8/6/2019 Pseudomonas Art 2

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A P P L E DM I C RO B I O L OGY,D e c . 1 9 7 4 ,p . 9 8 7 - 9 9 1C o p y r i g h t0 1 9 7 5Am e r i c a nS o c i e t yf o rM i c r o b i o l o g y

Vo l .2 8 ,N o . 6P r i n t e d i n U . S A .

A g r i c u l t u r a lP l a n t sa n d S o i la s a R e s e r v o i rf o rP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a

SYLVIA K . GREEN, MILTON N . SCHROTH, JOHN J . CHO, SPYROS D . KOMINOS, ANDVILMA B . VITANZA-JACK

D e p a r t m e n to fP l a n t P a t h o l o g y ,U n i v e r s i t yo fC a l i f o r n i a ,B e r k e l e y ,C a l i f o r n i a9 4 7 2 0 ,a n dM e r c yH o s p i t a l ,P i t t s b u r g h ,P e n n s y l v a n i a1 5 2 1 9

R e c e i v e df o rp u b l i c a t i o n1 5A u g u s t1 9 7 4

P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s awas d e t e c t e di n 24% o ft h e s o i ls am p l e s b u ti n o n l y0 . 1 3 %o ft h e v e g e t a b l es a m p l e sf r o mv a r i o u sa g r i c u l t u r a la reas o f C a l i f o r n i a .Th ed i s t r i b u t i o no fp y o c i nt y p e s o fs o i la n d v e g e t a b l ei s o l a t e swas s i m i l a r t o t h a t o fc l i n i c a ls t r a i n s ,a n d t h r e e o f t h e s o i l i s o l a t e swere r e s i s t a n tt o c a r b e n i c i l l i n .P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s am u l t i p l i e di n l e t t u c ea n d b e a nu n d e rc o n d i t i o n so fh i g ht e m p e r a t u r ea n d h i g hr e l a t i v eh u m i d i t y( 2 7C an d 8 0 - 9 5 %r e l a t i v eh u m i d i t y )b u td e c l i n e d when t h e t e m p e r a t u r ea n d h u m i d i t ywere l o w e r e d ( 1 6C , 5 5 - 7 5 %r e l a t i v eh um i d i t y ) .The r e s u l t ss u g g e s t t h a t s o i li s a r e s e r v i o rf o rP . a e r u g i n o s aa n d t h a t t h e b a c t e r i u mh a s t h e c a p a c i t y t o c o l o n i z ep l a n t s d u r i n g f a v o r a b l ec o n d i t i o n so f t e m p e r a t u r ea n d m o i s t u r e .

P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ai s c u r r e n t l yc o n s i d -e r e do n e o f t h e m o s tf r e q u e n t c a u s a t i v ea g e n t so f h o s p i t a l - a s s o c i a t e di n f e c t i o n sa n d t h e r e f o r eh a s b e e n t h es u b j e c to fmany e p i d e m i o l o g i c a li n v e s t i g a t i o n s .S t u d i e so n t h e s o u r c e sa n d v e h i -c l e sb y w h i c h t h e o r g a n i s mi s t r a n s f e r r e dt op a t i e n t sh a v e p r e v i o u s l yb e e n l i m i t e dt o t h ei m m e d i a t ee n v i r o n m e n to f p a t i e n t s i n s i d et h eh o s p i t a l .S u c hi m p l i c a t e ds o u r c e si n c l u d es i n k s ,s o l u t i o n sa n d c r e a m s ,h a n d so fp e r s o n n e l ,a n di n h a l a t i o na n d r e s u s c i t a t i o ne q u i p m e n t( 4 ,5 ,9 ,1 2 , 1 3 ,1 6 ) .L i t t l ea t t e n t i o nw a s g i v e nt o n a t u r a l s o u r c e s

c o n t r i b u t i n gt od i s e a s eu n t i lK o m i n o se t a l .( 1 0 )f o u n d h i g h c o u n t s o f P . a e r u g i n o s ai n r a wv e g e t a b l e si n t h e h o s p i t a lk i t c h e na n d s u g g e s t e dt h a tt h e s ef o o d sc o u l d a c t a sp r i m a r yv e h i c l e sf o ri n t r o d u c i n gt h e o r g a n i s mt o p a t i e n t s .T h e i rs t u d i e sw e r e m o t i v a t e df r o m t h e f i n d i n g so fS h o o t e re t a l .( 1 5 ,1 6 ) ,who f o u n dt h a t f o o d sa n ds a l a d si n h o s p i t a lk i t c h e n sc o n t a i n e dE s c h e -r i c h i ac o l i ,P . a e r u g i n o s a ,a n dK l e b s i e l l as p e c i e sa n d s h o w e dt h a tp a t i e n t sc o u l d a c q u i r et h e s eb a c t e r i ai n t h e i r i n t e s t i n a lf l o r a .O r n a m e n t a lp o t t e d p l a n t s ( J . J . C h o , S . K . G r e e n ,M. N .S c h r o t h ,a n d S . D . K o m i n o s ,P h y t o p a t h o l o g y6 3 : 1 2 1 5 ,1 9 7 3 )w e r e a l s of o u n d t o h a r b o r P .a e r u g i n o s a ,i n d i c a t i n gt h a t p l a n t s may s e r v ea sa n a t u r a l r e s e r v o i ri n n a t u r e .S i g n i f i c a n td e c r e a s eo f P s e u d o m o n a si n f e c -

t i o n i n b u r n p a t i e n t sw a s n o t e d b y S . D .K o m i n o s( u n p u b l i s h e dd a t a ) f o l l o w i n gt h ee l i m i n a t i o no f f r e s hv e g e t a b l e sf r o m t h e d i e t .

