ISSN 373 - 580 X

Bol. Soc. Argent. Bot. 33 (1-2): 1-6. 1997

PRODUCCION DE CELULASAS POR TRES ESPECIES DE ASCOBOLUS

(ASCOMYCOTINA, PEZIZALES)

POR ANDREA S. SÍVORI, OSCAR A. MERCURI Y FLAVIA FORCHIASSIN'

SUMMARY: Cellulase production by three species of Ascobolus (Ascomycotina, Pezizales).

Endoglucanase and p-glucosidase activity and production were studied for three species of Ascobolus

during growth on crystalline cellulose as carbon source. Glucose was added to the culture medium to testa possible effect of enzyme induction-repression. The highest enzyme production and best growth wereobserved for A. albidus while A. crenulatus and A. gamundii showed lower values when growing oncellulose. A. albidus showed high repression rates for both enzymes when glucose was added, whereas

A. gamundii was less affected and A. crenulatus appeared to be non inhibited. On the basis of substrate

occurrence and the observed results, eco-physiological implications are discussed.

Palabras clave: Ascobolus, celulasas, endoglucanasas, p-glucosidasas

jar luz sobre los aspectos ecofisiológicos que deter¬minan la sucesión de las diversas poblaciones

Si bien la microflora del rumen de los herbívoros coprófilas en el estiércol de herbívoros. Asimismo,es responsable de la degradación de los polímeros la caracterización biológica de los complejosestructurales de las plantas que aquéllos ingieren, e-nzimáticos, puede constituir una herramienta va-sólo una parte (entre el 30 y 60 %) es hidrolizada a liosa - junto a otras características de cultivo - paraproductos solubles. El resto pasa casi intacto por el elaborar un sistema taxonómico sobre bases mástracto digestivo de los animales y es expulsado for- amplias que la morfología clásica (Ranalli y

. mando la mayor parte del estiércol. Los ascomicetos Mercuri, 1995).de la familia Ascobolaceae, mayoritariamente habi¬

tantes normales del estiércol de herbívoros, son res-

INTRODUCCION

El objetivo de este trabajo fue estudiar y compa¬rar los sistemas celulolíticos de tres especies de

ponsables de reciclar esos residuos celulósicos, so- ascoboláceas (Ascobolus albidusCrouan, A. crenulatuslos o en asociación con otras poblaciones fúngicas P.Karst, A. gamundii Dokmetzian et Ranalli). Sa-pertenecientes a diversos grupos taxonómicos hiendo que estos organismos son colonizadores pri-(Mercuri, 1987; Markham y Bazin, 1991; Taj-Aldeen manos del estiércol de diversos herbívoros, se in-et al., 1990). tentó comparar el crecimiento y la habilidad dife-

Los organismos coprófilos, en particular los rencial para producir enzimas celulolíticas utilizan-hongos filamentosos, han evolucionado adaptán- do diferentes fuentes de carbono en estudios indose a un sustrato muy particular tanto en estruc- vitro.tura cuanto en composición. Dos características sa¬

lientes para el desarrollo en este hábitat son: la MATERIALES Y METODOS

producción de esporas que resistan el pasaje por el

tracto digestivo del herbívoro, y la capacidad desintetizar complejos enzimáticos extracelulares, es¬pecíficos para atacar los polímeros lignocelulósicos latus P.Karst, BAFC-21422, y A. gamundii Dokmet-

que.componen las paredes celulares de las plantas zian et Ranalli, BAFC-31899. Las cepas fueron

(Wicklow et al., 1979). El conocimiento de los siste- servadas en tubos con medio PF (Ranalli y Mercuri,

mas lignocelulolíticos de estos hongos puede arro-

Organismos: las cepas de Ascobolus utilizadasfueron: A. albidus Crouan, BAFC-22321, A. crenu-

con-

1995) a 4°C.Medio de cultivo (por litro): asparagina 4 g;

Sulfato de magnesio pentahidrato, 0.5 g; Fosfatodibásico de potasio, 0.6 g; Fosfato monobásico depotasio, 0.5 g; Sulfato de cobre pentahidrato, 0.4

mg; Cloruro de manganeso tetrahidrato, 0.09 mg;

