravougaonici).

Drosha i Dicer imaju simetrične RNazne domene odgovorne za RNaza III endonukleolitičku reakciju. Drosha sadrži

još dva funkcionalna domena za protein-protein interakcije - domen P bogat Pro, i domen RS, bogat Arg i Ser. Dicer

sadrži još četri funkcionalna domena - domen PAZ, koji vezuje 3'-kraj pre-miRNK dugačak dva nt, i domene

nepoznate funkcije (DEAD-boks RNK helikazni domen, helikazni domen i domen DUF). Protein DGCR8 sadrži i

domen WW odgovoran za interakcije protein-protein. Veličina svakog proteina izražena je u broju aminokiselina.

Drosha i Dicer svoje funkcije obavljaju u kompleksu sa partner proteinima (kofaktorima) koji

sadrže vezivne domene za dvolančanu RNK (slika 3). Partneri Drosha su protein pasha kod D.

melanogaster i protein DGCR8 (eng. DiGeorge syndrome critical region gene 8) kod sisara. Partener

Dicera kod D. melanogaster je produkt gena loquacious i kod sisara protein TRBP (eng. TAR RNA

binding protein).

Pri-miRNK se savija u dvolančanu strukturu ukosnice koja sadrži dršku i kratku jednolančanu

petlju. Dvolančana bazno sparena drška je dugačka 33 bp (tri helijačna okreta dvolančane RNK) i sadrži

samo nekoliko pogrešno sparenih baza (slike 2b i 4a). Region drške sadrži dva funkcionalna dela: donji

deo, približne dužine 11 bp, i gornji deo, približne dužine 22 bp u kome se nalazi buduća zrela miRNK

(slike 4a i b). Na vrhu drške je petlja različite veličine (obično oko 10 nt), čija sekvenca nije bitna za

obradu.

U nukleusu, kompleks Drosha-DGCR8, poznat i kao mikroprocesorski kompleks, uvodi dva

prekida u pri-miRNK oslobaĎajući samu strukturu ukosnice, koja predstavlja pre-miRNK (slika 4). Za

obradu kompleksom Drosha-DGCR8 neophodn je jednolančani region RNK koja ograničava 5'- i

3'-krajeve drške i dvolančana drška. Granica jednolančane i dvolančane RNK u pri-miRNK odreĎuje

mesto sečenja, jer Drosha uvodi prekide na mestima koja su po 11 bp udaljena od te granice, odnosno

izmeĎu gornjeg i donjeg funkcionalnog dela drške. Sa dva uvedena asimetrična prekida formira se

pre-miRNK dugačka oko 65 do 70 nt, koja je izgraĎena iz jednolančanog 3'-kraja dužine dva nt,

dvolančane drške dužine 22 bp i jednolančane petlje (slika 4b).

8

Slika 4. Obrada primarne miRNK (pri-miRNK) i prekursora miRNK (pre-miRNK) a) Pri-miRNK formira

strukturu ukosnice koja se sastoji od dvolančane drške dugačke ~33 bp i jednolančane petlje. Dvolančana drška je

izgraĎena od dva funkcionalna domena: donjeg od ~11 bp i gornjeg od ~22 bp. b) Drosha se zajedno sa proteinom

DGCR8 vezuje za pri-miRNK i uvodi dva asimetrična jednolančana prekida u dršci i to 11 nt od granice

jednolančane i dvolančane RNK, formirajući prekursor miRNK (pre-miRNK). Pre-miRNK je dugačka ~65 do 70 nt

i izgraĎena je iz jednolančanog 3'-kraja dužine dva nt, dvolančane drške dužine 22 bp i jednolančane petlje; c)

Trodimenzionalna struktura Dicera podseća na sekiru: kraj drške sekire predstavlja domen PAZ, koji prepoznaje

jednolančani 3'-kraj dužine dva nt u pre-miRNK, dršku sekire sadrži vezivnu površinu za RNK, dok je sečivo

predstavljeno sa dva simetrična RNazna domena.

Pre-miRNK se transportuje u citoplazmu pomoću eksportina 5 (slika 1), gde dolazi do druge

endonukleazne reakcije katalizovane kompleksom Dicerom-TRBP. Trodimenzionalna struktura Dicera

podseća na sekiru (slika 4c). Domen PAZ je na kraju drške sekire, gde formira vezivni džep za

jednolančani 3' kraj pre-miRNK. Region izmeĎu domena PAZ i RNaznih domena formira dršku sekirice,

i sadrži pozitivno naelektrisanu vezivnu površinu za RNK. "Sečivo" sekire se sastoji od dva RNazna

domena, rasporeĎenih kao simetričan dimer. Dicer deluje na dvolančanu RNK nezavisno od njene

sekvence, i uvodi dva jednolančana prekida na udaljenosti od 22 nt od njenog kraja.

Rezultat aktivnosti proteina Drosha i Dicer je dvolanĉana miRNK dužine od 21 do 23 bp, koja

ima jednolančane 3'-krajeve dužine dva nt, od kojih je jedan nastao aktivnošću Droshe, a drugi aktivnošću

Dicera. Jedan lanac iz dvolančane miRNK biće selektovan da bude funkcionalna jednolančana zrela

miRNK, dok će drugi lanac biti degradovan. Lanac koji postaje zrela miRNK označava se kao lanac

9

"vodiĉ", a onaj koji se degraduje kao lanac "putnik". Po opštem pravilu, lanac čiji se 5'-kraj nalazi u

termodinamički manje stabilnom delu dvolančane miRNK se selektuje da bude lanac "vodič".

Pored kanonskog, opisani su i alternativni putevi biogeneze pre-miRNK. Neki introni kod C.

elegans, D. melanogaster i sisara, nazvani mirtroni, u pogledu dužine i strukture u potpunosti

odgovaraju genu za miRNK. Njihova obrada ne zahteva učešće kompleksa Drosha-DGCR8, već se

samim njihovim iskrajanjem splajsozomom formira pre-miRNK (slika 1). TakoĎe, neke klase malih

nukleolarnih RNK (snoRNK) obraĎuju se alternativnim putevima do malih RNK koje deluju slično kao

miRNK.