T h ep y o c i nt y p e so fP . a e r u g i n o s af r o mv e g e t a -b l e sw e r ed i s t r i b u t e ds i m i l a r l yt o t h o s e i s o l a t e df r o mc l i n i c a ls p e c i m e n s .T h e f i n d i n gt h a t c o n s u m p t i o no f v e g e t a b l e s

i nh o s p i t a l sc o u l d b ea means b y w h i c hp a t i e n t sc o n t r a c tP . a e r u g i n o s as u g g e s t e da s t u d y t od e t e r m i n ew h e t h e r a g r i c u l t u r a ls o i l s a c t a sn a t u r a l r e s e r v o i r so f t h i s b a c t e r i u m . I t a l s os e e m e di m p o r t a n tt o i n v e s t i g a t ew h e t h e rf o o dp l a n t sa r ec o m m o n l yc o l o n i z e db yP .a e r u g i n o s af r o m s o i l i nt h e f i e l d ,o r i f t h i sm i g h to c c u rd u r i n g h a r v e s t ,o r d u r i n g a l a t e rp r o c e s s i n gs t a g e ,b e f o r er e a c h i n gt h e c o n s u m e r .T h i s r e p o r td e s c r i b e dt h e o c c u r r e n c eo f P .

a e r u g i n o s ai n a g r i c u l t u r a ls o i l sa n d p l a n t sa n dt h e c a p a c i t y o f c l i n i c a li s o l a t e st o s u r v i v e i np l a n t sd u r i n g v a r i o u s e n v i r o n m e n t a lc o n d i -t i o n s .

MATERIALS AND METHODSF i e l d i s o l a t i o n s .S o i la n d v e g e t a b l em a t e r i a lw e r e

s a m p l e da t f i v er a n d o m l ys e l e c t e ds i t e s f r o m 5 8d i f f e r e n tl o c a t i o n si n v a r i o u s a g r i c u l t u r a la r e a s o fc e n t r a lC a l i f o r n i ad u r i n g t h e summer o f 1 97 3 . S o i ls a m p l e sf r o me a c hf i e l dw e r ec o l l e c t e dt oa d e p t ho f3 0c m , c o m b i n e d ,a n d t h o r o u g h l ym i x e d .F i f t yg r a m so fe a c h s o i l s a m p l e w a s p l a c e d i n 1 0 0 m l o f s t e r i l ed i s t i l l e dw a t e r ( p H7 . 2 )a n d s h a k e nf o r1 h a t 3 0 0r p m .A p o r t i o n ( 0 . 5m l ) o f e a c h s o i ls u s p e n s i o nw a s t h e na d d e dt o 4 . 5m l o fb r o t hc o n s i s t i n go fa c e t a m i d ea n ds a l t s( 1 7 ) .Te n f o l dd i l u t i o n st o 1 0 - 4w e r em a d e , a nda f t e r4 8 h o f i n c u b a t i o n a t 4 2 C , 0 . 1m l o f e a c hd i l u t i o nw a sp l a t e do n K i n gmed ium B ( 8 )w i t h 0 . 0 3%c e t r i m i d e a d d e d ( K B C )( 2 ) , a n d t h e p l a t e sw e r ei n c u b a t e da t 4 2 C .

9 8 7

8/6/2019 Pseudomonas Art 2

2/5

GREEN ET AL .

T h e s o i l ss a m p l e di n c o u n t i e s 1 t o 5 were a s a n d yl o a mw i t hpH v a l u e sv a r y i n gb e t w e e n7 . 0 a n d 7 . 6 .Th es o i l ss a m p l e di nc o u n t y 6were a l o a m ys a n dw i t ha pHo f7 . 3 .T h e i r r i g a t i o nw a t e r i n c o u n t i e s 1 , 2 , 4 a n d 6was f r o mw e l l sa n d i n c o u n t i e s3 a n d 5 f r o mr e s e r v o i r s .T h ew a t e rwas d e l i v e r e dt o t h e f i e l d sb y p i p e sa n d wasd e t e r m i n e dt o b e f r e eo fP . a e r u g i n o s ai n a l l c a s e s ( 3 0s a m p l e s )b y t h e p r e v i o u s l yd e s c r i b e di s o l a t i o nt e c h -n i q u e s . F e r t i l i z a t i o no f t h e f i e l d swas b y i n o r g a n i cf e r t i l i z e r s .

I s o l a t i o n f r o m v e g e t a b l e s a m p l e s . I n mos t i n -s t a n c e s , s a m p l e so f p l a n t m a t e r i a l we r e t a k e n f r o mf i v ed i f f e r e n tp l a n t sa t f i v er a n d o ms i t e spe r f i e l ds ot h a t a t o t a lo f2 5 p l a n t s was s a m p l e df r o m e a c hf i e l d .T h ef o l l o w i n gp a r t s we r e a s s a y e d :t o m a t o ,one f r i u t

a n d o n e l e a fpe r p l a n t ;l e t t u c e ,f i v eo u t e r l e a v e sa n dt h e h e a r t pe r p l a n t ;c e l e r y ,t h r e es t a l k s( t w o f r o mo u t s i d e ,o n e f r o m i n s i d e )a n d t h e h e a r t pe r p l a n t ;c a u l i f l o w e r ,t w o l e a v e sa n d t h e h e a d o f o n e p l a n t( t h r e ed i f f e r e n tp l a n t s were s a m p l e da t e a c h r a n d o ms i t e ) ;a n d s p i n a c h , o n e l e a fpe r p l a n t ( 1 0d i f f e r e n tp l a n t swere s a m p l e da t e a c h r a n d o ms i t e ) .T h ev e g e t a b l es a m p l e swere s l i c e dw h e nn e c e s s a r y

a n d p l a c e d i n d i v i d u a l l yi n t of l a s k sc o n t a i n i n gp h o s -p h a t e - b u f f e r e d( 0 . 0 1M) a c e t a m i d eb r o t h ( p H7 . 0 ) .

I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n .A l l c u l t u r e swerei n c u b a t e df o r4 8 t o 9 6 h a t 4 2 C t o a l l o wg r o w t ho fP .a e r u g i n o s aw h i l ei n h i b i t i n gs a p r o p h y t i cb a c t e r i a ( 7 ) .C u l t u r e sg r own i n a c e t a m i d eb r o t ha n d on KB C aga rw h i c hf l u o r e s c e dw i t h an u l t r a v i o l e tl a m pwere s u s -p e c t e dt o b e P . a e r u g i n o s a .R e p r e s e n t a t i v ey e l l o wo rb l u e - g r e e nf l u o r e s c e n tc o l o n i e sf r o me a c hs a m p l ewerei s o l a t e don K i n g med ium B a n d c o n f i r m e da s P .a e r u g i n o s ab y t h e c h a r a c t e r i z a t i o ns c h e m eo f G i l a r d i( 6 ) .

