UNIVERSIDAD NACIONAL DE UCAYALI

FACUALTAD DE CIENCIAS FORESTALES

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA FORESTAL

DETERMINACIÓN DEL PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN DE SEMILLAS DE

BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, Mart.) Y CEDRO (Cedrela odorata, L.) PARA

GERMINACION IN VITRO.

Plántulas de cedro y bolaina germinadas en el laboratorio.

Bach. FRANK PETTER APONTE SHUPINGAHUA.

PUCALLPA – PERU.

2008

DETERMINACIÓN DEL PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN DE SEMILLAS DE

BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, MART.) Y CEDRO (Cedrela odorata, L.),

PARA GERMINACIÓN IN VITRO.

DETERMINATION OF THE PROTOCOL OF DISINFECTION OF SEEDS OF

BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, MART.) AND CEDAR (Cedrela odorata, L.)

FOR IN VITRO GERMINATION.

Frank Petter Aponte Shupingahua.(1)

RESUMEN

Con la finalidad de establecer un procedimiento ideal en la esterilización de semillas de

bolaina blanca (Guazuma crinita) y cedro (Cedrela odorata), para su germinación In Vitro,

se probaron diferentes tiempos de exposición al hipoclorito de sodio al 2%, que consistieron

en 10, 30 y 40 min. Los resultados fueron que, para el cedro se requiere 40 min de exposición

al desinfectante, obteniéndose 0% de contaminación, mientras que en bolaina blanca se

requiere 30 min, con iguales resultados. Asimismo se obtuvo que en el porcentaje de

germinación se alcanzó 26.66% y 28% para el cedro y bolaina respectivamente.

PALABRAS CLAVES: Tiempos de exposición, hipoclorito de sodio, Guazuma crinita

Mart, Cedrela odorata L, porcentaje de contaminación, porcentaje de semillas germinadas.

ABTRACT.

With the purpose of establishing an ideal procedure in the sterilization of seeds of bolaina

blanca (Guazuma crinita) and cedar (Cedrela odorata), for his In vitro germination, they were

proved different times of exhibition to the hipoclorito of sodium to 2 %, which consisted of

10, 30 and 40 min. The results were that, For the cedar 40 min of exhibition are needed to the

disinfectant, 0 % of pollution being obtained, whereas in bolaina blanca are needed 30min,

with equal results. Likewise there was obtained that in the percentage of germination 26.66 %

and 28 % were reached for the cedar and bolaina respectively.

KEY WORDS: Times of exhibition, hipoclorito of sodium, Guazuma crinita Mart, Cedrela

odorata L, percentage of pollution, percentage of germinated seeds.

(1) Bachiller en Ciencias Forestales - UNUINTRODUCCION

Ante el poco conocimiento de las técnicas y procedimientos de propagación in Vitro para

la especie Guazuma crinita, Mart, y Cedrela odorata, se hace difícil determinar la

metodología adecuada para introducir de manera aséptica las semillas al cultivo in Vitro, que

es el primer paso para propagar micro estacas de plántulas germinadas en condiciones de

laboratorio en un medio MS, con el objeto de cultivar grandes cantidades de individuos en

espacios reducidos (CALZADA. 1980).

Al determinarse el protocolo de desinfección de Guazuma crinita, y Cedrela odorata, se

podrá establecer una metodología dentro de un programa de multiplicación In Vitro de la

especie en cuestión, además de la posibilidad de multiplicación de explantes de alto valor

genético y libre de enfermedades, con lo cual se podrá abastecer a los empresarios dedicados

a realizar reforestación, motivo por el cual se convertirá en una actividad rentable para todo

aquél que se dedique a la producción de plántulas bajo este método, que a su vez evitará la

dependencia de semillas provenientes de los bosques y disminuirá el impacto causado sobre

las poblaciones naturales.