MikroRNK sa AGO i drugim proteinima formiraju ribonukleoproteinske čestice označene kao

utišavajući kompleksi miRISC. Formiranje miRISC je obično povezano sa obradom pre-miRNK

pomoću Dicera, ali svi detalji procesa nisu poznati. Dvolančana miRNK nastala aktivnošću Dicera

inkorporira se u miRISC, zatim denaturiše kako bi nastao lanac "vodič". Lanac "putnik" ili biva

degradovan proteinom AGO ili se kompletan otklanja iz kompleksa miRISC i zatim degraduje.

Proteini familije Argonaut su visoko-specijalizovani proteini za vezivanje malih regulatornih

RNK. Ime su dobili po fenotipu AGO-knockout biljke A. thaliana koji podseća na krake hobotnice

Argonauta argo. Familija proteina Argonaut je visoko-konzervisana u sva tri domena živih bića.

Interesantno je da model organizam Saccharomyces cerevisiae nema proteine Argonaut i puteve RNKi.

Na osnovu homologije u sekvenci članovi familije proteina Argonaut dele se u dve velike

subfamilije. Prema srodnosti sa proteinom AGO1 A. thaliane jedna subfamilija se označava AGO, dok

se druga naziva PIWI po srodnosti sa proteinom PIWI Drosophile (videti kod piRNK). Subfamilija

proteina AGO kod sisara i čoveka sadrži četiri člana: AGO1, AGO2, AGO3 i AGO4. Oni se eksprimiraju

u svim ćelijama i asociraju sa različitim malim regulatorinim RNK.

Argonaut proteini su mali proteini (~100 kD) koji sadrže domene PAZ, PIWI i MID, i N-kraj koji

se odlikuje najvećom heterogenošću meĎu članovima (slika 5). Ključni domeni za RNKi su PAZ i PIWI.

Domen PAZ, kao i kod proteina Dicer, formira specifičan džep koji vezuje 3'-jednolančani kraj dužine

dva nt lanca "vodiča" iz dvolančane male regulatorne RNK. Domen PIWI je odgovoran za

endonukleolitičku aktivnost i sličan je bakterijskoj RNazi H, koja specifično seče RNK u hibridu

DNK-RNK. Dok komponente miRISC kompleksa nisu bile poznate, opisivalo se da on ima slicer

aktivnost. Nakon otkrtića domena PIWI proteina Argonaut, postalo je jasno da je slicer aktivnost vezana

za sam protein Argonaut. MeĎutim, domen PIWI kod svih proteina Argonaut nije endonukleolitički

kompetentan. MeĎu proteinima AGO sisara, samo AGO2 ima očuvanu endonukleaznu aktivnost. Domen

MID se nalazi izmeĎu domena PAZ i PIWI i formira specifičan džep koji vezuje 5'-fosfatni kraj male

regulatorne RNK. Pored vezivanja 3'-i 5'-kraja lanca "vodiča" male regulatorne RNK, Argonaut protein

uspostavlja intrakcije sa njenom šećerno-fosfatnom okosnicom, ostavljajući tako baze slobodnim da se

spare sa komplemantarnim bazama u ciljnoj RNK (slika 5). Ciljna RNK ne uspostavlja interakcije sa

proteinom Argonaut.

Ukoliko se miRNK perfektno spari sa ciljnom iRNK, ulogu efektora u miRISC ima sam protein

AGO, čiji domen PIWI katalizuje endonukleolitičku degradaciju iRNK. U slučaju neperfektnog baznog

sparivanja miRNK i ciljne RNK, efektornu ulogu ostvaruju proteini sa kojima AGO stupa u interakciju.

Naime, pored proteina AGO miRISC sadrže i druge proteine koji imaju funkciju efektora ili regulatora u

10

GW182 binding

posredovanju represivne ili aktivirajuće funkcije miRNK. Kod životinja, grupa proteina koja je, pored

proteina AGO, ključna za represiju posredovanu sa miRNK su proteini familije GW182 (eng. glycine-

tryptophan (GW) repeat-containing protein of 182 kDa). Oni stupaju u direktnu u interkaciju sa C-krajem

proteina AGO i deluju kao efektori translacione represije i destabilizacije iRNK. Jedan od proteina koji

deluje kao regulatorni faktor miRISC je FMRP (eng. fragile X mental retardation protein). FMRP je

RNK-vezivni protein za koji je poznato da moduliše translaciju, posebno u neuronima, i dovodi se u vezu

sa stimulacijom translacije pomoću miRISC.

Slika 5. Domenska organizacija proteina Argonaut i struktura kompleksa miRNK-AGO: a) Proteini Argonaut

sadrže domene PAZ, MID i PIWI, dok N-kraj pokazuje heterogenost izmeĎu članova familije. Domen PAZ

specifično prepoznaje i vezuje jednolančani 3'-kraj lanca "vodiča" miRNK. Domen MID vezuje 5'-fosfatni kraj lanca

"vodiča". Domen PIWI je sličan RNazi H i poseduje endonukleolitičku aktivnost, koja nije očuvana kod svih

članova. C-kraj proteina AGO uspostavlja interakcije sa proteinom GW182. b) Perfektno komplementarno

sparivanje miRNK iz kompleksa miRNK-AGO i ciljne iRNK dovodi do endonukleolitičkog sečenja iRNK.

2.3. Principi interakcije miRNK-iRNK i vezivna mesta za miRNK (MIR)

Interakcija miRNK sa ciljnom iRNK ostvaruje se baznim sparivanjem. Kod biljaka, većina miRNK se

skoro perfektno sparuje sa svojim ciljnim iRNK. Suprotno, kod metazoa miRNK se uglavnom

neperfektno sparuju sa ciljnim iRNK, prateći nekoliko pravila (slika 6a). Najznačajnije i najrigoroznije

pravilo podrazumeva perfektno i kontinuirano bazno sparivanje regiona miRNK izmeĎu nukleotida 2 i 8

sa ciljnom iRNK. Ovaj region miRNK označen je kao "seme" i ono započinje interakciju sa iRNK.