S e n s i t i v i t yo f t h e i s o l a t i o np r o c e d u r e .S a m p l e so fs o i l ,a c l a yl o a ma n d a s an d y l o amw i t h a pH o f7 . 0a n d 7 . 2 ,r e s p e c t i v e l y ,were s e e d e dw i t h P . a e r u g i n o s aa t a r a n g e o f1 t o 1 0 ,1 0 t o 1 0 0 ,a n d 1 0 0t o 5 0 0c e l l spe r5 0 g o f s o i la n d p r o c e s s e da s p r e v i o u s l yd e s c r i b e d .L e t t u c e , c e l e r y ,a n d t o m a t o f r u i t swere s i m i l a r l yt e s t e d .F i v e r e p l i c a t i o n swere u s e d pe r t r e a t m e n t .A f t e r 4 d a y s o f i n c u b a t i o n , P . a e r u g i n o s awas r e -c o v e r e df r o m a l l f l a s k ss e e d e dw i t h P . a e r u g i n o s aa tt h e 1 t o 1 0 range . P . a e r u g i n o s awas n o t r e c o v e r e df r o m u n s e e d e dc o n t r o lf l a s k sc o n s i s t i n g o f s o i l o rv e g e t a b l em a t e r i a l .

I no c ul a t i o n o fp l a n t s .L e t t u c e a n d b e a np l a n t swere i n o c u l a t e d w i t h P . a e r u g i n o s at o d e t e r m i n ew h e t h e ro r n o t t h e b a c t e r i u mm u l t i p l i e di n p l a n tt i s s u e sa n d t o d e t e r m i n ehow l o n g i t p e r s i s t e du n d e rd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s .A c l i n i c a ls t r a i no f P . a e r u g i n o s a( P A 8 ) g r own o v e r n i g h ton K i n gBs l a n t swas u s e d i n a l l e x p e r i m e n t s .

L e a v e so f l e t t u c ep l a n t s( L a c t u c as a t i v a L . ," G r e a tL a k e " ) , a t t h e s i x - l e a fs t a g e , were i n f i l t r a t e du n d e rvacuum w i t h a c e l ls u s p e n s i o no f 7 x 1 0 'c e l l s / m lo f P .a e r u g i n o s a .T h i s was d o n e b y p l a c i n g t h e p o t t e dp l a n t su p s i d edown i n a vacuum c h a m b e r .The l e a v e swere c o m p l e t e l yi m m e r s e di n t h e i n o c u l u m ,a n d t h ep o t s were h e l d b y a p l a t f o r mw i t h a l u m i n u mf o i lp l a c e d a c r o s s t h e s o i ls u r f a c e t o p r e v e n ts oi l l os s .Avacuum o f7 1 0 mm f Hg was o b t a i n e d ,t h e n r e l e a s e d ,

a t w h i c ht i m e t h e l e a v e sb e c a m et h o r o u g h l yi n f i l -t r a t e dw i t h t h e i n o c u l u m ,g i v i n gt h e l e a v e sa w a t e r -s o a k e d a p p e a r a n c e .C o n t r o l l e a v e sw e r e i n f i l t r a t e dw i t hw a t e r .The p l a n t sw e r et h e ng r o w ni ng r e e n h o u s ec h a m b e r sa t 1 6a n d 2 7 C , a n d a t r e l a t i v eh u m i d i t i e sf l u c t u a t i n gb e t w e e n5 5 t o 7 5 %a n d 8 0 t o 9 5 % .T h ep o p u l a t i o no ft h e b a c t e r i u mw a sm e a s u r e da t 0 , 1 , 2 ,3 , 4 , 6 , 8 , 1 0 , 1 3 , 1 6 , 2 0 , 2 5 a n d 3 0 d a y s a f t e ri n o c u l a t i o nb y c u t t i n go n e 16-mm d i s kf r o m e a c ho ff i v ei n f i l t r a t e dl e a v e sp e r p l a n t .T h ed i s k sw e r er i n s e dt h r e et i m e si n s t e r i l ed i s t i l l e dw a t e rt o r e m o v em o s to ft h eb a c t e r i aa d h e r i n gt o t h e s u r f a c ea n d t h e n g r o u n dw i t h a m o r t a ra n d p e s t l ei n 5 m l o f s t e r i l ed i s t i l l e dw a t e r .T h r e e0 . 1 - m lp o r t i o n sf r o m e a c hd i l u t i o no fa1 0 - f o l dd i l u t i o ns e r i e sw e r ep l a t e do nKBC. E s t i m a t e so f t h e b a c t e r i a lp o p u l a t i o n sw e r emade a f t e ri n c u b a -t i o na t 4 2 C f o r4 8 h . T h e a b o v ee x p e r i m e n t sw e r er e p e a t e df i v et i m e s ,u s i n gt h r e ep l a n t sp e r t r e a t m e n t .

B e a np l a n t s( P h a s e o l u sv u l g a r i sL . ," P i n t o " )w e r ei n f i l t r a t e dw h e n t h e p r i m a r yl e a v e sw e r e a p p r o x i -m a t e l y 9 cm l o n g .T h e p l a n t sw e r e i n f i l t r a t e dw i t h 7 x 1 0 'c e l l so fb a c t e r i ap e r m l a n d m a i n t a i n e du n d e r t h e s a m e e n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sa s t h el e t t u ce p l a n t s .Two 5 -mm d i s k sw e r e c u t f r o m p r i -m a r yl e a v e so fe a c hp l a n t a n d t h e np r o c e s s e da s i n t h el e t t u c ee x p e r i m e n t s .T h e e x p e r i m e n t sw e r er e p e a t e dt w i c ew i t h t h r e ep l a n t sp e r t r e a t m e n t .