El presente trabajo tiene como objetivo encontrar el tiempo más adecuado a la exposición

de hipoclorito de sodio en la esterilización de las semillas de BOLAINA BLANCA

(Guazuma crinita, Mart.) Y CEDRO (Cedrela odorata, L.) para la germinación en

condiciones de In Vitro.

Según FONT QUER (1978), la especie Guazuma crinita Mart., se clasifica dentro del

Orden malvales; Familia Sterculaceae: Genero Guazuma. Además que es un árbol de

crecimiento rápido, fuste recto, madera blanda de propagación fácil, abundante semilla, sufre

ataque de hormigas. Su madera es comercial en la región, se utiliza principalmente para

viviendas rurales por su bajo costo.

Cedrela odorata perteneciente al Orden Sapindales, de la familia Meliaceae. Habita

en tierras altas de la selva y márgenes inundables de los ríos. Es un árbol maderable conocido

como cedro y cedro real y se distribuye desde el norte de México hasta el norte de Argentina.

Asimismo, es fácil de trabajar, cepillar, tallar, tornear y lijar y posee una alta resistencia al

ataque de hongos e insectos (INIFAD. 1994). Al igual que Swietenia microphylla, el cedro es

atacado por el barrenador de brotes, Hypsipyla grandella

Las especies heliófitas como la BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, Mart.) Y

CEDRO (Cedrela odorata, L.), son bastante requeridos en el mercado de la madera por sus

múltiples usos (TARIQUE. 1987), además VIDAURE (1992), afirma que bolaina blanca se

adecua bien a suelos del tipo Ultisol, Entisol e Inceptisol, mientras que el Cedro se adapta a

una gran variedad de suelos, principalmente bien drenados, de textura arenosa, franco arenosa

y arcillosa (CATIE, 1997).

Según DÍAZ, (2000) en 1 kilogramo hay aproximadamente 750,000 semillas de

bolaina, el Porcentaje de germinación es de 65 % para semillas frescas en condiciones

ambientales con temperatura promedio de 25 °C. Las semillas se pueden almacenar en

condiciones ambientales hasta un tiempo máximo de 280 días con un porcentaje de

germinación esperada de 40 %. En la propagación por semilla directamente a nivel de

investigación se obtuvo 19.75 % de germinación en campo definitivo en suelo mineral con

una cobertura de hojas pequeñas secas y 14.75 % en suelo mineral con una cobertura de

plantación de arroz.

Un kilogramo contiene aproximadamente de 15,000 a 69,000 semillas de cedro, con

un promedio de 32,000 y un contenido de humedad de 30%; presenta un porcentaje de pureza

de 40 a 70. Bajo condiciones ambientales, la viabilidad de las semillas disminuye

rápidamente después de un mes, La semilla fresca presenta una viabilidad del 80% y se

logran porcentajes de germinación de 85 a 95%, sin tratamiento pre germinativo. La

germinación se inicia de 8 a 15 días después de la siembra y se completa a los 15 a 18 días

(PROSEFOR, 1997).

El medio de cultivo es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua.

Usualmente incluye sales inorgánicas, carbohidratos y vitaminas y aminoácidos. A menudo

se denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento y

ocasionalmente con otras sustancias varias. El medio de cultivo mas conocido es el MS o de

Murashige y Skoog (1962)

En un trabajo de investigación realizado por VILLEGAS (2008), se utilizó una

concentración al 2% de hipoclorito de sodio durante 10, 20 y 40 min. para esterilizar semillas

de bolaina a ser sembradas en condiciones de In Vitro, donde determinó que no se obtuvieron

diferencias entre los tiempos de exposición de las semillas al hipoclorito de sodio, ya que se

dio una desinfección del 100% para las tres variables utilizadas.

MATERIAL Y METODO.