Adeninski ostatak u iRNK naspram pozicije 1 miRNK, ili adeninski ili uracilski ostaci naspram pozicije 9

miRNK poboljšavaju interakciju, iako nije neophodno da se spare sa miRNK. Sledeće pravilo je da

pogrešno sparene baze i izbočine mogu biti prisutne samo u centralnom regionu dupleksa miRNK-iRNK.

Na ovaj način onemogućava se endonukleolitičko sečenje sa proteinom AGO. Treće pravilo je postojanje

odreĎenog stepena komplementarnosti u 3'-polovini miRNK, kako bi se interakcija stabilizovala.

Pogrešno sparene baze i izbočine u ovom regionu se uglavnom tolerišu, iako ispravno bazno sparivanje,

posebno u regionu miRNK od nukleotida 13 do 16, postaje značajno kada podudaranje u regionu

"semena" nije optimalno.

Mnoge iRNK sadrže komplementarna ili parcijalno komplementarna mesta za veći broj miRNK,

koja se nazivaju miRNK-vezivna mesta (eng. microRNA response elements, MRE). Najveći broj

PIWI

11

bioinformatički predviĎenih i eksperimantalno dokazanih MRE nalaze se u 3'-netranslatirajućem regionu

(eng. untranslated region, UTR) (slika 6b), a reĎe u 5'-UTR-u ili čak u kodirajućim regionima.

Slika 6. Principi interakcije miRNK sa iRNK i vezivna mesta za miRNK (MRE) u iRNK: a) Region "semena"

od nukleotida 2 do 8 u miRNK je ključan za interakciju sa ciljnom iRNK. Adeninski ostatak u iRNK naspram

pozicije 1 miRNK, ili adeninski ili uracilski ostaci naspram pozicije 9 miRNK doprinose poboljšanju interakcije,

iako nije neophodno da se bazno spare sa miRNK. Pogrešno sparene baze i izbočine mogu biti prisutne samo u

centralnom regionu dupleksa miRNK-iRNK. 3'-kraj miRNK poseduje odreĎeni stepen komplementarnost sa ciljnom

iRNK. Ispravno bazno sparivanje, posebno u regionu miRNK od nukleotida 13 do 16, postaje značajno kada

podudaranje u regionu "semena" nije optimalno. b) Najveći broj miRNK-vezivnih mesta (MRE) nalazi se u

3'-UTR-u iRNK. Jedna iRNK sadrži MRE za veći broj istih i različitih miRNK, dok jedna miRNK može regulistati

na stotine ciljnih iRNK, što ukazuje na složenu post-transkripcionu regulaciju pomoću miRNK koja se ostvaruje u

okviru regulatornih mreža.

Dugački 3'-UTR eukariotskih gena sadrže brojne regulatorne elemente za koje se vezuju miRNK

i RNK-vezivni proteini. Regulatorni elementi predstavljaju platforme za asembliranje kompleksa

RNK-proteini i proteinskih kompleksa koji zajedno utiču na lokalizaciju, translaciju i stabilnost iRNK.

Kod metzoa, u 3'-UTR iRNK nalazi se veći broj broj MRE koji je su komplementaran ili parcijalno

komplementaran sa većim brojem miRNK. Uz to najveći broj MRE za pojedinačnu miRNK prisutan je u

većem broju kopija. Pokazano je da su višestruka MRE za istu ili razliĉite miRNK neophodna su za

efikasno utišavanje translacije (slika 6b). Kada se nalaze blizu jedno drugom, na udaljenosti od 10 do 40

nukleotida, MRE deluju kooperativno, tako da njihov zajednički efekat prevazilazi sumu pojedinačnih

efekata. Faktori koji doprinose manjem struktuisanju 3'-UTR iRNK čine MRE dostupnijim za intrakciju

sa miRNK. Na primer, regioni bogati parovima AU mogu poboljšati interakciju miRNK i iRNK i

doprineti efikasnijoj translacionoj represiji posredovanoj sa miRNK. U kodirajućim regionima, MRE su

manje efikasni, ali se smatra da korišćenje retkih kodona koji usporavaju napredovanje ribozoma čine

takva mesta dostupnijim za vezivanje miRNK. Asocijacija miRNK sa pojedinačnim ili višestrukim

vezivnim mestima u 5'-UTR može dovesti do aktivacije translacije.

Kao što je već napomenuto, post-transkripciona regulacija ekspresije gena sa miRNK je veoma

složena i ne samo da je jedna iRNK regulisana sa većim brojem miRNK, već i jedna miRNK reguliše cele

grupe ciljnih iRNK, koje broje na stotine, čak i hiljade transkripata, u okviru složenih regulatornih mreža.

2.4. Modeli utišavanja iRNK posredovani sa miRNK

Efekat miRNK na ciljnu iRNK zavisi od njihovog stepena komplementarnosti, tipa proteina AGO sa

kojim asocira miRNK i od partner-proteina iz kompleksa miRISC. Ukoliko se miRNK perfektno spari sa

iRNK indukuje se endonukleolitička degradacija iRNK katalizovana proteinom AGO, koji seče iRNK na

sredini perfektnog dupleksa miRNK-iRNK. Ukoliko je sparivanje miRNK i iRNK neperfektno dolazi do

represije translacije posredovane partner-proteinima iz miRISC.

12

2.4.1. Model endonukleolitičke degradacije iRNK

Kod biljaka i retko kod životinja, protein AGO iz kompleksa miRISC indukuje degradaciju ciljne iRNK

endonukleolitičkim sečenjem. Lanac "vodič" iz kompeksa miRISC se skoro perfektno bazno sparuje sa

ciljnom iRNK, a arhitektura kompleksa je takva da ovo vezivanje pozicionira aktivno mesto domena

PIWI tako da ono može da iseče ciljnu iRNK. Sečenje se dešava približno na sredini dupleksa

miRNK-iRNK, izmeĎu nukleotida 10 i 11 miRNK (slika 5b). MeĎu proteinima AGO sisara, samo AGO2

ima očuvanu endonukleaznu aktivnost, koji zbog ove osobine jedini učestvuje i u putu RNKi posredovane

sa siRNK.