To i n s u r e t h a ta n y i n c r e a s ei n b a c t e r i a lp o p u l a t i o ni n t h e a b o v ee x p e r i m e n tw a s a r e f l e c t i o no fb a c t e r i a lm u l t i p l i c a t i o ni n t h e i n t e r c e l l u l a rs p a c e so ft h e p l a n t sa n d n o t o n t h e p l a n ts u r f a c e ,o n ed i s k f r o me a c ho ft h ep r e v i o u s l yd e s c r i b e dt r e a t m e n t sw a s i m p r i n t e do nKBC a n d r e m o v e d .T h e r ew a s n e v e rm o r et h a n f i v ec o l o n y - f o r m i n gu n i t sp e r d i s ke x c e p ta t t h e c u t e d g e so f t h ed i s k s .A s a f u r t h e rc h e c kt o d i f f e r e n t i a t eb e -t w e e nm u l t i p l i c a t i o no f P .a e r u g i n o s ai n t h e i n t e r c e l l u -l a rs p a c e sa n d t h el e a fs u r f a c e ,t h ee n t i r ee x p e r i m e n tw i t h l e t t u c ew a s c o n d u c t e dt w i c ea s p r e v i o u s l yd e -s c r i b e d ,w i t h t h e e x c e p t i o nt h a t t h e l e a fd i s k sw e r ei m m e r s e di n 0 . 5 %s o d i u mh y p o c h l o r i t ef o r1 m i n t os u r f a c es t e r i l i z et h e m ,t h e na i r - d r i e db e f o r ep l a t i n go nKBC. T h e r ew a s n o a p p a r e n td i f f e r e n c ew h e nc o m -p a r i n g d a t a f r o m e x p e r i m e n t sw h e r et h ed i s k sw e r es u r f a c et r e a t e dw i t h s o d i u mh y p o c h l o r i t eo r w a s h e dw i t hw a t e r .

P y o c i n t y p i n g .S t r a i n so f P . a e r u g i n o s aw e r ed i f f e r e n t i a t e db y t h e m e t h o do fD a r r e l la n d Wahba( 3 )a s m o d i f i e db y Z a b r a n s k ya n dD a y( 1 8 ) .A p y o c i np r o d u c i n gi s o l a t eo fP . a e r u g i n o s aw a s d e f i n e da s ac e r t a i nt y p e b y t h e i n h i b i t i o np r o d u c e da g a i n s t1 1i n d i c a t o rs t r a i n so fP . a e r u g i n o s a .S e n s i t i v i t yt e s t i n g .A n t i m i c r o b i a ls u s c e p t i b i l i t yt o

c a r b e n i c i l l i nw a s d e t e r m i n e db y t h ed i s kd i f f u s i o nm e t h o d( 1 ) .

RESULTSP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aw a s r e c o v e r e df r o m

2 4 %( 1 4o u t o f5 8 )o ft h e s o i ls a m p l e s( T a b l e1 ) ,a n d o ft h e s ep o s i t i v es a m p l e s71% ( 1 0o u t o f1 4 )w e r e i s o l a t e df r o m c o u n t y 1 . S o i l si n w h i c ht o m a t o e sw e r e g r o w ny i e l d e dt h e h i g h e s tf r e -q u e n c yo f i s o l a t i o n ;P . a e r u g i n o s aw a s p r e s e n t

9 8 8 APPL .M I CROB I O L .

8/6/2019 Pseudomonas Art 2

3/5

PLANT AND S O I LRESERVOIRS FOR P .AERUGINOSA

TA m V1 . I s o l a t i o no fP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s af r o ms o i la n d p l a n t m a t e r i a l

N o .o fs a m p l e sp o s i t i v e / t o t a lC o u n t y C r o p F r u i ta n d

s o i l F o l i a g e f l o w e r s1 T o m a t o 1 0 / 1 7 1 1 4 2 50 / 4 2 5

O n i o n 0 / 1

L e t t u c e 0 / 1 2 0 / 2 0 0C e l e r y 1 / 9 1 / 1 7 5C a u l i f l o w e r 0 / 3 0 / 4 5P o t a t o 0 / 1C a b b a g e 0 / 1B r o c c o l i 0 / 1S p i n a c h 0 / 1 0 / 5 0O n i o n 0 / 1

3 T o m a t o 0 / 4 0 / 1 0 0C o r n 0 / 1

4 T o m a t o 1 / 2 0 / 5 0 0 / 5 0

5 T o m a t o 0 / 1 0 / 2 5G a r l i c 0 / 1

6 C o t t o n 1 / 1C o r n 1 / 1

i n 4 5 %( 1 1o u t o f 2 4 ) o ft h e t oma to f i e l d s .O n l y1 1 %( 1o u t o f9 ) o f t h e c e l e r ys o i l sc o n t a i n e dP .a e r u g i n o s a .T h e b a c t e r i u mwas n o t r e c o v e r e df r o ml e t t u c e( 0o u t o f 1 2 )o r c a u l i f l o w e rf i e l d s( 0o u t o f 3 ) .O f t h e r e m a i n i n gf i e l d sa s s a y e d ,r e p r e s e n t i n g

n i n e d i f f e r e n t c rop s i n f i v e c o u n t i e s , P .a e r u g i n o s awas o n l y d e t e c t e di n o n e c o t t o n a n do n e co rn f i e l d ,b o t hf r o mc o u n t y6 .Tw e n t y - n i n ep e r c e n t o f t h e s o i l st h a t were p o s i t i v ef o rP .a e r u g i n o s a c o n t a i n e d more t h a n 1 0 0 P .a e r u g i n o s ac e l l s / g( d r yw e i g h t )o fs o i l( Ta b l e2 ) .P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s awas r e co v er e d o n l y

t w i c e f r o m p l a n t m a t e r i a l c o l l e c t e d f r o m 4 3f i e l d s( Ta b l e1 ) .I t was i s o l a t e df r o mo n e t oma tol e a ff r o m a f i e l di n w h i c hP . a e r u g i n o s awasd e t e c t e di n t h e s o i la n d f r o mo n e c e l e r yp l a n t i na f i e l dw h e r eP . a e r u g i n o s awas n o t i s o l a t e df r o ms o i l ,even t h o u g ha t o t a lo f1 0 r a n d o ms o i ls a m p l e s were t a k e n , i n s t e a d o f t h e u s u a l 5( Ta b l e 1 ) .T a b l e 3 s h o w s t h e p y o c i n t y p e s o f P .

