Polymerase chain reaction Polymerase chain reaction amplification of the Bag320 satellite amplification of the Bag320 satellite

family reveals the ancestral library and family reveals the ancestral library and past gene conversion events in Bacillus past gene conversion events in Bacillus

rossius (Insecta Phasmatodea)rossius (Insecta Phasmatodea)M. Cesari, A. Lucchetti, M. Passamonti, V. Scali, B. Mantovani; M. Cesari, A. Lucchetti, M. Passamonti, V. Scali, B. Mantovani; 20032003

Carla BusattoCarla Busatto

Il DNA satellite è formato da sequenze simili ma Il DNA satellite è formato da sequenze simili ma non uguali ripetute in tandem (una dopo non uguali ripetute in tandem (una dopo l’altra), principalmente collocato nei centromeri l’altra), principalmente collocato nei centromeri e nei telomeri dei cromosomi.e nei telomeri dei cromosomi.

Attualmente si pensa che queste sequenze Attualmente si pensa che queste sequenze siano coinvolte in molti processi e/o funzioni siano coinvolte in molti processi e/o funzioni (struttura dei centromeri e dinamica, (struttura dei centromeri e dinamica, evoluzione dei cariotipi, trascrizioni tessuto-evoluzione dei cariotipi, trascrizioni tessuto-specifiche e sesso-specifiche). specifiche e sesso-specifiche).

Il DNA satellite tende ad essere più omogeneo Il DNA satellite tende ad essere più omogeneo all’interno di un’unità evolutiva (cromosoma, all’interno di un’unità evolutiva (cromosoma, popolazione, sottospecie, specie…) che non tra popolazione, sottospecie, specie…) che non tra unità evolutive diverse.unità evolutive diverse.

INTRODUZIONEINTRODUZIONE

Il DNA satellite è un esempio di evoluzione Il DNA satellite è un esempio di evoluzione concertata ed è archiviato nell’unità evolutiva concertata ed è archiviato nell’unità evolutiva tramite la trasmissione molecolare che coinvolgetramite la trasmissione molecolare che coinvolge::

L’omogenizzazione di nuove varianti in tutta la L’omogenizzazione di nuove varianti in tutta la famiglia ripetuta per mezzo di meccanismi di famiglia ripetuta per mezzo di meccanismi di turnover genomici,turnover genomici,

La loro fissazione nella popolazione come La loro fissazione nella popolazione come conseguenza della riproduzione sessuale.conseguenza della riproduzione sessuale.

Le famiglie di DNA satellite, nelle specie di Le famiglie di DNA satellite, nelle specie di Insetti presentano una variabilità tra monomeri Insetti presentano una variabilità tra monomeri che va dall’1 al 15%.che va dall’1 al 15%.

Molte famiglie possono essere specie-specifiche Molte famiglie possono essere specie-specifiche qualitativamente o avere un numero di copie qualitativamente o avere un numero di copie specie- specifico.specie- specifico.

IPOTESI LIBRARY:IPOTESI LIBRARY:

I taxa affini vanno a formare una library I taxa affini vanno a formare una library contenente varianti di sequenze monomeriche contenente varianti di sequenze monomeriche satellite che possono essere diversamente satellite che possono essere diversamente amplificate come numero di copie.amplificate come numero di copie.

Questa non predice i meccanismi e non può Questa non predice i meccanismi e non può valutare se c’è una pressione selettiva che valutare se c’è una pressione selettiva che favorisce un tipo di variante monomerica sulle favorisce un tipo di variante monomerica sulle altre.altre.

Bacillus rossiusBacillus rossius

Il genere Il genere BacillusBacillus comprende: comprende:

B. rossiusB. rossius

B. grandiiB. grandii

B. atticusB. atticus

B. rossius-grandiiB. rossius-grandii

B. whiteiB. whitei

B. lynceorumB. lynceorum

bisessualibisessuali

unisessualeunisessuale

Ibridi diploidi Ibridi diploidi e triploidi e triploidi non non mendeliani mendeliani

B.rossiusB.rossius può può presentare presentare partenogeniapartenogenia

Areali di distribuzione del genere Areali di distribuzione del genere BacillusBacillus::

Sulla base di allozimi, DNA satellite e dati Sulla base di allozimi, DNA satellite e dati mitocondriali mitocondriali B.rossiusB.rossius e e B.grandiiB.grandii sono sono altamente differenziati.altamente differenziati.