Novija istraživanja ukazuju da miRNK biljaka mogu reprimirati translaciju bez efekta na

degradaciju ciljnih iRNK, što je slično mehanizmima represije translacije sa miRNK kod životinja.

2.4.2. Modeli utišavanja iRNK posredovani sa GW182 - translaciona represija i destabilizacija

Najveći broj miRNK životinja je samo delimično komplementaran svojim ciljnim iRNK, a u velikom

broju slučajeva proteini AGO nisu dovoljni da sami posreduju u translacionoj represiji. Najbolje proučene

komponente kompleksa miRISC koje imaju efektornu ulogu u utišavanju translacije su proteini familije

GW182.

Proteini familije GW182 stupaju u direktnu interakciju sa proteinima AGO i sa proteinima koji se

u citoplazmi vezuju za poli(A) rep (eng. poly(A) binding protein, cytoplasmic 1, PABPC1). Interakcija

GW182 sa PABPC1 reguliše ciljnu iRNK na dva načina (slika 8): 1) interferiranjem sa cirkularizacijom

iRNK smanjuje se efikasnost translacije i inhibira se inicijacije translacije zavisne od 5'-kape, što vodi

translacionoj represiji (i eventualnoj degradaciji iRNK) i 2) olakšavanjem deadenilacije iRNK, što

destabilizuje iRNK i pokreće put degradacije iRNK smera 5'3' zavisan od deadenilacije1. Da bi se

rezumeli ovi modeli potrebno je upoznati se sa domenskom organizacijom proteina PABPC1 i GW182.

Protein PABPC1 je visoko-konzervisani protein eukariota koji se vezuje za poli-A rep iRNK u

citoplazmi. Na N-kraju sadrži četri domena za prepoznavanje i vezivanje jednolančane RNK (eng. RNA

recognition motifs, RRM), označena kao RRM1-RRM4, zatim sledi nestruktuisani linker bogat prolinima,

i na C-kraju sadrži domen MLLE za interakciju sa proteinima (slika 7a). Prva tri domena RRM, pored

vezivanja za iRNK, služe za uspostavljanje interakcije sa eukariotskim inicijacionim faktorom 4G

(eIF4G), koji drugim svojim domenom uspostavlja interakciju sa eIF4E vezanim za 5'-kapu iRNK.

Rezultat interakcija PABPC1-eIF4G-eIF4E je cirkularizacija iRNK i stabilizacija vazivanja eIF4E za

5'-kapu (slika 7a). Nastala kružna struktura iRNK stimuliše translaciju i štiti krajeve iRNK od

degradacije. Sa druge strane, PABPC1 služi i kao platforma za regrutovanje brojnih proteina uključenih u

1 Putevi degradacije iRNK u citoplazmi zavisni od deadenilacije - Degradacija najvećeg broja iRNK

započinje skraćivanjem poli(A) repa, označenom kao deadenilacija. Deadenilacija je katalizovana kompleksom

deadenilaza koje su 3’5’ egzoribonukleaze. Skraćivanje poli(A) repa destabilizuje iRNK narušavajući njenu

kružnu strukturu i čineći krajeve iRNK dostupnim enzimskim mašinerijama za degradaciju iRNK koje deluju ili sa

5' ili sa 3'-kraja. U putu degradacije zavisnom od deadenilacije smera 5’3’, deadenilacija stimuliše otklanjanje

5’-kape linearizovane iRNP pomoću kompleksa enzima za otklanjanje 5’-kape (Dcp1-Dcp2), nakon čega sledi

egzonukleolitička degradacija nezaštićenog transkripta u smeru 5’3’ aktivnošću egzonukleaze (Xrn1). U putu

degradacije zavisnom od deadenilacije smera 3’5’, skraćivanje poli(A) repa čini iRNK dostupnu citoplazmatičnoj

formi egzozoma, kompleksu od devet egzonukleaza, koji degraduje iRNK u smeru 3’5’. Otklanjanje 5’-kape sa

kratkog fragmenta RNK nastalog nakon delovanja egzozoma vrši enzim DcpS.

13

N-GW M-GW C-GW

P-body targeting

regulaciji translacije i stabilnosti (deadenilacije) iRNK. Tako, proteini koji sadrže motive PAM1 (eng.

PABP-interacting motif 1) uspostavljaju interakciju sa prva tri domena RRM PABPC1 i kompetiraju sa

eIF4G, utičući na formiranje kružne strukture iRNK. Proteini koji sadrže motiv PAM2 (eng.

PABP-interacting motif 2) uspostavljaju interakciju sa domenom MLLE, što redukuje afinitet PABPC1 za

poli(A) rep, čineći ga dostupnijim delovanju deadenilaza.

Slika 7. Domenske organizacije proteina PABPC1 i GW182: a) PABPC1 sadrži četiri konzervisana motiva za

prepoznavanje RNK (eng. RNA recognition motifs, RRM) na N-kraju (RRM1-4), nestruktuisani linker bogatim

prolinom, i konzervisani MLLE domen na C-kraju. Prva tri domena RRM stupaju u interakciju i sa eukariotskim

inicijacionim faktorom 4G (eIF4G) i proteinima koji sadrže domen PAM1(eng. PABP-interacting motif).

Interkacijom PABPC1 sa eIF4G, koji je vazan za eIF4E, uspotavalja se kružna struktura iRNK. Kompeticija eIF4G

sa proteinima koji sadrže PAM1 može naruštiti kružnu strukturu iRNK, neophodnu za efikasnu translaciju i

stabilnost iRNK. Proteini koji sadrže motiv PAM2 stupaju u intrakciju sa domenom MLLE, što redukuje afinitet

PABPC1 za poli(A) rep čineći ga dostupnijim delovanju deadenilaza. b) Proteini GW182 sastoje se iz četri

nestruktuisana regiona i dva strukturna domena. Nestruktuisani regioni su N-GW, M-GW i C-GW, koji redom

predstavljaju N-terminalni, središnji i C-terminalni region sa ponovljenim motivima GW (Gly-Trp), i region bogat

glutaminom (Q). IzmeĎu ovih regiona nalaze se dva strukturna domena: domen asociran sa ubikvitinom (domen

UBA) i motiv za prepoznavanje RNK (domen RRM). Za reprsesiju iRNK bitni su: N-GW koji stupa u interakciju sa

proteinom AGO, i bipartitni region za utišavanje na središnjem i C-kraju koji sadrže motive za interakciju sa

PABPC1: motiv sličan sa PAM2 i motiv sličan sa PAM1. Region koji uključuje N-GW, domen UBA i region bogat

glutaminom odgovoran je za usmeravanje GW182 proteina u P tela.