a e r u g i n o s ai s o l a t e df r o m s o i la n d p l a n t s .TypeD - 2 a n d B - 7 we r e t h e mos t f r e q u e n t l y re -c o v e r e d , b u t n o n t y p e a b l e s t r a i n s o f P .a e r u g i n o s awe r e a l s ocommon ly i s o l a t e df r o ms o i l .O t h e r t y p e s o c c a s i o n a l l yr e c o v e r e dwereD - 5 , D - 9 , K , X - 1 a n d X - 1 0 . The t wo t y p e si s o l a t e df r o mp l a n t s were B - 7 f r o m t oma t o a n dS f r o m c e l e r y .O f t h e s e 3 4 i s o l a t e s ,2 2 weres e n s i t i v et o c a r b e n i c i l l i n ,9 e x h i b i t e d i n t e r m e d i -a t e r e s i s t a n c e ,a n d 3 were r e s i s t a n t .

M o d e r a t e l yh i g ht e m p e r a t u r e sa n d h u m i d i -t i e sa p p e a r e dt o f a v o rc o l o n i z a t i o na n d s u r v i v a lo fP .a e r u g i n o s aw i t h i np l a n tt i s s u e( F i g . .1 ) .A t2 7 C a n d 8 0 - 9 5 % r e l a t i v eh u m i d i t y P .a e r u g i n o s am u l t i p l i e dw i t h i n t h ep l a n t t i s s u ea n d c a u s e da r o to ft h e l e a v e s .T h el e a v e sb e g a nt oy e l l o w2 t o 3 d a y sa f t e ri n o c u l a t i o n ,c o n c o m i -t a n t w i t h b a c t e r i a lm u l t i p l i c a t i o n .T h e b a c t e -r i a lp o p u l a t i o nr e a c h e di t s h i g h e s tl e v e ls h o r t l yb e f o r et h e l e a v e sw i l t e d( 8 t o 1 0 d a y s ) .Wa t e r -i n f i l t r a t e dp l a n t sm a i n t a i n e du n d e r t h esamec o n d i t i o n sb u t n o t i n o c u l a t e dw i t h t h e b a c t e -r i u m b e g a n t o y e l l o wa p p r o x i m a t e l y1 3 d a y sa f t e r t r e a t m e n t b e c a u s e o f t h e u n f a v o r a b l ee f f e c to f h i g h t e m p e r a t u r ea n d h u m i d i t yo nl e t t u c eg r o w t h .When p l a n t sw e r em a i n t a i n e da t h i g ht e m -

p e r a t u r ea n d l o wh u m i d i t y ,t h e p o p u l a t i o no fP .a e r u g i n o s ar e m a i n e da l m o s tc o n s t a n tf o ra b o u t1 5 d a y s b e f o r es l o w l yd e c r e a s i n g( F i g .1 ) . As l i g h ty e l l o w i n go f t h e i n f i l t r a t e dl e a v e sw a so b s e r v e da f t e r1 0 t o 1 5 d a y s .C o n t r o lp l a n t si n f i l t r a t e dw i t h w a t e r s h o w e dn o s y m p t o m s

TA B L E2 . P o p u l a t i o no fP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ai s o l a t e df r o ms o i la n d p l a n t m a t e r i a l

N o .o fs a m p l e sw i t hCoun t ' C rop N o . i n d i c a t e dc o l o n yc o u n t s "p o s i t i v e

I~ ~ ~ ~ ~ 1 0 - 1 0 '1 0 ' - 1 0 ' ,1 0 ' 2 - 1 0 '

1 T o m a t o( s o i l ) 1 0 2 4 41 T o m a t o( l e a f ) l b2 C e l e r y( s o i l ) 1 12 C e l e r y( s t a l k ) l b4 T o m a t o( s o i l ) 1 16 C o t t o n( s o i l ) 1 16 C o r n( s o i l ) 1 1

a P e r g r a mo fd r y w e i g h t .I C o u n tn o t d e t e r m i n e d .

TA B L E3 . P y o c i nt y p e so fP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ai s o l a t e df r o ms o i la n d p l a n t m a t e r i a l

N o . o f P y o c i nt y p e sC r o p i s o l a t e s- - -

t y p e dB - 7 D - 2 D - 5D - 9 K S X - 1 X - 1 0NTa

To m a t o 2 8 7 1 0 1 1 3 1 5( s o i l )

T o m a t o 1 1( l e a f )

C o t t o n 1 1( s o i l )

C o r n 2 1( s o i l )

C e l e r y 1 1( s o i l )

C e l e r y 11( s t a l k ) INTW,N o n t y p a b l e s ;no i n h i b i t i o no f i n d i c a t o rs t r a i n s .

n 9 8OL .2 8 ,1 9 7 4

8/6/2019 Pseudomonas Art 2

4/5

GREEN ET AL .

U

L L 6

- J

L i J

H

L L 4

0

00- J

2 4 6 8 1 0 1 3 1 6 2 0 2 5 3 0

DAYS AFTER INOCULATION

F I G .1 . G r o w t hc u r v eo fP . a e r u g i n o s ai n l e a v e so f

l e t t u c ep l a n t s a t d i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s :0 , 1 6 C ,5 5 - 7 5 %r e l a t i v eh u m i d i t y ;0 , 1 6 C ,8 5 - 9 5 %r e l a t i v eh u m i d i t y ;0 , 2 7C ,5 5 - 7 5 %r e l a t i v eh u m i d i t y ,A , 2 7 C ,8 5 - 9 5 %r e l a t i v eh u m i d i t y .E a c hp o i n t r e p r e -s e n t s1 5 r e p l i c a t i o n s .

d u r i n g t h e e xp e r i m e n t .T h e p o p u l a t i o no f P .a e r u g i n o s ad e c r e a s e da f t e ri n f i l t r a t i o nt op l a n t st h a tw e r e g r o w na t 1 6 C , a l t h o u g ht h e r a t eo fd e c r e a s ew a s c o n s i d e r a b l yl o w e r w h e np l a n t sw e r e m a i n t a i n e da t a h i g h r e l a t i v eh u m i d i t y( F i g .1 ) .A t t h i sl o w t e m p e r a t u r e ,t h e r ew a s n oe v i d e n c eo f i n j u r yt o l e a v e si n f i l t r a t e dw i t hb a c t e r i ao r w a t e r w h e nt h e p l a n t sw e r e i n c u -b a t e d a t e i t h e rh i g h o r l o wh u m i d i t y .T h e s u r v i v a la n d m u l t i p l i c a t i o n o f P .

a e r u g i n o s aw i t h i n b e a n t i s s u e s ( F i g .2 ) u n d e rd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sw e r es i m i l a rt o t h a t i n i n f i l t r a t e dl e t t u c el e a v e s .T h e l e a v e sw i l t e da f t e ri n o c u l a t i o nw i t h b a c t e r i aw h e ng r o w na t h i g ht e m p e r a t u r ea n d h i g hh um i d i t y .O t h e r w i s e ,t h e r ew e r en o s y m p t o m so f i n j u r y .