MATERIAL

De Laboratorio

Matraces Erlenmeyers de 250 y 500 ml

Vasos de precipitado de 500 ml

Placas petri

Pipetas de 1 y 10 ml

Probetas de 100 ml

Mechero de alcohol

Pinzas

Tubos de ensayo autoclavable

Varillas de vidrio

Frascos ámbar

Tubo de ensayo

Papel aluminio

Cintas selladoras

Mangos de bisturí

Hoja de bisturí

Cuchillas

Equipos de Laboratorio

Autoclave

Estufa

Balanza analítica

Cámara de flujo laminar

Aire acondicionado

Refrigeradora

Cocina eléctrica

Horno Pasteur

METODO

Se empleó el método experimental, que consistió en cualificar y cuantificar el efecto

del tiempo de exposición del hipoclorito de sodio al 2% en la asepsia de las semillas de

bolaina y cedro, con lo cual se obtuvo una metodología adecuada para el protocolo de

desinfección de esta especie.

Preparación del germoplasma.

Las semillas utilizadas para el desarrollo del presente trabajo de investigación fueron

proporcionadas por el CIDRA (Centro de Investigación y Desarrollo Rural Amazónico), las

mismas que fueron extraídas de árboles seleccionados con características fenotípicas

superiores, provenientes de plantaciones ubicadas en el bosque Macuya, perteneciente al

distrito de Tournavista, Provincia de Puerto Inca, Región Huánuco. Las semillas se

conservaron en una bolsa de papel dentro de un refrigerador para mantener su viabilidad

hasta el día del trabajo en el laboratorio. Las semillas no fueron expuestas a ningún tipo de

tratamiento pre germinativo.

Procedimiento de desinfección.

El experimento se desarrollo en las instalaciones del laboratorio de cultivos y

vegelates perteneciente a la Facultad de Trópicos y Sub Trópicos de la Universidad de

Agricultura de Praga en Republica Checa.

Para el procedimiento de desinfección se utilizó en todos los tratamientos, una

concentración de alcochol de 96º por 60 segundos, y después se colocó en hipoclorito de

sodio al 2%, los tiempos de exposición a dicha concentración se muestran en el siguiente

cuadro:

Tabla 1.-Tiempo de exposición a una concentración de hipoclorito de sodio al 2%, para el

proceso de desinfección de semillas de BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, Mart.) Y

CEDRO (Cedrela odorata, L.), en condiciones de In Vitro.

Tratamientos por especie Tiempo de inmersión al hipoclorito de sodio al

2%T ET1 cedro 20 min.T2 cedro 30 min.T3 cedro 40 min.T4 bolaina 20 min.T5 bolaina 30 min.T6 bolaina 40 min.

Para todos los tratamientos se agregó 2 gotas de Tween 80, como detergente líquido

para mejorar la capacidad desinfectante, además cada tratamiento fue expuesto durante dos

minutos en alcohol al 96º. Se utilizó un agitador electrónico para garantizar la homogeneidad

en la solución. Al finalizar el tiempo de exposición al desinfectante, se enjuagó las semillas

con agua estéril 3 veces, esto se realizó dentro de la cámara de flujo laminar justo antes de la

siembra.

Preparación del medio de cultivo.

La preparación del medio de cultivo se realizó en base a la constitución de sales de

Murashige Skoog (MS), más 4 gr. De Fitagel/litro, también se agrego 30 gr. De

sacarosa/litro. Seguidamente el medio de cultivo se distribuyo en frascos de vidrio y cerrados

con papel aluminio. Finalmente se introdujo en el autoclave a 121ºC, y 6.8 Kg/cm2, por 15

min., finalmente se dejo enfriar hasta que la solución se gelatinice.

Procedimiento de siembra.

Se procedió a la siembra de las semillas ya esterilizadas, para esto se utilizo una pinza

con la cual se colocaron las semillas en la superficie del medio de cultivo, a razón de una

semilla por frasco, haciendo un total de 166 muestras distribuidos en 6 tratamientos. Los

frascos se rotularon y colocaron dentro de la cámara de incubación a condiciones controladas

de temperatura (25 ºC), y una intensidad lumínica de 4000 luz.