Proteini GW182 imaju karakterističnu strukturu koja se sastoji iz četiri nestruktuisana regiona i

dva strukturna domena (slika 7b). Nestruktuisani regioni su N-GW, M-GW i C-GW, koji redom

predstavljaju N-terminalni, središnji i C-terminalni region sa ponovljenim motivima GW (Gly-Trp), i

region bogat glutaminom (Q). IzmeĎu ovih regiona nalaze se dva strukturna domena: centralni domen

asociran sa ubikvitinom, označen kao UBA, i domen RRM za prepoznavanje i vezivanje jednolančane

RNK na C-kraju.

Dva regiona proteina GW182 imaju esencijalnu ulogu u utišavanju ciljne iRNK u putu miRNK:

1) domen N-GW, koji direktno vezuje C-kraj proteina AGO (slika 6) i 2) bipartitni domen za utišavanje

na središnjem i C-kraju, koji promoviše narušavanje kružne strukture iRNK i destabilizaciju ciljnih

14

iRNK. U okviru bipartitnog domena za utišavanje nalaze se dva motiva koja mogu uspostaviti interkciju

sa dva različita regiona proteina PABPC1 (slika 7b). U regionu M-GW nalazi se motiv koji pokazuje

sličnost sa PAM2, i vezuje se za domen MLLE u PABPC1. U zadnjem delu regiona M-GW i u regionu

C-GW nalazi se manje definisana sekvenca koja funkcionalno imitira motiv PAM1. Motiv sličan PAM1

posreduje u vezivanju proteina GW182 za motive RRM u PABPC1.

Slika 8. Utišavanje iRNK sa miRICS posredovano sa GW182. PAM1 motiv (C) iz bipartitnog domena za

utišavanje GW182 kompetira sa eIF4G za vezivanje RRM domena u PABPC1. Kada se GW182 veže za RRM

domene u PABPC1 narušava se kružna strukture iRNK, što vodi do represije translacije, i na kraju mogućoj

degradaciji iRNK. PAM 2 motiv(M) iz bipartitnog domena za utišavanje GW182 uspostavlja interakciju sa

domenom MLLE iz PABPC1, čime se formira platforma za vezivanje deadenilaza (kompleks CAF1-CCR4-NOT),

što destabilizuje iRNK, i krajnje reprimira translaciju. Naime, deadenilacija je praćena otklanjanjem 5'-kape pomoću

DCP2 i egzonukleolitičkom degradacijom u smeru 5'3' pomoću proteina XRN1. Protein DCP2 zahteva dodatne

proteine za potpunu aktivnost i/ili stabilnost, kao što su protein DCP1, pojačivač za otklanjanje 5'-kape 4 (eng.

enhancer of decapping 4, EDC4) i RNK helikaza DDX6 (eng. DEAD-box protein 6).

Činjenica da bipartitni domen za utišavanje proteina GW182 stupa u interakciju i sa N- i sa

C-domenima PABPC1 ukazuje da kompleks miRNK-AGO-GW182 interferira sa funkcijom PABPC1 u

cirkularizaciji i stabilizaciji iRNK korišćenjem dva modela (slika 8). Jedan model predviĎa da proteini

GW182 i eIF4G kompetiraju za motive RRM na N-kraju PABPC1. Ukoliko se za RRM motive PABPC1

veže bipartitni domen GW182 narušava se kružna struktura iRNK, što rezultuje smanjenom efikasnošću

translacije, doprinosi inhibiciji inicijacije translacije i krajnje smanjuje stabilnost iRNK (slika 8).

Smanjena stabilnost iRNK vezana je za činjenicu da je linearizovana iRNK dostupnija sistemima za

degradaciju iRNK koji deluju sa njenih krajeva.

Drugi model predviĎa interakciju bipartitnog domena GW182 sa domenom MLLE u PABPC1

(slika 8). Smatra se da ova interakcija redukuje afinitet PABPC1 za poli(A) rep, čineći ga dostupnijim

delovanju deadenilaza. Naime, slično nekim drugim proteinma koji poseduju motiv PAM2, i interakcija

PAM2 motiva GW182 sa PABPC1 stvara platformu za vezivanje deadenilaza, iako kružna struktura

iRNK nije narušena. Deadenilacija dalje aktivra put degradacije iRNK smera 5'3' zavisnog od

deadenilacije, koji podrazumeva otklanjanjem 5'-kape pomoću enzima za otklanjanje 5'-kape i

egzonukleolitičku degradaciju u smeru 5'3' pomoću proteina egzoribonukleaze (slika 8). Efekti i jednog

i drugog modela su smanjenje efikasnosti translacije ciljne iRNK i smanjenje njene stabilnosti, usled čega

se iRNK degraduje.

15

Komponente kompleksa miRISC (uključujući miRNK, AGO i GW182) i reprimirane iRNK

lokalizuju u P telima, ribonukleoproteinskim citoplazmatičnim granulama u kojima se čuvaju i degraduju

translaciono reprimirane iRNK. Protein GW182 je jedna od osnovnih komponenti P tela, koja se po

njemu označavaju i kao GW tela, a ujedno je važan i za efikasnu represiju translacije sa miRNK.

2.4.3. Drugi modeli translacione represije sa miRNK

Utišavanja iRNK sa miRISC posredovano sa GW182 predviĎa takvu represiju translacije i smanjenje

stabilnosti iRNK, što krajnje vodi njenoj degradaciji. MeĎutim, prema eksperimentalnim podacima nivo

iRNK utišanih sa miRNK može biti skoro nepromenjen. Ovi rezultati ukazuju da se translaciona represija

može desiti i bez značajnije degradacije iRNK, i da bi mogla uključivati mehanizme koji inhibiraju sam

proces translacije. Još uvek nije poznato da li se ovi efekti miRNK ostvaruju tokom inicijacije i/ili u

koracima nakon incijacije translacije. Više eksperimentalnih podataka podržava model inhibicije

transalcije u koraku inicijacije.