DISCUSSIONP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aw a s r e c o v e r e df r o m

2 4 %( 1 4o u t o f5 8 )o ft h e C a l i f o r n i as o i l st e s t e d ,w h i c hs u g g e s t s t h a t i t i s f a i r l yc ommon s o i l -b o r n e b a c t e r i u m i n a g r i c u l t u r a ls o i l s .T h a tt h e s es o i l sa r e a n a t u r a lh a b i t a t f o rt h e b a c t e -r i u m i s s u p p o r t e db y t h e f a c t st h a t t h e r ew a sn oh i s t o r yo f o r g a n i cf e r t i l i z e r sb e i n gu s e d o n t h ef i e l d s ,n o p a s t u r i n go f a n i m a l s ,a n d i r r i g a t i o nw a t e r w a s f r e e o f t h e b a c t e r i u m . A l t h o u g hv a r i o u s t e x t b o o k sc i t es o i la s a c ommon s o u r c ef o r t h e b a c t e r i u m ,w e , a s w e l la s R i n g e na n dD r a k e( 1 4 ) ,c o u l df i n dl i t t l ep u b l i s h e dd a t a t os u p p o r t t h e s t a t e m e n t s . F u r t h e r m o r e ,R i n g e na n dD r a k e( 1 5 )f o u n dP . a e r u g i n o s ai no n l y3 o f1 0 0s o i ls a m p l e sa n d c o n c l u d e dt h a t " i t sn a t u r a lh a b i t a t ,i n p a r t a t l e a s t ,i s h uma n f e c e sa n d

s e w a g e . "O u rg r e a t e rp e r c e n t a g eo fd e t e c t i o no fP . a e r u g i n o s af r o ms o i li s p r e s u m a b l ya r e f l e c -t i o no f i m p r o v e di s o l a t i o nt e c h n i q u e s .We h a v e n o e x p l a n a t i o nf o r t h e s p o r a d i c

o c c u r r e n c eo f P . a e r u g i n o s ai n t h e d i f f e r e n t

l o c a l i t i e s .I t d i d n o t a p p e a rt o b e r e l a t e dt o s o i lt y p e ,pH r a n g e ,o rf e r t i l i z a t i o np r a c t i c e s .I t w a ss u r p r i s i n gt h a t s u c h a h i g h p e r c e n t a g eo f s o i lw a s f o u n d t o c o n t a i nP . a e r u g i n o s aw h e nc o n -s i d e r i n gt h e r e l a t i v e l yf ew s am p l i n g sp e r f i e l d .Many m i c r o o r g a n i s m sa r en o t e v e n l y d i s t r i b -u t e d t h r o u g h o u ts o i l a n d o c c u r i n c l u m p so rp o c k e t so fs o i la s s o c i a t e dw i t h a f o o db a s e .T h i smay b e t h e c a s ew i t hP . a e r u g i n o s a ,a n d t h u s i t so c c u r r e n c ei n s o i l sc o u l d w e l lb e e v e n m o r ep r e v a l e n t t h a n i n d i c a t e db y o u r d e t e c t i o nm e t h o d s .P y o c i nt y p i n go f P . a e r u g i n o s as h o w e dt h a t

s o i l c o n t a i n e d a v a r i e t yo f s t r a i n s ,many o fw h i c hh a d t h e s a m ep y o c i np r o d u c t i o np a t t e r na s c l i n ic a ls t r a i n s .T h em o s tc o m m o n l yi s o l a t e dt y p e so fP . a e r u g i n o s af r o mc l i n i c a ls p e c i m e n s ,B - 7 a n d D - 2 ( 1 0 ) ,w e r e a l s ot h e t y p e s m o s tf r e q u e n t l yd e t e c t e di n s o i l .T h i s s u g g e s t s t h a ts o i lc o n s t i t u t e sa p o s s i b l er e s e r v o i rf o rs t r a i n so fP . a e r u g i n o s a f o u n d i n h u m a n s .The o t h e rt y p e s ,D - 5 ,D - 9 ,K , X - 1 ,X - 1 0a n d n o n t y p a b l e s ,h a v e i n f r e q u e n t l yb e e n r e c o v e r e df r o m c l i n i c a ls p e c i m e n s( 1 0 ) .O f p a r t i c u l a ri m p o r t a n c ewas t h e i s o l a t i o no f

t h r e e c a r b e n i c i l l i n - r e s i s t a n ts t r a i n s o f P .

a e r u g i n o s a f r o m s o i l . C a r b e n i c i l l i n - r e s i s t a n ts t r a i n sh a v e a l s ob e e n i s o l a t e df r o mv e g e t a b l e s

7 -

LL4

- J

C - )

U _ 40

0

DAYS AFTER INOCULATION

F i G .2 . G r o w t ho fP . a e r u g i n o s ai n l e a v e so fp i n t ob e a n sa t v a r i o u se n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s :0 , 1 6 C ,5 5 - 7 5 %r e l a t i v eh u m i d i t y ;0 , 1 6 C , 8 5 - 9 5 %r e l a t i v eh u m i d i t y ;0 , 2 7 C , 5 5 - 7 5 %r e l a t i v eh u m i d i t y ;A ,2 7C ,8 5 - 9 5 %r e l a t i v eh um i d i t y .E a c hp o i n t r e p r e s e n t ss i xr e p l i c a t i o n s .