Evaluación de parámetros.

La evaluación de los índices de contaminación y germinación se realizaron a los 3, 7 y 15

días después de haber sido sembradas las semillas.

Tratamiento de datos.

Para el ensayo se utilizó un Diseño Completo al Azar (DCR), los porcentajes de los

promedios obtenidos en la contaminación y germinación de las semillas en cada tratamiento

se sometieron a una prueba de Independencia al 95% grados de libertad.

RESULTADOS.

Contaminación de las semillas.

Para esta variable se determinó que existe relación entre los tres tiempos de exposición al

hipoclorito de sodio y la asepsia de las semillas de cedro y bolaina, como se muestra en los

cuadros siguientes:

Tabla 2.- Prueba de independencia para el porcentaje de contaminación de cedro.

TratamientoN° de semillas

sembradas

Prueba de independencia (0,05)(% de contaminación)

T3 30 0T2 40 60T1 25 100

Tabla 3.- Prueba de independencia para el porcentaje de contaminación de bolaina blanca

Tratamiento N° de semillas sembradas

Prueba de independencia (0,05) (% de

contaminación)T5 50 0

T6 20 0

T4 25 100

100

60

0

100

0 00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100% de contaminacion

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos% de contaminacion

Figura 01. Porcentaje de contaminación de semillas de bolaina y cedro sometidas a diferentes

tiempos de exposición a una concentración de 2% de hipoclorito de sodio.

En la Figura 01 se observa que T1 y T4 muestran una contaminación de una 100%, mientras

que T2 logró disminuir la contaminación a 60%, pero con los tratamientos T3, T5 y T6, la

contaminación se disminuye a 0 %.

Germinación de las semillas.

Para esta variable se determinó que existe relación entre los tres tiempos de exposición al

hipoclorito de sodio y la germinación de las semillas de cedro y bolaina, como se muestra en

las tablas siguientes:

Tabla 4.-Prueba de independencia para el porcentaje de germinación de semillas de Cedro.

TRATAMIENTON° de semillas

sembradasPrueba de independencia (0,05)

% de GerminaciónResistencia a

la germinación

T3 30 26.66 9 - 15 díasT2 16 12.5 9 - 15 díasT1 25 0 0

Tabla 5.- Prueba de independencia para el porcentaje de germinación de semillas de bolaina

TRATAMIENTON° de semillas

sembradasPrueba de independencia (0,05) %

de GerminaciónResistencia a la

germinación

T5 50 28 6 - 15 díasT6 20 25 6 - 15 díasT4 25 0 0

0,00

12,50

26,66

0,00

28,00

25,00

0

5

10

15

20

25

30% de germinacion

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos% de Germinación

Figura 02. Porcentaje de germinación de semillas de bolaina y cedro sometidas a diferentes

tiempos de exposición a una concentración de 2% de hipoclorito de sodio.

En la Figura 02 se tiene que, tanto T1 como T4 no muestran germinación debido a que estas

semillas se eliminaron por presentar contaminación, mientras que T2 muestra 12,5%, de

germinación, seguido de T6 con 25%, el tratamiento T3 con 26,66% y T5 con 28%.

DISCUSIONES.

En el cuadro 2 se muestra el porcentaje de contaminación en las semillas de cedro,

donde se tiene que las semillas de cedro expuestas a 20 min a la concentración de hipoclorito

de sodio a 2% (ver Tabla 1) no muestra resultados favorables, ya que se obtuvo un 100% de

contaminación de las semillas, siendo el tiempo óptimo para esta especie 40 min, al obtenerse

un 0% de contaminación. El porcentaje de contaminación de semillas de bolaina (Tabla 3), se

observa que éstas, expuestas a 20 min a la concentración de hipoclorito de sodio a 2% (ver

Tabla 1), no tiene efecto positivo para la esterilización de la especie, pero que con 30 y 40

min se tiene que la contaminación disminuye en un 100%.