Slika 9. Domenska organizacija proteina AGO2 ĉoveka sa potencijalnim domenom za vezivanje 5'-kape. AGO2 sadrži domen DUF (nepoznate funkcije), domen PAZ (specifično prepoznaje i vezuje 3'-kraj lanca vodiča

miRNK) i domen PIWI (domen sličan RNazi H koji je endonukleolitički kompetentan). Region koji razdvaja

domene PAZ i PIWI sadrži dve aromatične aminokiseline (fenilalanin na pozicijama 470 i 505) u kojima mutacije

sprečavaju represiju translacije.

Model po kome miRNK dovode do inhibicije translacije u koraku inicijacije potiče iz

eksperimenata koji su pokazali da je funkcionalna 5'-kapa esencijalna za represiju translacije sa miRNK.

Poznato je da mnogi faktori koji se vezuju za 3'-UTR iRNK inhibiraju incijaciju translacije regrutovanjem

proteina koji ometaju interakciju eIF4E-eIF4G ili direktno vezuju 5'-kapu. Faktori koji dirketno vezuju

5'-kapu su u kompeticiji sa eIF4E i ne stupaju u interkaciju sa eIF4G, što vodi inhibiciji incijacije

translacije. Takav faktor bi mogao biti protein AGO2, jer njegov centralni domen pokazuje ograničenu

homologiju sa regionom proteina eIF4E koji vezuje 5'-kapu, uključujući dva ključna aromatična

aminokiselinska ostatka (slika 9). Model inhibicije incijacije translacije vezivanjem AGO za 5'-kapu

može objasniti potrebu za većim brojem miRISC kako bi se postiglo značajno utišavanje translacije sa

miRNK: veći broj miRISC, u okviru kojih se nalazi AGO2 sa manjim afinitetom za 5'-kapu u odnosu na

eIF4E, bi povećao verovatnoću asocijacije AGO2 sa 5'-kapom. MeĎutim, ovaj model je doveden u pitanje

eksperimantima koji su pokazali da mutacije dva aromatična ostatka u AGO2 interferiraju sa interakciom

AGO sa GW182, koja je neophodna za translacionu represiju posredovanu sa miRNK.

Neki eksprimentalni podaci su pokazali da se u izolovanim kompleksima miRICS-iRNK nalaze

40S subjedinice ribozoma, što je ukazalo da bi miRNK mogle inhibirati incijaciju translacije

sprečavanjem vezivanja 60S subjedince ribozoma nepoznatim mehanizmom (slika 10).

16

Slika 10. Modeli utišavanje iRNK sa miRNK: (gornji levi deo slike) miRISC vezan za 3'-UTR iRNK može

narušiti kružnu strukturu iRNK ili destabilizovati iRNK usled interkacije proteina GW182 iz miRISC sa PABPC1

vezanim za poli(A) rep iRNK. (donji levi deo slike) miRISC može inhibirati inicijaciju translacije u koraku

prepoznavanja 5'-kape ili u koraku pridruživanja 60S subjedinice ribozoma. Utišana iRNK se povlači u

citoplazmatične RNK granule (P tela), gde se degraduje ili čuva dok opet ne bude potrebna ćeliji. (slika dole desno)

Represija translacije sa miRISC bi se mogla desiti i nakon inicijacije translacije, usled usporene elongacije ili

spadanja ribozoma. (slika desno gore) miRNK bi mogla reprimirati translaciju pokretanjem proteolitičke degradacije

rastućeg polipeptida, nazavisno od degradacije proteazomom. Od navedenih modela, ekspreimntalni dokazi postoje

samo za utišavanje iRNK posredovano sa GW182 iz miRISC.

Kosedimentacija značajne frakcije miRNK ili proteina AGO sa polizomima u mnogim studijama

podržava pretpostavku da bi inhibicija translacije sa miRNK mogla da se ostvaruje i u koracima nakon

inicijacije transalcije, za sada nepoznatim mehanizmima. Predloženi je da bi miRISC mogao da dovede

do usporavanja elongacije transalcije ili do spadanja ribozoma sa iRNK (eng. ribosome drop off)

posredovani (slika 10). TakoĎe, predloženo je da bi miRISC mogao da regrutuje proteazu koja bi brzo

degradovala rastuće polipetide (slika 10). Ovaj model bi uključivao aktivnost nepoznate proteazu jer je

pokazano da inhibitori proteazoma nemaju efekat na represiju translacije posredovano sa miRNK.

MeĎutim, treba istaći da je represija ciljne iRNK sa jednom miRNK generalno samo parcijalna, tako da

vezivanje jednog kompleksa miRISC za iRNK često nema efekat na represiju transalcije. Stoga,

kosedimentacija miRISC sa polizomima ne mora neophodno da ukazuje na represiju nakon incijacije

translacije, već može odražavati neefikasnu asocijaciju miRISC sa iRNK, tako da iRNK podeleže

produktivnoj translaciji.

17

2.5. MikroRNK kao aktivatori transalcije

Iako prihvaćene kao opšti post-transkripcioni represori, miRNK u izmenjenim fiziološkim uslovima

mogu aktivirati ili stimulisati translaciju.

Regulacija translacije sa nekim miRNK može oscilirati izmeĎu represije i aktivacije u zavisnosti

od stanja ćelijskog ciklusa uslovljenog fiziološkim uslovima. Kada se ćelija normalno deli odreĎene

miRNK imaju funkciju represora translacije, a kada se ćelija zarobi u G1 fazu imaju funkciju aktivatora

translacije (slika 11). U kulturama ćelija sisara pokazano je da 3'-UTR iRNK za TNF-α (eng. tumor-

nekrosis factor α) stimuliše translaciju u uslovima nedostatka hranljivih sastojaka i faktora rasta, što

dovodi do zarobljavanja ćelija u G1 fazu. Ova stimulacija translacije je zavisna od miRNK miR369-3 i

proteina AGO2. U istim uslovima, u odsustvu miR369-3 ne dolazi do stimulacije translacije. U uslovima

kada se ćelijski ciklus normalno odvija miR369-3 reprimira translaciju iRNK za TNF-α.