9 9 0 APPL .M I C ROB I O L .

8/6/2019 Pseudomonas Art 2

5/5

PLANT AND S O I LRESERVOIRS FOR P . AERUGINOSA

s e r v e dt o p a t i e n t s ( S .D . K o m i n o s , u n p ub l i s h e dd a t a ) .S u c h r e s i s t a n ts t r a i n smay b e s e l e c t e dt h r o u g h a n t i b i o t i ct h e r a p y a n d t h u s l e a dt of u r t h e rc o m p l i c a t i o n so f t h e i n f e c t i o u s p r o c e s s .L o w b u r ye t a l . ( 1 1 )d e m o n s t r a t e dt h e e m e r g -e n c e o fh i g h l yr e s i s t a n ts t r a i n so fP . a e r u g i n o s af o l l o w i n gc a r b e n i c i l l i nt r e a t m e n to fh o s p i t a l i z e dp a t i e n t s .K o m i n o se t a l . ( 1 0 )s h o w e dt h a t f r e s hv e g e t a -

b l e sc o m m o n l yc a r r i e ds t r a i n so fP . a e r u g i n o s aa n d c o n s i d e r e dt h e mt o b e a m a j o rv e h i c l ef o rt h e d i s s e m i n a t i o no f t h i sb a c t e r i u m .H o w e v e r ,i n t h i s i n v e s t i g a t i o n ,P . a e r u g i n o s aw a s o n l yf o u n d t w i c e i n p l a n t s s a m p l e di n t h e f i e l d -f r o ma t o m a t ol e a f( t y p eB - 7 ) a n d f r o ma c e l e r yp l a n t ( t y p eS ) . I t w a s s u r p r i s i n gt h a t t h er e c o v e r yo fP . a e r u g i n o s af r o mt h e c e l e r yp l a n tw a s i n a f i e l dw h e r ei t w a s n o t d e t e c t e di n t h es o i l .M o s tl i k e l y ,h o w e v e r ,i t w a sp r e s e n ti n s o i lb ut w a sn o t d e t e c t e d .T h e r a r ef i n d i n go fP . a e r u g i n o s ao n v e g e t a -

b l e si n C a l i f o r n i a ,e v e n t h o u g hp r e s e n t i n v a r i -o u s s o i l s ,r a i s e sq u e s t i o n sa s t o h o wt h e r e l a -t i v e l yh i g h p e r c e n t a g eo fv e g e t a b l e ss am p l e d b yK o m i n o se t a l . ( 1 0 )b e c a m ec o l o n i z e db y P .a e r u g i n o s a .I fp l a n t s a r en o t w i d e l yc o l o n i z e db yP . a e r u g i n o s ai n g r o w i n gf i e l d s ,a s t h i ss t u d ys u g g e s t s ,t h e n c o n t a m i n a t i o nmay o c c u rd u r i n gh a r v e s t ,h a n d l i n g ,p r o c e s s i n g ,a n d t r a n s i t .Ve g -e t a b l e smay c o m ei n c o n t a c tw i t h s o i l ,i n s e c t s ,h u m a n s ,a n d o t h e r s ou r c e so f P . a e r u g i n o s a ,t h e r e b y a c q u i r i n g t h e o r g a n i s m.C o l o n i z a t i o nw o u l dt h u s o c c u r r a p i d l y ,i f , d u r i n gp r o c e s s i n ga n d t r a n s i t ,t h e r ew e r ep e r i o d sw h e nt e m p e r a -t u r e a n d m o i s t u r e f a v o r e d b a c t e r i a lg r o w t h .T h i s c o n c e p ti s s t r e n g t h e n e db y t h e f i n d i n g so fK o m i n o se t a l . ( 1 0 ) ,w h i c hs h o w e dt h a t t r a n s -p o r t e d v e g e t a b l e s( e s p e c i a l l yt o m a t o e s ) c o n -t a i n e d l a r g en u m b e r so fP . a e r u g i n o s a .T h e i n c i d e n c eo fP . a e r u g i n o s ai n p l a n t s a n d

s o i l sf r o mC a l i f o r n i aa n d o t h e rs t a t e ss h o u l db es t u d i e d f o rs e v e r a ly e a r s ,h o w e v e r ,b e f o r ec o n -c l u d i n gt h a t t h i s o r g a n i s mi s a n i n f r e q u e n tc o l o n i z e ro fp l a n tma t e r i a l si n f a r m l a n d s .T h e

e n v i r o n m e n td i f f e r ss u b s t a n t i a l l yamong y e a r s ,a n d ,a s w i t h common b a c t e r i a ld i s e a s e s o fC a l i f o r n i ap l a n t s ,t h e r ea r ey e a r s w h e nc o n d i -t i o n sd o n o t f a v o rb a c t e r i a li n f e c t i o n .T h eC a l i f o r n i a c l im a t e ,i n g e n e r a l ,w o u l dn o t s e e mt o b e c o n d uc i v ef o rP . a e r u g i n o s at o c o l o n i z ep l a n t sb e c a u s eo ft h e s e m i a r i dc o n d i t i o n sw h e r em o s t c r o p s a r eg r o w n .C l i m a t e sw h e r ea h i g hh u m i d i t yi s c o m m o n ,w i t h f r e q u e n t r a i n f a l l ,w o u l d a p p e a ri d e a lf o rP . a e r u g i n o s ai n v a s i o no fp l a n t s .S p r i n k l e ri r r i g a t i o nw o u l da l s oa p p e a rt of a v o rP . a e r u g i n o s a ,s i n c es p l a s h i n gw a t e rc o u l dc a r r yt h e b a c t e r i u m t o a b o v e - g r o u n dp l a n tp a r t sw h e r et h e y c o u l de n t e r t h e p l a n tt h r o u g h

w a t e r - c o n g e s t e da r e a s .A l lt h e f i e l d st e s t e d i nt h i ss t u d yw e r ef u r r o wi r r i g a t e da n d s i t u a t e d i na n a r e a w h e r et h e a v e r a g esummer r a i n f a l lw a sn e g l i g i b l e .