1 Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de BuenosAires, Ciudad Universitaria, Pab. 2, Piso 4. 1428 Buenos Aires, e-

mail: fla@bg.fcen.uba.ar

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ácido bórico, 0.07 mg; Molibdato de sodio celulosa cristalina (CC) y glucosa; el máximo creci-dihidrato, 0.02 mg; Cloruro férrico 1 mg; Cloruro miento estimado como proteína de micelio se ob-de zinc 10 mg; Biotina 5 mg; Tiamina 0.1 mg. Las servó para Ascobolus crenulatus con 120 pg/mi, enfuentes de carbono utilizadas para inducir el siste- tanto que A. albidus y A. ganmndii llegaron a unma celulolítico fueron: 5 g celulosa cristalina + 5 g máximo de 40 pg/ml; en los tres casos hacia el día

11 de crecimiento (Fig. 1 A).En medio con CC pero sin el agregado de gluco-

cabo en erlenmeyers de 125 mi conteniendo 50 mi sa el comportamiento de las tres cepas fue distinto:del medio adecuado. El inoculo se realizó a partirde cultivos de7días de crecimiento sobre Bacto-agar2% y se incubaron a 24°C con agitación continua a125 r.p.m.

Estimación del crecimiento: El micelio fue filtradoa presión reducida, secado a 70°C hasta peso cons- ~~tante y molido. Se midió el peso seco y se cuantifica-ron proteínas totales de micelio después de una ~hidrólisis con NaOH IN, 1 hora a 100°C, según el ométodo de Bradford (1976).

En el sobrenadante se midieron la actividadcelulolítica y las cantidades de proteínas solubles y £glucosa residual.

Actividad de fi-l,4-endoglncanasas: Se estimó por 2valoración de extremos reductores liberados de la D-

degradación de Carboximetil Celulosa, sal sódica(CMC), por el método de Somogyi y Nelson (1944,1952). La mezcla de reacción contuvo 0.4 mi deCMC 0.5% en buffer acetato 100 mM, pH=4.8 y 0.1mi de sobrenadante de cultivo y se incubó por unahora a 37°C (Pardo y Forchiassin, 1993).

Actividad $-glucosidasa: se utilizó una mezcla dereacción con 0.9 mi de p-nitrofenil-P1D glucopira-nósido (0.02%) en buffer acetato 100 mM, pH=4.8,y 0.1 mi de sobrenadante de cultivo. Se incubó 1hora a 50°C. La reacción se detuvo agregando 2 mide Buffer Clark y Lubs (pH=9.8) y la absorbanciafue leída a 445 nm (Pardo y Forchiassin, 1995). cr-

Las unidades de actividad enzimática se definie- -éron como la cantidad de enzima necesaria para libe- §rar azúcares reductores equivalente a 1 mg de glu- O

cosa (endoglucanasas), o 1 mg de p-nitrofenol g(p-glucosidasa) en un minuto, en las condiciones gde reacción. En todos los casos la actividad-

glucosa; ó 10 g de celulosa cristalina.Condiciones de cultivo: Los cultivos se llevaron a

150

A

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100-

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oo 5 10 15 20

Día

150

B

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a>

enzimática fue expresada como Unidades Enzi-máticas/mi de sobrenadante de cultivo. Se realiza- c

ron curvas standard de glucosa y p-nitrofenol para . ocalcular la actividad enzimática correspondiente y Q.

de albúmina sérica bovina para determinar proteí¬nas utilizando el método de Bradford (1976). Losdatos presentados son, en todos los casos, el pro¬medio de tres ensayos por duplicado, con un errorestándar menor al 5%.

50-5

oo 5 10 15 20

Día

RESULTADOS Fig.1.-Cinéticas de crecimiento deAscobolus crenulatus (•),A. albidus (O) y A. ganmndii (ÿ) en medios de cultivo concelulosa cristalina + glucosa (A) y.celulosa cristalina (B)como fuentes de carbono.

La cinética de crecimiento de la tres especiesanalizadas siguió un patrón similar en medio con

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A. S. Sívori, O. A. Mercuri y F. Forchiassin, Celulasas en Ascobolus

se observo una fase lag más prolongada y, conse- crenulatus y A. gamundii alcanzaron 110 y 80 pg decuentemente, los máximos de proteína miceliana proteína/ml.retrasados hasta el día 14 (Fig. 1 B). El mayor creci¬miento se registró para A. albidus (140 pg/ml); A.