Esto forma un contraste en lo obtenido por VILLEGAS (2008), ya que encontró que

no existen diferencias entre los diferentes tiempos de exposición de las semillas de bolaina al

hipoclorito de sodio , siendo los resultados de esterilización de las semillas favorables en un

100% a los 10, 20 y 40min., esto deja en evidencia que la procedencia de las semillas y el

trato que reciben al momento de ser cosechadas y transportadas juegan un papel importante

en la asepsia de las mismas (HARTAMAN. 1995), lo cual se refleja en la complejidad y

efectividad para esterilizar el material genético.

En la Tabla 4, se tiene el porcentaje de germinación de las semillas de Cedro después

del proceso de desinfección, donde las semillas expuestas a 40 min al desinfectante tienen

mejores resultados (26.66%), cuya germinación se da entre los 9 y 15 días, esto último

coincide con lo obtenido por PROSEFOR (1997), con respecto a la germinación de la especie

en el estado natural. En el porcentaje de germinación de las semillas de bolaina blanca se

aprecia que las semillas expuestas a 30 min a la concentración de hipoclorito de sodio a 2 %

muestran 28% de efectividad, que es el mejor resultado para esta especie, la germinación

comenzó desde el día 6 después de la siembra hasta el día 15.

Es interesante mencionar que VILLEGAS (2008) obtuvo porcentajes similares de

germinación para la especie de Guazuma crinita Mart, y que, al igual que ahora, la relación

tiempo de exposición al hipoclorito de sodio al 2% (X) - porcentaje de germinación (Y) es

parabólica, es decir que a mayor tiempo de exposición menor será la germinación. Al

respecto HARTAMAN (1995), señala que la desinfección requiere el empleo de materiales

químicos que son tóxicos para los organismos pero relativamente inocuos para le material

vegetal. Tanto la efectividad del tratamiento como el daño al tejido viviente aumentan como

respuesta al tiempo-dosis, de manera que se debe buscar un equilibrio efectivo de esos

factores.

CONCLUSION.

1. Los resultados del experimento de esterilización superficial permitió confirmar que el uso

de hipoclorito de sodio fue necesario para obtener semillas libres de contaminantes

superficiales.

2. Las semillas de Cedro (Cedrela odorata, L.), expuestas por 40 min a una concentración

de hipoclorito de sodio al 2 % obtienen 0% de contaminación en el proceso de siembra en

condiciones In Vitro.

3. Las semillas de bolaina (Guazuma crinita, Mart.), expuestas por 30 min a una

concentración de hipoclorito de sodio al 2 % es óptimo para ser sembradas en

condiciones In Vitro, ya que no se obtuvo contaminación alguna.

4. El tratamiento T3 influye favorablemente en el rompimiento de la dormancia de las

semillas de cedro, al obtenerse un 26.66 % de germinación en un periodo de 6 a 15 días

después de transcurrida la siembra.

5. Para la especie de bolaina blanca, el tratamiento T5 es le mas indicado, obteniéndose un

28% de germinación en un periodo de tiempo de 6 a 15 días después de transcurrida la

siembra.

AGRADECIMIENTOS.

Mi sincero agradecimiento:

A Dios y a mi madre por haberme apoyado en todo momento durante todo el proceso de mis

estudios.

A La Universidad Nacional De Ucayali, a la Facultad De Ciencias Forestales y al Centro de

Investigación y Desarrollo Rural Amazónico por haber hecho posible el convenio de

intercambio de estudiantes entre la Universidad Nacional de Ucayali y la Universidad de

Agricultura de Praga en República Checa.

A la Universidad De Agricultura En Praga por haber brindado sus instalaciones durante el

semestre académico “I 2008. “

Al Ing. Pablo P. Villegas por sus enseñanzas en el Laboratorio De Cultivo De Tejidos y

Meristemas de la Universidad Nacional de Ucayali.

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