LITERATURE CITED

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2 . B r o w n ,V. I . , a n d E . J . L . L ow b u r y .1 9 6 5 .Us e o f a ni m p r o v e dc e t r i m i d ea g a r medium a n d o t h e r c u l t u r em e t h o d sf o rP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a .J . C l i n .P a t h o l .1 8 : 7 5 2 - 7 5 6 .

3 . D a r r e l l ,J . H . ,a n d A . H . Wa h b a .1 9 6 4 .P y o c i n e - t y p i n go fh o s p i t a ls t r a i n so f P s e u d o m o n a sp y o c y a n a e .J . C l i n .P a t h o l . 1 7 : 2 3 6 - 2 4 2 .

4 . E d m o n d s ,P . ,R . R .S u s k i n d ,B .G . M ac m i l l an ,a n d I . A .H o l d e r . 1 9 7 2 . E p i d e m i o l o g yo f P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a i n a b u r n s h o s p i t a l :s u r v e i l l a n c eb y ac o m b i n e dt y p in g s y s t e m.A p p l .M i c r o b i o l .2 4 : 2 1 9 - 2 2 5 .5 . F i e r e r ,J . , P . M . Ta y l o r ,a n d H. M. G e z o n . 1 9 6 7 .P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ae p i d e m i ct r a c e d t o a d e l i v e r yr o o mr e s u s c i t a t o r .N . E n g l . J . M e d .2 7 6 : 9 9 1 - 9 9 6 .

6 . G i l a r d i ,G . L . 1 9 7 1 .C h a r a c t e r i z a t i o no f P s e u d o m o n a ss p e c i e si s o l a t e df r o m c l i n i c a ls p e c i m e n s .A p p l . M i c r o -b i o l .2 1 : 4 1 4 - 4 1 9 .

7 . H a y n e s ,W. C . 1 9 5 1 .P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a - i t sc h a r -a c t e r i z a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o n .J . G e n . M i c r o b i o l .5 : 9 3 9 - 9 5 0 .

8 . K i n g , E . O . ,M . K . Wa r d ,a n d D . E . R a n e y .1 9 5 4 .Twos i m p l em e d i af o rt h e d e m o n s t r a t i o no fp y o c y a n i na n df l u o r e s c e i n .J . L a b . C l i n .M e d .4 4 : 3 0 1 - 3 0 7 .

9 . K o m i n o s ,S . D . ,C .E . C o p e l a n d ,a n d B . G r o s i a k .1 9 7 2 .Mode o f t r a n s m i s s i o no fP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ai n ab u r n u n i ta n d a n i n t e n s i v ec a r eu n i t i n a g e n e r a l

h o s p i t a l .A p p l .

M i c r o b i o l .2 3 : 3 0 9 - 3 1 2 .1 0 .K o m i n o s ,S . D . ,C . E . C o p e l a n d ,B . G r o s i a k ,a n d B .P o s t i c .1 9 7 2 .I n t r o d u c t i o no fP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ai n t o a h o s p i t a l v i av e g e t a b l e s .A p p l . M i c r o b i o l .2 4 : 5 6 7 - 5 7 0 .

1 1 .L o w b u r y ,E . J . L . ,A. K i d s o n ,H . A. L i l l y,G . A . J . Ay l i f f e ,a n d R . J . J o n e s . 1 9 6 9 .S e n s i t i v i t yo f P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s at o a n t i b i o t i c s :e m e r g e n c eo f s t r a i n sh i g h l yr e s i s t a n tt o c a r b e n i c i l l i n .L a n c e t2 : 4 4 8 - 4 5 2 .

1 2 .L o w b u r y ,E . J . L . ,B .T . T h o m ,H . A . L i l l y,J . R . B a b b ,a n d K .W h i t t a l l .1 9 7 0 .S o u r c e so f i n f ec t i o nw i t hP s e u -d o m o n a sa e r u g i n o s ai n p a t i e n t sw i t h t r a ch e o s to m y .J .M e d .M i c r o b i o l .3 : 3 9 - 5 6 .

1 3 .P h i l l i p s ,I . , a n d G . S p e n s e r . 1 9 6 5 .P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a :c r o s s i n f ec t i o nd u e t o c o n t a m i n a t e dr e s p i -r a t o ra p p a r a t u s .L a n c e t2 : 1 3 2 5 - 1 3 2 7 .

1 4 .R i n g e n ,L . M . , a n d C . H . D r a k e . 1 9 5 2 .A s t u d y o f t h ei n c i d e n c eo f P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s af r o m v a r i o u sn a t u r a ls o u r c e s .J . B a c t e r i o l .6 4 : 8 4 1 - 8 4 5 .

1 5 .S h o o t e r ,R . A . ,E . M. C o o k e ,M. C .F a i e r s ,A. L .B r e a d e n ,a n d S .M. O ' F a r r e l l .1 9 7 1 .I s o l a t i o no fE s c h e r i c h i ac o l i ,P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ,a n d K l e b s i e l l af r o m f o o d i nh o s p i t a l s ,c a n t e e n s ,a n d s c h o o l s .L a n c e t2 : 3 9 0 - 3 9 2 .

1 6 .S h o o t e r ,R . A . ,H . G a y a , E . M. C o o k e ,P . K u m a r ,N .P a t e l ,M. T . P a r k e r ,B . T . T h o m ,a n d D . R . F r a n c e .1 9 6 9 .F o o d a n d m e d i c a m e n t sa s p o s s i b l es o u r c e s o fh o s p i t a ls t r a i n so f P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a .L a n c e t1 : 1 2 2 7 - 1 2 2 9 .

1 7 .S m i t h ,R . F . , a n d S . L .D a y t o n .1 9 7 2 .U s eo fa c e t a m i d eb r o t h i n t h e i s o l a t i o no fP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s af r o mr e c t a ls w a b s .A p p l .M i c r o b i o l .2 4 : 1 4 3 - 1 4 5 .

1 8 .Z a b r a n s k y ,R . J . , a n d F . E .D a y. 1 9 6 9 .P y o c i n e - t y p i n go fc l in i c al s t r a i n so fP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a .A p p l .M i -c r o b i o l .1 7 : 2 9 3 - 2 9 6 .

9 9 1O L .2 8 ,1 9 7 4