En la Figura 2 se muestran los perfiles de activi¬dad enzimática de endoglucanasas y (3-glucosida-

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DíaFig. 2.- Actividades de endoglucanasa y p-glucosidasa durante el crecimiento de: A, B, Ascobolus albidus; C, D, A.crenulatus; E, F, A. gamundii; en medios de cultivo con celulosa cristalina (•) y celulosa cristalina + glucosa (ÿ).

Día

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sas para las tres especies creciendo en medios de hipercelulolíticas (Chaudhary y Tauro,1990; Araujocultivo con y sin glucosa. Si bien con cinéticas dis- et al., 1991; Tengerdy et al., 1991; Harkki et al.,tintas, puede verse que las actividades registradas 1991), tanto en producción de proteína extra-celularpara ambos grupos de enzimas siguen un patrón cuanto en actividad específica.similar en cuanto al efecto de la glucosa, con dife¬rencias cuantitativas según la especie ensayada.

En medio con CC solamente, el mayor produc- mite elaborar consideraciones sobre el aprovecha-tor de endoglucanasas fue A. albidus con 16 UE/ml, miento de la fuente carbonada in vitro, y proponerseguido por A. crenulatus y A. gamundii con 11 y 6 una aproximación hacia aspectos ecológicos y aúnUE/mi respectivamente (Fig. 2 A, C, E), coincidien- taxonómicos.do el día de mayor actividad enzimática medidacon el final de la fase logarítmica del crecimiento de en estudio, estimado como proteína de micelio, escada especie (Cfr. Fig. 1).

Cuando se analiza la producción de p-glucosi- respuesta podría estar asociada con los mecanismosdasas, se ve un orden similar para las tres especies: de inducción-represión del sistema celulolítico (RyuA. albidus - A. crenulatus - A. gamundii con activida- y Mandéis, 1980; Sternberg y Mandeis, 1982;des de 7.4 - 5.7 y 4.6 UE/ml respectivamente (Fig. 2 Kubicek et al., 1993). Por otra parte, el aprovecha¬

miento de la fuente carbonada, depende de la dis-Los perfilesdeactividad de ambas enzimascuan- ponibilidad inmediata de la misma.

Según los resultados expuestos, puede verificar-y glucosa muestran un ordenamiento similar de las se’el efecto diverso de la presencia de glucosa en elespecies pero con una cinética distinta y diferencias medio sobre las tres especies. Para A. albidus lacuantitativas importantes entre ellas (Fig. 2). Las represión del sistema celulolítico por la glucosa seactividades enzimáticas en medio con CC solamen- mánifiesta por la diferencia en la actividad dete se observan significativamente retrasadas (hasta endoglucanasas y p-glucosidasas cuando desarro-5 días) frente al medio con agregado de glucosa, lia con y sin el monosacárido (Figuras 2 A y 2 B). Encoincidiendo con la fase lag más prolongada y el A. crenulatus la inhibición es menor, en tanto que A.consecuente retraso del pico de crecimiento (Cfr. gamundii no presenta diferencias significativas en

cuanto a la actividad del sistema celulasa en ambosLa mayor diferencia de actividad para ambas medios (Figuras 2 E y 2 F).

enzimas en medio con y sin glucosa, se observó enA. albidus (Figuras 2 A y 2 B) con más de10 UE/ml a to, se observa una fase de autólisis muy pronuncia-favor del micelio creciendo sobre celulosa cristalina da para-A albidus luego del 13° día (Figura1B). Estosola para endoglucanasas o P-glucosidasas. Las di- justificaría el aumento sustancial en la actividadferencias medidas para A. crenulatus fueron meno- enzimática de sobrenadante señalada en las Figurasres (< 5 UE/mi) (Figuras 2 C y 2 Dj,.en tanto que el 2 A y 2 B. Al margen de la producción de biomasa,sistema celulasa de A. gamundii presentó las meno- la autólisis del micelio podría significar la libera¬res diferencias de actividad frente a la incorpora- ción de una mayor cantidad de proteínas activas alción o no de glucosa al medio (Figuras 2 E y 2 F).