Smatra se da fiziološki uslovi utiču na regrutovanje komponenti miRISC koje mogu promeniti

efekat miRNK. U normalnim fiziološkim uslovima miRISC regrutuje represivne partnere, kao što je

GW182. Kada je ćelija zarobljena u G1 fazu ćelijskog ciklusa kompleks miRNK-AGO regrutuje protein

FXR1 (eng. Fragile X Mental Retardation, Autosomal Homolog) i stimuliše se translacija (slika 11). Da li

se na kompleks miRNK-AGO regrutuju i drugi aktivatori i da li represivni partneri napuštaju kompleks

nije poznato.

Slika 11. Dvostruka funkcija miRNK u regulaciji transalcije. Ista miRNK može reprimirati ili aktivirati

translaciju ciljne iRNK u zavisnosti od fizioloških uslova. Fiziološki uslovi utiču na regrutovanje partner-proteina u

miRISC. U normalnim uslovima u miRISC regrutuje se GW182 koji promoviše represiju translacije, tako da

miRNK deluju kao represori translacije. U izmenjenim fiziološkim uslovima koji dovode do zarobljavanja ćelije u

G1 fazu ćelijskog ciklusa, u miRISC regrutuje se FXR1 (eng. Fragile X Mental Retardation, Autosomal Homolog) i

stimuliše se transalcija ciljne RNK, tako da miRNK deluju kao aktivatori translacije.

MikroRNK koje se vezuju za 5'-UTR ciljnih iRNK takoĎe mogu stimulisati translaciju, ali

korišćenjem drugačijeg mehanizma. Informacione RNK za komponente transalcione mašinerije

(ribozomske proteine i translacione faktore) u 5'-UTR sadrže regulatorne sekvence TOP (eng. 5'-terminal

oligopyrimidine tract). One vezuju specifičan protein (TIA-1/TIAR), koji reprimira njihovu transalciju u

uslovima nedostatka aminokiselina. Neposredno nizvodno od sekvence TOP u ovim iRNK nalazi se

vezivno mesto za miR10a. U normalnim uslovima, miR10a je vezana za 5'-UTR ovih iRNK i verovatno

18

sprečava vezivanje represornih proteina TIA-1/TIAR za TOP sekvence, čime stimuliše njihovu

translaciju. Interesantno je da vezivanje miR10a za 5'-UTR iRNK koje sadrže TOP sekvence izgleda ne

prati uobičajna pravila interakcije regiona "semena" miRNK sa iRNK.

Aktivacija translacije sa miRNK u opisanim primerima dešava se na specifičnim iRNK i pod

odreĎenim uslovima u ćeliji, što ukazuje da je reč o specijalizovanom i regulisanom procesu. Smatra se da

aktivacija translacije sa miRNK nije opšti mehanizam u ćelijama koje se ne dele i u normalnim

fiziološkim uslovima. Male regulatorne RNK koje imaju funkciju i represora i aktivatora ekspresije

ciljnih gena mogle bi, pored miRNK da obuhvate i siRNK i piRNK.

2.6. Regulacija miRNK i proteina miRISC

Regulacija ekspresije miRNK je prostorno i vremenski precizno regulisana. Glavni modulatori ekspresije

miRNK se proteini ADAR, koji katalizuju editovanje A-u-I u pri- i pre-miRNK (videti kod Editovanja

RNK). Nivo koncentracije efektornih miRNK reguliše se kompetirajućim endogenim RNK (iRNK,

transkriptima pseudogena, lnc RNK, kružnim RNK), koje funkcionišu kao "endogeni" sunĎeri za miRNK

(videti kod Kompetirajućih endogenih RNK).

Proteini AGO imaju specifičan obrazac ekspresije, specifične partner proteine i specifične

biohemijske osobine. Iako se malo se zna o reguaciji miRISC, sve je više podataka da reverzibilne

post-trasnlacione modifikacije imaju ulogu u regulaciji aktivnosti osnovnih komponenti kompleksa.

Poznato je da proteini AGO, PIWI i GW182 podležu reverzibilnoj post-translacionoj fosforilaciji.

Da bi obavile svoju funkciju, ne samo da je potrebno da se odreĎena miRNK i proteinske

komponenete miRISC regulisano eksprimiraju, već odreĎena miRNK mora asocirati sa specifičnim

komponentama miRISC. Zbog toga se danas intenzivno istražuje sortiranje malih regulatornih molekula

RNK u odnosu na AGO proteine, odnosno šta i kako odreĎuje specifičnost interakcije odreĎene

regulatorne RNK sa odreĎenim proteinom familije Argonaut.

KLJUĈNI KONCEPTI

Regulatorne RNK su novootkrivena klasa molekula RNK koja je esencijalna u kontroli svih nivoa ekspresije

genoma eukariota. Formiraju složenu regulatornu mrežu koja funkcioniše paralelno sa regulatornom mrežom

proteina. Dele se na male nekodirajuće RNK i duge nekodirajuće RNK.

Male nekodirajuće RNK su dužine 20 do 30 nt, prepoznaju komplementarnu sekvencu u ciljnim RNK i kroz

interakciju sa proteinima familije Argonaut regulišu invazivne nukleinske kiseline (virusne RNK i transpozone),

post-transkripcionu ekspresiju genoma i epigenetičku memoriju.

Familija proteina Argonaut je visoko-konzervisna i specijalizovana za vezivanje i funkcionisanje malih

nekodirajućih RNK. Poseduju domene za vezivanje malih RNK i domen PIWI sa endonukleaznom aktivnošču, koja

nije očuvana kod svih članova. Obuhvata dve subfamilije: AGO i PIWI.

Male nekodirajuće RNK sa proteinima Argonaut formiraju utišavajući kompleks (RISC), u okviru koga male RNK

komplementarnim sparivanjem prepoznaju ciljne nukleinske kisleine, a proteini Argonaut obavljaju efektornu

funkciju i/ili regrutuju proteine koji obavaljaju efektornu funkciju.