B.grandii grandiiB.grandii grandii mostra una alta affinità con le mostra una alta affinità con le femmine automittiche partenogenetiche di femmine automittiche partenogenetiche di B.atticusB.atticus..I taxa del genere I taxa del genere Bacillus Bacillus condividono la stessa condividono la stessa famiglia satellite centromerica famiglia satellite centromerica Bag320Bag320..

MATERIALI E METODIMATERIALI E METODII campioni raccolti in campo sono stati fatti crescere I campioni raccolti in campo sono stati fatti crescere in laboratorio in gabbie aerate con cibo vegetale in laboratorio in gabbie aerate con cibo vegetale fresco. fresco.

I corpi sono stati congelati e conservati a -80°C. I corpi sono stati congelati e conservati a -80°C.

I monomeri I monomeri Bag320Bag320 sono stati amplificati sono stati amplificati tramite PCR, con primers interni specifici tramite PCR, con primers interni specifici progettati su una sequenza consenso derivata progettati su una sequenza consenso derivata dal dal Bag320Bag320 di di B.atticusB.atticus e e B.grandiiB.grandii analizzata in analizzata in un precedente lavoro.un precedente lavoro.Le sequenze sono state allineate e dopo aver Le sequenze sono state allineate e dopo aver osservato i livelli di variabilità e i trends sugli osservato i livelli di variabilità e i trends sugli interi monomeri sono state ridotte alla interi monomeri sono state ridotte alla lunghezza degli amplificati di lunghezza degli amplificati di B.rossiusB.rossius. .

Su di esse sono stati creati dendrogrammi di Su di esse sono stati creati dendrogrammi di Neighbour Joining e cladogrammi di parsimonia.Neighbour Joining e cladogrammi di parsimonia.

RISULTATIRISULTATI

I prodotti della PCR sono tutti monomeri di circa I prodotti della PCR sono tutti monomeri di circa 250 bp più una seconda banda di circa 500 bp.250 bp più una seconda banda di circa 500 bp.

Il confronto con sequenze satellite di altri taxa Il confronto con sequenze satellite di altri taxa di di BacillusBacillus ha rivelato che le sequenze di ha rivelato che le sequenze di Bag320Bag320 sono state amplificate tramite PCR. sono state amplificate tramite PCR.

Le analisi di sequenziamento sono state fatte Le analisi di sequenziamento sono state fatte sulla prima banda per 124 monomeri clonati sulla prima banda per 124 monomeri clonati con lunghezza media di 238 bp.con lunghezza media di 238 bp.

I monomeri I monomeri Bag320Bag320 sono presenti in sono presenti in B.rossiusB.rossius ma in un numero molto basso di copie che le ma in un numero molto basso di copie che le procedure standard di PCR possono non procedure standard di PCR possono non scoprire.scoprire.

B.rossiusB.rossius forma un cluster forma un cluster con con B.atticusB.atticus e e B.grandii B.grandii grandiigrandii

B.rossiusB.rossius forma un cluster forma un cluster con con B.grandii benazziiB.grandii benazzii e e B.grandii maretimiB.grandii maretimi

Cladogramma di Cladogramma di massima parsimonia massima parsimonia

costruito sui 124 costruito sui 124 monomeri monomeri

Cladogramma di Cladogramma di massima parsimonia massima parsimonia

costruito su un costruito su un sottogruppo di sottogruppo di

monomeri presi a monomeri presi a casocaso

Le sequenze di Le sequenze di B.rossiusB.rossius mostrano differenze mostrano differenze

significative ma comunque significative ma comunque uno specifico grado di uno specifico grado di

affinità con le altre affinità con le altre sequenze sequenze Bag320Bag320..

Sono presenti monomeri Sono presenti monomeri clonati dallo stesso clonati dallo stesso

individuo di individuo di B.rossiusB.rossius in in ognuno dei rami ognuno dei rami

dell’albero, questo porta a dell’albero, questo porta a ipotizzare un antenato che ipotizzare un antenato che

contenga tutte le diverse contenga tutte le diverse sequenze sequenze Bag320Bag320..