El comportamiento diferente entre las cepas en¬sayadas frente a la degradación de la celulosa, per-

En primer término, el crecimiento de las especies

mayor si el sustrato es celulosa cristalina pura. Esta

B, D, F).

dose utilizó medio de cultivo con celulosa cristalina

Fig. 1 B).

Cuando se comparan las cinéticas de crecimien-

medioextracelular y, consecuentemente, un aumen¬to en la velocidad de degradación del sustratocelulósico.DISCUSION Y CONCLUSIONES

Es un hecho conocido que se produce mayorLas tres especies de la familia Ascobolaceae estu- liberación deenzimas exlracelulares durante la fase

diadas sintetizaron y liberaron enzimas celulolíticas de autólisis del micelio creciendo in vitro para algu-al medio durante su crecimiento in vitro en medios ñas especies (Nuero et al., 1993; Gaikwad y

Maheshwari, 1994).De todos modos, el aprovechamiento de la fuen-

y de endoglucanasas activas en el medio te de carbono por estos organismos, la represión deextracelular. Este sistema enzimático - celulasas - es los sistemas enzimáticos por azúcares solubles, ycapaz de degradar, al menos parcialmente, el las actividades específicas de las proteínassustrato natural donde desarrollan aquellos orga- degradadoras de la celulosa del estiércol, son carac¬

terísticas que pueden ser relacionadas con la pre-La producción de enzimas celulolíticas por estas sencia de esos hongos en un determinado momento

especies de Ascobolus es significativamente menor y en un determinado,lugar.que la de otros organismos capaces de degradarcelulosa in vitro, en particular cepas mutantes tenido de azúcares solubles y fuentes disponibles

sintéticos.Fue comprobada la presencia de P-glucosidasas

nismos.

La composición del sustrato en cuanto a su con-

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De hecho, los resultados del análisis in vitro delas especies coprófilas estudiadas se puedencorrelacionar con aspectos ecológicos y aún

taxonómicos. Si bien las especies estudiadas perte¬necen a un mismo grupo (Ascobolaceae), A. albidustiene un desarrollo ontogenético cleistohimenial delascocapo que difiere del hemiangiocárpico de lasotras dos especies; y aún más: los registros de nu¬

merosas colecciones lo señalan como habitante nor¬mal de estiércol de caballo (Ranalli y Cinto, 1972),

frente a A. crenulatus (Gamundí y Ranalli, 1966) y A.gamundii (Dokmetzian y Ranalli, 1995) que han sidohallados con más frecuencia sobre estiércol de vaca.El tipo de sustrato y su particular tipo de desarrollo,

se suman al comportamiento distinto de A. albidusin vitro.

A. crenulatus y A. gamundii son habitantes nor¬males de estiércol de vaca en nuestras praderas, ysu comportamiento in vitro (Cfr. Figuras 2 C-E y 2E-F) puede ser explicado sobre la base de datos dedesarrollo en el sustrato natural:- A. gamundii desa¬rrolla (produce cuerpos fructíferos) mucho más tem¬prano (4o día de incubación) (Dokmetzian y Ranalli,

1995) que A. crenulatus (7o-8o día) (Gamundí yRanalli, 1966), esto es: coloniza el sustrato con ma¬yor velocidad. Dado que el sustrato posee inicial¬mente, además de los restos celulósicos, hidratos decarbono solubles, esto explicaría simultáneamentela mayor capacidad de A. gamundii para utilizarmono o disacáridos y la indiferencia de la especierespecto de la producción desu sistema celulolítico..El retardo en la aparición de A. crenulatus podríaindicar la represión de su sistema celulolíticoextracelular por los hidratos de carbono solubles ysu posterior capacidad de degradar celulosa, unavez agotada la fuente de carbono asimilable directa¬mente.

El estudio de especies como las ensayadas eneste trabajo puede llevar a un mejor entendimientode la dinámica de las poblaciones de un sustrato tanparticular como estiércol de herbívoros, que consti¬tuye gran parte de la fuente de fertilidad de lossuelos de praderas de uso para ganadería.

Por otra parte, el comportamiento de los organis¬mos in vitro frente a variables del medio, puede seruna contribución al sistema taxonómico tradicionalbasado en características morfológicas.

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