Represija ili utišavanje ciljnih nukleinskih kiselina kompeksom RISC naziva se RNK interferencija (RNKi). RNKi

se ostvaruje na post-transkripcionom nivou, kada reguliše stabilnost i translaciju ciljnih RNK, i na epigenetičkom

nivou, kada vrši utišavanje koje zahteva aktivnu transkripciju ciljnih regiona genoma. Smatra se da je RNKi

19

evoluirala kao efikasan imunski sistem za odbranu od endogenih i egzogenih invazivnih nukleinskih kiselina kod

prokariota i eukariota, a da je kasnije prilagoĎena i regulatornim funkcijama u ekspresiji genoma eukariota.

Male nekodirajuće RNK se na osnovu biogeneze, proteina Argonaut sa kojima stupaju u interakciju, mehanizmima

kojima ostvaruju RNKi i funkcijama koje obavljaju dele u tri klase: male-interferirajuće RNK (siRNK), mikroRNK

(miRNK) i RNK koje stupaju u interkaciju sa proteinima PIWI (piRNK).

MikroRNK (miRNK) su dugačke 21 do 23 nt, nastaju obradom jednolančanog prekursora u obliku ukosnice

delovanjem ednonukleaza Drosha i Dicer, asociraju sa proteinima AGO i esencijalne su za post-transkripcionu

regulaciju ekspresije gena u svim aspektima funkcionisanja eukariotske ćelije. Mutacije u putu miRNK dovode do

poremećaja razvića, i često su letalne za embrion.

Jednolančani prekursor miRNK naziva se primarna miRNK (pri-miRNK) i prepisuje se sa samostalnih gena za

miRNK ili sa gena za miRNK koji su delovi gena za proteine, duge nekodirajuće RNK ili pseudogena. Pri-miRNK

formira strukturu ukosnice i u nukleusu se obraĎuje sa Drosha do prekurskora miRNK (pre-miRNK). Pre-miRNK se

transportuje u citoplazmu i obraĎuje sa Dicer do dvolančane miRNK. Ona se udružuje sa jednim od proteina AGO i

dodatnim proteinima, formirajući kompleks miRISC. U kompleksu miRISC jedan lanac miRNK se selektuje da

postane zrela miRNK, a drugi lanac se degraduje.

Kompleks miRISC reguliše post-transkripcionu ekspresiju gena endonukleolitičkom degradacijom, destabilizacijom,

translacionim represijom (i aktivacijom) ciljne iRNK. Ukoliko je miRNK perfektno komplementarna ciljnoj RNK i

asocirana sa endonukleolitički kompetentnim proteinom AGO, ciljna iRNK se degraduje aktivnošću AGO. Ukoliko

miRNK nije perfektno komplementarna sa ciljnom iRNK, dolazi do njene destabilizacije ili translacione represije.

Kod životinja, u kompleksu miRISC koji dovodi do transalcione represije i destabilizacije ciljne iRNK efektornu

ulogu ima protein GW182, koji stupa u interakciju sa proteinom AGO i proteinom vezanim za pol(A) rep iRNK

(PABPC1). Jednim delom bipartitnog domena za utišavanje GW182 kompetira sa PABPC1 za interakciju sa

eukariotskim incijacionim faktorom 4G (eIF4G), što može narušiti kružnu strukturu iRNK vodeći do represije

translacije, i eventualno do degradacije iRNK. Drugim delom bipartitnog domena za utišavanje GW182 vezuje deo

PABPC1 važan za stabilzaciju njegove interkcije sa poli(A) repom, čime se olakšava vezivanje deadenilaza, dolazi

do destabilizacije iRNK i njene degradacije. U zavisnosti od fizioloških uslova i stanja ćelijskog ciklusa jedna

miRNK može delovati kao represor ili aktivator translacije. Aktivacija translacije u izmenjenim fizološkim

uslovima, kada dolazi do zarobljavanja ćelije u G1 fazu ćelijskog ciklusa, posredovana je zamenom represivnih

partnera kompleksa miRISC sa partnerima koji aktiviraju translaciju.

Vezivna mesta za miRNK u iRNK (MRE) uglavnom se nalaze u 3'-UTR, a reĎe u 5'-UTR ili kodirajućem regionu.

Jedna iRNK može imati veći broj MRE za jednu ili različite miRNK, dok jedna miRNK može regulisati na stotine

iRNK. Ovakava interakcija miRNK i iRNK ukazuje da MRE mogu delovati kooperativno, i da se

post-transkripciona regulacija sa miRNK ostvaruje u složenim regulatornim mrežama.

Regulacija ekspresije miRNK je prostorno i vremenski precizno regulisana. Glavni modulatori ekspresije miRNK su

proteini ADAR koji katalizuju editovanje A-u-I u pri- i pre-miRNK. Nivo koncentracije efektornih miRNK u

citoplazmi reguliše se kompetirajućim endogenim RNK (iRNK, transkriptima pseudogena, lnc RNK, kružnim

RNK), koje deluju kao "endogeni" sunĎeri za miRNK. Proteini AGO imaju specifičan obrazac ekspresije, a njihova

funkcija, kao i funkcija drugih komponenti miRISC reguliše se revezibilnim post-translacionim modifikacijama.

PITANJA

1. Šta su regulatorni molekuli RNK, koja je njihova funkcija i kako se dele?

2. Šta su male nekodirajuće RNK, kako se dele i na osnovu kojih osobina?

3. Šta je RNK interferencija i kojim mehanizmima se ostvaruje?

4. Kojim mehanizmima RNK interferncija ostvaruje regulaciju ekspresije gena na post-transkripcionom nivou?

5. Kojim mehanizmima RNK interferncija ostvaruje regulaciju epigenetičke memorije?

6. Koje su osnovne komponente utišavajućeg kompleksa RISC i koje funkcije obavljaju u RNK interferenciji?

7. Šta su miRNK i koje biološke procese regulišu?

20

8. Opišite biogenezu miRNK i formiranje kompleksa miRISC?

9. Opišite mehanizme kojim miRNK utišavaju ciljne iRNK.

10. Kako su regulisane miRNK?