B.rossiusB.rossius accoglie ancora molta o tutta la accoglie ancora molta o tutta la variabilità della famiglia satellite variabilità della famiglia satellite Bag320Bag320 contenendo monomeri di ciascun taxon contenendo monomeri di ciascun taxon derivato e anche sequenze private mancanti derivato e anche sequenze private mancanti negli altri taxa.negli altri taxa.

Sembra che le sequenze Sembra che le sequenze Bag320Bag320 non siano non siano state salvate come una componente maggiore state salvate come una componente maggiore del satellite ma semplicemente rappresentano del satellite ma semplicemente rappresentano il rimanente di una famiglia satellite ancestrale il rimanente di una famiglia satellite ancestrale presente nell’antenato presente nell’antenato B.rossiusB.rossius..

Ipotesi LibraryIpotesi Library

Nel cluster A1 sono presenti sequenze identiche in Nel cluster A1 sono presenti sequenze identiche in animali geograficamente distanti, tramite la gene animali geograficamente distanti, tramite la gene conversion analysis sono stati trovati 2 putative conversion analysis sono stati trovati 2 putative converted tracts (PCT) che appartengono a converted tracts (PCT) che appartengono a sequenze di origine di sequenze di origine di B.atticusB.atticus; lo stesso è ; lo stesso è accaduto peraccaduto per B.grandii grandiiB.grandii grandii nel cluster A3. nel cluster A3.Il ritrovamento di sequenze uguali con uguali PCT in Il ritrovamento di sequenze uguali con uguali PCT in aree diverse suggerisce che gli eventi di gene aree diverse suggerisce che gli eventi di gene conversion, che hanno prodotto il PCT (Cluster A1), conversion, che hanno prodotto il PCT (Cluster A1), sono capitati in un antenato sono capitati in un antenato B.rossius B.rossius prima di 5.30-prima di 5.30-1.06 Mya.1.06 Mya.Nel cluster A3 invece si può supporre che l’evento di Nel cluster A3 invece si può supporre che l’evento di gene conversion sia accaduto, prima dell’antenato gene conversion sia accaduto, prima dell’antenato di di B.grandiiB.grandii grandiigrandii, 15.37-2.65 Mya., 15.37-2.65 Mya.

Ancestral gene conversion Ancestral gene conversion eventsevents

Variability trends and levels Variability trends and levels in B.rossiusin B.rossius

I campioni bisessuati delle I campioni bisessuati delle tre sottospecie analizzate tre sottospecie analizzate mostrano una variabilità mostrano una variabilità

significativa in tutti i livelli .significativa in tutti i livelli .

Lo stesso accade nei Lo stesso accade nei campioni partenogenetici.campioni partenogenetici.

La variabilità all’interno La variabilità all’interno delle sottospecie invece delle sottospecie invece

non è significativa.non è significativa.

In generale il valore di In generale il valore di p-distance medio di p-distance medio di B.rossius è più alta B.rossius è più alta

che in B.atticus e che in B.atticus e B.grandii.B.grandii.

Dai dati di variabilità appare chiaramente che il set Dai dati di variabilità appare chiaramente che il set di sequenze diverse ancora accolte nel genoma di di sequenze diverse ancora accolte nel genoma di B.rossiusB.rossius non è omogenizzato, neppure 16 Mya, non è omogenizzato, neppure 16 Mya, probabilmente a causa del loro basso numero di probabilmente a causa del loro basso numero di copie.copie.

Il pattern della sequenza Il pattern della sequenza Bag320Bag320 odierna suggerisce odierna suggerisce che la riproduzione bisessuale attua la regola di che la riproduzione bisessuale attua la regola di fissazione solo per famiglie ben rappresentate nel fissazione solo per famiglie ben rappresentate nel genoma di un organismo.genoma di un organismo.

I livelli e i trends di variabilità delle sequenze I livelli e i trends di variabilità delle sequenze Bag320Bag320 di di B.rossiusB.rossius appaiono essere legati solo alla specifica appaiono essere legati solo alla specifica storia di questa famiglia satellite nel taxon analizzato.storia di questa famiglia satellite nel taxon analizzato.

FINEFINE